CN114470212B - EIF4B siRNA在制备治疗埃博拉病毒病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真核翻译起始因子EIF4B(Gene ID:1975)作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用，所述应用包括：采用能够抑制EIF4B表达的物质制备用于预防埃博拉病毒感染或治疗埃博拉病毒病的产品。经实验证明，使用真核翻译起始因子EIF4B siRNA处理细胞后其中埃博拉病毒复制显著降低，证明EIF4B siRNA可有效抑制埃博拉病毒的增殖。本发明还进一步筛选出了对EIF4B有显著敲低作用的siRNA，该siRNA具有更好的抑制埃博拉病毒增殖的作用。本发明为埃博拉病毒感染导致的急性传染病防治提供新的治疗策略。

Description

EIF4B siRNA在制备治疗埃博拉病毒病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及真核翻译起始因子EIF4B作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用。

背景技术

埃博拉病毒病(EVD)是一种由埃博拉病毒(EBOV)引起的人畜共患烈性传染病，自1976年发现以来不间断的在非洲多次爆发。埃博拉病毒属于丝状病毒，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，能够引起人类和非人灵长类急性出血性传染病，死亡率约在50％-90％。埃博拉病毒基因组顺序为3’端非编码区-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’端非编码区，可以编码核蛋白NP、病毒粒子蛋白VP35、基质蛋白VP40、糖蛋白GP、VP30、 VP24、RNA依赖的RNA聚合酶L共7个结构蛋白。尽管埃博拉病毒最初靶向巨噬细胞与树突状细胞，但最终它能够感染除淋巴细胞以外所有类型的细胞。目前针对埃博拉病毒有效的防治策略仍然是亟待解决的世界难题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点，该靶点为真核翻译起始因子EIF4B(Gene ID:1975)，经实验证明，使用真核翻译起始因子EIF4B siRNA处理后细胞中埃博拉病毒复制显著降低，证明EIF4B siRNA可有效抑制了埃博拉病毒的增殖。本发明为埃博拉病毒感染导致的急性传染病防治提供新的治疗策略。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明涉及真核翻译起始因子EIF4B(Gene ID:1975)作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用，所述应用包括：采用能够抑制EIF4B 表达的物质制备用于预防埃博拉病毒感染或治疗埃博拉病毒病的产品。

优选地，所述能够抑制EIF4B表达的物质包括但不限于EIF4B抑制剂、EIF4B siRNA或敲除EIF4B表达的基因编辑工具。

优选地，所述EIF4B siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA，或者为由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4 所示的两条单链退火形成的siRNA。更优选为前者，使用前者对293细胞中的EIF4B进行敲低后，EIF4B的表达量下降更为显著。

5’-CCUUCAAGGACAACUCAAATT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-UUUGAGUUGUCCUUGAAGGTT-3’(SEQ ID No.2)。

5’-GGAACCACUAUGCCAUGAATT-3’(SEQ ID No.3)；

5’-UUCAUGGCAUAGUGGUUCCTT-3’(SEQ ID No.4)。

第二方面，本发明涉及EIF4B siRNA在制备治疗埃博拉病毒感染或埃博拉病毒病药物中的应用；所述所述EIF4B siRNA为由SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

(三)有益效果

本发明提供了一种治疗埃博拉病毒病的新靶点，即真核翻译起始因子EIF4B，研究表明使用真核翻译起始因子EIF4B siRNA处理细胞后，细胞内埃博拉病毒复制显著降低，有效抑制细胞中埃博拉病毒的增殖。本发明为埃博拉病毒感染导致的急性传染病防治提供新策略，在药物研发及疫苗开发方面有重要应用价值。

附图说明

图1为免疫沉淀及免疫印迹检测VP35与EIF4B的相互作用；图中 lysate指的是全细胞裂解液，IP之前的细胞产物。

图2为利用免疫印迹法(WesternBlot)比较不同siRNA敲低EIF4B的能力。

图3为采用筛选的EIF4B siRNA对293细胞中的EIF4B进行敲低后，测试病毒的复制水平变化(RLUC荧光强度相对值)，并与阴性对照组 (NC)和缺失L基因组(△L)进行比较。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

下述实验中需使用的试剂或材料说明(来源、获取途径)如下：

质粒：pCAGGS-NP、pCAGGS-VP35、pCAGGS-VP30、pCAGGS-L、 p4cis-vRNA-Rluc、pCAGGS-T7、pCAGGS-Tim1均为来自军事医学研究院钟武课题组赠予，结构以及迷你基因组相关操作参见Hoenen T等人与 2014年在JoVE杂志发表文章中的图1和图4。

(Hoenen T,Watt A,Mora A,Feldmann H.2014.Modeling the lifecycle ofEbola virus under biosafety level 2conditions with virus-like particlescontaining tetracistronic minigenomes.Journal of visualized experiments: JoVEdoi:10.3791/52381:52381.)

试剂：双荧光素酶检测试剂盒购于Promega公司(目录号为T8787)；转染试剂Lipofectamine2000和Lipofectamine3000购买于Thermo公司； DMEM培养基(目录号为C11995500BT)、胎牛血清(目录号为 16000-044)、胰酶(目录号为25200-056)、PBS(目录号为C10010500BT) 均购于GIBCO；TransIT X2转染试剂购于Mirus Bio公司(目录号为MIR6003)；EIF4B抗体购买于Proteintech公司(目录号为17917-1-AP)；β-Actin抗体购买于Proteintech公司(目录号为66009-1-Ig)；Flag-HRP 抗体购买于Sigma-Aldrich公司(目录号为A8592)；Myc-HRP抗体购买于Sigma-Aldrich公司(目录号为M5546)。

实施例1

本实施例利用免疫共沉淀检测确认EIF4B和VP35的相互作用。VP35 是埃博拉病毒复制过程中重要的结构蛋白。

具体实验方法如下：

(1)构建Myc-EIF4B、Flag-VP35表达载体。构建方法为：

以Myc-EIF4B表达质粒构建为例，阐述相关实验步骤。如下：在数据库NCBI上查找EIF4B基因序列，使用primer5设计出EIF4B扩增引物，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成；PCR扩增目的片段，在37℃使用EcoRI和XhoI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后将酶切产物进行回收。使用T4连接酶将其与PCMV-Myc载体在16℃反应2小时以上，转化DH5α感受态细胞，后将菌液均匀涂布在含有载体对应抗生素的固体LB培养基上。37℃培养10-14小时后，挑取单个菌落在5ml含有抗生素的液体LB培养基中培养，提质粒后送到北京诺赛基因有限公司测序。其他质粒可参照前述方法或采用其他已知方法构建。

(2)将构建好的Myc-EIF4B、Flag-VP35、Flag-Vector等的质粒利用TransIT X2转染试剂按照图1中所示的组合方式转染至293细胞中，每种质粒转染1μg，48h后将培养基吸去，使用预冷1×PBS收集并重悬细胞，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(Tris-HCl50mM pH 8.0， NaCl 150mM，NP40 1％，蛋白酶抑制剂1片/50ml)后，置于冰上30min， 4℃下12000rpm离心10min，吸取上清至干净1.5mL EP管中，加入15μL 偶联Flag抗体的琼脂糖珠，于4℃旋转孵育2h进行免疫共沉淀，4℃下 8000rpm离心1min，去上清，使用不含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液清洗3次，将免疫沉淀产物加入75μl的1×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，4℃下8000rpm离心3min，取10-15μL上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80V电泳30min后，将电压调至120V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。

(3)将PVDF膜用10ml甲醇激活10s，去离子水清洗之后置于1×半干转膜缓冲液中(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM、20％甲醇)，随后将完成电泳的SDS-PAGE凝胶置于PVDF膜上；按照从上至下滤纸-胶- 膜-滤纸的顺序依次逐层放置于转膜仪上，使用按压棒来去除层间的气泡，18V电压转膜2h。转膜完成后使用含有5％脱脂奶粉的TBST进行室温封闭1h，1×TBST清洗3次，每次5min。使用按1:1000稀释好的抗体孵育 (参见图1所用抗体)，室温1h或4℃过夜，1×TBST清洗3次，每次 5min。最后使用ECL方法进行显影，使用显影仪来显影。

如图1的结果发现，Flag-VP35的免疫沉淀产物中存在EIF4B，且 EIF4B在VP35的沉淀物中丰度较高，证明了EIF4B和VP35存在相互作用，并且使用RNA酶消化后，EIF4B依然存在于Flag-VP35的免疫沉淀产物中，并且总量未减少，证明这种相互作用是不依赖于RNA的。此外，已知VP35在埃博拉病毒复制过程中的重要作用，且EIF4B是真核翻译起始因子之一，其主要通过与核糖体、mRNA和起始tRNA之间的相互作用来完成真核生物的翻译起始。基于实验结果和EIF4B的功能分析，可确定EIF4B参与了埃博拉病毒复制过程。因此EIF4B是作为埃博拉病毒病的治疗靶点之一。

实施例2

本实施例利用免疫印迹筛选敲低EIF4B效率最高的siRNA，方法如下：

(1)使用TransIT X2转染试剂分别将2对0.15nmol siRNA转染至 293细胞中(六孔板)，72h后收细胞。先将培养基吸去，使用预冷1×PBS 收集并重悬细胞，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(Tris-HCl 50mM pH8.0，NaCl 150mM，1％NP40，蛋白酶抑制剂1片/50ml)后，置于冰上30min，4℃12000rpm离心10min，吸取60μl上清至干净1.5ml EP 管中，加入15μl的5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，4℃、8000rpm 离心3min，取10μl上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80V 电泳30min后，将电压调至120V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。

所述三对EIF4B siRNA结构如下：

siRNA-EIF4B-1:

5’-GGAACCACUAUGCCAUGAATT-3’(SEQ ID No.3)；

5’-UUCAUGGCAUAGUGGUUCCTT-3’(SEQ ID No.4)。

siRNA-EIF4B-2:

5’-CCUUCAAGGACAACUCAAATT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-UUUGAGUUGUCCUUGAAGGTT-3’(SEQ ID No.2)。

ctrl siRNA:

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.5)；

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID No.6)。

(2)然后，将PVDF膜用10ml甲醇激活10s，去离子水清洗之后置于1×半干转膜缓冲液中(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM、20％甲醇)，随后将完成电泳的SDS-PAGE凝胶置于PVDF膜上；按照从上至下滤纸- 胶-膜-滤纸的顺序依次逐层放置于转膜仪上，使用按压棒来去除层间的气泡，18V电压转膜2h。转膜完成后使用含有5％脱脂奶粉的TBST进行室温封闭1h或4℃过夜，1×TBST清洗3次，每次5min。使用按1:1000稀释好的EIF4B、β-Actin一抗孵育，室温1h或4℃过夜，1×TBST清洗3 次，每次5min。使用按1:1000稀释好的二抗孵育，室温1h，1×TBST清洗3次，每次5min。最后，使用ECL方法进行显影。

如图2所示，可以看到当使用siRNA对293细胞中的EIF4B进行敲低后，EIF4B的表达量显著下降，证明敲低是有效果的，其中 siRNA-EIF4B-2效率最好。

实施例3

本实施例利用埃博拉最小基因组检测EIF4B siRNA对于病毒复制的影响。本实施例使用的是埃博拉最小基因组，在生物安全二级条件下模拟埃博拉病毒的生命周期。该系统通过将海肾荧光素报告基因(RLUC) 与病毒缺失NP、VP35、L的基因组相连，组成4顺反子迷你基因组 (minigenome,MG)。当MG与NP、VP35、L以及T7聚合酶共转至293 细胞中，病毒即可发生复制，产生含有MG的病毒颗粒(无自行复制能力)。病毒发生复制时，RLUC也随之表达。因此通过采用双荧光素酶检测试剂盒检测RLUC的数值可评价病毒复制情况。即RLUC值越高，病毒复制水平越高。

实验方法如下：

第1天，将细胞HEK293接种在6孔板中培养，并使用TransIT X2将 EIF4B siRNA-2转染至HEK293细胞中，转染量为0.15nmol。第2天，将质粒pCAGGS-NP(125ng)、pCAGGS-VP35(125ng)、pCAGGS-VP30 (75ng)、pCAGGS-L(1000ng)、p4cis-vRNA-Rluc(250ng)与pCAGGS-T7(250ng)转染到原代细胞p0。第3天，将p0上清更换为5％FBS的培养基。第6天，将细胞收集，并用250μl/1孔PLB细胞裂解液裂解30min，离心备用。在1.5mL离心管中加入20uL细胞裂解液，然后加入100uL的 LARII溶液(Luciferase Assay ReagentⅡ，Promega公司，Dual-Luciferase Report Assay System货号E1910中组分)，混合后放入发光检测仪检测第一次发光值；然后加入Stop Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检测第二次发光值。

从图3中可以看到，当使用EIF4B siRNA-2处理(实验组)后，与阴性对照组(NC组，在相同条件下未使用EIF4B siRNA-2转染HEK293 细胞)相比，实验组RLUC值显著下降(P<0.05)。由该实验结果证明，当敲低EIF4B后，埃博拉病毒的复制受到显著抑制。同时，缺失L基因组(△L)，病毒复制停滞，RLUC值近乎于0，证明NC组与实验组中埃博拉病毒是可以正常复制的，表明实验组和NC组的比较结果是可信的。缺失L基因是在上实验中于第2天传染各质粒时缺失pCAGGS-L。上述实验说明埃博拉病毒的复制与EIF4B的表达量显著相关。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 真核翻译起始因子EIF4B作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用

<130> EJS220294I

<141> 2022-03-22

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccuucaagga caacucaaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

uuugaguugu ccuugaaggt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggaaccacua ugccaugaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

uucauggcau agugguucct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (1)

1.EIF4B siRNA在制备治疗埃博拉病毒病药物中的应用；所述EIF4B siRNA为由SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

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