CN113943734B - 抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途，涉及生物工程领域，解决现有抑制病毒复制的研究大多靶向冠状病毒入侵细胞后被宿主细胞已经翻译生成的RdRp蛋白本身，而不是抑制RdRp的翻译。本发明公开的反义寡聚核苷酸及其联合应用，可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列上的关键茎环结构，寡聚核苷酸序列选自A21，B21，E21和F21等。本发明针对冠状病毒基因组和亚基因组5’UTR进行抗病毒药物设计，是从干扰病毒侵染后多肽段非结构蛋白ORF1ab基因和病毒蛋白翻译的角度考虑，而不是等病毒蛋白大量翻译后再以病毒蛋白作为药物靶点，本发明是以最小的抗冠状病毒成本投入获得最大抗冠状病毒效益产出。

Description

抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的是涉及抗冠状病毒包括新冠病毒和GX_P2V病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途技术领域。
背景技术
目前新冠病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19已经成为本世纪以来对全球健康最为严重的威胁。新冠病毒是一种单股正链β属RNA冠状病毒，病毒遗传物质进入受体细胞后，可以被受感染细胞内核糖体翻译系统直接识别并翻译成病毒的ORF1ab编码的多肽段非结构蛋白（NSP），后随即被切割成16段非结构功能肽（NSP1-16），分别负责行使病毒基因组复制(包括RdRp)和免疫逃逸等功能。根据β属RNA冠状病毒的基因组共同结构特征，即编码ORF1ab以及后续相邻编码每个病毒结构蛋白（包括S、E、N和M蛋白）基因的终止密码子与相邻编码结构蛋白基因的起始密码子之间的序列特点（都含有ACGAAC、间隔短而且不能被核糖体直接结合开始下一个相邻蛋白的翻译）以及转录组学分析，推测病毒结构蛋白和辅助蛋白的翻译不是由完整序列的冠状病毒基因组直接指导完成，而是以冠状病毒亚基因组为模板进行（图1）。此类病毒亚基因组具有相似的5’UTR（图2，图5A和图5B），而5’UTR在病毒RNA的稳定、折叠和核糖体与病毒RNA结合以及病毒蛋白的翻译效率中起到关键作用。
新冠病毒的肆虐促使病毒作用机制、寻找药物靶点和抗冠状病毒药物开发成为非常紧迫的研究课题。当前全球正致力于寻找研发针对抑制病毒进入（Wang X, et al. Theanti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 invitro. Cell Discov. 2020. 6: 28；Wang M, et al. Remdesivir and chloroquineeffectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) invitro. Cell Res. 2020. 30(3): 269-271）、抑制病毒复制（Riva L, et al. A Large-scale Drug Repositioning Survey for SARS-CoV-2 Antivirals. bioRxiv. 2020）、借助免疫调节药物（Xu X, et al. Effective treatment of severe COVID-19 patientswith tocilizumab. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020. 117(20): 10970-10975；DiurnoF, et al. Effective treatment of severe COVID-19 patients with tocilizumab.Proc Natl Acad Sci U S A. 2020. 117(20): 10970-10975.）和免疫球蛋白治疗（DuanK, et al. Effectiveness of convalescent plasma therapy in severe COVID-19patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020. 117(17): 9490-9496；Shen C, et al.Treatment of 5 Critically Ill Patients With COVID-19 With ConvalescentPlasma. JAMA. 2020. 323(16): 1582-1589.）等关键节点作为靶点的治疗手段（图3）（Hu,B., Guo, H., Zhou, P. et al. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. NatRev Microbiol (2020). https://doi.org/10.1038/s41579-020-00459-7）。目前有多种针对COVID-19的药物正在研发，如瑞德西韦(GS-5734)、法匹拉韦 (T-705)、利巴韦林、洛匹那韦和利托那韦。除了能抑制3CLpro的洛匹那韦和利托那韦外，其他三种药物均以RdRp为靶点。FDA已发布瑞德西韦紧急使用授权，用于治疗住院的重症COVID-19患者。它也是欧洲联盟批准的用于治疗需要补充氧的成人和青少年肺炎的第一种选择。日本研发的抗病毒药物法匹拉韦(T-705)已获中国、俄罗斯和印度批准用于COVID-19的治疗。我国的一项临床研究显示，法匹拉韦显著降低了患者胸部症状，缩短了病毒清除的时间。目前还没有有效证据证实洛匹那韦和利托那韦在治疗COVID-19方面有好的临床表现（Hu, B., Guo, H., Zhou,P. et al. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol(2020). https://doi.org/10.1038/s41579-020-00459-7）。
以往药物靶点主要集中在抑制病毒进入、抑制病毒复制、免疫调节药物和免疫球蛋白治疗等方面。病毒进入细胞是通过抑制病毒S蛋白与表达ACEII的受体细胞结合或者通过胞吞机制，病毒复制依赖于由病毒基因组翻译产生的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。因为只要有ACEII阳性细胞和胞吞现象存在，病毒进入细胞就无法避免；抑制病毒复制的研究大多靶向RdRp蛋白本身，而不是抑制RdRp的生成。另外免疫调节药物和免疫球蛋白治疗是被动免疫， 特异性和疗效都非常有限。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述抑制病毒复制的研究大多靶向冠状病毒入侵细胞后被宿主细胞已经翻译生成的RdRp蛋白本身，而不是抑制RdRp的翻译，此外现有技术是被动免疫，特异性和疗效都非常有限的问题，本发明提供抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
反义寡聚核苷酸，可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列关键茎环结构，所述寡聚核苷酸序列选自：
A21：GGGAAGGUAUAAACCUUUAAU，
B21：UUUAGAGAACAGAUCUACAAG，
E21：AAACCGUAAGCAGUCUGCAGA，
F21：UUUCGGUCACACCCGGACAAA，
A21’：GGGAAGGTATAAACCTTTAAT，
B21’：TTTAGAGAACAGATCTACAAG，
E21’：AAACCGTAAGCAGTCTGCAGA，
F21’：TTTCGGTCACACCCGGACAAA中的一种或多种。
其中，反义寡聚核苷酸RNA，可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列关键茎环结构，所述寡聚核苷酸RNA序列选自：
A21：GGGAAGGUAUAAACCUUUAAU；
B21：UUUAGAGAACAGAUCUACAAG；
E21：AAACCGUAAGCAGUCUGCAGA；
F21：UUUCGGUCACACCCGGACAAA。
另外，反义寡聚核苷酸DNA，可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列关键茎环结构，所述寡核苷酸序列DNA序列选自：
A21’：GGGAAGGTATAAACCTTTAAT;
B21’：TTTAGAGAACAGATCTACAAG;
E21’：AAACCGTAAGCAGTCTGCAGA;
F21’：TTTCGGTCACACCCGGACAAA。
本申请的技术方案中，设计的ASO是与部分茎环结构及其临近周围序列互补的寡核苷酸序列，长度在16-55nt。针对冠状病毒5’UTR中的茎环结构，设计了一系列反义寡核苷酸（ASO）以干预茎环结构的形成，同时验证了多种ASO的组合可以减少冠状病毒GX_P2V颗粒的产生；设计的ASO以碱基互补配对原则，特异性结合冠状病毒基因组或亚基因组5’UTR中的IRES特定序列，达到抑制病毒蛋白翻译的功能。从控制冠状病毒基因组和亚基因组翻译的角度，从病毒进入细胞暴露裸露的病毒基因组利用受感染细胞核糖体翻译体系翻译出多肽段非结构蛋白ORF1ab (NSP1-16)开始抑制RdRp的形成，同时抑制病毒亚基因组编码的结构蛋白和辅助蛋白的翻译，从而降低病毒结构蛋白的产生和病毒颗粒的组装。
本发明公开的反义寡聚核苷酸及其联合应用，可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列上的关键茎环结构，寡聚核苷酸序列选自A21，B21，E21，F21，A21’， B21’， E21’，F21’中的一种或多种；本发明是针对冠状病毒基因组和亚基因组5’UTR进行抗病毒药物设计，是从干扰病毒侵染后多肽段非结构蛋白ORF1ab基因和病毒蛋白翻译的角度考虑，而不是等病毒蛋白大量翻译后再以病毒蛋白作为药物靶点，本发明是以最小的抗冠状病毒成本投入获得最大抗冠状病毒效益产出。
进一步的，含反义寡聚核苷酸序列及可药用载体的药物组合物。
进一步的，反义寡聚核苷酸用于制备抗冠状病毒药物的用途。
进一步的，对所述的反义寡聚核苷酸RNA序列
(A21：GGGAAGGUAUAAACCUUUAAU；
B21：UUUAGAGAACAGAUCUACAAG;
E21：AAACCGUAAGCAGUCUGCAGA；
F21：UUUCGGUCACACCCGGACAAA）的5’或/和3’方向延伸或缩短，获得15-60nt序列。
进一步的，对所述的反义寡聚核苷酸DNA序列
(A21’：GGGAAGGTATAAACCTTTAAT
B21’：TTTAGAGAACAGATCTACAAG
E21’：AAACCGTAAGCAGTCTGCAGA
F21’：TTTCGGTCACACCCGGACAAA。
）的5’或/和3’方向延伸或缩短，获得15-60nt序列。
进一步的，含获得15-60nt序列及可药用载体的药物组合物。
进一步的，获得15-60nt序列用于制备抗冠状病毒药物的用途。
进一步的，IRES序列关键茎环结构的确定方法，包括如下步骤：
步骤1、针对冠状病毒GX_P2V基因组 5’UTR中的11个茎环结构，分别构建相应的质粒，以分析IRES序列的关键位置；
步骤2、将构建的携带有报告基因GFP的质粒，分别转染到HEK293T或VERO E6细胞中，在二氧化碳培养箱中培养后，以GFP为报告基因，利用荧光显微镜获取图像和/或做蛋白电泳获取图像；
步骤3、根据质粒中报告基因表达的强度与含5’UTR全长序列的对照序列质粒中该报告基因的表达水平差异，确定IRES序列关键茎环结构。
进一步的，冠状病毒包括GX_P2V或SARS-CoV-2。
本发明利用了通过报告基因寻找IRES关键茎环结构的方法：即利用构建含IRES驱动的报告基因质粒通过改变β冠状病毒基因组和亚基因组中5’UTR的茎环结构的区域，通过IRES驱动的报告基因表达量的变化来确定IRES的关键区域；利用体外重建茎环结构，设计靶向茎环结构的ASO，以此进行体外验证所设计的ASO对重建的茎环结构的影响进行评估。
本发明的有益效果如下：
1. 本发明首次证实了冠状病毒基因组和亚基因组5’UTR具有IRES功能，并找出了决定IRES功能的关键茎环结构；
2. 对β冠状病毒基因组5’UTR介导的非结构蛋白翻译抑制作用最强的ASO组合ABF是靶向SL1，SL2-3和SL9的ASO联用 ，即ASO A21、ASO B21和ASO F21联合使用或ASO A21’、ASO B21’和ASO F21’联合使用；
3. 对β冠状病毒亚基因组5’UTR介导的结构蛋白和辅助蛋白翻译抑制作用最强的ASO组合AB是靶向SL1-2-3的ASO联用，即ASO A21和ASO B21 联合使用或ASO A21’和ASOB21’联合使用。
4. 本发明针对茎环结构关键区设计出有效地解茎环用反义寡核苷酸ASO，可以将冠状病毒GX-P2V抑制80%以上；
5. 本发明通过抑制病毒基因组指导的多肽段非结构蛋白（NSPs）翻译和亚基因组指导的结构蛋白和辅助蛋白翻译为切入点，寻找调控病毒翻译的5’UTR关键环节以开发相应的病毒干预策略，从病毒进入受感染细胞后暴露出病毒基因组的初期就开始早期干扰病毒翻译和复制；
6. 本发明是针对冠状病毒基因组和亚基因组的5’UTR进行抗病毒药物设计，是从抑制病毒侵染细胞后的初期多肽段非结构蛋白ORF1ab的翻译、病毒基因组复制和病毒结构蛋白和辅助蛋白翻译的角度入手考虑，而不是等病毒蛋白大量翻译以后再针对病毒蛋白作为药物靶点进行干预，本发明是以最小的抗病毒成本投入获得最大抗病毒效益产出。
本申请的技术方案中，Free energy of secondary structure:-77.20 kcal/mol表示二级结构的自由能：每摩尔分子二级结构的自由能为-77.20千卡。
附图说明
图1是SARS-CoV-2基因组和亚基因组示意图；
图2是冠状病毒GX_P2V与SARS相关的三种β冠状病毒SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS中5’UTR 的序列比较图；
图3是SARS-CoV-2的复制及其它潜在治疗靶点图；
图4是冠状病毒基因组5’UTR序列具有IRES功能的附图；
图5为冠状病毒GX_P2V基因组5’UTR的二级结构（A），新冠病毒SARS-CoV-2基因组5’UTR的二级结构（B）及根据GX_P2V基因组5’UTR序列构建的质粒示意图；
图6 为含有不同长度5’UTR对报告基因GFP表达水平的荧光显微镜和蛋白电泳图；
图7为靶向冠状病毒GX_P2V基因组和亚基因组5’UTR各茎环结构的ASO RNA序列设计图；
图8为反义寡核苷酸ASO RNA序列对体外重建的茎环结构的解茎环作用图；
图9为靶向冠状病毒5’UTR茎环结构的反义寡核苷酸链ASO RNA对编码病毒复制相关蛋白RdRp和病毒结构蛋白E基因表达的影响图。
图10 为靶向冠状病毒GX_P2V基因组和亚基因组5’UTR各茎环结构的ASO DNA序列设计图；
图11为反义寡核苷酸ASO DNA 对体外重建的茎环结构的解茎环作用图；图12为靶向冠状病毒5’UTR茎环结构的反义寡核苷酸链ASO DNA对编码病毒复制相关蛋白RdRp和病毒结构蛋白E基因表达的影响图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图4所示，本实施例确定冠状病毒GX_P2V基因组的5’UTR具有IRES功能：
根据对新冠病毒和其它冠状病毒基因组和亚基因组序列的分析，推测SARS-CoV-2的5’UTR可能具有IRES的功能。本发明采用与SARS-CoV-2序列高度相似的GX_P2V基因组5’UTR来开展实验研究。二者的5’UTR序列比较和二级结构比较分别如图2和图5（A和B）所示。本发明构建使用了两种质粒，其中质粒PIG (Puromycin_IRES_Green fluorescentprotein)中的IRES（采用已知脑心肌病毒EMCV的IRES）作为阳性对照（Bochkov YA andPalmenberg AC. Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectorsis dependent upon IRES sequence and gene location. Biotechniques. 2006. 41(3): 283-4, 286, 288 passim.）；在另外一个质粒5’Pig中，用冠状病毒GX_P2V的5’UTR的全长（265nt）替代了PIG质粒中EMCV的IRES位于puromycin（嘌呤霉素）和GFP两个报告基团之间（图4A），并由金斯瑞公司构建的该质粒，命名为5’Pig。在质粒PIG中，由于嘌呤霉素抗性基因（PuroR）3’末端有终止密码子，但因为有EMCV的IRES序列存在，被转染细胞（宿主细胞）中的核糖体依然可以结合IRES并启动质粒PIG所携带GFP基因的表达。在质粒5’Pig中，如果GX_P2V病毒基因组5’UTR不具有IRES功能，则GFP基因不会被表达。蛋白电泳和荧光显微镜的检测结果显示，含有脑心肌病毒IRES的质粒和冠状病毒的5’UTR质粒转染到HEK293T细胞都可以表现出GFP的表达（图4B和图4C），表明GX_P2V 基因组的5’UTR含有具备IRES功能的序列，而且从GFP的表达水平来看，该冠状病毒基因组5’UTR的IRES功能更强于阳性对照EMCV的IRES功能。
图4中，A为质粒PIG和5’Pig结构示意图。质粒PIG中的IRES是指已知脑心肌病毒EMCV的IRES序列。质粒5’Pig中5’UTR是冠状病毒GX_P2V的5’UTR序列（全长265nt）； B为蛋白电泳分析质粒PIG和5’Pig在HEK293T细胞中GFP表达的情况；C为荧光图像显示质粒PIG和5’Pig在HEK293T细胞中的GFP表达的情况。
实施例2
如图1，图5和图6所示，本实施例确定GX_P2V基因组5’UTR中IRES序列关键茎环结构：
每个冠状病毒的亚基因组RNA都包含共同的5’前导序列，该序列由约70个核苷酸(“头”)与亚基因组下游的编码病毒结构蛋白或辅助蛋白mRNA序列（“体”）融合(Lai和Stohlman，1981；Sola等人2015年)。根据流行的模型，在负链合成过程中，头体融合发生在称为转录调节序列(TRSS)的短基序中，这些短基序位于ORF附近。TRSS含有一个被可变序列包围的保守的6-7nt核心序列(CS)“ACGAAC”。在负链合成过程中，RdRp在穿过“体(body)”部的TRS(TRS-B)时暂停，并将模板切换到“前导(leader)”TRS(TRS-L)，这导致转录不连续，导致前导-小体融合。由融合的负链中间产物转录出正链mRNAs，即编码结构蛋白和辅助蛋白的亚基因组（图1）。
为了确定GX_P2V 5’UTR中发挥IRES功能的关键区域，针对GX_P2V病毒基因组5’UTR (图5A)和SARS-CoV-2 病毒基因组5’UTR（图5B）中的茎环结构（其中6个茎环结构较为明显），构建了相应的质粒（图5C）以分析IRES序列的关键位置。将构建的质粒，分别转染到HEK293T细胞中，在二氧化碳培养箱中培养16h后，利用荧光显微镜采集报告基因GFP表达的荧光图像。结果显示，相比于冠状病毒GX_P2V全长5’UTR对照组，质粒C228（去掉5’UTR末端的两个茎环结构）几乎不表达GFP蛋白（图6），而G188质粒（去除5’UTR末端的三个茎环结构）有GFP蛋白的高表达。继续截短5’UTR序列至C85位置，GFP荧光又再次减弱。冠状病毒GX_P2V亚基因组的5’UTR中含有共同的序列（1-71nt）和保守序列ACGAAC。如图6所示，质粒T77（1-77nt）和G62都能够引起报告基因GFP高表达，继续缩短5’UTR至G46和G7的位置，GFP表达越来越弱，甚至无法检测到。故此，以GFP为报告基因的荧光图像结果和蛋白电泳结果都表明，GX_P2V基因组5’UTR（1-265nt）和亚基因组5’UTR（1-77nt）都含有IRES的功能序列。
在GX_P2V基因组5’UTR的IRES功能序列（驱动ORF1ab的翻译）中有11个茎环结构，其中5’UTR的末端的两个茎环结构（A229-G265）促进蛋白翻译，G188以后的三个茎环结构可能协同作用抑制了蛋白翻译，C85以后的茎环结构在控制GX_P2V基因组的IRES功能中也起到非常重要的作用。
在GX_P2V亚基因组5’UTR的IRES功能序列中（1-77nt）（驱动S蛋白等病毒蛋白和辅助蛋白的翻译）存在三个茎环结构，其中第三个茎环结构（G62-C76）的去除，相比于亚基因组5’UTR的驱动的蛋白表达有轻微影响，而第一个茎环结构(G7-C34)和第二个茎环结构（G46-C60）对冠状病毒亚基因组5’UTR的IRES功能起到决定性作用。
图5中，A. 冠状病毒GX_P2V基因组5’UTR二级结构示意图，图中G7、G46、G62、T77、C85、G188和C228是指5’UTR中从该位点以后的5’UTR序列被删除。B. 新冠病毒SARS-CoV-2基因组5’UTR二级结构示意图，图中主要茎环结构与GX-P2V基因组的5’UTR中二级结构非常相似。C. 报告基因质粒的结构图。所有质粒都采用PGK1作为启动子驱动PuroR和EGFP的转录，在PuroR 和EGFP基因之间插入不同长度的来自GX_P2V 5’UTR的序列，其中，CC是全长的5’UTR作为阳性对照。
图6表示不同长度5’UTR对其下游基因表达的影响。将图5B中构建的质粒分别转染至HEK293T细胞，通过荧光显微镜和蛋白电泳分析比较含有不同长度5’UTR对报告基因GFP表达水平的影响。β-actin是加样对照。
实施例3
如图7和图8所示，靶向冠状病毒GX_P2V基因组和亚基因组5’UTR的ASO设计及体外验证。
通过上述分析比较证实了冠状病毒GX_P2V的基因组和亚基因组5’UTR都具有IRES的功能，并且不同的茎环结构（SL1-9）（图7A）在驱动蛋白质翻译过程中起到不同的作用。接下来，对5’UTR的部分茎环结构进行拆分和体外构建，如图7B。
为了通过打开破坏基因组和亚基因组5’UTR中关键茎环结构从而影响达到抑制冠状病毒非结构蛋白、病毒蛋白和辅助蛋白的目的，根据预测的GX_P2V基因组和亚基因组RNA（或DNA）二级结构并设计了针对这些茎环结构的一系列ASO（长度为21nt左右）（表1和表2）。防守链为RNA的反应中所用随机ASO RNA对照选自PURO基因，长度为21nt，其序列为UGCAAGAACUCU UCCUCACGC。
表1. 进攻链（ASO）和防守链（ASO靶向GX_P2V基因组或亚基因组5’UTR的茎环结构）的RNA序列表
表2. 进攻链（ASO）和防守链（ASO靶向GX_P2V基因组或亚基因组5’UTR的茎环结构）的DNA序列表
为了验证所设计的ASO 是否能够破坏对应的茎环结构，以ASO 作为进攻链，以体外重建的DNA(或RNA）茎环结构作为防守链进行了体外实验。首先将合成的防守链经95°C变性后再逐渐复性，在体外分别重建防守链SL1、SL2-3、SL8和SL9，以分别模拟G7附近的茎环结构 SL1；G46附近的茎环结构SL2和SL3，亚基因组5’UTR T77 (1-77nt)的茎环结构SL1、SL2和SL3；G188附近的茎环结构 SL8和C228附近的茎环结构SL9。复性的防守链与进攻链(ASO)及其组合在37°C孵育2小时，进攻链与防守链的混合物经native-page 胶分析，以鉴定进攻链对防守链的解茎环结构作用。
由于防守链体外模拟形成茎环结构使其在native-page电泳中的运动速度较快，当防守链被设计的进攻链ASO能够有效干扰并发生解茎环作用时，防守链的茎环结构被破坏，电泳速度明显减慢（如图8A-D所示，实验组A21(G7-P)、B21（G46-P）、E21(G188-P)和F21（C228-P）在对应茎环结构的对应防守链位置（G7-BP，G46-BP，G188-BP和C228-BP）上没有条带或仅有少量条带出现，即茎环结构被完全或部分打开。在图8E中，冠状病毒亚基因组5’UTR(T77)中三个茎环结构（SL1、SL3和SL3）的存在导致防守链T77-BP在native-page电泳中的运动速度最快，随着进攻链的A21(见图8E，T77-P1)或B21（见图8E,T77-P2）分别进攻T77茎环结构时，都会使其有不同程度的解茎环作用，体现为电泳中的移动速度减慢。当两个进攻链A21和B21同时攻击时，T77中的三个茎环结构同时受到攻击而完全破坏，表现为在电泳中的移动速度最慢(图8E，T77-P3）。 总之，通过体外实验表明，所设计的ASO可以有效而且特异性靶向并解开对应的冠状病毒基因组或亚基因组5’UTR中的茎环结构。
图7A以图形展示了冠状病毒GX_P2V基因组5’UTR (1-265nt)和亚基因组5’UTR(1-77nt)序列中的茎环结构。 图7B显示了体外重建的茎环结构（防守链）和作为进攻链的互补反义寡核苷酸链ASO RNA。进攻链可以与对应的防守链上的互补核苷酸形成共价结合，破坏其茎环结构。
图8A 展示进攻链ASO RNA A21对防守链SL1（模拟G7附近的茎环结构SL1：G7-C34）的解茎环作用。图中G7-P表示防守链G7：进攻链A21以1：2反应；G7-N表示防守链G7：阴性对照链PC1以1：2反应；G7-BP为只含防守链G7；G7-BA为只含进攻链A21;G7-BN为只含阴性对照链PC1；图8B显示攻链ASO RNA B21对防守链SL2-3(模拟G46附近的茎环结构SL2和SL3：A40-C76）的解茎环作用,图中G46-P表示防守链G46：进攻链B21以1：2反应；G46-N表示防守链G46：阴性对照链PC1以1：2反应；G46-BP为只含防守链G46；G46-BA为只含进攻链B21;G7-BN为只含阴性对照链PC1；图8C和D分别展示了进攻链ASO E21对防守链SL8(模拟G188附近的茎环结构SL8：C176-C218)，以及进攻链ASO RNA F21对防守链SL9(模拟C228附近的茎环结构SL9：C222-T262)的解茎环作用。图中G188-P表示防守链G188：进攻链E21以1：2反应；G188-N表示防守链G188：阴性对照链PC1以1：2反应；G188-BP为只含防守链G188；G188-BA为只含进攻链E21;G188-BN为只含阴性对照链PC1；图中C228-P表示防守链C228：进攻链F21以1：2反应；C228-N表示防守链C228：阴性对照链PC1以1：2反应；C228-BP为只含防守链C228；C228-BA为只含进攻链F21;C228-BN为只含阴性对照链PC1；图8E 展示进攻链ASO RNA A21和B21对防守链SL1-SL2-SL3（模拟冠状病毒亚基因组5’UTR的三个茎环结构）的解茎环作用。图中U77-P1表示防守链U77：进攻链A21以1：2反应； U77-P2表示防守链U77：进攻链B21以1：2反应； U77-P3表示防守链U77与（进攻链A21+进攻链B21）反应，其中防守链：进攻链以1：2反应； U77-N表示防守链U77：阴性对照链PC1以1：2反应；U77-BP为只含防守链U77；U77-BA1为只含进攻链A21; U77-BA2为只含进攻链B21; U77-BA3为只含进攻链A21和B21; U77-BA为只含阴性对照链PC1。
实施例4
如图9所示，冠状病毒GX_P2V侵染细胞实验及ASO RNA及其组合使用 的保护作用
为了验证设计的ASO RNA的抗冠状病毒作用效果，将针对冠状病毒5’UTR不同区域茎环结构的反义寡核苷酸ASO RNA及其组合（A、B、E、F、AB、AF、EF、ABE、ABF和ABEF等）分别预处理Vero 细胞2小时 （其中ASO A、B、E和F的终浓度分别为100 nM、200nM、100nM和200nM），再用GX_P2V(MOI=0.01)感染ASO预处理的Vero细胞（GX_P2V感染未经ASO RNA预处理的Vero细胞作为阳性对照，PC）。细胞染毒48h后，对细胞进行裂解，收集核酸样品，用荧光定量反转录PCR检测编码病毒蛋白的基因表达水平，验证各ASO RNA 及其组合对病毒生成影响。 如图9所示，虽然各ASO RNA 单独使用不能抑制病毒功能非结构蛋白和结构蛋白的产生，但组合使用寡核苷酸A和B（AB组），以及组合使用A、B和F（ABF组）对病毒的产生有非常明显的抑制作用。其中，相比于阳性对照组（PC组），ASO RNA A和B联合使用（AB组）可将GX_P2V冠状病毒E蛋白和RdRp蛋白的生成分别降低60%和80%，而联合使用A、B和F（ABF组）可以使E蛋白和RdRp蛋白抑制在20%以下。
图9A和图9B分别显示了ASO RNA 对编码病毒非结构蛋白RdRp和对编码病毒结构蛋白E基因表达的影响。Vero细胞经不同ASO RNA及其组合分别预处理 2小时后染毒GX_P2V。未经ASO RNA 预处理的PC组为阳性对照组。
实施例5
冠状病毒GX_P2V侵染细胞实验及ASO DNA及其组合使用的保护作用。实施例4证明了ASO RNA及其组合对冠状病毒侵染的保护作用。为了证明ASO DNA同样可以发挥类似作用，发明人采用了相同的研究模式，将ASO RNA序列换成ASO DNA序列（表2），首先测试了ASODNA对对应的茎环结构的破坏作用。图10显示了体外重建的茎环结构（防守链）和作为进攻链的互补反义寡核苷酸链ASO DNA。进攻链可以与对应的防守链上的互补核苷酸形成共价结合，破坏其茎环结构。
图11 G7展示进攻链ASO DNA A21’对防守链SL1（模拟G7附近的茎环结构SL1：G7-C34）的解茎环作用。图中G7-P表示防守链G7：进攻链A21’以1：1反应；G7-N表示防守链G7：阴性对照链B21’以1：1反应；G7-BP为只含防守链G7；G7-BA为只含进攻链A21’;G7-BN为只含阴性对照链B21’。
图11 G46显示攻链ASO DNA B21’对防守链SL2-3(模拟G46附近的茎环结构SL2和SL3：A40-C76）的解茎环作用。图中G46-P表示防守链G46：进攻链B21’以1：2反应；G46-N表示防守链G46：阴性对照链A21’以1：2反应；G46-BP为只含防守链G46；G7-BA为只含进攻链B21;G46-BA为只含阴性对照链A21’。
图11 G188和图11 C228分别展示了进攻链ASO DNA E21’对防守链SL8(模拟G188附近的茎环结构SL8：C176-C218)，以及进攻链ASO DNA F21对防守链SL9(模拟C228附近的茎环结构SL9：C222-T262)的解茎环作用；图中G188-P表示防守链G188：进攻链E21’以1：1反应；G188-N表示防守链G188：阴性对照链F21’以1：1反应；G188-BP为只含防守链G188；G188-BA为只含进攻链E21;G188-BN为只含阴性对照链F21’；C228-P表示防守链C228：进攻链F21’以1：2反应；C228-N表示防守链C228：阴性对照链E21’以1：2反应；C228-BP为只含防守链C228；C228-BA为只含进攻链F21’;C228-BN为只含阴性对照链E21’。
图11 T77展示进攻链ASO DNA A21’和B21’对防守链SL1-SL2-SL3（模拟冠状病毒亚基因组5’UTR的三个茎环结构）的解茎环作用。图中T77-P1表示防守链T77：进攻链A21’以1：1反应； T77-P2表示防守链T77：进攻链B21’以1：2反应； T77-P3表示防守链T77与（进攻链A21’+进攻链B21’）反应，其中T77：A21’=1：1,T77：B21’=1：2； T77-N表示防守链T77：阴性对照链E21’以1：1反应；T77-BP为只含防守链T77；T77-BA1为只含进攻链A21’; T77-BA2为只含进攻链B21’; T77-BA3为只含进攻链A21’和B21’; G77-BN为只含阴性对照链E21’。
图12分别显示了在Vero 细胞内ASO DNA对编码病毒非结构蛋白RdRp和对编码病毒结构蛋白E基因表达的影响。 为了验证设计的ASO DNA及其相应组合使用抗冠状病毒作用效果，将针对冠状病毒5’UTR不同区域茎环结构的反义寡核苷酸ASO DNA及其组合（A、B、E、F、AB、AF、EF、ABE、ABF和ABEF等）分别预处理Vero 细胞2小时 （其中ASO A、B、E和F的终浓度分别为100 nM、200nM、100nM和200nM），再用GX_P2V(MOI=0.01)感染ASO DNA预处理的Vero细胞（GX_P2V感染未经ASO RNA预处理的Vero细胞作为阳性对照，PC）。细胞染毒48h后，对细胞进行裂解，收集核酸样品，用荧光定量反转录PCR检测编码病毒蛋白的基因表达水平，验证各ASO DNA 及其组合对病毒生成影响。如图12所示，虽然各ASO DNA 单独使用不能抑制病毒功能非结构蛋白和结构蛋白的产生，但组合使用寡核苷酸A和B（AB组），以及组合使用A、B和F（ABF组）对病毒的产生有非常明显的抑制作用。其中，相比于阳性对照组（PC组），ASO DNAA和B联合使用（AB组）可将GX_P2V冠状病毒E蛋白和RdRp蛋白的生成分别降低60%和80%，而联合使用A、B和F（ABF组）可以使E蛋白和RdRp蛋白抑制在20%以下。
序列表
<120>抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途
<160>8
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gggaagguau aaaccuuuaa u21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
uuuagagaac agaucuacaa g21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
aaaccguaag cagucugcag a21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
uuucggucac acccggacaa a21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gggaaggtat aaacctttaa t21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
tttagagaac agatctacaa g21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
aaaccgtaag cagtctgcag a21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
tttcggtcac acccggacaa a21。
序列表
<110> 安文林
<120> 抗冠状病毒的反义寡聚核苷酸及其制药用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaagguau aaaccuuuaa u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuuagagaac agaucuacaa g 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaccguaag cagucugcag a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uuucggucac acccggacaa a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaaggtat aaacctttaa t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttagagaac agatctacaa g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaccgtaag cagtctgcag a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttcggtcac acccggacaa a 21

Claims (4)

1.反义寡聚核苷酸，其特征在于：可特异性地结合冠状病毒5’UTR中IRES序列关键茎环结构，所述反义寡聚核苷酸选自A21B21、A21’B21’、A21B21F21及A21’B21’F21’组合中的一种或多种；
其中：
A21：GGGAAGGUAUAAACCUUUAAU，
B21：UUUAGAGAACAGAUCUACAAG，
F21：UUUCGGUCACACCCGGACAAA，
A21’：GGGAAGGTATAAACCTTTAAT，
B21’：TTTAGAGAACAGATCTACAAG，
F21’：TTTCGGTCACACCCGGACAAA；
所述冠状病毒包括GX_P2V或SARS-CoV-2。
2.含权利要求1中的反义寡聚核苷酸及可药用载体的药物组合物。
3.权利要求1中的反义寡聚核苷酸用于制备抗冠状病毒药物的用途。
4.根据权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于：IRES序列关键茎环结构的确定方法，包括如下步骤：
步骤1、针对冠状病毒基因组5’UTR中的茎环结构，分别构建相应的质粒；
步骤2、将构建的携带有报告基因GFP的质粒，分别转染到HEK293T或VEROE6细胞中，在二氧化碳培养箱中培养后，以GFP为报告基因，利用荧光显微镜获取图像和/或做蛋白电泳获取图像；
步骤3、根据质粒中报告基因表达的强度与含5’UTR全长序列的对照序列质粒中该报告基因的表达水平差异，确定IRES序列中关键茎环结构。
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