CN117441023A

CN117441023A - 慢病毒载体及其用途

Info

Publication number: CN117441023A
Application number: CN202180098198.XA
Authority: CN
Inventors: 胡安·安东尼奥·布埃伦龙塞罗; 苏珊娜·纳瓦罗奥多涅斯; 亚里·希门尼斯马丁内斯; 曼努埃尔·帕拉西奥斯佩雷斯; 丹尼斯·拉方丹
Original assignee: Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Universitario Nino Jesus; Network Biomedical Research Joint Center; Universite Libre de Bruxelles ULB; Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz
Current assignee: Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Infantil Universitario Nino Jesus; Network Biomedical Research Joint Center; Universite Libre de Bruxelles ULB; Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2024-01-23
Also published as: JP2024521989A; WO2022238595A1; EP4339291A1; MX2023012476A; BR112023023798A2; CA3219359A1

Abstract

本发明提供了慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含多核苷酸，其中所述多核苷酸的特征在于其包含转录单元，所述转录单元继而包含人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、编码RPS19蛋白的核苷酸序列和经优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)。本文还提供了所述慢病毒载体的组合物和用途，特别是用于治疗Diamond‑Blackfan贫血。

Description

慢病毒载体及其用途

技术领域

本发明提供了用于挽救细胞中RPS19表达的组合物和方法。特别地，本文提供了用于Diamond Blackfan贫血的基因治疗的方法和组合物。

背景技术

Diamond Blackfan贫血(Diamond Blackfan anemia，DBA)是罕见疾病，其估计的患病率为每百万出生生命中有5至7例，显示出患者在不同国家的发病率和分布。DBA的标志是大细胞性贫血，其通常在第一年出现，并且经常演变为中性粒细胞减少症和血小板减少症，并在一些情况下演变为骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病(Ruggero&Shimamura，2014)。因此，虽然DBA通常与纯红细胞再生障碍相关，但全身性造血缺陷将DBA限定为骨髓衰竭(bone marrow failure，BMF)综合征。

20个DBA基因加3个“DBA样”基因中的突变占DBA患者的70％至80％。编码核糖体蛋白S19的基因RPS19在DBA中是最常受影响的(患者中的25％)(Da Costa，Narla，&Mohandas，2018)。这些患者通常是针对该基因单倍体不足的(一个基因不受影响，另一个基因失活)，导致功能性核糖体的产生显著降低。

皮质类固醇构成DBA患者的第一治疗选择。患者中的约80％最初对皮质类固醇有响应，并且其贫血得到改善或完全缓解。然而，长期皮质类固醇治疗在许多患者中显示出有限的效力，因此仅约40％将维持皮质类固醇延长的时间段，意味着总体而言，DBA患者中的至少40％是输注依赖性的。迄今为止，同种异体造血干细胞移植(allogenichematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是DBA患者唯一可用的治愈性治疗。共识是使用同胞供体或完全匹配的(10/10)不相关供体，然而，仅少数患者获得合适的供体。此外，10岁之后经替代供体移植的DBA患者的临床结局非常差。另外，DBA现在被确定为癌症易发疾病，并且在清髓性预处理和移植之后，这些患者的癌症发病率甚至可提高，如已经在患有范科尼贫血(Fanconi anaemia，FA)的患者中表明的。

旨在纠正造血干细胞中基因突变的基因治疗代表了这种遗传性病症的潜在治疗策略。通过γ逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的基因治疗是有吸引力的，因为病毒具有进入到细胞中并向细胞递送遗传物质的天然能力。特别地，慢病毒载体(lentiviralvector，LV)是用于基因递送的合适载剂，因为它们被认为相对安全并且能够稳定整合到广泛范围的分裂和非分裂哺乳动物细胞类型的基因组DNA中。稳定整合到基因组中的能力使LV成为用于基因治疗，尤其是用于纠正和治疗遗传性病症例如DBA的独特且理想的工具。

因此，仍然迫切需要用于DBA的有效治疗方案，并且本发明提供了不仅能够恢复RPS19蛋白的表达并且能够纠正核糖体生物发生过程中的改变的LV。

附图说明

图1.产生的治疗性载体的示意图：a)PGK.CoRPS19.Wpre*和b)EF1α(s).CoRPS19.Wpre*。5′LTR：5′长末端重复；PBS：引物结合位点；Ψ：psi包装信号；ΔGAG：截短的Gag序列；SA：剪接接受体；RRE：Rev响应元件(Rev responsive element，RRE)；cPPT：DNA瓣中央多嘌呤束(DNA flap central polypurine tract)；PGK：磷酸甘油酸激酶启动子；EF1α(s)：延伸因子1α的短形式；CoRPS19：编码RPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列；Wpre*：突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件；3′LTR：3′长末端重复；PolyA：多腺苷酸化信号序列。

图2.Diamond Blackfan贫血(DBA)患者骨髓中CD34⁺细胞数目的确定：a)从DBA患者(DBA)、范科尼贫血患者(FA)和作为对照的健康供体(healthly donor，HD)中提取的总骨髓细胞中CD34⁺细胞的百分比，b)骨髓的细胞型。c)骨髓中CD34⁺/CD38^-细胞的百分比。使用曼惠特尼(Mann Whitney)检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了中位数和四分位数范围以及90∶10百分位数。

图3.对DBA患者和健康供体的骨髓中不同造血祖细胞亚群的百分比的定量。a)HSC(造血干细胞：Lin^-CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-)。b)MPP(多能祖细胞：CD34⁺CD38^-Thy-1^-CD45RA^-Flt3⁺CD7^-CD10^-)。c)MLP(多淋巴样祖细胞：CD34⁺CD38^-Thy-1^低CD45RA^-Flt3⁺CD7^-/+CD10^-)。d)CMP(髓系共同祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy-1^-CD45RA^-、Flt3⁺CD7^-CD10^-)。e)MEP(巨核细胞和红系祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy^-1^-CD45RA^-Flt3^-CD7^-CD10^-)和f)GMP(粒细胞-单核细胞祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy-1^-CD45RA⁺Flt3⁺CD7^-CD10^-)。使用曼惠特尼检验确定显著性程度。该图示出了中位数和四分位数范围以及90∶10百分位数。HD：健康供体；DBA：DBA患者。

图4.骨髓中造血祖细胞集落形成细胞(colony forming cell，CFC)数目的确定：a)每10⁵个接种的单核细胞(mononuclear cell，MNC)的粒细胞-巨噬细胞祖细胞集落形成单位(granulocyte-macrophage progenitor colony forming unit，CFU-GM)的数目。b)每10⁵个接种的MNC的红系祖细胞爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroidprogenitor，BFU-E)的数目。使用曼惠特尼检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了中位数和四分位数范围以及90∶10百分位数。BM：骨髓；HD：健康供体；DBA：DBA患者；FA：范科尼贫血患者。

图5.免疫缺陷NSG小鼠中来自健康供体和DBA患者的CD34⁺细胞的重建潜力的确定：a)在三个不同时间点(移植之后天数(days post-transplant，dpt)为30、60和90天)移植到小鼠骨髓中的人CD45⁺(human CD45⁺，hCD45⁺)细胞的百分比。b)向不同谱系的分化。CD33⁺：髓样干细胞，CD19⁺：淋巴样干细胞，和CD34⁺：造血干细胞(HSC)。通过曼惠特尼检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了中位数和四分位数范围以及90∶10百分位数。HD：健康供体，DBA：DBA患者。

图6.研究疾病模型细胞系中RPS19基因的内源性表达(通过以下在RPS19基因中干扰K562：载体LV-THM.shRPS19和pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19)随后通过PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体进行校正：a)左图：通过载体LV-THM.shRPS19(ShRPS19-LV)降低RPS19的内源性表达；右图：随后检测治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19-LV)和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(EF1α.CoRPS19-LV)中存在的CoRPS19序列。b)左图：通过载体pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19(ShRPS19-LV)降低RPS19的内源性表达；右图：随后检测治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19-LV)和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19-LV)中存在的CoRPS19序列。通过t检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了平均值和标准差。左图中的虚线指示未经干扰的K562对照细胞(mock)中的RPS19基础内源性表达。

图7.针对RPS19基因干扰的K562细胞系中核糖体生物发生进行分析并随后通过PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体进行校正：a)左图：在用干扰载体LV-THM.shRPS19干扰并随后用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19-LV)或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(EF1α.CoRPS19-LV)转导的细胞中通过northern印迹进行检测(前体21S/21C rRNA(星号，21S/21S-C)的水平)；右图：示出了在用干扰载体LV-THM.shRPS19干扰并随后用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的细胞中通过northern印迹检测的前体21S与21C rRNA之间的比率(前体rRNA21S/21S-C)的定量的图。b)左图：在用干扰载体pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19干扰并随后用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的细胞中通过northern印迹检测的21S和21C前体rRNA水平(星号)；右图：示出了在用干扰载体pLKO.1-pureTurboGFP^TM shRPS19干扰并随后用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的细胞中通过northern印迹检测的前体21S与21C rRNA之间的比率(前体rRNA21S/21S-C)的定量的图。通过ANOVA检验及其逐组分析确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了三个实验的平均值和标准差。1.Mock：非转导细胞；2.SCRB：用LV-THM.shscramble转导的细胞。1.Mock和2.SCRB作为阴性对照包括在内。PGK.CoRPS19：用PGK.CoRPS19.Wpre*载体转导的条件；EF1α.CoRPS19：用EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体转导的条件；Sh+PGK.CoRPS19：用在a)LV-THM.shRPS19和b)pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19中的干扰载体和PGK.CoRPS19.Wpre*载体共转导的条件；以及Sh+EF1α.CoRPS19：用在a)LV-THM..shRPS19和b)pLKO.1-pureTurboGFP^TM shRPS19中的干扰载体和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*LV共转导的条件。

图8.通过用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或者用PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的DBA患者CD34⁺细胞产生的造血祖细胞集落的数目的确定：a)每10⁵个接种的单核(mononuclear，MNC)细胞的CFU-GM集落的数目。b)每10⁵个接种的MNC细胞的BFU-E集落的数目。用经PGK.EGFP..Wpre*载体(PGK EGFP)转导的细胞进行的实验数为N＝3，用经PGK.CoRPS19.Wpre*载体(PGK.CoRPS19)转导的细胞进行的实验数为N＝5，以及用经EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体(EF1α.CoRPS19)转导的细胞进行的实验数为N＝5。

图9.用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体在DBA患者的CD34⁺细胞中进行的有效校正和无毒性(null toxicity)：a)用PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19)或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(EF1α.CoRPS19)治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体(PGK EGFP)的DBA患者造血祖细胞中的转导百分比。整合到维持在b)液体培养物中和c)CFC中的细胞中的载体拷贝数(number of vector copy，VCN)。通过曼惠特尼检验确定显著性程度。针对条件进行的实验数：PGK.EGFP.Wpre*载体：N＝4，PGK.CoRPS19.Wpre载体N＝5，以及对于EF1α(s).CoRPS19.Wpre*：N＝3。该图表示了与来自5名不同患者的CD34⁺细胞的转导对应的平均值以及对应的标准差。

图10.对治疗性载体转导对在DBA患者造血祖细胞的液体培养物中离体扩增的作用的分析。用PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19)或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(EF1α.CoRPS19)治疗性载体成功转导的来自DBA患者的骨髓造血祖细胞的数目。PGK.EGFP.Wpre*载体(PGK EGFP)用作对照。在转导之前第0天(D0)和转导之后两个不同时间点(D7和D14，在7天和14天之后)测量细胞数目。

图11.对用治疗性载体校正的来自DBA患者的细胞的红系分化过程的分析：对用PGK.CoRPS19.Wpre*(PGK.CoRPS19)或EF1α.CoRPS19.Wpre*(EF1α.CoRPS19)治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体(PGK.EGFP)转导的BM CD34⁺DBA细胞中CD71⁺/CD235a⁺和CD71^-/CD235a⁺(CD71/CD235a)细胞群的百分比进行的定量。该图示出了a)3名患者(DBA-31、DBA-25和DBA-36)的个体分析和b)批量分析。通过曼惠特尼检验确定显著性程度。该图示出了平均值和标准差。

图12.对移植到NSG免疫缺陷小鼠中的用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的DBA患者细胞的重建潜力的分析：在细胞移植之后三个不同时间点(30天(D30)、60天(D60)和90天(D90))用治疗性载体校正的来自DBA患者的BM CD34⁺细胞的植入水平(hCD45+细胞百分比)以及对髓样细胞(CD33⁺)、淋巴样细胞(CD19⁺)和HSC(CD34⁺)中的分化的多谱系潜力的确定。使用曼惠特尼检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001；ns：不显著)。该图示出了平均值和标准差。MOCK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF.CoRPS19、EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图13.在移植之后第90天，对用治疗性载体或EGFP载体对照转导并移植到NSG接受体小鼠中的DBA患者细胞中的载体拷贝数(VCN)进行的定量。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值＜0.05)。

图14.对由用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体脐带CD34⁺细胞产生的集落的数目进行的定量：a)每10⁵个接种的单核细胞(MNC)的粒细胞-巨噬细胞祖细胞集落形成单位(CFU-GM)的数目。b)每10⁵个接种MNC的BFU-E的数目。使用曼惠特尼检验确定显著性程度(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了5个实验的平均值和标准差。PGK.EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK.CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF1α.CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图15.用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体CD34⁺细胞的集落和液体培养物中的VCN/细胞、转导百分比和CoRPS19转基因的表达水平的确定：a)集落中的载体拷贝数(VCN)/细胞以及CD34⁺细胞中的转导百分比的确定。b)液体培养物(liquid culture，LC)中的VCN/细胞的确定。c)针对VCN/细胞归一化的CoRPS19的表达。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.000105)。图a)中的图示出了5个实验的平均值和标准差，b)中的图示出了4个实验的平均值和标准差，以及c)中的图示出了3个实验的平均值和标准差。PGK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF1αCoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图16.用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体和PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体脐带CD34⁺细胞的生长曲线。通过曼惠特尼检验确定显著性程度(P值＜0.05)。该图示出了5个实验(N＝5)的平均值和标准差。D，天数；PGKEGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图17.对用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体CD34⁺细胞的再群体化和分化潜力的分析：a)再群体化潜力通过对初级(primary)和次级(secondary)接受体中hCD45⁺细胞的百分比进行定量来确定。b)髓样细胞(CD33⁺)、淋巴样细胞(CD19⁺)和HSC(CD34⁺)细胞在初级和次级接受体中的分布。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.000105)。该图示出了转导来自健康供体脐带血的CD34⁺并在NSG小鼠的体内造血重建之后进行的两个安全性实验的平均值和平均值的标准误差。D，天数；PGK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图18.用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导并移植到作为初级接受体的NSG小鼠中的健康供体CD34+细胞中的VCN定量。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.0001)。该图示出了所进行的两个不同实验的平均值和平均值的标准误差，所述实验用于分析治疗性载体在转导健康供体的来自脐带血的CD34⁺并将其移植到NSG小鼠中之后的体内安全性和毒性作用。PGK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图19.移植有用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体和PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体CD34⁺细胞的NSG小鼠的体重的确定。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.000105)。该图示出了所进行的两个不同实验的平均值和平均值的标准误差，所述实验用于分析治疗性载体在转导健康供体的来自脐带血的CD34⁺并将其移植到NSG小鼠中之后的体内安全性和毒性作用。D，天；_PGK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

图20.移植有用PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*治疗性载体或PGK.EGFP.Wpre*对照载体转导的健康供体CD34⁺细胞的NSG小鼠中的血液学参数的确定：a)红细胞、b)白细胞、c)血小板和d)中性粒细胞。使用曼惠特尼检验确定统计学显著性(P值；*≤0.05；**≤0.01；***≤0.001；****≤0.000105)。该图示出了所进行的两个不同实验的平均值和平均值的标准误差，所述实验用于分析治疗性载体在转导健康供体的来自脐带血的CD34⁺并将其移植到NSG小鼠中之后的体内安全性和毒性作用。D，天数；PGK EGFP：PGK.EGFP.Wpre*对照载体；PGK CoRPS19：PGK.CoRPS19.Wpre*载体；EF CoRPS19：EF1α(s).CoRPS19.Wpre*载体。

发明内容

一般定义

必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。此外，除非另外指出，否则应将一系列要素之前的术语“至少”理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文中所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被本发明涵盖。

术语“约”在本文中用于意指大约、大致、大概或在……的区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界扩展到所示数值之上和之下来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将高于和低于所述值的数值向上或向下(较高或较低)修改10％的变化。

本文中使用的在多个所引用要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项二者。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一选项是指第一要素在没有第二要素的情况下的适用性。第二选项是指第二要素在没有第一要素的情况下的适用性。第三选项是指第一要素和第二要素一起的适用性。这些选项中的任何一者都被理解为落入该含义内，并且因此满足本文中使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时适用也被理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

在整个本说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”及其变化形式将被理解为暗指包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时可用术语“具有”代替。任何前述术语(包含、含有、包括、具有)，本文中无论何时在本发明的一个方面或实施方案的上下文中使用时，都可用术语“由……组成”代替，尽管不太优选。

当本文中使用“由……组成”时，排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。

“基本上由”蛋白质或核苷酸“组成”的蛋白质或核苷酸是与特定蛋白质或核苷酸具有相当相同的氨基酸或核苷酸序列的蛋白质或核苷酸。

分别与蛋白质或核苷酸具有“基本上相同的氨基酸或核苷酸序列”的蛋白质或核苷酸通常与该蛋白质或核苷酸具有超过90％的氨基酸或核苷酸同一性。该定义中包括保守氨基酸替换。

出于本发明的目的，术语“分离的”指已从其原始环境(其天然存在的环境)中移出的生物物质(细胞、多肽、多核苷酸或者其片段、变体或衍生物)。

本文中使用的“富集”意指相对于包含在组合物中的总细胞，特定细胞群例如CD34⁺细胞的纯度或百分比提高至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。用于富集特定细胞群的方法是本领域已知的，例如，通过使用特定试剂盒，所述特定试剂盒使用阴性或阳性选择。

“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指单链形式或双链螺旋中的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)或其任何磷酸酯类似物(例如硫代磷酸酯和硫代酯)的磷酸酯聚合形式。术语核酸分子，并且特别是DNA或RNA分子，仅是指分子的一级和二级结构，并且不将其限制于任何特定的三级形式。因此，该术语尤其包括线性或环状DNA分子(例如限制性片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中存在的双链DNA。

“密码子优化”在本文中是指通过用更传统的稳定密码子替换野生型代表密码子来增强表达，以使获得功能性和活性蛋白质的机会最大化。

“编码区”或“编码序列”是由可翻译成氨基酸的密码子组成的多核苷酸的一部分。

本文中使用的“启动子”涵盖指导RNA聚合酶结合并由此促进RNA合成的DNA序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的，意味着在广泛范围的细胞、组织和物种中具有活性或者细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子序列可以由不同的启动子片段(不同的或相同的片段)构成，这些片段紧密地位于DNA序列中并且可通过接头或间隔子分开。这样的启动子称为嵌合启动子。

本文中使用的“增强子”涵盖刺激或抑制邻近基因转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也称为“沉默子”。增强子可从距离编码序列和转录区域下游位置多至数千碱基对(kilobase pair，kb)内以任一方向发挥功能(即，可与编码序列相关联)。

术语“下游”是指位于一个或更多个参考核苷酸序列的3′的核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列涉及转录起始点之后的序列。

术语“上游”是指位于参考核苷酸序列的5′的核苷酸序列。在某些实施方案中，上游核苷酸序列涉及位于核苷酸区域的5′区的序列。

本文中使用的术语“基因调节区”或“调节区”是指位于编码区上游(5′序列)、之内或下游(3′序列)的核苷酸序列，并且其影响相关联编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译。调节区可包含启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。如果编码区旨在在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列将通常位于编码序列的3′。

术语“转录后调节元件”是指转录时产生增强或抑制蛋白质表达的三级结构的DNA序列。

“转录控制序列”是指DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。

本申请中使用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(therapy)”是指旨在治愈和/或减轻疾病和/或症状并且目的是解决健康问题的一组卫生的、药理学的、外科的和/或物理的的手段。术语“治疗(treatment)”和“治疗(therapy)”包括预防性和治愈性方法，因为二者都涉及维持和/或重建个体或动物的健康。无论症状、疾病和残疾的起源如何，施用合适的药物以减轻和/或治愈健康问题都应当被解释为本申请上下文中的治疗(treatment)或治疗(therapy)的形式。

术语“治疗有效量”是指具有治疗作用并且能够治疗DBA的物质的量。

术语“个体”、“患者”或“对象”在本申请中可互换使用并且不意味着以任何方式进行限制。“个体”、“患者”或“对象”可以是任何年龄、性别和身体状况。

本文中使用的术语“宿主细胞”是指已经用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件，例如温度、pH等，是先前在选择用于表达的宿主细胞的情况下使用的那些条件，并且对于本领域技术人员来说将是明显的。应当理解，术语“宿主细胞”是指原始转导的、感染的、转染的或转化的细胞及其后代。

本文中使用的“可药用载体”或“可药用稀释剂”意指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且不限制本发明的范围，包括：另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；生物可降解的聚合物，例如聚酯；成盐反离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(cyclitol)(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮。

本文中使用的短语“有此需要的对象”包括将受益于本文中提供的多核苷酸分子、多肽或载体的施用的对象，例如哺乳动物对象，例如，以纠正遗传缺陷、纠正蛋白质功能缺陷或改善稳态。

本文中使用的关于核苷酸序列的术语“经优化的”是指编码多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已被突变以增强该多核苷酸序列的特性。

术语“慢病毒”是指可感染人细胞并在人细胞中复制、在人和其他哺乳动物物种中引起疾病的逆转录病毒属。“载体”是可用于人工携带外来遗传物质到细胞中的任何载剂。因此，“慢病毒载体”是指携带多核苷酸到细胞中的重组慢病毒。除非另有要求的情况下，否则该术语覆盖所有亚型以及天然存在和重组形式二者。术语“LV”是慢病毒的缩写并且可用于是指病毒本身或其衍生物。

本文中使用的术语“基因”或“编码序列”是指在体外或体内编码基因产物的核苷酸序列。在一些情况下，基因由编码序列组成或基本上由编码序列组成，所述编码序列即编码基因产物的序列。

本文中使用的“转录单元”意指包含在本发明的LV载体中的核苷酸序列，其从5′至3′包含：磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或延伸因子1α(Elongation factor 1alpha，EF1α)的短形式(EF1α(s))，编码RPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(CoRPS19)，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatoryelement，Wpre)、优选突变的Wpre，以及至少多腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信号序列；其中磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或延伸因子1α(EF1α)、Wpre和多腺苷酸化(polyA)信号序列与CoRPS19可操作地连接并调节CoRPS19的表达。

描述

如上所述，DBA患者通常是RPS19基因单倍体不足的。这意味着，尽管RPS19基因的等位基因之一不受影响且有功能，但RPS19蛋白的表达不足，这最终导致核糖体功能障碍和疾病的发生。

先前的研究已使用基因治疗(gene therapy，GT)以尝试通过使用慢病毒载体(LV)来纠正RPS19蛋白的表达，其中将RPS19基因置于强病毒启动子的控制下，目的是获得较高的RPS19蛋白表达水平。然而，尽管已知人启动子例如PGK或EF1α比强病毒启动子更安全，但PGK或EF1α不足够强以在其中需要大量蛋白质(RPS19)的特定疾病(例如常染色体显性病症，即DBA)的背景下驱动所述蛋白质的表达。

本发明的作者在本文中表明，包含人启动子的慢病毒载体能够表达足够量的RPS19蛋白以纠正核糖体生物发生的改变。特别地，已经开发了两种自失活慢病毒载体(self-inactivating lentiviral vector，SIN-LV)，其具有两种不同的人启动子：磷酸甘油酸激酶(PGK)和延伸因子1α的短形式(EF1α(s))启动子。如图7中所示，两种LV都能够表达经密码子优化的RPS19蛋白(称为CoRPS19)并纠正其中RPS19基因的表达已被干扰RNA沉默的K562细胞系的核糖体生物发生的改变。本文中还显示出，在来自缺乏RPS19的患者骨髓的CD34⁺细胞中，与用携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的非治疗性载体转导的对照组相比，这些LV载体的粒细胞巨噬细胞集落(CFU-GM)的数目和红系集落(BFU-E)的数目分别提高1.5倍和3.9倍。因此，出乎意料地发现，即使人PGK启动子仅能够使RPS19的表达提高1.5倍，但这种提高被证明足以在严重的DBA模型中实现核糖体生物发生的校正；K562细胞系中RPS19的表达几乎完全消除。

另外，治疗性载体逆转了来自DBA患者的红系祖细胞的特征性红系分化缺陷，使成熟CD71^-/CD235a⁺红系细胞的产生提高了2.5倍。同样，本文中还显示出，这些祖细胞的转导保留了免疫缺陷NSG小鼠中这些细胞的再群体化能力，表明DBA患者的造血干细胞的这种能力没有受到严重影响。毒性研究显示，优化形式的RPS19基因在来自健康供体的细胞中的过表达是无毒性的。

总之，这些结果为使用这些LV载体用于DBA治疗开辟了道路，因为它们表明了在患有这种疾病的患者中纠正RPS19蛋白表达缺陷的可行性。特别地，这些结果显示出在PGK启动子控制下表达RPS19蛋白的慢病毒载体在治疗DBA中的潜在用途。

因此，在第一方面中，本发明提供了包含多核苷酸的慢病毒载体(LV)，其中所述多核苷酸的特征在于其包含转录单元，其中所述转录单元在本文中被限定为从5′至3′包含：选自磷酸甘油酸激酶(下文称为PGK)启动子或延伸因子1α(下文称为EF1α)启动子或其功能变体的启动子，编码人RPS19蛋白的核苷酸序列、优选编码人RPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列(下文称为CoRPS19)、或其功能变体，和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(下文称为Wpre)、优选突变的Wpre、或其功能变体；其中PGK或EF1α启动子和Wpre与RPS19或CoRPS19可操作地连接并调节RPS19或CoRPS19的表达。当将编码序列和基因表达控制序列以使编码序列的表达或转录和/或翻译置于基因表达控制序列的影响或控制之下的这样的方式连接时，称它们是可操作地连接的。例如，PGK或EF1α启动子和Wpre与编码CoRPS19蛋白的核苷酸序列可操作地连接，使得CoRPS19的表达水平受到启动子之一和Wpre的调节。

在一个实施方案中，根据第一方面的LV载体中包含的多核苷酸还包含一个或更多个慢病毒骨架元件，其被限定为编码LV执行其功能(感染细胞并整合到病毒基因组中以在细胞中持续存在)所必需的蛋白质的多核苷酸以及编码LV执行其功能所必需的调节序列的多核苷酸。

因此，第一方面的LV载体包含多核苷酸，其中所述多核苷酸的特征在于其包含1)转录单元和2)一个或更多个LV载体骨架元件或其组合。以下详细表征了这两种组分及其多核苷酸中的每种：

1)转录单元

如上文所限定，转录单元在本文中是指本发明的LV载体的多核苷酸中包含的多核苷酸序列，其从5′至3′包含：选自PGK或E1Fα的启动子，编码RPS19蛋白的核苷酸序列、优选CoRPS19，和Wpre元件、优选突变的Wpre，其中PGK或E1Fα启动子和Wpre与RPS19或CoRPS19可操作地连接并调节RPS19或CoRPS19的表达。

●启动子

如上所述，转录单元中包含的启动子选自PGK或E1Fα启动子。在慢病毒载体基因组整合到靶细胞中之后，所述启动子引起RPS19，优选CoRPS19的表达。

在一些实施方案中，慢病毒载体中的启动子在靶细胞中选择性增强RPS19，优选CoRPS19蛋白的表达。在一些实施方案中，慢病毒载体中包含的多核苷酸分子稳定整合到靶细胞或靶组织的基因组中，例如，造血干细胞和祖细胞的基因组中。

在一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体的多核苷酸中包含的启动子是PGK启动子。在一个实施方案中，PGK启动子是人PGK启动子。优选地，所述PGK启动子包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：10或者与SEQ ID NO：10在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，PGK启动子包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：10。

在一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体的多核苷酸中包含的启动子是E1Fα启动子。在一个优选的实施方案中，E1Fα启动子是Shubhranshu et al.2017中描述的E1Fα启动子的短形式(Shubhranshu et al.，Lentiviral Vectors with Cellular PromotersCorrect Anemia and Lethal Bone Marrow Failure in a Mouse Model for Diamond-Blackfan Anemia，Molecular Therapy，Volume 25，Issue 8，2017，Pages 1805-1814，ISSN1525-0016，https：//doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.04.002)。在一个实施方案中，E1Fα启动子是人E1Fα启动子。优选地，所述短E1Fα启动子包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：11或者与SEQ ID NO：11在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，短E1Fα启动子包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：11。

●编码RPS19蛋白的核苷酸序列，优选编码经密码子优化的RPS19蛋白的核苷酸序列(CoRPS19)。

本文中提供的慢病毒载体在转录单元中包含编码人RPS19蛋白或其功能片段的核苷酸序列。优选地，转录单元包含经密码子优化形式的人RPS19基因(下文称为CoRPS19)。在一个实施方案中，RPS19或CoRPS19与至少一个、优选两个包含启动子和转录后元件的表达控制序列可操作地连接。在一些实施方案中，本发明提供了包含分离的多核苷酸分子的慢病毒载体，所述分离的多核苷酸分子包含编码与RPS19具有相似活性的多肽的核苷酸序列。

优选地，所述编码CoRPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：12或者与SEQ ID NO：12在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码CoRPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：12。

●WHV(土拨鼠肝炎病毒)转录后调节元件(Wpre)

本文中提供的慢病毒载体还在转录单元中包含至少一个与编码RPS19，优选CoRPS19蛋白的核苷酸可操作地连接的转录后调节元件。在一个实施方案中，所述转录后调节元件是WHV(土拨鼠肝炎病毒)转录后调节元件(Wpre)。在一个实施方案中，转录后调节元件被突变(也称为Wpre*)以提高载体的安全性。在一个优选的实施方案中，突变的Wpre包含基因X框架中的突变。

在一个优选的实施方案中，包含WHV(土拨鼠肝炎病毒)转录后调节元件(Wpre)的核苷酸序列是突变的Wpre元件。优选地，包含突变的Wpre的所述核苷酸包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：13或者与SEQ ID NO：13在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含突变的Wpre的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：13。

应当理解，上文针对转录单元的不同元件(PGK或E1Fα启动子，编码RPS19、优选CoRPS19蛋白的核苷酸序列，和Wpre元件、优选Wpre*)描述的所有实施方案可彼此组合。

在一个优选的实施方案中，慢病毒载体的多核苷酸中包含的转录单元由以下组成：选自磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或延伸因子1α(EF1α)启动子的启动子、编码RPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列、和突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)，其中启动子和Wpre元件与编码RPS19蛋白的核苷酸序列可操作地连接并调节其表达。

在一个优选的实施方案中，慢病毒载体的多核苷酸中包含的转录单元由以下组成：与SEQ ID NO：10在全长上具有至少95％序列同一性的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；与SEQ ID NO：12在全长上具有至少95％、优选98％序列同一性的编码CoRPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列；以及与SEQ ID NO：13在全长上具有至少95％、优选98％序列同一性的突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)；其中PGK启动子和突变的Wpre元件与编码CoRPS19蛋白的核苷酸序列可操作地连接并调节其表达。

在一个优选的实施方案中，慢病毒载体的多核苷酸中包含的转录单元由以下组成：与SEQ ID NO：11在全长上具有至少95％序列同一性的延伸因子1α(EF1α)启动子；与SEQID NO：12在全长上具有至少95％、优选98％序列同一性的编码CoRPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列；以及与SEQ ID NO：13在全长上具有至少95％、优选98％序列同一性的突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)；其中EF1α启动子和突变的Wpre元件与编码CoRPS19蛋白的核苷酸序列可操作地连接并调节其表达。

2)慢病毒载体骨架元件

如上所述，慢病毒载体骨架元件被限定为LV执行其功能(感染细胞并整合到病毒基因组中以在细胞中持续存在)所需的多核苷酸序列。

慢病毒包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、绵羊山羊(ovinecaprine)慢病毒组和灵长类慢病毒组的成员。在一些实施方案中，基因递送载体是自限性LV。

在一些实施方案中，本文中提供的慢病毒载体是“第三代”慢病毒载体。本文中使用的术语“第三代”慢病毒载体是指具有第二代载体系统的特征并且还缺乏功能性tat基因的慢病毒包装系统，例如其中tat基因已缺失或失活的慢病毒包装系统。通常，编码rev的基因在单独的表达构建体上提供。本文中使用的“第二代”慢病毒载体系统是指缺乏功能性辅助基因的慢病毒包装系统，例如其中辅助基因vif、vpr、vpu和nef已缺失或失活的慢病毒包装系统。本文中使用的“包装系统”是指包含编码参与包装重组病毒的病毒蛋白质的基因的一组病毒构建体。通常，包装系统的构建体最终将被并入到包装细胞中。

在一些实施方案中，本文中提供的第三代慢病毒载体是自失活慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是VSV.G假型慢病毒载体。

在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染分裂和非分裂细胞的重组慢病毒的载体。在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染造血干细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、造血CD34⁺细胞和CD34⁺群体内的任何簇分化亚群的载体。慢病毒基因组和前病毒DNA通常具有存在于逆转录病毒中的三种基因：gag、pol和env，其侧翼为两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；以及env基因编码病毒包膜糖蛋白。5′和3′LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所必需的所有其他顺式作用序列。在一些实施方案中，慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、net和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。

在某些实施方案中，慢病毒载体缺失了HIV毒力基因env、vif、vpr、vpu和nef，但不损害载体转导分裂和非分裂细胞的能力。

在某些实施方案中，基因转移盒包含一种或更多种另外的元件，例如选自以下的一种或更多种元件：5′LTR、引物结合位点、DNA瓣中央多嘌呤束、Rev响应元件、编码序列(例如截短的gag序列)、包装信号、3′LTR和/或PolyA信号。

如上文所限定，本文中提供的慢病毒载体包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含先前限定的转录单元。在一个实施方案中，慢病毒载体中包含的所述多核苷酸还在上游即在如上文限定的转录单元的5′区域处，并且以5′至3′的顺序，包含以下多核苷酸序列中的至少一种或更多种：a)5′长末端重复(5′LTR)，其继而包含嵌合巨细胞病毒(chimericcytomegalovirus，CMV)启动子，b)引物结合位点(primer binding site，PBS)，c)psi(Ψ)包装信号，d)Rev响应元件(RRE)，和e)DNA瓣中央多嘌呤束(central polypurine tract，cPPT)，或其任意组合。

在另一个实施方案中，慢病毒载体中包含的所述多核苷酸还在下游即在如上文限定的转录单元的3′区域处，包含i)3′长末端重复(LTR)和，任选地j)位于3′LTR之后的多腺苷酸化(PolyA)信号序列。在一些实施方案中，慢病毒载体包含5′和/或3′LTR的U3区缺失。LTR的U3区缺失可以是完全缺失或部分缺失。野生型LTR的U3序列的缺乏涉及慢病毒载体构建体是Tat非依赖性的，并且因此其将在第三代中产生。

应当理解，核苷酸a)至e)以及i)和j)的任何可能的组合都包含在本发明中并且与以上部分中描述的转录单元组合。因此，慢病毒载体可仅包含与上文限定的转录单元组合的选自a)至e)以及i)和j)的一种、两种、三种或更多种元件。下文进一步限定了核苷酸a)至e)以及i)和j)中的每一种及其优选实施方案。

5′LTR核苷酸序列在慢病毒载体产生期间负责前病毒转录。在本文中提供的慢病毒载体构建体中，5′LTR包含嵌合形式的CMV启动子或由嵌合形式的CMV启动子组成。另外，在本文中提供的慢病毒载体构建体中，5′LTR还可包含野生型HIV-15′LTR的一部分，命名为RU5。在一个优选的实施方案中，5′LTR包含以下或由以下组成：嵌合形式的CMV启动子、和野生型HIV-15′LTR的一部分(称为RU5元件)。嵌合CMV启动子在慢病毒载体产生期间引起前病毒的转录。在一个实施方案中，嵌合CMV启动子包含以下或由以下组成：CMV增强子(下文称为CMV增强子)和CMV启动子(下文称为CMV启动子)。

在一个优选的实施方案中，包含CMV增强子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：3或者与SEQ ID NO：3在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含CMV增强子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：3。

在一个优选的实施方案中，包含CMV启动子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：4或者与SEQ ID NO：4在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含CMV启动子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：4。

在一个优选的实施方案中，包含嵌合CMV启动子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：2或者与SEQ ID NO：2在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含嵌合CMV启动子的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：2。

如上所述，5′LTR核苷酸还包含含有RU5元件的核苷酸序列。该序列对于前病毒基因组的逆转录和整合到转导细胞中是必需的。在一个优选的实施方案中，包含RU5元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：5或者与SEQ ID NO：5在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含RU5元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：5。

在一个优选的实施方案中，包含5′LTR的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：1或者与SEQ ID NO：1在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含5′LTR的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：1。

紧邻5′LTR可存在以下所必需的序列：基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Ψ位点)。衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所必需的序列可从病毒基因组中缺失，顺式缺陷阻止了基因组RNA的衣壳化。然而，所得突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白质的合成。

在一个实施方案中，5′LTR下游是基因组逆转录所必需的序列，其是tRNA引物结合位点(下文称为PBS或PBS SL23)。因此，在一个实施方案中，5′LTR核苷酸的下游是引物结合位点SL123核苷酸。在该PBS元件中，在靶细胞转导之后和整合到细胞基因组中之前，在前病毒基因组的逆转录期间，tRNA与PBS元件合并。在一个优选的实施方案中，包含PBS SL123的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：6或者与SEQ ID NO：6在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94/、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含PBS SL123的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：6。

在一些实施方案中，本文中提供的慢病毒载体包含至少psi(Ψ)包装信号，也称为Ψ位点，用于将病毒RNA有效封装到颗粒中。psi(Ψ)包装信号可位于PBS SL123的下游。在一个优选的实施方案中，包含psi(Ψ)包装信号的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：7或者与SEQ ID NO：7在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含psi(Ψ)包装信号的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：7。

本文中提供的慢病毒载体可包含包装信号(Ψ)，其参与将逆转录病毒基因组包装到病毒衣壳中，如上文所限定。认为LV载体在该区域需要约300bp的Gag基因。目前，该Gag序列已减少至仅40bp。因此，在一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体还包含编码截短的Gag蛋白的核苷酸序列，其位于psi(Ψ)包装信号的下游。

在一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体还包含Rev响应元件(下文称为RRE)，其将与慢病毒载体转录物中的该序列融合以帮助在慢病毒载体产生期间前病毒的核输出。在一个实施方案中，RRE元件位于psi(Ψ)包装信号的下游。在一个优选的实施方案中，包含RRE元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：8或者与SEQ ID NO：8在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含RRE元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：8。

在一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体还包含中央多嘌呤束(以下称为cPPT)，其在转导靶细胞之后在慢病毒载体逆转录期间充当正DNA链转录的引物。cPPT还提高前病毒DNA核输入，并且因此提高慢病毒载体转导效力。此外，其提高了慢病毒载体滴度(title)。在一个实施方案中，cPPT元件位于RRE元件的下游。在一个优选的实施方案中，包含cPPT元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：9或者与SEQ ID NO：9在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含RRE元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：9。

上文限定的骨架元件可存在于转录单元的上游(即，朝向慢病毒载体中包含的多核苷酸的5′区域)。然而，本文中提供的慢病毒载体还可在转录单元下游(即，朝向慢病毒载体中包含的多核苷酸的3′区域)具有其他骨架元件。在一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体中包含的多核苷酸还包含3′LTR和任选地多腺苷酸化(polyA)信号序列。3′LTR参与慢病毒载体产生期间mRNA的多腺苷酸化。在一个实施方案中，整合的病毒基因组将包含病毒启动子区(U3)的缺失，导致转导细胞中潜在可包装病毒基因组的无转录活性。

在一个实施方案中，3′LTR包含截短的U3元件。在一个实施方案中，3′LTR包含来自野生型HIV-1的元件R和U5。在一个实施方案中，3′LTR包含多腺苷酸化信号序列。在一个优选的实施方案中，3′LTR包含以下或由以下组成：截短的U3元件(下文称为ΔU3元件)以及来自野生型HIV-1的元件R和U5(下文称为RU5元件)。

在一个优选的实施方案中，包含3′LTR核苷酸中包含的ΔU3元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：15或者与SEQ ID NO：15在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含ΔU3元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：15。

在一个优选的实施方案中，包含3′LTR核苷酸中包含的RU5元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：16或者与SEQ ID NO：16在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含RU5元件的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：16。

在一个实施方案中，3′LTR下游存在SV40多腺苷酸化信号序列(下文称为PolyA)。在一个实施方案中，polyA信号序列来源于猿猴空泡病毒40病毒。优选地，包含位于3′LTR核苷酸下游的PolyA的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：33或者与SEQ ID NO：33在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含polyA的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：33。

在一个优选的实施方案中，包含3′LTR的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：14或者与SEQ ID NO：14具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，包含3′LTR的核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQID NO：14。

在另一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体包含多核苷酸，其中所述多核苷酸的特征在于其从5′至3′包含：

a)5′长末端重复(5′LTR)，其继而包含嵌合巨细胞病毒启动子，

b)引物结合位点(PBS)，

c)psi(Ψ)包装信号，

d)Rev响应元件(RRE)，

e)DNA瓣中央多嘌呤束(cPPT)，

f)选自磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)或延伸因子α短启动子(EF1α(s))的启动子，

g)编码RPS19蛋白的核苷酸序列，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)

i)3′长末端重复(3′LTR)，

其中5′和3′LTR区已通过LTR的U3区中的全部或部分缺失而使得基本上无转录活性，并且其中f)和h)与g)可操作地连接并调节g)的表达。

b)引物结合位点(PBS)，

c)psi(Ψ)包装信号，

d)Rev响应元件(RRE)，

e)DNA瓣中央多嘌呤束(cPPT)，

f)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，

g)编码RPS19蛋白的核苷酸序列，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)

i)3′长末端重复(3′LTR)，

b)引物结合位点(PBS)，

c)psi(Ψ)包装信号，

d)Rev响应元件(RRE)，

e)DNA瓣中央多嘌呤束(cPPT)，

f)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，

g)编码RPS19蛋白的核苷酸序列，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)

i)3′长末端重复(3′LTR)，和

j)多腺苷酸化(polyA)信号序列，

a)5′长末端重复(5′LTR)，其继而包含嵌合巨细胞病毒启动子，其中5′LTR与SEQID NO：1在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

b)引物结合位点(PBS)，其与SEQ ID NO：6在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

c)psi(Ψ)包装信号，其与SEQ ID NO：7在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

d)Rev响应元件(RRE)，其与SEQ ID NO：8在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

e)DNA瓣中央多嘌呤束(cPPT)，其与SEQ ID NO：9在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

f)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，其与SEQ ID NO：10在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

g)编码RPS19蛋白的核苷酸序列，优选编码CoRPS19蛋白的经密码子优化的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：12在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)，其与SEQ ID NO：13在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，和

i)3′长末端重复(3′LTR)，其与SEQ ID NO：14在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

c)Ψ包装信号，其与SEQ ID NO：7在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)，其与SEQ ID NO：13在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

i)3′长末端重复(3′LTR)，其与SEQ ID NO：14在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，和

j)多腺苷酸化(PolyA)信号序列，其与SEQ ID NO：33在全长上具有至少95％、优选98％、最优选100％的序列同一性，

另外，如本领域普通技术人员将认识到的，多核苷酸盒可任选地包含其他元件，包括但不限于促进克隆的限制性位点和特定基因表达载体的调节元件。

在一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体中包含的全长多核苷酸包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：17(本文也称为PGK.CoRPS19.Wpre*-LV序列)或者与SEQ ID NO：17在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体中包含的全长核苷酸包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：17。

在一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体中包含的全长多核苷酸包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：18(本文也称为EF1α(s).CoRPS19.Wpre*-LV序列)或者与SEQ ID NO：18在全长上具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，本文中提供的慢病毒载体中包含的全长核苷酸包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：18。

在一个实施方案中，病毒颗粒的脂质包衣可包含先前存在于宿主细胞表面上的膜结合多肽。

在一个实施方案中，根据本发明或任何其实施方案的慢病毒载体用于转导人造血干细胞(HSC)，其随后可移植到患有DBA的人中。因此，在第二方面中，本发明涉及宿主细胞(例如，CD34⁺造血细胞)或细胞群，其包含(例如，转导的)如第一方面或任何其实施方案中限定的慢病毒载体。

在另一些实施方案中，细胞是待递送至对象以向该对象提供由第一方面或任何其实施方案的慢病毒载体编码的基因产物的细胞。在一个实施方案中，一种或更多种宿主细胞的基因组完全或部分地包含第一方面或任何其实施方案的慢病毒载体中包含的多核苷酸。在一个实施方案中，一种或更多种宿主细胞的基因组至少包含如上限定的转录单元。在一个实施方案中，一种或更多种宿主细胞在其基因组中完全或部分地包含根据第一方面或任何其实施方案的慢病毒载体的多核苷酸。在某些实施方案中，细胞对于待治疗的对象是自体的或从待治疗的对象获得。在另一些实施方案中，细胞对于待治疗的对象是同种异体的或从除待治疗的对象之外的供体获得。在一些具体实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞。在一些具体实施方案中，细胞是从待用通过本文中公开的基因递送载体转导之后的细胞治疗的对象获得的CD34⁺细胞。在一个具体实施方案中，细胞是从被诊断患有DBA的对象获得的CD34⁺细胞。

在一个优选的实施方案中，细胞富集CD34⁺造血干细胞和祖细胞。在一个优选的实施方案中，细胞富集CD34⁺造血干细胞和祖细胞，其中富集意指至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％或100％的细胞是CD34⁺。在第二方面的一个实施方案中，宿主细胞或细胞群包含富集的CD34⁺造血细胞群或由富集的CD34⁺造血细胞群组成。在一个实施方案中，所述富集的CD34⁺造血干细胞群和祖细胞群在其基因组中包含根据第一方面或任何其实施方案的慢病毒载体。

在另一个实施方案中，宿主细胞还可以是包装细胞，其中LV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中；或者是生产细胞，其中LV载体基因组是稳定维持和包装的。示例性包装和生产细胞来源于SF-9、293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化并制备LV载体。在另一个实施方案中，一种或更多种宿主细胞用于产生病毒基因递送载体。

在一些具体实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞。在一些实施方案中，细胞是血细胞。在一些实施方案中，细胞是红系细胞。在一些实施方案中，细胞是骨髓细胞，例如，谱系耗竭的骨髓细胞。在一些具体实施方案中，细胞是造血干细胞或CD34⁺细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，优选的细胞是CD34⁺造血干细胞。在一些实施方案中，优选的细胞是定向造血红系祖细胞。在第二方面的一个实施方案中，宿主细胞或细胞群是CD34⁺造血干细胞和祖细胞。在一些实施方案中，细胞选自造血干细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、造血CD34⁺细胞、和CD34⁺群体内的任何簇分化亚群。在一个实施方案中，CD34⁺细胞是从骨髓样品获得或收集的。在一些实施方案中，骨髓样品是CD16⁺白细胞耗竭的。在另一个实施方案中，HSC从外周血获得。在一个实施方案中，外周血样品是红细胞耗竭的。在一些实施方案中，血液样品是CD16⁺白细胞耗竭的。CD34⁺细胞的选择方法可以是正选择、负选择或其任意组合。在一些实施方案中，选择可基于这些标志物中任一者的单独或组合的表达：CD34⁺、CD59⁺、CD90/Thy1⁺、CD38^低/-、c-Kit^-/低、CD16⁺和Lin^-。在一些具体实施方案中，优选的细胞是从待用通过本文中公开的基因递送载体转导之后的细胞治疗的对象获得的CD34⁺细胞。在一个具体实施方案中，细胞是从被诊断患有DBA的对象获得的CD34⁺DBA细胞。在另一个实施方案中，一种或更多种宿主细胞可来自已建立的细胞系，或者它们可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，是指来源于对象并允许在体外生长以有限或无限次传代即分裂培养物的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物是可能已传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但次数不足以经历危机阶段的培养物。通常，本发明的原代细胞系在体外维持少于10代。本发明的一些实施方案包括用病毒递送载体转导的哺乳动物细胞(例如CD34⁺细胞)，所述病毒递送载体例如包含人RPS19基因、优选CoRPS19并且优选地在人PGK启动子控制下的LV载体。

在某些实施方案中，当用本文中公开的载体转导细胞时，使细胞与载体接触约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约2小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约36小时、约8小时、约60小时。在一些实施方案中，细胞转导少于60小时、少于48小时、少于36小时或少于24小时。

在第三方面中，本发明涉及分离的核酸，其包含如在第一方面或其实施方案中任一者中所限定的慢病毒载体中含有的多核苷酸。

药物组合物

在第四方面中，本发明提供了药物组合物，其包含如在第一方面中或其实施方案中任一者中所限定的慢病毒载体、根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群、和/或者如在第三方面或其实施方案中任一者中所限定的多核苷酸、以及可药用的载体或稀释剂。优选地，药物组合物包含以下或由以下组成：用根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体转导的富含CD34⁺造血干细胞和祖细胞的细胞群，以及可药用的载体或稀释剂。

在一些实施方案中，使根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群或者第四方面或其实施方案中任一者的药物组合物与根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体接触，或者根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群或者第四方面或其实施方案中任一者的药物组合物用根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体进行转导，无论是体内、体外还是离体。优选地，慢病毒载体的施用是离体的。

如本文中所述的药物组合物还可以包含其他物质。这些物质包括但不限于冷冻保护剂、冻干保护剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂和稳定剂。在一些实施方案中，药物组合物可以是冻干的。在一个优选实施方案中，药物组合物包含盐水溶液。

本文中使用的术语“冷冻保护剂”包括通过优先从慢病毒载体表面排除而为慢病毒载体提供针对冷冻诱导应力的稳定性的试剂。冷冻保护剂还可以在初级和次级干燥以及长期产品储存期间提供保护。冷冻保护剂的非限制性实例包括糖，例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖醇、甘露糖和乳糖；聚合物，例如葡聚糖、羟乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80)；以及氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。通常使用在生物系统中表现出低毒性的冷冻保护剂。

在一个实施方案中，将冻干保护剂添加至本文中所述的药物组合物。本文中使用的术语“冻干保护剂”包括通过提供无定形玻璃状基质并通过经由氢键与慢病毒载体表面结合，替代在干燥过程期间去除的水分子，在冷冻干燥或脱水过程(初级和次级冷冻干燥循环)期间为慢病毒载体提供稳定性的试剂。这有助于使在冻干周期期间的产品降解最小化并提高长期产品稳定性。冻干保护剂的非限制性实例包括糖，例如蔗糖或海藻糖；氨基酸，例如谷氨酸单钠、非结晶甘氨酸或组氨酸；甲基胺，例如甜菜碱；溶致性盐(lyotropicsalt)，例如硫酸镁；多元醇，例如三元或更高元的糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克(pluronic)；及其组合。添加至药物组合物的冻干保护剂的量通常是当药物组合物被冻干时不会导致不可接受的毒株降解量的量。

在一些实施方案中，填充剂包含在药物组合物中。本文中使用的术语“填充剂”包括提供冻干产品的结构而不直接与药物产品相互作用的试剂。除提供药学上精美的块(cake)之外，填充剂还可以在改变塌陷温度、提供冻融保护和增强长期储存中的毒株稳定性方面赋予有用的品质。填充剂的非限制性实例包括甘露糖醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。填充剂可以是结晶的(例如甘氨酸、甘露糖醇或氯化钠)或无定形的(例如葡聚糖、羟乙基淀粉)并且通常以0.5％至10％的量用于制剂中。

另一些可药用载体、赋形剂或稳定剂(例如Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的那些)也可以包含在本文中所述的药物组合物中，前提是它们不会对药物组合物的期望的特征产生有不良影响。本文中使用的“可药用载体”意指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；成盐抗衡离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、环糖醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫基乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮。

药物组合物可制备成用于经口、舌下、经颊、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经结膜、经直肠、经皮、鞘内、表面和/或吸入介导的施用。在一个优选实施方案中，药物组合物可以是适合于静脉内、肌内、经结膜、经皮、腹膜内和/或皮下施用的溶液剂。在另一个实施方案中，药物组合物可以是适合于舌下、经颊和/或吸入介导的施用途径的溶液剂。在一个替代实施方案中，药物组合物可以是适合于鞘内施用的凝胶剂或溶液剂。在一个替代实施方案中，药物组合物可以是适合于吸入介导的施用的气雾剂。在一个优选实施方案中，药物组合物可以制备成用于鞘内施用。

药物组合物还可包含本领域已知的常见赋形剂和载体。对于固体药物组合物，可以使用常规的无毒固体载体，其包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于注射用溶液剂，药物组合物还可包含冷冻保护剂、冻干保护剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂和可药用载体。对于气雾剂施用，药物组合物通常以细碎形式与表面活性剂和抛射剂一起提供。当然，表面活性剂必须是无毒的，并且通常可溶于抛射剂。这样的试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油酯酸(olesteric acid)和油酸)与脂族多元醇或其环状酸酐的酯或偏酯。可以使用混合酯，例如混合或天然甘油酯。根据需要，载体还可以包括例如用于鼻内递送的卵磷脂。对于栓剂，传统的黏合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。在一个优选实施方案中，载体是纳米粒。在一个更优选实施方案中，纳米粒充当载剂以将本发明的慢病毒载体中包含的多核苷酸引入到细胞内部。

因此，适合用于注射的药物组合物可包括缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选的稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在与本文中教导相容的另一些实施方案中，可以将慢病毒载体直接递送至不良细胞群(即肝细胞)的部位，从而提高患病组织对治疗剂的暴露。

本文中提供的慢病毒载体可以任选地与有效治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性)的障碍或病症的其他药剂组合施用。本文中提供的慢病毒载体与辅助治疗结合或组合的施用意指治疗和所公开多肽顺序的、同时的、同延的、同步的、伴随的或同期的施用或施加。

医学用途以及施用的时间表、途径和剂量

在第五方面中，本发明提供了根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体、根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群、根据第三方面或其实施方案中任一者的分离的核酸、或者第四方面或其实施方案中任一者的药物组合物，其用作药物。在第六方面中，本发明提供了根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体、根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群、根据第三方面或其实施方案中任一者的分离的核酸、或者第四方面或其实施方案中任一者的药物组合物，其用于治疗DiamondBlackfan贫血(Diamond Blackfan anemia，DBA)，该用途包括向对象施用所述慢病毒载体、所述宿主细胞或细胞群或者所述组合物。在一个优选实施方案中，慢病毒载体用于治疗Diamond Blackfan贫血(DBA)，所述慢病毒载体包含在全长上与SEQ ID NO：17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸。因此，本公开内容的方法和组合物可用于例如治疗DiamondBlackfan贫血。

本发明还提供了治疗、预防或改善有此需要的对象的DBA病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据第一方面或其实施方案中任一者的慢病毒载体、根据第二方面或其实施方案中任一者的宿主细胞或细胞群、第三方面或其实施方案中任一者的分离的核酸、或者第四方面或其实施方案中任一者的药物组合物。在一些具体实施方案中，该方法用于治疗DBA，并且病毒载体是包含本文中公开的表达构建体的LV，所述表达构建体包含与RPS19基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子，和本文中公开的突变的Wpre。

在另一个实施方案中，本文中提供的慢病毒载体、宿主细胞或细胞群、或者组合物的施用不会在对象中诱导免疫应答或在所述对象中诱导非常低的免疫应答。

在一些实施方案中，本发明的慢病毒载体、宿主细胞或细胞群、或者组合物作为单剂量或多剂量施用。在一些实施方案中，本发明的慢病毒载体、宿主细胞或细胞群、或者组合物的剂量以一次施用或分成多个亚剂量(例如两个亚剂量、三个亚剂量、四个亚剂量、五个亚剂量、六个亚剂量或多于六个亚剂量)施用。在一些实施方案中，施用多于一种慢病毒载体。最优选地，本发明的慢病毒载体、宿主细胞或细胞群、或者组合物作为单剂量施用。

在一些实施方案中，重复施用本发明的慢病毒载体、本发明的宿主细胞或细胞群、或者药物组合物的剂量至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、或至少十次。

本发明的慢病毒载体、本发明的宿主细胞或细胞群、或者药物组合物可以局部或全身施用。在一个实施方案中，慢病毒载体的施用途径是肠胃外的。本文中使用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、经直肠或经阴道施用。在一个实施方案中，所述慢病毒载体可以静脉内、皮下、肌内或通过任何黏膜表面(例如经口、舌下、经颊、经鼻、经直肠、经阴道)或通过肺部途径施用。优选肠胃外施用的静脉内形式。在一个实施方案中，施用的形式将是用于注射的溶液剂，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液剂。

用于治疗DBA的本文中提供的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、对象的生理状态、对象是人还是动物、所施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常地，对象是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。在一个实施方式中，对象包括但不限于患有DBA的个体。在一些实施方案中，对象是儿科对象，而在另一些方面中，对象是成人对象。

本发明的慢病毒载体、宿主细胞或细胞群、或者药物组合物可以连续或以特定的时间间隔施用。单剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。根据疾病的发展或所述慢病毒载体的治愈作用，间隔也可以是不规则的。在转导过程完成之后，可以立即输注经转导细胞。剂量和/或剂量方案的有效量可以容易地由临床前测定、由安全性和递增以及剂量范围试验、个体临床医生-患者关系凭经验确定。可以采用体外或体内测定以确定最佳剂量范围和/或施用的时间表。另外，有效剂量可以从动物模型获得的剂量-响应曲线推断得出。

在一个优选实施方案中，本发明的慢病毒载体、本发明的宿主细胞或细胞群、或者药物组合物以至少1×10⁹个载体基因组/Kg体重，优选1×10¹⁰、1×10¹¹或1×10¹²个载体基因组/Kg体重的剂量施用。更优选地，施用至少或约4.6×10¹²个载体基因组/Kg体重。

通常来说，在DBA患者中实现改变的有效量将为约1×10⁸个载体基因组或更多，在一些情况下为1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²或1×10¹³个载体基因组或更多，在某些情况下，为1×10¹⁴个载体基因组或更多。在一些情况下，递送的载体基因组的量为至多约1×10¹⁵个载体基因组，例如1×10¹⁴个载体基因组或更少，例如1×10¹³、1×10¹²、1×10¹¹、1×10¹⁰或1×10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下为1×10⁸个载体基因组，并且通常不少于1×10⁸个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量为1×10¹⁰至1×10¹¹个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量为1×10¹⁰至3×10¹²个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量为1×10⁹至3×10¹³个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量为1×10⁸至3×10¹⁴个载体基因组。

在一个实施方案中，慢病毒载体可以以以下浓度进行施用：10⁸个载体基因组/ml或更多，例如5×10⁸个载体基因组/mL、10⁹个载体基因组/mL、5×10⁹个载体基因组/mL、10¹⁰个载体基因组/mL、5×10¹⁰个载体基因组/mL、10¹¹个载体基因组/mL、5×10¹¹个载体基因组/mL、10¹²个载体基因组/mL、5×10¹²个载体基因组/mL、10¹³个载体基因组/mL、1.5×10¹³个载体基因组/mL、3×10¹³个载体基因组/mL、5×10¹³个载体基因组/mL、7.5×10¹³个载体基因组/mL、9×10¹³个载体基因组/mL、1×10¹⁴个载体基因组/mL、5×10¹⁴个载体基因组/mL或更多，但通常不超过1×10¹⁵个载体基因组/mL。

在一些情况下，本发明的慢病毒载体、本发明的宿主细胞或细胞群、或者待施用的药物组合物可以使用感染复数(multiplicity of infection，MOI)来测量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸可被递送至的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI可以是1×10⁶。在一些情况下，MOI可以是1×10⁵至1×10⁷。在一些情况下，MOI可以是1×10⁴至1×10⁸。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为至少约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、和1×10¹⁸MOI。在一些实施方案中，该范围为约20至约400MOI。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为1×10⁸至3×10¹⁴MOI。在一些情况下，本公开内容的重组病毒为至多约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³。在一些实施方案中，患者通过输注接受的细胞剂量将是从转导过程获得的剂量。在多个优选实施方案中，将至少至少约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸个或更多个CD34⁺细胞/KG患者体重输注到患者中。在一些实施方案中，将1×10⁶至4×10⁶个CD34⁺细胞/KG患者体重输注到患者中。在另一些实施方案中，将3×10⁵和4×10⁶个CD34⁺细胞/Kg患者体重输注到患者中。

在一些实施方案中，药物组合物的量包含约1×10⁸至约1×10¹⁵个重组病毒、约1×10⁹至约1×10¹⁴个重组病毒、约1×10¹⁰至约1×10¹³个重组病毒或约1×10¹¹至约3×10¹²个重组病毒。

上述范围内的中间剂量也旨在本发明的范围内。

为了在DBA中实现成功的基因治疗，从对象收集“足够”数目的造血干细胞(HSC)是有益的。在本发明的一些实施方案中，HSC是在动员之后从对象获得的。动员可通过用导致干细胞从骨髓移动到血液中的药物或化合物治疗对象来实现。可以收集并储存干细胞。在一些实施方案中，动员通过用G-CSF(非尔司亭(filgrastin))治疗对象来实现。在另一些实施方案中，动员通过用普乐沙福(plerixafor)治疗对象来实现。在另一些实施方案中，动员通过用非尔司亭与普乐沙福的组合治疗对象来实现。

本发明的慢病毒载体、本发明的宿主细胞或细胞群、或者药物组合物的施用剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本文中提供的慢病毒载体的组合物施用于尚未处于疾病状态的对象，以增强对象的抵抗力或使疾病的影响最小化。这样的量被定义为“预防性有效剂量”。在较长的一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些对象可在其余生中继续接受治疗。

在一些实施方案中，提供了其中使细胞与根据本发明的慢病毒、多核苷酸或组合物接触的方法。如上所述，接触可以发生在体外、体内、或离体。另外，本发明包括转导哺乳动物细胞(例如人造血干细胞或本文中所述的另一些细胞)的方法，所述方法包括使细胞与基因递送载体(例如，本文中公开的或包含本文中所述的转录单元的LV载体)接触。在某些实施方案中，细胞先前从待治疗的对象或从另一供体获得。在一些具体实施方案中，对象被诊断为患有DBA，并且细胞用包含编码人RPS19基因或cDNA的表达盒的LV进行转导。应当理解，所公开的方法，例如用于将RPS19基因产物(例如使用RPS19 cDNA序列)递送至对象的那些方法也可用于治疗DBA。在一些具体实施方案中，经转导细胞是从患有DBA的对象获得的细胞群，一旦所述细胞已被转导，则将用所述细胞对所述对象进行治疗。细胞可以从骨髓或血液获得。在某些实施方案中，用药剂治疗患有DBA的对象以动员干细胞，然后从对象获取血液，去除红细胞，并选择CD34⁺细胞。在选择后，然后转导细胞。在一些具体实施方案中，经转导细胞在使用之前被储存或冷冻，而在某些实施方案中，所述细胞在其转导之后立即或不久(例如在一小时、两小时或四小时内)向对象提供。

考虑到本文中公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员来说将是明显的。本说明书和实施例旨在仅被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求书来指示。

实施例

实施例1-材料和方法

1.慢病毒载体构建

已经开发了两种适合于RPS19单倍体不足患者临床使用的治疗性慢病毒载体。这两种载体携带人RPS19基因(在25％的DBA患者中突变)的密码子优化形式。在这些LV中，RPS19的表达由人磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)驱动；在PGK.CoRPS19.Wpre*LV中)，或者由短形式的人延伸因子-1α启动子(EF-1α短o EF1α(s))驱动；在EF1α(s).CoRPS19.Wpre*LV中)。另外，两种载体均含有突变的Wpre序列(Wpre*)，所述序列通过稳定目的蛋白的mRNA来提高其产生(参见图1)。

选择两种不同启动子的原因是其中其能够指导目的转基因表达的强度。一方面，我们具有显示出稳定表达目的基因的PGK启动子。其次，选择EF1α启动子是因为其具有更高活性。

这些载体是自失活的慢病毒载体。它们由这样的慢病毒载体产生，所述慢病毒载体为我们实验室开发的，携带密码子优化形式的PKLR基因，并继而由Dr.Naldini实验室构建和提供的载体pCCL.sin.ppt.hPGK.EGFPY..Wpre*开发(HSRTIGET，San RaffaeleTelethon Institute或Gene Therapy和Vita Salute San Raffaele University MedicalSchool，Milano，Italy)。该载体携带磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。开发PGK.CoRPS19.Wpre*治疗性载体的第一步由以下组成：提取PKLR基因并引入RPS19基因的优化形式，使用限制性靶标Xbal和Sall，其是在设计目的转基因序列期间通过化学合成引入的。

第二治疗性慢病毒载体(EF1α(s).CoRPS19.Wpre*LV)具有以其短形式(EF1α(s))的人延伸因子α(延伸因子1α的EF1α)的启动子作为所述第二治疗性慢病毒载体的差异元件。在这种情况下，为了用EF1α(s)替代PGK启动子，使用p′HR.EF1αS.eGFP.Wpre作为模板载体，通过PCR扩增EF1α(s)序列(由Dr.Adrian Trasher实验室提供；UCL Great OrmondStreet Institute Of Child Health)。为了将EcoRV和Sall限制酶序列靶标引入到用EF1α(s)启动子获得的序列中，将其序列靶标与在所使用的寡核苷酸的3′和5′端处的两个核苷酸碱基(EcoRV-AT和-TC-Sall)一起包含在内。使用Zero克隆试剂盒系统分离并克隆获得的片段。一旦克隆了EF1α(s)启动子，则使用EcoRV和Sall限制酶靶标将其分离，并且克隆之前从第一治疗性载体的骨架中提取PGK启动子，从而生成第二治疗性慢病毒载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*。

因此，在本发明的一个方面中，提出了治疗DBA的基因治疗方法，所述方法由用含有密码子优化的RPS19基因(codon-optimized RPS19 gene，CoRPS19)的自失活慢病毒载体转导的自体CD34⁺富集细胞组成。1)自失活慢病毒载体(self-inactivating lentiviralvector，SIN-LV)提供了更稳健的表达，并且比γ逆转录病毒载体更不易受到转录沉默的影响(Pfeifer et al.2002)。它们还显示出安全的多的整合谱(Mitchell et al.2004；Schroder et al.2002；Wu et al.2003)，并且由于它们在3′LTR序列中携带400个碱基对(base pairs，bp)缺失(Miyoshi et al.1998)，因此转基因表达由内部启动子调节，提高了基于LV的遗传修饰的安全性。

2)载体序列还包括数种修饰，以改善靶细胞中的转基因表达和安全性：

●人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的使用，其已经由其在患者中再输注基因校正的HSC之后在体内稳定且长期表达而表征，并且与基因治疗中使用的另一些启动子相比提高了安全性特性(Biffi et al.2013；Modlich et al.2009；Montini et al.2006)。PGK导致转基因的更多生理性表达和对转录沉默的较低敏感性(Garcon et al.2013；Zychlinskiet al.2008)。

●编码RPS19蛋白的核苷酸序列的密码子优化形式(CoRPS19)以提高转录时mRNA的稳定性。为了优化，已使用软件，提高了GC含量并去除了隐藏的剪接位点，以避免转录沉默，并从而提高转基因表达。CoRPS19优化序列显示出与人RPS19基因具有81％同源性，而蛋白质的氨基酸序列没有变化。

●还包括缺乏任何残留开放阅读框的土拨鼠肝炎病毒(Wpre*)的突变转录后调控元件，以改善治疗基因的表达水平和稳定性。

1.1序列：

1.1.1元件序列

5′LTR或长末端重复(SEQ ID NO：1)：其负责在慢病毒载体产生期间前病毒的转录。在该慢病毒载体构建体中，5′LTR由CMV启动子的嵌合形式和野生型HIV-15′LTR的一部分，RU5构成。野生型5′LTR的U3序列的缺乏涉及该慢病毒载体构建体是Tat-独立的，并因此所述构建体将在第三代中产生。

-嵌合CMV启动子(SEQ ID NO：2)：该序列在慢病毒载体产生期间引导前病毒的转录。其由两种不同的序列构成，一种具有增强子活性，而另一种具有启动子活性。

○CMV增强子(SEQ ID NO：3)：

○CMV启动子(SEQ ID NO：4)：

-RU5：不含RU3的截短5′LTR(SEQ ID NO：5)：该序列对于前病毒基因组的逆转录和整合到转导细胞中是必需的。

PBS SL123(引物结合位点)(SEQ ID NO：6)：在靶细胞转导之后和在整合到细胞基因组中之前，在前病毒基因组的逆转录期间tRNA与PBS元件合并。

Ψ(包装信号)(SEQ ID NO：7)：该元件负责慢病毒载体颗粒的二聚化和包装。

RRE(Rev-响应元件)(SEQ ID NO：8)：ReV将在慢病毒载体转录物中与该序列合并，以帮助在慢病毒载体产生期间前病毒的核输出。

cPPT(中央多嘌呤束，central polypurin tract)(SEQ ID NO：9)：在转导靶细胞之后，在慢病毒载体的逆转录期间，该元件充当正DNA链转录的引物。其还提高了前病毒DNA核输入，并因此提高慢病毒载体转导效力。此外，其还提高了慢病毒载体滴度。

1.1.2.真核内部启动子(一个或另一个)：

-磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)(SEQ ID NO：10)：

-以其短形式的延伸因子1α启动子(EF1α(s))(SEQ ID NO：11)：

密码子优化形式的RPS19(CoRPS19)(SEO ID NO：12)：

突变的Wpre(WHV(±拨鼠肝炎病毒)转录后调节元件)(Wpre*)(SEQ ID NO：13)：由于多腺苷酸化、核RNA输出和蛋白质合成的改善，其提高了经转导细胞中的转基因表达。其包含基因X框架中的突变以提高安全性。

3′LTR：DR3RU5(SEQ ID NO：14)：3′LTR参与慢病毒载体产生期间mRNA的多腺苷酸化。在这种情况下，3′LTR由截短的U3元件和来自野生型HIV-1的元件U5和R构成，是一种自失活的慢病毒载体。整合的病毒基因组将包含病毒启动子区(U3)的缺失，导致经转导细胞中潜在可包装病毒基因组的转录失活。

-ΔU3(SEQ ID NO：15)：

-RU5(SEQ ID NO：16)：

SV40多腺苷酸化(PolyA)信号序列(SEQ ID NO：33)：

1.1.3完整的FASTA载体序列

A)PGK.CoRPS19.Wpre*-LV序列(SEQ ID NO：17)：

B)EF1α(s).CoRPS19.Wpre*-LV序列(SEQ ID NO：18)

2.慢病毒产生

慢病毒是使用以HEK293T系作为包装细胞建立的第三代产生的。产生在150mm皿(p150，Corning)中进行，其中60％至70％的细胞汇合转移CaCl2DNA沉淀法所需的不同质粒。

所使用的质粒由Dr.L.Naldini(HSR-TIGET，Milan，Italy)友情提供，并由PlasmidFactory产生。所使用的质粒为：转移质粒(目的转基因；37μg/p150)、rev质粒(pRSV-REV；9μg/p150)、gag和pol质粒(pMDLg/pRRE；23.5μg/p150)和VSV包膜质粒(pMD2-VSVG；12.3μg/p150)。将质粒与457μl/p150的CaCl2 2.5M和3.2ml/p150的水混合。之后，将3.6ml/p150的HBS 2×(281mM NaCl、100mM HEPES、1.5mM Na2HPO4，pH 7)滴加至混合物以生成Ca2+/DNA沉淀，并将该溶液添加至HEK293T细胞培养物。

在5至6小时之后，除去培养基并添加新鲜的收集培养基(补充有5％HyClone的IMDM)。转染后48小时收获上清液，离心(450g，7分钟)并过滤(0.22μm，PES，Merck)以消除细胞残留。使用超透明管(Beckman-Coulter)通过超速离心(70000g，2小时，20℃；Optima L-100XP Ultracentrifugue，Beckman-Coulter)浓缩上清液。将病毒沉淀物在100至300μL盐水溶液(NaCl 0.9％)中进行重构。通过在HEK293T细胞(在尺寸为24的多孔板上150至180,000个细胞/孔；FALCON)上连续稀释载体(从10-2至10-6)来滴定病毒。在经GFP标记的载体的情况下，转导单位(transducing unit，TU)基于在转导之后48至72小时的流式细胞术测量应用下式进行计算。

3.慢病毒载体滴定

PGK-CoRPS19LV滴定在HEK293T中进行。对于LV滴定，将5×10⁴个细胞接种在24孔板中。在接种之后二十四小时，用培养基中连续稀释的LV转导细胞，并确定第0天的细胞数。在转导之后14天，收集细胞，并使用组织试剂盒(Macherey)按照制造商说明提取基因组DNA(genomic DNA，gDNA)。

通过qPCR确定整合到经转导细胞中的慢病毒载体基因组(VCN)的数目。为了分析慢病毒载体基因组的拷贝，我们使用了针对慢病毒载体的ψ序列设计的引物((SEQ ID NO：19)Fw：5’-CAGGACTCGGCTTGCTGAAG-3’；(SEQ ID NO：20)Rv：5’-TCCGCGGCTTAATACTGACG-3’)和探针((SEQ ID NO：21)5’-GGCACGGGAAGAGGCGAGG-3’)(Thermo FisherScientific)。为了确定内源DNA的量，我们使用了针对人白蛋白基因的引物((SEQ ID NO：22)Fw：5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTG-3’；(SEQ ID NO：23)Rv：

5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’)和探针((SEQ ID NO：24)5’-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3’)(Thermo Fisher Scientific)。我们还使用标准曲线以确定ψLV特定序列的拷贝数和二倍体基因组数/样品，其使我们能够计算LV拷贝数/细胞(VCN＝ψ的拷贝数/二倍体基因组数)。最后，基于该参数，我们采用下式计算LV滴度，其被定义为转导单位数/毫升：

使用含有ψ和人白蛋白序列的DNA片段的系列稀释进行标准曲线外推qPCR数据。所有反应均在7500快速实时PCR系统(Fast Real-Time PCR System)(Applied)中一式两份进行。

4.实验动物

将人CD34⁺细胞移植到非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)免疫缺陷Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(NSG)中。该毒株在NOD/ShiLtJ遗传背景上携带两个突变：一个导致重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，scid)，另一个导致IL2受体共同γ链(IL2rgnull)完全缺失。scid突变发生在Prkdc基因中，编码DNA修复复合物，并在B和T细胞中引发(originate)缺陷。IL2rgnull突变通过多个受体阻止细胞因子信号传导，导致NK细胞功能缺陷。重症免疫缺陷使得小鼠能够通过移植人CD34⁺细胞、患者来源异种移植物或成体干细胞和组织而人源化。

所有实验程序均根据该领域的欧洲和西班牙法规(European and Spanishregulations)进行：欧洲公约ETS 123，其关于用于实验和其他科学目的的脊椎动物哺乳动物的使用和保护，指令2010/63/UE和西班牙法律6/2013以及Real Decreto(R.D.)53/2013，其关于科学研究中动物的保护和使用。

5.动物程序

涉及经遗传修饰的生物体(Genetically Modified Organism)的程序根据适当的以下欧洲和西班牙法规进行：指令2009/41/CE和西班牙法律9/2003和R.D.178/2004。该程序由CIEMAT动物实验伦理委员会根据所有外部和内部生物安全和生物伦理指南批准，并且先前由西班牙政府授权(代码PROEX#070-15#，染色体不稳定罕见疾病的细胞和基因治疗)。

将小鼠在CIEMAT实验动物设施(注册号ES280790000183)下饲养和繁育，在那里根据西班牙实验动物科学协会(Spanish Society for the Laboratory Animal Science，SECAL)和欧洲实验动物科学协会联合会(Federation of European Laboratory AnimalScience Associations，FELASA，Tomworth，United Kingdom)的建议，对所述小鼠进行病原体的常规筛查，并且没有发现病原体。

在受控环境条件下，向小鼠随意提供食物(TEKLAD Global Diet 2918，用25KGyγ射线进行辐照)和水(酸化和高压灭菌的)。在实验方案期间，将小鼠饲养在IIL型微绝缘体独立通风笼中，并且25次空气笼中变化/小时。每个笼中最多饲养6只小鼠。房间照明控制为13/11小时的光/暗周期，并且温度和湿度分别调节在20±2℃和55％±10％。所有房间均存在HEPA空气过滤器。

小鼠在标准饮食(随意的水和食物)下维持，并且所有方案均遵循欧洲和西班牙法律和法规(ETS123欧洲公约，关于用于实验和其他科学目的的脊椎动物哺乳动物的使用和保护；以及西班牙法律RD 53/2013)进行。

6.来自健康供体和DBA患者的人样品

所示结果中使用的人样品是外周血和骨髓，其来自健康供体和来自患有DBA的患者，以及在知情同意下收集的来自健康供体的脐带血。

所有样品均已在“临床前研究以探明在用慢病毒载体的Diamond Blackfan贫血中离体基因治疗方法的效力和安全性(Preclinical studies to demonstrate theefficacy and the safety of an ex vivo gene therapy approach in DiamondBlackfan Anemia with lentiviral vectors)”项目的背景下使用，所述项目由CIBERER-ISCIII-Centro de Investigación Biomédica en Red of Rare Diseases资助，并于2018年5月8日由Jiménez Díaz基金会伦理委员会批准。该评价阐明：

.该研究符合现行法规(皇家法令1090/2015和CAM法令39/94)中确立的要求。

.符合该类研究中机构的标准道德标准。

.遵守SAS指示3470/2009和世界医学协会赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki of the World Medical Association)中制定的道德准则。

在Sysmex XN-1000^TM血液分析仪(Sysmex，Kobe，Japan)上以预稀释模式对120μl外周血或骨髓的来自患有DBA的患者和健康供体的样品进行血液学分析。

7.经LV注射的小鼠中的VCN的确定

在动物处死之后，收集不同的组织(肝、脾、肺、骨髓、淋巴结、脑、睾丸、胰腺和肾)并保存在-80℃下。为了确定整合到这些组织中的LV基因组，用组织试剂盒(Macherey Nagel)按照制造商说明提取基因组DNA。

通过qPCR来确定经注射小鼠组织中整合的慢病毒载体基因组(VCN)数。为了分析整合的前病毒的拷贝数，我们使用了针对慢病毒载体的Ψ序列设计的引物((SEQ ID NO：25)Fw：5’CAGGACTCGGCTTGCTGAAG 3’；(SEQ ID NO：26)Rv：5’TCCCCCGCTTAATACTGACG 3’)和探针((SEQ ID NO：27)5’-CGCACGGCAAGAGGCGAGG-3’)(Thermo FisherScientific)。为了确定内源DNA的量，我们使用了针对小鼠肌联蛋白(titin)基因的引物((SEQ ID NO：28)Fw：5’AAAACGAGCAGTGACGTGAGC 3’；(SEQ ID NO：29)Rv：5’TTCAGTCATGCTGCTAGCGC 3’)和探针((SEQ ID NO：30)5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’)。一旦确定了LV拷贝数和二倍体基因组数/样品，则能计算出VCN(VCN＝ψ的拷贝数/二倍体基因组数)。

使用包含ψ和肌联蛋白序列的DNA片段的系列稀释进行标准曲线。所有反应均在7500快速实时PCR系统(Applied)中一式两份进行。

8.CoRPS19表达的确定

通过Q-PCR进行了经由治疗性载体整合的CoRPS19转基因及其非优化生理形式RPS19的表达的确定。使用RNeasy组织试剂盒(Qiagen GMBH)从细胞中提取RNA，并使用Superscript Vilo试剂盒(Invitrogen SuperScript IV VILO Master Mix，ThermoFisher)进行逆转录过程。一旦获得cDNA，则在7500实时PCR系统(ThermoFisherScientific)上进行表达分析。为了计算内源RPS19基因以及优化形式CoRPS19的表达，使用Livak(2ΔCt)209的相对定量方法的变化形式。为此，首先计算了目的基因(hRPS19和CoRPS19)和参考基因hGAPDH的扩增效率。一旦已假定扩增效率为100％，则使用下式用参考基因(在该情况下为GAPDH)对目的基因的相对表达进行归一化：

RPS19的相对表达＝2^{(CTGAPDH)_(CTRPS19)}

CoRPS19的相对表达＝2^{(CTGAPDH)_(CTCoRPS19)}

表1.用于检测CoRPS19转基因及其野生型RPS19表达的引物和探针的序列。

9.前rRNA处理的Northern印迹和引物延伸分析。

将使用TRI试剂(Invitrogen)提取的5μg总RNA在变性琼脂糖凝胶上解析并进行Northern印迹处理。将Northern印迹暴露于Fuji成像板(Fujifilm)并使用MultiGauge软件(Fujifilm，v 3.1)在磷光成像仪(FLA-7000；Fujifilm)上进行定量。

10.流式细胞术

10.1患有DBA的患者的造血特征

通过流式细胞术使用表2中指定的六个不同的组对患有DBA的患者和健康供体的免疫表型进行分析。添加抗体(在表2中示出)，在4℃下孵育30分钟，并随后用PBA(含0.2％叠氮化钠的PBS(Merck)和1％BSA(Sigma))洗涤。对于第1组和第2组，将外周血样品分别以1∶400和1∶10的比率在PBA中预稀释。在抗体孵育之后，针对组3、4、5和6进行采用氯化铵缓冲液(0.155M NH4Cl、0.01M KHCO3、0.1mM EDTA；室温下孵育10分钟)的裂解步骤，以去除红细胞级分。将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)添加至终浓度为1μg/ml，以鉴定死细胞。用Fortessa LSR(BD Biosciences)获取和记录事件，并通过FlowJo软件(BD，Becton，Dickinson&Company)来分析细胞计数数据。

表2.用于患有DBA的患者和健康供体的免疫表型的抗体组。

10.2多能干细胞分析(Multistem Analysis)

使用表3中所示的抗体组合通过流式细胞术进行DBA患者和健康供体的骨髓中不同造血祖细胞的确定。标记方案与用Fortessa RSL(BD Biosciences)获取的患者和健康供体的样品中的免疫表型确定中使用的方案类似。为了正确评价不同分析，所分析最小细胞的数目为1×10⁶。通过FlowJo软件(BD，Beton，Dickinson&Company)来分析该细胞术结果。

表3.用于确定骨髓中造血祖细胞的抗体组。

10.3红系分化的免疫表型

使用表4中指定的抗体组合通过流式细胞术来分析向红系谱系分化的造血祖细胞的免疫表型。

表4.用于向红系谱系分化的细胞的免疫表型的抗体组。

将细胞稀释至最终体积为100μl，在4℃下标记30分钟，并用PBA洗涤。添加DAPI(1μg/ml最终浓度)并用Fortessa LSR(BD Biosciences)记录事件。通过FlowJo软件(BDBiosciences)对结果进行分析。

11.细胞系培养物

将K562细胞系(慢性髓细胞性白血病；ATCC：CCL-243)在Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)、HyClone(10％；GE Healthcare)和青霉素/链霉素(1％；Gibco)中培养。将细胞维持在浓度为1×10⁵至1×10⁶个细胞/ml。

将HEK293T细胞系(能够复制带有SV40T抗原的载体的人胚胎肾细胞系；ATCC：CRL-3219)在Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)、HyClone(10％；GE Healthcare)和青霉素/链霉素(1％；Gibco)中培养。将细胞维持在浓度为5×10⁵个细胞/ml。

使用的所有细胞系的孵育条件均相同：37℃、5％CO2和95％相对湿度。

12.造血祖细胞和造血干细胞功能测定

CD34⁺细胞从患有DBA的患者和健康供体的外周血和骨髓样品中获得以用于表征和慢病毒校正研究，以及从健康供体的脐带血中获得以用于安全性研究。首先，使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)根据制造商说明对全血或骨髓进行密度梯度。然后收集单核细胞条带并用PBS(Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline，Sigma)(本文称为PBE)；Hyclone2％，GE Healthcare；2mM EDTA进行洗涤。一旦获得单核细胞条带，则使用商业CD34⁺微珠试剂盒(MACS，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)以及柱及QuadroMACS和OctoMACS磁性分离器(Miltenyi Biotech)分离CD34⁺细胞级分。一旦获得CD34⁺细胞，则进行流式细胞术分析以确定样品的纯度。为此，收集等分试样并用抗CD34 PE抗体在4℃下标记30分钟，用PBA洗涤，并用Fortessa LSR(BD Biosciences)分析CD34⁺细胞的百分比，并且通过FlowJo软件(BD，Becton，Dickinson&Company)分析该细胞术数据。

在低氧条件(37℃、5％O2、5％CO2和95％相对湿度)下，将细胞在补充有1％GlutaMAX^TM(Gibco)、1％P/S(Gibco)、100ng/ml hSCF和hFlt3、20ng/ml hTPO和hIL3(全部为EuroBioSciences GmbH)的StemSpam培养基(StemCell Technologies)或X-VIVO 20培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中培养。

人造血祖细胞使用三种不同的方式向红系谱系分化(图11)。第一培养基(第1至7天)是基于补充有以下的StemSpan SFEM I(Stem Cell Technologies)：hSCF(50ng/ml；EuroBioSciences)、hFlt3-配体(16.7ng/ml；EuroBioSciences)、骨形态发生蛋白4(bonemorphogenetic protein 4，BMP-4，6.7ng/ml；Peprotech)、人白介素3(human interleukin3，hIL-3，6.7ng/ml；EuroBioSciences)、人白介素11(hIL-11，6.7ng/ml；EuroBioSciences)和人促红细胞生成素(human erythropoietin，h-EPO，1.3U/ml；Amgen)。在扩增的第7天，将细胞转移至由IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)构成的第二培养基，并且培养直至第14天，所述IMDM补充有谷氨酰胺(补充有IMDM GlutaMAX；Gibco)并富含BSA(1％；Sigma)、胰岛素(0.01mg/ml；Sigma)、人转铁蛋白(0.2mg/ml；Sigma)、β-巯基乙醇(91μM；Gibco)、青霉素/链霉素(1％；Gibco)、脂质混合物1(1×；Sigma)、乙醇胺(0.004％，Sigma)、hSCF(5ng/ml；EuroBioSciences)、hIL-3(6.7ng/ml；EuroBioSciences)、hIL-11(6.7ng/ml；EuroBioSciences)、hEPO(1，3U/ml；Amgen)、胰岛素样生长因子-1(insulin-as growthfactor-1，IGF-1，20ng/ml；PeproTech)和氢化可的松(1μM；Sigma)。在第14天之后并持续2天，将细胞转移至第三培养基，所述培养基也基于补充有以下的IMDM GlutaMAX培养基(Gibco)：BSA(1％；Sigma)、胰岛素(0.01mg/mL；Sigma)、人转铁蛋白(0.2mg/mL；Sigma)、β-巯基乙醇(91μM；Gibco)、青霉素/链霉素(1％；Gibco)、脂质混合物1(1×；Sigma)、乙醇胺(0.004％；Sigma)和hEPO(10U/ml Amgen)。

所有培养基在使用之前均经过0.22μm过滤器过滤。在第3、5、7、10和14天进行细胞的计数和流式细胞术分析。在红系分化期间，将细胞维持在浓度为4×10⁵至4×10⁶个细胞/ml。孵育条件还是37℃、5％CO₂和95％相对湿度。

根据以下方案评价患有DBA的患者中外周血和骨髓中的造血祖细胞的数目：将单个核造血细胞和/或CD34⁺细胞重悬于X-vivo培养基中，并在25mm2培养板中以外周血为3×10⁵个有核细胞/ml且骨髓为5×10⁴个有核细胞/ml的浓度接种在半固体甲基纤维素培养基(StemMACS^TM HSC-CFU，其补充有30％胎牛血清、1％BSA、2mM谷氨酰胺、2-巯基乙醇0，1nM、SCF 50ng/ml、GM-CSF 20ng/ml、G-CSF 20ng/ml、IL-320ng/ml、IL-620ng/ml、EPO 3U/ml；Miltenyi)中。每个重复使用1ml对每个样品进行一式三份重复。在缺氧(37℃、5％O₂和5％C0₂、98％相对湿度)中孵育14天之后，使用相衬Nikon ELWD 0.3倒置显微镜对形成的集落进行计数。结果表示为每10⁵个所接种细胞的集落总数目的平均值。

13.NSG小鼠中人造血细胞的移植

单个核细胞级分从DBA患者和健康供体的骨髓中获得，并使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)根据制造商说明通过密度梯度进行分离。在安全性试验的情况下，使用相同的过程从脐带血中获得MNC。使用商业CD34⁺微珠试剂盒(MACS，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)以及柱及QuadroMACS和OctoMACS磁性分离器(MiltenyiBiotech)通过免疫磁性分离来获得CD34⁺级分。在植入之前，将NSG小鼠用亚清髓性剂量(submyeloablative dose)(1.5Gy)进行辐照，并用2×10⁵个小鼠经纯化的CD34⁺细胞进行移植。我们通过流式细胞术分析了在NSG小鼠中在输注后第30天、第60天和第90天、以及直至第120天的安全性测试的情况下外周血和骨髓中的造血移植物。为了评估人造血移植物的水平，在移植之后第4、8和12周通过股骨骨髓抽吸收获细胞，并用hCD45 APC-Cy7抗体(eBioscience)根据制造商说明进行标记。使用CD45 APC-Cy7(BioLegend)、CD34 APC(BDBiosciences)、CD33 PE(BD Biosciences)、CD19 PE-Cy7和CD3 FITC(BioLegend)根据制造商说明进行多谱系移植分析。配对的荧光染料同种型用作对照。阳性4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)细胞被排除在分析之外。所有流式细胞术分析均在Fortessa LSR(BDBiosciences)上进行，并用FlowJo v7.6.5软件进行分析。为了进行二次移植(secondarytransplantation)，对原代NSG接受者进行麻醉并使其出血以获得血液学结果。一旦麻醉，则通过颈椎脱位将其处死，并从每只小鼠的后腿移出股骨和胫骨。通过灌注各骨获得股骨和胫骨的骨髓。一旦获得骨髓细胞，则通过流式细胞术经由细胞分离来选择人CD45+细胞。一旦被纯化，则将细胞移植回免疫缺陷的经1.5Gy辐照的NSG小鼠中。在移植后30、60、90和120天进行分析。

14.整合位点分析(integration site analysis，ISA)

这些整合的分析在体外扩增14天的细胞以及两个实验中的移植到初级和次级NSG接受体中的细胞二者中进行。该分析我们通过Genewerk进行。通过Genewerk使用的技术是基于S-EPTS/LM-PCR(剪切延伸第一标签选择连接介导的PCR)，其扩增和测序在整合载体DNA侧翼的未知区域。通过声处理使DNA样品破碎成500个碱基对片段，然后使用对整合载体的LTR序列具有特异性的生物素化引物通过PCR进行扩增。在扩增之后，对生物素化产物进行纯化，将产物连接到包含分子标签(条码)的盒中，并用允许使用MiSeq技术(IIIumina，Thermofisher)进行测序的引物进行第二步PCR扩增。对于IS分析，使用了10个最常见的整合位点。

15.统计学分析

用针对Windows的GraphPad Prism 7.0版进行统计学分析。以前的统计学研究使用柱(column)的统计学分析并应用D′Agostino&Pearson正态性检验、Shapiro-Wilk正态性检验和KS正态性检验进行来检查数据是否遵循正态分布。一旦已研究了不同分析中的分布，则应用最合适的检验——曼-惠特尼统计检验、Student t检验和ANOVA检验。当P＜0.05时，则认为差异是显著的。

结果描述于下面的实施例2至4中。

实施例2：来自患有骨髓DBA的患者的骨髓CMH群的表征

由于仍不确定DBA中的HSC数目可在多大程度上能限制这些细胞的收集，正如已经在许多范科尼贫血(Fanconi anemia，FA)患者中观察到的一样，我们首先对来自DBA患者的骨髓(BM)样品进行了表征，将其与健康供体和与FA患者进行了比较。

2.1患有DBA的患者的骨髓HSC群的确定

本研究获得的结果表明，当我们与来自健康供体的样品相比时，在来自患有DBA的患者的骨髓样品中，CD34⁺细胞以及更原始的CD34⁺/CD38^-祖细胞群的水平未降低。这些结果(参见图2)表明，与其中患者的CD34⁺细胞数目显著下降的其他疾病中(例如FA中)发生的情况相反，在患有DBA的患者中获得这些细胞并不构成对在DBA患者中待用于基因治疗试验的临床相关数目的HSC收集的限制。

2.2 DBA患者骨髓中多能干细胞CD34⁺造血祖细胞的分析

尽管MHC群看起来未受到影响，但数项研究描述了患有DBA的患者的红系祖细胞数目减少，并甚至在一些情况下在疾病过程期间出现中性粒细胞减少和血小板减少(Giri etal.2000；Santucci et al.1999；Tsai，Arkin，and Lipton 1989)。为了进一步研究患有DBA的患者的造血祖细胞，分析了中间造血前体细胞群(Doulatov et al.2012)。我们的结果表明，以下这些群中的任一者均未显著减少(参见图3：a)HSC(造血干细胞：Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-)，b)MPP(多能祖细胞：CD34⁺CD38^-Thy-1^-CD45RA^-Flt3⁺CD7^-CD10^-)c)，MLP(多淋巴样祖细胞：CD34⁺CD38^-Thy1^低CD45RA^-Flt3⁺CD7^-/+CD10^-)，d)CMP(共同髓系祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy-1^-CD45RA^-Flt3^-CD7^-CD10^-)，e)MEP(红系和巨核细胞祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy^-1^-CD45RA^-Flt3^-CD7^-CD10^-)和f)GMP(粒细胞-单核细胞祖细胞：CD34⁺CD38⁺Thy-1^-CD45RA⁺Flt3⁺CD7^-CD10^-))。

2.3 DBA患者骨髓中定向造血祖细胞的分析

一旦确定患有DBA的患者骨髓中，CD34⁺细胞的数目没有受到显著影响，则下一个评估点就是通过体外克隆形成测定来评估其功能。多种研究观察到患有DBA的患者的CD34⁺细胞生成红系祖细胞的能力降低(Hamaguchi et al.2003；Iskander et al.2015；Ruggeroand Shimamura 2014)。我们的结果与该观察结果一致(图4)，因为红系祖细胞计数(BFU-E，红系祖细胞爆式集落形成单位)存在极显著降低(图4b)。关于骨髓谱系的祖细胞(CFU-GM，粒细胞-巨噬细胞祖细胞集落形成单位)(图4a)，结果显示与健康供体相比降低，但是比在BFU-E中观察到的明显少得多。

2.4来自患有DBA的患者的HSC的植入和分化潜能的分析

重要的是要考虑到治疗DBA患者的成功基因治疗方案需要植入校正的细胞。因此，我们首先评价了这些细胞在免疫缺陷NSG小鼠中的群体化潜能，如材料和方法部分中详述的。我们的结果表明，虽然在移植之后的前60天期间，来源于患有DBA的患者的骨髓与来源于健康供体的骨髓的细胞之间没有显著性差异，但当我们抵达第90天实验结束时，观察到DBA患者的细胞植入水平显著的降低(图5a)，其可表明这些患者的MHC的长期再群体化能力较低。尽管再群体化潜能在移植后90天显示降低，但分化潜能却没有出现同样的情况。图5b示出了在人CD45⁺细胞内产生的不同谱系的比例，并且表明来自患有DBA的患者与来自健康供体的细胞之间没有显著性差异。这些结果表明，移植的DBA患者的CD34⁺群的分化潜能仍然与健康供体中观察到的相似。

总之，本部分中获得的结果使我们能够预测HSC的收集不应对患有DBA的患者构成显著的限制；原则上，在研究的样品中，CD34⁺CD38^-细胞的含量或属于某些谱系的未成熟祖细胞的含量没有降低。然而，尽管造血祖细胞数目没有降低，但较低的克隆形成潜能(主要在CFU-GM和BFU-E水平下)使我们能够看到该群体的较低红细胞生成潜能。与此同时，应该指出的是，来自患有未经转导DBA的患者的细胞在免疫缺陷小鼠中维持着高的再群体化潜能，这与来自患有FA的患者的细胞不同，在FA患者中观察到高度缺陷的再群体化潜能(Rioet al.2019)。

实施例3：治疗性临床适用的慢病毒载体(LV)的产生：K562细胞系中和来自DBA患者的RPS19单倍体不足的CD34⁺细胞中的效力研究

通过从患有DBA的患者中收集功能性HSC的实际可行性(所述HSC可以使用基因治疗方案进行校正)得到支持，我们决定使用密码子优化形式的RPS19基因，在磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)或其短形式的延伸因子α(EF1α(s))的控制下，开发两种临床适用的慢病毒载体(LV)。

3.1治疗性载体在干扰RPS19的K562细胞系中的功能性分析

首先，检查了通过治疗性载体表达目的转基因的能力，其由优化密码子形式的RPS19基因(CoRPS19；优化密码子RPS19)组成。为此，K562细胞最初用携带两种特定shRNA序列的两种慢病毒载体转导以干扰RPS19表达(LV-THM.shRPS19和pLKO.1-pureTurboGFP^TM TurboGFP^TM shRPS19)，以这种方式产生DBA模型；随后，用治疗性载体校正其中RPS19表达受到影响的这些细胞。

对LV-THM.shRPS19载体的干扰表明其能够以50％至60％的水平沉默RPS19基因的mRNA水平，如在图6a中所示。与此结果一起，在没有干扰但用治疗性载体进行转导的那些对照条件下和在具有干扰并随后用治疗性载体进行校正的条件下二者，在干扰细胞中确定了治疗性载体(转基因CoRPS19)的表达(图6a)。

对第二载体pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19进行了这种相同的研究，确定了较高的干扰能力显示出95％的RPS19基因的mRNA沉默(图6b)。然而，即使具有这种干扰目的基因的能力，但对优化形式CoRPS19的分析显示出与之前实验相同的结果，仅观察到在用治疗性载体转导的条件下CoRPS19序列的表达(图6b)。

3.1.1 RPS19基因干扰并用治疗性载体校正的K562系中核糖体生物发生过程的分析

由于患有Blackfan-Diamond贫血的患者的细胞的特征在于核糖体生物发生过程中的缺陷，因此研究了其中RPS19表达受到干扰的K562细胞中该过程的参与程度。为此，我们继续研究用产生的两种干扰载体转导的K562细胞。同时，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*校正K562干扰细胞时，分析了该作用的可能逆转。

对这些样品的分析揭示了，受干扰的细胞中存在21S前rRNA的积累。干扰载体LV-THM.shRPS19产生的21S前rRNA的积累显著高于在未转导非特异性发夹(乱序(scramble))或未受非特异性发夹(乱序)干扰的对照K562细胞中观察到的积累。当用两种治疗性载体中的任一种转导K562细胞(无论是否受到干扰)时，前21S rRNA的水平显示出与对照条件下观察到的水平类似(图7a)。

当细胞用pLKO.1-pure TurboGFP^TM shRPS19干扰载体干扰时，经干扰细胞中21S/21C前rRNA的积累比细胞用载体LV-THM.shRPS19干扰时观察到的高两倍多。值得注意的是，即使在这些条件下，当用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导细胞时，21S前rRNA水平显示出与对照条件类似的值(图7b)，载体PGK.CoRPS19.Wpre*总是显示出比载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*更显著的恢复。

3.2慢病毒基因治疗在患有DBA的患者的细胞中的效力研究

一旦PGK治疗性载体的功能在细胞系中确定，PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*，下一步是在DBA患者的原代细胞中继续这些研究。这些研究针对不同DBA患者中的骨髓细胞进行。这些实验的目的是：1)评价转导患有DBA的患者的造血祖细胞的可能性，2)确定治疗性载体在造血祖细胞中是否具有毒性，3)评价这些细胞表型逆转的程度，以及4)评估经校正细胞是否能够移植到体内异种移植模型中。

3.2.1用治疗性载体转导的患有DBA的患者的造血祖细胞的克隆潜能(CFC)的分析

为了评估转导对DBA患者的造血祖细胞的作用，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及用对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导来自DBA患者的BM CD34⁺细胞。然后进行克隆形成测定，以检查不同治疗性载体的转导是否改变了CD34⁺细胞的克隆形成潜能。当用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*进行转化时DBA患者的CD34⁺细胞产生的集落数目并未降低的事实指示不存在这些载体介导的毒性(图8)。对形成的集落总数的测定揭示了，与用对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导的细胞相比，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导提高了集落数目，用载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的样品中BFU-E集落数目差异显著(图8b)。

3.2.2在用治疗性载体转导之后DBA患者的造血祖细胞中前病毒拷贝数(VCN)和转导百分比的确定

我们的实验室在原代CD34⁺转导，并且特别是患有骨髓衰竭的患者的细胞的转导方面的经验，使得能够使用转导来自患有DBA的患者的这些细胞的优化的方案。为了确定该方案在DBA患者的造血祖细胞中的效率，通过检测Q-PCR前病毒包装信号(ψ)来确定经转导细胞中整合载体(VCN)的拷贝数。这些分析在液体培养物中CD34⁺转导+扩增的细胞组中持续14天以及在克隆形成测定中获得的单个集落二者中进行。从这些集落中确定转导百分比，定量前病毒呈阳性的集落数目相对于总数目。

转导效率的确定揭示了，77.93％的CFC已被PGK载体CoRPS19.Wpre*转导并且57.79％被载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导，对于PGK载体对照.EGFP.Wpre*为48.85％(图9a)。在液体培养物(图9b)中和收集的集落(图9c)中二者中，慢病毒载体拷贝数的检测表明，在所有条件下每个细胞中存在约两个前病毒的拷贝。每个患者的单独CD34⁺细胞转导的结果列于表5中。

表5.在用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导来自患有DBA的患者的CD34⁺细胞之后获得的结果。

3.2.3转导对患有DBA的患者中造血祖细胞的增殖的作用的分析

这些实验分析了与治疗性载体的互补是否产生了经校正造血祖细胞相对于未经校正造血祖细胞的体外增殖优势。一旦CD34⁺细胞与PGK治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*二者以及与载体对照PGK.EGFP.Wpre*一起，则将其在液体培养物中保存14天。生长曲线分析揭示了随时间推移，用PGK治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*与用载体对照PGK.EGFP.Wpre*转导的造血祖细胞的细胞生长没有显著性差异(图10)。

3.2.4用治疗性载体校正的DBA患者造血祖细胞红系分化的分析

来自患有DBA的患者的细胞红系分化过程显示，红系祖细胞的成熟阶段中的阻断产生了较少的红细胞。因此，分析了与未经校正细胞相比，治疗性载体是否能够逆转红系分化的阻断。

为了确定该过程，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及用对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导来自DBA患者的骨髓来源CD34⁺细胞。在转导之后，将细胞在促进红系分化的培养基中培养，并使用流式细胞术使用作为红系分化过程的特征的先前描述的标志物CD45、CD36、CD71(转铁蛋白受体)和CD235a(糖蛋白A；GPA，glycophorineA)来分析红系分化过程的不同阶段。

使用以下策略进行细胞术分析：在第一次选择中，C36⁺/CD45^-是那些向红系谱系分化的细胞。在细胞组C36⁺/CD45^-中选择两个窗口，其中第一个窗口收集对应于红系祖细胞的事件CD71⁺/CD235a⁺，第二个窗口收集对应于网织红细胞和成熟红细胞的事件CD71^-/CD235a⁺(图11)。

对DBA患者的造血祖细胞中红系分化过程的确定揭示了两个观察结果。与用对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导的条件相比，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的样品具有更高的成熟红细胞百分比(窗口CD71^-/CD235a⁺⁾(图11)。该事实表明，CD71⁺/CD235⁺与CD71^-/CD235*a阶段之间红系祖细胞成熟的阻断通过用治疗性载体进行转导而逆转。

3.3.用治疗性载体转导并移植到免疫缺陷NSG小鼠中的患有DBA的患者的造血祖细胞的血液学表型的分析。

为了研究用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的过程是否影响具有RPS19单倍体不足的患者的CMH再群体化能力，在NSG免疫缺陷小鼠中进行了经转导细胞移植。

3.3.1用治疗性载体转导的患有DBA的患者的CD34⁺骨髓细胞重建潜能的分析

对于这些实验，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导来自DBA患者的CD34⁺细胞，并将其移植到NSG免疫缺陷小鼠中。在第30和60天时，通过股骨穿刺获得骨髓样品，并在第90天宰杀小鼠。

对经移植小鼠的骨髓中人CD45+细胞的百分比+的研究揭示了这些经校正细胞的再群体化能力，在补充治疗性载体的样品与用PGK.EGFP.Wpre*转导的样品之间没有观察到显著性差异，直至移植后第90天(参见图12)。还研究了用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及用载体对照PGK.EGFP.Wpre*校正的造血祖细胞产生不同谱系的能力。图12示出了CD34⁺的多能潜能以及产生髓样细胞(CD33⁺)或b淋巴样细胞(CD19⁺)的能力在所有经转导细胞的组中都是类似的。

3.3.2 NSG小鼠中经转导和经移植的DBA患者细胞中的载体拷贝数分析

通过以下过程来获得先前部分中获得的移植物对应于我们的治疗性经转导细胞的证实。一旦移植后第90天处死小鼠，则通过分选来选择经移植小鼠的人骨髓CD45⁺群(通过流式细胞术选择目的群)。一旦获得已移植的人细胞，则通过Q-PCR来确定VCN(图13)。用治疗性载体转导并移植到NSG小鼠中的患者细胞中的VCN的确定表明，在移植后第90天，观察到治疗性载体的整合水平为：对于载体PGK.CoRPS19.Wpre*，平均约2个拷贝/细胞，对于载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*，一个拷贝/细胞。

实施例4：患有DBA的患者中与HCM基因治疗相关的安全性研究

4.1体外安全性研究

为了进行这样的研究，其使我们能够评价用慢病毒载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*对来自患有DBA的患者的MHC进行转导的安全性，首先进行了对来自健康供体的脐带血的CD34⁺细胞进行转导的实验。

4.1.1用治疗性载体的健康和经转导供体的造血祖细胞的克隆形成分析

为了分析用两种治疗性载体转导对健康供体的造血祖细胞是否显示出毒性作用，用两种治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*或EF1α(s).CoRPS19.Wpre*以及对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导CD34⁺细胞。

对经转导细胞产生的集落数目的确定显示出CFU-GM数目(图14a)在所有载体下类似。然而，与用载体PGK.EGFP.Wpre*转导的细胞相比，在用载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导的细胞中观察到BFU-E的数目显著降低20.32％(图14b)。

4.1.2.来自健康供体的CD34⁺细胞的集落和转导后液体培养物中前病毒的拷贝数和CoRPS19的表达水平的分析。

为了验证不同条件下的转导水平具是相当的，在集落和液体培养物中分析了载体/细胞拷贝数。对先前实验中收集的单独集落进行的VCN/细胞的确定显示出，以值大于0.3拷贝/细胞的集落作为阳性集落，用载体PGK.EGFP.Wpre*的集落的转导效率为85.9％，并且载体PGK.CoRPS19.Wpre*的效力为77.03％。对于载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*，其转导效率为67.83％，这显著低于对照载体PGK.EGFP.Wpre*和治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*所示的转导效率(图1Sa)。

在液体培养物的分析中观察到的平均拷贝数在PGK.EGFP.Wpre*条件下为每个细胞3.40±0.91个拷贝，在PGK.CoRPS19.Wpre*条件下为5.80±1.80个拷贝，以及在EFα(s).CoRPS19.Wpre*条件下为2.00±0.49个拷贝，这显著低于前两个载体中所示的拷贝数(图15b)。

在以下三个实验中，基于用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*转导，以对照PGK.EGFP.Wpre*作为参考，来确定CoRPS19转基因的表达。如可在图1Sc中所见，仅在用治疗性载体转导的细胞中观察到对应于RPS19基因的优化形式的mRNA的表达。另外，每个载体的CoRPS19转基因的表达被确定为整合拷贝数的函数。图15c示出了通过治疗性载体诱导的CoRPS19表达水平是类似的。

4.1.3.来自用治疗性载体和对照载体转导的健康供体的CD34⁺细胞的细胞生长的分析

在这些实验中，我们研究了在用治疗性载体转导之后CD34⁺细胞的生长。为此，培养了经转导的CD34⁺细胞，并在液体培养物中每周一次定量细胞数，持续三周。

如在图16中所示，用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*与用对照PGK.EGFP.Wpre*转导的细胞的生长没有显示出显著性差异。

4.2体内安全性研究

4.2.1.来自用治疗性载体转导的健康供体的CD34⁺细胞的再群体化潜能的分析

为了分析经转导的健康供体MHC的再群体化潜能，将这些细胞移植到免疫缺陷的NSG小鼠中。在移植后30、60、90和120天时，确定移植到初级接受体上的人CD45⁺细胞的比例。同样，来自这些初级接受体的骨髓细胞被移植回到次级接受体中，以研究长期再群体化潜能(次级移植后30和120天)。

如在图17a中所示，不同实验组之间初级接受者的移植物水平没有观察到显著性差异。次级接受体分析揭示了，与用载体PGK.CoRPS19.Wpre*转导的细胞相比，用对照载体PGK.EGFP.Wpre*转导的细胞中在二次移植后第120天时植入水平显著更低。据推测，观察到的显著性差异是由于与用载体PGK.EGFP.Wpre*获得的高异质性相比，用载体PGK.CoRPS19.Wpre*转导的细胞组中结果为同质性，。

与先前的分析一起，对经移植细胞产生的不同谱系进行了量化，没有观察到分化潜能的显著性差异，无论是在初级还是次级接受体中(图17b)。4.2.2.移植有来自用治疗性载体转导的健康供体的CD34⁺细胞的NSG小鼠中的前病毒拷贝数分析

在处死先前实验中的NSG小鼠之后，获得骨髓并确定VCN/细胞，以确定携带治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*和EF1α(s).CoRPS19.Wpre*的前病毒序列的经移植细胞。

如可在图18中所示，VCNVCN/细胞的确定显示出，用对照载体PGK.EGFP..Wpre*转导(2.6±1.87个拷贝)与用载体PGK.CoRPS19.Wpre*(5.9±1.8个拷贝)转导的细胞中检测到的前病毒拷贝数之间的显著性差异，用载体EF1α(s).CoRPS19.Wpre*(5.65±3.67)未观察到这些差异(图18)。

4.2.3.移植有来源于健康供体脐带并用治疗性载体转导的的CD34⁺细胞的NSG小鼠中体重和血液学的分析。

为了评估经移植动物的健康状况，在初级接受体中每30天评价一次经移植NSG小鼠的体重和血液学直至处死之日，以及在次级接受体中在第30天和120天时评价。

对用经转导细胞移植的NSG小鼠的体重确定表明，不同条件之间没有显著性差异，如在图19中所示。

在初级和次级NSG接受体中确定的血液学参数显示，在初级接受体中，在红细胞、血小板、白细胞或中性粒细胞方面，没有显著性差异(图20)。然而，次级接受体的分析显示，在对照组PGK.EGFP.Wpre*与对应于载体PGK.CoRPS19.Wpre*的组之间，红细胞数目和血红蛋白浓度显著略有提高。尽管如此，对应于红系谱系的另一些参数(HCT、MCV)未显示出组间显著性差异。

4.3基因毒性研究：前病毒在来自用载体PGK.CoRPS19.Wpre*转导的健康供体的造血细胞的基因组中整合的分析。

在来自健康供体的CD CD34⁺细胞中进行载体整合位点的分析，所述细胞用治疗性载体PGK.CoRPS19.Wpre*转导，并移植到先前部分中所示的NSG小鼠中。Genewerk对最常见的整合位点进行了分析以评价可能的肿瘤发生或克隆主导事件。该研究在两种样品类型中进行：在移植前在液体培养物中保存的细胞和在经移植小鼠中存在的人CD45⁺细胞。对于分析，每种样品的参考了10个最常见的整合位点(用于确定每种样品前10个的114个基因的列表)。

第一整合位点分析研究用来自NSG小鼠中移植前安全性实验的液体培养样品进行。在这些液体培养物样品中，整合位点的最高贡献对应于4.37％作为第1位，没有显示出克隆优势的迹象。第二分析对经移植的初级和次级接受体中存在的人+细胞进行。对于初级接受体，整合站点分析显示，最高的贡献(highest contribution)占总数的5.009％。对于次级接受体，最高贡献占32.33％。

对常见整合位点(CIS)的分析揭示了10个主要顺式区域的不同组成，其中没有一个与不良事件(例如克隆生长或致癌过程)相关。与此同时，也没有特定整合到附近的基因或涉及其他基因治疗试验(CCND2、LMO2、MDS1/EVI1(MECOM)、MN1)中描述的不良作用。

总之，用PGK.CoRPS19.Wpre*转导的样品，无论是保存在液体培养物中的样品还是移植到NSG小鼠中的样品，均显示出多克隆整合模式，其中在移植到安全性实验3的次级接受体中的两个样品中观察到更强的克隆生长，其中IS(第1)的相对贡献达到32,336％。

Claims

1.慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含多核苷酸，其中所述多核苷酸的特征在于其从5′至3′包含以下核苷酸：

a)5′长末端重复(5′LTR)，所述5′长末端重复继而包含嵌合巨细胞病毒启动子，

b)引物结合位点(PBS)，

c)Ψ包装信号，

d)Rev响应元件(RRE)，

e)DNA瓣中央多嘌呤束(cPPT)，

f)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，

g)编码RPS19蛋白的核苷酸序列，

h)突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)，和

i)3′长末端重复(3′LTR)，

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述人PGK启动子在SEQ ID NO：11全长上具有至少95％，优选98％的序列同一性。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的慢病毒载体，其中所述编码RPS19蛋白的核苷酸序列是经密码子优化的核苷酸序列，所述经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO：12在全长上具有至少95％，优选98％的序列同一性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的慢病毒载体，其中所述突变优化的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Wpre)与SEQ ID NO：13在全长上具有至少95％，优选98％的序列同一性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体中包含的多核苷酸还包含位于3′LTR之后的多腺苷酸化(polyA)信号序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体的全长多核苷酸与SEQ ID NO：17具有至少95％，优选98％的序列同一性。

7.根据权利要求6所述的慢病毒载体，其中与SEQ ID NO：17的序列同一性是100％。

8.细胞群，其用根据权利要求1至7中任一项所限定的慢病毒载体转导。

9.根据权利要求8所述的细胞群，其中所述细胞富集CD34⁺造血干细胞和祖细胞。

10.根据权利要求8和9中任一项所述的细胞群，其中所述细胞对于对象是自体的。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所限定的慢病毒载体或根据权利要求8至10中任一项所限定的细胞群、和可药用载体或稀释剂。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的慢病毒载体、根据权利要求8至10中任一项所述的细胞群、或权利要求11所述的药物组合物，其用作药物。

13.根据权利要求1至7中任一项所述的慢病毒载体、根据权利要求8至10中任一项所述的细胞群、或权利要求11所述的药物组合物，其用于在有此需要的对象中治疗Diamond-Blackfan贫血。

14.根据权利要求6和7中任一项所述的慢病毒载体，其用于在有此需要的对象中治疗Diamond-Blackfan贫血。

15.根据权利要求13和14中任一项所述应用的慢病毒载体，其中所述有此需要的对象是人。