CN102234687A - 抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体作为诊断造血系统疾病的分子标志物的用途，该miRNA或其前体包含选自SEQ ID NO：1～7中的序列。本发明还公开了上述miRNA或其前体在制备治疗造血系统疾病的药物中的用途。本发明抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体，既可作为肝癌等造血系统疾病的分子标志物，又可开发为miRNA小分子药物。

Description

抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体的应用。

背景技术

锌指蛋白作为转录调控因子活跃在基因调控领域，参与细胞发育、代谢等调控，与许多发育、代谢疾病及癌症发生息息相关。根据形成锌指结构域保守序列的不同，锌指蛋白主要分为Cys2His2、Cys4和Cys6三个亚型。其中，近几年发现的ZBTB20(Zinc finger and BTBdomain-containing protein 20)，属于经典Cys2His2型锌指蛋白分类下POK(含有BTB/POZdomain)蛋白家族，最初由德国cDNA联盟发现并克隆(GeneBank，accession numberAL050276)。2000年N.Tommerup等运用核放射及荧光原位杂交法将ZBTB20基因定位到3号染色体q13.2带上。ZBTB20与BCL-6高度同源，可能参与造血、癌症发生及免疫反应。利用ZBTB20基因敲除小鼠进行ZBTB20功能研究，发现ZBTB20作为一个关键的转录抑制子调节肝脏中甲胎蛋白AFP(肝癌重要指标之一)的表达。

microRNA(miRNA)是非编码小RNAs的一种，编码miRNA的基因首先由RNA聚合酶II转录生成初级转录本(pri-miRNA)，其发夹结构可被RNA酶III Drosha识别并剪切成为约70个核苷酸长度的发夹状前体miRNA(pre-miRNA)。前体miRNA在Exportin5的作用下从细胞核转运至细胞质中，再由另一种RNA酶11I Dicer加工处理成为长约22个核苷酸的成熟miRNA。

先前的研究均表明miRNA作为一种新的基因表达调控因子，能够通过序列特异性结合于靶基因mRNA的3’非翻译区(3’un-translated region，3’UTR)来负调控靶基因的表达，广泛参与机体内多种生理、病理过程。miRNA通过直接剪切mRNA或抑制mRNA翻译在转录后水平调节基因表达。miRNA的异常表达与恶性肿瘤发生发展过程密切相关，这一事实使越来越多的研究人员着眼于对肿瘤相关miRNA的筛选、靶基因的确定和具体作用机制的研究。预测的miRNA对其靶基因是否存在真正的调控作用还有待实验方法来证实。荧光报告载体实验是目前验证miRNA靶基因的常用方法，即将含有目的miRNA结合位点的靶基因mRNA 3’UTR片段克隆插人荧光素酶(luciferase)编码区的下游，构建荧光报告载体，有的学者用EGFP代替荧光素酶构建荧光报告分子，然后采用Western Blot的方法来检测荧光蛋白表达情况。

人类基因组总共表达约700个左右的miRNA，而锌指蛋白目前发现的Cys2His2型有700多个，假设miRNA作为一种上游的调控因子调控锌指蛋白的表达进而调控更广范围的基因的表达。但是，到目前为止，还没有出现抑制调控锌指蛋白ZBTB20表达的miRNA的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体的应用，可以作为诊断造血系统疾病如肝癌的分子标志物，同时可开发为miRNA小分子药物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种miRNA或其前体的用途，用于作为诊断造血系统疾病的分子标志物，所述miRNA或其前体包含选自SEQ ID NO：1～7中的序列。

由于有证据显示ZBTB20是肝癌指标蛋白甲胎蛋白AFP的有效转录抑制子，肝癌病人血中甲胎蛋白含量明显升高，很可能是由于ZBTB20量的减少或其活性降低造成，本发明的miRNA或其前体与ZBTB20能发生特异结合，进而对ZBTB20进行上游抑制调控。因此，可以将本发明的miRNA或其前体作为诊断造血系统疾病的分子标志物，通过检测该miRNA或其前体的异常表达来诊断造血系统疾病。

在本发明的另一方面，还提供了一种miRNA或其前体的用途，用于制备治疗造血系统疾病的药物，所述miRNA或其前体包含选自SEQ ID NO：1～7中的序列。所述药物可以施用于因miRNA异常表达引起锌指蛋白ZBTB20调节失控、进而产生的造血系统疾病如肝癌、白血病、或淋巴瘤等。

优选的，所述miRNA选自SEQ ID NO：1～7中的序列，更优选的，所述miRNA选自SEQ IDNO：1～2中的序列。

优选的，所述miRNA前体选自SEQ ID NO：8～11中的序列，更优选的，所述miRNA前体为SEQID NO：8所示序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种筛选上述miRNA或其前体的方法，包括以下步骤：

构建双荧光报告基因系统，该系统包含靶基因3’UTR载体、以及含有候选miRNA的miRNA载体，所述靶基因3’UTR载体为含有ZBTB20基因mRNA的3’UTR序列的载体；

用双荧光报告基因系统转染细胞；

检测双荧光，根据荧光数值判断荧光蛋白的表达水平，若荧光蛋白表达水平降低，则表明所述候选miRNA能与ZBTB20靶基因3’UTR结合而抑制ZBTB20基因翻译。

本发明抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体，可以作为诊断造血系统疾病如肝癌的分子标志物，同时可开发为miRNA小分子药物。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2靶基因3’UTR载体psiCHECK-2及pEZX-MT01的结构示意图；

图2是本发明实施例2的miRNA载体pEZX-MR0X的结构示意图；

图3是本发明实施例2的3’UTR载体pEZX-MT01、psiCheck-2与miRNA载体MR0X系列兼容性试验柱状图；

图4是本发明实施例2的miRNA载体pEZX-MR03aPattL的结构示意图；

图5是本发明实施例2中mir-21抑制PDCD4的3’UTR载体的柱状图；

图6是本发明实施例3筛选出的4个miRNA对ZBTB20-3’UTR的抑制效率柱状图；

图7是本发明实施例4的荧光定量PCR结果图；

图8是本发明实施例5经候选miRNAs处理的细胞内ZBTB20蛋白水平变化图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1  预测针对锌指蛋白ZBTB20的miRNAs

借助miRNA数据库miRbase和Targetscan，通过生物信息学预测出针对锌指蛋白ZBTB20的43个miRNAs(见下表1)。miRNA数据库miRbase和Targetscan的网址如下：

1)miRbase：http://www.mirbase.org/index.shtml(zbtb20相关页面：http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/detail_view.pl？transcript_id＝ENST00000357258)；

2)Targetscan：http://www.targetscan.org/(zbtb20相关页面：http://www.Targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_50/view_gene.cgi？taxid＝9606&gs＝ZBTB20&showcnc＝0&shownc＝0。

表1通过生物信息学预测的针对锌指蛋白ZBTB20的43个miRNAs

hsa-mir-30c-1	hsa-mir-203	hsa-mir-583	hsa-mir-501
				hsa-mir-186	hsa-mir-22	hsa-mir-548a-1	hsa-mir-325
hsa-miR-214	hsa-mir-142	hsa-mir-206	hsa-mir-30c-2
				hsa-mir-375	hsa-mir-634	hsa-mir-129-1	hsa-mir-7-2
hsa-mir-425	hsa-mir-199a-1	hsa-mir-7-1	hsa-mir-7-3
				hsa-mir-570	hsa-mir-515-1	hsa-mir-455	hsa-mir-548a-2
hsa-mir-302d	hsa-mir-518e	hsa-mir-146b	hsa-mir-548a-3
				hsa-mir-302a	hsa-mir-296	hsa-mir-492	hsa-mir-876
hsa-mir-302c	hsa-mir-1-1	hsa-mir-380	hsa-mir-923
				hsa-mir-302b	hsa-mir-185	hsa-mir-376a-1	hsa-mir-944
hsa-mir-582	hsa-mir-222	hsa-mir-656

实施例2  优化psiCheck-2/pEZX-MR03aPattL双荧光报告共转染系统

为了从43个预测的miRNA中筛选出对靶基因ZBTB20起有效抑制作用的miRNA，本发明构建并优化了psiCheck-2/pEZX-MR03aPattL双荧光报告共转染系统，具体实验方法如下：

(1)载体的选择与构建

采用promega公司的psiCheckTM-2载体(见图1a)和广州复能基因公司的pEZX-MT01载体(见图1b)构建靶基因3’UTR载体，在其Renila luciferase基因的终止密码子处插入预测miRNA的靶标基因ZBTB20的3’UTR。本实验室联合广州复能基因公司研发中心构建含有预测miRNA的miRNA载体pEZX-MR0X系列(见图2，pEZX-MR0X系列包括pEZX-MR01、pEZX-MR02、或pEZX-MR03，“X”在此代表1、2、或3)。在图2中，a为pEZX-MR01，b为pEZX-MR02/03。

(2)3’UTR载体pEZX-MT01、psiCheck-2与miRNA载体MR0X系列兼容性检测试验

实验分两组：第一组是3’UTR载体pEZX-MT01组，第二组是3’UTR载体psiCheckTM-2组。在第一组中又分成5个小组(A～E)，A组转染3’UTR-pEZX-MT01作为阳性对照组。B，C，D，E组均转染3’UTR-pEZX-MT01；在此基础之上，B组还转染miRNA载体pEZX-MR01的空载(图3中简称MR01)，C组还转染miRNA载体pEZX-MR01装载不相关miRNA(图3中指mir-24-2-MR01)，D组还转染miRNA载体pEZX-MR02的空载(图3中简称MR02)，E组还转染miRNA载体pEZX-MR02装载不相关miRNA(图3中指mir-24-2-MR02)。

在第二组中又分成5个小组(A’～E’)，A’组转染3’UTR-psiCheckTM-2作为阳性对照组。B’、C’、D’、E’组均转染3’UTR-psiCheckTM-2；在此基础之上，B’组还转染miRNA载体pEZX-MR01的空载(图3中简称MR01)，C’组还转染miRNA载体pEZX-MR01装载不相关miRNA(图3中指mir-24-2-MR01)，D’组还转染miRNA载体pEZX-MR02的空载(图3中简称MR02)，E’组还转染miRNA载体pEZX-MR02装载不相关miRNA(图3中指mir-24-2-MR02)。

按上述实验分组，在人体胚胎肾(HEK)293T细胞中，共转染3’UTR载体pEZX-MT01、psiCheck-2与miRNA载体MR01、MR02(空载以及装载不相关miRNA)。48小时后收细胞进行荧光活性测定。

结果如图3所示，MR01空载对pEZX-MT01、psiCheck-2均有80％左右的抑制(见图3的B和B’)。MR02和靶标3’UTR载体的相容性较好(见图3的D、E和D’、E’)。

(3)miRNA载体MR02的进一步优化实验

由于MR02的报告基因mCherry的检测不如GFP方便，继续改造载体，将MR02的报告基因mCherry替换成GFP，并将改造后的载体命名为pEZX-MR03aPattL(见图4)，同时克隆已被其他实验验证有相互作用的miR-21及其靶标PDCD4进行再次检测。按类似于实施例2的(2)中实验分组，在293T细胞中，共转染PDCD4的3’UTR载体pEZX-MT01、psiCheck-2与miRNA载体MR02、MR03aPattL、MR03(空载以及装载miR-21)。48小时后收细胞进行荧光活性测定。

结果如图5所示，表明PEZX-MT01/MR0X与psiCheck-2/MR0X一样均支持miR-21对PDCD4有抑制作用，虽然PEZX-MT01两种荧光酶表达量更接近，但psiCheck-2/MR0X系统更稳定。因此，最后选定psiCheck-2/pEZX-MR03aPattL双荧光报告系统作为筛选系统。

实施例3  双荧光素酶法对microRNA抑制效率的检测

双荧光检测实验检测的是靶标载体上的两个荧光基因表达活性，其中之一是报告基因(Reporter gene，与3’UTR偶联，若3’UTR有接受来自miRNA的抑制或激活作用，将反映在该基因的表达活性变化上)；另一个荧光基因则用作内参(由独立的启动子启动稳定表达)，内参基因的引入即是所谓的双报告基因检测系统，它的优点是减小由于转染效率、细胞状态等差异造成的实验误差。

在预测的43个miRNA的基础上，用psiCheck-2/pEZX-MR03aPattL双荧光报告系统批量筛选与锌指蛋白基因ZBTB20相互作用的miRNA。

(1)细胞培养及转染

使用MEM/DMEM+10％FBS的培养液来培养293T细胞，当细胞长到实验所需的满度时(一般为24小时)，同时细胞状态良好(在显微镜下观察后判断得到)，则可用于转染(以24well为例，其余按比例放缩)，具体步骤如下：

1)在正式转染前1小时换液，吸尽培液，再分别加入250ml的不含血清的DMEM，然后迅速放回培养箱；

2)在EP管中加入50μl不含血清的DMEM，再将所需转染质粒psiCheck-2-ZBTB20-3’UTR和包含预测miRNA或其前体的pEZX-MR03aPattL质粒(或对照、内参质粒，一般为100ng左右)加入其中，混匀；

3)在25μl不含血清的DMEM中加入1μl转染试剂Plus，混匀后加入2)中所述EP管中，混匀，静置15分钟；

4)在25μl不含血清的DMEM中加入1μl转染试剂Lipo，混匀后加入3)中所述EP管中，混匀，静置15分钟；

5)将混匀的含质粒试剂50μl均匀滴加到细胞培养盘的目标孔中(一般最少有一个复孔，以避免实验误差)，轻轻混匀，迅速放回培养室；

6)转染3小时后终止，将盘取出，吸尽培液，再加入500ml含10％血清的MEM/DMEM进行培养；

7)转染后培养48小时后，收集细胞进行底物反应并测定荧光活性。

(2)双荧光检测

双荧光检测需要在检测完萤火虫荧光素酶的荧光强度后，再检测海肾荧光素酶的荧光强度(Invitrogen公司的Dual-luciferase试剂盒)：

1)将收集的细胞用PBS漂洗一次，再吸尽；

2)每孔(24well)加入100μl的细胞裂解液，在水平摇床上摇3-4分钟；

3)用枪头转移到EP管中；

4)取出20μl的裂解液于测活板中，再在每孔中加入10μl的荧光素酶的荧光底物，迅速混匀后，测活；

5)再每孔加入10μl的Stop&Glo试剂，终止荧光素酶的荧光反应，同时开始海肾荧光反应，迅速混匀后，测活；

6)将每个样品的绿色荧光含量/红色荧光蛋白含量(GFP/RFP)，用所得数值来衡量各个样品荧光蛋白的表达水平。若预测miRNA可与靶基因ZBTB20-3’UTR结合而发挥对ZBTB20基因翻译的抑制作用，则可检测到该样品的荧光蛋白表达水平降低。

(3)结果如图6所示，以抑制率高于25％为标准，在293T细胞中，通过优化的双荧光报告系统psiCheck2～pEZX-MR03aPattL筛选出四个候选的miRNAs：Hsa-miR-296(图6a)，Hsa-miR-515-1(图6b)，Hsa-miR-518e(图6c)及Hsa-miR-375(图6d)。

筛选出的四个miRNAs的前体及成熟序列见下表2，在表2中，成熟miRNA序列中“/”分隔的两段序列表示两种不同的成熟剪切体。

表2四个miRNAs的前体及成熟序列

名称	miRNA前体(pre-miRNA)序列	成熟miRNA序列
			hsa-mir-296	AGGACCCUUCCAGAGGGCCCCCCCUCAAUCCUGUUGUGCCUAAUUCAGAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCCUGAAGGGCUCU(SEQ ID NO：8)	AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(SEQID NO：1)/GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC(SEQ ID NO：2)
hsa-mir-515-1	UCUCAUGCAGUCAUUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUGUUGUCUGAAAGCAGAGUGCCUUCUUUUGGAGCGUUACUGUUUGAGA(SEQ ID NO：9)	UUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUG(SEQID NO：3)/GAGUGCCUUCUUUUGGAGCGUU(SEQ ID NO：4)
			hsa-mir-518e	UCUCAGGCUGUGACCCUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUGUUGGCUAAAAGAAAAGAAAGCGCUUCCCUUCAGAGUGUUAACGCUUUGAGA(SEQ ID NO：10)	AAAGCGCUUCCCUUCAGAGUG(SEQID NO：5)/CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG(SEQ ID NO：6)
hsa-mir-375	CCCCGCGACGAGCCCCUCGCACAAACCGGACCUGAGCGUUUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGAGGC(SEQ IDNO：11)	UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQ ID NO：7)

实施例4  荧光定量PCR检测候选miRNAs处理细胞mRNA水平变化

外转候选miRNAs入293T细胞，终止转染48小时后，收集细胞抽提RNA进行荧光定量PCR检测。进行荧光定量PCR的引物如下：

ZBTB20F1：GAGGCTTGGGTGAATAATAGTTT(SEQ ID NO：12)；

ZBTB20R1：AGGGTTGTATTTAGAGGCCAGTAG(SEQ ID NO：13)。

采用天根的RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒、TAKARA的SYBR Premix荧光定量试剂盒分别检测锌指蛋白ZBTB20的mRNA表达水平。

结果如图7所示，表明外转入miRNAs处理的293T细胞中内源zbtb20mRNA表达水平无显著变化，这与哺乳动物中miRNAs主要通过抑制翻译而非降解抑制基因表达的理论相符合。图7中，a图为ZBTB20的扩增曲线，b图为ZBTB20的溶解曲线。

实施例5  Western Blot检测经候选miRNAs处理的细胞内ZBTB20蛋白水平变化

在Hep G2细胞中，分别外转入实施例3筛选出的四个miRNAs，并用多克隆ZBTB20抗体(来源于第二军医大学章卫平实验室)对Hep G2内源ZBTB20蛋白水平进行Western Blot检测。

结果如图8所示，Hep G2细胞主要表达81KD的ZBTB20蛋白，四个预选miRNAs中miR-296对ZBTB20蛋白表达有显著抑制作用。这一结果暗示miRNA-296最可能作为转录因子ZBTB20的上游调控子抑制其表达，为miRNA-296作为造血系统疾病的新miRNA标志物提供实验依据，同时，为开发治疗造血系统疾病的miRNA小分子药物提供实验依据。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>抑制锌指蛋白ZBTB20的miRNA或其前体的应用

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>1

agggcccccc cucaauccug u                            21

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>2

gaggguuggg uggaggcucu cc                            22

<210>3

<211>24

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>3

uucuccaaaa gaaagcacuu ucug                        24

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>4

gagugccuuc uuuuggagcg uu                            22

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>5

aaagcgcuuc ccuucagagu g                            21

<210>6

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>6

cucuagaggg aagcgcuuuc ug                                            22

<210>7

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>7

uuuguucguu cggcucgcgu ga                                            22

<210>8

<211>80

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>precursor_RNA

<222>(1)..(80)

<223>miRNA前体

<400>8

aggacccuuc cagagggccc ccccucaauc cuguugugcc uaauucagag gguugggugg    60

aggcucuccu gaagggcucu                                                80

<210>9

<211>83

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>precursor_RNA

<222>(1)..(83)

<223>miRNA前体

<400>9

ucucaugcag ucauucucca aaagaaagca cuuucuguug ucugaaagca gagugccuuc    60

uuuuggagcg uuacuguuug aga                                            83

<210>10

<211>88

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>precursor_RNA

<222>(1)..(88)

<223>miRNA前体

<400>10

ucucaggcug ugacccucua gagggaagcg cuuucuguug gcuaaaagaa aagaaagcgc    60

uucccuucag aguguuaacg cuuugaga                                       88

<210>11

<211>64

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>precursor_RNA

<222>(1)..(64)

<223>miRNA前体

<400>11

ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug    60

aggc                                                                 64

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>12

gaggcttggg tgaataatag ttt                                            23

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>13

agggttgtat ttagaggcca gtag                                          24

Claims (8)

1.一种miRNA或其前体的用途，其特征在于，用于作为诊断造血系统疾病的分子标志物，所述miRNA或其前体包含选自SEQ ID NO：1～7中的序列。

2.一种miRNA或其前体的用途，其特征在于，用于制备治疗造血系统疾病的药物，所述miRNA或其前体包含选自SEQ ID NO：1～7中的序列。

3.根据权利要求1或2所述的miRNA或其前体的用途，其特征在于，所述miRNA选自SEQID N0：1～7中的序列。

4.根据权利要求3所述的miRNA或其前体的用途，其特征在于，所述miRNA选自SEQ IDNO：1～2中的序列。

5.根据权利要求1或2所述的miRNA或其前体的用途，其特征在于，所述miRNA前体选自SEQ ID N0：8～11中的序列。

6.根据权利要求5所述的miRNA或其前体的用途，其特征在于，所述miRNA前体为SEQ IDNO：8所示序列。

7.根据权利要求1或2所述的miRNA或其前体的用途，其特征在于，所述造血系统疾病包括肝癌、白血病、或淋巴瘤。

8.一种筛选权利要求1所述miRNA或其前体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建双荧光报告基因系统，该系统包含靶基因3’UTR载体、以及含有候选miRNA的miRNA载体，所述靶基因3’UTR载体为含有ZBTB20基因mRNA的3’UTR序列的载体；

用双荧光报告基因系统转染细胞；

检测双荧光，根据荧光数值判断荧光蛋白的表达水平，若荧光蛋白表达水平降低，则表明所述候选miRNA能与ZBTB20靶基因3’UTR结合而抑制ZBTB20基因翻译。

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