CN115068611B - ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用 - Google Patents

ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ssc‑miR‑374b‑3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用。属于抗病毒药物技术领域。本发明将增加ssc‑miR‑374b‑3p表达的模拟物和降低ssc‑miR‑374b‑3p表达的抑制剂分别转染至猪小肠上皮细胞(IPEC‑J2)，转染后24h使用PDCoV感染细胞，感染病毒后12h以荧光定量PCR技术检测细胞中PDCoVM基因的表达量，发现PDCoVM基因的表达量分别显著减少和升高，表明ssc‑miR‑374b‑3p能够抑制PDCoV在IPEC‑J2细胞中的增殖。本发明为抗PDCoV增殖药物的制备提供了新的候选miRNA。

Description

ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗病毒药物技术领域，更具体的说是涉及ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种猪肠道致病性腹泻病原，可诱发猪出现水样腹泻、呕吐、脱水和死亡。该病毒已成为诱发猪腹泻病的主要病原体之一，对养猪业造成了巨大的经济损失。目前尚无商业化疫苗和特异性药物用于防治该病毒引发的猪腹泻病，迫切需要发展新的抗病毒策略。
目前研究者正在从研制抗病毒药物和疫苗靶标两个角度积极寻找抑制PDCoV复制的抗病毒分子。
从研发抗病毒药物角度探索的抗病毒分子多为化合物。罗丹宁衍生物LJ001对PDCoV在ST细胞中的复制具有有效的抑制能力，其能够限制病毒RNA和蛋白质的合成，并抑制该病毒的复制。胆固醇的氧化产物25-羟基胆固醇能够通过阻断PDCoV进入细胞进而抑制该病毒复制。胆汁酸鹅去氧胆酸和石胆酸通过诱导IFN-λ3和IFN刺激基因15(ISG15)的产生抑制PDCoV复制。麦角甾醇过氧化物(EP)在病毒附着、病毒入侵阶段对PDCoV的复制均具有抑制活性。此外，褪黑素、热休克蛋白90抑制剂17-AAG和VER-82576，均在PDCoV复制的早期阶段抑制该病毒的复制，凝集素GRFT能够与PDCoV表面的刺突蛋白结合，通过包裹病毒并阻止其进入细胞抑制该病毒复制，而消化道皮肤素D(GSDMD)通过促进IFN-β的非常规分泌抑制PDCoV复制。
从研发疫苗角度寻找抗病毒分子的报道集中于构建表达病毒基因的shRNA质粒、来自病毒基因组的减毒活病毒疫苗候选基因和病毒样颗粒(VLP)。基于PDCoV基因组M和N基因构建的shRNA能够抑制PDCoV在ST细胞中的复制，研究人员进而设计了一种针对N基因的双shRNA表达质粒，命名为pSil-double-shRNA-N1。NS6蛋白是PDCoV的一个重要毒力因子，为开发减毒活疫苗提供了潜在的候选基因。Zhang等人用绿色荧光蛋白(GFP)替换PDCoV全长感染性cDNA克隆的NS6基因，以生成重组病毒rPDCoV-ΔNS6-GFP。rPDCoV-ΔNS6-GFP在体外和体内均表现出病毒产量下降，并且rPDCoV-ΔNS6-GFP感染仔猪后几乎未观察到临床症状或肠道病变。含Qβ噬菌体外壳蛋白的VLP嵌合疫苗具有冠状病毒的抗原表位，该疫苗可以诱导小鼠体内产生对MHV、PEDV和PDCoV的中和抗体反应。
综上所述，有待从新的角度进一步探索抑制PDCoV复制的抗病毒分子及相关机制，以丰富用于该病毒疫苗和特异性药物研发的靶标分子种类。
microRNA(miRNA/miR)是非编码RNA家族的成员，其在转录后水平调控功能基因的表达，广泛参与多种生物学过程的调控。研究发现，miRNA能够通过调控宿主细胞天然免疫应答、细胞凋亡、线粒体损伤等途径实现对多种冠状病毒增殖的抑制作用，但抑制PDCoV增殖的抗病毒miRNA尚不明确。本发明另辟蹊径，从miRNA角度为PDCoV的抑制药物提供候选抗病毒分子。
申请人发现，猪miR-374b-3p(ssc-miR-374b-3p)能够调节PDCoV在猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell line J2，IPEC-J2)中的增殖，本发明从新的角度为抗PDCoV增殖药物的制备提供了候选miRNA。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用。
本发明将增加ssc-miR-374b-3p表达的模拟物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和降低ssc-miR-374b-3p表达的抑制剂(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)分别转染至猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell line J2，IPEC-J2)，转染后24h使用PDCoV-TJ1毒株感染细胞，感染病毒后12h以荧光定量PCR技术检测细胞中PDCoV M基因的表达量，发现PDCoV M基因的表达量分别显著减少和升高，表明ssc-miR-374b-3p能够抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖。本发明为抗PDCoV增殖药物的制备提供了候选miRNA。
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1；
CUGGGAGAAGGCTGTTACTCT；SEQ ID NO.2。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
以ssc-miR-374b-3p为作用靶点在制备抗PDCoV增殖药物中的应用，所述ssc-miR-374b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
增加ssc-miR-374b-3p表达量的物质在制备抗PDCoV增殖药物中的应用；
所述ssc-miR-374b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用；
所述ssc-miR-374b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
一种抗PDCoV增殖的药物，包括增加ssc-miR-374b-3p表达量的物质。
进一步的，所述增加ssc-miR-374b-3p表达量的物质的核苷酸序列如下：
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：ssc-miR-374b-3p能够抑制PDCoV在猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell lineJ2，IPEC-J2)中的增殖，本发明从新的角度为抗PDCoV增殖药物的制备提供了候选miRNA。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中PDCoV感染IPEC-J2细胞后降低ssc-miR-374b-3p的表达；
图2附图为本发明实施例2中模拟物增加ssc-miR-374b-3p在IPEC-J2细胞中的表达，其中*代表P<0.05；
图3附图为本发明实施例3中抑制剂降低ssc-miR-374b-3p在IPEC-J2细胞中的表达；
图4附图为本发明实施例4中增加ssc-miR-374b-3p的表达可以抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖，其中**代表P<0.01；
图5附图为本发明实施例5中降低ssc-miR-374b-3p的表达可以促进PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖，其中*代表P<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
IPEC-J2细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司；
胎牛血清购自依科赛生物科技(太仓)有限公司；
高糖DMEM培养基购自Gibco公司；
PDCoV-TJ1毒株为天津市农业科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控创新团队分离并保存；(郑丽,李秀丽,鄢明华*,任卫科,张蕾,路超,田向学,韩伟.猪德尔塔冠状病毒TJ1株的分离鉴定及生物学特性分析[J].中国畜牧兽医(中文核心期刊).2018,45(1):219-224)；
riboSCRIPT Reverse Transcription Kit(500T)购自广州锐博生物技术有限公司；
Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit购自广州锐博生物技术有限公司；
Opti-MEM培养基购自Thermo Fisher Scientific公司；
Lipofectamine 3000 Reagent购自Thermo Fisher Scientific公司；
PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
TB
Figure BDA0003713284190000041
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
未提及实验试剂、用品为常规实验试剂、用品，采购自市售渠道；
未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
PDCoV感染IPEC-J2细胞后降低ssc-miR-374b-3p的表达
1.实验细胞培养：
将IPEC-J2细胞接种于6孔板，用含有10％体积浓度胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养至80％汇合度的细胞单层。
2.病毒接种：
将PDCoV-TJ1毒株以MOI为1.0的剂量接种于IPEC-J2细胞(每孔1.6mL，含终体积浓度为1％胰液素)(接毒组)，同时设未接病毒的对照组，随后在37℃、5％CO2条件下进行培养。
3.总RNA提取与miRNA RT产物合成：
接种病毒后12h收集IPEC-J2细胞沉淀，采用TRIzol法提取总RNA，使用riboSCRIPTReverse Transcription Kit(500T)将总RNA反转录为miRNA RT产物(反转录时使用的ssc-miR-374b-3p茎环引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，每10μL体系加入5μg总RNA；反转录程序为42℃60min，70℃10min。
GGTTGTGGTTGGTTGGTTTGTATACCACAACCAATGAT；SEQ ID NO.3。
4.荧光定量PCR：
以反转录得到的miRNA RT产物为荧光定量PCR的模板；将ssc-miR-374b-3p和内参基因U6的引物分别稀释为200nM，ssc-miR-374b-3p上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，U6上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.7，采用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit并根据说明书配置体系和设定程序(退火温度设为60℃)；根据荧光定量PCR实验的Ct值，以U6为内参基因，用2-ΔΔCt公式计算出对照组与接毒组之间ssc-miR-374b-3p的表达量变化倍数。
AGGGGCTTATCAGGTTGTATT；SEQ ID NO.4；
GTTGTGGTTGGTTGGTTTGT；SEQ ID NO.5；
ATAGATCTAGGAGGACTCCAGGGAC；SEQ ID NO.6；
CTGAATTCGGGTCTTCTCAGAGG；SEQ ID NO.7。
结果如图1所示，图1结果表明，ssc-miR-374b-3p在PDCoV TJ1感染后12h的IPEC-J2细胞中表达量降低。
实施例2
增加ssc-miR-374b-3p表达的模拟物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)增加ssc-miR-374b-3p在IPEC-J2细胞中的表达
1.实验细胞培养：
将IPEC-J2细胞接种于96孔板，用含有10％体积浓度胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养至80％汇合度的细胞单层。
2.细胞转染实验：
将0.75μL终浓度为150nM的增加ssc-miR-374b-3p表达的模拟物和模拟物对照分别加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将0.3μl Lipofectamine 3000Reagent加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将稀释好的模拟物溶液、模拟物对照溶液分别与加入Opti-MEM的Lipofectamine 3000 Reagent充分混匀，静置15min；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在96孔板的IPEC-J2细胞，接着将上述模拟物/模拟物对照和Lipofectamine 3000 Reagent的混合液加入各孔IPEC-J2细胞中，每孔90μL，轻轻摇晃后，放置37℃、5％CO2条件下的细胞培养箱培养，24h后收集IPEC-J2细胞沉淀。
3.总RNA提取与miRNA RT产物合成：
使用TRIzol法提取总RNA，采用riboSCRIPT Reverse Transcription Kit(500T)将总RNA反转录为miRNA RT产物，反转录时使用的ssc-miR-374b-3p茎环引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3，每10μL体系加入5μg总RNA；反转录程序为42℃60min，70℃10min。
4.荧光定量PCR：
以反转录得到的miRNA RT产物为荧光定量PCR的模板；将ssc-miR-374b-3p和内参基因U6的引物分别稀释为200nM，ssc-miR-374b-3p上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，U6上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.7，采用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit并根据说明书配置体系和设定程序(退火温度设为60℃)；根据荧光定量PCR实验的Ct值，以U6为内参基因，用2-ΔΔCt公式计算出模拟物组与模拟物对照组之间ssc-miR-30c-3p的表达量变化倍数。
结果如图2所示，图2表明，转染增加ssc-miR-374b-3p表达的模拟物后24h，IPEC-J2细胞中ssc-miR-374b-3p的表达量显著增加。
实施例3
降低ssc-miR-374b-3p表达的抑制剂(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)降低ssc-miR-374b-3p在IPEC-J2细胞中的表达
1.实验细胞培养：
将IPEC-J2细胞接种于96孔板，用含有10％体积浓度胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养至80％汇合度的细胞单层。
2.细胞转染实验：
将0.75μL终浓度为150nM的降低ssc-miR-374b-3p表达的抑制剂和抑制剂对照分别加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将0.3μl Lipofectamine 3000Reagent加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将稀释好的抑制剂溶液和抑制剂对照溶液分别与加入Opti-MEM的Lipofectamine 3000 Reagent充分混匀，静置15min；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在96孔板的IPEC-J2细胞，接着将抑制剂/抑制剂对照和Lipofectamine 3000 Reagent的混合液加入各孔IPEC-J2细胞中，每孔90μL，轻轻摇晃后，放置37℃、5％CO2条件下的细胞培养箱中培养，24h后收集IPEC-J2细胞沉淀。
3.总RNA提取与miRNA RT产物合成：
使用TRIzol法提取总RNA，采用riboSCRIPT Reverse Transcription Kit(500T)将总RNA反转录为miRNA RT产物，反转录时使用的ssc-miR-374b-3p茎环引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3，每10μL体系加入5μg总RNA；反转录程序为42℃60min，70℃10min。
4.荧光定量PCR：
以反转录得到的miRNA RT产物为荧光定量PCR的模板；将ssc-miR-374b-3p和内参基因U6的引物分别稀释为200nM，ssc-miR-374b-3p上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，U6上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.7，采用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit并根据说明书配置体系和设定程序(退火温度设为60℃)；根据荧光定量PCR实验的Ct值，以U6为内参基因，用2-ΔΔCt公式计算出对照组与接毒组之间ssc-miR-374b-3p的表达量变化倍数。
结果如图3所示，图3表明，转染降低ssc-miR-374b-3p表达的抑制剂后24h，IPEC-J2细胞中ssc-miR-374b-3p的表达量降低。
实施例4
增加ssc-miR-374b-3p的表达抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖
1.实验细胞培养：
将IPEC-J2细胞接种于96孔板，用含有10％体积浓度胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养至80％汇合度的细胞单层。
2.细胞转染与接毒实验：
将0.75μL终浓度为150nM的增加ssc-miR-374b-3p表达的模拟物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和模拟物对照分别加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将0.3μl Lipofectamine 3000 Reagent加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将稀释好的模拟物溶液、模拟物对照溶液分别与加入Opti-MEM的Lipofectamine 3000Reagent充分混匀，静置15min；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在96孔板的IPEC-J2细胞，接着将上述模拟物/模拟物对照和Lipofectamine 3000 Reagent的混合液加入各孔细胞中，每孔90μL，轻轻摇晃后，放置37℃、5％CO2条件下的细胞培养箱培养，24h后将PDCoV-TJ1毒株以MOI为1.0的剂量接种于IPEC-J2细胞(每孔100μL，含终体积浓度为1％的胰液素)，随后在37℃、5％CO2条件下进行培养，接毒后12h收获IPEC-J2细胞沉淀。
3.总RNA提取与cDNA产物合成：
使用TRIzol法提取总RNA，PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)将总RNA反转录为cDNA，每20μL体系加入1μg总RNA；反转录程序为30℃10min，42℃1h，99℃5min。
4.荧光定量PCR：
以反转录得到的cDNA产物为荧光定量PCR的模板；将PDCoV M基因和内参基因GAPDH的引物分别稀释为10μM，PDCoV M基因上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9，GAPDH上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11，根据TB
Figure BDA0003713284190000091
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)说明书配置体系和设定程序(退火温度设为59℃)，使用该试剂盒完成荧光定量PCR试验，根据荧光定量PCR实验的Ct值，以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt公式计算出对照组与接毒组之间PDCoV M基因的表达量变化倍数。
CGTGTGATCTATGTTATTAAAC；SEQ ID NO.8；
CAGGATATGAAGGTCAGTA；SEQ ID NO.9；
AGGAGTAAGAGCCCCTGGA；SEQ ID NO.10；
TCTGGGATGGAAACTGGAA；SEQ ID NO.11。
结果如图4所示，图4表明，在增加ssc-miR-374b-3p表达量的IPEC-J2细胞中，PDCoV M基因的表达量显著下降，表明PDCoV的增殖水平显著减少。提示增加ssc-miR-374b-3p的表达抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖。
实施例5
降低ssc-miR-374b-3p的表达促进PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖
1.实验细胞培养：
将IPEC-J2细胞接种于96孔板，用含有10％体积浓度胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养至80％汇合度的细胞单层。
2.细胞转染与接毒实验：
将0.75μL终浓度为150nM的降低ssc-miR-374b-3p表达的抑制剂(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和抑制剂对照分别加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将0.3μl Lipofectamine 3000Reagent加入5μL Opti-MEM培养基中充分混匀，静置10min；将稀释好的抑制剂溶液、抑制剂对照溶液分别与加入Opti-MEM的Lipofectamine 3000Reagent充分混匀，静置15min；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在96孔板的IPEC-J2细胞，接着将上述抑制剂/抑制剂对照和Lipofectamine 3000 Reagent的混合液加入各孔细胞中，每孔90μL，轻轻摇晃后，放置37℃、5％CO2条件下的细胞培养箱培养，24h后将PDCoV-TJ1毒株以MOI为1.0的剂量接种于IPEC-J2细胞(每孔100μL，含终体积浓度为1％胰液素)，随后在37℃、5％CO2条件下进行培养，接毒后12h收获IPEC-J2细胞沉淀。
3.总RNA提取与cDNA产物合成：
使用TRIzol法提取总RNA，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect RealTime)将总RNA反转录为cDNA，每20μL体系加入1μg总RNA；反转录程序为30℃10min，42℃1h，99℃5min。
4.荧光定量PCR：
以反转录得到的cDNA产物为荧光定量PCR的模板；将PDCoV M基因和内参基因GAPDH的引物分别稀释为10μM，PDCoV M基因上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9，GAPDH上游引物和下游引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11，根据TB
Figure BDA0003713284190000101
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)说明书配置体系和设定程序(退火温度设为59℃)，使用该试剂盒完成荧光定量PCR试验，根据荧光定量PCR实验的Ct值，以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt公式计算出对照组与接毒组之间PDCoV M基因的表达量变化倍数。
结果如图5所示，图5表明，在抑制ssc-miR-374b-3p表达的IPEC-J2细胞中，PDCoVM基因的表达量显著上升，表明PDCoV的增殖水平显著升高。提示抑制ssc-miR-374b-3p的表达促进PDCoV在IPEC-J2细胞中的增殖。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
                         序列表
<110>  天津市农业科学院
<120>  ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用
<160>  11
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  22
<212>  RNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
cuuaucaggu uguauuauca uu                                           22
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA/RNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
cugggagaag gctgttactc t                                            21
<210>  3
<211>  38
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
ggttgtggtt ggttggtttg tataccacaa ccaatgat                          38
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
aggggcttat caggttgtat t                                            21
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
gttgtggttg gttggtttgt                                              20
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
atagatctag gaggactcca gggac                                        25
<210>  7
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
ctgaattcgg gtcttctcag agg                                          23
<210>  8
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
cgtgtgatct atgttattaa ac                                           22
<210>  9
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  9
caggatatga aggtcagta                                               19
<210>  10
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  10
aggagtaaga gcccctgga                                               19
<210>  11
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  11
tctgggatgg aaactggaa                                               19

Claims (2)

1.ssc-miR-374b-3p在制备抗PDCoV增殖药物中的应用；
所述ssc-miR-374b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
2.一种抗PDCoV增殖的药物，其特征在于，包括增加ssc-miR-374b-3p表达量的物质；
所述增加ssc-miR-374b-3p表达量的物质的核苷酸序列如下：
CUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUU；SEQ ID NO.1。
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