CN115927470A - 腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。本发明的腺病毒包装用系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；所述供体质粒由5’‑3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因；所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间，以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。使用本发明的腺病毒包装系统进行腺病毒包装操作步骤简单，病毒包装时间短，病毒效价高。

Description

腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。

背景技术

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。重组腺病毒载体具有广泛的应用，例如作为载体其可以高效运输、表达目的基因。经过一系列改造后的第二代腺病毒可包装达到8kb的外源基因。第三代载体缺失了全部的或大部分腺病毒基因，仅保留ITR和包装信号序列，最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少，载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达，并增加了载体的稳定性。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验和疫苗的开发方面有了越来越多的应用，成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

目前腺病毒包装主要有三种包装方案，一种是较为传统的AdEasy，需要在大肠杆菌中重组，获得重组后的大载体，重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒。第二种为利用Infusion分子克隆技术将目的基因和包含腺病毒骨架的质粒直接连接转化大肠杆菌细胞获得重组质粒，重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒。第三种是AdMax系统，在体内利用Cre/loxp酶，将穿梭载体和病毒骨架载体在HEK293细胞利用位点特异性重组的方式，特点是操作方便，直接两个载体共转染HEK293即可。然而，前两种方法需要将目的基因克隆到病毒骨架载体上，由于病毒骨架质粒比较大(约34kb)，对分子克隆技术要求较高，克隆效率比较低而且大质粒在大肠杆菌中不稳定容易突变、全质粒测序验证工作量大、成本比较高，通常采用多挑取克隆的方法进行筛选稳定的质粒，另外大质粒提取、纯化困难。尽管AdMax系统不涉及复杂的分子克隆但需要制备病毒骨架载体质粒，而且大质粒制备困难依然存在，同时AdMax是出毒周期较长，通常需等待发生在转染后10～12天以上才能观察到空斑的形成。

CN109943591A公开了一种快速构建腺病毒的方法，该方法本质是将传统的AdEasy与Gibson Assembly技术相结合，将目的基因构建到穿梭质粒上，然后再将穿梭质粒与病毒骨架质粒利用Gibson Assembly分子克隆技术获得重组质粒。但是，该技术类似Infusion克隆技术，同样需要重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒，也同样存在克隆效率比较低、大质粒在大肠杆菌中不稳定容易突变、全质粒测序验证工作量大、成本比较高，大质粒提取、纯化困难等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的出毒周期长、相关技术要求高、效率低等问题，提供一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。使用本发明的腺病毒包装系统进行腺病毒包装操作步骤简单，病毒包装时间短，病毒效价高。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种腺病毒包装用系统，其特征在于，所述系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；

其中，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；

所述供体质粒由5’-3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因，并且不含有转录终止信号；

所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；

所述sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；

所述sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间，以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。

本发明第二方面提供如前所述的系统在腺病毒包装中的应用。

本发明第三方面提供一种使用如前所述的系统进行腺病毒包装的方法，所述方法包括：

(1)将表达载体转染至宿主细胞中并获得稳定细胞株；

(2)将供体质粒和腺病毒转至步骤(1)得到的稳定细胞株中。

本发明利用基因编辑Crispr/Cas9系统将腺病毒基因组DNA双链和包含目的基因的供体质粒同时在相同的靶点切开，利用宿主细胞内非同源重组末端连接机制将供体质粒和病毒基因组直接相连接获得重组病毒。

本发明的腺病毒包装方法为：先构建稳定表达sgRNA1、sgRNA2以及Cas9的细胞株，其中，sgRNA1靶向腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间，sgRNA2靶向(a)腺病毒基因组携带外源基因表达盒的启动子和转录终止信号之间以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。当供体质粒转染至该细胞株中时，由于供体质粒含有sgRNA2的识别位点(即sgRNA2靶向供体质粒)，供体质粒被sgRNA2识别并被Cas9切割，得到切割后的供体质粒；当腺病毒感染该细胞株时，由于腺病毒的基因组上有sgRNA1、sgRNA2的识别位点(即sgRNA1、sgRNA2靶向腺病毒基因组)，sgRNA1、sgRNA2可引导Cas9在腺病毒基因组的sgRNA1识别位点和sgRNA2的识别位点发生切割，进而切除腺病毒基因组的包装信号，得到切割后的病毒基因组；切割后的供体质粒与切割后的病毒基因组发生非同源末端连接DNA修复，从而最终包装出表达目的基因的重组腺病毒。

本发明具备以下优点：

1、操作步骤简单，本发明只需要将目的基因克隆到供体质粒，不需要复杂的分子克隆以及大质粒的制备、节省大量的时间和成本。

2、病毒包装时间缩短，病毒效价高。优选的情况下，当使用的腺病毒为ADV-GFP腺病毒时，本发明可在转染供体质粒后4-6小时直接感染ADV-GFP腺病毒，在感染后的2-3天即可出现重组病毒，第5天可以产生大量重组病毒。

3、病毒包装结果验证方法简单：优选的情况下，供体质粒中含有荧光蛋白基因，由于供体质粒中不含有转录终止信号，因此供体质粒不与腺病毒基因组发生重组时，单独供体质粒不表达荧光蛋白，因此荧光蛋白的表达可以作为重组病毒包装成功与否的标志；供体质粒上不含有sgRNA1的识别位点，因此不会被sgRNA1识别，供体质粒含有sgRNA2的识别位点，腺病毒ADV-GFP感染至细胞中，切割后的供体质粒与切割后的病毒发生非同源末端连接DNA修复，由于不含有sgRNA1的识别位点，从而最终包装出表达目的基因的重组腺病毒；腺病毒ADV-GFP感染至细胞中，腺病毒ADV-GFP基因组中同时含有sgRNA1和sgRNA2的识别位点，腺病毒的基因组被Cas9切割后，即使病毒基因组发生非同源末端连接DNA修复，由于连接后的腺病毒基因组缺乏腺病毒包装信号，无法成功包装出病毒颗粒。

附图说明

图1为lentiCRISPR v2质粒图谱。

图2为实施例2中的酶切后的lentiCRISPR v2质粒的电泳图

图3为sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的测序结果。其中，A为lentiCRISPR v2-sgRNA1测序结果图，B为lentiCRISPR v2-sgRNA2测序结果图。

图4为实施例1步骤(2)中转染HEK293细胞所用质粒的质粒图谱。其中，A为辅助质粒PLP1图谱，B为辅助质粒PLP2图谱，C为辅助质粒PLP-VSVG图谱，D为主质粒lentiCRISPRv2-sgRNA1图谱，E为主质粒lentiCRISPR v2-sgRNA2图谱。

图5为实施例2中所用腺病毒ADV-GFP的基因组图谱

图6为实施例2步骤(3)中不同时间包装重组病毒的荧光强度。其中，

A:实验组细胞ADV-GFP感染48h的细胞明场；

B:实验组ADV-GFP感染48h包装出重组病毒的红色荧光强度；

C:实验组细胞ADV-GFP感染72h的细胞明场；

D:实验组细胞ADV-GFP感染72h包装出重组病毒的红色荧光强度；

E:实验组细胞ADV-GFP感染96h的细胞明场；

F:实验组细胞ADV-GFP感染96h包装出重组病毒的红色荧光强度；

G:对照组细胞感染48h的细胞明场；

H:对照组细胞感染48h包装出重组病毒的红色荧光强度；

I:对照组细胞感染72h的细胞明场；

J:对照组细胞感染72h包装出重组病毒的红色荧光强度；

K:对照组细胞感染96h的细胞明场；

L:对照组细胞感染96h包装出重组病毒的红色荧光强度。

图7为不同时间扩增病毒的滴度测定。

图8为本发明的在一些实施方式的实验原理图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

未作特殊说明的情况下，本发明述及的各种表达元件或序列以5’至3’的顺序示出和连接。

本发明第一方面提供一种腺病毒包装用系统，所述系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；

其中，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；

所述供体质粒由5’-3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因，并且不含有转录终止信号；

所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；

所述sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；

所述sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间，以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。应当理解的是，在用于腺病毒包装的腺病毒中，为了表达外源基因，腺病毒基因组含有外源基因表达盒。本发明中，所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒。优选的情况下，所述腺病毒基因组含有一个外源基因表达盒。其中，所述外源基因表达盒的位置、含有元件均可以为本领域常规技术选择，本领域技术人员可以毫无意义地知晓。

本发明中，所述反向末端重复序列(ITR)指的是腺病毒基因组本身所含有的反向末端重复序列。应当理解的是，本发明中，所述供体质粒含有的反向末端重复序列与所述腺病毒基因组含有的反向末端重复序列的序列相同。例如，当所述腺病毒为ADV-GFP腺病毒时，所述供体质粒含有的反向末端重复序列与ADV-GFP腺病毒的反向末端重复序列的序列相同。

本发明中，所述Cas9也称为Cas9蛋白或Cas9核酸酶，所述Cas9的种类可以为本领域常规的技术选择，在此不再赘述。优选的情况下，编码所述Cas9的核苷酸片段经密码子优化以在真核细胞中表达。

本发明中，所述sgRNA指的是向导RNA。所述sgRNA的识别位点指的是能够被sgRNA所识别的序列。

本发明中，所述包装信号指的是腺病毒包装信号，优选为包装信号Ψ。应当理解的是，对所述包装信号Ψ的选择为本领域常规技术操作，本领域技术人员可以根据实际需要选择，在此不再赘述。

本发明中，可以采用根本领域常规的方法来构建所述表达载体，例如，所述Cas9、sgRNA1、sgRNA2可以在同一个表达载体中表达，也可以在不同表达载体中表达。本发明中，当sgRNA1、sgRNA2在不同表达载体中表达时，表达sgRNA1的表达载体称为sgRNA1表达载体；表达sgRNA2的表达载体称为sgRNA2表达载体。优选的情况下，所述Cas9分别与sgRNA1、sgRNA2在两个表达载体中表达。

本发明的一些实施方式中，为了所述表达载体所使用的“载体”可以为本领域常用于构建Cas9、sgRNA1、sgRNA2表达载体的“载体”，例如可以为慢病毒载体。当所使用的“载体”为慢病毒载体时，sgRNA1表达载体也可以称为慢病毒sgRNA1表达载体，sgRNA2表达载体也可以称为sgRNA2表达载体。其中，所述慢病毒载体为慢病毒质粒包装系统中的主质粒和辅助质粒。优选的情况下，用于构建Cas9、sgRNA1、sgRNA2表达载体的“慢病毒载体”为慢病毒质粒包装系统中的主质粒。

应当理解的是，本发明中，所述sgRNA表达载体含有sgRNA骨架序列和sgRNA识别序列。其中，sgRNA表达载体含有的sgRNA骨架序列经过转录后可以与Cas9蛋白结合，该序列为本领域常规技术选择，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不再赘述；所述sgRNA表达载体含有的sgRNA识别序列经过转录后能够识别sgRNA的识别位点。

本发明的一些实施方式中，所述表达载体所使用的“载体”为含有sgRNA骨架序列的载体。优选的情况下，所使用的“载体”还含有Cas9基因，例如lentiCRIPR v2。

本发明的一些实施方式中，sgRNA1表达载体的制备方法为：先设计sgRNA1的识别位点，然后根据sgRNA1的识别位点设计一对引物sgRNA1F和sgRNA1R，进行引物退火得到sgRNA1退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连，得到sgRNA1表达载体，所述sgRNA1表达载体含有sgRNA1识别序列。优选的情况下，所述sgRNA1的识别位点为SEQ ID NO：1，所述sgRNA1F的序列为SEQ ID NO：3，所述sgRNA1R的序列为SEQ ID NO：4。其中，所述sgRNA1识别序列为SEQ ID NO：7。优选的情况下，所述线性质粒为线性化的lentiCRISPR v2。

本发明的一些实施方式中，sgRNA2表达载体的制备方法为：先设计sgRNA2的识别位点，然后根据sgRNA2的识别位点设计一对引物sgRNA2F和sgRNA2R，进行引物退火得到sgRNA2退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连，得到sgRNA2表达载体，所述sgRNA2表达载体含有sgRNA2识别序列。优选的情况下，所述sgRNA2的识别位点为SEQ ID NO：2，所述sgRNA2F的序列为SEQ ID NO：5，所述sgRNA2R的序列为SEQ ID NO：6。其中，所述sgRNA2识别序列为SEQ ID NO：8。优选的情况下，所述线性质粒为线性化的lentiCRISPR v2。

本发明中，所述供体质粒不含有sgRNA1的识别位点。

本发明中，为了防止元件间距离太近，从而影响切割后的修复，各元件之间由一些碱基序列进行间隔，所述碱基序列的选择没有特殊限定，只要能将各元件间隔开即可，为本领域技术人员公知，在此不再赘述。例如，供体质粒中，由5’-3’端依次含有的反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因之间由一些碱基序列进行间隔。应当理解的是，所述供体质粒中，所述反向末端重复序列和包装信号之间的间隔序列不含有sgRNA1的识别位点。

本发明的一些实施方式中，为了方便观察重组病毒是否产生，所述供体质粒还含有荧光蛋白基因，所述供体质粒的荧光蛋白基因为TagRFP基因、RFP基因、mcherry基因、YFP基因中的至少一种。

本发明的一些实施方式中，所述供体质粒的荧光蛋白基因与目的基因融合表达。其中，所述“融合表达”指的是所述供体质粒的荧光蛋白基因与目的基因串联表达。其中，所述供体质粒的荧光蛋白基因可以在目的基因的3’端或5’端。

本发明的一些实施方式中，当所述供体质粒的荧光蛋白基因与目的基因融合表达时，所述荧光蛋白基因与目的基因融合形成融合基因，所述sgRNA2的识别位点位于所述融合基因的3’端。

本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白基因与目的基因不融合表达。当所述荧光蛋白基因与目的基因不融合表达时，本领域技术人员可以根据本领域常规技术选择所述荧光蛋白基因的位置，在此不再赘述。当所述荧光蛋白基因与目的基因不融合表达。当所述荧光蛋白基因与目的基因不融合表达时，所述sgRNA2的识别位点位于荧光蛋白基因和目的基因的3’端。

本发明的一些实施方式中，所述供体质粒还可以含有抗性基因，所述抗性基因的种类为本领域常规技术选择，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不再赘述。

本发明的一些实施方式中，所述sgRNA2的识别位点位于供体质粒上时，所述sgRNA2的识别位点位于供体质粒的目的基因和反向末端重复序列之间。

本发明的一些实施方式中，所述sgRNA2的识别位点位于供体质粒上时，所述sgRNA2的识别位点位于供体质粒的目的基因和抗性基因之间。

本发明的一些实施方式中，所述sgRNA2的识别位点位于供体质粒上时，对所述sgRNA2的识别位点和目的基因的距离没有严格要求，只要能够切割供体质粒同时不破坏ITR、包装信号、启动子和目的基因即可，对此本领域技术人员可根据实际情况进行选择。优选的情况下，所述sgRNA2的识别位点与目的基因之间的碱基数量在10-1000bp之间，优选为20-100bp。

本发明中，所述供体质粒可以通过本领域常规技术手段制备得到，本领域技术人员可根据实际需要进行制备。应当理解的是，制得的供体质粒中不含有sgRNA1的识别位点。

本发明的一些优选的实施方式中，所述供体质粒的制备方法为：合成含有反向末端重复序列ITR、包装信号Ψ、启动子、TagRFP基因和sgRNA2的识别位点并且不含有sgRNA1的识别位点的基因序列，将合成的基因序列克隆到载体上，得到所述供体质粒。其中，所述供体质粒所使用的“载体”可以为本领域常用的PUC系列载体，例如可以为pUC-57-Kan。优选的情况下，所述启动子为miniCMV启动子。

本发明的一些实施方式中，所述腺病毒的基因组还含有荧光蛋白基因。优选的情况下，所述腺病毒基因组的荧光蛋白基因与供体质粒的荧光蛋白基因不同。进一步优选地，所述腺病毒基因组的荧光蛋白基因为GFP基因、eGFP基因、coGFP基因中的至少一种。

本发明的一些实施方式中，当所述腺病毒的基因组含有荧光蛋白基因时，所述腺病毒基因组的荧光蛋白基因位于腺病毒组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间；其中，所述sgRNA2的识别位点位于腺病毒基因组的荧光蛋白基因上。

本发明的一些实施方式中，所述腺病毒为ADV-GFP腺病毒。

本发明中，所述ADV-GFP腺病毒可以商购得到，也可以通过自行制备得到。所述ADV-GFP腺病毒的制备方法可以用本领域常规技术进行制备，在此不再赘述。

本发明的一些实施方式中，当所述腺病毒为ADV-GFP腺病毒时，所述sgRNA1识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号Ψ之间，所述sgRNA2识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的GFP基因上。

本发明一种优选的实施方式中，所述腺病毒包装用系统包括表达载体、供体质粒和ADV-GFP腺病毒；

其中，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；

所述供体质粒由5’-3’端依次含有ADV-GFP腺病毒的反向末端重复序列、包装信号Ψ、启动子、目的基因、TagRFP基因，并且不含有终止子；

所述sgRNA1的识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号Ψ之间；

所述sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组的GFP基因上，以及(b)供体质粒的荧光蛋白基因和目的基因的3’端；

优选地，所述供体质粒的荧光蛋白基因和目的基因融合表达。

本发明第三方面提供如前所述的系统在腺病毒包装中的应用。

本发明第四方面提供如前所述的系统进行腺病毒包装的方法，所述方法包括：

(1)将表达载体转染至宿主细胞中并获得稳定细胞株；

(2)将供体质粒和腺病毒转至步骤(1)得到的稳定细胞株中。

本发明中，所述宿主细胞可以为本领域常用的用于腺病毒包装的细胞，例如可以为HEK293T细胞、HEK293A细胞或HEK293细胞。优选的情况下，所述宿主细胞为HEK293细胞。

本发明中，所述表达载体转染至宿主细胞的方法和条件可以为本领域常规选择，例如可以为化学转染法。本领域技术人员可以根据实际情况对其方法和条件进行调整，在此不再赘述。

本发明的一些实施方式中，为了缩短获得稳定表达所述Cas9、sgRNA1、sgRNA2的稳定细胞株的时间，所述表达载体可以利用慢病毒包装质粒系统转染至宿主细胞中。因此，本发明的一些实施方式中，步骤(1)为：将表达载体和慢病毒包装质粒系统的辅助质粒同时转染至宿主细胞中。优选的情况下，步骤(1)还包括转染至宿主细胞中后进行稳定细胞株的筛选。所述稳定细胞株的筛选可以为本领域常用的方法，例如可以为药物抗性筛选。

本发明中，所述慢病毒包装质粒系统为本领域常用的慢病毒包装质粒系统，所述辅助质粒也为本领域常规技术选择，可以通过商购获得；所述慢病毒包装质粒系统的转染方法也为本领域常规技术选择，在此不再赘述。本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)包括：先使用供体质粒转染所述稳定细胞株，再将腺病毒感染所述稳定细胞株。

本发明中，所述供体质粒转染、腺病毒感染的方法和和条件可以为本领域常规选择，本领域技术人员可以根据实际情况对表达载体转染的方法和条件进行调整，在此不再赘述。

为了更好的说明本发明的腺病毒包装用系统以及其进行腺病毒包装的原理，以本发明的一些实施方式所述的腺病毒包装用系统的原理图(图8)进行说明。如图8所示，所述供体质粒由5’-3’端依次含有ADV-GFP腺病毒的反向末端重复序列ITR、包装信号Ψ、启动子(promoter)、目的基因(GOI)、荧光蛋白基因TagRFP、ori、Kana抗性基因，并且不含有终止子，也不含有sgRNA1的识别位点，其中目的基因和荧光蛋白基因为融合形成融合基因；所述腺病毒为ADV-GFP腺病毒；所述sgRNA1的识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的5’端的反向末端重复序列ITR和包装信号Ψ之间；所述sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组的GFP基因上，以及(b)供体质粒的融合基因的3’端；其中，所用宿主细胞为HEK293T细胞。先将能够表达sgRNA1、sgRNA2、Cas9的表达载体转至HEK293T细胞并获得稳定的细胞株，然后将供体质粒、ADV-GFP腺病毒转至稳定表达的细胞株中。供体质粒、ADV-GFP腺病毒转至稳定表达sgRNA1、sgRNA2以及Cas9的HEK293T细胞株后，由于供体质粒含有sgRNA2的识别位点，供体质粒被sgRNA2识别并被Cas9切割，得到切割后的供体质粒；由于腺病毒的基因组上有sgRNA1、sgRNA2的识别位点，sgRNA1、sgRNA2可引导Cas9在腺病毒基因组的sgRNA1识别位点和sgRNA2的识别位点发生切割，进而切除腺病毒基因组的包装信号，得到切割后的病毒基因组；切割后的供体质粒与切割后的病毒基因组发生非同源末端连接DNA修复，从而最终包装出表达目的基因的重组腺病毒。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，除非特别说明，所用产品均购自正规化学或生物试剂供应商，所用方法均为本领域常用方法。以下实施例中，除非特殊说明，采用、合成的序列均委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成，测序均委托北京睿博兴科生物技术有限公司进行。

以下实施例中，除非特殊说明，所用细胞培养基为含10％FES的DMEM培养基。

抗性(Amp+，氨苄青霉素)LB培养基的成分配比为：蛋白胨10g/L、酵母浸液5g/L、氯化钠10g/L、Amp+100ug/ml。当抗性(Amp+)LB培养基为固体时，还含有15g/L的琼脂。

所用ADV-GFP病毒购自苏州镁伽科技有限公司，病毒图谱如图5所示。

sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的转化按照以下方法进行：

(1)细菌转化

准备工作(提前30min)：从-80℃冰箱取出储存在EP管中的感受态细胞Trans-T1(购自北京全式金)(每管为100μL)，置于冰上融化(约15min)后，每管分出一半(50μL)到一个新EP管；打开42℃和37℃两个水浴锅；取抗性(Amp+)LB固体培养基放入37℃培养箱预热。

每管感受态细胞Trans-T1(50μL)分别进行如下操作：加入10μL待转化的质粒(即sgRNA1表达载体或sgRNA2表达载体)，冰上放置10min，放入42℃水浴锅内，热击40s，快速转移至冰上放置2min，加入500μL无抗生素LB培养基，置于37℃水浴锅内1h，12,000rpm离心2min，弃上清，500μL LB培养基重悬后涂板于抗性(Amp+)LB固体培养基，放入37℃培养箱过夜。

(2)测序鉴定

准备适量EP管，每管加入1mL抗性(Amp+)LB液体培养基。每块细菌培养板挑5个正常大小的单菌落，分别放入上述EP管内，放入37℃振荡培养箱，225rpm，16h，将菌液送测序鉴定，选取测序正确克隆的菌落进行提质粒。

实施例1

本实施例用于说明能够稳定表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2的HEK293稳定细胞株的构建。

(1)构建慢病毒sgRNA载体(sgRNA1和sgRNA2表达载体)

根据ADV-GFP病毒基因组上的ADV的ITR和ADV包装信号之间的序列、GFP序列分别设计两个sgRNA识别位点(即sgRNA1识别位点和sgRNA2识别位点)，根据设计的序列合成两对单链聚核苷酸，每对分别俩俩退火获得两个粘性末端的双链DNA片段，分别与线性化lentiCRISPR v2(ADDGENE:#52961，质粒图谱如图1所示)连接后进行测序分析鉴定，测序正确即得到测序正确的sgRNA1表达载体(命名为lentiCRISPR v2-sgRNA1)和sgRNA2表达载体(命名为lentiCRISPR v2-sgRNA2)。具体步骤如下：

(a)sgRNA引物退火

sgRNA1的识别位点(SEQ ID NO：1，TGGTGTGCGCCGGTGTACACAGG)和sgRNA2的识别位点(SEQ ID NO：2，GCGCGATCACATGGTCCTGCTGG)。根据两个识别位点分别设计一对引物，所述引物序列如表1所示。

表1

SEQ ID NO：3，sgRNA1F(5＇-3＇)	CACCGTGGTGTGCGCCGGTGTACA
		SEQ ID NO：4，sgRNA1R(5＇-3＇)	AAACGTGTACACCGGCGCACACCA
SEQ ID NO：5，sgRNA2F(5＇-3＇)	CACCGCGCGATCACATGGTCCTGC
		SEQ ID NO：6，sgRNA2R(5＇-3＇)	AAACGCAGGACCATGTGATCGCGC

按照表2分别在PCR管中配制反应体系，将反应体系放入PCR仪，95℃变性5分钟后缓慢退火(每6s下降0.1℃)70min，分别得到sgRNA1退火产物和sgRNA2退火产物。

表2

(b)BsmBI酶切lentiCRISPR v2质粒，酶切体系如表3:

表3

BsmBI-V2(购自NEB)	1μL
		NEB Buffer3.1(10×)	10μL
lentiCRISPR v2	4μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	87μL
TOTAL	100μL

将配制好的酶切体系于55℃水浴锅2h，1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，回收14kb的片段载体(图2)，即线性lentiCRISPR v2质粒。

(c)连接

按照表4所示在PCR管中分别配制反应体系(连接体系)，置于室温1h，分别得到线性lentiCRISPR v2质粒与sgRNA1退火产物的连接产物、线性lentiCRISPR v2质粒与sgRNA2退火产物的连接产物。其中sgRNA1表达载体含有sgRNA1的识别序列(SEQ ID NO：7，TGGTGTGCGCCGGTGTACAC)，sgRNA2表达载体含有sgRNA2的识别序列(SEQ ID NO：8，GCGCGATCACATGGTCCTGC)。

表4

(d)sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的转化与质粒提取

分别将线性lentiCRISPR v2质粒与sgRNA1退火产物的连接产物、线性lentiCRISPR v2质粒与sgRNA2退火产物的连接产物进行细菌转化、挑选单克隆、送样测序鉴定，将测序正确的克隆分别命名为：lentiCRISPR v2-sgRNA1(即sgRNA1表达载体)和lentiCRISPR v2-sgRNA2(即sgRNA2表达载体)，测序结果见图3。根据送样测序结果，选择测序正确的克隆进行摇菌，提取sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的质粒。

(e)质粒的提取

在提取质粒的前一天，选取测序正确的lentiCRISPR v2-sgRNA1和lentiCRISPRv2-sgRNA2的菌液，在超净台上，分别吸取菌液于两支装有30mL含Amp+的LB培养基的100mL的摇菌瓶中，然后放置在37℃的振荡培养箱中，220rpm，12-16h。第二天用小提中量试剂盒(天根)提取正确质粒，用Nanodrop测质粒浓度(lentiCRISPR v2-sgRNA1浓度为800ng/μL，lentiCRISPR v2-sgRNA2浓度为1000ng/μL)、纯度(A260/A280、A260/A230均于1.8—2.0)。

(2)转染HEK293药物筛选获得稳定细胞系

(a)细胞铺板

质粒转染前一天，从37℃，5％(v/v)CO₂细胞培养箱拿出细胞状态良好的HEK293细胞(购自中国医学科学院细胞库，GNHu17)，吸出原培养基，加入PBS 1ml轻轻洗细胞表面之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心，1000rpm，5min，吸出上清液，加入1ml培养基吹打混匀后，计数后制备成6×10⁵个/mL的细胞悬液，6孔板每个孔中加入2mL细胞悬液、摇匀，37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养。细胞密度达到约80％融合时，将市售慢病毒包装质粒系统的辅助质粒(辅助质粒PLP1、PLP2、PLP-VSVG，均购自庄盟生物，图4A、B、C所示)及lentiCRISPR v2-sgRNA1(图4D)和lentiCRISPR v2-sgRNA2(图4E)(即主质粒)，按照表5配制转染体系。

表5

按照上表配制好体系后，将A管溶液加入B管内，混匀、静置10min，逐滴加入到待转染的细胞，6h后将转染后细胞的培养基吸弃，沿皿壁缓慢加入新鲜的细胞培养基，放入37℃，5％ CO₂培养箱培养。

转染24h后，取出HEK293细胞，收集24h后的病毒上清于离心管中，沿皿壁缓慢加入新鲜的细胞培养基。转染48h后，准备好15ml离心管，收集48h后的病毒上清于离心管中。

(b)稳定细胞系的筛选

收集48h的病毒上清后，将细胞传代至10cm皿中，加入2.5ug/mL的嘌呤霉素(puromycin)，每隔2-3天换一次终浓度2.5ug/mL嘌呤霉素(puromycin)的新鲜的细胞培养基。

药物筛选约5天后，可获得稳定细胞株，将此细胞株命名为HEK293ADVΨ/GFPsgRNA。

实施例2

本实施例用于说明重组腺病毒的构建。

(1)供体质粒(ADV-miniCMV-TagRFP质粒)的构建

ADV-mini-CMV-TagRFP序列由金斯瑞公司全基因合成(合成的序列中不含有sgRNA1的识别位点)，合成的基因序列克隆到pUC57-Kan(金斯瑞提供)，得到的供体质粒不含有sgRNA1的识别位点。其中ADV-miniCMV-TagRFP序列由5’端-3’端依次包含的主要元件有ADV-GFP病毒的反向末端重复序列ITR、包装信号Ψ(AD5Ψ)、minimal CMV启动子、TagRFP序列和sgRNA2识别位点，每个元件序列间有间隔的序列。

反向末端重复序列ITR:

CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAG(SEQ ID NO：9)

AD5Ψ：

GTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGAGATCAG(SEQ ID NO：10)

Minimal CMV启动子：

GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGGTACCGCCACCACCGGTGCCACC(SEQ ID NO：11)

TagRFP序列：

ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAGAACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAGGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAGCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACCACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAAACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAATTGA(SEQ ID NO：12)

sgRNA2的识别位点：

GCGCGATCACATGGTCCTGCTGG(SEQ ID NO：2)

(2)转染供体质粒

在HEK293ADVΨ/GFP sgRNA(实验组)及野生型HEK293(对照组)细胞系中转染合成的供体质粒(ADV-miniCMV-TagRFP质粒)。转染前按照上述细胞铺板，细胞制备成6×10⁵个/mL的细胞悬液，在6孔板每个孔中加入2mL细胞悬液，摇匀，37℃、5％CO₂培养箱培养，第二天当细胞密度达到80％融合时，进行细胞的转染。按照表6配制转染体系：

表6

配制好转染体系后，将A管中的液体逐滴加入到B管内，混匀，静置10min，逐滴加入到待转染的细胞中，将细胞放回到培养箱中培养。

(3)感染ADV-GFP病毒

实验组和对照组细胞在转染供体质粒6h后，将培养基吸弃，更换新鲜的细胞培养基，同时向两种细胞中按照MOI＝10加入ADV-GFP病毒液(10¹⁰TCID₅₀/ml，苏州镁伽科技有限公司，ADV-GFP的病毒图谱见图5)。ADV-GFP病毒感染后48h、72h和96h，分别镜下观察细胞的荧光情况。如图6，实验组在病毒感染后48h即可以看到红色荧光出现，表明有重组病毒产生，随着时间延长，红色荧光表达量逐渐增加，说明供体质粒和腺病毒ADV-GFP在Cas9/sgRNA的作用下发生切割，经过细胞内DNA非同源重组末端连接修复将供体质粒与腺病毒基因组连接包装出带有红色荧光的重组病毒；而对照组，由于野生型HEK293不表达Cas9/sgRNA，不能切割腺病毒基因组，供体质粒不能与腺病毒基因组连接，而供体质粒自身不含转录终止信号导致转录mRNA不稳定无法单独表达TagRFP红色。通过对表达红色与否可以对重组病毒的包装是否成功进行早期的判断。

(3)获得重组病毒

步骤(2)中的实验组，感染后待50％出现细胞病变(120h)、从细胞培养板上脱落时进行收毒，准备好15mL离心管，做好相应的标记。吸取细胞上清液来回吹打皿底部细胞，让细胞完全脱落，然后将细胞与上清液全部收集到对应的15mL离心管中，拧紧管盖，直接放置-80℃冰箱中直至完全结冰，然后放至37℃水浴锅中彻底融化(反复3次)。4000rpm/10min离心。吸取上清分装到病毒管中，得到重组腺病毒液，-80℃保存备用。

实施例3

本实施例用于说明重组病毒扩增及病毒滴度的测定

(1)重组病毒扩增

野生型HEK293细胞消化传代制备成5×10⁵个/mL的细胞悬液，在6孔板每个孔中加入2mL细胞悬液，摇匀，37℃、5％ CO₂培养箱培养,第二天当细胞密度达到50％融合时，将实施例2得到的实验组的重组腺病毒液按照1％(体积比)的接毒量接种6孔板HEK293细胞，感染4h后弃去培养基，更换新鲜细胞培养基，并分别在接种病毒24h、48h、72h、96h、120h和144h收获病毒液，吸取细胞上清液来回吹打皿底部细胞，让细胞完全脱落，然后将细胞与上清液全部收集到对应的15mL离心管中，拧紧管盖，直接放置-80℃冰箱中直至完全冻住，然后放至37℃水浴锅中彻底融化(反复3次)。4000rpm/10min离心。吸取上清分装到病毒管中，得到不同收毒时间的重组腺病毒液，简称24h病毒液、48h病毒液、72h病毒液、96h病毒液、120h病毒液和144h病毒液，-80℃保存备用。

(2)病毒滴度的测定

将步骤(1)中不同收毒时间的病毒液分别按照以下方法进行梯度稀释，得到24h病毒液、48h病毒液、72h病毒液、96h病毒液、120h病毒液和144h病毒液的不同稀释度的重组腺病毒稀释液：准备9个1.5ml EP管，每管加入900μl细胞培养液，往第一个管中加入100μl步骤(1)获得的重组腺病毒液，混匀后，吸取100μl加入第二个管混匀，依此类推，一共设置9个梯度，每个梯度10倍关系递变，根据浓度高低，依次标注：10^-1稀释液、10^-2稀释液、10^-3稀释液、10^-4稀释液、10^-5稀释液、10^-6稀释液、10^-7稀释液、10^-8稀释液、10^-9稀释液、10^-10稀释液、10^-11稀释液、10^-12稀释液。

提前一天在96孔板接种野生型HEK293细胞，3000个细胞/孔，次日(接种后24h)弃去培养液，分别加入不同稀释度的、不同收毒时间的重组腺病毒稀释液(100μL/孔)，同一收毒时间、不同稀释度的重组腺病毒稀释液在一个96孔板进行病毒滴定，从左至右依次进行不同稀释度的重组腺病毒稀释液的测定，每个样品的测定做8个重复。24h后补加细胞培养基，100μL/孔；120h后荧光拍照并进行滴度计算，96孔板从左至右数出最后2排有荧光的细胞克隆数，分别假设为X和Y，则病毒滴度(TCID₅₀/mL)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μL)，滴度测定重复三次。从图7结果可以看出该发明的方法制备的重组病毒具有良好的繁殖扩增能力，在病毒感染HEK293细胞24h后病毒迅速增殖，在120h病毒增殖达到峰值，随后病毒滴度开始下降。

通过上述实施例可以看出，本发明的腺病毒包装用系统及腺病毒包装方法病毒包装时间段，病毒效价高。上述实施例中，通过含有TagRFP基因的供体质粒以验证重组病毒产生情况，并通过实验结果可以看出重组病毒中TagRFP基因能够表达，应当理解的是，能够通过上述实施例的结果能够知晓当供体质粒含有目的基因时也能够稳定表达目的基因。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种腺病毒包装用系统，其特征在于，所述系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；

其中，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；

所述供体质粒由5’-3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因，并且不含有转录终止信号；

所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；

所述sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；

所述sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间，以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述供体质粒还含有荧光蛋白基因，所述供体质粒的荧光蛋白基因为TagRFP基因、RFP基因、mcherry基因、YFP基因中的至少一种；

和/或，所述包装信号为包装信号Ψ。

3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述供体质粒的荧光蛋白基因与目的基因融合表达。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的系统，所述腺病毒的基因组还含有荧光蛋白基因，所述腺病毒基因组的荧光蛋白基因为GFP基因、eGFP基因、coGFP基因中的至少一种；

其中，所述腺病毒基因组的荧光蛋白基因位于腺病毒组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间；

其中，所述sgRNA2的识别位点位于腺病毒基因组的荧光蛋白基因上。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的系统，其中，所述腺病毒为ADV-GFP腺病毒。

6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述sgRNA1识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号Ψ之间，所述sgRNA2识别位点位于ADV-GFP腺病毒基因组的GFP基因上。

7.权利要求1-6中任意一项所述的系统在腺病毒包装中的应用。

8.一种使用权利要求1-6中任意一项所述的系统进行腺病毒包装的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将表达载体转染至宿主细胞中并获得稳定细胞株；

(2)将供体质粒和腺病毒转至步骤(1)得到的稳定细胞株中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述宿主细胞为HEK 293细胞。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述步骤(2)包括：先使用供体质粒转染所述稳定细胞株，再将腺病毒感染所述稳定细胞株。

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