CN111139240B

CN111139240B - 一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用

Info

Publication number: CN111139240B
Application number: CN202010066656.9A
Authority: CN
Inventors: 陈宇; 严鲲; 冯姜澎; 刘杏
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111139240A

Abstract

本发明公开了一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用。根据CRISPR的gRNA的设计原则及不同基因型HBV序列的保守性区域，筛选3条gRNA并构建在PX601表达载体上，同时选择不同肝脏特异性启动子与HBV病毒基因组的增强子进行组合，筛选出2个启动子组合对表达载体PX601进行改造。在细胞模型和小鼠模型中利用上述gRNA指导的CRISPR改造系统，可以在显著提升SaCas9的肝组织表达特异性的同时，有效的抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制。该系统易于操作、安全性高、对HBV复制的抑制效率高。该改造的CRISPR/SaCas9系统有望成为治疗乙型肝炎病毒新型治疗药物。

Description

一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用

技术领域

本发明属于基因突变和基因工程技术领域，具体涉及对能够被腺相关病毒(AAV)载体递送的CRISPR/SaCas9核酸酶系统的改造，选取高效且更具安全性的肝脏特异性表达SaCas9核酸酶的启动子组合，并针对多种基因型和亚型的乙型肝炎病毒保守序列，设计、构建、筛选最优的指导RNA及其靶位点序列。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种能引起患者慢性感染，增加肝硬化和肝癌风险的病毒。据统计，全球大约有2.91亿人口感染乙型肝炎病毒，每年约有100万人因为乙型肝炎及其引发的肝硬化和肝癌失去生命。因此，病毒性乙型肝炎是威胁全球健康的一个重要问题。核苷(酸)类似物(NUCs)和干扰素(IFN)是目前治疗HBV仅有的两类药物，然而这两类药物均无法清除稳定存在于细胞核中且能够作为模板产生子代病毒的闭合共价环状DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)，此外，HBV耐药相关突变(RAM)和疫苗逃逸突变(VEM)也降低了现有治疗和预防策略的成功率。因此，人们在努力开发直接靶向cccDNA，将之失活或清除以实现治愈慢性乙肝的治疗手段。

CRISPR-Cas系统是在原核生物中发现的一种获得性免疫系统,根据行使功能的蛋白组成作用方式不同分为两类，六种型。其中Ⅱ类系统的Type Ⅱ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPR RNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif)附近特异性剪切DNA双链，形成DSB(double strandbreak)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-HomologousEnd Joining NHEJ)DNA修复方式，另一种是同源重组修复(Homology Directed RepairHDR)方式。

特异性靶向HBV基因组保守区域的CRISPR/Cas9基因编辑系统，不仅能够有效抑制病毒复制，相比其他基因编辑工具，设计也更加简单灵活，成为了一个十分具有吸引力的治疗选择。目前已经有大量的研究证明了CRISPR/Cas9系统可以有效抑制HBV的复制^[1-6],但真正将其投入到治疗应用之前,还需要解决几个重要的问题：首先是如何高效安全的递送CRISPR/Cas9系统；其次是关于CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，CRISPR/Cas9在识别并切割靶位点的同时，也可能对与靶位点相似的DNA序列同样进行切割。

病毒载体在基因和细胞治疗中具有巨大的应用潜力，鉴于腺相关病毒(AAV)在多种动物模型和人类临床试验中均具有良好的安全性和治疗功效，AAV病毒载体被认为是适用于基因治疗的最有效的方法之一。虽然AAV能够实现将CRISPR/Cas9系统有效安全的递送，但是其包装载量有限(<4.2kb)，给常用的CRISPR/Cas9基因编辑系统的结合使用带来了挑战。因此一种具有更小包装载量要求的来源于金黄色葡萄球菌的Cas9同源物(SaCas9，3.16kb)可以解决这个问题。之前发表的基于AAV传递的CRISPR-SaCas9系统抗HBV复制的研究^[7,8]均存在局限性：首先，在上述两个研究中对病毒指标的检测有限，仅以部分病毒抗原为主，Yu Liu等人对于病毒核酸的检测也只以实时定量PCR(real-time PCR)作为单一的手段；其次，AAV不同的血清型具有不同的组织嗜性，虽然上述研究均选用AAV8血清型作为载体具有较好的肝脏组织特异性递送，但未对减小脱靶效应的可能做进一步的改进。

因此，开发出具有更好肝特异性表达SaCas9核酸酶的启动子组合，设计一些高效、安全、靶向乙型肝炎病毒保守序列、且突变率较低区域的gRNA，对于CRISPR/Cas9系统安全高效的发挥作用极为重要，并具有更进一步的重要应用价值。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明首先提供肝脏特异性启动子组合用于CRISPR/SaCas9系统的改进。同时也提供经筛选的靶向不同基因型和亚型HBV突变率较低的区域的高效的gRNA及其靶位点序列，从而实现有效特异地清除HBV。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种基于肝脏特异性启动子与HBV病毒增强子的SaCas9肝脏特异性启动子组合，所述启动子组合为Enh2-PPck或Enh2-Pa1AT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

第二方面，提供一种基于CRISPR/SaCas9系统能够特异性抑制HBV复制的gRNA分子，所述gRNA分子的靶点序列如SEQ ID NO：3-5任一项所示。

第三方面，提供一种含有上述SaCas9肝脏特异性启动子组合和上述gRNA分子的CRISPR/SaCas9系统，所述CRISPR/SaCas9系统以PX601(Addgene ID:61591)为表达载体，用上述SaCas9肝脏特异性启动子组合对表达载体的CMV启动子进行替换得到替换了启动子的PX601表达载体，将上述gRNA分子与替换了启动子的PX601表达载体相连接。

优选地，所述连接为，先在所述gRNA分子的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

N表示A、G、C和T，将双链DNA片段和用BbsI酶切过的替换了启动子的PX601表达载体进行连接。

第四方面，提供上述CRISPR/SaCas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用，所述药物中包含一种或多种上述CRISPR/SaCas9系统。

在一个优选的实施方案中，所述CRISPR/SaCas9系统被包装于AAV8血清型重组腺相关病毒基因组中。

第五方面，提供一种含有上述CRISPR/SaCas9系统的组合物，所述组合物包含一种或多种上述CRISPR/SaCas9系统，及含有制药学上可接受的载体。

优选地，所述组合物被制备为注射剂。

第六方面，提供一种非诊断或治疗目的的抑制HBV复制的方法，其包括以下步骤：

(1)将上述一种或多种CRISPR/SaCas9系统导入宿主细胞或者生物体中；以及

(2)表达上述一种或多种CRISPR/SaCas9系统，并在所表达的导向RNA和SaCas9核酸酶共同作用下，破坏共价闭合环状DNA。

本发明的有益效果：

本发明以CRISPR/SaCas9系统的原理及其gRNA的设计原则为基础，以PX601(Addgene ID:61591)为表达载体，通过筛选组合HBV自身的基因组顺势元件和其他来源的肝脏特异性启动子对PX601载体进行改造替换；另外，通过序列比对找出22种基因型和亚型HBV基因序列的保守区域，以这些保守区域为靶位点设计了一系列gRNA。通过筛选和一系列分析测试，最终选出2个启动子组合和3个更优的gRNA。在细胞模型和小鼠模型中利用上述gRNA指导的CRISPR改造系统，可以在显著提升金黄色葡萄球菌Cas9复合物(SaCas9)的肝组织表达特异性的同时，有效的抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制，同时并未对细胞的增殖活性产生明显的抑制，也未检测出明显的脱靶效应。本发明上述gRNA指导的CRISPR改造系统同时针对HBV的多个基因型，不存在由于患者基因型不同而对本发明提供的药物组合物的反应性不同的情况，比传统药物具有更高的广谱性。此外，又可通过3种gRNA多种组合进行多位点剪切，在增加InDel突变率的同时，造成剪切位点之间DNA片段的缺失；多个gRNA的联合应用，可以更大程度地破坏HBVcccDNA，使其片段化，从而失去HBV复制和再传播的可能，从根本上消灭HBV的感染和传染，这种策略能够进一步降低病毒突变之后逃逸治疗的可能。

在Huh7细胞系中分析检测筛选出的3条更为有效的gRNA(T2、T3、T6)及其组合(Tmix)gRNA对于HBV复制和表达的抑制作用，通过实验组与对照组的结果对比，可以看出gRNA T2、T3、T6及组合Tmix对HBV抗原HBsAg和HBeAg的分泌均有更为显著地抑制效果。与对照组TeGFP相比，HBeAg的含量分别下降了59.21±6.95％、59.01±7.01％、88.55±6.98％、74.35±6.96％，HBsAg的含量分别下降了71.92±3.7％、67.36±3.38％、88.7±3.31％、74.65±3.24％(图2)。

在Huh7细胞中同时转染了PX601-U6-HBVgRNA、prcccDNA、pCMV-Cre和pSVβ-gal质粒，将转染后的Huh7细胞培养3天，然后分别提取细胞中和培养基中的壳体化HBV DNA，用real-time PCR测定提取出来的HBV DNA浓度，其中gRNA T2、T3、T6及组合Tmix依旧能更有效的降低细胞内和细胞外的HBV DNA浓度，与对照组相比HBV DNA含量下降均超过99％(p<0.0001)(图3)。

在Huh7细胞中同时转染了PX601-U6-HBVgRNA、prcccDNA、pCMV-Cre和pSVβ-gal三种质粒，将转染后的Huh7细胞培养3天，分别提取细胞中的总RNA和总DNA，采用NorthernBlot检测细胞内HBV RNA的水平，Southern Blot检测病毒质粒在细胞内形成的类似HBVcccDNA的rcccDNA，由此获得gRNA系统对HBV复制及转录的影响。对比实验组与对照组HBVRNA或者HBV DNA的强弱，与之前实验结果一致，其中gRNA T2、T3、T6及组合Tmix表现更好(图4)。

在肝源细胞系(HepG2)和非肝源细胞系(HeLa)中分析检测2个具有优异表现的肝脏特异性启动子组合Enh2-PPck和Enh2-Pa1AT的肝脏特异性表达，在肝源细胞系启动表达下游基因的水平相较于非肝原细胞系分别为8.6倍和50.3倍(图5)。

根据筛选出的3个gRNA与2个肝脏特异性表达启动子，构建出改造的PX601-U6-HBVgRNA表达载体(图6)，在Huh7细胞系中，分别用乙型肝炎表面s抗原和e抗原诊断试剂通过ELISA法检测培养基中HBV分泌抗原HBsAg和HBeAg的浓度；real-time PCR检测HBV DNA复制水平；Northern Blot检测细胞内HBV RNA的水平，Southern Blot检测病毒质粒在细胞内形成的类似HBV cccDNA的rcccDNA(图7)。HBsAg和HBeAg的含量均下降了至少50％，细胞内的病毒DNA复制中间物含量均下降超过80％，细胞外的病毒DNA含量下降超过70％，Northern结果显示HBV三条不同长度的RNA实验组相比对照组均有较为显著的减少，Southern结果显示在接近2kb位置的rcccDNA实验组相比对照组也均有显著减少。

在水动力注射prcccDNA-shB2M、pCMV-Cre到小鼠模型中，利用AAV8包装递送研究CRISPR/SaCas9系统对于HBV复制的抑制作用，分别使用ELISA法检测小鼠血清中的HBsAg和HBeAg的浓度；real-time PCR检测小鼠肝脏中HBV DNA与HBV RNA的水平；免疫组织化学染色法研究小鼠肝脏切片中HBV core抗原的表达水平(图9)。对于注射AAV8-Enh2-Pa1AT-T2的小鼠实验组HBeAg的含量下降更为显著，达到55.21％，注射AAV8-Enh2-Pa1AT-T6的小鼠实验组对HBsAg的抑制更为明显，为59.88％，小鼠血细胞中的病毒DNA复制中间物和小鼠肝脏中的病毒RNA的抑制均达到2倍，免疫组化显示，HBV core蛋白(图中为褐色)的含量经过CRISPR/SaCas9系统的作用而减少。

此外，同时检测肝脏特异性启动子和AAV8递送手段的组织差异表达水平(图10)。通过慢病毒包装系统，发现Enh2-Pa1AT启动子组合与CMV启动子相比，在小鼠的心脏、脾、肺、肾组织中分别能够降低启动子下游基因的表达54.74±12.16％、32.94±10.49％、59.22±13.43％、61.41±8.7％；在AAV8递送条件下，实验组Enh2-Pa1AT启动子组合下游表达的SaCas9蛋白表达与对照组CMV启动子下游递送的GFP蛋白表达相比，在小鼠的心脏、脾、肺、肾组织中能够降低启动子下游基因的表达效果均超过97.3％(p<0.01)。

附图说明

图1：gRNA与不同基因型亚型的HBV序列的比对。

图2：在转染HBV的细胞系中检测分泌型抗原的表达水平。

结果显示gRNA能够有效的抑制HBsAg，HBeAg的表达。

A：HBeAg表达水平；B：HBsAg表达水平。

图3：使用qPCR在转染HBV的细胞系中检测细胞内的病毒复制中间体DNA，以及分泌到培养基中的子代病毒DNA的复制水平。

结果显示，gRNA能够有效抑制HBV复制。

A：细胞内的HBV复制中间体水平；B：细胞外的HBV-DNA的水平。

图4：使用Northern Blot、Southern Blot在转染HBV的细胞系中检测病毒RNA和病毒cccDNA类似物。

结果显示gRNA能够有效抑制HBV RNA水平和HBV cccDNA类似物水平。

A：细胞内的HBV RNA水平；B：细胞内的HBV cccDNA类似物的水平。

图5：使用双荧光实验在转染荧光素酶报告质粒的肝源细胞系和非肝源细胞系检测不同启动子的肝脏特异性表达。

结果显示，筛选的启动子在肝源细胞系中的表达明显优于非肝源细胞系。

图6：经过两个启动子组合替换后的改造PX601-U6-HBVgRNA表达载体示意图。

图7：使用上述的实验技术在转染HBV的细胞系中验证改造后的CRISPR/SaCas9系统对病毒的清除效果。

结果显示，在病毒的多个水平上均受到有效抑制。

A：HBeAg表达水平和HBsAg表达水平；B细胞内的HBV复制中间体水平和细胞外的HBV-DNA的水平；C：细胞内的HBV RNA水平；D：细胞内的HBV cccDNA类似物的水平。

图8：使用ELISA在转染不同基因型HBV的细胞系中验证改造后的CRISPR/SaCas9系统对病毒HBeAg水平的抑制。

结果显示，对不同的基因型有着不同的抑制水平。

A：A基因型HBeAg表达水平；B：B基因型HBeAg表达水平；C：C基因型HBeAg表达水平；D：D基因型HBeAg表达水平。

图9：使用ELISA和real time PCR在小鼠模型中验证改造后的CRISPR/SaCas9系统经AAV8递送后对病毒的清除效果。

结果显示，在病毒的多个水平上均受到有效抑制。

A：血清HBsAg、HBeAg水平；B：血清HBV DNA水平；C：肝组织中HBV RNA水平；D肝组织HBcAg免疫组化。

图10：使用real time PCR在小鼠模型中验证由AAV8递送的肝脏特异性启动子的CRISPR/SaCas9系统的核酸酶SaCas9组织差异表达。

结果显示，AAV8的递送和启动子的替换使得核酸酶SaCas9在小鼠体内的表达更具肝特异性。

A：慢病毒携带不同启动子作用下，下游基因在不同组织的表达差异；B：AAV8携带不同启动子作用下，下游基因在不同组织的表达差异。

图11：使用深度测序的方法，以小鼠肝组织基因组为样品，对T2、T6相应的脱靶位点进行比对分析。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】靶向22种不同基因型HBV保守性序列的gRNA序列的设计、合成以及真核表达载体构建

1、靶向HBV DNA的gRNA的选择和设计

以D型HBV(Genebank ID：V01460.1)为参考序列，通过crispr.mit.edu上的Crisprdesign工具找到HBV DNA上打分较高的靶位点，靶位点序列的形式为5’-(20N)-NNGRRT3’或者5’-ARRCNN(20N)-3’。与以往的设计不同，本发明将22种不同基因型的HBV DNA序列进行比对，从找到的靶位点中选出位于保守性较高区域的gRNA序列，这些保守区域本身也是复制过程中基因突变率较低的区域。同时也对比了人体基因组序列，排除与人体基因组序列同源性高的gRNA，最终设计出一系列gRNA序列及靶点(图1)。从而保障设计的gRNA能有效靶向各种HBV基因型及亚型，降低病毒突变而导致的失效。

2、靶向HBV DNA的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表达载体的构建

根据选择的gRNA，在其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

变性、退火体系为：

2μl 正向寡核苷酸链(50μM)

2μl 反向寡核苷酸链(50μM)

46μl 1×NEB buffer

在PCR仪中按以下程序运行：90℃，4min；70℃，10min；37℃，20min；25℃，20min。

退火后的双链寡核苷酸链含有Bbs1的粘性末端，直接与被Bbs1酶切过的PX601载体进行连接，可以得PX601-U6-HBV gRNA重组质粒。

酶切体系：

酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。

连接体系：

1、将上述步骤得到的连接产物转化JM109感受态细胞，涂布于Amp⁺的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒提取质粒进行分析及测序鉴定，确定gRNA表达载体构建成功(命名为PX601-U6-HBVgRNA)。

【实施例2】在细胞水平验证本发明gRNA指导的CRISPR/Cas9系统对HBV复制的抑制

为了验证本发明中设计的gRNA指导的CRISPR/SaCas9系统是否具有抗HBV复制的能力，本发明中将构建的gRNA的克隆与乙型肝炎病毒的复制子prcccDNA(基因型D；Genebank ID：V01460.1)、pCMV-Cre共同转染进入肝癌细胞系Huh7之中，另外一个靶向于GFP的gRNA(T_GFP)被用作对照组。为了将不同孔之间的转染效率标准化，每个孔都转染了相同量β-半乳糖苷酶的表达质粒pSVβ-gal。于转染48小时之后，观察Huh7细胞系生长状态好，取培养基上清用来测定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的表达水平。结果显示，筛选到3个不同的gRNA T2、T3、T6及其组合Tmix指导的CRISPR/SaCas9系统均在不同程度上抑制了HBeAg和HBsAg的表达水平(图2A和2B)，与对照组TeGFP相比，HBeAg的含量分别下降了59.21±6.95％、59.01±7.01％、88.55±6.98％、74.35±6.96％，HBsAg的含量分别下降了71.92±3.7％、67.36±3.38％、88.7±3.31％、74.65±3.24％。另外，Northern Blot结果表明，细胞内病毒的几种RNA的表达水平均在不同程度上被抑制。Southern Blot结果表明，病毒以微染色体形式存在的cccDNA类似物可以被有效抑制(图4A和4B)。转染72小时之后，使用real time PCR法测定了不同组分泌出到细胞中的子代病毒和细胞内部的病毒DNA复制中间体的含量。结果显示，筛选到的3个gRNA T2、T3、T6及其组合Tmix均有效的抑制了病毒的DNA复制水平和子代病毒的产生(图3A和3B)。综上所述，本发明中设计构建并筛选到的3种全新的gRNA T2、T3、T6及其组合Tmix均能够指导CRISPR/SaCas9系统去更有效的抑制乙型肝炎病毒的基因表达、复制及子代病毒的产生。具体实验步骤如下：

1、细胞培养与转染

a、Huh7细胞接种于DMEM培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

b、在转染前一天将细胞铺在24孔板中，等到密度70％-80％时进行转染。

c、转染前移除细胞上原有的培养基，换为新鲜的无血清培养基。

d、以PX601-U6-HBV gRNA质粒：prcccDNA质粒:：pCMV-Cre质粒：β-gal质粒＝8:0.5:0.5::1的比例将质粒DNA溶于opti-MEM中，混匀后加入Neofect^TM，轻柔混匀，室温静置15-30min，转染复合物制备完成。

e、将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀。

f、继续培养48或72小时后，用ELISA、Northern blot或qPCR检测不同的指标。

2、ELASA法测定细胞表面抗原和e抗原表达的变化

转染后第三天收集上清，按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒及乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒说明书测量上清中的HBVs抗原及e抗原。具体步骤如下：

a、每孔加入待测样本50μl，设阴、阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μl，并设空白对照1孔；

b、每孔加入酶结合物各50μl(空白对照除外)，充分混匀，封板，置37℃孵育30min；

c、手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5s，甩干，重复5次后拍干；

d、各孔加入显色剂A液、显色剂B液各50μl，充分混匀，封板，37℃孵育；

e、加入终止液50μl，混匀；

f、用酶标仪读书，取波长450nm。

3、细胞内RNA的提取

a、根据培养皿的面积加入适量的TRIZOL(1ml每10cm²)，用枪反复吹打，使细胞充分裂解；

b、室温放置5min，加入氯仿(每1mlTRIZOL加入0.2ml)，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃12000g 15min；

c、将上清转移到一个新的EP管中，加入异丙醇沉淀RNA(每1mlTRIZOL加入0.5mL)，室温放置10min，4℃12000g 10min；

d、去掉上清，用75％乙醇洗RNA沉淀，每1mlTRIZOL至少用1ml乙醇，震荡重悬沉淀，4℃12000g>5min；

e、去掉上清，在空气中干燥5-10min，用无RNA酶的水溶解RNA，室温下放置5min，测RNA的浓度。

4、Northern blot

a、加入2×loading，先放65℃变性10min，取出后立刻放冰上，上样进行电泳80V跑2h

RNA琼脂糖凝胶配方：1％琼脂糖，水:甲醛＝4:1，10×Mops

b、跑完的胶在紫外下照完相后，将多余的部分裁掉；

c、用milliQ水泡胶3次，每次5min，然后用20×SSC泡两次，每次15min，尼龙膜先用milliQ水泡15min，再加20×SSC泡15min；

d、裁20多张与胶一样宽的滤纸，4条一样宽但很长的滤纸，从下到上按干纸巾、干滤纸、湿滤纸、膜、胶，湿滤纸、滤纸桥、湿滤纸的顺序搭好转膜，室温转3h；

e、转好的膜先进行UV交联1.8min；

f、取2ml DIG easy Hyb，55℃与杂交，大于1h；

g、取1μl制备好的单链RNA探针，100℃煮5min，取出后立即放入冰上，再稀释入1mlDIG easy Hyb中，直接加500μl到之前封闭的杂交袋中，55℃过夜；

h、以milliQ水配制2×SSC和0.1×SSC，并加入20％SDS，终浓度为0.1％，先用2×SSC泡5min，两次，常温摇，再用0.1×SSC泡胶15min，两次，55℃，中途摇；

i、用washing buffer洗膜两次，加封闭液，常温摇30min；

j、以block buffer稀释DIG抗体(1:15000～1:20000)，常温，30min；

k、washing buffer洗膜两遍，每遍15min，再以Detection buffer涮一遍；

l、将显色底物加在膜上，用胶片曝光。

5、壳体化HBV DNA的提取

a、用冰预冷的PBS洗细胞两次；

b、加400μl Lysis buffer，室温摇10min；

c、裂解后的细胞转入EP管中，13200rpm离心1min；

d、吸取上清，加20μl DNase1和20μlDNase1 buffer以及5μlRNase A，37℃温浴2h左右；

e、加20μl 0.5M的EDTA，沸水煮5min；

f、加10μl proteinase K(20mg/ml)和20μl 10％SDS，混匀，55℃过夜；

g、按1:1体积添加酚/氯仿(1:1)，猛烈摇匀后静置2min，13200rpm离心5min，去上清；

h、加入2倍体积的乙醇和0.1倍体积的NaAc(3M，PH5.2)，室温放置5min，13200rpm离心5min，弃上清；

i、加1ml70％乙醇，重悬沉淀，13200rpm离心3min，弃上清，干燥；

j、加15μl TE buffer将DNA溶解。

6、使用基因组DNA提取试剂盒提取细胞的总DNA

a、用胰酶重悬收集细胞；

b、常温5000g离心5min后弃掉胰酶，加入试剂盒中的GA；

c、加入20ul Proteinase K溶液，混匀

d、加入200ulGB,充分颠倒混匀，70℃放置10min；

e、加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15sec；

f、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中；

g、向吸附柱CB3中加入500ulGD，12000rpm离心1min，倒掉废液；

h、向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液；

i、重复步骤h；

j、将吸附柱CB3放回收集管中，最大转速离心2min，倒掉废液；

k、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间加入30ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，最大转速离心2min，将溶液收集到离心管中。

7、Southern Blot

a、普通1％琼脂糖凝胶(TAE)，上样进行电泳80V跑1h40min；

b、跑完胶后将多余的部分裁掉；

c、用变性buffer处理胶45min，然后用中和buffer处理胶两次，每次15min，尼龙膜先用milliQ水泡15min，再加20×SSC泡15min；

e、转好的膜先进行UV交联1.8min；

f、取2ml DIG easy Hyb，55℃与杂交，大于1h；

i、用washing buffer洗膜两次，加封闭液，常温摇30min；

j、以block buffer稀释DIG抗体(1:15000～1:20000)，常温，30min；

l、将显色底物加在膜上，用胶片曝光。

Southern Blot和Northern Blot探针序列(157-1068)：

CATACAAAGGCATCAACGCAGGATAACCACATTGTGTAAAAGGGGCAGCAAAACCCAAAAGACCCACAATTCGTTGACATACTTTCCAATCAATAGGCCTGTTAATAGGAAGTTTTCTAAAACATTCTTTGATTTTTTGTATGATGTGTTCTTGTGGCAAGGACCCATAACATCCAATGACATAACCCATAAAATTTAGAGAGTAACCCCATCTCTTTGTTTTGTTAGGGTTTAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGTAACAGCGGTAAAAAGGGACTCAAGATGCTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAGGAGAAACGGGCTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCGAAAGCCCAGGATGATGGGATGGGAATACAGGTGCAATTTCCGTCCGAAGGTTTGGTACAGCAACAGGAGGGATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGTAGTCATGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTTGTTGAGGATCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGAAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAACCAGGACAAGTTGGAGGACAAGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTGCGAATTTTGGCCAAGACACACGGTAGTTCCCCCTAGAAAATTGAGAGAAGTCCACCACGAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGAGGATTCTTGTCAACAAGAAAAACCCCGCCTGTAACACGAGAAGGGGTCCTAGGAATCCTGATGTGATGTTCTCCAT

8、qPCR体系

qPCR中使用的引物序列为：

HBVF：5`-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3`

HBVR：5`-CTGCAGGATGAAGAGGAA-3`。

表1、3条gRNA、2个启动子组合的序列

【实施例3】不同候选启动子在肝源和非肝源细胞系中的差异表达水平

1、根据D型HBV(Genebank ID：V01460.1)的基因组结构，选择相应的四个启动子Enh1/X、Enh2/C、preS1、preS2，一个增强子Enh2作为候选；根据人和大鼠基因组信息选择具有肝脏特异性表达的三个启动子PPck(Gene ID:362282)、Palb(Gene ID:111832673)、Pa1AT(Gene ID:5265),一个增强子Ealb作为候选。最终选择13个启动子组合：Enh1/X、Enh2/C、preS1、preS2、PPck、Ealb-PPck、Enh2-PPck、Palb、Ealb-Palb、Enh2-Palb、Pa1AT、Ealb-Pa1AT、Enh2-Pa1AT。

2、将上述启动子片段和CMV启动子用Sac1酶、Hind3酶处理的pGL3荧光素酶报告质粒连接；

3、将上述2中构建的14个质粒分别与带有海肾荧光素酶基因的质粒phRL-TK共转肝癌细胞系HepG2细胞和宫颈癌细胞系HeLa细胞；

4、共转细胞培养48小时后，通过双荧光素酶系统实验，以CMV启动子作为对照来检测13个启动子组合在肝源细胞系和非肝源细胞系中的表达差异。结果发现Enh2/C、Enh2-PPck和Enh2-Pa1AT具有显著的表达特异性，在肝源细胞系启动表达下游基因的水平相较于非肝原细胞系分别为17.2倍、8.6倍和50.3倍(图5)，综合考虑后，选用Enh2-PPck和Enh2-Pa1AT这两个启动子组合。

【实施例4】检测本发明结合改造的CRISPR/SaCas9系统gRNA对于不同基因型HBV的抑制效果

根据筛选出的3个gRNA与2个肝脏特异性表达启动子，构建出改造的PX601-U6-HBVgRNA表达载体(图6)，即将Enh2-PPck和Enh2-Pa1AT两个启动子片段分别和用XbaI酶、AgeI酶处理的PX601-U6-HBVgRNA T2、PX601-U6-HBVgRNA T3、PX601-U6-HBVgRNA T6连接。

分别用乙型肝炎表面s抗原和e抗原诊断试剂通过ELISA法检测培养基中HBV分泌抗原HBsAg和HBeAg的浓度；real-time PCR检测HBV DNA复制水平；Northern Blot检测细胞内HBV RNA的水平，Southern Blot检测病毒质粒在细胞内形成的类似HBV cccDNA的rcccDNA。

为了检测本发明涉及的gRNA是否对于基因型为A,B,C的HBV具有抑制作用，首先，我们将HBV基因型A(Genebank ID：AF305422.1)，基因型B(Genebank ID：EU570069.1)，基因型C(Genebank ID：FJ899793.1)和基因型D(Genebank ID：V01460.1)分别与gRNA共转染Huh7细胞系，2天后检测病毒e抗原以及S抗原的表达水平。结果如图7所示，T2、T3、T6、Tmix对于HBsAg以及HBeAg均有不同程度的抑制，均下降了至少50％，细胞内的病毒DNA复制中间物含量均下降超过80％，细胞外的病毒DNA含量下降超过70％，Northern结果显示HBV三条不同长度的RNA实验组相比对照组均有较为显著的减少，Southern结果显示在接近2kb位置的rcccDNA实验组相比对照组也均有显著减少。不同启动子替换的CRISPR/SaCas9系统对不同基因型的抑制效果不一样。这反映了病毒增强子来源和宿主来源的启动子组合的变动对不同基因型存在不同的表现，但均有不同程度的抑制效果，体现了gRNA组合的潜力和应用前景。

【实施例5】在小鼠模型中应用本发明结合AAV8递送改造的CRISPR/SaCas9系统gRNA及其组合Tmix清除HBV

先高压尾静脉注射将乙型肝炎病毒的质粒系统prcccDNA-shB2M和pCMV-Cre注射到小鼠体内，从而构建乙型肝炎病毒的小鼠模型。一周之后，将经过公司包装好的AAV8-eGFP、AAV8-Enh2-Pa1AT-T2、AAV8-Enh2-Pa1AT-T6、AAV8-Enh2-Pa1AT-Tmix也注射到小鼠体内，一个月之后，处死小鼠并检测病毒的复制指标。分别使用ELISA法检测小鼠血清中的HBsAg和HBeAg的浓度；real-time PCR检测小鼠肝脏中HBV DNA与HBV RNA的水平；免疫组织化学染色法研究小鼠肝脏切片中HBV core抗原的表达水平(图9)。对于注射AAV8-Enh2-Pa1AT-T2的小鼠实验组HBeAg的含量下降更为显著，达到55.21％，注射AAV8-Enh2-Pa1AT-T6的小鼠实验组对HBsAg的抑制更为明显，为59.88％，小鼠血细胞中的病毒DNA复制中间物和小鼠肝脏中的病毒RNA的抑制均达到2倍，免疫组化显示，HBV core蛋白(图中为褐色)的含量经过CRISPR/SaCas9系统的作用而减少。具体实施步骤如下：

1、将5μg prcccDNA-shB2M质粒和5μg pCMV-Cre质粒溶于2mlPBS中；

2、用2ml的医用注射针将溶有质粒的PBS快速(<5s)通过尾静脉注射到小鼠体内；

3、一周后，用1ml的医用注射针对小鼠再次进行普通注射包装了CRISPR/SaCas9的AAV病毒；

4、注射后的小鼠0天，10天使用眼眶静脉丛取血方法对小鼠温和取血，20天之后，摘除眼球取血，处死剖开取小鼠内脏保存，其中最大的一叶肝脏用甲醛固定；

5、小鼠的血液在4℃冰箱放置过夜后，3000rpm离心15min，取上清，即小鼠血清；

6、取少量小鼠血清稀释后用EILSA测其中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原；

7、从小鼠血清中提取HBV DNA，并用qPCR检测其中的HBV DNA含量；

8、从小鼠肝脏中提取RNA，通过qPCR检测其中的HBV RNA含量；从小鼠其他组织中提取RNA，通过qPCR检测SaCas9和eGFP的mRNA表达量；

9、甲醛中保存的肝脏小叶用来做病理切片，并通过免疫组化的方法检测其中的Core蛋白含量。

【实施例6】在小鼠模型中验证由AAV8递送的肝脏特异性启动子的CRISPR/SaCas9系统的核酸酶SaCas9组织差异表达

为了验证AAV8病毒载体递送方式和肝脏特异性启动子替换这两种应用在小鼠模型中对核酸酶SaCas9肝特异性表达的影响，分别检测了慢病毒载体携带上游Enh2-Pa1AT启动子的荧光素酶报告基因在小鼠不同组织中的表达，以及实施例5中AAV8病毒载体携带的eGFP基因和SaCas9基因在小鼠不同组织的表达。

通过慢病毒包装系统，发现Enh2-Pa1AT启动子组合与CMV启动子相比，在小鼠的心脏、脾、肺、肾组织中分别能够降低启动子下游基因的表达54.74±12.16％、32.94±10.49％、59.22±13.43％、61.41±8.7％；在AAV8递送条件下，实验组Enh2-Pa1AT启动子组合下游表达的SaCas9蛋白表达与对照组CMV启动子下游递送的GFP蛋白表达相比，在小鼠的心脏、脾、肺、肾组织中能够降低启动子下游基因的表达效果均超过97.3％(p<0.01)。其中慢病毒感染小鼠实验具体实施步骤如下：

1、将Enh2-Pa1AT启动子与荧光素酶报告基因的DNA片段构建到慢病毒转移载体pHAGE上；

2、将构建好的慢病毒转移载体pHAGE、包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染到T175瓶的293T细胞包装慢病毒；

3、用1ml的医用注射针将经浓缩后用PBS重悬的慢病毒通过尾静脉注射到小鼠体内；

4、射后的小鼠2天之后，摘除眼球取血，处死剖开取小鼠内脏；

5、从小鼠不同的组织中提取RNA，通过qPCR检测Luciferase的mRNA表达量。

【实施例7】使用深度测序的方法验证由AAV8递送的肝脏特异性启动子的CRISPR/SaCas9系统的脱靶安全性。

1、使用CRISPR/SaCas9脱靶位点预测在线网站Cas-OFFinder预测T2、T6两条gRNA可能的脱靶位点(网页http://www.rgenome.net/cas-offinder/)；

2、根据选取的高脱靶风险设计PCR引物，引物信息如下

脱靶位点	正向引物	反向引物
			T2脱靶位点1	TGTAGCCTAAATTATACCAG	TTTCATTGCTCTTGTTTGTT
T2脱靶位点2	GTCAAGCATCCCGTGGTTAG	TATTTGAGTAACTTCATGTGGGAG
			T2脱靶位点3	AAGTCCTTGGCTTTCACTATTA	GTACAAAGCCACAATCGTCA
T6脱靶位点1	GCAATAGGCTGTATTATTTGGA	CTTCCAACCTCTGCCTCCT
			T6脱靶位点2	ATGGCAATTTTAAGTTAGTCCAGTT	TGAGCACCTCTGATGGGGA
T6脱靶位点3	TTGTTGCGCCTGCTTATTC	TCCACAAGGGCACTCCATA

3、以小鼠基因组为模板，将预测的脱靶位点片段分别PCR进行扩增，DNA电泳切胶回收获得待测序样品，进行深度测序并比对参考序列。

结果显示分别对应的3个高潜在可能的脱靶位点在深度测序的检测范围内并未发现序列突变。

综上，本发明中设计筛选的2个启动子组合能提升SaCas9核酸酶的肝特异性表达，尤其是Enh2-Pa1AT在小鼠中的表现更优。并且，设计的T2、T3、T6和组合的Tmix所指导的CRISPR/Cas9系统可以明显的抑制病毒复制，具有较好的清除病毒感染的能力。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 695

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 60

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 120

gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactcgcg acccttctca tgacctttgg 180

ccgtgggagt gacacctcac agctgtggtg ttttgacaac cagcagccac tggcacacaa 240

aatgtgcagc cagcagcata tgaagtccaa gaggcgtccc ggccagccct gtccttgacc 300

cccacctgac aattaaggca agagcctata gtttgcatca gcaacagtca cggtcaaagt 360

ttagtcaatc aaacgttgtg taaggactca actatggctg acacgggggc ctgaggcctc 420

ccaacattca ttaacaacag caagttcaat cattatctcc ccaaagttta ttgtgttagg 480

tcagttccaa accgtgctga ccatggctat gatccaaagg ccggcccctt acgtcagagg 540

cgagcctcca ggtccagctg aggggcaggg ctgtcctccc ttctgtatac tatttaaagc 600

gaggagggct agctaccaag cacggttggc cttccctctg ggaacacacc cttggccaac 660

aggggaaatc cggcgagacg ctctgagatc tctga 695

<210> 2

<211> 460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 60

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 120

gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtacgccac cccctccacc ttggacacag 180

gacgctgtgg tttctgagcc aggtacaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt 240

acactgccca ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg 300

acttagcccc tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag 360

cctcccccgt tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct 420

cctcagcttc aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat 460

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggctttcgg aaaattccta t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacctggccg ttgccgggca a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcatggacat cgacccttat a 21

<210> 6

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catacaaagg catcaacgca ggataaccac attgtgtaaa aggggcagca aaacccaaaa 60

gacccacaat tcgttgacat actttccaat caataggcct gttaatagga agttttctaa 120

aacattcttt gattttttgt atgatgtgtt cttgtggcaa ggacccataa catccaatga 180

cataacccat aaaatttaga gagtaacccc atctctttgt tttgttaggg tttaaatgta 240

tacccaaaga caaaagaaaa ttggtaacag cggtaaaaag ggactcaaga tgctgtacag 300

acttggcccc caataccaca tcatccatat aactgaaagc caaacagtgg gggaaagccc 360

tacgaaccac tgaacaaatg gcactagtaa actgagccag gagaaacggg ctgaggccca 420

ctcccatagg aattttccga aagcccagga tgatgggatg ggaatacagg tgcaatttcc 480

gtccgaaggt ttggtacagc aacaggaggg atacatagag gttccttgag cagtagtcat 540

gcaggtccgg catggtcccg tgctggttgt tgaggatcct ggaattagag gacaaacggg 600

caacatacct tgatagtcca gaagaaccaa caagaagatg aggcatagca gcaggatgaa 660

gaggaagatg ataaaacgcc gcagacacat ccagcgataa ccaggacaag ttggaggaca 720

agaggttggt gagtgattgg aggttgggga ctgcgaattt tggccaagac acacggtagt 780

tccccctaga aaattgagag aagtccacca cgagtctaga ctctgcggta ttgtgaggat 840

tcttgtcaac aagaaaaacc ccgcctgtaa cacgagaagg ggtcctagga atcctgatgt 900

gatgttctcc at 912

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtagcctaa attataccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcattgct cttgtttgtt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcaagcatc ccgtggttag 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tatttgagta acttcatgtg ggag 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtccttgg ctttcactat ta 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtacaaagcc acaatcgtca 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaataggct gtattatttg ga 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttccaacct ctgcctcct 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcaattt taagttagtc cagtt 25

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgagcacctc tgatgggga 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttgttgcgcc tgcttattc 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tccacaaggg cactccata 19

Claims

1.一种基于CRISPR/SaCas9系统能够特异性抑制HBV复制的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的靶点核苷酸序列如SEQ ID NO：4或5所示。

2.一种含有SaCas9肝脏特异性启动子组合和权利要求1所述gRNA分子的CRISPR/SaCas9系统，其特征在于，所述SaCas9肝脏特异性启动子组合为核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的Enh2-PPck或Enh2-Pa1AT，所述CRISPR/SaCas9系统以PX601为表达载体，用SaCas9肝脏特异性启动子组合对表达载体的CMV启动子进行替换得到替换了启动子的PX601表达载体，将权利要求1所述gRNA分子与替换了启动子的PX601表达载体相连接。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/SaCas9系统，其特征在于，所述将权利要求1所述gRNA分子与替换了启动子的PX601表达载体相连接为先在所述gRNA分子的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

N表示A、G、C和T，将双链DNA片段和用BbsI酶切过的替换了启动子的PX601表达载体进行连接。

4.权利要求2或3所述的CRISPR/SaCas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用，其特征在于，所述药物中包含一种或多种权利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系统。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/SaCas9系统被包装于AAV8血清型重组腺相关病毒基因组中。

6.一种含有一种或多种权利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系统的组合物，其特征在于，所述组合物含有制药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备为注射剂。

8.一种非诊断或治疗目的的抑制HBV复制的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求2或3所述一种或多种CRISPR/SaCas9系统导入宿主细胞或者生物体中；以及

(2)表达权利要求2或3所述一种或多种CRISPR/SaCas9系统，并在所表达的导向RNA和SaCas9核酸酶共同作用下，破坏共价闭合环状DNA。