JP7403461B2 - ピルビン酸キナーゼ欠損症を治療するためのpklr送達用レンチウイルスベクター - Google Patents
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Description
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2017年10月16日出願の米国仮特許出願第62/573,037号に対する優先権を主張する。
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルのファイル名は、ROPA_004_01WO_SeqList_ST25.txtである。本テキストファイルは、29KBであり、2018年10月15日に作成され、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
本発明は、ピルビン酸キナーゼ欠損症の遺伝子治療に関する。
ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)は、様々な症候の溶血性貧血をもたらし、新生児期に致命的であり得る、PKLR遺伝子における突然変異によって引き起こされる代謝性単一遺伝子疾患である。PKDの劣性遺伝形質および同種骨髄移植によるその治癒的治療により、遺伝子治療アプローチの開発に理想的なシナリオが提供される。
[本発明1001]
ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)のための発現カセットであって、
(a)プロモーター配列、および
(b)ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列
を5’から3’の順に含むポリヌクレオチド配列を含み、
前記プロモーター配列が、前記ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列に作動可能に連結されており、
前記ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列が、SEQ ID NO:8と少なくとも95%の同一性を共有する、
発現カセット。
[本発明1002]
前記プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、本発明1001の発現カセット。
[本発明1003]
突然変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(wPRE)をさらに含む、本発明1001または本発明1002の発現カセット。
[本発明1004]
前記突然変異したwPREが、SEQ ID NO:24と少なくとも99%の同一性を有する配列を含むキメラwPREである、本発明1003の発現カセット。
[本発明1005]
ポリプリントラクト(PPT)をさらに含む、本発明1001~1004のいずれかの発現カセット。
[本発明1006]
ポリアデニル化(ポリA)シグナル配列をさらに含む、本発明1001~1005のいずれかの発現カセット。
[本発明1007]
SEQ ID NO:26と少なくとも95%の同一性を共有する、本発明1001~1006のいずれかの発現カセット。
[本発明1008]
SEQ ID NO:26と少なくとも99%の同一性を共有する、本発明1007の発現カセット。
[本発明1009]
レンチウイルスベクターである、本発明1001~1008のいずれかの発現カセットを含む組み換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1010]
以下の配列:
(a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
(b)HIV-1ψ配列、
(c)RRE、
(d)cPPT/CTS配列、
(e)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
(f)SEQ ID NO:8と少なくとも99%の同一性を有するヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列、
(g)SEQ ID NO:24と少なくとも100%の同一性を有する突然変異wPRE配列、
(i)修飾3’LTR、
(j)SV40ポリ(A)シグナル、
(k)SV40複製起点(ori)、
(u)CMVエンハンサー配列、および
(v)CMVプロモーター配列
を5’から3’の順に含む、本発明1009の組み換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1011]
治療遺伝子送達ベクターである、本発明1009の組み換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1012]
臨床使用において長期安定性および安全性能力を有する、本発明1011の組み換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1013]
本発明1001~1008のいずれかの発現カセットまたは本発明1009~1012のいずれかの組み換え遺伝子送達ベクターを含む、細胞。
[本発明1014]
造血幹細胞である、本発明1013の細胞。
[本発明1015]
コミットされた造血赤血球前駆細胞である、本発明1014の細胞。
[本発明1016]
薬学的に許容される賦形剤と、本発明1009~1012のいずれかの組み換え遺伝子送達ベクターまたは本発明1013~1015のいずれかの細胞と、を含む、薬学的組成物。
[本発明1017]
ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)の治療または予防を必要とする対象におけるピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)を治療または予防する方法であって、前記対象に本発明1016の薬学的組成物を提供することを含む、方法。
[本発明1018]
前記薬学的組成物が、前記組み換え遺伝子送達ベクターを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記薬学的組成物が、前記細胞を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記細胞が、前記対象に対して自家性である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
赤血球細胞においてヒトPKLR遺伝子を発現させるための方法であって、1つ以上の赤血球細胞を組み換えウイルスベクターの有効量と接触させることを含み、前記ベクターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、コドン最適化PKLR導入遺伝子、および突然変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを含み、前記コドン最適化PKLR導入遺伝子が、SEQ ID NO:8と少なくとも95%の同一性を共有し、前記接触後、PKLRが前記1つ以上の赤血球細胞において検出可能なレベルで発現する、方法。
定義
本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと結合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介することができる巨大分子または巨大分子の結合を指す。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
本開示のいくつかの態様では、真核細胞(複数可)中の導入遺伝子の発現のために、組成物が提供される。いくつかの態様では、真核細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞である。いくつかの態様では、哺乳類細胞は、コミットされた造血赤血球前駆細胞である。
、またはSEQ ID NO:12と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:13と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:14と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:15と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:16と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:17と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:18と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:19と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:20と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:21と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:22と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
、またはSEQ ID NO:23と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
a)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
b)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、および
c)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列。
a)cPPT配列、
b)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
c)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、および
d)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列。
a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
b)cPPT配列、
c)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
d)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、
e)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列、および
f)3’LTR、任意に、修飾3’LTR。
a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
b)cPPT配列、
c)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
d)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、
e)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列、
f)3’LTR、任意に、修飾3’LTR、
g)SV40ポリ(A)シグナル、および
h)SV40複製起点(ori)。
a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
b)cPPT配列、
c)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
d)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、
e)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列、
f)3’LTR、任意に、修飾3’LTR、
g)SV40ポリ(A)シグナル、
h)SV40複製起点(ori)、
i)T7プロモーター、
j)f1 ori、および
k)NeoR/KanR配列。
a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
b)HIV-1ψ配列、
c)RRE、
d)cPPT/CTS配列、
e)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
f)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、
g)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列、
h)dNEFシグナル、
i)3’LTR、任意に、修飾3’LTR、
j)SV40ポリ(A)シグナル、
k)SV40複製起点(ori)、
l)T7プロモーター、
m)f1 ori、
n)NeoR/KanR配列;
o)rrnGターミネーター
p)ori配列、
q)CAP結合部位、
r)lacプロモーター配列、
s)lacプロモーター配列、
t)T3プロモーター配列、
u)CMVエンハンサー配列、および
v)CMVプロモーター配列。
a)5’LTR、任意に、修飾5’LTR、
b)HIV-1ψ配列、
c)RRE、
d)cPPT/CTS配列、
e)PGKプロモーター配列、任意に、ヒトPGKプロモーター配列、
f)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意に、coRPKコード配列またはcDNA配列、
g)任意に、SEQ ID NO:24の配列を含むか、それからなる、突然体wPRE配列、
h)任意に、dNEFシグナル、
i)3’LTR、任意に、修飾3’LTR、
j)SV40ポリ(A)シグナル、
k)SV40複製起点(ori)、
l)T7プロモーター、
m)pUC ori、
u)CMVエンハンサー配列、および
v)CMVプロモーター配列。
本明細書に開示されるように、主題のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターは、本明細書で集合的に「主題の組成物」として称され、動物の細胞内での導入遺伝子の発現における使用を見出す。例えば、主題の組成物は、例えば、遺伝子が細胞の生存率および/または機能に及ぼす効果を決定するための研究で使用され手もよい。別の例として、主題の組成物は、例えば、疾患もしくは障害を治療または予防するために、医薬品で使用されてもよい。したがって、本発明のいくつかの態様では、細胞中の遺伝子の発現のための方法が提供され、本方法は、細胞を本開示の組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、接触は、インビトロまたはエクスビボで生じる。いくつかの実施形態では、接触はインビボで生じ、すなわち、主題の組成物が対象に投与される。
ベクターLV上清の産生LVを、本明細書に記載される通りに生成した。CoRPK配列は、GeneArt(登録商標)ソフトウェアを使用して、配列のGC含量を増加させ、異所性スプライス部位を防止するように設計した。ベクターは、Naldini博士(HSR-TIGET,San Raffaele Telethon Institute,Milano,Italy)から寛大にも提供していただいた、pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-wPRE*構築物を骨格として使用して開発した。元々のpCCLレンチウイルス導入ベクターおよびそのエレメントは、その全体が本明細書に組み込まれる、Dull et al.,J Virol,1998;72(11):8463-8471に記載されている。VSV-GシュードタイプLVのベクターストックを、293T細胞(ATCC:CRL-1573,Rockeville,MD,USA)中の3-プラスミドリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって、前述のように[Follenzi A,et al.(2000).Nat Genet 25:217-222]調製した。感染性LVの力価は、HT1080細胞(ATCC:CCL-121)中でqPCRによって、他で記載されるように決定した[Charrier S,et al.(2005).Gene Ther 12:597-606]。107~108個のウイルス粒子(vp)/mLの力価のLVストックを、慣習的方法に従って得た。
PGK-coRPK治療LVベクターは、遺伝的に修復されたPKDマウスにおける貧血表現型の安定かつ長期的な修復をもたらす。
PGK-coRPK LVのインビボ有効性(図2a)を、PKDマウス(図2b)からの系統枯渇BM細胞(Lin-細胞)の形質導入および移植によって評価した。図2aは、対照ベクター中のEGFP導入遺伝子の発現を調節する(上図)か、または治療ベクター中のcoRPK cDNAの発現を調節する(下図)、ヒトPGKプロモーターを有する、遺伝子治療実験全体で使用されるSIN LVベクターの概略図である。coRPK配列は、ヒトPKLR cDNAと80.4%の相同性およびマウスPklr cDNAと76.5%の相同性を示し、アミノ酸配列に変化はなかった。図2bは、開発されたPGK-coRPK LVベクターの機能性に対処するために実施される遺伝子治療プロトコルの概略図である。PKD表現型の修復は、血液学的分析および代謝プロファイリングを通して、PBおよびBMへの移植後4~9ヶ月間研究した。組み込み分析は、LVベクトルの安全性に対処するために、全てのマウスの異なる組織および時点で実行した。移植後280日目に、coRPK導入遺伝子を担持する一次移植マウスからの総BMを、致死的な放射線を浴びた雌PKDマウス(二次レシピエント)に再度移植して、生着の安定性および安全性を試験した。coRPK LVで形質導入された欠損細胞を移植した、致死的な放射線を浴びたPKDマウスは、移植されていないPKD同腹仔またはEGFP LVで形質導入された細胞を移植したマウスと比較したとき、試験された全ての血液赤血球パラメータに有意な改善を示した(図3および表2)。
(表2)末梢血における移植後140日目に記録された血液学的変数
データは平均値±SEMを表し、クラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定を使用して、EGFP発現マウスと比較することによって、統計的に分析した。*p<0.05;**p<0.01。
データは、平均値±SEMを表し、n.dは、未決定を表す。a 実験1から構築された線形回帰における内挿推定によって得られた推定形質導入比率(X軸:VCN/WBC、Y軸:プロウイルス+CFUの%)。
LV由来のRPK発現は、赤血球分化を正常化して、機能的な成熟赤血球の産生を可能にする。
PKDマウスは、代償性赤血球産生機構によって引き起こされる赤血球区画の特有な拡大を示している(Min-oo et al 2004)。移植したマウスの赤血球分化パターンの研究は、異所性RPK発現がこの機構を回復させることを示した(図7a、b)。PKDおよびEGFP発現マウスは、BMおよび脾臓において未成熟な赤血球前駆細胞(サブ集団I:前赤芽球、およびサブ集団II:好塩基性赤芽球)の優位性、および後期赤血球(集団IV:網状赤血球および成熟赤血球)の顕著な低下を示し、一方、coRPK LVで形質導入された細胞を移植したマウスは、BMおよび脾臓の未成熟赤血球前駆細胞(サブ集団IおよびII)の大幅な低減、および健常なマウスと同等の最新の赤血球区画(サブ集団IV)の大幅な増加を示した(図7a、b)。加えて、PKDおよびEGFP発現マウスとは異なり、coRPK導入遺伝子を担持するマウスは、血漿中のエリスロポエチン(Epo)レベルの大幅な低減を示した(図7c)。図8aは、脾臓からの総CFUを示し、図8bは、移植後140日目の骨髄を示している。点は、分析されたマウス当たりのコロニーの数を表し、線は、各群における平均値±SEMを表す。データを、ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定によって統計的に分析した。治療ベクターで処置されたPKDマウスにおける赤血球産生の正常化は、脾臓の前駆細胞含量の数の正常レベルへの低減によって達成された(図8a)が、BM CFU含量の変化は認められなかった(図8b)。
coRPK LVベクターで形質導入された細胞の移植は、髄外赤血球産生および臓器病理を元に戻す。
RPK欠損赤血球の活発な破壊により、PKDおよびEGFP発現マウスは、健常な対照と比較したとき、200%を超える脾臓の重量およびサイズの急性脾腫を示した(図9a、b)。脾臓組織の乱れた構造および脾赤髄の拡大もこれらの動物で観察され、PKDおよびEGFP発現肝切片における赤血球細胞クラスターの存在によっても強い髄外赤血球産生が支持されていることを示している(図9c)。注目すべきことに、coRPK導入遺伝子の異所性発現は、遺伝子修復されたマウスの脾臓および肝臓の病理を完全に元に戻し、RBCの蓄積を低減し、脾臓の組織学的構造およびサイズを正常化した(図9)。さらに、組織学的研究は、遺伝子修復されたマウスの肝臓には鉄沈着物がまったく存在しないことを明らかにしたが、一方、移植されていない群またはEGFPを担持するベクターで形質導入されたHSCを移植した群のいずれかのPKDマウスは、継続的な溶血プロセスのために強い鉄過剰を示した(図9c)。全体的に、PKDマウスにおける遺伝子修復されたHSCの移植は、赤血球産生の正常な状態および溶血性貧血によって引き起こされる全ての二次的影響を回復した。
PGK-coRPK LV由来の発現は、WBC代謝バランスを変更することなく、RBCの解糖経路を回復する。
次に、RPK酵素活性の機能的修正を研究するために、全ての移植マウスおよび対照マウスの広範なメタボロミック解析を実行した。非標的プロファイリング戦略に従って、我々は、異なる群間でRBCの解糖中間体の有意な変化を観察し、別個の傾向を有する代謝産物パターンの3つの広範なクラスターを特定した(図10a)。coRPK発現マウスからのRBCは、健常な対照と同様にクラスター1からの代謝産物の増加を示したが、EGFP導入遺伝子を担持する移植マウスとは異なっていた。同様に、クラスター3は、野生型マウスに類似し、EGFP発現マウスとは異なる、遺伝子修復されたマウスにおける代謝産物の減少傾向を反映していた。それにもかかわらず、アッセイ1からのクラスター2は、移植したマウス群(EGFPおよびcoRPKを発現するマウス)間で代謝産物プロファイルの違いを示さなかった(図10a)。非標的代謝プロファイリングは、遺伝子改変が、いくつかの重要な解糖中間体を改変し、PGK-coRPK LV形質導入HSCで移植したマウスから単離した赤血球のATP(図10b)、ADP(図10c)、およびピルビン酸(図10d)レベルの増加を達成することができることを示した。これらの代謝傾向を考慮して、我々は、標的プロファイリング手法を使用して、PK触媒反応の近くに位置する他の代謝産物を分析した。PK触媒反応の上流に位置する直接PK基質ホスホエノールピルビン酸(PEP)(図10e)および3-ホスホグリセリン酸(3-PG)(図10f)のレベルは健常な参照マウスのレベルに近づいた。coRPK導入遺伝子を発現する欠損赤血球も、PKDおよびEGFP発現マウスと比較したとき、嫌気性解糖の最終産物であるD-乳酸(図10g)の増加ももたらした。解糖代謝産物での補償が成熟赤血球のPK活性の正常化の結果であるかどうかを試験するために、我々はこの酵素の活性を測定し、欠損動物における多量の網状赤血球の影響を回避するために、ヘキソキナーゼ活性と関連してそれを正常化させた。白血球のPK活性の混入を防止するために、RBCをセルロースカラムを通して精製した。野生型の健常な動物から、および正常で健常な血液ドナーボランティアから得られたものと同様の比に達するcoRPKを発現する動物において、PK活性の完全な補償が観察された(図11)。図11aは、対照マウスおよび形質導入細胞を移植したマウスからのRBCにおけるピルビン酸キナーゼ活性を示し、図11bは、ヘキソキナーゼ活性を示し、図11cは、ピルビン酸キナーゼとヘキソキナーゼ酵素活性との比を示す。RBCは、白血球のPK活性の混入を回避するためにセルロースカラムを通して血液試料から精製して、酵素活性評価にかけられた。黒バーは健常なマウス(n=2)であり、白バーは、EGFP発現ベクターで形質導入された細胞を移植したマウス(n=3)であり、スクラッチドバーは、coRPK発現ベクターで形質導入された細胞を移植したマウス(n=3)である。格子縞のバーは、健常なボランティア(n=1)からの値を表す。データは、各群の平均値±SEMを表す。
PGK-coRPK LV形質導入細胞は、ベクター遺伝毒性の証拠なしで、ポリクローナル造血再構成を行う。
coRPKまたはEGFP導入遺伝子のいずれかを担持するLVの組み込みプロファイルを移植したマウスで分析した。LVのゲノム全体の組み込みプロファイルからの結果から、各挿入が、個々の形質導入された細胞のクローン行動を追跡するために使用され得る特有な遺伝子マークを作り出した。ゲノムDNA(gDNA)は、WBCから、BM細胞から、および一次ならびに二次移植マウスから、ならびに移植前に形質導入された細胞プール(Lin-細胞)から得られた。線形増幅媒介PCR(LAM-PCR)(図13および14)を使用して、ベクター/ゲノムジャンクションを増幅させ、ベクターISを特定した。図13は、ベクターISを、3’ベクターLTR-ゲノムジャンクションのLAM-PCR増幅によって特定したことを実証している。いくつかのバンドによって特性化されるパターンを生成するMultiNA自動化システムを使用した。ベクター骨格由来のTsp509I内部対照バンド(IC)は、矢印で示されている。図14は、ベクターISを、3’ベクターLTR-ゲノムジャンクションのLAM-PCR増幅によって特定したことを実証している。いくつかのバンドによって特性化されるパターンを生成するMultiNA自動化システムを使用した。ベクター骨格由来のHpyCH4IV5のICは、矢印で示されている。
ヒト臨床試験
脾臓摘出術に抵抗性の重症で輸血依存性貧血の病歴を有するPKDの患者において、EU/3/14/1130医薬品(RPK遺伝子を含有するLVベクターで形質導入された自家CD34+造血幹細胞)を使用して、自家造血幹細胞移植(HSCT)の安全性および予備的な有効性を評価するために、臨床試験を行う。
骨髄(BM)または動員された末梢血細胞のいずれかから、PKD患者由来のCD34+前駆細胞を採取した後、これらを、エクスビボで医薬品で形質導入し、治療ベクターが細胞のゲノムに組み込まれることになる。一旦組み込まれると、治療ヒト遺伝子(coRPK)が欠損細胞内で転写および翻訳され、PKD成熟赤血球では欠落または減少している治療RPKタンパク質を産生する。形質導入されたPKD造血前駆細胞は、次いで遺伝子修復され、これによりそれらの機能を達成するのに十分な量のATPを含む赤血球を産生することができる(図22)。これらの遺伝子修復された造血前駆細胞(医薬品を構成することになる)は、その後患者に移植され、一旦生着すると、正常な赤血球を生成し、生涯にわたって疾患の治癒を提供する。
患者は患者のそれぞれの病院で動員されるが、最初の2人の患者は、Hospital del Nino Jesus,Madrid(Spain)で動員される。動員過程は、組み換え刺激因子顆粒球コロニー(G-CSF,Neupogen,Amgen,Thousand Oaks,CA,USA)を、12mg/kgで1日2回、出生から最長8日間の投与、プレリキサホルを4日目に240mg/kg/日(Mozobil(登録商標),Genzyme Europe BV,Naarden,Netherlands)で4日間連続して、4回の皮下投与に含まれる。末梢血からの造血前駆細胞を、白血球アフェレーシスによって収集し、動員の5日目からの大容量を、マドリードのHospital Nino Jesusの標準プロトコルに従って細胞分離器を通して送る。全ての機器および溶液は、CEマークが付けられており、医療機器に関する法律の仕様を満たしている。
動員過程と一致して、アフェレーシスは患者が動員される病院で行われる。アフェレーシス産物は、強力な永久磁石および強磁性マトリックスを備える分離カラムを通して、高磁場勾配による細胞の分離を可能にするMACS「磁気細胞選別」技術(Miltenyi Biotec,Germany)を介して造血前駆細胞(CD34+細胞)を選択するために、すぐに処理される。CliniMACS(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)システムは、コンピューター(CliniMACS(登録商標)plusInstrument)、特定のCD34+選択ソフトウェア、一連の滅菌チューブ(CliniMACS Tubing Sets)、磁気制御反応滅菌装置(CliniMACS CD34 Reagent)、および滅菌緩衝液(CliniMACS PBS/EDTA緩衝液)からなる。使用される機器および試薬は、CEマークが付けられており、医療機器に関する法律の仕様を満たしているであろう。この段階とその後の洗浄では、非特異的免疫グロブリン(静脈内Flebogamma5% 0.5gr、Grifols)およびヒトアルブミン(ヒトアルブミンGrifols(登録商標)20%、Grifols)を利用し、これらは、その後、遠心分離後に洗浄して除去される。次いで、CD34+細胞を定量化する。得られた製品の微生物学的管理は、特定のプロトコルに従って、培養用に標準的な真菌、好気性細菌および嫌気性菌の試料を採取することによって実行される。
ODD EU/3/14/1130によって精製されたCD34+細胞の形質導入は、GMP条件下で、患者からの細胞の抽出(アフェレーシス)から48時間以内の時間窓で実行される。細胞のエクスビボでの培養は、48時間未満継続し、適切に配合された培地X-vivo-20(Lonza)の使用、造血増殖因子(100ng/mlのhrSCF、100ng/mlのhrFlt-3、100ng/mlのTPO、および20ng/mLのIL-3(全てのPrepotech製)、1μg/mLプルモザイムの添加、ならびに制御された5%のO2濃度を含む、確立された基準に従って培養されるであろう。形質導入は、VIVEbiotech(San Sebastian,Spain)が製造したODD EU/3/14/1130のGMP LVバッチを使用して実行される。形質導入後、細胞はX-vivo-20(Lonza)で洗浄され、最終的に凍結保存に好適な輸送バッグにパッケージ化される。特定の試料が収集され、最終産物がその最終的な放出について既に述べた全ての仕様を満たしているかどうかが決定される。産物の安定性を評価するために、3つの独立した検証が実行される。ベクターを含む全ての産物および溶液は、医療機器および臨床使用のための法律の仕様を満たす。生産前に、全ての原材料(消耗品、生物学的試薬、化学粉末を含む)は、標準実施要領(SOP)に従ってCliniStemの品質管理(QC)ユニットによって検査されるであろう。
患者は、試験用に考慮される標準化された具体的なプロトコルに従って前処置される。患者の前処理用の代替品と見なすために、調製された産物が処置された患者の造血を完全に再構成しない場合に使用するために、2×106個の操作されていないCD34+細胞/kgのバックアップを凍結させておく。
注入前に、患者の適格性がチェックされ、試験の要件を満たしていることを確認する。注入日に、使用された前投薬および予防的投薬が記録される。
非臨床開発
以前の研究は、25%を上回る遺伝子修復された細胞が移植された場合の、マウスにおけるPKDのHSC遺伝子治療の実現可能性を実証した。これらの結果は、PKDの治療効果を達成するためには、かなりの数のドナーの遺伝子修復されたHSC(Zaucha,Yu et al.2001)および高レベルの導入遺伝子発現が必要であることを示唆している。PKLR cDNAの発現を駆動するhPGK真核プロモーターを保有する、新しい治療LVベクターを開発して、この臨床試験用に提案し、2014年8月に希少医薬品として指定された(EU/3/14/1130)。このベクターを用いて、我々は、疾患のマウスモデルでPKDについての前臨床遺伝子治療プロトコルを実施した。臨床基準に基づいたLV投与量を用いることにより、異所性RPK発現が、赤血球区画を正常化させ、血液学的表現型を修復し、臓器病理を元に戻すことができた。メタボロミック研究は、遺伝子修復されたRBCにおける解糖経路の機能的修復が、白血球における代謝障害を伴わないことを実証した。注目すべきことに、並行して分析された白血球は、PGKなどのユビキタスプロモーターの活性下でRPKが異所的に発現されるとき、白血球の代謝バランスの変化を示さず、考えられる安全性への懸念としての白血球代謝の利点を排除し、EU/3/14/1130ベクターの治療的有効性を強化する。
臨床開発
臨床試験のプロトコル支援は、審査当局に要請される。我々の目的は、欧州委員会が後援する臨床試験を実行することである。欧州の様々な臨床医および基礎研究者によって構成されるForGeTPKDコンソーシアムは、PKDの研究と新しい治療戦略の開発に重点を置くために設立された。ForGeTPKD臨床試験は、この医薬品のヒトへの最初の投与となるであろう。これは重度のピルビン酸キナーゼ欠損症患者の赤血球型ピルビン酸キナーゼ(RPK)遺伝子(EU/3/14/1130)を含有するレンチウイルスベクターを用いて、エクスビボで形質導入された自家CD34+細胞の移植の安全性および有効性を評価するために、国際共同、多施設、第I相/第II相の非盲検試験として設計されている。
本医薬品は、現時点で販売承認を受けていない。PKDコンソーシアムの目的は、最終的には販売承認を取得するために、医薬品の臨床開発を前に進めることである。
薬理学
完了した試験:開発された医薬品は、PKDの遺伝子治療にいくつかの利点をもたらす、その配列中にいくつかの改変を含む。1)SIN-LVベクター設計の使用は、ウイルス株の比較的容易かつ安全な生産を可能にし、HSCを効率的に形質導入でき;2)メチル化によるサイレンシングの影響を受けにくいこと、hPGKなどの弱い真核プロモーターの使用(Gerolami,Uch et al.2000)が、導入遺伝子の生理学的発現をもたらし、臨床基準内のウイルス量(1.65 VCN)で治療レベルを達成すること(Matrai,Chuah et al.2010);および3)コドン最適化導入遺伝子配列と突然変異したwPRE配列の存在が、導入遺伝子mRNAの安定性を増加させることである。治療ベクター配列にレポーター遺伝子が含まれておらず、免疫原性の問題が発生する可能性を回避した(Morris,Conerly et al.2004);(Stripecke,Carmen Villacres et al.1999)。
進行中の試験
以下の試験のために、健常なドナーおよびPKD患者からのヒト造血前駆細胞の形質導入を行った:1)ヒト細胞におけるODD EU/3/14/1130の形質導入の効率を決定すること;2)RPK治療用タンパク質の効率的かつ治療的発現を得るための最適なベクターのコピー数/細胞を定義すること;および3)造血幹細胞の能力を失うことなく、治療的形質導入レベルを得るために最適な条件を定義すること。
完了した試験結果は、1)ヒトRPKの異所性発現が、白血球の代謝バランスを変更することなく、RBCのエネルギー欠陥を修正することと、2)ベクターのゲノム組み込み分析が、(i)特異的細胞クローンの相対的存在量の分析が、一部のマウスではオリゴクローナル造血再構成を明らかにし、いかなる一次および二次移植マウスでもクローン優性を明らかにしなかったこと、(ii)マウスで実行された2つの独立した遺伝子治療実験からの検出されたCISが、高配列カウントによって表されず、かつ優先的に癌遺伝子を標的化しなかったために、挿入による突然変異誘発の特徴と考えられるCIS分析が、遺伝毒性のいかなる兆候も、経時的なCISの異常な富化も示さなかったこと、(iii)LV組み込みの標的となる遺伝子のGO分析、およびゲノムの特異的領域におけるベクター組み込みの位置の分析が、癌、細胞増殖、またはアポトーシスの調節に関与する遺伝子クラスに偏らないことを実証したこと、および(iv)全体として、医薬品組み込み分析が、遺伝毒性のいかなる証拠も示さなかったことを実証したことと、を含む。
ヒト臨床試験
臨床有効性を試験するために、ForGeTPKD試験が行われる。提案された臨床試験は、脾摘出に不応性の重症で輸血依存性貧血の病歴を有するPKD患者において、EU/3/14/1130医薬品(赤血球型ピルビン酸キナーゼ(RPK)遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで形質導入された自家CD34+造血幹細胞)を使用して自家HSCTの安全性および予備的有効性を評価することを目的としている。
回診-1:プレスクリーニング回診
可能性のある候補者は、試験の目的および特徴について通知され、二通りの書面によるインフォームド・コンセントが患者(または未成年の場合は法定代理人)によって、取得、履行、および署名される。試験に適格であるためには、患者は、チェックされる、全ての組み入れ基準を満たし、かつ除外基準のいずれも満たさない必要がある。このことは、生存可能なCD34+細胞を動員して得て、A.非生着の場合のバックアップとして機能する2×106個のCD34+細胞/kg体重を保存し、B.少なくとも6×106個のCD34+細胞/kg体重を、EU/3/14/1130ベクターで形質導入して医薬品を生成し、医薬品の放出に必要な全ての品質管理を行うための前処置手順を含む。医薬品の放出後に利用可能な十分な形質導入細胞(2×106個の形質導入CD34+細胞/kg体重)を有する患者のみが試験に組み入れられるであろう。
-関連する医療または手術歴の登録。
-人口統計データと臨床的に関連する身体検査所見の登録
-関連する併用薬の登録。
-日常的な血球算定(CBC)、生化学、凝固測定、血清学についての末梢血検査。
-心エコー図、肺機能検査、胸部X線。
-生活の質に関するアンケート(SF-36またはPEDSQL)。
-PKDの遺伝子診断。
1.ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)のための発現カセットであって、
a)プロモーター配列、
b)遺伝子産物をコードする配列、および
c)リボ核酸(RNA)搬送シグナルを、5’から3’の順に含むポリヌクレオチド配列を含み、
プロモーター配列が、遺伝子産物をコードする配列に作動可能に連結されている、発現カセット。
2.プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、項目1に記載の発現カセット。
3.遺伝子産物が、治療遺伝子産物である、項目1または項目2に記載の発現カセット。
4.治療遺伝子産物が、ピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意にピルビン酸キナーゼ、肝臓および赤血球(PKLR)ポリペプチドである、項目3に記載の発現カセット。
5.遺伝子産物をコードする配列が、コドン最適化されている、項目1~4のいずれか一項に記載の発現カセット。
6.コドン最適化配列が、SEQ ID NO:8と少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、項目5に記載の発現カセット。
7.RNA搬出シグナルが、突然変異したウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント(wPRE)である、項目1~6のいずれか一項に記載の発現カセット。
8.突然変異したwPREが、SEQ ID NO:24と少なくとも80%の同一性を有する配列を含むキメラwPREである、項目7に記載の発現カセット。
9.1つ以上のエンハンサー配列をさらに含む、項目1~8のいずれか一項に記載の発現カセット。
10.ポリプリントラクト(PPT)またはポリアデニル化(ポリA)シグナル配列をさらに含む、項目1~9のいずれか一項に記載の発現カセット。
11.以下の配列、
i)パッキングシグナル配列、
ii)切断型Gag配列、
iii)Rev応答エレメント(RRE)、
iv)セントラルポリプリントラクト(cPPT)、
v)セントラル末端配列(CTS)、および
vi)任意にシミアンウイルス40からの上流配列エレメント(SV40-USE)のうちの1つ以上をさらに含む、項目1~10のいずれか一項に記載の発現カセット。
12.5’および3’長末端反復配列をさらに含む、項目1~11のいずれか一項に記載の発現カセット。
13.項目1~12のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、組み換え遺伝子送達ベクター。
14.ウイルスまたはウイルスベクターである、項目13に記載の組み換え遺伝子送達ベクター。
15.ウイルスまたはウイルスベクターが、レンチウイルス(LV)である、項目14に記載の組み換え遺伝子送達ベクター。
16.項目1~12のいずれか一項に記載の発現カセットまたは項目13~15のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子送達ベクターを含む、細胞。
17.造血幹細胞である、項目16に記載の細胞。
18.コミットされた造血赤血球前駆細胞である、項目16に記載の細胞。
19.薬学的に許容される賦形剤と、項目13~15のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子送達ベクターまたは項目16~18のいずれか一項に記載の細胞と、を含む、薬学的組成物。
20.疾患もしくは障害の治療または予防を必要とする対象における疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、対象に項目19に記載の薬学的組成物を提供することを含む、方法。
21.疾患もしくは障害が、ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)であり、遺伝子産物が、ピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意にピルビン酸キナーゼ、肝臓および赤血球(PKLR)ポリペプチドである、項目20に記載の方法。
22.薬学的組成物が、組み換え遺伝子送達ベクターを含む、項目20または項目21に記載の方法。
23.薬学的組成物が、細胞を含む、項目20または項目21に記載の方法。
24.細胞が、対象に対して自家性である、項目23に記載の方法。
25.1つ以上の赤血球細胞を、有効量の組み換えウイルスベクターと接触させることを含む、赤血球細胞中で導入遺伝子を発現するための方法であって、ベクターが、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーター、ヒトピルビン酸キナーゼのコドン最適化型肝臓および赤血球(PKLR)cDNA導入遺伝子、および突然変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを含み、該接触後に、PKLRが、1つ以上の赤血球細胞中で検出可能なレベルで発現される、方法。
Claims (17)
- ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)のための発現カセットであって、
(a)プロモーター配列、
(b)ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列、および
(c)突然変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(wPRE)
を5’から3’の順に含むポリヌクレオチド配列を含み、
前記プロモーター配列が、前記ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列に作動可能に連結されており、かつ
前記ヒトPKLR遺伝子産物をコードするコドン最適化配列が、SEQ ID NO:8と少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、かつ
前記突然変異したwPREが、SEQ ID NO:24と少なくとも99%の同一性を有する配列を含むキメラwPREである、
前記発現カセット。 - 前記プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記突然変異したwPREが、SEQ ID NO:24を含むキメラwPREである、請求項1または2に記載の発現カセット。
- ポリプリントラクト(PPT)をさらに含む、請求項1~3のいずれかに記載の発現カセット。
- ポリアデニル化(ポリA)シグナル配列をさらに含む、請求項1~4のいずれかに記載の発現カセット。
- SEQ ID NO:26と少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1~5のいずれかに記載の発現カセット。
- SEQ ID NO:26と少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項6に記載の発現カセット。
- レンチウイルスベクターである、請求項1~7のいずれかに記載の発現カセットを含む組み換え遺伝子送達ベクター。
- 治療遺伝子送達ベクターである、請求項8に記載の組み換え遺伝子送達ベクター。
- 請求項1~7のいずれかに記載の発現カセットを含むか、または請求項8~9のいずれかに記載の組み換え遺伝子送達ベクターで形質転換されている、細胞。
- 造血幹細胞である、請求項10に記載の細胞。
- コミットされた造血赤血球前駆細胞である、請求項11に記載の細胞。
- 薬学的に許容される賦形剤と、請求項10~12のいずれかに記載の細胞と、を含む、薬学的組成物。
- それを必要とする対象におけるピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)の治療または予防のための、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記細胞が、前記対象に対して自家性である、請求項13または14に記載の薬学的組成物。
- 単離された赤血球細胞においてヒトPKLR遺伝子を発現させるための方法であって、1つ以上の赤血球細胞を組み換えウイルスベクターの有効量と接触させることを含み、前記ベクターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、コドン最適化PKLR導入遺伝子、および突然変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(wPRE)を含み、前記コドン最適化PKLR導入遺伝子が、SEQ ID NO:8と少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、前記突然変異したwPREが、SEQ ID NO:24と少なくとも99%の同一性を有する配列を含むキメラwPREであり、かつ前記接触後、PKLRが前記1つ以上の赤血球細胞において検出可能なレベルで発現する、方法。
- 1つ以上の赤血球細胞を請求項8~9のいずれかに記載の組換え遺伝子送達ベクターの有効量と接触させることを含む、単離された赤血球細胞においてヒトPKLR遺伝子を発現させるための方法であって、前記接触後、PKLRが前記1つ以上の赤血球細胞において検出可能なレベルで発現する、前記方法。
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