CN116064659A - 基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用,将载体pCDN3.1‑CMV‑G418通过SacI/PmeI双酶切获得线性化片段,将SEQ IDNO.4‑SEQ ID NO.5所示引物和SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.7所示引物对D型HBV1.3倍体质粒扩增获得片段1和片段2,与所述线性化片段通过无缝克隆获得重组质粒,经ScaI单酶切后转染肝癌细胞,经抗性筛选获得基于Spacer基因定向插入HiBit标签的具有复制能力的细胞系。源于该细胞模型可获得具有复制感染能力的新型重组病毒,可完成病毒的整个生活周期,实现简单快速的检测和抗病毒药物高通量的筛选。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科,主要感染人的肝细胞,可导致急性或慢性肝炎,HBV慢性感染可显著提高肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的发病率。虽然近几十年已存在针对乙型肝炎的预防性疫苗,但全世界约有2.57亿人正遭受HBV感染的困扰,HBV感染仍然是全球范围内严重的公共安全问题(WHO.Hepatitis B FactSheet.Available at:https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b(Accessed:March 2020)(2020).)。现由美国食品和药品管理局(FDA)批准针对慢性HBV感染的治疗性药物主要有两类:I型干扰素(IFNA)和核苷类似物(Nucleos(t)ideanalogues,NAs)。这两种药物治疗均在一定程度上抑制HBV复制,但是不能彻底清除肝细胞中乙肝病毒共价闭合环状DNA(cccDNA),未能实现HBV功能性治愈(Kwon H,LokAS.Hepatitis B therapy.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011.8:275-284.NassalM.HBV cccDNA:viral persistence reservoir and key obstacle for a cure ofchronic hepatitis B.Gut 2015.64:1972-1984.)。因此,探究HBV慢性感染机制以及研发和筛选能够治愈乙型肝炎的新型药物仍然是需要解决的重要科学问题。
为了解决以上问题,最理想的方法是构建能够快速、高效地监测HBV复制感染过程且稳定表达报告基因或者荧光元件的重组病毒,通过检测报告基因或标记物往往比检测HBV指标(HBV-DNA,HBsAg,HBeAg,HBV RNA和HBV cccDNA)要容易得多。通过将外源基因定向插入病毒基因组构建重组病毒报告系统,在一定程度上不影响其生活周期的情况下产生重组病毒是非常困难的。对于HBV而言,实现病毒标记其自身具有一定的局限性。首先,HBV基因组仅有3.2kb,排列紧密,包含四个重叠的开放阅读框(preC/C,P,preS1/preS2/S和X),同时还包含多个顺式作用的控制元件,如用于前基因组RNA(pgRNA)合成、包装和反转录的复制控制区。因此,在排列紧密的HBV基因组中很难找到合适的插入位置。其次,能够被有效组装进入HBV衣壳的基因组的大小是有严格限制的,外源基因插入会严重影响病毒的包装效率。此外,即使以回补方式补充完整的HBV蛋白,也很难恢复因插入外源基因而造成的功能损失。现阶段,虽然已经报道了多种标记策略来制备重组HBV,但是具有复制感染能力的重组乙肝病毒的尝试都没有成功(Bai WY,Cui XX,Xie YH,Liu J.EngineeringHepadnaviruses as Reporter-Expressing Vectors:Recent Progress and FuturePerspectives.Viruses.2016 May 10;8(5).E125.)。
HBV长期慢性感染的原因是HBV cccDNA在宿主细胞长期稳定存在。现阶段,临床上用于慢性乙肝的药物主要是干扰素和核苷酸类似物,这些药物虽然在一定程度上可以抑制HBV复制,但是未能达到功能性治愈。因此,开发新型抗HBV药物迫在眉睫。急需建立高效的HBV细胞培养系统来模拟HBV的整个生命周期,并能简单、快速、高效地监测HBV复制感染水平。因此,有必要开发一种具有复制感染能力新型重组病毒报告系统,用于快速、高效和高通量的体外筛选。
发明内容
为了解决所述技术问题,本发明提供了一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系、重组病毒及其制备方法与应用,基于NanoBiT荧光互补的报告系统,将HiBit编码序列定向插入到D型HBV1.3基因组中,特异性与LgBiT大亚基结合,在底物的作用下发出稳定的荧光信号,成功构建了重组病毒报告系统。该构建策略可以获得新型重组病毒(HBV-HiBit),并且在一定程度上并不影响病毒的复制感染能力。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
在本发明的第一方面,提供了一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系的制备方法,所述方法包括:
将载体pCDN3.1-CMV-G418通过SacI/PmeI双酶切,获得线性化载体骨架片段;
将SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示引物和SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示引物对D型HBV1.3倍体质粒进行扩增,分别获得片段1和片段2;
将所述线性化载体骨架片段、片段1和片段2通过同源重组和转化,获得重组质粒pCDN3.1-CMV-HBV1.3-HiBit-G418;
将所述重组质粒pCDN3.1-HBV1.3-HiBit-G418经ScaI单酶切获得线性化片段,后转染HepG2细胞并通过G418抗性筛选,获得多克隆细胞系;将所述多克隆细胞系通过G418抗性筛选,获得基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系。
所述载体pCDN3.1-CMV-G418质粒序列如SEQ ID NO.2所示;
所述HBV1.3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述重组质粒pCDN3.1-HBV1.3-HiBit-G418的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的第二方面,提供了采用所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系。
在本发明的第三方面,提供了基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒的制备方法,所述方法包括:
将所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系扩大培养至细胞密度达到70%-90%时更换为含有DMSO的培养基进行诱导,收集细胞培养上清,并更换为新鲜的产毒培养基;
将所述细胞培养上清通过离心和过滤,获得浓缩病毒液,即基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒。
进一步地,所述含有DMSO的培养基中DMSO的添加体积为培养基体积的2%±0.5%。
在本发明的第四方面,提供了采用所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒。
在本发明的第五方面,提供了所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
在本发明的第六方面,提供了所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明提供的一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系及其制备方法与应用,基于NanoBiT技术,小亚基HiBit可特异性与大亚基LgBit结合,在底物作用下发出稳定的荧光信号,通过酶标仪可以快速、高效地进行检测,具体地:
(1)本发明通过将新型标签HiBit作为报告基因定向插入到D型HBV1.3基因组中,进行稳定细胞系的筛选,获得HBV1.3-HiBit DNA稳定整合的细胞模型,源于该模型可以制备新型具有复制感染能力的重组病毒。外源序列定向插入HBV基因组实现重组病毒的构建存在一定的局限性。本发明的创新性之一在于外源序列的插入位置:首先,HBV基因组仅有3.2kb且排列紧密,包含四个重叠的开放阅读框(preC/C,P,preS1/preS2/S,和X),其基因组包含多个顺式作用的控制元件,因此,很难找到合适的插入位置。其次,有效包装HBV衣壳的基因组大小有严格限制,外源基因插入会严重影响包装效率。
(2)本发明的创新性之二在于融合表达外源标签的重组病毒HBV1.3-HiBit能够实现病毒的感染复制。基于基因组插入位点的正确选择以及外源HiBit片段的大小,重组病毒报告系统成功构建。该报告系统只需要借助化学发光法检测细胞培养上清中化学信号的强弱来替代相关HBV指标的检测,操作简单、快速、高效。本发明构建的新型重组病毒报告系统可用于病毒与宿主相互作用的基础研究及新型抗病毒药物的开发和评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是外源标签定向插入病毒基因组的示意图;
图2是通过无缝克隆技术进行pCDN3.1-CMV-HBV1.3-HiBit-G418重组质粒的构建;
图3是融合表达外源标签重组质粒表型验证;其中图3A为质粒转染时间流程图;图3B和3C分别为野生型质粒和重组质粒转染2d和4d后细胞培养上清中HBeAg和HBsAg分泌水平的检测;图3D为野生型质粒和重组质粒转染后胞内蛋白水平的表达情况;
图4是HBV1.3-HiBit DNA稳定整合细胞模型的构建及筛选;其中,图4A为HBV1.3-HiBit DNA稳定整合细胞模型的构建过程;图4B为筛选过程中HBV相关复制指标的检测情况,横坐标分别代表待检测的细胞株,其中HepAD38为阳性对照。
图5是新型重组病毒的制备;其中,图5A为新型重组病毒的制备过程;图5B为重组病毒滴度检测;
图6是新型重组病毒感染后相关HBV复制指标的检测;图6A为重组病毒感染过程流程图;图6B为重组病毒感染后上清中HBeAg指标的检测;图6C为重组病毒感染后蛋白表达情况。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及,以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法,可通过查询文献获得;用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件,不进行额外的冷却或加热处理,一般常温控制在10~30℃,最好是15~25℃。
实施例1、基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系及其制备方法
一、线性化载体片段制备
用于获得线性化载体骨架片段的质粒模板为pCDN3.1-CMV-G418(该载体骨架序列是常用序列)。用于获得线性化载体骨架片段的酶切位点为SacI(#R3156S)和PmeI(#R0560S),pCDN3.1-G418线性片段大小为5.6kb。利用NEB公司的限制性内切酶SacI和PmeI进行双酶切,反应总体系为:SacI 1μl,PmeI 1μl,模板2μl,CutSmart buffer 5μl,灭菌蒸馏水补至50μl。反应条件为37℃,1h。
二、插入目的片段的获得
通过PCR技术扩增目的片段,用于扩增HBV目的片段的模板为D型HBV1.3倍体质粒(基因型D,序列见SEQ ID NO.3所示)。设计并合成引物见下表,利用Vazyme公司高保真DNA聚合酶(货号P510-01),反应体系25μl,PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5μl,引物F/R各0.5μl,模板1μl(1ng),灭菌蒸馏水10.5μl。反应条件98℃,10s,56℃,5s或15s,72℃,5s/kb,32个循环。扩增HBV1.3-HiBit用的模板为HBV1.3倍体,使用的扩增引物为HBV1.3-F1/HBV1.3-HiBit-R1和HBV1.3-HiBit-F2/HBV1.3-R2。本实施例中,将新型HiBit序列添加到扩增HBV1.3序列的引物上,分两段进行PCR扩增获得目的片段。本实施例中涉及的引物序列如表1所示:
表1
三、胶回收纯化目的片段
采用DNA胶回收试剂盒(Vazyme,货号DC301)获得纯化后的目的片段。具体操作如下:
1.将上述通过双酶切获得的线性片段和通过PCR获得的目的片段分别进行DNA电泳,在紫外灯照射下快速回收包含目的DNA片段的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量),100mg凝胶等同于100μl体积,作为一个凝胶体积。
2.加入等倍体积Buffer GDP。50-55℃水浴7-10min,确保凝胶完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。
3.短暂离心收集管壁上的液滴。将Fastpure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中,把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中,12000×g离心30-60s。若溶胶体积大于700μl,把吸附柱放回收集管中,剩余的溶胶液转移至吸附柱中,12000×g离心30-60s。
4.弃滤液,把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12000×g离心30-60s。
5.弃滤液,把吸附柱置于收集管中。加入600μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000×g离心30-60s。
6.重复步骤5。
7.弃滤液,把吸附柱放回收集管中。12000×g离心2min。
8.将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中,加入7-30μl Elution Buffer至吸附柱中央,放置2min。12000×g离心1min。弃去吸附柱,把DNA保存于-20℃。
四、线性化载体与插入片段同源重组
将纯化得到的上述三个片段通过无缝克隆方法进行同源重组,参照ABclonalMultiF Seamless Assembly Mix(货号RK21020)试剂盒说明书进行操作,10μl反应体系:
表2
反应条件:50℃作用30min。1-2个片段插入到载体,推荐用0.02-0.5pmols的DNA总量(包含所有片段和载体的DNA总量)。可根据片段的长度和质量来计算得到每个片段的pmols数,计算公式:pmols=(质量ng)×1000/(碱基对数×650道尔顿)。
五、重组产物转化
1、取冻存于-80℃的100μl DH5a感受态置于冰上融化;
2、将上述同源重组连接产物快速加入到感受态细胞中,轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀),冰上静置30min;
3、42℃水浴热激45s后,立即置于冰上冷却2-3min;
4、加入900μl SOC或LB培养基(不添加抗生素),37℃摇菌1h;
5、将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热;
6、将培养物5000rpm离心5min,用移液枪弃掉900μl上清,用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。置于37℃培养箱倒置培养过夜。
六、菌液PCR鉴定
过夜培养后,转化平板上形成数百个单克隆。挑取转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定,PCR反应体系为:待测菌液1μl,上下游引物各0.5μl,2×DNA聚合酶mix 12.5μl,去离子水10.5μl。PCR反应程序为:预变性:95℃,3min;变性:95℃,30s,退火:56℃,15s;延伸:72℃,1min,32个扩增循环。将扩增PCR产物跑1%琼脂糖凝胶电泳并进行成像。
七、质粒测序
选取步骤六中鉴定正确的单菌落,按1:1000比例接种到50ml离心管中。置于37℃摇床,200转/分钟,培养14-16h。菌液离心弃去上清获得菌体,按照质粒提取试剂盒的操作说明进行质粒提取。同时,进行质粒测序。
八、重组质粒转染及表型验证
1、质粒转染:在24孔细胞培养板铺Huh7细胞(105cell/well),当细胞密度约为60%时进行质粒PEI转染。PEI转染的方法为:在1.5ml的无菌EP管中用opti-MEM分别稀释500ng质粒(记作A液)和1.5μl PEI(记作B液),然后将B液加入到A液中,旋涡震荡混匀,室温静置20min,然后将混合液均匀的加到孔板中。
2、指标检测:重组质粒转染Huh7细胞后收集细胞培养上清及细胞进行相关HBV复制指标的检测。结果如图3所示,表明重组质粒成功构建。
九、HBV1.3-HiBit DNA稳定整合新型细胞模型的构建及筛选
(a)多克隆细胞系的构建及筛选
重组质粒pCDN3.1-HBV1.3-HiBit-G418经单酶切法获得线性化片段,转染HepG2细胞,通过G418抗性筛选获得多克隆细胞系。通过检测细胞培养上清中的HBeAg和HBsAg指标确定多克隆细胞系是否正常工作。具体方法为:
(1)线性化载体的获得:重组质粒pCDN3.1-HBV1.3-HiBit-G418经ScaI单酶切获得线性化载体,酶切体系为:ScaI 2μl,CutSmart Buffer 5μl,重组质粒2μl(2μg),加灭菌水补至50μl。置于37℃孵育1h。通过DNA纯化试剂盒将上述酶切产物进行溶液回收,获得纯化后的线性化片段。
(2)转染:以6孔板为例,当细胞密度达到80-90%时进行转染。取100μl转染溶剂Opti-MEM,线性化后的质粒片段与转染试剂FuGENE-HD(promega)比例为1:4,使用移液枪或旋涡混匀,混合液室温静置15-20min,缓慢加到孔板中并混匀,置于37℃培养箱进行培养。转染后8h换液,更换为新鲜培养基。
(3)筛选:转染后48h更换为含有G418抗性的培养基进行加压筛选,连续进行抗性筛选2-3次,初步筛选获得多克隆细胞株。
(4)HBV相关指标检测:收集上述筛选获得的细胞株的细胞培养上清,通过ELISA方法对其HBeAg和HBsAg表达水平进行检测,若二者均有表达,即多克隆细胞系构建筛选成功。
(b)单克隆细胞系的筛选
为了提高细胞系的产毒能力,进行单克隆细胞系的构建及筛选。具体方法为:
(1)铺细胞:将上述筛选获得的多克隆细胞系HepG2-1.3HBV-HiBit与HepG2按照1:5的比例铺细胞到96孔板;
(2)抗性筛选:在显微镜下对上述已铺细胞进行观察,当孔内有细胞团生成时加入含有G418的筛选培养基进行抗性筛选2-3次,抗性筛选后孔内仅有一个细胞团的可作为初步筛选获得的细胞株。
(3)HBV指标检测:收集上述初步筛选获得的细胞株的培养上清进行HBV指标(乙肝病毒表面抗原/e抗原诊断试剂盒和乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒)的检测。结果如图4所示,表明成功筛选获得单克隆细胞系。
实施例2、基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒及其制备方法
HBV1.3-HiBit DNA稳定整合的新型细胞模型用于重组病毒的制备。具体方法如下:
(1)铺细胞:单克隆细胞株扩大培养铺到T175细胞瓶中;
(2)细胞培养上清的获得:当细胞密度达到90%时更换为含有2%DMSO的培养基进行诱导,每隔两天收集一次细胞培养上清,并更换为新鲜的产毒培养基。
(3)重组病毒过滤浓缩:上述收集的细胞培养上清2000rpm/min离心10min除去细胞碎片,经0.22μm的滤器过滤后使用Plus-70浓缩柱(Millipore)进行浓缩,5000rpm/min 4℃离心60min,获得浓缩病毒液,将浓缩病毒液分装后冻于-80℃。
(4)重组病毒滴度检测:采用乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒检测重组病毒滴度。详细的步骤参照试剂盒说明书。结果如图5所示,源于该模型可以获得重组病毒,其滴度大于109copies/ml。
实施例3、新型重组乙肝病毒体外感染
所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用的具体方法包括:
(1)细胞铺板:以HepG2-NTCP细胞为例,计数后按照3×105cell/well接种于胶原包被的24孔培养板。
(2)HepG2-NTCP细胞汇合达100%时,更换为含2%DMSO、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。
(3)含2%DMSO的DMEM培养基孵育HepG2-NTCP细胞48h后,乙肝病毒以MOI100感染HepG2-NTCP细胞24h,其中,MyrB作为对照组。24h后弃去病毒液,并用PBS洗细胞3次。随后加入含2%DMSO、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基继续培养7天,感染7天后进行后续指标检测。
结果如图6所示,表明新型重组病毒具有复制感染能力,可以支持病毒的整个生活周期。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将载体pCDN3.1-CMV-G418通过SacI/PmeI双酶切,获得线性化载体骨架片段;
将SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示引物和SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示引物对D型HBV1.3倍体质粒进行扩增,分别获得片段1和片段2;
将所述线性化载体骨架片段、片段1和片段2通过同源重组和转化,获得重组质粒pCDN3.1-CMV-HBV1.3-HiBit-G418;
将所述重组质粒pCDN3.1-HBV1.3-HiBit-G418经ScaI单酶切获得线性化片段,后转染HepG2细胞并通过G418抗性筛选,获得多克隆细胞系;将所述多克隆细胞系通过G418抗性筛选,获得基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系。
2.一种采用权利要求1所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系。
3.一种基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将权利要求2所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系扩大培养至细胞密度达到70%-90%时更换为含有DMSO的培养基进行诱导,收集细胞培养上清,并更换为新鲜的产毒培养基;
将所述细胞培养上清通过离心和过滤,获得浓缩病毒液,即基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述含有DMSO的培养基中DMSO的添加体积为培养基体积的2%±0.5%。
5.一种采用权利要求3或4所述的方法制备得到的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒。
6.权利要求2所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的细胞系在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
7.权利要求5所述的基于Spacer基因定向插入HiBit标签的重组病毒在筛选和评估新型抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
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