CN111904973B - ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用 - Google Patents

ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ssc‑miR‑122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，属于抗病毒药物技术领域。本发明提供了ssc‑miR‑122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc‑miR‑122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标，为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选miRNA。

Description

ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药 物中的应用
技术领域
本发明涉及抗病毒药物技术领域，具体涉及ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。
背景技术
微小非编码RNA(miRNA)是一类长度为20～25个核苷酸(nt)的内源性小非编码RNA，是基因表达的重要调控因子，通过识别互补序列靶元素，在转录后水平通过抑制mRNA翻译或诱导mRNA降解来调控基因表达。miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生，在哺乳动物中它们可能负责调控约50％的编码基因。最近的证据表明，在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA也发挥着重要作用，参与病毒与宿主的互作。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome，PRRS)，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和生长育肥猪呼吸困难为主要特征的接触性传染病。它的病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，是一种单股正链RNA病毒，主要感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)、成熟单核细胞、小胶质细胞等抗原递呈细胞，抑制宿主抗病毒免疫反应。传统的疫苗不能有效的防控，迫切需要发展新的抗病毒策略。
发明内容
本发明的目的在于提供ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。本发明为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标，为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选miRNA。
本发明提供了ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了增加ssc-miR-122表达量的物质在制备拮抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用。试验结果表明，在PAM细胞中增加ssc-miR-122的表达量可以抑制PRRSV复制，减少该miRNA的表达量可以促进PRRSV复制。本发明为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标，为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选miRNA。
附图说明
图1为本发明提供的PAM细胞以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，24小时后提取总miRNA，实时荧光定量PCR结果。
图2为本发明提供的PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122的模拟物，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果。
图3为本发明提供的PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122抑制剂，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果。
图4为本发明提供的PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122模拟物，24小时后以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果。
图5为本发明提供的PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122抑制剂，24小时后以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果。
具体实施方式
本发明提供了ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU)。
本发明还提供了增加ssc-miR-122表达量的物质在制备拮抗猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用，所述ssc-miR-122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。感染PPRSV毒株24小时后，ssc-miR-122在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中的表达量下降。在PAM细胞中增加ssc-miR-122的表达量(ssc-miR-122模拟物，SEQ ID NO.1，UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU)可以抑制PRRSV复制，减少该miRNA的表达量(ssc-miR-122抑制剂，SEQ ID NO.2，ACAAACACCAUUGUCACACUCCA)可以促进PRRSV复制。本发明为研究拮抗PRRSV病毒复制的药物提供了新靶标，也为深入认识PRRSV感染后宿主抗病毒信号通路提供了候选miRNA。
下面结合具体实施例对本发明所述的ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)分离：选取1月龄内的PRRSV阴性健康猪，麻醉处死后无菌分离肺脏，用无菌PBS缓冲液灌洗肺脏。将收集的灌洗液400g离心10分钟后弃去上清，加入50mL PBS缓冲液重悬沉淀细胞，重复2次后收集沉淀细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，接种于12孔板，37℃温箱培养(或以1×107个细胞/mL冻存)。贴壁细胞即为PAM，培养6小时左右，更换含10％FBS的新鲜RPMI-1640完全培养基。
病毒接种：将GSWW/2015毒株(Weijie B,Zhijia W,Pu S,et al.The molecularcharacteristic analysis of PRRSV GSWW/2015 strain and its pathogenicity topigs[J].BMC Veterinary Research,2018,14(1):240，GSWW/2015毒株的NCBI登录号为：KX767091)以MOI为0.5接种于PAM细胞，同时设未接病毒Mock对照，补充含2％FBS的RPMI-1640培养基至1mL，于细胞培养箱进行培养。
总miRNA提取，第一链cDNA合成及实时荧光定量PCR：接毒后24小时收集细胞，用Qiagen miRNeasy Mini Kit提取总miRNA。采用广州易锦生物技术有限公司的All-in OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录总miRNA，每25μL体系加入500ng总miRNA；反转录程序为37℃60分钟，85℃ 5分钟；以反转录得到的cDNA为荧光定量PCR的模板；引物稀释为10μM；采用广州易锦生物技术有限公司的All-in OneTM miRNA qPCR kit并根据说明书配置体系和和设定程序；根据荧光定量PCR实验的Ct值，以U6为内参，用
Figure BDA0002602805200000031
公式计算出接毒组和对照组之间的ssc-miR-122分子表达变化倍数。如图1(PAM细胞以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，24小时后提取总miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，RT-QPCR结果显示ssc-miR-122在GSSWW/2015感染的PAM细胞中下调表达。ssc-miR-122上游引物序见SEQ ID NO.3(CTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT)，U6上游引物序列见SEQ ID NO.4(CTCGCTTCGGCAGCACA)，通用下游引物序列见SEQ ID NO.5(AACGCTTCACGAATTTGCGT)。
ssc-miR-122模拟物增加ssc-miR-122在PAM细胞中的表达。将2.5μL 100μM的ssc-miR-122模拟物和NC(阴性对照)模拟物(uuguacuacacaaaaguacug，SEQ ID NO.9，由吉玛公司合成)分别加入125μL Opti-MEM培养基中混匀，将2.5μl Lipofectamine 3000Reagent加入125μL Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5分钟；将稀释好的模拟物溶液与Lipofectamine 3000Reagent充分混匀，室温静置15分钟；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在12孔板的PAM细胞，接着将模拟物和脂质体的混合液加入各孔细胞中，最后补加745μL10％FBS RPMI-1640培养基，轻轻摇晃。最终于细胞培养箱培养，24小时后收集细胞。提取总miRNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测ssc-miR-122表达水平。如图2(PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122的模拟物，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，转染ssc-miR-122的模拟物后，ssc-miR-122的表达量增加极其显著。
ssc-miR-122抑制剂减少ssc-miR-122在PAM细胞中的表达。将1.25μL 100μM的ssc-miR-122抑制剂和NC(阴性对照)抑制剂(CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，SEQ ID NO.10由吉玛公司合成)分别加入125μL Opti-MEM培养基中混匀，将1.25μl Lipofectamine3000Reagent加入入125μL Opti-MEM培养基中混匀，室温静置5分钟；将稀释好的抑制剂溶液与Lipofectamine 3000Reagent充分混匀，室温静置15分钟；用Opti-MEM培养基润洗预先接种在12孔板的PAM细胞，接着将抑制剂和脂质体的混合液加入各孔细胞中，最后补加747.5μL 10％FBS RPMI-1640培养基，轻轻摇晃。最终于37℃恒温、5％CO2的温箱培养，24小时后收集细胞。提取总miRNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测ssc-miR-122表达水平。如图3(PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122抑制剂，24小时后提取细胞总miRNA，实时荧光定量PCR结果)所示，转染ssc-miR-122的抑制剂后，ssc-miR-122的表达量减少极其显著。
增加ssc-miR-122的表达量对PRRSV复制的影响。PAM细胞以50nM浓度转染ssc-miR-122模拟物和阴性对照模拟物，24小时后，以MOI为0.5的GSWW/2015接种细胞，24小时后收获病毒，弃上清后收集细胞，用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR036A)反转录，然后用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF6的表达量，以GAPDH为内参计算PRRSV ORF6 mRNA相对表达量。PRRSV ORF6上下游引物序列分别见序列表SEQ ID NO.6(CGGCAAATGATAACCACGC)和SEQ ID NO.7(TTCTGCCACCCAACACGAG)。如图4(PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122模拟物，24小时后以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果)所示，增加ssc-miR-122表达量的PAM细胞中，PRRSV的复制水平下降。ssc-miR-122有抑制病毒复制的功能。
减少ssc-miR-122的表达量对PRRSV复制的影响。PAM细胞以25nM浓度转染ssc-miR-122抑制剂和阴性对照抑制剂，24小时后，以MOI为0.5的GSWW/2015接种细胞，24小时后收获病毒，弃上清后收集细胞，用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR064A)绝对定量PCR测定PRRSV病毒的拷贝数，PRRSV探针序列见序列表SEQ ID NO.8(TGTGCCGTTRACCGTAGTGGAGCC)。如图5(PAM细胞中分别转染NC和ssc-miR-122抑制剂，24小时后以MOI为0.5接种GSWW/2015毒株，感染24小时后提取总RNA，实时荧光定量PCR结果)所示，减少ssc-miR-122表达的PAM细胞中，PRRSV的复制水平上升。提示ssc-miR-122有抑制病毒复制的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uggaguguga caaugguguu ugu 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaacacca uugucacacu cca 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtggagtg tgacaatggt gtttgt 26
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcaaatga taaccacgc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttctgccacc caacacgag 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgccgttr accgtagtgg agcc 24
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uuguacuaca caaaaguacu g 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims (1)

1. ssc-miR-122作为唯一活性成分在制备拮抗猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV复制的药物中的应用，所述ssc-miR-122的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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