JP2017506893A - ウイルス複製不活化組成物並びにその製造方法及び使用 - Google Patents

ウイルス複製不活化組成物並びにその製造方法及び使用 Download PDF

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Abstract

組換え構築物、ベクター及び発現カセットが本明細書で提供される。前記は、第一のプロモーター（第一の単一ガイドRNAをコードする第一のポリヌクレオチドに作動可能に連結された、適切にはtRNAプロモーターである）、及びCas9ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第二のプロモーターを含む。第一の単一ガイドRNAは、DNAウイルスの標的配列の鎖と相補的な第一の部分及びCas9ポリペプチドと相互作用することができる第二の部分を含む。コドン最適化黄色ブドウ球菌由来Cas9ポリヌクレオチド及びポリペプチドもまた提供され、前記は核局在シグナル及び場合によってエピトープタグを有する。tRNAを含むsgRNAの製造のための構築物もまた提供される。当該組成物を用いて、ウイルス複製の阻害、ウイルスの標的配列の発現の阻害、又はウイルス感染若しくはウイルス誘発癌の治療のための方法もまた提供される。

Description

（関連出願）本特許出願は、米国仮特許出願61/940,883（2014年2月18日出願）（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
（連邦政府の研究支援に関する記述）本発明は、アメリカ国立衛生研究所グラント番号R01 DA030086、R01 AI097376、T32 CA009111、P30 AI064518及びP30 AI050409により米国政府の支援を受けて達成された。米国は本発明に一定の権利を有する。
（配列表）本出願はFES-Webにより電子出願され、txt形式で電子提出された配列表を含む。本txtファイルは“2015-02-18_5667-00184_ST25.txt”の表題の配列表を含み、前記は2015年2月18日に作成され、サイズは36,060バイトである。このtxtファイルに含まれる配列表は本出願の部分であり、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本発明は、CRISPR/Cas9系による、ウイルス複製の不活化、ウイルス感染の治療及びウイルス誘発癌の治療に関する。より具体的には、本発明は、黄色ブドウ球菌由来Cas9ポリヌクレオチドを含む組換え構築物、ベクター及び発現カセット、並びに前記の製造方法及び使用に関する。
標的へ誘導されるDNAエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN））による従来の遺伝子治療の手法は、注文仕様のDNA結合ドメインをベースにする。これらの技術は、扱いにくく実施が困難であり、ただ1つの標的部位を切断できるだけである。同時に多数のDNA標的を狙い撃ちするために、細菌のII型CRISPR/Cas9系RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼ（RGN）を用いることができる。これらのRGNは最小限として、単一ガイドRNA（所望のDNA標的配列と完全に相補的である）を搭載したCas9エンドヌクレアーゼからなる。注文操作のDNA結合ドメイン（固有の配列を標的とするように設計される）を用いる他の標的誘導ヌクレアーゼとは対照的に、Cas9タンパク質はそれぞれ異なるガイドRNAの発現によって簡単に再度標的へ誘導されうる。化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のCas9 RGN（SPCas9）は、アデノ随伴ウイルス（AAV）系ベクター（これまでのところin vivo目的のために好ましい遺伝子デリバリーベクターである）のパッケージ限界、約4.8kbを優に超える。したがって、より小さなCas9タンパク質の開発が希求されている。
ZFNによる遺伝子治療はいくつかの事例で臨床試験を通して進歩してきたが、それらは単一遺伝子座を標的とすることができるだけで、特異性が低いことが判明している。本開示の組成物は、遺伝子破壊だけでなく完全な遺伝子欠損も許容にするZFNを用いたときに可能であるものを超えて編集有効性を大きく拡張する、多重標的誘導を提供することによって前記問題を解決する。ウイルス感染標的細胞の場合には、遺伝子欠損はまた、ウイルス受容体又は必須の補助因子の除去のために用いることができ、当該細胞を感染耐性にできよう。形質導入が困難な多くの組織があり、そのような組織ではAAVは唯一の有効な選択肢である。CRISPR/Cas9/AAVが、抗ウイルス治療の選択肢としての新規な遺伝子治療の潜在能力を開花させるのはこれらの組織においてである。
CRISPR/Cas系は、バクテリオファージ及び他の水平伝播される遺伝子エレメントから細菌を防御するために進化した細菌の適応免疫応答を媒介する。いくつかのCRISPR/Cas系が存在するが、もっとも簡単な変種（II型と称される）はただ1つのエフェクターDNAエンドヌクレアーゼを有する。前記エンドヌクレアーゼはCas9と呼ばれ、2つの小RNA（crRNA及びtracrRNA）によってそのウイルスDNA標的へ誘導される。哺乳動物細胞でのDNA編集のためにCRISPR/Cas系を適合させようとする最初の努力（化膿連鎖球菌（Spy）由来Cas9タンパク質に集中した）は、Spy Cas9は哺乳動物細胞で単一ガイドRNA（sgRNA）と呼ばれるtracrRNA:crRNA融合転写物によってDNA標的へ先導されうることを示した。結合時に、Cas9はDNA切断を誘発し、エラー多発非相同性末端結合（NHEJ）の結果として突然変異をもたらす。この系を用いて、本明細書に提示及び記載するように、DNAウイルスを標的とし、当該ウイルスを切断し、さらに細胞から最終的に排除することができる。
CRISPR/Cas9によるウイルス複製の不活化、ウイルス感染の治療及びウイルス誘発癌の治療のための組成物並びに前記組成物の製造方法及び使用が本明細書で提供される。前記組成物は、組換え発現カセット又はベクター（ウイルスベクター（例えば遺伝子治療ベクター）を含む）の作製のための組換え構築物を含む。前記構築物は、第一の単一ガイドRNAをコードする第一のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第一のプロモーター、及びDNAウイルス又はDNA中間体を有するウイルスの配列を標的とするCas9ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第二のプロモーターを含む。第一の単一ガイドRNAは、DNAウイルスの標的配列の鎖と相補的な第一の部分、及びCas9ポリペプチドと相互作用できる第二の部分を含む。DNAウイルスは、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科及びレトロウイルス科からなる群から選択されるファミリーに分類できる。
組換えベクター及びウイルスベクター（例えばアデノ随伴ウイルス（AAV）又は他のウイルスベクター）を含む医薬組成物もまた本明細書で提供される。
構築物が、DNAウイルスを保持する細胞に、第一の単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドの発現を可能にする条件下で導入されるとき、第一の単一ガイドRNAはCas9ポリペプチドを当該DNAウイルスに誘導し、標的配列を切断する。DNAウイルスゲノムの二重鎖破断は、標的配列によってコードされる遺伝子の遺伝子発現の減少をもたらし、ウイルス複製阻害及びウイルスゲノムの細胞からの消失もまたもたらしうる。
別の特徴では、DNAウイルスに感染した細胞でウイルスの複製又は標的配列の発現を阻害する方法が提供される。前記方法は、当該細胞を、単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター又は構築物と、前記組換えベクターの当該細胞へのデリバリー並びに前記単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドの生成を可能にするために有効な量で接触させる工程を含む。前記単一RNA及びCas9ポリペプチドは、細胞内の標的配列の切断を媒介する。標的配列の切断は、該標的配列を包含するDNAの消失、該標的配列によってコードされる遺伝子の遺伝子発現の低下、無関係の遺伝子生成物の発現の低下、又は標的配列の変異導入をもたらしうる。本方法を用いてウイルス感染を治療することができる。
さらに別の特徴では、配列番号:57の組換え黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus（Sau））Cas9ポリペプチド、及び配列番号:55のコドン最適化Sau Cas9ポリヌクレオチドが提供される。前記ポリヌクレオチドは、アフィニティータグ（例えばFLAGタグ）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。該ポリヌクレオチドはまた、ポリ(A)付加部位及び核局在シグナルを含むことができる。ポリヌクレオチドの発現を強化できる他のエレメント（例えばイントロン）もまた当該ポリヌクレオチド中に含むことができる。Sau Cas9ポリペプチドは核局在シグナル又はアフィニティータグ（本明細書に記載される）を含むことができる。
さらにまた別の特徴では、単一ガイドRNAの発現のための組換え構築物が提供される。前記構築物では、哺乳動物又はウイルスのtRNAをコードする第一のポリヌクレオチドは単一ガイドRNAをコードする第二のポリヌクレオチドと作動可能に連結される。この構築物は、tRNase Z切断部位を有する単一ガイドRNAに連結されたtRNAを含む融合RNAのRNAポリメラーゼIII依存生成をtRNAが先導することを可能にする。内因性の細胞性tRNase Z酵素の作用は、単一ガイドRNAからtRNAを切断し、非常に少量のプロモーターエレメントを用いて単一ガイドRNAの効率的な生成を可能にする。これらの構築物を含むキットもまた含まれる。
Spy Cas9 HPV-18-特異的sgRNAによるスクリーニングを示すセット図である。前記では、HPV-18 E6又はE7タンパク質のアミノ末端をコードするDNAを標的とする2つのsgRNAが設計され、もっとも有効な候補物を認定するためにスクリーニングが実施された。図1Aは、融合タンパク質をベースにするレポーターアッセイを示す模式図であり、前記は、HIV-1 Revフラグメント（エピトープタグとして機能する）、インフレームHPV-18由来標的配列及びカルボキシ末端eGFPオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。他のアッセイでは、ホタルのルシフェラーゼ（FLuc）ORFがGFPの代わりに用いられた。図1Bは、FLAGタグ付加Spy Cas9タンパク質及びHPV-18 E6遺伝子特異的sgRNAを発現するプラスミド、又はコントロール構築物、及びそれらの同系インジケータープラスミドを共同トランスフェクトした293T細胞のeGFP発現データを示すグラフである。トランスフェクト細胞を72時間でフローサイトメトリーのために処理した。GFP陽性細胞数及びこれらの細胞の平均蛍光強度（MFI）が示されている。独立した3実験の平均をSDとともに示した。図1CはパネルBと同様であるが、ただし2つのHPV-18E7特異的sgRNAが用いられた。図1Dは、Rev-GFPインジケーター融合タンパク質の発現を検出するためにHIV Rev特異的抗血清を用いたウェスタンブロットを示し、したがったsgRNAの有効性及び特異性を表している。 SURVEYORアッセイの写真であり、HPV-18 E6及びE7-特異的Spy Cas9 sgRNAは、HPV-18のゲノムの予想される切断部位で突然変異を誘発することを示している。E6及びE7 sgRNA並びにSpy Cas9発現構築物をトランスフェクトし、SURVEYORアッセイを実施した。予想サイズのSURVEYOR切断生成物は矢印で示されている。DNAマーカー（左レーン）は塩基対によって示されている。 HPV-18 E6及びE7特異的RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼ（RGN）は、HeLa細胞で腫瘍抑制因子遺伝子の発現を誘発することを示すセット写真である。表示のように、Spy Cas9及びHPV-18特異的sgRNAを発現するベクターをHeLa細胞にトランスフェクトし、ウェスタンブロットのために処理した。これらのデータは、3つの生物学的複製の代表的なものである。図3Aは、ローディングコントロールとして利用される内因性β-アクチンを用いてp53及びp21発現が精査された溶解物である。Cas9タンパク質はFlagエピトープタグに特異的な抗体によって検出された。図3Bは図3Aと同様であるが、ただしこの溶解物は網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）について精査された。図3Cは、E6 sgRNA1の存在下でSpy Cas9による切断に耐性であるように設計した変異体E6発現構築物の配列を示す。前記変異は小文字で示され、PAMには下線が付されている。図3Dは、切断耐性E6遺伝子は、Spy Cas9及びE6 sgRNA1の存在下でp53タンパク質の発現をトランス-補完することを示すウェスタンブロットセットである。N.S.は非特異的を表す。 E6又はE7遺伝子座のRGN先導突然変異は細胞周期のG1停止を誘発することを示すセット図である。図4Aは、HPV-18 E6又はE7遺伝子のSpy Cas9媒介破壊は、HeLa細胞の増殖の予想される阻害をもたらすこと示す。Spy Cas9、コントロール又はHPV特異的sgRNA及びgfp遺伝子をコードするベクターをトランスフェクトされたGFP+細胞の数が示されている。図4Bは、BrdU取り込み及びヨウ化プロピジウム（PI）染色並びにその後のFACS分析を用いたE6又はE7特異的RGNを発現するHeLa細胞の細胞周期分析を示す。トランスフェクトしたeGFP陽性HeLa細胞集団の4つの別々の生物学的対応物から得られた結果が示されている。図4Cは、表示したsgRNAの代表的なフローサイトメトリー図を示す。各細胞周期でGFP陽性HeLa細胞のパーセンテージが定量され表示されている。NSは非特異的を表す。 Spy Cas9並びにHPV-18 E6及びE7に特異的なSgRNAを発現するレンチウイルスベクターは子宮頸癌細胞死を誘発することを示す2つのグラフのセットである。HeLa細胞に以下を形質導入した：eGFPを発現するレンチウイルスベクター（レンチウイルスの毒性のためのコントロール（LCE））又はSpy Cas9及び非特異的sgRNA又はE6若しくはE7特異的sgRNAを発現するレンチウイルスベクター。図5Aでは、HeLa細胞にレンチウイルスベクターを約2.2の感染多重度（MOI）で形質導入し、約90%の培養細胞で形質導入が生じた。続いて細胞増殖を10日間の期間にわたって追跡監視した。図5Bでは、HeLa細胞にMOI約37でレンチウイルスベクターを形質導入し、99％を超える培養細胞が形質導入されることを期待した。これらの細胞を10日目にMTT染色によって生存率についてアッセイした。N.S.は非特異的を表す。 HPV-16特異的E6及びE7 RGNはSiHa子宮頸癌細胞株でp21及びRB発現をレスキューすることを示すウェスタンブロットセットである。SiHa細胞にSpy Cas9発現ベクター及び表示のHPV-16特異的SgRNAをトランスフェクトし、ウェスタンブロットのために処理した。図6Aでは、Flagタグ付加Cas9タンパク質、p53エフェクタータンパク質p21及び内因性β-アクチンについて溶解物を精査した。図6Bも同様であるが、ただしRb発現について精査された。この図では、コントロールとして用いたN.S.（非特異的）sgRNAはE6 sgRNAである（前記はHPV-18 E6遺伝子に特異的であるが、HPV-16 E6遺伝子を認識することは予想されない）。 HBV標的誘導方法及びsgRNA最適化を示すセット図である。感染細胞のHBV DNA中間体を標的とするために、我々は、図７Aに示すように、HBV表面抗原（Ag）、コア及び逆転写酵素（RT）のORFを設計した。有効性を査定するために、融合タンパク質をベースにするインジケータープラスミド（前記はアミノ末端HIV-1 Rev由来エピトープタグ、インフレームHBV由来標的、及びカルボキシ末端FLucインジケーター遺伝子をコードする）を、図１Aと同様に用いた。図７Bに示すように、3つのsgRNA候補物の全てが、コントロール（非特異的（N.S.）sgRNA）と比較したとき、それらの同系レポータープラスミドのFLuc発現を共同トランスフェクト293T細胞で効果的に阻害した。図7Cでは、同じ融合タンパク質の発現をα-Revウサギポリクローナル抗血清によるウェスタンブロットで精査した。Cas9の共発現は、このタンパク質に存在するFLAGエピトープに特異的な抗体を用いて確認された。レポーターがsgRNAと同系であったとき、融合タンパク質標的の発現レベルの顕著な低下が観察され、被験sgRNAの各々の特異性及び有効性が確認できた。 HBV特異的Cas9/sgRNA組み合わせによるHBV複製の抑制を示す。まず初めにテトラサイクリン（Tet）の非存在下で48時間培養することによってHepAD38細胞でHBV複製を誘発した。続いてこれら細胞にレンチウイルスベクター（HBV RTに特異的なSpy Cas9/sgRNA組合せ、表面抗原又はコアORF、選択ピューロマイシンをコードする）を形質導入し、Tetの持続的非存在下で培養した。陰性コントロールとして、Tet+培地でもHepAD38細胞を維持した。HepAD38細胞及び培養上清を採集し、全HBV DNA（図8A）及び細胞内HBV DNA又はcccDNA（図8B）を培養10又は14日後にそれぞれqPCRによって定量した。（＋）は、サンプルが検出限界以下であったことを示す（＞45サイクル）。qPCRの全ての結果をN.S.sgRNAコントロール細胞株に対して標準化した。培養液中に分泌されたHBsAg（図8C）及びHBeAg（図8D）のレベルは培養10日後にELISAによって測定した。データはそれぞれの平均±SDとして示されている。統計分析は、JMP pro10ソフトを用い2グループ間の比較のためにスチューデントt-検定を用いて実施した。P＜0.05（*）の値を統計的に有意とみなした。（***）はP＜0.001を表す。 HepAD38細胞におけるTDF、ETV、HAP12及び3TCの抗ウイルス活性を示すセットグラフである。多様なCas9/sgRNAの組み合わせを発現するレンチウイルスベクターを形質導入したHepAD38細胞を0.1μMの3TCで、又はy軸に示すようにいくつかの濃度（μM）のHAP12、TDF若しくはETVで処理した。7日目に、分泌されたHBV DNAの全レベルをリアルタイムPCRで測定し、陽性コントロールで認められたHBV DNA複製レベルのlogウイルス阻害（左パネル）及びパーセント阻害（右パネル）として示している。Cas9及びN.S.sgRNAを発現する未処理細胞に対して全データを標準化した。図9A、9B、9C及び9Dは、N.S.、RT、表面Ag及びコアsgRNAを発現するレンチベクターを形質導入したHepAD38細胞を用いて得られた結果をそれぞれ示している。データは、それぞれの平均±SDとして示されている。-Tetは培養液にTetが存在しないことを示す。TDFはテノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ETVはエンテカビル、HAP12はカプシドアッセンブリーエフェクター12、3TCはラミブジンである。 RGN切断は培養からDNAエピソームの除去をもたらすことを示す。図10は、HSV-1 IC10特異的sgRNAをHBV逆転写酵素特異的sgRNAと比較するウェスタンブロットクロストーク実験を示す。抗FLAG抗体はCas9発現を示し、抗Rev抗体は対応するプラスミドレポーターの高度に特異的な排除を示す。 Spy sgRNAはtRNAから発現させることができ、U6プロモーター駆動発現と同等に機能しうることを示すセット図である。図11Aは、表示したtRNase Z切断部位を有するグルタミンtRNA-sgRNA融合物の模式図である。“N”ヌクレオチドはsgRNA標的配列を表す。図11Bは、化膿連鎖球菌（Spy）Cas9タンパク質及びHPV-18 E6若しくは E7遺伝子に特異的なsgRNA又はコントロールsgRNAを発現するプラスミド及びそれらの同系インジケータープラスミドを共同トランスフェクトした293T細胞の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。sgRNAはU6プロモーター又はtRNAから発現された。図11Cは、化膿連鎖球菌Cas9タンパク質及びHPV-18 E7遺伝子に特異的なsgRNAを発現する（U6又はtRNAのどちらかから発現される）プラスミドをトランスフェクトした293T細胞のSpy sgRNAのノザンブロットを示す。内因性の細胞性U6 RNAをローディングコントロールとして供した。矢印はSpy sgRNAの予想される位置を示す。 Nme sgRNAはtRNAから発現させることができ、U6プロモーター駆動発現と同等に機能しうることを示すセット図である。図12Aは、髄膜炎菌（N. meningitidis）（Nme）Cas9タンパク質及び細菌由来プロトスペーサー9（P9）若しくはP25 DNA配列に特異的なsgRNA又はコントロールsgRNAを発現するプラスミド、並びにそれらの同系インジケータープラスミドを共同トランスフェクトした293T細胞の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。sgRNAは、表示のようにU6プロモーター又はtRNAから発現された。図12Bは、Nme Cas9及びP25に特異的なsgRNAを発現する（表示のようにU6又はtRNAのどちらかから発現される）プラスミドをトランスフェクトした293T細胞のNme sgRNAのノザンブロットである。内因性の細胞性U6 RNAをローディングコントロールとして供した。矢印はNme sgRNAの位置を示す。図12Cは図12Aと同様であるが、ただし多様なsgRNAガイド配列が用いられた（P25：プロトスペーサー25、P9：プロトスペーサー9、ICP4：HSV-1感染細胞タンパク質4、GFP：緑色蛍光タンパク質、G6P：グルコース-6-ホスファターゼ）。 多様なtRNAが機能的なSau sgRNAを発現できることを示すセット図である。図13Aは、化膿連鎖球菌（Sau）Cas9及びHSV-1 ICP0に特異的なsgRNA又はコントロールsgRNAを発現するプラスミド並びに同系インジケータープラスミドを共同トランスフェクトした293T細胞の相対的ルシフェラーゼ活性を示す。sgRNAは多様なtRNAから発現された。図13Bは、tRNAプロモーターから転写されてSau Cas9及びHSV-1 ICP0特異的sgRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトした293T細胞から回収したSau sgRNAのノザンブロットを示す。内因性の細胞性U6 RNAをローディングコントロールとして供した。矢印は成熟sgRNAの予想位置を示し、一方、星印はプロセッシングされていないtRNA-sgRNA融合転写物を示す。 Sau Cas9及びsgRNAの機能の代表的証拠を示すセット図である。293T細胞に、以下のウイルスによって発現される遺伝子に由来するDNA標的を含むインジケーター構築物をトランスフェクトした：HBV（図14A）、HSV-1（図14B）、EBV（図14C）又はHPV-18（図14D）。各事例で、FLuc構築物（上記に記載）、Sau Cas9を発現するベクター、及び対象のウイルスDNA標的に特異的なsgRNAを発現するベクターを293T細胞にトランスフェクトした。非特異的（NS）sgRNAは陰性コントロールとして供した。図14Eはウェスタンブロットを示し、前記ではHeLa細胞に以下をトランスフェクトした：Spy Cas9及び以前に記載したHPV-18 E6特異的sgRNAを発現するベクター、又はSau Cas9及び図14Dに示すHPV-18 E6及びE7に特異的なsgRNAを発現するAAVをベースにするベクター。48時間後に、細胞を採集し、使用したE6特異的sgRNAが予想のようにHPV-18 E6遺伝子を効果的に切断できるか否かをp53及びp21の誘発について分析した。 mRNA5'非翻訳領域（5'UTR）に挿入されたイントロンはSau Cas9発現を大いに強化することを示すウェスタンブロットである。293T細胞に以下をトランスフェクトした：完全長Sau Cas9（N-末端FLAGエピトープタグを有し、CMV-IE（hCMV最初期）プロモーター/エンハンサーの制御下にある）を含む発現ベクター、又は同様な構築物であって、Cas9の5'UTRに挿入されたラットプレ-プレインスリンII遺伝子由来のイントロンを保持する構築物。Cas9発現は、FLAGエピトープタグに特異的なモノクローナル抗体を用いてトランスフェクション72時間後のウェスタンブロットによって決定された。前記ウェスタンブロットは、当該イントロンが含まれた場合には約20倍高レベルのCas9発現を示した。ローディングコントロールとして、共同トランスフェクトしたグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を用いた。 AAVをベースとするベクターの構造の模式図であり、前記ベクターは、2つのsgRNAを駆動する2つのPolIII依存プロモーター及び核局在シグナル（NLS）に連結されたCas9タンパク質発現を駆動するPolII依存プロモーターを含む。この構築物はまた、2つのAAV逆向き末端反復配列（ITR）、Cas9遺伝子の5'UTR領域のイントロン及び合成ポリ(A)付加部位を含む。可能なPolIII依存プロモーターには、U6及びH1プロモーターの他に本明細書に記載の任意のtRNAプロモーターが含まれる。可能なPolII依存プロモーターには、ウイルスプロモーター（例えばCMV最初期プロモーター）又は細胞性プロモーター（例えばEIF1αプロモーター）が含まれる。 Sau Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の認定を示す棒グラフである。可能な広範囲のPAM配列を含むインジケーター構築物を構築し、図1Aに記載したようにレポーターとしてFLucを用いSau Cas9発現ベクター及びsgRNA発現ベクターを共同トランスフェクトすることによって分析した。この分析によって、Sau Cas9タンパク質のためにもっとも活性なPAMとして5'-NNGRRT-3'（Nは任意のヌクレオチドであり、RはG又はAである）が認定された。 HIV-1ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトした細胞の相対的ルシフェラーゼ発現を示すグラフセットである。細胞にSpy Cas9及びHIV-1 tat遺伝子（図18A）又はTARエレメント（図18B）の保存領域に特異的なsgRNAをトランスフェクトし、その他にHIV-1受容体CD4及びCXCR4をコードするプラスミドをトランスフェクトした。72時間後に、ウイルスのnef遺伝子の代わりにFLucをコードするHIV-1のNL4-3株のストックをトランスフェクトした293T細胞に感染させ、相対的ルシフェラーゼ活性を測定した。
ウイルス複製の不活化、ウイルス感染治療及びウイルス誘発癌の治療のための、CRISPR/Cas9系をベースにする組成物が本明細書で提供される。加えて、前記組成物を製造及び使用する方法が本明細書で提供される。CRISPR（規則的に間隙を空けて集合する短いパリンドローム配列の繰返し）遺伝子座は広範囲の細菌で見いだされる。前記は転写されて、当該細菌に感染しうる種々の一連のDNAバクテリオファージに特異的な標的誘導RNAファミリーを生じることが今や示されている。II型CRISPR/Cas系を発現する細菌では、これらのファージ由来配列は、隣接する定常領域由来配列と一緒に転写され、CRISPR RNA（crRNA）を生じる。前記crRNAは、不変trans-活性化crRNA（tractRNA）と複合体を形成する（tracrRNAとcrRNAの不変部分との間の配列相補性を利用する）。このヘテロダイマーは続いてII型CRISPR/Cas系のエフェクタータンパク質（Cas9と呼ばれる）と結合する。Cas9は、一般的に用いられる化膿連鎖球菌（Spy）Cas9タンパク質のための短いDNA配列、5'-NGG-3'（プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる）を直接認識する能力を有する。Cas9タンパク質は標的ゲノムをPAM配列についてスキャンし、続いて結合して、crRNAの可変部分に対する完全な5'配列相補性について当該DNAでクエリーを行う。相補性が検出された場合に、Cas9タンパク質は、約3bp 5'から当該PAMまで標的バクテリオファージDNAの両方の鎖をそれぞれ異なる2つのタンパク質ドメインにより直接切断する（すなわち、Cas9 RuvC-様ドメインは非相補鎖を切断し、一方、Cas9 HNHヌクレアーゼドメインは相補鎖を切断する）。続いてこのdsDNA破断はファージDNAゲノムの分解を誘発し、感染を阻止する。したがって、CRISPR/Casをベースにする系は高度に特異的であり、新しいゲノム遺伝子座への容易な再標的誘導を可能にする。
ヒト細胞での遺伝子操作のためにこのSpy Cas9系をより扱いやすくする作業を進展させる重要な工程は、crRNA及びtracrRNAが人工ループ配列によって連結され、完全に機能的な小さなガイドRNA（sgRNA）（長さが約100nt）を生成できることを示すことであった。更なる作業（DNA標的の変異分析を含む）によって、Spy Cas9の配列特異性は、PAM及びsgRNAの約20ntの可変領域の3'側の約13ntに対する完全な相補性の両方に依存することが明らかにされた（より5'側の配列はわずかに寄与するだけである）。Spy Cas9はしたがって、約15bpの配列特異性を有する（ガイドの13bp及びPAMの2bp）。前記配列特異性は高いけれども、ヒト細胞に存在する大きなゲノムで少数の潜在的オフターゲット切断を完全に回避するには概して不十分である。それにもかかわらず、前記は高レベルの特異性であり、特に潜在的オフターゲット切断部位のバイオインフォマティクス分析に相応の注意が払われるならば、ヒトゲノムの非転写領域における少数のオフターゲットが大きな問題となることはないであろう。
前記の懸念は、Cas9タンパク質を変異させて2つのそれぞれ異なるHNH及びRuvCヌクレアーゼ部位の1つを不活化し、いわゆる“ニッカーゼ” (Cong et al., 2013; Ran et al., 2013)を生成することによって処理できる。続いて、2つのニッカーゼCas9を当該DNA標的の2つの鎖上の2つの近接近位部位へ誘導することができる。両方の鎖にニックが生じる場合、当該DNAは分離し、食い違いを有するdsDNA破断を生じるであろう。前記dsDNA破断は、野生型Spy Cas9を用いた単一認識配列の切断で得られるものと同様であるが、ただしこのDNA標的特異性は今やSpy Cas9について約30bpであり、大きなゲノム（例えばヒト細胞に存在するようなもの）でさえ完全な特異性を担保するために十分大きい。この実施態様では、2つの単一ガイドRNA標的配列は、標的配列の対向鎖へ誘導するために適切に設計され、さらにCas9ニッカーゼは互いに約30bp以内で切断できるように設計される。適切には、切断部位は互に40、35、30、25、20、15、10又は5ヌクレオチド未満であり、したがって一本鎖切断は、DNA修復ではなく当該DNA配列のいくらかの部分の欠失又は変異を生じる。
CRISPR系は異なる多くの細菌から同定され特徴が明らかにされている。それらCas9酵素の任意のものを本明細書に記載の方法で用いることができる。例えば、以下のいずれかに由来するCas9タンパク質を用いることができる：コリネバクター（Corynebacter）、スッテレラ（Sutterella）、レジオネラ（Legionella）、トレポネーマ（Treponema）、フィリファクター（Filifactor）、ユウバクテリウム（Eubacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバシルス（Lactobacillus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、バクテロイデス（Bacteroides）、フラビイボラ（Flaviivola）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、スファエロカエタ（Sphaerochaeta）、アゾスピリルム（Azospirillum）、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）、ナイセリア（Neisseria）、ロセブリア（Roseburia）、パルビバクルム（Parvibaculum）、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター（Nitratifractor）、マイコプラズマ及びカンピロバクター（Campylobacter）。いくつかのCas9構築物はAddgeneから入手できる。
実施例では、化膿連鎖球菌（Spy）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides（Nme））及び黄色ブドウ球菌（Sau）由来のCRISPR系及びCas9タンパク質が用いられる。これらのタンパク質の各々はそれぞれ異なる認識部位又はPAMに依存する。Spy Cas9のPAMは5'-NGG-3'であり、Nmeのそれは5'-NNNNGATT-3'であり、SauについてPAMは本明細書では5'-NNGRRT-3'と認定されている（Rはプリンである）。各々は、単一ガイドRNAの3'部分を構成するそれぞれ異なるsgRNA足場配列を有する。sgRNAの標的配列特異的5'部分の長さもまたCas9酵素間で同様に多様である。Spyは13−15ヌクレオチドの標的配列を利用する。Nme及びSauは18−24ヌクレオチドの標的配列を利用する。
実施例に示すように、Sau Cas9をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは配列番号:55として本明細書に提供される。コドン最適化Sau Cas9は真核細胞で良好な発現を示し、さらにアフィニティータグ、例えばFLAGタグ及び/又は核局在シグナル（NLS）と結合させてCas9の核への誘導を可能にすることができる。FLAGタグ及びNLSを有するSau Cas9ポリペプチド配列は配列番号:57として示される。FLAGタグ及びNLSの組み合わせポリヌクレオチド配列は配列番号:54として提供される。他のNLSも当業者には入手可能であり、配列番号:59−62で提供される配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。Cas9タンパク質の発現を可能にするために、当該ポリヌクレオチド配列はポリ(A)付加部位（例えば配列番号:56）及びプロモーター/エンハンサーを要求することは当業者には理解されよう。Cas9タンパク質の組換え構築物及び発現構築物は下記でさらに詳しく記載される。
CRISPR系では、Cas9酵素は、DNA標的配列を切断するためにsgRNAによって先導される。sgRNAは2つの機能を有する少なくとも2つの部分を含む。第一の部分はsgRNAの標的誘導部分であり、前記は第二の部分に対して当該sgRNAの5'末端に存在する。sgRNAの第一の部分は標的配列の鎖に相補的である。標的配列は、標的DNA上のCas9のためのPAM配列のすぐ5'側にある。sgRNAの標的配列と相補的な部分は、長さが10ヌクレオチド、13ヌクレオチド、15ヌクレオチド、18ヌクレオチド、20ヌクレオチド、22ヌクレオチド又は24ヌクレオチドの間であるか、又は10から30の任意の数のヌクレオチドでありうる。sgRNAの標的配列と相補的な部分は標的鎖中の当該配列とハイブリダイズすることができ、場合によって当該標的配列と完全に相補的である。sgRNAの相補性部分の厳密な長さ及び位置は、それが対を形成するCas9酵素に左右されるであろう。選択されるCas9酵素は、sgRNAが当該酵素との使用のために特異的に設計されることを必要とし、sgRNAの設計を制御するであろう。いくつかのsgRNAの標的誘導部分が本明細書に記載され、配列番号:1−35及び63−65で提供するものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
sgRNAの3'末端に存在するsgRNAの第二の部分はCas9酵素と相互作用する足場である。当該足場配列は各Cas9に特異的である。本明細書で用いられる足場配列は配列番号:36−38として示されている。ある実施態様では、1つ以上のsgRNAを含むベクター又は構築物が提供される。このベクター中のsgRNAは、標的配列と相補的な第一の部分を欠くがその代わりに当該足場又はsgRNAの第二の部分の上流にクローニング部位を含むことができる。ベクターはまた、Cas9ポリヌクレオチド並びにsgRNA及びCas9ポリペプチドの発現を可能にするプロモーター又は他の転写エレメントを含むことができる。クローニング部位はsgRNAの標的誘導部分の効率化された取り込みを可能にし、新しいDNA配列を標的とする新しいCRISPR系の迅速な生成を可能にするであろう。標的誘導部分の簡単な取り込みのための制限酵素認識部位を含む例示的なsgRNA足場は、配列番号:39及び40として提供される。前記の配列は、BsmB1及びBbs1から選択される2つの反復制限部位の下流にSau Cas9特異的sgRNA足場配列をそれぞれ有する。特異的sgRNAの構築を効率化された迅速なプロセスにするために、他の制限部位も用いることができる。
標的：
いくつかの病原性ヒトDNAウイルス（例えば単純疱疹ウイルス1型及び2型（HSV-1及びHSV-2）並びにB型肝炎ウイルス（HBV））によって引き起こされる持続感染は公知の治療法がなく、RGNは慢性感染に必須のウイルスの遺伝物質を排除するための代表的な方法である。HIV-1はレトロウイルであるが、ウイルスゲノムのDNAコピーが細胞ゲノムに組み込まれる場合には慢性感染を開始することができる。これらの組み込まれたウイルスは、使用されている抗ウイルス治療に服さないウイルスの貯蔵所として機能する。他のDNAウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（HPV）及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）は癌で見いだされる。これらのウイルスを標的とすることによって、癌のリスクを低下させるか又は癌を治療することができる。したがって本明細書で標的とされるウイルスは、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科及びレトロウイルス科から選択できる。
HBV
世界中で3億人以上がHBVに感染し、流行地域では主として周産期伝播される。慢性HBVはしばしば進行して重篤な合併症、例えば肝細胞癌又は肝硬変を引き起こし、2002年には563,000人が死亡した。HBVワクチンは利用可能であるが、既に感染している個体では役に立たない。必須のウイルスdsDNA中間体（共有結合閉環状DNA（cccDNA）と称される）は、感染肝細胞で並外れて長い半減期を有し、前記によって細胞内持続が可能になる。このエピソーム性DNA中間体はウイルス複製の中枢であり、従来の治療（例えば逆転写酵素阻害剤）はその完全除去をもたらさない。これらの治療抵抗性dsDNA分子を感染肝臓から排除する試みでは、この超安定性HBVウイルスDNA中間体の破壊が必要とされる。
実施例で、我々は、Cas9/sgRNAの組み合わせによって、急性感染又は慢性感染下の細胞内でHBVゲノムDNA分子（cccDNAを含む）を効果的に切断し、変異導入により不活化できることを示す。HBVの場合には、HBV逆転写酵素（RT）、コア又は表面抗原遺伝子（配列番号:1−７を参照されたい）へ誘導されるCas9/sgRNA組合せは、ウイルスタンパク質発現の顕著な阻害及びウイルスDNA分子の消失をもたらす（前記ウイルスDNA分子には共有結合閉環状DNA（cccDNA）が含まれ、cccDNAは、RT機能のヌクレオシド系阻害剤による治療の真っ最中においてさえ患者のHBV持続に重要な役割を果たす）。AAVはこの作業に理想的である。なぜならば、いくつかのAAV血清型は天然で肝向性であり、より強く肝向性のAAVが最近AAV配列のin vivo“シャッフリング”によって単離されているからである。
HSV
ヘルペスウイルス科は大きなウイルスファミリーであり、単純疱疹ウイルス1型（HSV-1）、単純疱疹ウイルス2型（HSV-2）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）の他にいくつかの他のヒトヘルペスウイルスが含まれる。HBVと同様に、いったん獲得されたヘルペスウイルスは一生宿主とともに留まり、さらにHSV-1及びHSV-2の場合には、典型的には感覚ニューロンの核内に安定なdsDNAエピソームの形で潜伏し続ける。
例えば、HSV-1は感染個体の三叉神経神経節に潜伏し続ける。HSV-1は米国の人口の約70％に感染し感染個体の約1/3が主として口腔内に再発性単純疱疹を罹患する。潜伏期間中には、活発に転写されるゲノム領域のみが潜伏関連転写物LAT（プロセッシングされて約2.1kbの長い単一の非コードRNAを生じる）を、ウイルスによりコードされる8つのmiRNAと同様にコードされ、それらは一緒になって潜伏期からの出口を調節すると考えられる。ウイルス転写アクチベーター（ICP0及びICP4を含む）の発現がウイルス再活性化のために要求される。しばしば炎症以上のものではないが、一方、HSV-1感染はまた重篤な症状に至ることがあり、HSV-1角膜炎は米国では感染性失明のもっとも一般的な形態である。近縁ウイルスのHSV-2（米国の人口の約20％で見いだされる）は、同様な複製周期を有するが、一般的には性交により伝播されしばしば生殖器粘膜に感染する。薬剤（例えばバラシクロビル）は活発な溶解性複製を阻害することができるが、潜伏感染ウイルス貯蔵所に対しては実体的な効果をもたない。実施例に示すように、Cas9/sgRNA組合せによって、HSVゲノム分子は細胞内で効果的に切断され変異導入により不活化されうる。実施例では、ICP0及びICP4が標的とされ、使用sgRNAは配列番号:16−19及び63として見いだされる。AAVは三叉神経の神経節細胞に公知の手段により感染させることができる。マウスの三叉神経神経節（TG）のニューロンのHSV-1潜伏感染は容易に得られ、したがってHSV-1特異的Cas9/sgRNA組合せをコードするAAV系ベクターによるこれら同一TGの形質導入が、ウイルスDNA量の検出可能な低下及び潜伏HSV-1の再活性化能力の阻害をもたらすか否かを、感染TGを取り出して培養した後で試験することが可能である。
他のDNAウイルス
他の多数のDNAウイルスが重篤なヒトの疾患に関与している（エプスタイン-バーウイルス（EBV）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）及びマーケル細胞ポリオーマウイルス（MCPｙV）、その他が含まれる）。これらのうちで、おそらくもっとも関係が深いものがEBVであり、前記はいくつかの癌の病因である。前記の癌には鼻咽頭癌（NPC）と呼ばれる上皮細胞腫瘍が含まれ、前記腫瘍は中国南部及び東南アジアに極めて多い。NPC細胞では、EVBは潜伏ウイルスの形で見いだされ、それにもかかわらず前記はいくつかのウイルス性非構造タンパク質及びマイクロRNAの発現に関与する。EBV＋NPCは、HPV-16＋頭部及び頸部（H&N）癌と多数の特徴を共有し、さらに後者の事例と同様に、ウイルス（この場合EBV）ゲノムの持続的存在及び転写は腫瘍の生存に必須と考えられる。EBVエピソームは、特異的Spy Cas9/sgRNA組合せによって容易に分断及び破壊されることは既に示され、NPC細胞は、EBVゲノムに特異的なSau Cas9/sgRNA系AAVベクターを用いるin vivo形質導入の優れた標的であろうということは想像に難くない。実施例に示されるように、EBVを標的とするsgRNAが設計され、意図した標的配列を切断することが示された。実施例で用いられたsgRNAは、EBV FR（反復配列ファミリー）、DR（ダイレクトシンメトリー）、EBNA-1（EBV核内抗原）、Qpプロモーター、及びLMP-1（潜在膜タンパク質-1）に特異的である。前記sgRNAの標的誘導配列は配列番号:20−27として示されている。
HPV
人間は極めて多様なHPVに感染する。HPVは通常では無害であるがまた、皮膚又は性器にいぼを生じうる。殆どのHPV変種は皮膚の上皮基底層でエピソームとして複製し、そこでウイルスはもっぱら非構造タンパク質を発現する。感染した上皮前駆細胞は表皮表面に移動し、ケラチノサイトへ分化し、生産性HPV複製周期が活性化されて感染性HPVビリオン放出に至る。ほとんどのHPVは非病原性であるが、なお少数のいわゆるハイリスクHPV血清型が存在する。それらのうちもっとも多いものがHPV-16及びHPV-18で、合わせて全子宮頸癌の約70%を引き起こす。ほとんどのHPV誘発癌で、HPVエピソームは、ウイルスE2遺伝子が破壊されるか又は欠失した状態で細胞ゲノムにクローンとして組み込まれて見いだされる。E2の1つの重要な活性は、HPVオンコジーンE6及びE7の発現を制限することであり、宿主細胞ゲノムへの組み込み時のE2の破壊は、高く構成的レベルのE6及びE7発現をもたらしうる。E6はp53腫瘍抑制因子と結合してこれを脱安定化させるために機能し、一方、E7は同様にRb腫瘍抑制因子と結合してこれを脱安定化させる。さらにこれら2つの機能はHPV形質転換細胞の維持に決定的な役割を果たす。HPV感染が関与する癌には、子宮頸癌（ほぼ常にHPV陽性である）、実質的割合の頭部及び頸部（H&N）癌、並びに肛門癌が含まれる。
HPVの事例では、ウイルスE6遺伝子（通常は細胞性腫瘍抑制因子p53の活性を阻止するために機能する）の効率的な変異による不活化は、p53転写因子及びその下流エフェクターの活性化を生じ、細胞周期の停止及びHPV形質転換細胞のアポトーシス死をもたらす。実施例では、我々は、Spy CRISPR/Casを用いるHPV-18＋子宮頸癌細胞株HeLa又はHPV-16＋細胞株SiHaでのE6遺伝子の不活化が、p53発現の誘発と前記に続いてこの細胞性転写因子の下流の標的（CDK阻害因子p21及びいくつかのアポトーシスアクチベーターを含む）の発現をもたらし、細胞周期の停止及び細胞死を生じることを示す。同様に、我々は、CRISPR/Casを用いるE7遺伝子の破壊が、Rbの発現増加、Rb/E2Fヘテロダイマーの形成、さらに続いて老化及び細胞死を誘発する細胞性遺伝子の誘発をもたらすことを示した。使用したsgRNA標的配列は配列番号:8−15として示されている。高力価AAVベクター調製物のHPV+腫瘍への直接注射による、HPV E6及び/又はE7に特異的なCRISPR/Cas組合せのデリバリーは、化学療法耐性HPV-16誘発肛門腫瘍及びH&N腫瘍のための新規な高度に特異的及び効果的な治療方法として役立つ潜在能力を有する。
HIV-1
高度に能動的な抗レトロウイルス療法（HAART）は検出限界以下のレベルにHIV-1複製を減少させることができるが、一方、HIV-1は潜伏感染として少数の休止CD4+メモリーT細胞で存続する。これらの長寿命細胞では、無傷の組み込みHIV-1プロウイルスは、薬剤及び宿主免疫応答の両方に抵抗性である転写的にサイレントな状態で存続する。しかしながら、これらのメモリーT細胞は適切なリコール抗原によって再活性化でき、生産性ウイルス複製周期の誘発をもたらす。薬剤治療が停止した後で前記事象が生じると、HIV-1は利用可能なCD4+T細胞を介して急速に拡散し、抗ウイルス薬治療前に認められた同じレベルのウイルス複製を再燃させるであろう。
潜伏感染細胞プールを一掃する試みは2つの方法に集中した。一方では、いくつかのグループが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びPKCアゴニストを含む薬剤を用いて潜伏HIV-1プロウイルスを活性化しようと試みた。しかしながらこの方法は、潜伏感染細胞を高率で活性できないことが判明した。別の方法は、HIV-1特異的CRISPR/Cas組合せを用いて潜伏プロウイルスを直接標的にして破壊することであろう。原則的には、HIV-1プロウイルスはCRISPR/Casのための完璧な標的である。なぜならば、感染細胞には単一のプロウイルスコピーが存在し、抗ウイルス薬の存在下ではウイルスの拡散は不可能だからである。実施例で、我々は、Tat又はTARを標的とするHIV-1特異的Cas9/sgRNA組合せの発現は当該ウイルスを切断し、HIV複製を阻止できることを示す。sgRNA標的誘導配列は配列番号:30−35として示されている。
CRISPR/Cas系デリバリーのためのウイルスベクター
標的とされるウイルスに関する上記考察で特記したように、DNAウイルス感染のin vivo治療のためのCRISPR/Cas系アプローチは、Cas9及びsgRNAを当該感染細胞にデリバリーするための遺伝子デリバリーベクターを必要とし、アデノ随伴ウイルス（AAV）をベースにするベクターの開発が最適でありうると考える。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスを含む他の遺伝子デリバリーベクターもまた用いることができる。実施例では、我々はレンチウイルスベクターを用い、さらにAAVベクターも同様に開発した。AAVベクターの利点は、それらは概ね1mL当たり1014以上のウイルス粒子の力価に濃縮できることである。前記力価は、患者の全ウイルス感染細胞に形質導入する潜在能力を有するベクターレベルである（特にこれらの細胞が全て単一の場所（例えば肝臓又は固有ニューロン）で見いだされる場合）(Kotterman and Schaffer, 2014)。さらにまた、AAV系ベクターは十分に確立された安全性記録を有し、さらに標的細胞ゲノムに有意なレベルで組み込まれることがなく、したがって挿入による有害遺伝子の活性化の可能性が回避される。
このアプローチに関する問題は、AAVベクターは最大パッケージ容量が約4.7kbであり、これはAAVの逆向き末端反復配列を含み、前記は合わせて約290bpを占有し、異種DNAのためには約4.4kbを残すだけである。Spy Cas9遺伝子（必須の添加される核局在シグナル（NLS）を含む）はサイズが約4.2kbであるので、これは、Cas9発現のためのpolIIプロモーター及びポリ(A)付加部位並びにpolIIIプロモーター及びsgRNA配列のための十分な余地を残さない。
1つの善処方法は、他の細菌種によってコードされる多くのより小さなCas9タンパク質の1つを使用することである。髄膜炎菌（Nme）はPAM配列5'-NNNNGATT-3'を有するCas9タンパク質をコードし、一方、黄色ブドウ球菌（Sau）はPAM配列5'-NNGRRT-3'（Rはプリンである）を有するCas9をコードする。両タンパク質は長さが約3.2kbの遺伝子によってコードされ、必要とされる全ての調節エレメントに加えて2つのsgRNAのためにAAVベクターで余地を残す。我々の方法では、Sau Cas9は、同じDNA標的配列ではSpy Cas9と少なくとも活性が同じであり（或いは場合によってより活性が高く）、Sau Cas9の配列特異性はSpy Cas9に匹敵するように思われる。
sgRNA発現の効果的手段としてのtRNA
以前の研究は、sgRNA転写を駆動するためにU6 polIIIプロモーターの使用に集中した。U6プロモーターは非常に効果的ではあるが、長さが約254bpであり、2つのU6プロモーターはしたがってAAVベクターの全パッケージ容量の10%以上を必要とするであろう。したがって、U6よりもはるかに小さく等価の効果を有するpol III依存プロモーターを同定することが所望される。実施例で、我々は、ヒト又はウイルス起源のtRNAプロモーターを用いて、広範囲のDNA標的に特異的なsgRNA及び細菌性Cas9タンパク質を高レベルで発現することができることを報告する。
以前に、我々は、マウスγ-ヘルペスウイルス68（MHV68）はいくつかの約60nt長の前マイクロRNA（前miRNA）分子をコードすることを示した。前記分子は、まず初めに3'前miRNAヘアピンと融合した5'ウイルスtRNA部分からなる融合転写物として転写される。これらは続いて細胞酵素のtRNase Zによる切断のために正確に分離される（tRNase Zは常態では細胞のtRNAの正確な3'末端の範囲を定めるために機能する）。我々はまた、ヒトのtRNAは、ヒト又はウイルス起源の前miRNAヘアピンと融合させたとき、前miRNA中間体及び機能的な成熟miRNAの両方を生じ、さらに前記はtRNase Zによるプロセッシングを再び要求して前miRNAからtRNAを遊離させることを示した。したがって、我々は、図11Aに模式的に示すように、前駆体tRNA融合中間体を介して機能的なsgRNAを生成するためにヒトtRNAもまた用いることができるか否かを知りたいと考えた。以前に記載されたtRNA:前miRNA融合転写物と比較したとき、このtRNA:sgRNA融合物は、sgRNAが顕著に大きく（約101nt対約60nt）さらにより複雑な二次構造に折り畳まれるという両方の点で相違する。
実施例で報告するように、哺乳動物又はウイルス起源のtRNAはsgRNAの発現を駆動することができる。ほとんどの事例で、tRNA:sgRNAはtRNase Zによって切断されてsgRNAを生成し、生成されたsgRNAは活性を有した。試験したtRNAは配列番号:41−50として示されてあり、実施例に示すように、いくつかは、他のものよりも活性が高く、より高レベルのsgRNA を生成した。この技術は、より小さなプロモーターエレメントを用いてsgRNAの発現を駆動する手段を示し、小さな運搬容量のベクター（例えばAAV）を用いる場合に有利であろう。これらのtRNA:sgRNA構築物は、標的部分を欠くがその代わりに多様な標的部分の挿入のためにsgRNAの足場区画の上流に制限酵素部位を含むsgRNAを含むことができる。これらのtRNA:sgRNA構築物は、新規なCRISPR/Cas標的誘導系の開発のためのキットに包含させることができる。
構築物及びベクター
“組換え核酸”というとき、天然の状態では互に結合していない2つ以上の核酸領域の存在を示す。
“発現カセット”、“発現構築物”又は“発現ベクター”という用語は、発現されるべき少なくとも1つの核酸配列を、その転写制御配列及び場合によって翻訳制御配列と一緒に含む核酸分子を指す。発現カセットの取替えは、前記が取り込まれているベクターに種々の配列又は配列の組み合わせの発現を指令させるであろう。5'及び3'末端に存在するように操作された制限部位のために、当該カセットを容易に挿入し、除去し、又は別のカセットと置き換えることができる。
“作動可能に連結される”又は“作動可能に結合される”という用語は、調節エレメント及び遺伝子又はそのコード領域間の連結を表現するために用いられる。すなわち、遺伝子発現は、典型的には一定の調節エレメント（例えば構成的又は誘発性プロモーター、組織特異的調節エレメント及びエンハンサーであるが、ただしこれらに限定されない）の制御下に置かれる。遺伝子又はコード領域が調節エレメントによって制御されるか又はその影響を受けることを意味するとき、遺伝子又はコード領域は、該調節エレメントと“作動可能に連結”又は“動作的に連結”又は“作動可能に結合”又は“作動可能に接続”されていると表現される。プロモーター、エンハンサー、トランス活性化因子を含む調節エレメントが本明細書に包含される。
本明細書で用いられるように、“対象動物”及び“患者”という用語は本明細書では互換的に用いられ、ヒト及び非ヒト動物の両方を指す。本開示の“非ヒト動物”という用語は全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、マウス、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象動物はヒトの患者である。より好ましくは、対象動物は、ウイルス感染又はウイルス感染誘発癌若しくはウイルス感染関連癌に罹患するヒト患者である。
本明細書で用いられるように、“遺伝子治療”という用語は、多細胞性真核細胞性物の細胞内への、in vivoであれ、ex vivoであれ、又はin vitroであれ核酸組成物の移転を意味する。“遺伝子治療”という用語は代謝性疾患を修正する目的に限定されるべきではなく、一般的な（特定の治療目的に依存しない）治療目的のために核酸組成物（例えば発現カセット又はミニ遺伝子）を移転するための技術的用語としてより広く解釈されるべきである。したがって、“遺伝子治療”という用語は、核酸分子移転手段による代謝性疾患の修正、癌治療、ワクチン免疫、細胞集団の監視、細胞増殖、幹細胞操作、ウイルス感染などを含む（ただし前記限定されない）。
発現カセット：
本発明のある特徴は組換え構築物又は発現カセットを提供し、前記は、第一の単一ガイドRNAをコードする第一のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第一のプロモーター及びCas9ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第二のプロモーターを含むか、前記からなるか、又は本質的に前記からなる。sgRNAは、DNAウイルスの標的配列の鎖と相補的な第一の部分（適切にはsgRNAの5'末端）及びCas9ポリペプチドと相互作用できる第二の部分（適切にはsgRNAの3'末端）を含む。ある実施態様では、組換え構築物は、ウイルスベクター（例えばAAVベクター）中のパッケージングのために、本明細書に記載の構築物又はカセットにフランキングする逆向き末端反復配列（ITR）を含む。該構築物又はカセットは5'から3'に向かって以下のように編成され、第一の逆向き末端反復配列とその後に続くRNAポリメラーゼIII依存プロモーター（単一ガイドRNAに作動可能に連結されてある）、RNAポリメラーゼII依存プロモーター/エンハンサー（Cas9をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されてある）、及び第二の逆向き末端反復配列を含む。
任意のRNAポリメラーゼプロモーターを使用できることは本開示の範囲内であるが、一方、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写干渉を回避するためにベクターの5'末端に挿入されるRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む（転写干渉は、RNAポリメラーゼIIIプロモーターがRNAポリメラーゼIIプロモーターの3'側に位置するときに生じることが知られている）。ある種の実施態様では、RNAポリメラーゼIIIプロモーターは細胞性H1及びU6プロモーターからなる群から選択される。他の実施態様では、用いられるRNAポリメラーゼIIIプロモーターは、上記に記載され実施例で使用するために示されたtRNAである。
RNAポリメラーゼIIIプロモーターは単一ガイドRNA（sgRNA）に作動可能に連結される。ある実施態様では、sgRNAは、標的DNA配列のセンス鎖と相補的な5'部分及びCas9との結合を可能にする保存され構造化された3'末端を含む。標的DNAは、変異及び/又は欠失のための標的として所望される遺伝子をコードする任意のDNA配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、標的DNA配列はウイルスのDNA配列を含む。可能性のある標的配列は、標的DNA配列中でCas9ポリペプチドによって認識されるPAM配列のまさに5'側に位置しなければならない。発現カセットはただ1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーター（sgRNAに作動可能に連結されてある）を含むか、又は発現カセット中に2つ以上のRNAポリメラーゼIIIプロモーター-sgRNA組合せを含むことができる。単一遺伝子又は標的配列において2つの標的配列を標的とする2つ以上のsgRNAの使用は、1つの完全な遺伝子座の欠失を可能にするために十分である。
発現カセットは、ベクターの3'末端のCas9発現を駆動するためにプロモーター/エンハンサーを含む。プロモーター/エンハンサーは、RNAポリメラーゼIIを補充しRNA転写を開始するDNA配列として当業界で公知であり、本開示の範囲内である。当業者は、本開示での使用にいずれが適切であるかを容易に決定できよう。ある種の実施態様では、プロモーター/エンハンサーはHSV-TKプロモーターを含む。他の実施態様では、プロモーター/エンハンサーはCMV最初期（CMV-IE）プロモーター/エンハンサーを含む。適切なプロモーターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：EFS、hCMV又はmCMV最初期、CBA、hシナプシン、HSV TK、SV40初期及びLSP。Cas9発現カセットはまた、プロモーターとCas9ポリヌクレオチドの5'末端との間にイントロンを含むことができる。イントロンは、発現構築物から転写されるmRNAの5'非翻訳領域に挿入されるときいくつか（全てではない）のポリペプチドの発現を高めることが示されている。例えば、ラットのプレプロインスリンイントロン（Sau Cas9の5'非翻訳領域でクローン化された配列番号:53）は、Cas9の発現を高めることが実施例で示された。
本開示の別の特徴は発現カセットを提供し、前記は、5'から3'に向かって、第一の逆向き末端反復配列（ITR）、第一のsgRNAに作動可能に連結された第一のRNAポリメラーゼIIIプロモーター、第二のsgRNAに作動可能に連結された第二のRNAポリメラーゼIIIプロモーター、Cas9発現配列に作動可能に連結されたプロモーター/エンハンサー、及び第二の逆向き末端反復配列を含むか、前記からなるか、又は本質的に前記からなる。本明細書で提供される配列の各々について、本明細書で提供される配列と90%、93%、95%、97%、98%又は99%同一の配列もまた包含される。ヌクレオチド又はアミノ酸で小さな修正を実施し、当該配列に関する知識に基づいて当該機能を維持できることは当業者には理解されよう。
一般的方法
本開示の実施には、特段の指示がなければ、通常的なウイルス学、微生物学、分子生物学の方法及び当業界の技術範囲内の組換えDNA技術が用いられるであろう。そのような技術は文献で完全に説明されている（例えば以下を参照されたい：Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（最新版）；DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II（D. Glover, ed.）；Oligonucleotide Synthesis（N. Gait, ed., 最新版）；Nucleic Acid Hybridization（B. Hames & S. Higgins, eds., 最新版）；Transcription and Translation （B. Hames & S. Higgins, eds., 最新版）；CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II（P. Tijessen, ed.）；Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II（B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.））。
本開示のある特徴は組換えベクターを提供し、前記は、本明細書に記載の発現カセットを含むか、前記からなるか、又は本質的に前記からなる。本開示のさらに別の特徴は組換えベクターを作製する方法を提供し、前記方法は本明細書に記載の発現カセットをベクターに挿入する工程を含むか、前記からなるか、又は本質的に前記からなる。
本明細書で用いられるように、“ベクター”という用語は、宿主細胞へ、宿主細胞中に、及び/又は宿主細胞内の特定の位置及び/又は区画に核酸組成物を移転させることができる及び/又は輸送することができる、任意のエレメント（例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体（YAC又はBAC）、ウイルス、ウイルスキャプシド、ビリオンなど）を含むことが意図される。したがって、前記用語は、クローニングベヒクル及び発現ベヒクルの他にウイルス及び非ウイルスベクター並びに裸のDNA又は複合DNAを含む。しかしながら、前記用語は、遺伝子移転ベクターを生成する細胞、例えばレトロウイルスパッケージング細胞株は含まない。
いくつかの実施態様では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む。本発明の目的のためには、“組換えウイルス”、“組換えビリオン”、“組換えベクター”又は“組換えウイルスベクター”とは、ウイルスであって、例えば当該粒子への異種核酸組成物の付加又は挿入によって遺伝的に改変されてあるものを意味する。いくつかの実施態様では、組換えウイルスはAAVを含む。したがって、例えば、“組換えAAVビリオン”は“組換えAAVベクター”と同義語として用いられる。組換えAAVベクターは、少なくとも1つのAAVキャプシド（“外殻”）及び組換えAAV（ベクター）ゲノム（カプシド内に保持される）を含む。
本発明の目的のためには、“組換えAAVゲノム”又は“組換えAAVベクターゲノム”とは、異種配列を含むAAVゲノムを意味する。一般的には、組換えAAVゲノムは、全てのウイルス遺伝子が異種配列（例えば発現カセット又はミニ遺伝子）によって置き換えられるような態様で設計され、当該ゲノムの必須のcisエレメント（すなわち逆向き末端反復配列（ITR）、DNAパッケージングシグナル、及び複製起点）のみが無傷のままである。また別には、当該ゲノムの必須のcisエレメントは、従来技術で文献（Musatov et al.：“A cis-acting element that directs circular adeno-associated virus replication and packaging.”：J Virol. December 2002;76(24),12792-802）に記載されているものでありうる。組換えAAVゲノムは組換えAAVベクターの部分である。
本開示の別の特徴は、本開示のある実施態様の組換え発現カセットを含む、前記からなる又は本質的に前記からなる組換えベクターを作製する方法を提供し、前記方法は一般的に以下の工程を含む：（1）(r)AAVベクター構築物を生成細胞(例えば293細胞)に導入する工程；（2）“AAVパッケージング構築物”を前記生成細胞に導入する工程（ここで前記パッケージング構築物は、本明細書に記載の組換え発現カセット又は構築物、及びAAVベクター構築物から失われたAAVパッケージング機能を補完するために当該生成細胞で発現されうる任意のAAVコード領域（例えばrep及びcap配列）を含む）（プラスミド系AAVパッケージング構築物はしばしば“トランス”プラスミドと称される）；（3）1つ以上のヘルパーウイルス及び/又は補助機能ベクター構築物を前記生成細胞に導入する工程（ここで前記ヘルパーウイルス及び/又は補助機能ベクター構築物は、当該生成細胞での効率的な組換えAAV（“rAAV”）ビリオン生成を支援することができる補助機能を提供する）（しばしば用いられる細胞はHEK293細胞及びSf9細胞である）；及び（4）前記生成細胞を培養してAAVビリオンを生成する工程；（5）前記細胞を採集する工程及びrAAVビリオンを単離/精製する工程。
AAVベクター構築物、AAVパッケージング構築物、及びヘルパーウイルス又は補助機能ベクター構築物は、生成細胞に同時に又は連続して標準的トランスフェクション技術を用いて導入することができる。生成細胞への分子の導入（プラスミド又はウイルスとして）はまた当業者に公知の技術を用いて達成でき、それらは本明細書を通して考察される。好ましい実施態様では、標準的なトランスフェクション技術が用いられ、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション又はエレクトロポレーション、及び/又は細胞株（例えばヒト胎児腎臓細胞株HEK293）へのハイブリッドアデノウイルス/AAVベクターによる感染である（HEK293は、トランス作用性E1タンパク質を提供する機能的なアデノウイルスE1遺伝子を含むヒト腎臓細胞株である）。このようにして生成された、rAAVを本明細書に記載の組成物及びキットを調製に用いることができ、さらに本発明の方法で用いることができる。
組換えAAVベクター構築物（例えば本明細書に記載の発現カセットを含む組換えAAVベクター）は公知の技術を用いて構築され、転写の先導で作動可能に連結された成分として少なくとも以下を提供する：第一の逆向き末端反復配列（ITR）、第一のsgRNAに作動可能に連結された第一のRNAポリメラーゼIIIプロモーター、場合によって、第二のsgRNAに作動可能に連結された第二のRNAポリメラーゼIIIプロモーター、Cas9発現配列に作動可能に連結されたプロモーター/エンハンサー（RNAポリメラーゼII依存プロモーター）、及び第二の逆向き末端反復配列。作動可能に連結された成分を含む生成構築物は、機能的なAAV ITR配列で区切られる（5'及び3'）。
各々の発現カセットの5'及び3'末端は逆向き末端反復配列領域（ITR）を含み、前記は、当該ベクター（例えば組換えAAVベクター）の増量及びパッケージングに必要とされる。本発明のベクターで用いられるAAV ITRは野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変異させることができる。いくつかの実施態様ではまた、5'-ITR及び3'-ITRは異なる血清型（例えばAAV2-5'-ITR及びAAV5-3'-ITR）から誘導できる。
さらに、AAV ITRはいくつかのAAV血清型のうち任意のものから誘導することができる（AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、トリAAV、ウシAAVなどを含む）。AAVベクター構築物中の選択したトランスジーン発現カセット構築物にフランキングする5'及び3'ITRは、必ずしも同一である必要はなく同じAAV血清型に由来する必要もない。したがって、AAVベクターの設計及び生成は、種々のAAV血清型間でのキャプシドタンパク質の交換を可能にする。例えばAAV2-ITRによってフランキングされ、さらにAAV2キャプシド中でパッケージングされる発現カセットを含む同種ベクターを生成でき、同様に、例えばAAV2 ITRによってフランキングされるが別のAAV血清型（例えばAAV5）からキャプシドが生じるハイブリッドベクターも生成できる。
実施例及び具体的には図16で示されるように、本明細書に記載する本発明のAAVベクターの挿入は、挿入物にフランキングする、AAVベクターパッケージングに必要な末端のITR（逆向き末端反復配列）を含む。5'から3'に向かって、ベクターは2つのsgRNA発現カセットを含み、前記sgRNAは、RNAポリメラーゼIII依存プロモーター（例えばヒトU6プロモーター）によって転写されるか、又はヒトtRNAプロモーター（例えばグルタミンtRNA又はプロリンtRNA）によって又はMHV68-由来tRNAプロモーターによって転写される。次に、Cas9 mRNAの発現を駆動するために、RNAポリメラーゼII依存プロモーター/エンハンサーが用いられる。適切なプロモーターの可能な例には、真核細胞翻訳開始因子2アルファ（EFS）プロモーター、ヒト（hCMV）又はマウス（mCMV）サイトメガロウイルス最初期プロモーター、ニワトリベータアクチン/hCMV融合プロモーターCBA、hシナプチンプロモーター又は肝特異的プロモーターLSPが含まれる。図16で実施例に示されるように、Cas9 5'UTRは、イントロン（この実施例ではラットプレプロインスリンII遺伝子に由来）及び核局在シグナルを含む。Cas9のアミノ末端に挿入される核局在シグナルはSV40大T抗原由来でも、ヌクレオプラスミン由来でも可能であり、又は合成NLSでもよい。多様なNLSのアミノ酸配列が配列番号:59−62として提供される。合成Cas9オープンリーディングフレーム（FLAGエピトープ及び最終的にはポリ(A)付加部位を有し、ウイルス若しくは細胞性遺伝子から誘導されるか又は合成により生成される）が含まれる。
医薬組成物及び治療方法
組換え発現カセット又は構築物及び本明細書に記載の前記発現カセットを含む組換えベクターは、多くの潜在的用途（例えば遺伝子欠失の強化、癌の治療、及びエピソーム性ウイルスゲノムを感染組織から除去するための抗ウイルス剤としての使用）を有する。本開示のある特徴は、対象動物でウイルス感染を治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の組換えベクターの治療的に有効な量を対象動物に投与する工程を含むか、前記工程からなるか、又は本質的に前記工程からなる。本開示の別の特徴は、対象動物でウイルスエピソームを除去する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の組換えベクターの治療的に有効な量を対象動物に投与する工程を含むか、前記工程からなるか、又は本質的に前記工程からなる。前記方法は、本明細書に記載の組換えベクター又は構築物の投与後に、ウイルス複製の阻害又は標的配列発現の阻害をもたらすことができる。
前記方法はまた、本明細書に記載の構築物及びベクターと細胞を接触させる工程を包含する。細胞は、in vivo、in vitro、又はex vivoで当該薬剤と直接的に又は間接的に接触させることができる。接触工程は、細胞、組織、哺乳動物、患者又は人間への投与を含む。他の適切な方法は、下記に規定される適切な手順及びルートを用いて薬剤を細胞、組織、哺乳動物又は患者に導入又は投与する工程を含むことができる。組換えベクターは前記対象動物の細胞に基本的にin vivoで投与することができる。すなわち、対象動物の細胞との接触は、もっとも典型的に用いられる手順に従って個体の体内で生じる。
本明細書で用いられるように、“治療”は、疾患、異常、又は患者によって示される（若しくは患者が感受性を有する）生理的状態に応答して実施される臨床的介入である。治療の目的は、徴候の緩和若しくは予防、疾患、異常若しくは症状の進行若しくは悪化の減速若しくは停止、及び/又は疾患、異常若しくは症状の寛解を含む。“治療”は、治療的処置及び予防的若しくは防止的手段の一方又は両方を指す。治療を必要とする者には、疾患、異常若しくは望ましくない生理的状態にすでに罹患している者の他に、疾患、異常若しくは望ましくない生理的状態が予防されるべき者が含まれる。
癌治療には、対象動物における癌細胞数又は腫瘍サイズの減少、癌又はより攻撃的な形態への進行の緩和、癌細胞増殖の低下又は腫瘍増殖速度の低下、癌細胞の殺滅、対象動物における癌細胞転移の低下又は癌再発の確率の低下が含まれる。本明細書で用いられる対象動物の治療は、疾患に罹患している又は発症のリスクにある対象動物に利益を付与する任意のタイプの治療を指し、前記には、対象動物の症状の改善（例えば1つ以上の徴候で）、疾患の進行の減速、徴候の開始の先送り、又は徴候の進行の減速などが含まれる。
“有効量”又は“治療的に有効な量”という用語は、有益な又は所望される生物学的及び/又は臨床的結果の達成に十分な量を指す。治療的に有効な量は、化合物、処方又は組成、疾患及びその重篤度、並びに治療されるべき対象動物の年齢、体重、生理的状態及び応答性にしたがって変動するであろう。組換えベクターは、好ましくは、人間又は人間以外の哺乳動物患畜への投与のために、医薬的に許容できるデリバリーベヒクル（すなわち生理学的に適合する担体）に懸濁される。当業者は適切な担体を容易に選択でき、前記担体は選択される投与ルートに左右されうる。
医薬組成物はまた、医薬的に許容できる成分、例えば賦形剤、担体及び/又は安定化剤を含むであろう。そのような成分には、当該組成物を投与される個体にそれ自体有害な免疫応答を誘発せず、さらに過度の毒性を与えることなく投与できる任意の薬剤が含まれる。医薬的に許容できる成分には、液体、例えば水、食塩水、グリセロール及びエタノールが含まれるが、ただし前記に限定されない。その中には医薬的に許容できる塩を含むことができ、それらは、例えば無機酸の塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）及び有機酸の塩（例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）である。さらに、補助物質（例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質など）もそのようなベヒクルに存在しうる。他の例示的成分にはラクトース、シュクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油及び水が含まれる。担体の選択は本発明を制限しない。場合によって、本開示の組成物は、rAAVベクター及び他の組成物に加えて、他の通常の医薬成分、例えば保存料、化学的安定化剤などを含むことができる。適切な例示的成分には、微晶質セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート80、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。医薬的に許容できる賦形剤の完全な考察は以下で入手できる：REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Mack Pub. Co., N.J. 1991）。
適切な用量はとりわけ、選択したAAVベクターの特異性（例えば血清型など）、投与ルート、治療される哺乳動物（例えば人間若しくは人間以外の霊長類、又は他の哺乳動物）、治療されるべき対象動物の年齢、体重、性別、及び一般的状態、並びに投与態様に左右されるであろう。したがって、適切な投薬量は患者ごとに変動しうる。当業者は適切な有効量を容易に決定できる。
投薬処置は単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールでありうる。さらにまた、対象動物は適切な回数だけ投与されうる。当業者は適切な投与回数を容易に決定できる。
しかしながら、代替投与ルート、又は治療利益と一切の副作用とのバランスを考慮して、投薬を調節することは必要でありうる。そのような投薬は、組換えベクターが用いられる治療用途にしたがって変動しうる。
組換えベクターは十分な量で投与されて、所望の細胞に進入して移転された核酸組成物の十分な機能性レベルを担保し、治療利益を提供し過度の有害作用をもたらさず或いは医学的に許容可能な生理学的効果（前記は医療従事者が決定できる）をもたらす。
場合によって、いくつかの実施態様では、本開示のrAAV媒介デリバリーは、他のウイルス系及び非ウイルス系ベクターによるデリバリーと組み合わせることができる。そのような他のウイルス系ベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及び単純疱疹ウイルス（HSV）ベクターが含まれるがただしこれらに限定されない）は容易に選択でき、当業界で公知の方法にしたがって作製できる。同様に、非ウイルス系ベクター（リポソーム、脂質をベースとするベクター、ポリプレックスベクター、分子複合物、ポリアミン、及び多価陽イオンベクターが含まれるが、ただしこれらに限定されない）は容易に選択でき、当業界で公知の方法にしたがって作製できる。これらの代替ルートによって投与されるとき、投薬量は上記の範囲が望ましい。
全RGNサイズを最小にするために、我々は、小さいが効果的なプロモーターを用いることによってCas9及びsgRNA発現カセットを最適化した。単一ガイドRNAキメラは2つの必須の部分からなる。すなわち、標的DNAセンス鎖の配列と完全に相補的な5'部分、及びCas9結合のために必須の保存された構造化3’末端足場である。我々は、髄膜炎菌並びに黄色ブドウ球菌のcrRNA及びtracrRNAの部分を融合するsgRNAを開発し特徴を調べた（前記は実施例に示すようにただ1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現されうる）。
この最少のsgRNAは、5'標的誘導配列を改変することによって容易に修正して任意のDNA遺伝子座を標的にすることができる。実施例に示したSpy Cas9、Nme Cas9及びSau Cas9を用いた新規な緑色蛍光タンパク質（GFP）及びルシフェラーゼ切断レポーターアッセイによって示されるように、sgRNAは、Cas9に搭載されたとき機能を示す。前記アッセイは、HIV-1Revタンパク質及びGFP又はルシフェラーゼコード配列とインフレーム融合させた標的DNAの発現を測定する（すなわち切断はRev/GFP若しくはRev/Luc発現の低下又は停止をもたらす）。適切なgRNAと合わせてNmeCas9タンパク質の発現は、顕微鏡で検出されるGFP発現の消失、及びルシフェラーゼアッセイ光単位によって測定されるルシフェラーゼ生成の低下、及びRev特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって検出されるRev融合タンパク質発現の消失をもたらす。これらのアッセイは、我々は培養で適切なCas9及びsgRNAレベルの発現に成功したこと、及びDNA標的切断は高度に有効でありかつ特異的であることを示している。
単一及び二重sgRNA Cas9 AAV発現ベクターの構築は、抗ウイルスRGNによるin vivoでのウイルスDNAエピソームの効率的な破壊に必要な効率的な細胞内デリバリー及び発現を直接的に促進するであろう。特定のAAV血清型が、in vivoで肝細胞及びニューロンの双方に対し高い指向性レベルを示した。さらにまた、AAVベクターはin vivoでの使用に安全であることが示され、さらに高力価で生成できる。このことは、HBV感染ヒト化ネズミ肝又はHSV-1潜伏感染ネズミ三叉神経神経節でそれぞれ抗HBV及び抗HSV-1 RGNを試験するために理想的である。RGNを用いるゲノム操作実験の間に、ゲノムDNAの切断は、非相同性末端結合による不完全な修復のために位置特異的変異導入、他の点変異又は挿入/欠失をもたらすことが示された。しかしながら、Sas9 RGNが複製性エピソームに標的誘導されるとき、我々はそれらエピソームが細胞から排除されることを観察した。提唱のウイルス標的誘導は細胞のエピソーム排除を可能にする。このエピソーム排除現象は新規かつ有益であり、HSV-1及びHBV gRNAはともに、複数のウイルス遺伝子を同時に標的とするために組み合わせることができ、したがって所望の阻害効果を強化できる。
HBV及びHSVに対して極めて重要な多数の遺伝子標的を上記に規定したように選択した。HBV逆転写酵素、コアタンパク質及びエンベロープタンパク質S及びLは感染性ウイルス粒子の生成に必須であり、これらは培養でRev-GFPレポーターアッセイを用いて首尾よく標的誘導された。HSV-1の事例では、LAT領域（ニューロン潜伏期で唯一転写される領域である）並びに必須のICP4及びICP0遺伝子で多数の標的がまた選択された。HBV又はHSV-1特異的Cas9系ペイロードをコードするAAVベクターを非特異的コントロールAAVベクターと直接比較し、定量的PCRによって、肝臓及び三叉神経神経節の組織をそれぞれHBV cccDNA又はHSV-1エピソームの消失について査定することができる。HBV慢性感染のヒト化マウスモデル又はHSV-1潜伏期のネズミモデルにおけるin vivo概念の証明は、AAVによる肝又は三叉神経神経節特異的形質導入と対合させた高度に効果的なエフェクター/ウイルス標的の両方を必要とするであろう。AAVによってデリバーされるCas9/sgRNA組み合せは、感染組織のウイルスDNAエピソームの特異的かつ効率的なin vivo排除を誘発するために新規な（かつ潜在的に極めて効果的な）治療である（前記ウイルスDNAエピソームにはHBV及びHSV-1だけでなくHSV-2及びヒトパピローマウイルス(HPV)-由来ウイルスDNAエピソームが含まれる）。
本開示は、本明細書に示す構築物、組成物の編成又は方法の工程の具体的な詳細に限定されない。本明細書に開示した組成物及び方法は、以下の開示に照らし、当業者に明白な多様な方法で作製し、実施し、使用し、実行し及び/又は形成することができる。本明細書で用いられる語法及び用語は単に説明を目的とし、特許請求の範囲を制限するものとみなされるべきではない。多様な構造及び方法の工程に言及して詳細な説明及び特許請求の範囲で用いられる順序の指示（例えば第一、第二及び第三）は、いずれか特定の構造若しくは工程、又はそのような構造若しくは工程のいずれか特定の順序若しくは構成の指示と解されることを意図しない。本明細書で特段の指示がない限り、或いは内容に明瞭な矛盾が生じない限り、本明細書に記載の全ての方法は任意の適切な順序で実施できる。本明細書で提供されるいずれの例及び全ての例又は例示の言葉（例えば“such as”）の使用は単に開示を容易にすることを意図し、特段に指示しない限り本開示の範囲のいかなる制限も意図しない。本明細書中のいずれの言葉及び図面に示されるいずれの構造も、特許請求されていない任意の成分が開示の内容の実施に必須であることを示していると解されるべきではない。“including（含む）”、“comprising（含む）”又は“having（有する）”という用語及び前記の変型の本明細書での使用は、その後に記述される成分及びその等価物並びに追加の成分を包含することが意図される。ある種の成分を“including（含む）”、“comprising（含む）”又は“having（有する）”と称される実体はまた、そのようなある種の成分“から本質的になり”、さらにそのようなある種の成分“からなる”ことが意図される。
本明細書において値の範囲の記述は、本明細書で特段に指示されない限り、当該範囲内のそれぞれ別々の値を個々に言及する簡潔な方法として用いられ、それぞれ別々の値は、当該値が本明細書で個々に記述されているように本明細書に含まれる。例えば、濃度範囲が1%から50%と記載される場合、例えば2%から40%、10%から30%、又は1%から3%などの値が本明細書に明瞭に列挙されていることが意図される。これらは具体的に意図されることの単なる例であり、列挙されている最小値と最高値の間（前記値を含む）の全ての可能な数値の組み合わせが、本開示で明瞭に記載されていると考えられるべきである。特に列挙される量又は量の範囲を述べるために使用される“約”という語は、当該記述された量に非常に近い値が当該量に含まれることを示すことを意図する（例えば、製作公差、測定実施における装置及び人的誤差などが説明となりうるか或いは当然そのような理由による値）。量に関する全てのパーセンテージは特段の指示がなければ重量による。
いずれかの参考文献（本明細書に引用する一切の非特許又は特許文書を含む）が先行技術を構成するということは全く容認されない。特に、特段の記載がなければ、本明細書のいずれの文書に対する参照も、これらの文書が米国又は他の任意の国で通常の一般的知識の部分を構成しているということを容認するものではない。これら参考文献のいずれの考察もそれらの著者の主張を陳述しているが、出願人らは本明細書に引用するいずれの文書の正確さ及び妥当性についても反駁する権利を保留する。本明細書に引用した全ての参考文献は、特段の指示がなければ参照によりその全体が本明細書に含まれる。引用した参考文献で見出されるいずれかの定義及び/又は記述に何らかの矛盾が存在する場合には、本開示が優先するであろう。
以下の実施例は例示を目的とし、本発明の範囲又は添付の請求の範囲の制限を意図しない。
HPVを標的とする構築物の設計及び使用
CRISPR/Cas9構築物及びsgRNA設計：
Zifitウェブアプリケーション（http://zifit.partners.org）を用いて、HPV-18E6及びE7 ORFのアミノ末端領域をコードするDNA配列を標的とする、2対の単一ガイドRNA（sgRNA）を設計した。Spy Cas9発現px330ベクター（Addgene）でHPV特異的sgRNAをクローニングすることによって、RNAによって誘導されるDNAエンドヌクレアーゼ（RGN）を構築した（Cong et al, 2013）。sgRNAはまたpx458ベクターでクローニングされた（px458ベクターはフローサイトメトリー分析に有用なgfpマーカーを含むpx330の代替バージョンである（Ran et al., 2013））。RGN機能は、HPV-18 E6又はE7由来ウイルスDNA標的を含むベクターを作製して試験した（前記DNA標的はReVのアミノ酸1から59をコードするHIV-1 rev遺伝子フラグメント（Malim et al., 1989）と3'gfpインジケーター遺伝子との間にインフレームで挿入された）。レポータープラスミドとSpy Cas9/sgRNA発現構築物との共同トランスフェクションの後で、Rev及びGFP発現の特異的消失をそれぞれウェスタンブロット又はフローサイトメトリーによって機能を決定した。SiHa細胞株に組み込まれたHPV-16 E6及びE7 ORFを標的とするHPV-16特異的sgRNAを設計し、同様なアプローチを用いて試験した。以下の遺伝子特異的sgRNA配列を用い、先に概略したように構築した（(Cong et al., 2013）：HPV-18 E6t1（GGCGCTTTGAGGATCCAACA；配列番号:8）、HPV-18 E6t2（GAAGCTACCTGATCTGTGCA；配列番号:9）、HPV-18 E7t1（GGAGCAATTAAGCGACTCAG；配列番号:10）、HPV-18 E7t2（GAAGAAAACGATGAAATAGA；配列番号:11）、HPV-16 E6t1（GCAACAGTTACTGCGACGTG；配列番号:12）、及びHPV-16 E7t1（GCCAGCTGGACAAGCAGAAC；配列番号:13）。下線を付したヌクレオチドは、U6プロモーターから開始される転写のために要求されるミスマッチ5'G残基を示す。
細胞培養：
10%ウシ胎児血清（FBS）、2mM抗生抗菌剤（Gibco Cell Culture）及び50μg/mLゲンタマイシン（LifeTechnologies）を補充したダルベッコー修正イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle Medium（DMEM））で、HeLa、293T及びSiHa細胞を37℃で増殖させた。
レポーターアッセイ：
293T細胞でのレポーターアッセイは、リン酸カルシウムトランスフェクション方法を用いて実施した。293T細胞を12ウェルプレートに約1.25ｘ105細胞/ウェルでプレートし、RGN発現プラスミドとインジケータープラスミドを4：1の割合でトランスフェクトした。続いて、Revエピトープタグ発現の検出のためにウェスタンブロットで、さらに陽性分画及びトランスフェクション3日後のeGFP陽性細胞の平均蛍光強度（MFI）の決定ためにフローサイトメトリーで293T細胞をアッセイした。
SURVEYORアッセイ及び変異誘導域：
HeLa細胞を6ウェルプレートに2.5ｘ105細胞/ウェルでプレートし、RGN発現ベクターとpL/CMV/eGFP（pLCE（eGFPを発現する））（Seedorf et al., 1987）を3：1の割合でFugene6を用いてトランスフェクトし、トランスフェクション効率を決定した。トランスフェクション48時間後に、DNeasyキット（Qiagen）を製造業者のプロトコルにしたがって用いゲノムDNAを抽出した。Go Taqカクテル（Promega,# 9PIM300）を用いて、ウイルス標的部位を取り巻くゲノム領域を増幅し、続いて精製した。続いてPCR生成物を以下のように変性及び再アニーリングしてDNA異種二重鎖形成を可能にする：95℃で10分、-1℃/秒で95℃から85℃にランピング、-0.25℃/秒で85℃から25℃、及び25℃で1分間保持。再アニーリング後に、生成物をSURVEYORヌクレアーゼ及びSURVEYORエンハンサーS（Transgenomics）で製造業者のプロトコルにしたがって処理し、2%アガロースゲルで分析した。HPV-18 E6及びE7特異的sgRNAによって導入された変異の配列域を決定するために、予想されるRGN切断場所にフランキングする配列に結合する固有の制限酵素部位を有するプライマーを設計した。変異が導入されたHeLaゲノムDNAをトランスフェクション48時間後にPCR増幅し、クローニングし、配列決定し、HeLaゲノムとアラインメントを実施した。
ウェスタンブロット及びpRB定量：
製造業者のプロトコルにしたがってFugene6を用いて、RGNの表現型分析をHeLaで実施した。細胞を6ウェルプレートに2.5ｘ105細胞/ウェルでプレートし、RGN発現ベクターとpLCE（トランスフェクション効率を決定するために加えられるGFP発現プラスミド）を3：1の割合でトランスフェクトした。製造業者のプロトコルにしたがってリポフェクタミン300（Lipofectamine3000（Clontech））を用い、SiHa細胞にHPV-16特異的RGN発現ベクターをトランスフェクトした。続いてトランスフェクション48時間後に、細胞を採集し、SDS/β-メルカプトエタノールタンパク質溶解緩衝液で溶解した。溶解物を4−20%のSDS-ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）で電気泳動に付し、ニトロセルロース膜に移した。この膜を5%ミルク-PBS-T（PBS、0.1%トゥイーン20、0.5%ウシ血清アルブミン）中で以下の抗体で精査した：抗Flag（Sigma F1804）、ウサギRevポリクローナル抗血清（Malim et al., 1989）、抗β-アクチン（Santa Cruz SC-47778）、抗-p53（Santa Cruz SC-126）、抗-p21（Santa Cruz SC-397）、及び抗-Rb（BD Pharmigen 554136）。膜をPBS-Tで洗浄し、種特異的二次抗体とともにインキュベートし、続いてPBS-Tで洗浄した。ウェスタンブライトシリウスウェスタンブロット検出キット（Western Bright Sirius Western blot detection kit（Advansta））とともに前記膜をインキュベートし、ジーンスナップ（GeneSnap）を用いてシグナルを捕捉し、ジーンツール（GeneTools（Syngene））を用いて定量した。RGN切断の特異性を決定するために、我々は、Cas9“シード”領域に同義変異を保有するE6変異体を発現するpcDNA3構築物を作製した。これらの実験は、30−40%コンフルエンシーにある6ウェルプレートのHeLa細胞にRGN発現ベクターと変異E6発現プラスミドを3：1の割合でFugene6を用いてトランスフェクトすることによって実施した。トランスフェクション48時間後にウェスタンブロットを三組として実施した。
増殖阻害と細胞周期の分析：
RGNの増殖への影響を決定するために、HeLa細胞を12ウェルプレートに105細胞/ウェルでプレートし、750ngのHPV-18特異的RGN発現ベクターを三組にしてトランスフェクトした。FACS Cantoソフトウェアを用いて、eGFP陽性細胞のパーセンテージを測定するフローサイトメトリー分析をトランスフェクション48、72及び96時間後に実施した。データはpx458をトランスフェクトした細胞で標準化した。細胞周期の進行を試験するために、6cmプレートに106のHeLa細胞をプレートし、Fugene6を用いて、HPV-18 E6又はE7特異的RGN発現ベクター及びeGFP発現プラスミドを3：1の割合で共同トランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に、指数関数的に増殖する細胞を10μg/mLの5-ブロモデオキシウリジン（BrdU; Calbiochem）で1時間処理した。続いて細胞をトリプシンで処理し、PBSで洗浄し、2%のパラホルムアミドで1時間、25℃で固定した。細胞をPBSで洗浄し、70%エタノールにより4℃で一晩透過性にした。PBSで洗浄した後、2NのHClで30分間、25℃で細胞を処理してDNAを変性させ、続いてPBS-Tで2回洗浄した。細胞を100μLのPBS-T及び2.5μLのAlexa Fluor 647抗BrdU抗体（catalog no. 560209；BD Biosciences）中に25℃で20分間懸濁させた。細胞をPBSで1回洗浄し、200μLのヨウ化プロピジウム(PI)/RNase染色緩衝液（BD Biosciences）に再懸濁させた。続いて、BD FACSCanto II及びFlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーで細胞を分析した。BrdU及びPI染色を比較する別々のフロー図を作成して、トランスフェクト及び非トランスフェクト（GFP陰性）HeLa細胞を比較した。
細胞生存アッセイ：
HeLa細胞の形質導入効率を測定するために、我々はレンチウイルスLCE eGFP発現ベクター(Zhang et al., 2009)を利用した。前記によって、我々は89.3%の培養HeLa細胞が形質導入されたと決定でき、約2.2の開始MOIと一致した。使用したSpy Cas/sgRNA発現レンチウイルスベクターはlentiCRISPR（Shalem et al., 2014）をベースにし、適切なsgRNAがU6プロモーターの3'側に挿入されていた。HeLa細胞（5ｘ104）にこれらのレンチベクターを形質導入し、感染24時間後に新しい培養液を添加した。続いて細胞を10日間培養し、2日間隔で細胞数を定量した。
第二の実験では、再び、Spy Cas9及び非特異的sgRNA、E6 sgRNA若しくはE7 sgRNA1を発現するlentiCRISPR系ベクター、又はLCEをHeLa細胞に形質導入した。この第二の実験では、我々はより高いと考えられる約37のMOIを用いた（前記は本質的に全ての細胞の感染をもたらすはずである）。10日間培養した後、細胞を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）で染色した。MTTを0.04MのHClを含むイソプロパノールで細胞から溶出させ、フルオスターオメガ（Fluostar Omega；BMG Labtech）によって590nmで、620 nmの参照フィルターとともに吸収を測定した。生存率は模擬感染と比較して計算した。
結果
DNA切断のためにHeLa細胞に存在するHPV-18の組み込まれたゲノムコピーを標的とするために、我々は、HPV-18 E6オープンリーディングフレーム（ORF）のヌクレオチド5から24及び36から55、並びにHPV-18 E7 ORFのヌクレオチド84から103及び106から125に相補的なsgRNAを設計した。これらは、px330発現ベクターに存在するU6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターの制御下で発現される（px330発現ベクターはまたSpy Cas9タンパク質を発現する）（Cong et al., 2013）。これらsgRNAの機能性を査定するために、我々は、HIV-1 Revタンパク質（Malim et al., 1989）の最初の59アミノ酸をコードするアミノ末端領域とカルボキシ末端gfpインジケーター遺伝子との間で同系HPV-18 E6又はE7由来標的配列をインフレームでクローン化した（図1A）。sgRNAが実際に機能を有する場合、sgRNAは予想されるRev-標的-GFP融合タンパク質の発現を阻害し、前記はGFP蛍光分析又はRev特異的ポリクローナル抗血清を用いるウェスタンブロット分析のどちらかによって決定されるであろう。実際、図1Bに示すように、両E6特異的sgRNAは、RGN発現ベクターをインジケーターベクターと一緒に293T細胞に共同トランスフェクトしたとき、GFP陽性細胞数及び残存GFP陽性細胞の平均蛍光強度の両方を大きく減少させた。同様に、両E7特異的sgRNAはそれらの同系インジケータープラスミドのGFP発現を共同トランスフェクト細胞で劇的に阻害した(図1C)。さらにまた、これら同じ共同トランスフェクト293T細胞でのRev-標的-GFP融合タンパク質のウェスタンブロットによる発現の分析は、ほぼ完全なインジケータータンパク質発現の消失を示した(図1D)。したがって我々は、4つのHPV-18 E6又はE7特異的sgRNAは全て同系標的遺伝子の発現を効果的に沈黙させることができると結論した。
次に、我々は、HeLa細胞ゲノムに組み込まれた内因性HPV-18 E6及びE7遺伝子を不活化できたか否かを問うた。4つのsgRNAは全て同等に機能したように思われたので、その後の実験をE6 sgRNA1及びE7 sgRNA1に集中した。これらのsgRNAが期待したDNA切断を実際に誘発していたことを確認するために、SURVEYORアッセイを用いて、予想されるCas9切断部位にRGN誘発インデルを検出できるか否かを決定した。この目的のために、Spy Cas9及びE6又はE7特異的sgRNAをコードするpx330系ベクター（Cong et al., 2013）をHeLa細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に、HeLaゲノムDNAを単離し、Cas9のためのE6又はE7標的部位を含むHPV-18ゲノムの領域をPCR-増幅した。続いて生成PCRフラグメントの単離、変性及び再アニーリングによりDNA異種二重鎖集団を生成し、前記をSURVEYORヌクレアーゼ（Cas9により変異が導入された部位をいずれも切断すると予想される）を用いて消化した。図2に示すように、HPV-18 E6及びE7遺伝子の両方で予想されたCas9標的部位にインデルの存在が実際に容易に検出された。これらの変異の特徴をさらに詳しく調べるために、HPV-18 E6及びE7遺伝子に由来する同じPCRフラグメントをクローン化し、続いて、5’の3bpからCas9 PAM配列に位置する予想される切断部位全体のDNA配列決定を実施した（Mali et al., 2013）。HPV-18 E6遺伝子の分析は234のDNA配列の読みを提供し、そのうちの19は種々の欠失変異の寄せ集めを有し、一方、34は5’の3bpからSpy Cas9 PAMモチーフにただ1つの同じ“A”残基の挿入変異を含んでいた。分析した残りの181サンプルは野生型E6配列を含んでいた。同様に、HPV-18 E7遺伝子の事例では、232のDNA配列が回収され、そのうちの6つは予想されるSpy Cas9切断部位に隣接する欠失変異を示し、一方、46はやはり5’の3bp部位からPAMモチーフにおける1又は2bpの挿入であり、ただ1つの“T”ヌクレオチド挿入が突出して一般的であった。興味深いことに、ヒト染色体8に由来する配列を導入する大きな挿入変異を含む1つの配列が回収された。したがって、HPV-18 E6及びE7遺伝子の両方について、我々は、予想されるE6又はE7 RGN切断部位に多重変異を回収することができ、それらのほぼ全てがE6又はE7 ORFを破壊することが予想される。
E6及びE7の発現はHeLa細胞の増殖及び生存に必要であることが知られている（Howley, 1990；DeFilippis et al., 2003；Goodwin & DiMaio, 2000）。したがって次に我々は、RGNによるE6及びE7への標的誘導は実際にE6及びE7の機能を不活化するか否かを問うた。上記に記したように、HPV E6タンパク質は、宿主のp53腫瘍抑制因子の発現を抑制するように機能し、したがってE6機能の低下は、p53発現だけでなくp53の下流のエフェクター（サイクリン依存キナーゼ阻害因子p21を含む）の活性化もまたもたらすと期待される（Goodwin & DiMaio, 2000；Mighty & Laimis, 2014；McLaugh-Drubin & Munger 2014；及びSchffner et al., 1990）。図3Aに示すように、我々は実際p53及びp21の両方の発現の特異的誘発をE6 sgRNAを発現する細胞で観察したが、コントロール細胞又はE7 sgRNA発現細胞では認められなかった。
HPV-18 E7タンパク質は、網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質の低リン酸化型と結合しそれによってRb分解を誘発し、さらにRb/E2F複合体（細胞周期の進行を阻止する）の形成を妨げることによって、宿主細胞のRbタンパク質の機能を抑制するように機能する（Mighty and Laimis, 2014; McLaughlin-Drubin and Munger 2014; Howley, 1991; DeFilippis et al., 2003）。図3Bに示すように、我々はRb発現の増加を検出しなかった。しかしながら前記発現はβ-アクチン内部コントロールで標準化したときは相応な量であった（1.4±0.03倍）。しかしながら我々は、E7発現の破壊は細胞周期の停止をもたらすことを観察し、したがって破壊されたE7遺伝子を有する細胞はトランスフェクト培養から選択的に消失することが期待される。実際、我々は、Flagタグ付加Spy Cas9タンパク質の発現は、E6又はE7に特異的なsgRNAを発現する細胞で特異的に低下することを観察した（図3B）。この減少を勘定に入れると、Rb発現の増加はコントロールを超えてさらに実質的な5.54±1.42倍であり、これは統計的に有意である（p＝0.011）。
Spy Cas9及びE6特異的sgRNAを発現するHeLa細胞でのp53の活性化は、オフターゲット効果（例えば無差別的DNA損傷）から生じる非特異的効果であるという議論も起こりうる。しかしながら、NCBIヒトゲノムデータベースのBLAST検索によるヒトゲノムにおけるE6 sgRNA1の潜在的標的部位の分析では、Spy Cas9 PAMの5’-NGG-3’と合わせて13ntのE6 sgRNA1と完全に相補的である標的は全く同定できなかった。我々は、ヒトゲノムのある遺伝子座でE7 sgRNA1に対するただ1つの完全なヒトゲノム標的を確かに同定した。前記は-164032096と称され、転写されるとは考えられていない染色体2に位置する。加えて、我々は、E6 sgRNA1及びE7 sgRNA1の多数の潜在的標的部位を検出した。それらは完全な標的とはただ1つの塩基対で相違し、したがってヒトゲノムにおける潜在的なオフターゲット切断部位でありうる。
オフターゲットゲノムDNA損傷はp53を活性化することが予想され、我々は、E6 sgRNA1によるp53の活性化はもっぱらHPV E6遺伝子の切断から生じることを示すことに特に関心があった。したがって、我々はHPV-18 E6遺伝子の変異型を作製し、前記変異型に、sgRNA切断を阻止すると予想されるが、基本的なE6アミノ酸配列は変更しない変異を導入した（図3C）。図3Dに示すように、E6のこの変種型をコードする発現ベクターの共同トランスフェクションは、E6特異的RGNによるp53発現の活性化を完全に阻止した。このことは、E6 sgRNA1の存在下のp53誘発は、実際にE6発現の選択的消失の結果であることを強く提唱している。
以前の実験で、HeLa細胞及び他のHPVトランスフェクト細胞におけるE6又はE7機能の消失は、老化、細胞周期の停止、及びE6抑制の場合にはアポトーシスももたらすことが示された（Mighty and Laimins, 2014; McLaughlin-Durbin and Munger, 2009; DeFilippis et al., 2003）。E6又はE7に特異的なRGNは予想表現型効果を示すか否かを試験するために、我々は、Spy Cas9及びE6 sgRNA1又はE7 sgRNA1を発現する細胞の培養での増殖をコントロールsgRNAと比較して分析した。図4Aに示すように、コントロール細胞は複製を続けたが、E6又はE7特異的sgRNAを発現するHeLa細胞は時間とともに数が大いに減少した。次に我々は、E6 sgRNA1又はE7 SgRNA発現細胞と比較してコントロール細胞の細胞周期進行を分析した。前記分析は、BrdU（新たに合成されるDNAに取り込まれる）の存在下でそれらの細胞を培養し、続いてヨウ化プロピジウム（PI）で細胞を染色する（細胞当たりの全DNAレベルの測定を可能にする）ことによって実施された。図4Cのフローサイトメトリーで示されるように、コントロール培養は、G1で57%、S期で34%、G2で9.9%の細胞を示した。対照的に、E6 sgRNA1を発現する培養は、G1が77%、S期が17%、G2が6.0%であり、一方、E7 SgRNA1を発現する細胞は、G1が79%、S期が15%、G2が6.6%であった。4つの別々のBrdU/PI標識実験から得られたデータをまとめた図4Bの棒グラフで、E6及びE7特異的sgRNAはG1における細胞周期停止を誘発するが、一方、E6又はE7発現の阻害因子で期待されるように、S期の細胞又はG2に入る細胞の数を強力に減少させることが確認された。
上記に記載したように、子宮頸癌細胞におけるE6又はE7の抑制は、本明細書で図4において再現したように細胞周期停止を誘発するだけでなく、老化及び/又はアポトーシスもまた誘発するように思われる。したがって、E6又はE7に特異的なCas9/sgRNA組合せの発現は初めに細胞増殖を阻害し、続いて細胞死を誘発するであろうと期待される。この予測を検証するために、我々は、Cas9及びコントロール、E6特異的又はE7特異的sgRNAをコードするレンチウイルスベクターを同類のGFPコードレンチウイルベクターとともにHeLa細胞に形質導入するか、又は当該細胞で偽似形質導入を実施した。蛍光活性化細胞選別を用いて、GFP発現レンチウイルス形質導入細胞の89.3%がGFP+であることが観察され、開始MOIが約2.2であることと一致した。続いて、我々は、2日間隔で10日間培養細胞を計測した（図5A）。HPV-18 E6又はE7に特異的なCas9/sgRNA組合せを形質導入された培養は、全ての時点においてコントロール細胞より約10倍少ない細胞を有し、したがって増殖細胞は形質導入されなかった約10%の初期培養に由来すると示唆される。
HPV-18 E6又はE7に特異的なCas9/sgRNA組合せの発現が実際にHeLa細胞死を誘発したのか否かを問うために、我々は、ほぼすべての培養HeLa細胞が形質導入されると思われるより高力価（MOI約37）のレンチウイルスベクターを用いて上記の形質導入実験を繰り返した。培養10日後に、細胞をMTTで染色し、生存細胞のパーセンテージを決定した（図5B）。驚くべきことに、この実験では、コントロールレンチウイルスベクターは、細胞生存率で約2倍の減少をもたらし、前記は明らかにSpy Cas9発現のためではなかった（なぜならばGFP+レンチウイルスベクターで同じ効果が観察されていたからである）。対照的に、Spy Cas9の存在下では、E6及びE7特異的sgRNAは形質導入HeLa細胞のほぼ完全な終焉を誘発した。したがって、HPV E6又はE7の標的誘導破壊は、HPV形質転換細胞の特異的な排除を誘発する潜在能力を有する。
これまで記載した全ての実験はHPV-18形質転換子宮頸癌細胞株HeLaを用いた。これらの研究を伸展させるために、我々はまた、SiHa子宮頸癌細胞株（HPV-16によって形質転換される（Seedorf et al., 1987））を、HPV-18 E6及びE7と配列が異なるHPV-16 E6及びE7に特異的なsgRNAを用いて分析した。したがってこの実験では、我々が言う“非特異的な”sgRNAとしてE6 sgRNA1が用いられた。Spy Cas9タンパク質及びHPV-16 E6特異的sgRNAを用いたSiHa細胞のHPV-16遺伝子への標的誘導は、期待したように、p53エフェクターp21の特異的誘発をもたらした（図6A）（前記はまたE6の標的誘導後にHeLa細胞で観察されたとおりである（図3A））。しかしながら、HPV-18特異的E6 sgRNA1はp21発現を誘発できず、したがって、活性化はE6切断のためであってオフターゲットDNA切断のためではないことがさらに確認された。同様に、SiHa細胞におけるHPV-16 E7遺伝子の標的誘導は、当該細胞のRbタンパク質の発現の適度ではあるが有意な強化をもたらし（図6B）前記はHeLA細胞でも観察された（図3B）。したがって、E6又はE7に標的誘導されるRGNはそれぞれp53又はRb経路を、HPV-18だけでなくHPV-16形質導入子宮頸癌細胞で始動させることができる。
HBV特異的CRISPR/Cas9の開発及び使用
単一ガイドRNAの設計及びレンチウイルスベクターの生成：
HBV DNA標的の各々のために複数のsgRNAを、本質的には上記に記載の二重ルシフェラーゼインジケーターアッセイを用いてスクリーニングした。略記すれば、px330（Cong et al., 2013）をベースにしたSpy Cas9/sgRNA共同発現構築物を、アミノ末端HIV-1 Rev由来エピトープタグ、HBVオープンリーディングフレーム由来中央標的領域及び最後にカルボキシ末端ホタルルシフェラーゼ（FLuc）インジケーター遺伝子からなる融合タンパク質を発現するインジケータープラスミドに対して8：1の割合で293T細胞に共同トランスフェクトした。レニラルシフェラーゼ（RLuc）発現プラスミドもまた内部コントロールとして共同トランスフェクトした。トランスフェクションを、その72時間後にプロメガ（Promega）二重ルシフェラーゼアッセイによって、さらにコードされたRev-標的-FLuc融合タンパク質の発現のついてはウェスタンブロットによって分析し、当該DNA標的の特異的なノックダウンを確認した。当該sgRNAのHBV DNA標的は図7Aに示されている。これらの候補sgRNAはlentiCRISPRレンチウイルス発現ベクター（Shalem et al., 2014）にシャトルされた（前記ベクターは以前に記載したように293T細胞で共同トランスフェクションによって高力価で生成された）。
この実験で用いたsgRNAのためのHBV AYW株の標的は以下のとおりであった：
HBV RT（GTTCAGTTATATGGATGATG；配列番号:1）、HBV表面抗原（Ag）（GCCTGTCCTCCAACTTGTCC；配列番号:2）、HBVコアタンパク質（GTACCGCCTCAGCTCTGTAT：配列番号:3）、及び
非特異的コントロール（N.S.）（GAAATCCTGCAGAAAGACCT；配列番号:68）。U6プロモーターからの効率の良いRNAポリメラーゼIII転写のために要求される最初のGには下線が付され、DNA標的とは相補的ではない。
Spy Cas9/sgRNA切断によって生じる変異導入域を判定するために、固有の制限部位を保有するプライマーを設計して、RT遺伝子内の予想されるCas9切断部位にフランキングするHBV配列とアニールさせた。上記に記載のHBV RT遺伝子に特異的なCas9/sgRNA組合せを形質導入した後、全HBVゲノムDNAをHepAD38細胞から抽出し、PCR増幅し、pcDNA3（Invitrogen）でクローニングし、Sanger配列決定を実施した。続いて回収した配列を野生型HVB AYW株のゲノムに対してアサインメントを実施した。
細胞培養：
ヒト293T細胞をレポーターアッセイで用い、レンチウイルスベクター生成のために、10%ウシ胎児血清（FBS）及び抗生物質を含むダルベッコー修正イーグル培地（DMEM）で培養した。HepAD38細胞株は、培地中にTetが存在しているときも存在していないときもHBVの複製を調節する（King and Ladner, 2000; Ladner et al., 1997）。培地からTetを除去したとき、HBVは複製してこれらの細胞から分泌され、一方、Tet添加はHBV複製を完全に抑制する。HepAD38細胞は以下を補充したDMEM/F12培地（Life Technologies）で培養された：10%熱不活化FBS、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、100μg/mLカナマイシン、400μg/mL G418、及び0.3μg/mL Tet（HBV複製を阻害するため）或いはTetは一切補充されない（HBV複製を誘発するため）。HBV 2.2.15 細胞（Sells et al., 1987）をDMEM（10% FBS、100 IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び2mM L-グルタミンを含む）で培養した。
細胞のレンチウイルス形質導入：
HepAD38又はHBV2.2.15細胞（Tetを欠く培地で48時間増殖後85−90%コンフルエンシー）に、ピューロマイシン耐性遺伝子とともに上記に記載のSpy Cas9及びsgRNAを発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、HBV mRNA及びDNAの発現を確認した。形質導入後48時間して、細胞を4μg/mLのピューロマイシン（Life Technologies）中で10日間選別して、一切の非形質導入細胞を除去した。続いて培養上清及び細胞をELISA及びリアルタイムPCRアッセイのために採集した。非形質導入HepAD38細胞を含むコントロール細胞は、HBV複製のための陽性コントロール（培地にTetを欠く）として、或いは実質的なHBV複製を欠くコントロール（培地にTetを含む）として加えられた。非形質導入HBV 2.2.15細胞は対応する場合にコントロールとして実験に加えられた。
HepAD38細胞におけるHBV DNA及びcccDNAの定量：
HepAD38細胞でのHBV DNAの定量のために、HBV前-S遺伝子領域のためのプライマーセットを刊行されたリアルタイムPCRプロトコル（Pas et al., 2000）にしたがって査定し、前記によって89bpの生成物が得られた。HBV cccDNAの増幅のために、我々は、以前に示されたTaqManプライマー（Chen et al., 2004）を用いて、AB7900HT配列検出系（Applied Biosystems）又はライトサイクラー（Light Cycler）480装置（Roche）でcccDNAを特異的に増幅した。以前に記載された第二のHBV cccDNA特異的プライマーセット（Malmstrom et al., 2012）を用いてきわめて類似するデータがまた得られた（データは本明細書には示されていない）。
cccDNA分析のための核抽出：
トリプシン処理HepAD38細胞を遠心分離によって収集し、PBSで洗浄し、上清液を廃棄した。続いて500μLの低張性緩衝液（10mM HEPES、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.5mM DTT）を細胞ペレットに、酸化ジルコニウムビーズ（ZROB05, Next Advance）とともに加え、細胞質膜をビュレットブレンダ―（Bullet Blender；Next Advance）（速度を“4”に設定し15秒間）を用いて破壊した。続いて遠心分離（2500rpm、5分、4℃）によって核のペレットを収集し、全核DNAを収集キット（DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen））のプロトコルにしたがって抽出した。
HBV-CRISPR及びHepAD38系における抗ウイルス活性：
以下を含む4つの化合物をHepAD38細胞に対して試験した：ラミブジン（3TC）、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（TDF）、エンテカビル（ETV）、及びヌクレオキャプシドアッセンブリー阻害剤ヘテロアリールジヒドロピリミジン（HAP-12）。全ての抗ウイルス剤を我々の研究室で合成した。HepAD38細胞をコラーゲン被覆96ウェルプレートに50,000細胞/ウェルで播種した。試験化合物を0.001から10μMの範囲の最終濃度で細胞に添加した。
HepAD38におけるHBV DNA種のためのリアルタイムPCR：
7日目に市場で入手できるキット（DNeasy Blood & Tissue kit, Qiagen）を用いて、上清から全DNAを精製した。AB 7900HT配列検出系（Applied Biosystems）又はLightCycler 480（Roche）を文献（Stuyver et al. (2002)）の記載にしたがって用い、HBV DNAをリアルタイムPCRで増幅した。全てのサンプルを二組にして試験した。HBV DNAの複製を50%（EC50）又は90%（EC90）阻害する化合物の濃度を線形回帰によって決定した。HBV logウイルス減少もまた決定した。
細胞毒性：
HepAD38細胞生存率が、ミトコンドリアDNA（チトクロームcオキシダーゼサブユニットII（COXII））及び核DNA（リボソームDNA）のためのリアルタイムPCRによって後期時点でチェックされた。並行して、ミトコンドリアDNA（MtDNA）及び核DNA（リボソームDNA（Applied Biosystems））をリアルタイムPCRアッセイで増幅し、標的mtDNAの量を内因性コントロールの量に対して標準化してから未処理コントロールと比較して算出した。細胞毒性の証拠は見当たらなかった。
結果
細胞培養での排除を目指してHBVゲノム（SYWサブタイプ）を標的とするために、我々はまず初めに、HBV表面抗原、コア及び/又はRTをコードする、ウイルスのオープンリーディングフレーム（ORF）を標的とするSpy Cas9に特異的な3つのsgRNAを設計した。HBV構造タンパク質の表面抗原及びコアのために、N-末端標的がフレームシフト変異導入を誘発するように選択された。表面抗原特異的sgRNAはまたRT遺伝子を切断することが予想された（図7A）。RTはまた、表面抗原ORFの末端近くもまた切断すると予想されるsgRNAを用いて、酵素触媒作用に必要な高度に保存された“YMDD”モチーフで標的誘導された。効果的なsgRNA機能を検証するために、Spy Cas9及びsgRNAの発現プラスミドと同系インジケータープラスミドとのヒト293T細胞への共同トランスフェクションに基づく上記記載のインジケーターアッセイを利用した。このアッセイは、ホタルのルシフェラーゼ（FLuc）活性又はHIV-1 Rev-sgRNA標的-FLuc融合タンパク質の定常的発現レベルを追跡監視することによってsgRNA効率を定量的に測定する（高い切断活性は両方の実質的なノックダウンをもたらす）。図7B及び7Cに示すように、3つのsgRNAはいずれも、FLuc発現及びRev融合タンパク質発現の効果的で特異的なノックダウンを誘発した（それぞれ二重ルシフェラーゼアッセイ又はウェスタンブロット分析で測定）。これらの3つのsgRNA構築物を対応するHBV細胞培養で直接試験するために、次に、HepAD38及びHepaRG細胞株を効率的に形質導入することができるレンチウイルスCas9/sgRNA発現ベクター（Shalem et al., 2014）にこれらのsgRNAをシャトルした。
HBV RT、表面抗原及びコア遺伝子に特異的なCas9/sgRNA組合せによるHBV複製の抑え込み：HepAD38細胞株では、組み込まれたHBV線状DNAゲノムの転写開始はTet抑制プロモーターによって厳密に調節される（Ladner et al., 1997）。培養液にTetが存在しないとき、当該系はHBV mRNA及び前ゲノムRNAの転写によってHBV複製を模倣して、激しいHBV複製周期の開始に至り（HBV cccDNAの実質的レベルの合成を含む）、DNA含有ウイルス粒子を培養上清に放出する。結果的に、この細胞株は、HBV DNA標的に特異的なsgRNAを搭載したSpy Cas9によるHBV複製及びcccDNA合成の抑え込みを試験するための優れたモデルである。したがって、我々は、HBV特異的Cas9/sgRNA組み合せをコードするレンチウイルスベクターをHepAD38細胞に形質導入することによって、HBV複製を抑え込むこの系の能力を試験した。HBV転写を培養液からTetを除去することによって形質導入の48時間前に活性化させ、活発なHBV複製周期がCas9/sgRNA発現の前に進行中であることを担保した。その後で、Tetを培養液に再び添加し直して染色体のHBV遺伝子座を抑制し、cccDNAがウイルス転写の主たる供給源であることを担保した。使用したレンチウイルスベクターはまたピューロマイシン耐性遺伝子をコードし（Shalem et al., 2014）、したがって形質導入細胞の選別を可能にする。HBV遺伝子発現の陽性コントロールとして、HepAD38細胞にまた非特異的（N.S.）sgRNA構築物（いずれのHBV配列も標的としない）を形質導入した。HBV発現の最大抑制コントロールとして、Tetの持続的存在下（HepAD38細胞でHBV転写が阻止される（Ladner et al., 1997））でもまたHepAD38細胞を試験した。形質導入及び選別後に、リアルタイムPCRで測定したとき、3つのsgRNAはいずれも、細胞内のHBV DNAレベルを約10倍から約125倍、培養上清では約100倍から約800倍低下させた（図8A）。さらに印象深いことには、RT sgRNAはTet添加と同じ程度にHBV DNA複製を抑え込み、これは本質的にウイルス複製の完全な阻止である。
HBV特異的Cas9/sgRNA組合せによるcccDNA形成の抑制：cccDNA蓄積物を除去する、HBV特異的Cas9/sgRNA組合せの性能を試験するために、以前に記載されたcccDNA特異的プライマー（Chen et al., 2004）を用い培養14日後にリアルタイムPCRによって、cccDNA蓄積物レベルについて形質導入HepAD38細胞をまた分析した。注目すべきことに、HBV RT特異的sgRNAはcccDNA形成を約10倍抑え込み、一方、表面抗原及びコア特異的sgRNAはcccDNAレベルを約4倍抑制する（図8B）。全細胞内HBV DNA蓄積物は、HBV表面抗原及びコア特異的sgRNAによって約8倍減少し、RT特異的sgRNAによって約80倍抑制された（図8B）。感心させられたことには、HBV RT特異的sgRNAはしたがって、HBV cccDNA形成を約90%、さらに全HBV細胞内DNA蓄積物を約90%減少させることができた。
HBV特異的Cas9/sgRNA組合せはHBV表面抗原分泌を減少させる：HepAD38細胞では、HBV表面抗原（HBsAg）及び“e”抗原（HBeAg）の分泌レベルの分析は、HBV複製及び/又はウイルス遺伝子発現を阻害する抗ウイルス剤のスクリーニングのための有用なアッセイである。HBV特異的Cas9/sgRNA組合せがこれらのウイルス抗原の分泌を抑え込むことができるか否かを決定するために、培養12日後に採集した形質導入HepAD38細胞の培養上清を用いてELISAアッセイを実施した。RT、表面抗原及びコア遺伝子を標的とするHBV特異的sgRNAを形質導入したHepAD38細胞の上清で、低レベルの分泌HBsAgが観察されたが、N.S.sgRNAでは認められなかった。実際、表面抗原特異的sgRNAは、ほぼ検出不能レベルまでHBsAg生成を抑え込み（図8C）、おそらく、同系Cas9/sgRNA組合せによる編集に起因するこのウイルス遺伝子の変異導入不活化に一致する。我々はまた、RT特異的sgRNAを形質導入した細胞でHBeAg分泌の統計的に有意な低下を観察し、このことはおそらくこの事例でのcccDNAの全体的な減少を示している（図8D）。対照的に、我々は、コア及び表面sgRNAについてはHBeAgの有意な減少を観察せず、これはおそらくこのタンパク質の分泌及び並外れた安定性に起因している。HBsAg ORFとは対照的に、用いたsgRNAのいずれもこのウイルスORFを変異導入不活化のための直接標的とはしていないということは留意されるべきである。
Cas9/sgRNA組合せによるHBVの変異導入不活化：全HBV DNA及びcccDNA蓄積で観察された枯渇は甚大ではあったが（図8A及び8B）、我々はまた残存ウイルスDNAの変異導入状況に関して興味をもった。なぜならば、染色体標的のCas9切断は通常、小配列の挿入又は欠失（インデル）の導入をもたらすからである（Shalem et al., 2014）。この目的のために、我々は、HBV RT遺伝子の活動部位YMDDモチーフに特異的なsgRNAを形質導入したHepAD38細胞に注目した（図7A）。我々は、RT特異的Cas9/sgRNA組合せ（我々は、前記組み合わせはウイルスDNAレベルを効果的にノックダウンさせることを以前に示した（図8A及び8B））を形質導入したHepAD38細胞から全DNAを採集し、このDNAをHBV RT特異的プライマーでPCR増幅に付し、続いてクローニングし、得られたHBV DNAフラグメントの配列を決定した。73の欠失変異が回収され、前記変異は、5’側3bpから標的のDNA PAM配列の間に存在する予想されるCas9切断部位に又は前記切断部位にすぐ隣接して位置していた。我々はさらにHBVゲノムのこの同じ位置に5つの挿入変異を検出した。103の回収ウイルス配列のうちで、78（76%）が変異していることが見出され、興味深いことに、回収したアンプリコンの大半が致死的変異導入であることが予想された。インフレーム挿入又は欠失ですら極めて有害であろう。なぜならばこれらの残基はHBV RT機能に必要であり、したがって高度に保存されているからである。結論すれば、HBV RT遺伝子に特異的なCas9/sgRNA組合せの発現は、期待されたようにウイルスDNAレベルを劇的に低下させるだけでなく（図8A及び８B）、残存する低レベルのウイルスDNAの大半を変異により不活化させた。
Cas9/sgRNA組合せと併用した抗ウイルス剤によるHBV DNA蓄積阻害の強化：強力なRT阻害剤（TDF、ETV又は3TC）又はウイルスアッセンブリー阻害剤（HAP12）がHBV特異的Cas9/sgRNA発現細胞の残存ウイルス除去を強化し得る可能性を査定するために、我々は、分泌HBV DNAのリアルタイムPCRで測定したときこの系で単に部分的にHBV DNA複製を阻害する濃度でHepAD38細胞を処理した。最初に、我々はCas9及びN.S.sgRNAを発現する細胞でウイルス阻害レベルを査定し、試験した全ての阻害剤が期待した用量応答を示した（図9A）。注目すべきことに、さらに以前に観察されたように（図8A）、HBV RT特異的sgRNAを発現するHepAD38細胞は分泌HBV DNA蓄積の本質的に完全な鎮圧を示し、用いたウイルス複製阻害剤に由来する追加的利益を獲得することはなかった（図9B）。しかしながら、表面抗原及びコア特異的sgRNAの有効性は比較的弱く、抗ウイルス剤の存在下で、HBV DNA分泌の阻害誘発レベルの強化は、図9C及び9Dに示すように軽度ではあるが容易に検出可能であった。これらの結果をさらに確認するために、我々は、構成的HBV発現細胞系、HBV2.2.15細胞（Liu et al., 2004; Sells et al., 1987）を用いた。Cas9/sgRNA発現レンチウイルス構築物の形質導入及び選別後に、我々は、HBV DNAの細胞外レベルは、RT、表面抗原、及びコア特異的Cas9/sgRNA組合せによってそれぞれ約98%、約80%、及び約90%抑え込まれることを観察した（表1）。重要なことに、1μMのTDF、ETV、HAP12又は3TCによるこれらの細胞の処理は明確な少なくとも追加的な効果を示し、前記は、有効性が比較的低い表面抗原及びコア特異的sgRNAについては残存HBV DNA複製のより効率的な除去を2.2.15細胞でもたらした（表1）。RT特異的sgRNAの場合には、繰り返せば、可能な相乗的阻害レベルの検出はこのCas9/sgRNA組み合せの極端に強い有効性によって大きく妨げられた。
表1：HBV2.2.15細胞におけるTDF、ETV、HAP12及び3TCの抗ウイルス活性
非特異的コントロールsgRNAを発現するHBV2.2.15細胞と比較した、培養上清へのHBV DNA放出のパーセント阻害
N.S.：非特異的、RT：逆転写酵素
全ての値は三組として実施した実験の平均±SDを表す。
細胞毒性分析
レンチウイルスsgRNA/Cas9発現ベクターを形質導入したHepAD38細胞について細胞毒性アッセイを実施した。細胞毒性は後期時点でさえも全く観察されなかった。
HSV又はHBVのRGN切断は培養のDNAエピソーム排除をもたらす
Cas9がウイルスエピソームDNAを標的とすることができるか否かを示すために、SPCas9を用いて、図1Aで詳述したレポーターアッセイの文脈中の2つの必須のウイルス遺伝子を標的にした。すなわち1つはHSV-1 ICP0をコードし、他方はHBV逆転写酵素をコードする。非相同性末端結合によって誘導される変異誘導率によって予想されるGFP強度及び頻度の両方で期待される減少とは反対に、我々は多くの培養細胞からエピソームが除去されたと解釈できる二元的な結果を観察した。これは、Rev特異的抗体を用いたウェスタンブロットによってもまた示された（図10）、SV40又はEBV由来ウイルス複製起点をベースにするエピソームの事例であった。このエピソーム除去現象は新規かつ有益であり、HSV-1及びHBV gRNAの両方を組み合わせて、複数のウイルス遺伝子を同時に標的とすることができ、したがって所望の阻害効果を強化できる。
非常に小さなtRNAプロモーターを用いる機能的CRISPR/Cas単一ガイドRNAの発現
CRISPR/Cas9構築物、tRNA及びsgRNAの設計：
ヒトtRNA配列はゲノムtRNAデータベース（http://gtrnadb.ucsc.edu）から入手し、MHV tRNA-7配列は文献（Bogerd et al., Mol. Cell 37, p135-142, 2010）から入手した。tRNA-sgRNA発現構築物を作製するために、オーバーラップするオリゴヌクレオチドを集めてsgRNA足場及びpol III終結シグナルと融合したtRNAを作出した。tRNAとsgRNA足場との間に、2つのBsmBI又はBbsI部位を取り入れて、多様な標的誘導配列の挿入を可能にした。続いてtRNA-sgRNAカセットをCas9発現ベクターpCMVSau（下記でより完全に考察する）、pCMVNme、又はpX330（Addgene, plasmid #42230）でクローニングした（前記ベクターはそれぞれ黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌又は化膿連鎖球菌のCas9を発現する）。pX330の場合には、U6プロモーターをtRNA-sgRNAカセットのために交換した。
下記の表2は結果の節の被験tRNA配列を示す。
表2：tRNA配列
レポーターアッセイ：
293T細胞を用いたレポーターアッセイをリン酸カルシウムトランスフェクション方法により実施した。略記すれば、293T細胞を12ウェルプレートに約1.25ｘ105細胞/ウェルでプレートし、RGN発現プラスミドとFLuc系インジケータープラスミドを4：1の割合で、10ngのRLucプラスミドとともにトランスフェクトした。続いてトランスフェクション後72時間して、トランスフェクトした細胞を受動溶解緩衝液（Passive Lysis Buffer（Promega））中に採集し、FLuc及びRLuc活性の両方についてアッセイした。内部コントロール及び標準化因子としてRLucを供した。
細胞培養：
293T細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS）、2mM抗生抗菌剤（Gibco Cell Culture）及び50μg/mLゲンタマイシン（LifeTechnologies）を補充したダルベッコー修正イーグル培地（DMEM）で37℃にて増殖させた。
ノザンブロットアッセイ：
293T細胞を用いたノザンブロットアッセイをPEIトランスフェクション方法により実施した。293T細胞を10cmディッシュに約5.25ｘ106細胞でプレートし、約20μgのRGN発現プラスミドをトランスフェクトした。続いてトランスフェクション後72時間して、293T細胞をトリゾール（Trizol（Life Technologies））中に採集した。全RNAを単離し、10%TBE-尿素ゲル（Bio-Rad）で分画し、RNAをハイボンド-N（HyBond-N）膜（Amersham）に移し、UV架橋した（Stratalinker, Stratagene）。膜をエクスプレスハイブ（ExpressHyb；Clontech）で予備ハイブリダイズし、続いて32P-末端標識オリゴヌクレオチドとともに37℃でインキュベートした。膜を2ｘSSC/0.1%SDSで37℃にて洗浄し、オートラジオグラフィーでsgRNAを可視化した。
結果
従来のCRISPR/Casベクターは一般的に化膿連鎖球菌（Spy）によってコードされるCas9タンパク質を必要とし、前記は約4.2kb遺伝子によってコードされる。しかしながら、以前に我々自身及び他の者たちが考察したように、Cas9遺伝子及び同系のsgRNAの両方をin vivoで組織にデリバリーするためにはおそらくアデノ随伴ウイルス（AAV）系ベクターの開発が必要となろう。なぜならば、AAVのみが、所望される表現型効果を発揮するために十分な細胞にin vivoで形質導入するために必要な力価で容易に生成されうるからである。AAVベクターは4.7kbのDNAパッケージ限界を有し、そのうちの約290bpは2つの不変AAV逆向き末端反復配列（ITR）に与えられなければならず、ペイロード容量として約4.4kbが残されるだけである。この問題を回避するために、他のグループは最小プロモーターエレメントを用いて約4.2kbのSpy Cas9遺伝子を発現するAAVベクターを作製し、さらに第二のAAVを用いて同系sgRNAを発現させた（Swiech et al, Nature Biotech 33, p102-106, 2015）。このアプローチは、ゲノム編集を誘発するために、これら2つのAAVの各々による共同感染を必要とし、前記は明らかにin vivo環境では最適と言えないであろう。このような理由から、他の細菌種によってコードされる、高度に活性な小さなCas9タンパク質の同定に大きな関心が寄せられた。例えば、髄膜炎菌（Nme）及び黄色ブドウ球菌（Sau）のCas9は両方ともサイズはわずかに約3.2kbである。しかしながら、これでもなお、Cas9発現のために必要なRNAポリメラーゼII（polII）プロモーター及びポリ(A)付加部位の他にCas9の核移入に必要な核局在シグナル（NLS）、sgRNA転写に必要なRNAポリメラーゼIII（polIII）プロモーターのために約1.2kbの間隙が残されているだけである。多くの事例で、2つ以上のsgRNAが所望され、例えば、標的DNA分子の対向鎖上の2つの近接部位のニッキングによってDNA切断を誘発するために、dsRNA分子の一方の鎖のみを切断するCas9変異型（いわゆるCas9ニッカーゼ）を可能にする（Ran et al Cell 154, p1380-1389,2013）。さらにまた、いくつかの事例では、2つ以上のDNA標的を同時に編集して所望の表現型効果を表す必要があるかもしれない。
以前の研究はsgRNA転写を駆動するためにU6 polIIIプロモーターの利用に集中した。U6プロモーターは非常に有効であるが、約254bpと長く（配列番号:51を参照されたい）、2つのU6プロモーターはしたがってAAVベクターの全パッケージ容量の10%以上を必要としよう。したがって、U6よりもはるかに小さく同等に有効なpolIII依存プロモーターを同定することが所望される。我々は、ヒト又はウイルス起源のtRNAプロモーターを用いて、広範囲のDNA標的に特異的なsgRNA及び細菌性Cas9タンパク質を高レベルで発現できることを示した（表2参照）。
以前に、我々は、マウスγ-ヘルペスウイルス68（MHV68）がいくつかの約60nt長の前マイクロRNA（前miRNA）分子をコードすることを示した。前記分子は、まず初めに3’前miRNAヘアピンと融合した5'ウイルスtRNA部分からなる融合転写物として転写される（Bogerd et al, Mol. Cell 37, p135-142, 2010）。これらは続いて細胞酵素のtRNase Zによる切断のために正確に分離される（tRNase Zは常態では細胞のtRNAの正確な3’末端の範囲を定めるために機能する）。我々はまた、ヒトのtRNAは、ヒト又はウイルス起源の前miRNAヘアピンと融合させたとき、前miRNA中間体及び機能的な成熟miRNAの両方を生じ、さらに前記はtRNase Zによるプロセッシングを再び要求して前miRNAからtRNAを遊離させることを示した。したがって、我々は、図11Aに模式的に示すように、前駆体tRNA融合中間体を介して機能的なsgRNAを生成するためにヒトtRNAもまた用いることができるか否かを知りたいと考えた。以前に記載されたtRNA:前miRNA融合転写物と比較したとき、このtRNA:sgRNA融合物は、sgRNAが顕著に大きく（約101nt対約60nt）さらにより複雑な二次構造に折り畳まれるという両方の点で相違する。
最初に、我々は、上記に記載のヒトパピローマウイルス血清型18（HPV-18）E6又はE7遺伝子（それぞれ配列番号:8及び10）のどちらかに由来する標的DNA配列に特異的なSpy Cas9 sgRNAに連結された、ヒトグルタミンtRNA（配列番号:41）、ヒトヒスチジンtRNA（配列番号:44）又はMHV68 tRNA（M1-7；配列番号:50）からなる予想される融合転写物を作製した。FLuc遺伝子に連結し上記のように構築した、これらのウイルス標的配列からなるインジケータープラスミドを、Spy Cas9をコードするプラスミド、tRNAプロモーター又はU6プロモーターの各々をコードするプラスミド（同じsgRNAに連結されてある）、及び最後にRLuc系内部コントロールプラスミドと一緒に293T細胞に続いて共同トランスフェクトした。トランスフェクション後72時間して細胞を採集し、FLuc及びRLucレベルを決定した。図11Bに示すように、我々は、E6及びE7系インジケーター構築物の両方の効果的かつ同等なノックダウンを、U6プロモーター系sgRNA発現ベクターだけでなく、tRNAGLN及びtRNAMHV1-7をベースにするベクターでも観察したが、一方、tRNAHISベクターはわずかに効果が低いように見えた。
次に我々は、Spy sgRNA足場に特異的なプローブを用いて、トランスフェクト293T細胞でE7特異的sgRNAの発現レベルを分析した。図11Cに示すように、我々は、U6、tRNAGLN及びtRNAMHV1-7系ベクターによって生成された成熟E7特異的sgRNAのレベルが高くかつ同等であることを観察したが、tRNAHISベクターでははるかに低かった。我々は、tRNA系ベクターをトランスフェクトされたいずれの培養でも検出可能レベルの予想される約170ntのtRNA:sgRNA融合転写物を認めなかった。
異なるsgRNA足場を有する別個のCas9タンパク質にこれらの実験を広げるために、次に我々は、U6又はtRNAプロモーターを用いて転写されるNme Cas9 sgRNAの発現及び機能を分析した。Nme sgRNA足場（配列番号:37）はSpy sgRNA足場（配列番号:36）と配列が完全に異なり、さらにサイズがいくらか大きい（Hou et al, PNAS 110, p15644-15649, 2013）。我々はまた2つの異なるDNA標的に対してCas9活性を分析した。前記DNA標的の各々は、細菌由来の天然のプロトスペーサー配列でプロトスペーサー9（P9、配列番号:28）又はP25（配列番号:29）と呼ばれるものから成っている。ここで用いられるNme Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）は、以前に報告された5-NNNGATT-3’であった（Hou et al., 2013）。
図12Aに示すように、我々はまた、共同トランスフェクト細胞で、同系FLuc系インジケータープラスミドの特異的なノックダウンを観察したが、ただしこれはSpy Cas9で観察されたもの（図11B）より少なかった。Nme sgRNA足場に特異的なプローブを用いたsgRNAのノザン分析は、U6、tRNAGLN及びｔRNAMHV1-7系ベクターをトランスフェクトした細胞で非常に類似するレベルのP25特異的sgRNAを示したが、同じくtRNAHISプロモーターではそのレベルははるかに低かった（図12B）。
これらの実験を広げて種々のsgRNA可変領域がtRNA:sgRNA融合転写物のtRNase Z媒介プロセッシングに干渉しうるか否かを試験するために、次に我々は、25nt（配列番号:29）、P9（配列番号:28）、G6P（配列番号:65）又は24nt（ICP4（配列番号:63））、GFP（配列番号:64）可変領域を保持する広範囲のNme sgRNAの発現を、U6又はtRNAGLNプロモーターのどちらかを用いて分析した。図からわかるように（図12C）、我々は、一般的に非常に類似するsgRNA発現レベルを全ての事例で認めた。ICP4特異的tRNAGLN:sgRNAベクターの事例では、我々はまた、最初のtRNA:sgRNA融合転写物の予想サイズの約200ntに泳動する微量のより大きな転写物を認めた（図12C、レーン6）。
Sau Cas9遺伝子はNme Cas9遺伝子の小さな約3.2kbサイズを共有し、Sau Cas9は、同系PAM配列5’-NNGRRT-3’（“R”はプリン残基を示す）を含むDNA標的とともに提示されるとき非常に活性が高い。したがって、SauはAAVベクターで潜在的な有用性を有する有望なCas9遺伝子をコードする。tRNAプロモーターを用いて活性なSau sgRNAを生成できるか否かを分析するために、我々は、広範囲のヒトtRNAを用いて、HSV-1 ICP0遺伝子（配列番号:16）内標的に特異的な、同一Sau sgRNAを発現させた。インジケーターアッセイによって、ヒトtRNAGLN1、tRNAGLN2、tRNAGLY、tRNAGLU又はtRNAPROプロモーターを用いてsgRNA発現を駆動させたとき強力なノックダウンが観察され、さらにtRNAASN又はtRNACYSを用いたときは容易に検出できるノックダウンが観察されたが、tRNATYRプロモーターを用いたときは検出可能なノックダウンはほとんど又は全く観察されなかった（図13A）。Sau sgRNA足場に特異的なプローブを用いたとき、ノザン分析は、tRNAGLN1、tRNAGLN2、tRNAGLY、tRNAGLU、及び特にtRNAPROプロモーターにより成熟sgRNAの高レベル発現を示した。成熟sgRNAの発現は、tRNAGLY、tRNACYS及びtRNAASNプロモーターではそこそこであったが、tRNATYRプロモーターは検出可能なシグナルを生じなかった。興味深いことに、かつSpy及びNme sgRNAベクターで観察されたこととはきわめて対照的に、我々は、実質的レベルのプロセッシングされていない約170ntのtRNA sgRNAの前駆体融合転写物を全ての事例で観察した。これらのtRNA:sgRNA融合物の全てで認められたより低いプロセッシング効率の理由は今のところ不明であるが、この実験で用いた単一不変sgRNA配列に関係があるかもしれない。
より短いNme Cas9又はSau Cas9と一緒に、sgRNAのプロモーターとしてtRNAを使用することは、以下でより詳細に説明するように、一AAVベクターの限界範囲内でコードされる2つのsgRNA及びCas9遺伝子の添加を可能にするであろう。
Sau Cs9及びAAVベクター構築物の開発
我々の最初の概念実証実験はCas9及びsgRNAを細胞に送り届けるレンチウイルスベクターを必要としたが、AAVは遺伝子治療への応用に周知かつ適切なベクターである。上記で述べたように、AAVベクターは約4.4kbの遺伝子の積荷を許容するだけであり、したがって単一AAVベクターの使用を可能にするために、我々はより小さなCas9だけでなくsgRNAの発現を駆動するために短いtRNAプロモーターを必要とした。我々は、Sau Cas9の発現のためにコドン最適化ポリヌクレオチド（配列番号:55）を開発し、この系を試験するためにいくつかのウイルスへ向けられるsgRNAを設計した。設計及び試験したsgRNAは以下を含む:HBV RT、表面抗原（SA）及びコア（配列番号:4−7）；HSV-1 ICP0及びICP4（配列番号:16−19）；EBV FR、DS、EBNA-1、Clp及びLMP-1（配列番号:20−27）；並びにHPV E6及びE7（配列番号:14−15）。図14A−Dは、HBV、HSV-1、EBV及びHPV由来のウイルス配列のためのインジケーターベクターを用いて得られた、より広範囲のSau sgRNAの機能的データを示している。図14Eは、上記でより詳細に述べたHeLa細胞におけるHPVについての機能的データを示し、p53及びp21発現がsgRNAの内因性HPV-18 E6遺伝子切断を示す細胞で回復されることを示している。
Sau Cas9発現は我々の最初の構築物では最適ではなかったので、非翻訳領域（UTR）の5’イントロン付加がSau Cas9の発現に影響するか否かを試験した。図15に示すように、ラットのプレプロインスリンIIイントロン（配列番号:53に提示）の付加はSau Cas9発現を大いに強化した。イントロン無しと比較してイントロン有りで発現は約20倍増加した。
全ての配列を図16に示す“モデル”AAVベクターに導入した。前記は以下を含む：tRNA Gln PolIIIプロモーター（配列番号:41）、2つのBsmB1制限酵素部位を有する第一のsgRNA配列（前記制限酵素部位はイタリック体で示される可変領域の挿入に用いられる）、及び通常の大文字で示される不変Sau sgRNA足場（GGAGACGGACGTCTCCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT；配列番号:39）。U6 PolIIIプロモーターが含まれる（配列番号:51）。第二のSau sgRNA配列が含まれ、イタリック体で示される可変領域の挿入のために用いられる2つのBbsI制限酵素部位を有し、その後に通常の大文字で示されるSau sgRNA足場が続く（GGGTCTTCGAGAAGACCCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT；配列番号:40）。EFS PolIIプロモーターを用いてCas9発現を駆動した（配列番号:52）。5’非翻訳領域及びラットプレプロインスリンIIゲノム遺伝子由来イントロンで、イントロンには下線が付され、さらにイタリック体である（配列番号:53）。核局在シグナル（NLS）及びFLAGエピトープタグ（配列番号:54）がSau Cas9のアミノ末端に挿入される（小文字で示されている）。また別のNLS配列が配列番号:59−62として提供される。用いられたSau Cas9合成遺伝子配列は配列番号:55として示されている。最後に合成ポリ(A)付加部位は配列番号:56として示されている。NLS-FLAG-Sau Cas9タンパク質配列は配列番号:57として提供され、1つのAAVベクター挿入物は配列番号:58として提供される。
Sau Cas9の使用をさらに最適化するために、我々は、Sau Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を同定することを必要とした。我々は、広範囲の可能なPAM配列（-GRRT、-GRRX、-GXRT及び-GRXTを含む）を含むルシフェラーゼインジケーター構築物を構築した。結果は図17に示されている。この分析によって、Sau Cas9のためにもっとも活性が高いPAMとして5’-NNGRRT-3’（Nは任意のヌクレオチドでありRはG又はAである）が同定された。
CRISPR/Cas9ベクターによるHIV-1への標的誘導
CRISPR/Cas9系によるHIV-1ウイルスDNA中間体への標的誘導が可能か否かを決定するために、我々は、HIV-1 Tat特異的sgRNA（配列番号:33−35）及びTAR特異的sgRNA（配列番号:30−32）を設計した（前記領域はこのウイルスで高度に保存されている）。Spy Cas9及びHIV-1 tat遺伝子若しくはTARエレメントの保存領域に特異的なsgRNA、又は非特異的sgRNAをコードするプラスミドとともにHIV-1受容体CD4及びCXCR4をコードするプラスミドを293T細胞にトランスフェクトした。72時間後にトランスフェクト細胞に、ウイルスnef遺伝子の代わりにFLuc遺伝子をコードするHIV-1 NL4-3株ストックを感染させた。感染24時間後に細胞を採集し、FLuc活性についてアッセイした。結果は図18A（Tat）及び図18B（TAR）に示されている。Cas9及びHIV-1特異的sgRNAが発現されたとき感染は本質的に完全に阻止され、HIV-1はCRISPR/Cas9系の良好な標的であることが示された。
参考文献



Claims (65)

  1. 第一の単一ガイドRNAをコードする第一のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第一のプロモーター及びCas9ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第二のプロモーターを含む構築物であって、該第一の単一ガイドRNAがDNAウイルスの標的配列の鎖と相補的な第一の部分及び該Cas9ポリペプチドと相互作用することができる第二の部分を含む、前記構築物。
  2. DNAウイルスが、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科及びレトロウイルス科からなる群から選択される科に分類される、請求項１に記載の構築物。
  3. ヘルペスウイルス科が、単純疱疹ウイルス1型（HSV-1）、単純疱疹イルス2型（HSV-2）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）からなる群から選択される、請求項２に記載の構築物。
  4. ヘルペスウイルス科がHSV-1及びHSV-2からなる群から選択される、請求項３に記載の構築物。
  5. 標的配列が、ICP0、ICP4、及びウイルス潜伏期関連転写物又は隣接プロモーター配列から選択される、請求項３に記載の構築物。
  6. 単一ガイドRNAの第一の部分が配列番号:16−19及び63から選択される、請求項５に記載の構築物。
  7. ヘルペスウイルス科がEBVである、請求項３に記載の構築物。
  8. 標的配列が、FR（反復配列ファミリー）、DR（ダイレクトシンメトリー）、EBV核内抗原（EBNA1）、Qpプロモーター、及び潜在膜タンパク質-1（LMP-1）遺伝子からなる群から選択される、請求項７に記載の構築物。
  9. 単一ガイドRNAの第一の部分が配列番号:20−27から選択される、請求項８に記載の構築物。
  10. ヘパドナウイルス科がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項２に記載の構築物。
  11. 標的配列が逆転写酵素、表面抗原又はコアをコードする遺伝子から選択される、請求項１０に記載の構築物。
  12. 単一ガイドRNAの第一の部分が配列番号:1−7から選択される、請求項１１に記載の構築物。
  13. パピローマウイルス科がヒトパピローマウイルス（HPV）である、請求項２に記載の構築物。
  14. HPVがHPV-16又はHPV-18である、請求項１３に記載の構築物。
  15. 標的配列がE6遺伝子及びE7遺伝子から選択される、請求項１３に記載の構築物。
  16. 単一ガイドRNAの第一の部分が配列番号:8−15から選択される、請求項１５に記載の構築物。
  17. レトロウイルス科がヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）である、請求項２に記載の構築物。
  18. 標的配列がTat及びTARから選択される、請求項１７に記載の構築物。
  19. 単一ガイドRNAの第一の部分が配列番号:30−35から選択される、請求項１８に記載の構築物。
  20. 第一のプロモーターが、U6プロモーター、Gln tRNA、Pro tRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、Cys tRNA、Glu tRNA、マウスガンマヘルペスウイルス-68（MHV68）tRNA又は任意の哺乳動物のtRNAからなる群から選択される、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項１−１９のいずれか１項に記載の構築物。
  21. プロモーターが配列番号:41−50を含む、請求項２０に記載の構築物。
  22. Cas9ポリペプチドが、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のCas9ポリペプチド、又はそのニッカーゼCas9誘導体から選択される、請求項１−２１のいずれか１項に記載の構築物。
  23. 配列番号:57を有する黄色ブドウ球菌Cas9（Sau Cas9）ポリペプチドが選択される、請求項２２に記載の構築物。
  24. Sau Cas9ポリペプチドが配列番号:55を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２３に記載の構築物。
  25. さらに核局在シグナルを含む、請求項２３又は２４に記載の構築物。
  26. さらにイントロンを含む、請求項２４又は２５に記載の構築物。
  27. さらにポリ(A)付加部位を含む、請求項２４−２６のいずれか１項に記載の構築物。
  28. 第二のプロモーターが、EFS、hCMV又はmCMV最初期、CBA、hシナプシン、HSV TK、SV40初期及びLSPからなる群から選択される、RNAポリメラーゼII依存プロモーター/エンハンサーである、請求項１−２７のいずれか１項に記載の構築物。
  29. さらに第一の逆向き反復配列及び第二の逆向き反復配列を含み、逆向き末端反復配列がアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターでパッケージングのための構築物とフランキングする、請求項１−２８のいずれか１項に記載の構築物。
  30. 構築物が発現ベクターである、請求項１−２９のいずれか１項に記載の構築物。
  31. さらに、第二の単一ガイドRNAをコードする第三のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第三のプロモーターを含み、前記第二の単一ガイドRNAはDNAウイルスの第二の標的配列の鎖と相補的な第一の部分を含み、ここで該第三のプロモーターはRNAポリメラーゼIII依存プロモーターである、請求項１−３０のいずれか１項に記載の構築物。
  32. 第一の標的配列及び第二の標的配列がDNAウイルスの対向鎖上で互に30塩基対以内に位置する、請求項３１に記載の構築物。
  33. 請求項１−３２のいずれか１項に記載の構築物を含む組換えベクター。
  34. ベクターがウイルスベクターである、請求項３３に記載の組換えベクター。
  35. ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項３４に記載の組換えベクター。
  36. ベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）である、請求項３５に記載の組換えベクター。
  37. 請求項３３−３６のいずれか１項に記載の組換えベクター及び医薬担体を含む医薬組成物。
  38. DNAウイルスに感染した細胞でウイルスの複製又は標的配列の発現を阻害する方法であって、当該細胞を、請求項３３−３６のいずれか１項に記載の組換えベクター又は請求項１−３２のいずれか１項に記載の構築物に、前記組換えベクターの当該細胞へのデリバリー並びに前記単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドの生成を可能にするために有効な量で接触させる工程を含む、前記方法。
  39. 単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドが標的配列を切断する、請求項３８に記載の方法。
  40. 2つ以上の単一ガイドRNAが組換えベクター又は構築物に存在し、2つ以上の標的配列が切断される、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. 標的配列によってコードされる遺伝子生成物の発現が、組換えベクター又は構築物との接触並びに単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドの生成の後で低下する、請求項３８−４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 標的配列が組換えベクター又は構築物との接触後に改変される、請求項３８−４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 単一ガイドRNA及びCas9ポリペプチドが標的配列で欠失又は挿入を引き起こす、請求項４２に記載の方法。
  44. DNAウイルスが、組換えベクター又は構築物との接触後に当該細胞内で複製することができない、請求項３８−４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. DNAウイルスが組換えベクター又は構築物との接触後に当該細胞から排除される、請求項３８−４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 接触がin vitroで生じる、請求項３８−４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 接触が、組換えベクターを当該細胞に接触するために有効な量で対象動物に投与することによってin vivoで生じる、請求項３８−４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. ウイルス感染を対象動物で治療する方法であって、請求項３３−３６のいずれか１項に記載の組換えベクター又は請求項３７に記載の医薬組成物の有効量を、ウイルス感染を治療するべき対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
  49. 投与が、DNAウイルスのゲノム負荷又はウイルスエピソーム数を対象動物で減少させる、請求項４８に記載の方法。
  50. 投与がDNAウイルスの複製を対象動物で減少させる、請求項４８に記載の方法。
  51. 投与が、標的配列によってコードされる遺伝子生成物の発現を対象動物で減少させる、請求項４８に記載の方法。
  52. 配列番号:57の組換えSau Cas9ポリペプチド。
  53. 組換えSau Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号:55を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換えSau Cas9構築物。
  54. さらにポリ(A)付加部位及び核局在シグナルを含む、請求項５３に記載の組換えSau Cas9構築物。
  55. さらにイントロンを含む、請求項５３又は５４に記載の組換えSau Cas9構築物。
  56. プロモーターが、EFS、hCMV、mCMV、CBA、hシナプシン、HSV TK、SV40初期プロモーター及びLSPからなる群から選択される、RNAポリメラーゼII依存プロモーター/エンハンサーである、請求項５３−５５のいずれか１項に記載の組換えSau Cas9構築物。
  57. 配列番号:58を有する、請求項５３−５６のいずれか１項に記載の組換えSau Cas9構築物。
  58. 単一ガイドRNAの発現のための組換え構築物であって、前記構築物が哺乳動物又はウイルスのtRNAをコードする第一のポリヌクレオチドを含み、前記第一のポリヌクレオチドは、Cas9ポリペプチドと相互作用することができる単一ガイドRNAの少なくとも1つの第二の部分をコードする第二のポリヌクレオチドに作動可能に連結されてある、前記構築物。
  59. 第一のポリヌクレオチドが配列番号:41−50から選択される、請求項５８に記載の構築物。
  60. 第二のポリヌクレオチドがさらに、標的配列の5'に相補的な単一ガイドRNAの第一の部分からCas9ポリペプチドと相互作用することができる第二の部分までをコードする、請求項５８又は５９に記載の構築物。
  61. 第二のポリヌクレオチドがさらに、制限エンドヌクレアーゼのための1つ以上の認識部位を有する単一ガイドRNAの第一の部分をコードする、請求項５８−６０のいずれか１項に記載の構築物。
  62. Cas9ポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項５８−６１のいずれか１項に記載の構築物。
  63. 請求項５３−５７のいずれか１項に記載の組換えSau Cas9構築物を含むキット。
  64. 請求項５８−６２のいずれか１項に記載の組換え構築物を含むキット。
  65. 請求項５３−５７のいずれか１項に記載の組換えSau Cas9構築物をさらに含む、請求項６４に記載のキット。
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Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012048113A2 (en) 2010-10-07 2012-04-12 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
WO2014113493A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
WO2015183667A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 The Regents Of The University Of California HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE
KR20170005494A (ko) * 2014-05-30 2017-01-13 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 잠복 바이러스 감염에 대한 치료제를 전달하는 조성물 및 방법
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
WO2016196282A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
WO2016197132A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
US10676735B2 (en) 2015-07-22 2020-06-09 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
EP4345454A2 (en) 2015-08-25 2024-04-03 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US20170087224A1 (en) * 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Delivery methods and compositions
JP2018534258A (ja) * 2015-09-29 2018-11-22 アジェノビア コーポレーション 潜伏ウイルスの転写制御のための組成物および方法
WO2017058791A1 (en) * 2015-09-29 2017-04-06 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CA3001711A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
EP3390631B1 (en) * 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2018106268A1 (en) * 2016-01-25 2018-06-14 Excision Biotherapeutics Rna guided eradication of human jc virus and other polyomaviruses
WO2017180915A2 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
RU2018144745A (ru) * 2016-06-01 2020-07-09 Эксижн Биотерапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения, направленные на литические и лизогенные вирусы
CA3026332A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of hiv-1 by gene editing strategy
US11351273B2 (en) 2016-06-21 2022-06-07 Board Of Supervisors Of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College Method for delivering RNA to neurons to treat herpes infections
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018081504A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
EP4151729A1 (en) * 2016-11-11 2023-03-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for processing nucleic acid samples
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11674138B2 (en) 2017-03-13 2023-06-13 President And Fellows Of Harvard College Methods of modulating expression of target nucleic acid sequences in a cell
WO2018175502A2 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Shuber Anthony P Treating cancer with cas endonuclease complexes
EP3601562A1 (en) 2017-03-23 2020-02-05 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
WO2018183808A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Agenovir Corporation Antiviral therapeutic
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018237369A2 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Vical Incorporated LIPID NANOPARTICLE MEDIA ADMINISTRATION OF PLASMIDIC DNA EXPRESSING CRISPR FOR THE TREATMENT OF CHRONIC INFECTION WITH HEPATITIS B VIRUS
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
JP7207665B2 (ja) 2017-08-04 2023-01-18 北京大学 メチル化により修飾されたｄｎａ塩基を特異的に認識するｔａｌｅ ｒｖｄおよびその使用
CN111278983A (zh) 2017-08-08 2020-06-12 北京大学 基因敲除方法
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN109468319A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 中山大学 用于抑制HSV-1复制和/或靶标序列表达的CRISPR/Cas9系统、方法、试剂盒及其应用
CN109468318A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 中山大学 用于抑制HSV-1复制和/或靶标序列表达的CRISPR/Cas9系统、方法、试剂盒及其应用
CN107557394A (zh) * 2017-09-29 2018-01-09 南京鼓楼医院 降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
JP2021500029A (ja) 2017-10-20 2021-01-07 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル Ｎｔ−３遺伝子治療のための方法及び材料
WO2019152868A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus (hsv) related keratitis
WO2019184655A1 (zh) * 2018-03-27 2019-10-03 苏州克睿基因生物科技有限公司 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用
CN112088215A (zh) * 2018-05-09 2020-12-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 Crispr瞬时表达构建体(ctec)
CN111349654B (zh) * 2018-12-20 2023-01-24 北京大学 使用加标签的向导rna构建体进行高效基因筛选的组合物和方法
WO2020125762A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 Peking University Compositions and methods for highly efficient genetic screening using barcoded guide rna constructs
US20220110963A1 (en) * 2019-01-02 2022-04-14 The General Hospital Corporation Reverse transcriptase blocking agents and methods of using the same
WO2020160412A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions targeting virus genomes
WO2020191246A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
KR20200123392A (ko) * 2019-04-18 2020-10-29 주식회사 툴젠 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물 및 이의 방법
CN111139240B (zh) * 2020-01-20 2022-03-15 武汉大学 一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用
EP4114952A4 (en) * 2020-03-05 2024-05-08 Univ Nebraska CRISPR/CAS9 SYSTEM FOR THE TREATMENT OF MULTI-STRAIN HIV-1
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2024119102A1 (en) * 2022-12-01 2024-06-06 Locanabio, Inc. Adeno-associated viral vectors for proper packaging of repetitive elements

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093635A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
JP2016534125A (ja) * 2013-08-29 2016-11-04 テンプル ユニヴァーシティ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション Ｈｉｖ感染のｒｎａガイド処置のための方法および組成物
JP2017527256A (ja) * 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7090976B2 (en) * 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US20080318210A1 (en) * 2003-08-27 2008-12-25 Rosetta Genomics Bioinformatically detectable group of novel regulatory viral and viral associated oligonucleotides and uses thereof
WO2005116224A2 (en) * 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7795419B2 (en) * 2004-05-26 2010-09-14 Rosetta Genomics Ltd. Viral and viral associated miRNAs and uses thereof
US20090029461A1 (en) * 2005-02-23 2009-01-29 Agency For Science Technology And Research Immortalised Feeder Cells
US20080193563A1 (en) * 2006-08-01 2008-08-14 Rush University Medical Center Harnessing wnt signaling to restrict hiv replication
WO2009006584A2 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of Colorado Methods and compositions for identifying cellular rna transcripts
US8815779B2 (en) 2009-09-16 2014-08-26 SwitchGear Genomics, Inc. Transcription biomarkers of biological responses and methods
US9676810B2 (en) * 2010-07-08 2017-06-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Neuroprotective molecules and methods of treating neurological disorders and inducing stress granules
EP2694685B1 (en) * 2011-04-08 2019-01-09 Azzazy, Hassan, Mohamed, Ei-said Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
PE20190843A1 (es) 2012-05-25 2019-06-17 Emmanuelle Charpentier Arn de direccion a adn generico
CN110066775B (zh) 2012-10-23 2024-03-19 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的组合物及其用途
EP3363902B1 (en) 2012-12-06 2019-11-27 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
PT2931898E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequências com domínios funcionais
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
PL2784162T3 (pl) 2012-12-12 2016-01-29 Broad Inst Inc Opracowanie systemów, metod oraz zoptymalizowanych kompozycji przewodnikowych do manipulacji sekwencyjnej
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
CN103233028B (zh) * 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
CN105247049B (zh) * 2013-03-15 2019-09-13 米迪缪尼有限公司 新型核酸分子
WO2016061481A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093635A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
JP2016534125A (ja) * 2013-08-29 2016-11-04 テンプル ユニヴァーシティ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション Ｈｉｖ感染のｒｎａガイド処置のための方法および組成物
JP2017527256A (ja) * 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. NEUROVIROL., vol. Vol. 19, Suppl. 1, JPN6019010247, 2013, pages 38, ISSN: 0004141354 *
MOLECULAR CELL, vol. 37, JPN6019010248, 2010, pages 135 - 142, ISSN: 0004141355 *
PNAS, vol. 110, no. 4, JPN6019010250, 22 January 2013 (2013-01-22), pages 1404 - 1409, ISSN: 0004141357 *
RNA, vol. 16, JPN6019010249, 2010, pages 673 - 695, ISSN: 0004141356 *
SCI. REP. (AUG-2013) VOL.3, 2510, JPN6019005004, ISSN: 0004141351 *
SCIENCE (FEB-2013) VOL.339, NO.6121, P.819-823, JPN6019005014, ISSN: 0004141352 *
SCIENCE, vol. 343, JPN6019010246, 3 January 2014 (2014-01-03), pages 84 - 87, ISSN: 0004141353 *

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