CN111733187B - 一种wpre突变体病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病毒载体领域，具体涉及一种WPRE突变体病毒载体及其应用，所述WPRE突变体病毒载体包括WPRE突变体‑03，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其构建方法包括：S1：制备随机突变目的片段；S2：随机突变目的片段与能表达荧光蛋白的目的载体连接；S3：涂平板后流式细胞仪筛选细胞；S4：抽提筛选得到的细胞基因组，使用PCR技术扩增WPRE区域；S5：连接T载体后涂板获得克隆细胞，进行测序，得到WPRE突变体病毒载体。本发明中发明人通过大量的创新性劳动，设计并构建了一个WPRE随机点突变病毒文库，通过文库筛选发现一种新的WPRE突变体病毒载体，其对病毒包装有明显促进作用。

Description

一种WPRE突变体病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于病毒载体领域，具体涉及一种WPRE突变体病毒载体及其应用。
背景技术
WPRE（wood chuck hepatitis virus posttranscriptional regu latoryelement）即土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，长度大约600bp，属于顺式作用元件（DNA序列），由gamma，alpha，beta等三部分构成。WPRE的主要功能如下：1）提高病毒的包装滴度；2）帮助检测病毒的滴度；3）同时有效帮助mRNA的polyA加尾效率，增强转基因的表达和稳定。虽然具体的机制仍不十分明确，但是WPRE元件仍然被广泛使用在各种病毒载体中。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
然而现有的WPRE元件对慢病毒载体的滴度的改善水平还有待提高，亟需发明一种新的WPRE突变体以提高慢病毒的滴度水平。
发明内容
发明人发现来源于不同毒株的WPRE对慢病毒包装中的滴度有一定影响，针对于此，申请人设计并构建了一个WPRE随机点突变慢病毒文库，通过文库筛选获得对慢病毒包装有明显促进作用的WPRE突变体，解决了现有技术中WPRE元件对慢病毒载体的滴度的改善水平低等问题。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种WPRE突变体病毒载体，包括WPRE突变体-03，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述WPRE突变体病毒载体为WPRE突变体慢病毒载体或WPRE突变体腺相关病毒载体。
本发明第二个方面公开了一种病毒颗粒，包含上述的载体。
本发明第三个方面公开了一种细胞，所述细胞包含上述的载体。
本发明第四个方面公开了一种构建上述的WPRE突变体病毒载体的方法，采用WPRE元件进行随机点突变体文库的构建，并进行筛选得到WPRE突变体病毒载体；包括：
S1：制备随机突变目的片段；
S2：随机突变目的片段与能表达荧光蛋白的目的载体连接；
S3：涂平板后流式细胞仪筛选细胞；
S4：抽提筛选得到的细胞基因组，使用PCR技术扩增WPRE区域；
S5：连接T载体后涂板获得克隆细胞，进行测序，得到WPRE突变体病毒载体。
在本发明的一些优选实施例中，筛选得到三种WPRE突变体病毒载体：WPRE突变体-01、WPRE突变体-02和 WPRE突变体-03，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
优选的，在S1中，突变模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；更优选的，其中，正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
优选的，在S2中，所述目的载体为pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-wtWPRE或pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE。
优选的，在S4中，使用PCR技术扩增WPRE区域，所用的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
本发明第五个方面公开了根据上述的WPRE突变体病毒载体或上述的方法在提高病毒滴度中的应用。
本发明第六个方面公开了一种利用上述的WPRE突变体病毒载体进行病毒包装的方法，包括：
（1）培养待转染细胞；
（2）制备含有上述的WPRE突变体的DNA-转染试剂复合体；
（3）将DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养容器中，5-7h后弃去培养基，再加入新鲜的完全培养基培养。
本发明的一些具体实施例中，步骤（2）包括：
1）将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒pCAG-gag pol-Tat: 包膜蛋白质粒pHCMV-VSVG：穿梭质粒（pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-wtWPRE、pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-01、pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-02或pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-03=2：1：3）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟； 2）将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
本发明的一些具体实施例中，步骤（3）包括：
取出细胞培养皿，将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜完全培养基培养。
WPRE突变体病毒载体包装病毒后滴度测定方法：
转染48小时后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，并给细胞更换新鲜的完全培养基。转染72小时后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，丢弃细胞。将收集的培养上清，用离心机3500rpm，10min，室温离心后，上清倒入新的50ml离心管；用超速离心机30,000rpm，4℃离心2h后，小心地弃去上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，加入DPBS重悬沉淀，收集到1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。
采用Real time PCR法测定慢病毒滴度，制备样品：按1×105细胞每孔接种293T细胞于24孔板；第二天加入病毒（0.1μl、1μl和10μl），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光，后收取细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
优选的，所述细胞为293T细胞；优选的，所述培养基为Opti-MEM培养基。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明中发明人通过大量的创新性劳动，设计并构建了一个WPRE随机点突变慢病毒文库，通过文库筛选发现一种新的WPRE突变体病毒载体，其对慢病毒包装有明显促进作用；且该WPRE突变体病毒载体构建方法简单，因此本发明的技术方案具有很大的市场经济价值。
附图说明
图1为本发明实施例中突变WPRE与野生型WPRE序列比对结果示意图；
图2为本发明实施例中PCR产物电泳图；
图3为本发明实施例中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-wtWPRE载体图谱；
图4为本发明实施例中慢病毒滴度感染荧光示意图；
图5为本发明实施例中慢病毒滴度统计结果示意图；
图6为本发明实施例中pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE载体图谱示意图；
图7为本发明实施例中腺相关病毒滴度统计结果示意图；
图8为本发明实施例中细胞感染72h后荧光示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例构建随机突变目的片段并筛选出效果较好的WPRE突变体，包括：
1.1随机突变目的片段的制备
1.2突变模板序列如下：
tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（SEQ ID NO：4）
1.3引物设计：
F---taaggatcctcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattga（SEQ ID NO：5）
R---cactgcaggcccaaagggagatccgac（SEQ ID NO：6）
1.4随机突变反应：
1.4.1随机突变体系（50 μL）：
1.4.2
Figure DEST_PATH_IMAGE001
1.4.3PCR程序：
1.5
Figure 316411DEST_PATH_IMAGE002
1.6PCR结束后，向PCR样品中加入1μL DpnI用以消除甲基化的模板；
1.7随后，取5μL PCR产物电泳检测条带浓度和特异性；PCR产物电泳图如图2所示；
1.8将剩余的PCR产物电泳，切胶回收目标DNA片段；
1.9目的载体pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-wtWPRE（载体图谱见图3）使用BamHI和PstI酶切后回收大片段；
1.10DNA片段使用BamHI和PstI酶切后使用PCR产物回收试剂盒回收片段588bp片段连接入1.8中线性化的目的载体；
1.11将平板的克隆计数后，使用细胞刮刮下后收集；
1.12重复上述1.2-1.8，直到收集的克隆数达到107，获得WPRE突变体慢病毒质粒文库；
1.13将上述收集的菌抽提质粒后包装慢病毒, 获得WPRE突变体慢病毒文库. 滴度为5.8×108 TU/ml；
1.14使用上述文库感染293T细胞(感染复数MOI 设置为0.5)，72小时后，收集细胞进行流式细胞仪检测，分离并富集绿色荧光亮度前5%的细胞；
1.15抽提293T细胞基因组
1.16使用PCR扩增WPRE区域
F：5’tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattga 3’（SEQ ID NO：7）；
R：5’gcccaaagggagatccgac 3’（SEQ ID NO：8）；
1.17连接入T载体后涂板
1.18对获得克隆进行测序
1.19筛选到多个突变体，举例其中3个突变体
WPRE-突变体-01：携带5个点突变（C101G, T169A,G181C,A229G, C345A）；
WPRE-突变体-02：携带6个点突变（C211A, C258G,T287A,C306G,G355A,G501A）；
WPRE-突变体-03：携带4个点突变（C79G, T87A,G97C,A552G）；
2.WPRE突变体慢病毒载体构建
突变体序列1（pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE突变体-01）：
tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatgatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttaagaggagttgtgccccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcgacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggaaaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（SEQ ID NO：1）
突变体序列2（pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro -WPRE突变体-02）：
tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgaactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccagctgtcagctcctttccgggactttcgctatccccctccctattgccagggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcgactgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccacggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggc（SEQ ID NO：2）
突变体序列3（pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE突变体-03）：
tcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggataggctgcttaaatgcctttctatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcggacgagtcggatctccctttgggc（SEQ ID NO：3）；
3.WPRE突变体慢病毒载体病毒包装及滴度测定
转染前一天，将293T细胞接种到100mm培养皿中；转染前一小时取出细胞培养皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱；制备转染试剂和质粒的复合物：（1）将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒pCAG-gag pol-Tat：包膜蛋白质粒pHCMV-VSVG：穿梭质粒 (pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-wtWPRE、pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-01、pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-02或pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-03)=2：1：3）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（2）将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养皿，将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜完全培养基培养。
转染48小时后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，并给细胞更换新鲜的完全培养基。转染72小时后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，丢弃细胞。将收集的培养上清，用离心机3500rpm，10min，室温离心后，上清倒入新的50ml离心管；用超速离心机30,000rpm，4℃离心2h后，小心地弃去上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，加入DPBS重悬沉淀，收集到1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。
采用Real time PCR法测定慢病毒滴度，制备样品：按1×105细胞每孔接种293T细胞于24孔板；第二天加入病毒（0.1μl、1μl和10μl），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光（荧光图片见图4），后收取细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。三次慢病毒滴度统计结果见图5；其中pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-03可以提高约65%慢病毒的滴度。将pSLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-WPRE 突变体-03与野生型WPRE序列比对结果如图1所示。
实施例2
本实施例将有效的WPRE突变体在腺相关病毒载体上进行效果验证，具体如下：
一、腺相关病毒载体构建：
将检测增强效果的WPRE突变体03序列构建到腺相关病毒载体，在pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE（图谱见图6）基础上构建pAAV-CMV-EGFP-WPRE 突变体-03。
使用pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE和pAAV-CMV-EGFP-WPRE 突变体-03以AAV2/8作为血清型载体包装AAV病毒。使用WPRE引物对以上病毒进行滴度测定。并使用考马斯亮蓝染色验证。
转染前一天，将293T细胞接种到100mm培养皿中；转染前一小时取出细胞培养皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱；制备转染试剂和质粒的复合物：（1）将待转染的病毒载体质粒20μg（血清型质粒AAV2/8：辅助质粒pHelper：穿梭质粒pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE或pAAV-CMV-EGFP-WPRE 突变体-03=1：1.5：1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（2）将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟；（3）将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养皿，将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中，放回培养箱；6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜完全培养基培养。
转染72小时后，收集培养基至50ml离心管中，丢弃细胞。将收集的培养上清，用离心机3500rpm，10min，室温离心后，上清倒入新的50ml离心管；用密度梯度离心方法收取腺相关病毒，加入DPBS重悬沉淀，收集到1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。
采用Real time PCR法测定腺相关病毒滴度，并使用考马斯亮蓝染色的方法检测腺相关病毒，腺相关病毒包装滴度统计结果见图7；其中pAAV-CMV-EGFP-WPRE 突变体-03组可以提高约82%的腺相关病毒滴度。
按1×105细胞每孔接种293T细胞于24孔板；第二天加入病毒（按照MOI=5×105），12~20h后更换新鲜培养基；感染后72h拍照记录荧光（荧光图片见图8），pAAV-CMV-EGFP-WPRE突变体-03组的感染荧光亮于pAAV-CMV-EGFP-wtWPRE组。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 和元生物技术(上海)股份有限公司
<120> 一种WPRE突变体病毒载体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat gatgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttaag aggagttgtg 180
ccccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcga cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggaaagggg ctcggctgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggc 576
<210> 2
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg aactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccagct gtcagctcct ttccgggact ttcgctatcc ccctccctat 300
tgccagggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcgactgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc acggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggc 576
<210> 3
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatagg ctgcttaaat gcctttctat catgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cggacgagtc ggatctccct ttgggc 576
<210> 4
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggc 576
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaggatcct caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttga 44
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactgcaggc ccaaagggag atccgac 27
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attga 35
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccaaaggg agatccgac 19

Claims (8)

1.一种WPRE突变体病毒载体，其特征在于，包括WPRE突变体-03，所述WPRE突变体-03的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体，其特征在于，所述WPRE突变体病毒载体为WPRE突变体慢病毒载体或WPRE突变体腺相关病毒载体。
3.一种病毒颗粒，其特征在于，包含权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体。
5.根据权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体在提高病毒滴度中的应用。
6.一种利用权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体进行病毒包装的方法，其特征在于，包括：
（1）培养待转染细胞；
（2）制备含有权利要求1所述的WPRE突变体病毒载体的DNA-转染试剂复合体；
（3）将DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养容器中，5-7h后弃去培养基，再加入新鲜的完全培养基培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞为293T细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为Opti-MEM培养基。
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