KR102358280B1 - B형 간염 바이러스(hbv) 감염 처리용 시약 및 그 용도 - Google Patents

B형 간염 바이러스(hbv) 감염 처리용 시약 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 치료용 RNA 간섭 (RNAi) 시약, 이를 포함하는 조성물, 및 HBV로 감염된 개인을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 상기 시약은 단독으로 또는 추가적인 shmiRNA 또는 shRNA와 조합하여 사용되는 인공 miRNA (shmiRNA)이다.

Description

B형 간염 바이러스(HBV) 감염 처리용 시약 및 그 용도
본 출원은 2016. 5. 5.일자로 출원된 미국 가출원 제62/332,245호에 우선권을 주장하며 그것의 전체 내용은 여기에 참조로서 통합된다.
본 개시는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 감염을 처리하기 위한 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi) 시약, 이를 포함하는 조성물, 및 HBV로 감염된 개인을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계 수백만의 사람에게 영향을 미치는 심각하고도 흔한 감염성 간 질환이다. HBV는 헤파드나비이러스과(Hepadnaviridae)에 속하는 간친화성 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 전체길이는 약 3.2kb이고, 표면 항원 ("S 유전자"), 코어 항원 ("C 유전자"), DNA 중합효소 ("P 유전자") 및 "X 유전자"로서 칭하는 미확인된 기능의 유전자를 내포하는 네개의 해독틀들(open reading frames, ORFs)을 가지고 있다. 전세계적으로 20억 이상의 사람들이 그들 생애에 한 때 HBV에 감염되었고 이들 중 약 3.5~4억은 만성적으로 감염된 채로 바이러스의 보균자이다. HBV 감염은 급성 및 만성 B형 간염을 유발할 수 있으며, 결국에는 만성적인 간 부전(hepatic insufficiency), 간경변(cirrhosis), 및 간세포암(hepatocellular carcinoma)의 발병에 이를 수 있다. 게다가 HBV는 보균자는 여러 해동안 그 질환을 전염시킬 수 있다. 만성적인 HBV 감염을 가진 사람, 즉 보균자는 비보균자보다 간세포암 발병의 위험성이 12배 이상 높으며, HBV는 세계적으로 주요 간암의 60-80%를 유발한다. 결과적으로 HBV는 알려진 인간 발암인자중 오직 담배에 이어 두번째로 순위에 올라있다.
비록 HBV에 대한 백신이 사용가능하지만 인구 중 HBV 감염률은 높은 상태이다. 더욱이 만성 HBV 감염에 대한 최근의 치료법은 만성적으로 감염된 환자 대다수에서 바이러스 유전자 발현 및 복제에 대한 제한적 저해 효과만을 가질 뿐이다. 만성 HBV 감염에 대한 기존의 치료법 중 또 다른 한계는 약물에 대한 바이러스 내성의 출현이다.
이러한 이유로 HBV 감염을 처리하기 위한 새로운 치료제에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시는 예를 들어 치료법에 대한 바이러스 내성의 발생 및/또는 HBV 유전형(genotypes) 간에 치료법에 대한 반응성의 차이 때문에, 장기 치료가 필요한 경우와 같이 HBV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 기존의 백신 및 치료제가 그 효능이 제한적이라는 인식에 부분적으로 기초하고 있다. 본 개시는 HBV 게놈에 의해 생산되는 RNA 전사체의 보존된 영역, 즉 HBV의 상이한 유전형들 간에 보존되는 영역을 표적하는 하나 이상의 짧은 헤어핀 micro-RNAs (shmiR들)를 발현하는 DNA-유도 RNA 간섭 (DNA-directed RNA interference, ddRNAi) 구조체(constuct)들을 제공한다. 본 개시의 예시적 shmiR들은 활성 HBV를 품고있는 HepG2.2.15 세포에서 HBV 유전자 전사체의 발현을 저해하거나 감소시킬 수 있는 효과기 서열을 포함한다. 본 개시의 예시적 shmiR들은 HBV로 감염된 PXB 키메라 마우스에서 HBV 유전자 전사체의 발현을 억제하거나 감소시킬 수 있고, 세포내 및 세포외 HBV DNA를 감소시킬 수 있고, HBV 공유결합으로 닫힌 원형 DNA(covalently-closed circular DNA, cccDNA)를 감소시킬 수 있는 효과기 서열을 포함한다. 따라서 본 발명자들은 HBV에 의한 핵산의 발현 및/또는 발현되는 단백질을 저해하거나 감소시키는 신규한 화합물 및 그러한 화합물의 용도, 예컨대 개체에서의 HBV 감염의 치료를 제공한다.
따라서 본 개시는 짧은 헤어핀 마이크로-RNA (shmiR)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 제공하되, 상기 shmiR은
길이가 17 뉴클레오티드 이상인 효과기(effector) 서열;
효과기 상보(effector complement) 서열;
스템루프 서열; 및
1차 마이크로 RNA(pri-miRNA) 골격;을 포함하고,
상기 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, , 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에서 제시된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 것인 핵산을 제공한다. 바람직하게는 효과기 서열은 길이상 30 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 예를 들어 적합한 효과기 서열은 길이가 17-29뉴클레오티드의 범위일 수 있다. 바람직하게는 효과기 서열은 길이가 20 뉴클레오티드일 수 있일 것이다. 더 바람직하게는 효과기 서열은 길이가 21 뉴클레오티드일 것이고 효과기 상보 서열은 길이가 20 뉴클레오티드일 것이다.
효과기 서열은 그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 6 염기쌍 미스매치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서 효과기 서열은 그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 5 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서 효과기 서열은 그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 4 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서 효과기 서열은 그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 3 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서 효과기 서열은 효과자그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 2 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서 효과기 서열은 효과자그 효과기 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열에 대해 하나의 염기쌍 미스매치를 포함한다. 더욱 또 다른 예에서 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에 제시된 서열 내에서 동등한 길이 영역에 대해 100% 상보적이다. 미스매치가 존재하는 경우, 이들은 shmiR 의 시드 영역(seed region), 즉 효과기 서열의 뉴클레오티드 2-8 에 해당하는 영역 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다.
일 예에서, 여기서 기재하는 핵산은 다음으로 구성되는 군에서 선택되는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 12에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 12에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 14에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 14에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 16에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 16에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 18에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 18에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 20에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 20에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 22에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 22에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 24에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 24에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 26에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 26에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 효과자1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 28에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 28에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 30에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 30에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 32에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 32에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 34에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 34에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 36에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 36에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 38에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 38에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호40에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 40에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 42에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 42에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 111에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 111에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 113에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 113에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 115에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 115에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 117에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 117에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 119에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 119에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 121에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 121에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 123에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 123에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 125에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 125에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 127에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 127에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 129에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 129에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 131에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 131에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 133에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 133에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR.
또 다른 예에서, 여기서 기재하는 핵산은 다음으로 구성되는 군에서 선택되는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
서열번호 11에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 11에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 13에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 13에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 15에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 15에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 17에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 17에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 19에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 19에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 21에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 23에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 23에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 25에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 25에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 27에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 27에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 29에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 29에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 31에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 31에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 33에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 35에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 35에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 37에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 37에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 39에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 41에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 41에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 110에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 110에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 112에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 112에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 114에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 114에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 116에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 116에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 118에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 118에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 120에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 120에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 122에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 122에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 124에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 124에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 126에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 126에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 128에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 128에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 130에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 130에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
서열번호 132에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 132에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR.
예를 들어 여기에서 기재된 핵산에 의해 코딩되는 shmiR은, 동족(cognate) 효과기 및 효과기 상보 서열이 이중 구조 영역을 형성할 수 있다면, 해당 효과기 서열에 대해 1, 2, 3, 또는 4 미스매치를 포함하는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서 여기에서 기재하는 핵산은 다음으로 구성되는 군에서 선택되는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
서열번호 11에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 12에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 13에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 14에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 15에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 16에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 17에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 18에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 19에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 20에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 23에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 24에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 25에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 26에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 27에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 28에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 29에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 30에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 31에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 32에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 35에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 36에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 37에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 38에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
서열번호 41에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 42에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 110에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 111에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 112에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 113에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 114에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 115에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 116에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 117에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 118에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 119에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 120에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 121에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 122에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 123에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 124에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 125에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 126에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 127에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 128에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 129에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
서열번호 130에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 131에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
서열번호 132에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 133에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR.
본 개시의 핵산에 의해 코딩되는 shmiR은 5'에서 3' 방향으로
pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
효과기 상보 서열;
스템루프 서열;
효과기 서열; 및
pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열;을 포함할 수 있다.
적합한 루프 서열은 관련분야에서 알려진 것으로부터 선택할 수 있다. 그러나 예시적인 스템루프 서열을 서열번호 75에 제시하였다.
본 개시의 핵산에 사용하기 위한 적합한 일차 마이크로 RNA(pri-miRNA 또는 pri-R) 골격은 관련분야에서 알려진 것으로부터 선택할 수 있다. 예를 들어 pri-miRNA 골격은 pri-miR-30a 골격, pri-miR-155 골격, pri-miR-21 골격 및 pri-miR-136 골격으로부터 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는 pri-miRNA 골격은 pri-miR-30a 골격이다. pri-miRNA 골격이 pri-miR-30a 골격인 일 예에 따르면, pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열은 서열번호 76에서 제시한 바와 같고, pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열은 서열번호 77에 제시한 바와 같다.
일 예에서, 여기서 기재된 핵산은 서열번호 59-74 및 146-157중 어느 하나에서 제시된 서열로부터 선택된 DNA 서열을 포함한다. 이러한 예에 따르면, 본 개시의 핵산에 의해 코딩된 shmiR은 서열번호 43-58 및 134-145중 어느 하나에서 제시된 서열을 포함할 수 있다.
당해 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시에 따른 핵산이 HBV을 처리하기 위한 다른 치료제와 조합하거나 또는 결합하여 사용할 수 있음을 알 것이다. 따라서 본 개시는 여기에 기재된 바와 같은 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 HBV을 처리하기 위한 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 제공한다.
일 예에서, 다음을 포함하는 복수의 핵산을 제공한다:
(a) 여기에 기재된 하나 이상의 핵산; 및
(b) 하기로부터 선택된 하나 이상의 추가 핵산:
(i) 여기에 기재된 핵산들에 부합하는 일 핵산; 또는
(ii) 길이가 17 뉴클레오티드 이상인 효과기 서열 및 효과기 상보 서열을 포함하는, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133중 어느 하나에서 제시된 RNA 서열에 실질적으로 상보적인 핵산;
여기서 상기 (a)핵산이 코딩하는 shmiR 및 상기 (b)핵산이 코딩하는 shmiR 또는 shRNA은 상이한 효과기 서열을 포함한다.
바람직하게는 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에서 제시된 RNA 서열에 실질적으로 상보적인 (b)(ii) shRNA의 효과기 서열은 길이가 30 뉴클레오티드 미만이다. 예를 들어 shRNA의 적합한 효과기 서열은 길이가 17-29 뉴클레오티드의 범위에 있을 수 있다.
복수의 핵산 중 하나 이상이 shRNA를 코딩하는 일 예에 따르면, shRNA는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다:
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 12에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 12에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 14에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 14에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 16에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 16에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 18에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 18에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 20에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 20에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 22에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 22에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 24에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 24에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 26에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 26에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 28에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 28에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 30에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 30에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 32에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 32에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 34에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 34에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 36에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 36에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 38에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 38에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 40에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 40에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 42에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 42에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 111에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 111에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 113에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 113에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 115에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 115에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 117에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 117에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 119에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 119에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 121에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 121에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 123에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 123에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 125에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 125에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 127에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 127에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 129에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 129에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 131에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 131에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA; 및
(i) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 133에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열이되, 효과기 서열이 서열번호 133에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA.
복수의 핵산 중 하나 이상이 shRNA를 코딩하는 또 다른 예에 따르면 shRNA는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다:
서열번호 11에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 11에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 13에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 13에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 15에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 15에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 17에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 17에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 19에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 19에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 21에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 23에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 23에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 25에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 25에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 27에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 27에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 29에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 29에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 31에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 31에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 33에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 35에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 35에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 37에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 37에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 39에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 41에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 41에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 110에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 110에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 112에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 112에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 114에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 114에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 116에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 116에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 118에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 118에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 120에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 120에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 122에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 122에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 124에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 124에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 126에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 126에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 128에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 128에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 130에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 130에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA; 및
서열번호 132에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 132에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA.
예를 들어 여기에 기재된 복수의 핵산 중에서 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 동족 효과기 및 효과기 상보 서열이 이중구조 영역을 형성할 수 있다면, 해당하는 효과기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 포함하는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다.
복수의 핵산 중 하나 이상이 shRNA를 코딩하는 또 다른 예에서 shRNA는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다:
서열번호 11에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 12에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 13에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 14에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 15에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 16에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 17에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 18에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 19에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 20에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 23에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 24에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 25에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 26에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 27에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 28에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 29에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 30에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 31에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 32에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 35에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 36에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 37에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 38에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 41에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 42에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 110에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 111에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 112에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 113에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 114에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 115에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 116에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 117에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 118에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 119에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 120에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 121에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 122에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 123에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 124에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 125에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 126에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 127에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 128에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 129에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA;
서열번호 130에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 131에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA; 및
서열번호 132에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 133에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA.
본 개시의 핵산이 shRNA를 코딩하는 임의의 예에 따르면, shRNA는 효과기 서열 및 효과기 상보 서열 사이에 위치한 스템루프 서열을 포함할 수 있다. 적합한 루프 서열은 관련 분야에서 알려진 것들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로 적합한 스템 루프를 새로이(de novo) 개발할 수 있다. 일 예에서 shRNA를 코딩하는 여기에 기재된 복수의 핵산 중 한 핵산은 효과기 서열 및 효과기 상보 서열을 코딩하는 DNA 서열 사이에 위치하는 스템루프를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 개시의 핵산이 코딩하는 shRNA는 서열번호 78-93 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 따라서 여기에 기재된 복수의 핵산 중 한 핵산은 서열번호 94-109 중 어느 하나에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 복수의 핵산은 10 이하의 핵산을 포함할 수 있으며, 여기 기재한 바와 같이 각각의 핵산은 shmiR를 코딩하며, 예를 들어 2개의 핵산 또는 3개의 핵산 또는 4 개의 핵산 또는5개의 핵산 또는 6 개의 핵산 또는 7 개의 핵산 또는 8 개의 핵산 또는 9 개의 핵산 또는 10 개의 핵산과 같다.
일 예에서 복수의 핵산은 본 개시의 2개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 또 다른 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 3개의 뉴클레오티드핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 4개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 5개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 6개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 7개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 8개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 9개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 일 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 10개의 핵산을 포함하는데, 각각의 핵산은 여기 기재하는 바와 같이 shmiR을 코딩한다. 여기 기재된 임의의 예에 따르면, 복수의 핵산 중 하나 이상은 여기 기재된 바와 같이 shRNA를 코딩할 수 있다.
복수의 핵산이 제공되는 실시예에 따르면, 그 핵산 중 둘 이상이 동일한 폴리뉴클레오티드의 별도의 부분을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서 복수의 핵산 중 둘 이상의 핵산은 상이한 폴리뉴클레오티드의 부분을 각각 형성한다.
본 개시에 따른 핵산 또는 각각의 핵산은 하나 이상의 전사 종결자(terminator) 서열을 포함하거나 그러한 전사 종결자 서열과 작동가능하게 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어 상기 핵산 또는 각각의 핵산은 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 3' 말단에 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 그러한 서열은 프로모터의 선택에 의존적이며 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있다. 예를 들어 본 개시의 핵산이 RNA pol III 프로모터와의 작동 가능하게 연결되어 있는 경우 전사 종결자 서열은 'TTTTT' 또는 'TTTTTT'를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로 본 개시에 따른 핵산 또는 각각의 핵산은 전사 개시자(initiator) 서열을 포함하거나 그러한 전사 개시자(initiator) 서열과 작동가능하게 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어 상기 핵산 또는 각각의 핵산은 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 5' 말단에 전사 개시자 서열을 포함할 수 있다. 그러한 서열은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있는데 'G'를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로 본 개시에 따른 상기 핵산 또는 각각의 핵산은 하나 이상의 제한 자리를 포함하여 예컨대 핵산을 클로닝 또는 발현 벡터내에 클로닝하는 것을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어 여기 기재된 핵산은 본 개시의shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 상류 및/또는 하류에 제한 자리를 포함할 수 있다. 적합한 제한효소 인식 서열은 관련분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있을 것이다. 그러나, 일 예에서 본 개시의 핵산은 5' 말단, 즉 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 서열의 상류에서 a BamH1 제한 자리 (GGATCC), 및 3' 말단, 즉 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 서열의 하류에서 a EcoR1 제한 자리 (GAATTC)를 내포할 수 있다.
본 개시에 따른 핵산은 본 개시의 핵산이 코딩되하는 하나 이상의 shmiR들을 발현할 수 있는 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 구조체의 형태로 제공되거나, 또는 그런 구조체에 포함될 수도 있다. 이와 관련하여 본 개시의 핵산을 포함하는 하나 이상의 ddRNAi 구조체가 또한 제공된다.
또 다른 예에서, 각각이 여기 기재된 바와 같은 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 ddRNAi 구조체를 제공하며, 여기에서;
(a) 복수의 ddRNAi 구조체 중 하나 이상은 여기 기재된 복수의 핵산 중 제1 핵산을 포함하고;
(b) 복수의 ddRNAi 구조체 중 하나 이상은 여기 기재된 복수의 핵산 중 제2 핵산을 포함하며;
상기 제 1 및 제 2 핵산은 서로 상이한 shmiR들을 코딩한다.
여기에 기재된 복수의 ddRNAi 구조체는 10 개 이하의 ddRNAi 구조체를 포함할 수 있으며, 각각의 ddRNAi는 여기 기재된 바와 같은 shmiR를 코딩하는 핵산을 하나 이상 포함하며, 예컨대 본 개시의 2개의 ddRNAi 구조체 또는 3 개의 ddRNAi 구조체 또는 4 개의 ddRNAi 구조체 또는 5 개의 ddRNAi 구조체 또는 6 개의 ddRNAi 구조체 또는 7 개의 ddRNAi 구조체 또는 8개의 ddRNAi 구조체 또는 9 개의 ddRNAi 구조체 또는 10 개의 ddRNAi 구조체와 같다.
또 다른 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는, ddRNAi 구조체가 HBV를 표적하는 복수의 shmiR들을 코딩하며 그 각각의 shmiR들은 서로 상이하도록, 여기 기재된 바와 같은 복수의 핵산을 포함한다.
일 예에서, ddRNAi 구조체는 ddRNAi 구조체가 HBV를 표적하는 둘 이상의 shmiR들을 코딩하되 그 각각의shmiR들은 서로 상이하도록, 본 개시의 핵산을 둘 이상 포함한다.
본 개시의 핵산 둘 이상을 포함하는 예시적 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
또 다른 예에서 본 개시의 ddRNAi 구조체는 여기에 기재된 핵산을 세개 이상 포함하는데 ddRNAi 구조체가 HBV를 표적하는 세개 이상의 shmiR들을 코딩하되 그 각각은 서로 상이하도록 한 것이다.
본 개시의 ddRNAi 구조체 중 하나의 예는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 여기에 기재된 바와 같이 shmiR또는 shRNA을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
여기서는 (b)에서의 핵산이 (a) 및 (c)에서 상기 핵산에 의해 코딩된 shmiR의 효과기 서열과는 상이한 효과기 서열을 갖는 shmiR 또는shRNA를 코딩한다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산;
(b) 서열번호73에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산; 및
(c) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 49에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산;
(b) 서열번호65에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산; 및
(c) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산.
세 개의 shmiR들을 코딩하는, 본 개시의 ddRNAi 구조체의 또 다른 예에 따르면, ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
일 예에서는 예에서, (a) 내지 (c)는 ddRNAi 구조체 내에 5'에서 3' 방향으로 (a) 내지 (c)가 제공된다.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산;
(b) 서열번호149에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산; 및
(c) 서열번호 153에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산.
또 다른 예에서 본 개시의 ddRNAi 구조체는 여기에 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 여기에 기재된 바와 같이 HBV를 표적하는 shRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는데 여기서 ddRNAi 구조체가 코딩하는 shmiR 및 shRNA는 상이한 효과기 서열을 포함한다. 이러한 예에 따르면 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA를 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들면, 본 개시의 ddRNAi 구조체 는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한할 수 있다:
(a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 92에서 제시된 서열로 구성된 shRNA를 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들면, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산;
(b) 서열번호 108에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 로 구성된 핵산; 및
(c) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산.
일 예에서, 여기에 기재된 바와 같은ddRNAi 구조체는 본 개시의shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 핵산 또는 각각의 핵산에 작동가능하게 연결된 단일 프로모터를 포함한다.
또 다른 예에서 본 개시의shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 각각의 핵산은 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
예를 들어 프로모터(들)은 shmiR(들) 또는 shRNA(들)을 코딩하는 개개의 핵산(들)의 상류에 위치한다. 다중 프로모터를 포함하는 ddRNAi 구조체에 있어서, 그 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예시적 프로모터는 RNA pol III 프로모터, 예를 들면 U6 및 H1 프로모터와 같은 것들이다. 예시적인 U6 프로모터는 U6-1, U6-8 및 U6-9 프로모터이다.
일 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체 는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
또 다른 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체 는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 65에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
또 다른 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체 는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 149에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 153에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
본 개시는 본개시의 ddRNAi 구조체를 포함하는 발현 벡터를 또한 제공한다.
본 개시는 각각이 본 개시의 ddRNAi 구조체를 포함하는 복수의 발현 벡터를 또한 제공한다. 예를 들면 복수의 발현 벡터 중 하나 이상은 여기에 기재된 바와 같이 복수의 ddRNAi 구조체를 포함한다. 또다른 예에서, 복수의 발현 벡터 각각은 여기에 기재된 바와 같은 복수의 ddRNAi 구조체를 포함한다. 또 다른 예에서, 복수의 발현 벡터 각각은 여기에 기재된 바와 같은 단일 ddRNAi 구조체를 포함한다. 이 단락에서 전술한 어떠한 방법에서도 복수의 발현 벡터는 본 개시에 따라 복수의 shmiR를 통합적으로 발현할 수 있다.
일 예에서, 발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클이다.
일 예에서, 플라스미드 또는 미니서클 또는 발현 벡터 또는 ddRNAi 구조체는 양이온성 DNA 결합 폴리머와 복합체를 이룬다.
또 다른 예에서, 발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연계 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 (AdV) 및 렌티바이러스(LV) 벡터로 구성된 군에서 선택된다.
본 개시는 여기에 기재된 바와 같은 ddRNAi 구조체 및/또는 복수의 ddRNAi 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 복수의 발현벡터를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 일 예에서 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 희석제를 또한 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 조성물은 HBV 감염을 치료하기 위해 알려져 있는 또 다른 치료제를, 즉 보조 치료법으로서 더 포함할 수 있다. 예를 들어, HBV 감염을 치료하기 위해 알려져 있는 다른 치료제는 엔테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 및/또는 페그인터페론(pegylated interferon)으로부터 선택될 수 있다.
본 개시는 개체에 HBV 감염을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물을 개체에 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시는 HBV로 감염된 개체에 HBV 바이러스 로드를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물을 개체에 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시는 HBV감염으로 앓고 있는 개체에 HBV감염과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 여기 기재된 조성물을 개체에 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시는 HBV로 감염된 개체에 HBV 감염력(infectivity)를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물을 개체에 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시는 만성적인 간 부전(hepatic insufficiency), 간경변(cirrhosis), 및/또는 간세포암(hepatocellular carcinoma)의 발병을 유발할 HBV로 감염을 앓고 있는 개체의 위험도를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물을 개체에 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
여기 기재된 여하한 방법에 따르면, 일 예에서, 개체가 급성 HBV 감염을 앓고 있다. 대안적으로 일 예에서, 개체가 만성적인 HBV 감염을 앓고 있다.
일 예에서 여기 기재된 방법은 개체에서 HBV 게놈에 의해 코딩된 하나 이상의 전사체의 발현을 저해하거나 감소시키는 것을 포함한다.
일 예에서 여기 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물을 투여한 개체는 HBV 감염을 치료하기 위해 또 다른 치료제로 이미 치료를 받았다. 예를 들면 개체 및/또는 HBV는 난치성 또는 HBV 감염 치료용으로 알려진 다른 약제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 내성을 갖는다.
또 다른 예에서, 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 개시의 조성물은 HBV 감염을 치료하기 위해 알려진 또다른 치료제, 즉 보조적인 치료법(adjunctive therapy)와 조합하여 투여한다. 예를 들어, HBV 감염 치료용으로 알려져 있는 다른 치료제는 엔테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 및/또는 페그인터페론으로부터 선택될 수 있다. HBV 감염을 치료하기 위해 알려져 있는 다른 치료제 및 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 개시의 조성물은 별도로 또는 함께 투여할 수 있다. 투여를 별도로 수행하는 일의 예에 따르면, HBV 감염 치료용으로 알려져 있는 다른 치료제를 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 개시의 조성물의 투여와 동시에 투여할 수 있다. 투여를 별도로 수행하는 또 다른 예에 따르면, HBV 감염을 치료용으로 알려져 있는 다른 치료제를 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 개시의 조성물의 투여와 연속적으로 투여할 수 있다.
일 예에서, 본 개시의 조성물은 키트 내에서 제공한다. 예를 들어 본 개시의 조성물은 HBV 감염 치료용으로 알려져 있는 다른 치료제 하나 이상과 함께 포장한다. 그와 같은 다른 치료제는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, HBV 감염 치료용으로 알려져 있는 다른 치료제는 엔테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 및/또는 페그인터페론으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 조성물은 본 개시의 방법에 사용하기 위한 지시사항과 함께 포장한다.
본 개시는 약제의 제조를 위한, 예컨대 개체의 HBV 감염 치료용 약제의 제조 및/또는 여기에 개시된 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 여기 기재된 조성물의 용도를 또한 제공한다. 일 예에서, 개체는 급성 HBV를 앓고 있다. 대안적 예에서 개체는 만성 HBV를 앓고 있다.
본 개시는 치료법에 사용하기 위한 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 여기 기재된 조성물의 용도를 또한 제공한다. 예를 들어, 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 구조체, 복수의 ddRNAi 구조체, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 여기 기재된 조성물은 개체 내 HBV 감염의 치료 및/또는 여기서 개시된 방법에 사용하기 위한 것일 수 있다. 개체는 급성 HBV 감염을 앓고 있을 수 있다. 대안적인 예에서, 개체는 만성 HBV 감염을 앓고 있을 수 있다.
여기 기재된 임의의 예에 따른 HBV 치료는 개체에서의 HVB 바이러스 로드 감소, 개체의 HBV 감염과 연관된 증상의 중증도의 감소 및/또는 HBV 감염력의 감소 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 예에서 약은 투약된 개체에서 HBV 유전자 전사 산물을 감소시킬 것이다.
도 1은 루시페라제 리포터 어세이에서 shmiR-6, shmiR-15 및 shmiR-12로 지정된 shmiR들의 그 shRNA 대응물 (각각 shRNA-6, shRNA-15 및 shRNA-12)에 대한 저해활성을 나타낸다: (A) 루시페라제 리포터 어세이에서 shmiR-6, shmiR-15 및 shmiR-12로 지정된 shmiR들의 그 shRNA 대응물 (각각 shRNA-6, shRNA-15 및 shRNA-12)에 대한 센스 및 안티센스 가닥 선호 저해활성을 나타낸다; (B)-(D) 루시페라제 리포터 어세이 시스템에서 균등한 투여량시에 투여량 의존적인 방식으로 shmiR-6, shmiR-15 및 shmiR-12 각각의 그 shRNA 대응물 (각각 shRNA-6, shRNA-15 및 shRNA-12)에 대한 루시페라제 단백질 발현 저해 능력을 나타내고 대비한다.
도 2는 루시페라제 리포터 어세이에서 shmiR-12 및 shmiR-15의 변이체의 그 각각의 모(parental) shmiR들 (각각 shmiR-12 및 shmiR-15)에 대한 센스 및 안티센스 가닥 선호 저해활성을 나타낸다: (A) 는 shmiR-12의 여섯개의 모든 변이체가 모 shmiR에 대해 더 나은 가닥 선호도를 갖는다는 것을 보여준다; 그리고 (B)는 shmiR-15의 여섯개의 변이체 중 네개가 모 shmiR에 대해 더 나은 가닥 선호도를 갖는다는 것을 보여준다.
도 3은 RNAi 물질로 형질도입(transduced)된 HepG2.2.15 세포에서 세포당 카피수로 표현되어 ddRNAi 효과기 분자의 발현 수준을 나타낸다: (A)는 다음에 관한 효과기 서열의 상대적인 발현 수준을 보여준다: (i) 단일 구조체로 발현된 shmiR-12, (ii) 단일 구조체로 발현된 shRNA-12, 및 (iii) 형질도입 후 3, 4, 5 및 6일에 HBV-shRNAx3-v1의 일부로서 발현된 shRNA-12; 그리고 (B) 는 다음에 관한 효과기 서열의 상대적인 발현 수준을 보여준다: (i) 단일 구조체로 발현된 shmiR-15, (ii) 단일 구조체로 발현된 shRNA-15, 및 (iii) 형질도입 후 3, 4, 5 및 6일에 HBV-shRNAx3-v1의 일부로서 발현된 shRNA-15.
도 4는 형질도입후 3에서 6일에 (A) shmiR-12 또는 단일 또는 삼중 구조체의 일부로서 해당하는shRNA, 또는 (B) shmiR-15 또는 단일 또는 삼중 구조체의 일부로서 해당하는shRNA를 발현하는 HBV AdV 벡터 (MOI=100)로 형질도입된 HepG2.2.15에서 GAPDH mRNA의 수준에 상대적으로 HBV 항원 HBsAg, HBcAg 및 HbxAg에 해당하는영역에서 HBV RNA 전사체의 저해 수준을 나타낸다.
도 5는 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1에 대한 구조체 다이어그램을 제공한다.
도 6은 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1을 이용하여 PhoenixBio (PXB) 키메라 마우스에서 수행된 인비보 효능연구에 관한 플로우 다이어그램을 제공한다.
도 7은 단일 치료법 또는 엔테카비르와 조합하여 단일 투여의 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스에서 혈청 HBV DNA 수준이 감소된 반면 식염수가 처리된 대조군 동물에서 바이러스 타이터가 91일의 연구 과정 동안 상대적으로 일정했다는 것을 나타낸다.
도 8은 단일 치료법 또는 엔테카비르와 조합하여 단일 투여의 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스에서 혈청 HBsAg 항원 수준이 감소된 반면 식염수가 처리된 대조군 동물에서 혈청 HBsAg 항원 수준은 91일의 연구 과정 동안 상대적으로 일정했다는 것을 나타낸다.
도 9는 단일 치료법으로서 또는 엔테카비르와 조합하여 단일 투여의 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스에서 혈청 HBeAg 항원 수준이 감소된 반면, 엔테카비르만으로 처리된 동물은 혈청 HBeAg 항원 수준이 약간 떨어진 것(즉 0.37 로그)을 보여주고 식염수가 처리된 대조군 동물에서 HBeAg 항원 수준은 91일의 연구 과정 동안 상대적으로 일정했다는 것을 나타낸다.
도 10은 단일 치료법으로서 또는 페그인터페론과 조합하여(여기서 페그인터페론은 매일 두번 투여됨) 단일 투여의 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스에서 혈청 HBV DNA 수준은 상당히 떨어진 반면, 식염수가 처리된 대조군 동물에서는 혈청 HBV DNA 수준이 91일의 연구 과정 동안 상대적으로 일정했다는 것을 나타낸다.
도 11은 단일 치료법으로서 페그인터페론으로 처리, 또는 단일치료법으로 또는 엔테카비르나 페그인터페론과 조합하여 단일 투여의 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스에서 HBV RNA 수준이 감소된 반면, 엔테카비르만이 투여된 경우 HBV RNA 수준이 단지 온화하게 감소된 것을 나타낸다. (A)-(C) 는 shmiR-6, shmiR-15 및shmiR-12에 각각 해당하는전사체의 HBV RNA 수준을 보여준다.
도 12는 단일치료법으로서 또는 엔테카비르나 페그인터페론과 조합하여 단일 투여의 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로 처리된 마우스의 간에서 세포내 HBV DNA 및 cccDNA 수준이 감소되었음을 나타낸다.
도 13은 단일치료법으로서 또는 엔테카비르나 페그인터페론과 조합하여 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 로 처리된 마우스로부터 수득한 간 조직에서 세포 당 카피수로 표현되는 RNAi 효과기 분자의 발현 수준을 나타낸다.
도 14는 우세한 shRNA-6/shmiR-6 효과기 서열 종 및, 차세대 시퀀싱(NGS)로부터 결정된 바와 같이 PXB 마우스로부터 수득한 간 조직에서 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 로부터 생산된 그것의 수를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 우세한 shRNA-15/shmiR-15 효과기 서열 종 및, 차세대 시퀀싱(NGS)로부터 결정된 바와 같이 PXB 마우스로부터 수득한 간 조직에서 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로부터 생산된 그것의 수를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 우세한 shRNA-12/shmiR-12 효과기 서열 종 및, 차세대 시퀀싱(NGS)로부터 결정된 바와 같이 PXB 마우스로부터 수득한 간 조직에서 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1로부터 생산된 그것의 수를 나타낸다.
서열 목록에 대한 키(Key to the Sequence Listing)
서열번호 1: HBV 게놈 내 표적 영역 1에 대한 RNA 전사체.
서열번호 2: HBV 게놈 내 표적 영역 2에 대한 RNA 전사체.
서열번호 3: HBV 게놈 내 표적 영역3에 대한 RNA 전사체.
서열번호 4: HBV 게놈 내 표적 영역 4에 대한 RNA 전사체.
서열번호 5: HBV 게놈 내 표적 영역 5에 대한 RNA 전사체.
서열번호 6: HBV 게놈 내 표적 영역 6에 대한 RNA 전사체.
서열번호 7: HBV 게놈 내 표적 영역 7에 대한 RNA 전사체.
서열번호 8: HBV 게놈 내 표적 영역 8에 대한 RNA 전사체.
서열번호 9: HBV 게놈 내 표적 영역 9에 대한 RNA 전사체.
서열번호 10: HBV 게놈 내 표적 영역 10에 대한 RNA 전사체.
서열번호 11: shmiR-1의 RNA 효과기 서열.
서열번호 12: shmiR-1의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 13: shmiR-2의 RNA 효과기 서열.
서열번호 14: shmiR-2의 의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 15: shmiR-3의 RNA 효과기 서열.
서열번호 16: shmiR-3의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 17: shmiR-4의 RNA 효과기 서열.
서열번호 18: shmiR-4의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 19: shmiR-5의 RNA 효과기 서열.
서열번호 20: shmiR-5의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 21: shmiR-6의 RNA 효과기 서열.
서열번호 22: shmiR-6의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 23: shmiR-7의 RNA 효과기 서열.
서열번호 24: shmiR-7의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 25: shmiR-8의 RNA 효과기 서열.
서열번호 26: shmiR-8의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 27: shmiR-9의 RNA 효과기 서열.
서열번호 28: shmiR-9의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 29: shmiR-10의 RNA 효과기 서열.
서열번호 30: shmiR-10의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 31: shmiR-11의 RNA 효과기 서열.
서열번호 32: shmiR-11의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 33: shmiR-12의 RNA 효과기 서열.
서열번호 34: shmiR-12의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 35: shmiR-13의 RNA 효과기 서열.
서열번호 36: shmiR-13의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 37: shmiR-14의 RNA 효과기 서열.
서열번호 38: shmiR-14의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 39: shmiR-15의 RNA 효과기 서열.
서열번호 40: shmiR-15의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 41: shmiR-16의 RNA 효과기 서열.
서열번호 42: shmiR-16의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 43: shmiR-1에 대한 RNA 서열.
서열번호 44: shmiR-2에 대한 RNA 서열.
서열번호 45: shmiR-3에 대한 RNA 서열.
서열번호 46: shmiR-4에 대한 RNA 서열.
서열번호 47: shmiR-5에 대한 RNA 서열.
서열번호 48: shmiR-6에 대한 RNA 서열.
서열번호 49: shmiR-7에 대한 RNA 서열.
서열번호 50: shmiR-8에 대한 RNA 서열.
서열번호 51: shmiR-9에 대한 RNA 서열.
서열번호 52: shmiR-10에 대한 RNA 서열.
서열번호 53: shmiR-11에 대한 RNA 서열.
서열번호 54: shmiR-12에 대한 RNA 서열.
서열번호 55: shmiR-13에 대한 RNA 서열.
서열번호 56: shmiR-14에 대한 RNA 서열.
서열번호 57: shmiR-15에 대한 RNA 서열.
서열번호 58: shmiR-16에 대한 RNA 서열.
서열번호 59: shmiR-1을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 60: shmiR-2를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 61: shmiR-3을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 62: shmiR-4를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 63: shmiR-5를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 64: shmiR-6을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 65: shmiR-7을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 66: shmiR-8을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 67: shmiR-9를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 68: shmiR-10을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 69: shmiR-11을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 70: shmiR-12를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 71: shmiR-13을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 72: shmiR-14를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 73: shmiR-15를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 74: shmiR-16을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 75: shmiR들에 대한 스템루프 RNA 서열.
서열번호 76: pri-miR-30a 골격의 5' 인접 서열.
서열번호 77: pri-miR-30a 골격의 3' 인접 서열.
서열번호 78: shRNA-1로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 79: shRNA-2 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 80: shRNA-3 으로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 81: shRNA-4 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 82: shRNA-5 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 83: shRNA-6 으로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 84: shRNA-7 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 85: shRNA-8 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 86: shRNA-9 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 87: shRNA-10 으로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 88: shRNA-11 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 89: shRNA-12 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 90: shRNA-13 으로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 91: shRNA-14 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 92: shRNA-15 로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 93: shRNA-16 으로 지정된 shRNA의 RNA 서열.
서열번호 94: shRNA-1로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 95: shRNA-2 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 96: shRNA-3 으로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 97: shRNA-4 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 98: shRNA-5 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 99: shRNA-6 으로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 100: shRNA-7 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 101: shRNA-8 로 지정된 shRNA 를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 102: shRNA-9 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 103: shRNA-10 으로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 104: shRNA-11 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 105: shRNA-12 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 106: shRNA-13 으로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 107: shRNA-14 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 108: shRNA-15 로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 109: shRNA-16 으로 지정된 shRNA를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 110: shmiR-17의 RNA 효과기 서열.
서열번호 111: shmiR-17의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 112: shmiR-18의 RNA 효과기 서열.
서열번호 113: shmiR-18의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 114: shmiR-19에 대한의 RNA 효과기 서열.
서열번호 115: shmiR-19의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 116: shmiR-20의 RNA 효과기 서열.
서열번호 117: shmiR-20의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 118: shmiR-21의 RNA 효과기 서열.
서열번호 119: shmiR-21의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 120: shmiR-22의 RNA 효과기 서열.
서열번호 121: shmiR-22의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 122: shmiR-23의 RNA 효과기 서열.
서열번호 123: shmiR-23의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 124: shmiR-24의 RNA 효과기 서열.
서열번호 125: shmiR-24의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 126: shmiR-25의 RNA 효과기 서열.
서열번호 127: shmiR-25의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 128: shmiR-26의 RNA 효과기 서열.
서열번호 129: shmiR-26의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 130: shmiR-27의 RNA 효과기 서열.
서열번호 131: shmiR-27의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 132: shmiR-28의 RNA 효과기 서열.
서열번호 133: shmiR-28의 RNA 효과기 상보 서열.
서열번호 134: shmiR-17의 RNA 서열.
서열번호 135: shmiR-18의 RNA 서열.
서열번호 136: shmiR-19의 RNA 서열.
서열번호 137: shmiR-20의 RNA 서열.
서열번호 138: shmiR-21의 RNA 서열.
서열번호 139: shmiR-22의 RNA 서열.
서열번호 140: shmiR-23의 RNA 서열.
서열번호 141: shmiR-24의 RNA 서열.
서열번호 142: shmiR-25의 RNA 서열.
서열번호 143: shmiR-26의 RNA 서열.
서열번호 144: shmiR-27의 RNA 서열.
서열번호 145: shmiR-28의 RNA 서열.
서열번호 146: shmiR-17을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 147: shmiR-18 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 148: shmiR-19 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 149: shmiR-20 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 150: shmiR-21 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 151: shmiR-22 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 152: shmiR-23 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 153: shmiR-24 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 154: shmiR-25 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 155: shmiR-26 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 156: shmiR-27 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 157: shmiR-28 을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 158: HBV 정방향 프라이머의 DNA 서열.
서열번호 159: HBV 역방향 프라이머의 DNA 서열.
서열번호 160: HBV 타크만 프루브의 DNA 서열.
서열번호 161: HBV cccDNA 정방향 프라이머의 DNA 서열.
서열번호 162: HBV cccDNA 역방향 프라이머의 DNA 서열.
서열번호 163: HBV cccDNA 타크만 프루브의 DNA 서열.
서열번호 164: 인접(flanking) 서열을 포함하는 shRNA-6을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 165: shRNA-6 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 166: shRNA-6 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 167: shRNA-6 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 168: shRNA-6 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 169: shRNA-6 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
서열번호 170: shRNA-6 효과기 종 6에 해당하는DNA 서열.
서열번호 171: shRNA-6 효과기 종 7에 해당하는DNA 서열.
서열번호 172: shRNA-6 효과기 종 8에 해당하는DNA 서열.
서열번호 173: shRNA-6 효과기 종 9에 해당하는DNA 서열.
서열번호 174: shRNA-6 효과기 종 10에 해당하는DNA 서열.
서열번호 175: shRNA-6 효과기 종 11에 해당하는DNA 서열.
서열번호 176: miRNA 골격의 인접 서열을 포함하는 shmiR-6을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 177: shmiR-6 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 178: shmiR-6 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 179: shmiR-6 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 180: shmiR-6 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 181: shmiR-6 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
서열번호 182: 인접 서열을 포함하는 shRNA-15를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 183: shRNA-15 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 184: shRNA-15 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 185: shRNA-15 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 186: shRNA-15 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 187: shRNA-15 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
서열번호 188: shRNA-15 효과기 종 6에 해당하는DNA 서열.
서열번호 189: shRNA-15 효과기 종 7에 해당하는DNA 서열.
서열번호 190: shRNA-15 효과기 종 8에 해당하는DNA 서열.
서열번호 191: shRNA-15 효과기 종 9에 해당하는DNA 서열.
서열번호 192: shRNA-15 효과기 종 10에 해당하는DNA 서열.
서열번호 193: shRNA-15 효과기 종 11에 해당하는DNA 서열.
서열번호 194: shRNA-15 효과기 종 12에 해당하는DNA 서열.
서열번호 195: shRNA-15 효과기 종 13에 해당하는DNA 서열.
서열번호 196: shRNA-15 효과기 종 14에 해당하는DNA 서열.
서열번호 197: shRNA-15 효과기 종 15에 해당하는DNA 서열.
서열번호 198: shRNA-15 효과기 종 16에 해당하는DNA 서열.
서열번호 199: shRNA-15 효과기 종 17에 해당하는DNA 서열.
서열번호 200: shRNA-15 효과기 종 18에 해당하는DNA 서열.
서열번호 201: shRNA-15 효과기 종 19에 해당하는DNA 서열.
서열번호 202: miRNA 골격의 인접 서열을 포함하는 shmiR-15를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 203: shmiR-15 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 204: shmiR-15 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 205: shmiR-15 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 206: shmiR-15 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 207: shmiR-15 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
서열번호 208: shmiR-15 효과기 종 6에 해당하는DNA 서열.
서열번호 209: 인접 서열을 포함하는 shRNA-12를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 210: shRNA-12 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 211: shRNA-12 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 212: shRNA-12 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 213: shRNA-12 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 214: shRNA-12 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
서열번호 215: shRNA-12 효과기 종 6에 해당하는DNA 서열.
서열번호 216: shRNA-12 효과기 종 7에 해당하는DNA 서열.
서열번호 217: shRNA-12 효과기 종 8에 해당하는DNA 서열.
서열번호 218: shRNA-12 효과기 종 9에 해당하는DNA 서열.
서열번호 219: shRNA-12 효과기 종 10에 해당하는DNA 서열.
서열번호 220: shRNA-12 효과기 종 11에 해당하는DNA 서열.
서열번호 221: shRNA-12 효과기 종 12에 해당하는DNA 서열.
서열번호 222: shRNA-12 효과기 종 13에 해당하는DNA 서열.
서열번호 223: shRNA-12 효과기 종 14에 해당하는DNA 서열.
서열번호 224: miRNA 골격의 인접 서열을 포함하는 shmiR-12를 코딩하는 DNA 서열.
서열번호 225: shmiR -12 효과기 종 1에 해당하는DNA 서열.
서열번호 226: shmiR -12 효과기 종 2에 해당하는DNA 서열.
서열번호 227: shmiR -12 효과기 종 3에 해당하는DNA 서열.
서열번호 228: shmiR -12 효과기 종 4에 해당하는DNA 서열.
서열번호 229: shmiR -12 효과기 종 5에 해당하는DNA 서열.
일반사항
본 명세서를 통틀어 달리 특별하게 기술하거나 문맥적으로 다르게 요구되지 않는 단일 단계, 특징, 조성물, 단계의 그룹 또는 특징 또는 조성물의 그룹에 대한 언급은 이러한 단계, 특징, 조성물, 단계의 그룹, 또는 특징 또는 조성물의 그룹 중 하나 및 복수 개(즉 하나 이상)를 포함하는 것으로 취급된다.
당해 기술 분야에서 통상의 기술자는 본 개시가 특별히 기재된 바 이외에 변형 및 변경이 가능함을 인식할 것이다. 본 개시는 그런 모든 변형 및 변경을 포함한다는 것으로 이해하여야 한다. 본 개시는 또한 본 명세서에서 언급되거나 나타낸 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 통합적으로 포함하며, 그리고 상기 단계나 특징의 임의의 두개 이상 또는 임의의 그리고 모든 조합을 포함한다.
본 개시는 여기 기재된 구체적 예에 의해 그 범위가 제한되지 않는 바 그것은 예시적인 목적만을 위해 작성된 것이다. 기능적으로 동등한 물건, 조성물 및 방법은 명백히 본 개시의 범위 내에 존재한다.
여기서의 본 개시의 임의의 예는 특별히 달리 기재하지 않는 한 본 개시의 여타 다른 예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용될 것이다.
다른 식으로 특별히 정의되지 않는 한 여기서 사용하는 모든 기술적 및 과학적 용어는 관련분야(예를 들어 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 통상의 기술자에게 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 받아들일 것이다.
달리 지시되지 않는 한 본 개시에서 채용되는 재조합 DNA, 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 관련 분야 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 과정이다. 그러한 기술은 그 출처가 예컨대 다음과 같은 문헌에 기재되고 설명되어 있다: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함).
본 명세서를 통틀어 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다", "포함하는"과 같은 변형은 기술된 단계 또는 구성요소 또는 정수 또는 단계의 군 또는 단계들 또는 정수들을 포함함을 의미하고 여타 임의의 단계 또는 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 군을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는", 예컨대 "X 및/또는 Y" 는 "X 및 Y" 나 "X 또는 Y"를 의미하며 둘다의 의미 또는 둘 중 임의의 한쪽의 의미를 분명하게 제공하는 것으로 받아들여야 한다.
선택된 정의들
"RNA" 는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. " 리보뉴클레오티드"는 β-D-리보-푸라노즈 모이어티의 2' 위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 그 용어는 이중 가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 필수적으로 순수 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA 뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가, 결실, 치환 및/또는 변형하여 자연적으로 발생하는 RNA와 다른 변형된 RNA도 포함한다. 그러한 변형은 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서 비-뉴클레오티드 물질을 siNA의 말단 또는 내부와 같은 곳에 부가하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 RNA 분자내 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 이들 변형된 RNA들은 유사체 또는 자연발생적 RNA의 유사체로서 칭할 수 있다.
용어 "RNA 간섭(RNA interference)" 또는 "RNAi"는 세포의 세포질에서 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 개시되는 유전자 발현의 RNA-의존성 침묵(silencing)을 일반적으로 일컫는다. dsRNA 분자는 표적 핵산 서열의 전사 산물을 감소시키거나 저해하는데 그에 따라 그 유전자의 발현을 감소시키거나 유전자를 침묵시킨다.
여기서 사용되는 용어 "이중 가닥 RNA(double stranded RNA)" 또는 "dsRNA" 는 이중적 구조 (duplex structure)를 가지며 효과기 서열 및 그와 서로 비슷한 길이인 효과기 상보 서열을 포함하는 RNA분자를 일컫는다. 효과기 서열과 효과기 상보 서열은 단일 RNA 가닥 또는 분리된 RNA 가닥으로 존재할 수 있다. "효과기 서열 (effector sequence)" (종종 "가이드 가닥"으로 일컬어짐) 은 표적 서열에 실질적으로 상보적인데 이는 본 케이스의 경우에는 HBV 게놈의 RNA 전사 산물의 영역이다. "효과기 서열"은 "안티센스 서열"로도 또한 칭할 수 있다. "효과기 상보 서열(effector complement sequence)"은 효과기 서열에 충분히 상보적이어서 그것이 효과기 서열에 어닐하여 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다. 이와 관련하여 효과기 상보 서열은 표적 서열 영역에 상당히 동질적(homologous)이다. 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이 용어 "효과기 상보 서열"은 "효과기 서열의 상보체" 또는 센스 서열로 또한 칭할 수 있다.
여기서 사용하는 바와 같이 "이중구조(duplex)"는 두개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 핵산 (예컨대, RNA들), 또는 단일 가닥 핵산(예컨대, RNA) 내의 실질적으로 상보적인 영역을 지칭하는데 이는 Watson-Crick 염기쌍 또는, 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열 간에 안정된 이중 구조를 허락하는 임의의 여타 방식에 의해 서로 염기쌍을 형성하는 것이다. 통상의 기술자는 이중구조 영역 내에서 100% 상보성이 요구되지 않는다는 것을 이해할 것이다: 실질적인 상보성이 허용가능하다. 실질적인 상보성은 69% 이상의 상보성을 내포할 수 있다. 예를 들어 19 염기쌍(즉 18 염기쌍 및 하나의 미스매치)으로 구성된 이중구조 영역 내에서 단일 미스매치는 94.7% 상보성을 유발하는데 이로써 이중구조 영역을 실질적인 상보성으로 만드는 것이다. 또 다른 예에서 들어 19 염기쌍(즉 17 염기쌍 및 두개의 미스매치)으로 구성된 이중구조 영역 내에서 두 개의 미스매치는 89.5% 상보성을 유발하는데 이로써 이중구조 영역을 실질적인 상보성으로 만드는 것이다. 더 또다른 예에서 19 염기쌍(즉 16 염기쌍 및 세개의 미스매치)으로 구성된 이중구조 영역 내에서 세 개의 미스매치는 84.2% 상보성을 유발하는데 이로써 이중구조 영역을 실질적인 상보성으로 만드는 등등의 것이다.
dsRNA 는 효과기 서열 및 효과기 상보 서열로 이루어진 이중구조 영역이 스템루프라고 불리는 2 이상의 뉴클레오티드 서열로 연결된 헤어핀 또는 스템 루프 구조로 제공될 수 있다. dsRNA가 헤어핀 또는 스템 루프 구조로 제공될 때 "헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNAi 물질" 또는 "shRNA"로 칭할 수 있다.
헤어핀 또는 스템루프 구조를 유발하거나 이 구조로 제공되는 다른 dsRNA 분자는 일차 miRNA 전사체 (pri-miRNA) 및 전구체 microRNA (pre-miRNA)를 포함한다. Pre-miRNA shRNAs는 스템루프 구조를 형성하는 일차 miRNA 전사체의 영역을 인지하고 방출하는 효소 Drosha 및 Pasha의 작용에 의해 pri-miRNA로부터 자연적으로 생산될 수 있다. 대안적으로 pri-miRNA 전사체는 인공적/재조합 스템루프 구조로 자연적 스템루프 구조를 대체하도록 엔지니어링할 수 있다. 즉 인공적/재조합 스템루프 구조는 자연적 스템루프 구조가 없는 pri-miRNA 골격 서열에 삽입 또는 클론될 수 있다. pri-miRNA 분자의 일부로서 발현되도록 엔지니어링된 스템루프 서열의 경우 Drosha 및 Pasha는 인공적인 shRNA를 인식하고 방출한다. 이러한 접근법을 사용하여 생산된 dsRNA 분자는 "shmiRNA들", "shmiR들" 또는 "microRNA 프레임워크 shRNA들"로 알려져 있다.
여기서 사용되는 바와 같이 서열과 관련하여 용어 "상보적(complementary)"은 Watson-Crick 염기쌍에 의한 서열의 상보(complement)를 말하며 이에 따라 구아닌(G)은 시토신 (C)과 짝을 이루고, 아데닌 (A)은 우라실 (U)이나 티민 (T)과 짝을 이룬다. 서열은 또 다른 서열의 전체 길이에 상보적일 수 있고 또는 또 다른 서열의 특별한 구역이나 길이에 상보적일 수 있다. 관련분야의 통상의 기술자는 U가 RNA내에 존재할 수 있으며 T가 DNA내에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 RNA나 DNA 서열 중의 A는 RNA 서열 중의 U 또는 DNA 서열 중의 T와 짝을 이룰 수 있다.
여기서 사용되는 바와 같이 용어 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"은 핵산 서열 간, 예컨대 효과기 서열 및 효과기 상보 서열 간 혹은 효과기 서열 및 표적 서열 간에 안정되고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 짝이룸을 지시하는 것으로 사용된다. 핵산의 서열이 그것의 표적이나 상보체(complement)와 100% 상보적일 필요는 없는것으로 알려져 있다 . 그 용어는 돌출부(overhang)는 제외하고 또 다른 서열에 상보적인 서열을 포괄한다. 어떤 경우에 서열은 1-2 미스매치를 제외하고 다른 서열에 상보적이다. 어떤 경우에 서열은 1 미스매치를 제외하고 다른 서열에 상보적이다. 어떤 경우에 서열은 2 미스매치를 제외하고 상보적이다. 다른 경우에 서열은 3 미스매치를 제외하고 상보적이다. 또 다른 경우에 서열은 4 미스매치를 제외하고 상보적이다.
본 개시의 shRNA 또는 shmiR의 문맥에서 사용된 용어 "코딩된"은 DNA 주형으로부터 전사될 수 있는 shRNA 또는 shmiR를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 본 개시의 shRNA 또는 shmiR를 코딩하는 핵산은 shRNA 또는 shmiR 각각의 전사를 위한 주형으로서 기능하는 DNA 서열을 포함할 것이다.
용어 "DNA-유도 RNAi 구조체 " 또는 "ddRNAi 구조체 "는 전사되었을 때에 RNAi를 이끌어내는 shRNA 또는 shmiR 분자를 생산하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. ddRNAi 구조체는, 2 뉴클레오티드 이상의 스템루프로 연결된 이중구조 영역을 갖는 헤어핀 구조로 셀프-어닐링되어, 즉 shRNA 또는 shmiR를 형성할 수 있는 단일 RNA로서, 또는 다중 shRNA 또는 shmiR을 갖는 단일 RNA로서, 또는 각각이 단일 shRNA 또는 shmiR로 각각 폴딩될 수 있는 다중 RNA 전사체들로서 전사되는 핵산을 포함할 수 있다. ddRNAi 구조체는 예컨대 작동가능하게 프로모터에 연결되어 발현 벡터 내, 즉 "ddRNAi 발현 구조체" 내에 존재할 수 있다.
여기서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된(operably-linked)" 또는 "작동가능 링키지(operable linkage)" (또는 유사한) 은 코딩하는 핵산 서열이 조절 서열, 예컨대 프로모터에, 또는 이 서열에 연계하여 코딩 서열의 발현을 용이하게 하는 방식으로 연결되어 있음을 의미한다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기술적으로 인식되어 코딩서열의 발현을 유도하도록 선택되는 여타 발현 조절 구성요소를 포함한다.
"벡터"는 세포로 핵산을 도입하기 위한 운반체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 박테리아, 및 바이러스나 박테리아 원천에서 유도된 운반체를 내포하지만 이에 한정되지 않는다. "플라스미드"는 원형의 이중가닥 DNA 분자이다. 본 개시에 따라 사용하기에 유용한 타입의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 이종성(heterologous) DNA 서열이 바이러스 게놈에 삽입되는데 이는 바이러스 유전자 하나이상 또는 그것의 일부를 결실하도록 개변될 수 있는 것이다. 어떤 벡터는 숙주 세포 내에서 자가복제(autonomous replication)할 수 있다(예컨대 숙주 세포 내에서 기능하는 복제의 원점(origin)을 가진 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 여기서 사용하는 바, 용어 "발현 벡터(expression vector)"는 본 개시의 RNA 분자를 발현할 수 있는 벡터를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용하는 바, 용어 "치료하기", "치료하다" 또는 "치료" 및 이들의 변형은 임상병리학 과정 동안 처리된 개별체나 세포의 자연적 과정을 변환시키도록 디자인된 임상적 개입을 지칭한다. 치료의 이상적인 효과는 질환 진행의 속도 감소, 병상의 개선(palliating) 혹은 증상 완화, 및 차도나 개선된 예후를 포함한다. 다음으로 HBV 감염의 치료는 HBV로 감염된 개체 내에서 HBV 바이러스 로드의 감소, HBV 감염과 연계된 증상의 중증도 감소, 및 개체에서의 HBV의 감염력의 감소를 의미한다. 예를 들어 상기 치료 결과 중 하나 이상이 성취되었다면 개별체(individual)는 성공적으로 "치료된" 것이다.
"치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 특정 질환 (예컨대 HBV 감염)의 측정가능한 개선 효과를 보기 위해 필요한 적어도 최소한의 농도나 양이다. 여기서 치료적 유효량은 환자의 병상, 나이, 성, 및 체중과 같은 요소, 그리고 개별체 내에서 원하는 응답을 이끌어내기 위한 shRNA 또는 shmiR, 그것을 코딩하는 핵산, ddRNAi 또는 발현 구조체의 능력에 따라 가변적일 수 있다. 치료적 유효량은 또한 shRNA 또는 shmiR, 이를 코딩하는 핵산, ddRNAi 또는 발현 구조체의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 혜택을 받는 효과에 의해 압도되는 용량이다.
여기서 사용되는, "개체(subject)" 또는 "환자(patient)"는 HBV로 감염된 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. "비인간 동물"은 영장류, 가축(예컨대 양, 말, 소, 돼지, 당나귀), 반려동물(예컨대 개 및 고양이와 같은 애완동물), 실험실 시험 동물(예컨대 마우스, 토끼, 래트, 기니아피그), 성과 동물(예컨대 경주마, 낙타, 그레이하운드) 또는 포획된 야생동물일 수 있다. 일 예에서 개체 또는 환자는 포유류이다. 일 예에서 개체 또는 환자는 영장류이다. 일 예에서 개체 또는 환자는 인간이다.
용어 "감소된 발현", "발현 감소" 또는 그 유사 용어는 표적 유전자, 예컨대 HBV pol 유전자 또는 다른 HBV 유전자로부터 단백질 및/또는 mRNA 산물이 없거나 관찰가능한 수준의 감소를 지칭한다. 감소는 절대적일 필요는 없으며 본 개시의 핵산이 코딩하는 shmiR에 의한 RNAi의 결과로서 검출가능하거나 관찰가능한 변화에 충분한 부분적 감소일 수 있다. 이러한 감소는 shmiR 또는 shRNA, 이를 코딩하는 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 구조체가 없는 세포에 대해 상대적으로, 표적 핵산으로부터 mRNA 및/또는 단백질 산물의 수준 감소를 결정함으로써 측정할 수 있으며 1 %, 5% 또는 10% 정도로 적거나 절대적, 즉 100% 저해일 수 있다. 감소의 효과는 외부 특징, 즉 세포나 생명체의 양적 및/또는 질적 표현형을 검사함으로써 결정할 수 있으며, 본 개시의 ddRNAi 구조체의 투여에 이어 바이러스 로드를 평가하는 것을 포함할 수도 있다.
RNAi를 위한 제제
일 예에서 본 개시는 짧은 헤어핀 마이크로-RNA (shmiR)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 제공하는데, 상기 shmiR은 다음을 포함한다:
길이상으로 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 서열;
효과기 상보 서열;
스템루프 서열; 및
1차 마이크로 RNA(pri-miRNA) 골격;을 포함하고, 여기서 상기 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에서 제시된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 핵산이다. 바람직하게는 상기 효과기 서열은 길이상 30 뉴클레오티드 미만이다. 예를 들어 적합한 상기 효과기 서열은 길이상 17-29 뉴클레오티드의 범위에 있을 수 있다. 특히 바람직한 예에서 상기 효과기 서열은 길이상 21 뉴클레오티드일 것이다. 더욱 바람직하게는 상기 효과기 서열은 길이상 21 뉴클레오티드이고 효과기 상보 서열은 길이상 20 뉴클레오티드일 것이다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 1에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 2에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 3에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 5에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 6에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 7에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 8에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 10에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 38에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 40에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 42에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 111에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 111에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 113에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 113에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 115에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 115에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 117에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 117에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 119에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 119에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 121에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 121에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 123에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 123에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 125에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 125에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 127에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 127에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 129에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 129에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 131에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 131에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서 shmiR는 서열번호 133에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함한다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 6 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 5 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 4 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 3 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 2 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 상대적으로 1 미스매치 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어 효과기 서열은 서열번호 133에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 전사체에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시의 shmiR의 효과기 서열이 여기에 기재된 HBV RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고 그에 대해 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 미스매치 염기를 함유하는 예에 따르면, 미스매치가 shmiR의 시드영역, 즉 효과기 서열의 뉴클레오티드 2-8 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 12에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 12에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 11에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 11에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 11에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 12에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-1"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 14에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 14에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 13에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 13에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 13에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 14에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-2"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 16에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 16에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 15에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 15에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 15에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 16에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-3"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 18에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 18에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 17에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 17에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 17에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 18에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-4"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 20에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 20에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 19에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 19에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 19에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 20에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-5"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 22에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 22에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 21에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 21에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 21에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 22에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-6"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 24에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 24에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 23에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 23에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 23에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 24에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-7"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 26에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 26에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 25에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 25에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 25에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 26에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-8"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 28에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 28에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 27에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 27에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 27에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 28에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-9"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 30에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 30에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 29에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 29에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 29에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 30에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-10"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 32에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 32에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 31에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 31에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 31에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 32에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-11"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 34에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 34에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 33에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 33에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 33에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 34에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-12"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 36에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 36에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 35에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 35에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 35에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 36에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-13"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 38에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 38에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 37에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 37에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 37에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 38에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-14"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 40에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 40에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 39에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 39에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 39에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 40에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-15"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 42에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 42에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 41에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 41에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 41에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 42에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-16"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 111에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 111에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 112에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 112에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 112에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 111에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-17"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 113에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 113에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 114에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 114에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 114에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 113에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-18"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 115에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 115에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 116에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 116에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 116에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 115에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-19"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 117에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 117에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 118에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 118에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 118에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 117에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-20"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 119에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 119에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 120에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 120에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 120에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 119에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-21"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 121에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 121에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 122에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 122에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 122에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 121에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-22"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 123에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 123에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 124에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 124에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 124에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 123에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-23"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 125에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 125에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 126에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 126에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 126에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 125에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-24"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 127에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 127에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 128에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 128에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 128에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 127에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-25"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 129에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 129에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 130에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 130에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 130에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 129에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-26"으로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 131에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 131에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 132에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 132에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 132에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 131에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-27"로 지정한다.
일 예에서 여기에 기재된 핵산은 다음을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
(i) 효과기 서열이 서열번호 133에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 133에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shmiR는 서열번호 134에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 134에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 134에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 133에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shmiR를 이하에서 "shmiR-28"로 지정한다.
여기 기재된 예 중 어느 것에서든 본 개시의 핵산에 의해 코딩되는 shmiR은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
효과기 상보 서열;
스템루프 서열;
효과기 서열; 및
pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열.
적합한 스템루프 서열은 관련 분야에 공지된 것으로부터 선택될 수 있다. 그러나 예시적인 스템루프 서열을 서열번호 75에서 제시하였다.
본 개시의 핵산에 사용하기 위해 적합한 일차 마이크로 RNA(pri-miRNA 또는 pri-RNA) 골격은 관련 분야에 공지된 것으로부터 선택할 수 있다. 예를 들어 pri-miRNA 골격은 pri-miR-30a 골격, a pri-miR-155 골격, a pri-miR-21 골격 및 a pri-miR-136 골격으로부터 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는 pri-miRNA 골격은 pri-miR-30a 골격이다. pri-miRNA 골격이 pri-miR-30a 골격인 예에 따르면, pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열을 서열번호 76에서 제시하고 pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열을 서열번호 77에 제시하였다. 따라서 본 개시의 shmiR들(예컨대, 여기 기재된 shmiR-1 내지 shmiR-16)을 코딩하는 핵산은 서열번호 76에서 제시된 DNA 서열과 서열번호 77에서 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 59-74 및 146-157 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 59에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 43에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-1)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 60에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 44에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-2)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 61에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 45에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-3)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 62에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 46에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-4)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 63에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 47에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-5)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 64에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-6)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 65에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 49에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-7)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 66에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 50에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-8)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 67에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 51에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-9)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 68에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 52에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-10)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 69에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 53에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-11)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 70에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-12)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 71에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 55에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-13)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 72에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 56에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-14)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 73에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-15)를 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 74에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 58에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-16)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 146에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 134에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-17)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 147에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 135에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-18)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 148에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 136에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-19)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 149에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-20)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 150에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 138에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-21)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 151에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 139에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-22)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 152에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 140에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-23)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 153에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-24)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 154에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 142에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-25)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 155에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 143에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-26)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 156에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 144에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-27)을 코딩한다.
일 예에서, 여기 기재된 핵산은 서열번호 157에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 145에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-28)을 코딩한다
예시적인 본 개시의 핵산은 여기에 기재된 바와 같이 shmiR-6, shmiR-7, shmiR-12 및 shmiR-15에서 선택된 shmiR을 코딩한다. 더 예시적인 본 개시의 핵산은 shmiR-23, shmiR-24, shmiR-25, shmiR-26, shmiR-27 및 shmiR-28에서 선택된 shmiR-12의 변이체를 코딩하거나, 또는 shmiR-17, shmiR-18, shmiR-19, shmiR-20, shmiR-21 및 shmiR-22에서 선택된 shmiR-15의 변이체를 코딩한다.
관련 분야 통상의 기술자는 본 개시에 따른 핵산을 HBV을 처리하기 위한 다른 치료제와 조합하여 또는 결합하여 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 본 개시는 여기 기재된 바와 같이 shmiR (예컨대 여기에 기재된 shmiR1-shmiR-28로 지정된 하나 또는 복수의 shmiR)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 HBV을 처리하기 위한 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 제공한다.
하나의 실시예에서 다음을 포함하는 복수의 핵산을 제공한다:
(a) 여기에 기재된 하나 이상의 핵산; 및
(b) 하기로부터 선택된 추가적인 하나 이상의 핵산:
(i) 여기에 기재된 바와 같이 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 또는
(ii) 길이상으로 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 서열 및 효과기 상보 서열을 포함하는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 상기 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133중 어느 하나에서 제시된 RNA 서열에 실질적으로 상보적인 핵산;
여기서 (a)에서 상기 핵산에 의해 코딩된 상기 shmiR및 (b)에서 상기 핵산에 의해 코딩된 상기 shmiR또는 shRNA는 상이한 효과기 서열을 포함한다. 바람직하게는 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에서 제시된 RNA 서열에 실질적으로 상보적인 (b)(ii)에서 shRNA의 효과기 서열은 길이상 30뉴클레오티드 미만이다. 예를 들어 shRNA의 적합한 효과기 서열은 길이상 17-29 뉴클레오티드의 범위에 있을 수 있다.
따라서 일 예에서 본 개시의 복수의 핵산은 여기에 기재된 바와 같이 shmiR들을 코딩하는 둘 이상의 핵산, 예컨대 여기에 기재된 바와 같이 shmiR들을 코딩하는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯, 또는 일곱, 또는 여덟, 또는 아홉, 또는 열 개의 핵산을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 shRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는데 이는 길이상으로 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 및 효과기 상보서열을 포함하고, 여기서 상기 효과기 서열은 서열번호 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 133 중 어느 하나에서 제시된 RNA 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산이 코딩하는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 12에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 12에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 11에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 11에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 11에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 12에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-1"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 14에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 14에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 13에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 13에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 13에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 14에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-2"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 16에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 16에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 15에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 15에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 15에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 16에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-3"으로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 18에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 18에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 17에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 17에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 17에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 18에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-4"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 20에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 20에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 19에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 19에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 19에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 20에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-5"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 22에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 22에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 21에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 21에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 21에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 22에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-6"으로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 24에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 24에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 23에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 23에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 23에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 24에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-7"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 26에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 26에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 25에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 25에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 25에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 26에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-8"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 28에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 28에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 27에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 27에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 27에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 28에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-9"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 30에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 30에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 29에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 29에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 29에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 30에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-10"으로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 32에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 32에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 31에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 31에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 31에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 32에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-11"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 34에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 34에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 33에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 33에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 33에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 34에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-12"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 36에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 36에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 35에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 35에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 35에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 36에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-13"으로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 38에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 38에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 37에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 37에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 37에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 38에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-14"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 40에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 40에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 39에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 39에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 39에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 40에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-15"로 지정한다.
일 예에서, 복수 중 하나의 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 다음을 포함한다: (i) 효과기 서열이 서열번호 42에서 제시된 서열과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있다면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 염기 미스매치를 제외하고 서열번호 42에서 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 효과기 서열; 및 (ii) 효과기 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 효과기 상보 서열. 예를 들어 핵산에 의해 코딩되는 shRNA는 서열번호 41에서 제시되는 효과기 서열 및 서열번호 41에서 제시되는 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이중구조(duplex)를 형성할 수 있는 효과기 상보 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 41에서 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 효과기 상보 서열은 서열번호 42에 제시된 서열일 수 있다. 이 예에 따른 shRNA 를 이하에서 "shRNA-16"으로 지정한다.
여기에 기재된 복수의 핵산 중 하나 이상의 핵산이 shRNA를 코딩하는 임의의 실시예에 따르면 shRNA는 효과기 서열 및 효과기 상보 서열 사이에 위치한 스템루프 서열을 포함할 수 있다. 적합한 스템 루프 서열은 관련 분야에서 알려진 것들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 적합한 스템 루프를 새로이(de novo) 개발할 수 있다. 하나의 실시예에서, shRNA를 코딩하는 여기에 기재된 복수 중 하나의 핵산은 효과기 서열 및 효과기 상보 서열을 코딩하는 DNA 서열 사이에 위치한 스템루프 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 개시의 핵산에 의해 코딩된 shRNA는 서열번호 78-93 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 따라서 여기에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 핵산은 서열번호 94-109 중 어느 하나에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 59에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 43에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-1)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 60에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 44에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-2)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 61에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 45에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-3)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 62에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 46에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-4)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 63에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 47에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-5)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 64에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-6)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 65에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 49에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-7)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 66에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 50에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-8)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 67에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 51에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-9)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 68에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 52에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-10)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 69에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 53에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-11)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 70에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-12)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 71에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 55에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-13)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 72에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 56에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-14)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 73에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-15)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 74에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 58에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-16)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 146에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 134에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-17)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 147에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 135에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-18)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 148에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 136에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-19)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 149에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-20)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 150에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 138에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-21)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 151에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 139에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-22)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 152에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 140에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-23)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 153에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-24)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 154에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 142에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-25)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 155에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 143에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-26)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 156에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 144에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-27)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
일 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 서열번호 157에서 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 145에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된 shmiR (shmiR-28)을 코딩하는 핵산, 및 HBV를 표적하는 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 본 개시의 다른 핵산 하나 이상을 포함한다.
여기 기재된 복수의 핵산 중의 임의의 예에 따르면, 복수의 핵산은 여기 기재된 바와 같은 shmiR들 또는 shRNA들을 코딩하는 둘 이상의 핵산, 예컨대 여기 기재된 바와 같이 shmiR들을 코딩하는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯 또는 여섯 또는 일곱 또는 여덟 또는 아홉 또는 열개의 핵산을 포함할 수 있으며, 단 그 핵산 중 적어도 하나는 본 개시의 shmiR들을 코딩한다.
일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 두개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 세개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 네개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 다섯개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 여섯개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 일곱개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 여덟개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 아홉개의 핵산을 포함한다. 일 예에서, 그 핵산 중 적어도 하나가 여기 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩한다면 복수의 핵산은 여기 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 열개의 핵산을 포함한다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다. 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 갖는 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 적합한 핵산은 여기에 기재되어 있다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 5에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다. 서열번호 5에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 갖는 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 적합한 핵산은 여기에 기재되어 있다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다. 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 갖는 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 적합한 핵산은 여기에 기재되어 있다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 40에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다. 서열번호 40에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 갖는 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 적합한 핵산은 여기에 기재되어 있다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR의 효과기 서열은 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR의 효과기 서열은 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적이다; 그리고 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR의 효과기 서열은 서열번호 5에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열은 서열번호 4에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이고, 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR의 효과기 서열은 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA전사체에 실질적으로 상보적이다; 그리고 복수의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는 shmiR의 효과기 서열은 서열번호 40에서 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다.
서열번호 4, 5, 6, 또는 40에 제시된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 효과기 서열을 포함하는 shmiR들을 포함하면서 HBV를 표적하는 shmiR들을 코딩하는 본 개시의 예시적 핵산은 여기에 기재되며 필요한 부분만 약간 수정하여 본 개시의 복수의 핵산이 기재된 각각의 예에 적용될 수 있다.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산: 및
(ii) 서열번호 33에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) 서열번호 33에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) HBV 게놈의 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 길이상 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 서열을 포함하는 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 다른 핵산.
일 예에서, 본 개시의 다른 핵산은 (i) 및 (ii)에서 핵산에 의해 코딩된 shmiR들의 것과는 상이한 효과기 서열을 갖는 하나의 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 여기에 기재된 핵산이다.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) 서열번호 39에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) 서열번호 33에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) 서열번호 23에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 24에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) 서열번호 33에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) 서열번호 39에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) 서열번호 33에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(ii) 서열번호 116에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 117에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(ii) 서열번호 124에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 125에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 21에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) 서열번호 116에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 117에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) 서열번호 124에서 제시된 서열로 구성된 효과기 서열 및 서열번호 125에서 제시된 서열로 구성된 효과기 상보 서열을 포함하는 하나의 shmiR을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(ii) (서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) (서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) (서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) (서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) (서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) (서열번호 83에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 99에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) (서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(ii) (서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 149에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(ii) (서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 153에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
일 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 다음을 포함한다:
(i) (서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산;
(ii) (서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 149에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(iii) (서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 하나의 shmiR을 코딩하는) 서열번호 153에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 DNA 서열을 포함하는 핵산.
복수의 핵산을 제공하는 일 예에 따르면, 두개 이상의 핵산은 동일한 폴리뉴클레오티드의 별도의 부분을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 복수의 핵산 중 두개 이상이 상이한 폴리뉴클레오티드의 부분들을 각각 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 여기 기재된 복수의 핵산은 다중 구성분 예컨대 다중 조성물로서 제공된다. 예를 들어, 복수의 핵산 각각은 별개로 제공될 수 있다. 대안적으로 본 개시의 핵산 세개 이상이 제공되는 예에서, 그 핵산 중 하나 이상이 별도로 제공될 수 있으며 복수 중 두개 이상은 함께 제공될 수 있다.
어떤 예들에서, 본 개시에 따른 핵산 또는 각각의 핵산은 예컨대 RNA의 전사를 용이하게 하기 위하여 추가적인 구성요소를 포함하거나 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 각각의 핵산은 여기에 기재된 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 구성요소, 예를 들어 전사 종결자 및 개시자는 관련 분야에 공지 및/또는 여기에 기재되어 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로 본 개시에 따른 핵산 또는 각각의 핵산은 예컨대 클로닝 또는 발현 벡터에 핵산을 클로닝하는 것을 용이하게 하기 위하여 하나 이상의 제한효소 자리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기 기재된 핵산은 본 개시의 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 상류 및/또는 하류에 제한효소의 자리를 내포할 수 있다. 적합한 제한효소 인식 서열은 관련 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있을 것이다. 그러나 일 예에서 본 개시의 핵산은 5' 말단, 즉 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 상류에 BamH1 제한효소 자리 (GGATCC), 및 3' 말단, 즉 shmiR 또는 shRNA을 코딩하는 서열의 하류에 EcoR1 제한효소 자리 (GAATTC)을 내포할 수 있다.
ddRNAi
일 예에서 본 개시의 핵산 또는 각각의 핵산은 DNA-유도 RNAi (ddRNAi) 구조체의 형태로 또는 그에 포함되어 제공된다. 따라서 일 예에서 본 개시는 여기에 기재된 바와 같이 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체를 제공한다. 또 다른 예에서 본 개시는 여기 기재된 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체를 제공한다. HBV 전사체를 표적하는 효과기 서열을 포함하는 shmiR들 또는 shRNA들을 코딩하는 예시적 핵산이 여기에 기재되며 본 개시의 이러한 예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용될 것이다.
일 예에서, ddRNAi 구조체는 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 개시의 핵산을 포함한다.
ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 예에 따르면, 각각의 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 예에서, ddRNAi 구조체 내의 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 예에서, ddRNAi 구조체 내의 핵산은 상이한 프로코터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 59에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 43에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-1)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 60-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 60에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 44에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-2)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59, 61-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 61에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 45에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-3)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-60, 62-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 62에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 46에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-4)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-61, 63-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 63에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 47에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-5)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-62, 64-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 64에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-6)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-63, 65-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 65에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 49에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-7)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-64, 66-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 66에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 50에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-8)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-65, 62-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 67에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 51에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-9)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-66, 68-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 68에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 52에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-10)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-67, 69-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 69에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 53에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-11)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-68, 70-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 70에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-12)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-69, 71-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 71에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 55에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-13)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-70, 72-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 72에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 56에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-14)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-71, 73-74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 73에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-15)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-72, 74 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 74에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 58에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-16)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-73 및 146-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 146에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 134에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-17)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74 및 147-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 147에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 135에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-18)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146 및 148-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 148에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 136에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-19)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146, 147 및 149-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 149에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-20)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-148 및 150-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 150에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 138에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-21)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-149 및 151-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 151에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 139에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-22)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-150 및 152-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 152에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 140에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-23)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-151 및 153-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 153에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-24)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-152 및 154-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 154에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 142에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-25)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-153 및 155-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 155에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 143에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-26)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-154 및 156-157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 156에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 144에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-27)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74, 146-155 및 157 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi는 서열번호 157에서 제시된 DAN 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하고 서열번호 145에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR (shmiR-28)을 코딩한다. 그 ddRNAi 구조체는 본 개시의 핵산, 예컨대 서열번호 59-74 및 146-156 중 어느 하나에서 제시된 핵산들로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 예시적인 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 예시적인 ddRNAi 구조체는다음을 포함한다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) (shmiR-12를 코딩하는) 서열번호 70 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
또다른 예에서, 본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체는다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체는다음을 포함할 수 있다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) (shmiR-20을 코딩하는) 서열번호 149 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
또 다른 예에서, 본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체는다음을 포함할 수 있다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) (shmiR-24를 코딩하는) 서열번호 153 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시는 ddRNAi 구조체가 서로 상이한, HBV를 표적하는 세개 이상의 shmiR들을 코딩하도록 여기에 기재된 핵산 세 개 이상을 포함하는 ddRNAi 구조체를 또한 제공한다.
일 예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 ddRNAi 구조체를 제공한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 여기에 기재된 바와 같이 하나의 shmiR 또는 shRNA 을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
여기서 (b)에서의 핵산은 (a) 및 (c)에서 핵산에 의해 코딩된 shmiR들의 것과 상이한 효과기 서열을 갖는 하나의 shmiR 또는 shRNA를 코딩한다.
일 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번 호57 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) (shmiR-15을 코딩하는) 서열번호 73 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) (shmiR-12을 코딩하는) 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
일 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 49 (shmiR-7)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) (shmiR-7을 코딩하는) 서열번호 65 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) (shmiR-12을 코딩하는) 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
일 예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 ddRNAi 구조체를 제공한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 여기에 기재된 바와 같이 하나의 shmiR 또는 shRNA 을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(c) 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
여기서 (b)에서의 핵산은 (a) 및 (c)에서 핵산에 의해 코딩된 shmiR들의 것과 상이한 효과기 서열을 갖는 하나의 shmiR 또는 shRNA를 코딩한다.
일 예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 ddRNAi 구조체를 제공한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 여기에 기재된 바와 같이 하나의 shmiR 또는 shRNA 을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 및
(c) 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
여기서 (b)에서의 핵산은 (a) 및 (c)에서 핵산에 의해 코딩된 shmiR들의 것과 상이한 효과기 서열을 갖는 하나의 shmiR 또는 shRNA를 코딩한다.
일 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) (shmiR-6을 코딩하는) 서열번호 64 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) (shmiR-20을 코딩하는) 서열번호 149 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) (shmiR-24를 코딩하는) 서열번호 153에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
더욱 또다른 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 여기에 기재된 바와 같이 shmiR를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 여기에 기재하는 바와 같이 HBV를 표적하는 shRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있는데 여기서 ddRNAi 구조체에 의해 코딩된 shmiR 및 shRNA는 상이한 효과기 서열을 포함한다. 이러한 예에 따라 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 39에 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shRNA를 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) 서열번호 92에 제시된 서열로 구성된 shRNA를 코딩하는 핵산; 및
(c) 서열번호 54 에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) 서열번호 108에 제시된 서열 을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체를 설명하는 전술한 각각의 예에서, 거기 포함된 핵산 또는 각각의 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어 여기에 기재된 ddRNAi 구조체는 예컨대 ddRNAi 구조체로부터 하나 이상의 shmiR들 및/또는 shRNA들의 발현을 추진하기 위해 거기에 포함된 포함된 핵산 또는 각각의 핵산에 작동가능하게 연결된 단일 프로모터를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, ddRNAi 구조체에 포함된 본 개시의 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 각각의 핵산은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
다중 프로모터가 존재하는 예에 따르면 그 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 구조체는 본 개시의 상이한 핵산에 각각 작동가능하게 연결된 채 동일한 프로모터의 다수 카피를 포함할 수 있다. 또다른 예에서 본 개시의 RNA에 작동가능하게 연결된 각각의 프로모터는 상이하다. 예를 들어, 세개의 shmiR들을 코딩하는 ddRNAi 구조체에서는 세개의 shmiR들을 코딩하는 세개의 핵산은 상이한 프로모터에 각각이 작동가능하게 연결되어 있다.
추가적인 예에서, 세개 이상의 shmiR들을 코딩하는 ddRNAi 구조체에서는 shmiR들을 코딩하는 핵산 중 둘 (또는 그 이상)이 동일한 프로모터에 연결되어 있고 shmiR들을 코딩하는 핵산 중 하나 (또는 그 이상)는 상이한 프로모터에 연결되어 있다.
일 예에서, 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터이다. 프로모터에 관하여 언급 시, 용어 "구성적(constitutive)"이란 프로모터가 특이적 자극(예컨대 열충격, 화학물질, 빛 등)이 없을 때 작동가능하도록 연결된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있는 것을 의미한다. 전형적으로 구성적 프로모터는 대체로 어떠한 세포나 어떠한 조직에서도 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 본 개시의 핵산(들)로부터 shmiR들 또는 shRNA들을 전사하는데 사용되는 프로모터는 RNA polymerase II 에 의해 제어되는 pgk 유전자, 유비퀴틴, CMV, β-액틴, 히스톤 H4, 또는 EF-1α, 또는RNA polymerase I에 의해 제어되는 프로모터 구성요소를 내포한다.
일 예에서, CMV, SV40, U1, β-액틴 또는 하이브리드 Pol II 프로모터와 같은 Pol II 프로모터가 채용된다.
또 다른 예에서 RNA polymerase III에 의해 제어되는 프로모터가 사용되는데, U6 프로모터 (U6-1, U6-8, U6-9), H1 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터 (hY1, hY3, hY4 (Maraia, et al., Nucleic Acids Res 22(15):3045-52(1994) 참조) 및 hY5 (Maraia, et al., Nucleic Acids Res 24(18):3552-59(1994) 참조), 인간 MRP-7-2 프로모터, 아데노바이러스 VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 또는 5s 리보조말 RNA 프로모터과 같은 것들이다.
본 개시의 ddRNAi 구조체용으로 적합한 프로모터는 미국특허 제8,008,468호 및 미국특허 제8,129,510호에 기재되어 있다.
일 예에서, 프로모터는 RNA pol III 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6 프로모터 (예컨대 U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터)이다. 또다른 예에서, 프로모터는 H1 프로모터이다.
여기에 기재된 바와 같이, 복수의 shmiR들을 코딩하거나, 또는 하나 이상의 shmiR들 및 하나의 shRNA를 코딩하는 본 개시의 ddRNAi 구조체의 경우, ddRNAi 구조체에서의 핵산 각각은 U6 프로모터 예컨대 별개의 U6 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
일 예에서, 구조체에서의 프로모터는 U6 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-1 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-8 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-9 프로모터이다.
어떤 예에서, 가변적 강도의 프로모터가 채용된다. 예를 들어, 두개 이상의 강한 프로모터 (Pol III-type 프로모터 같은 것)를 사용하면 예컨대 가용성 뉴클레오티드의 풀 또는 전사를 위해 필요한 기타 세포 구성원들을 결실시킴으로써 세포에 많은 부담을 줄 수도 있다. 게다가 또는 대안적으로 몇 개의 강한 프로모터를 사용하면 세포에서 RNAi 물질 예컨대, shmiR들 또는 shRNA들의 발현의 독성적 수준을 유발할 수 있다. 따라서 어떤 예에서는 다중-프로모터 ddRNAi 구조체에서의 프로모터 중 하나 이상이 구조체 내에서의 다른 프로모터보다 약하거나, 또는 구조체 내에서의 모든 프로모터가 최대 속도보다 작게 shmiR들 또는 shRNAs를 발현할 수도 있다. 전사의 더 약한 수준 또는 더 강한 수준을 얻기 위하여 다양한 분자적 테크닉을 이용하여, 또는 예컨대 다양한 조절 구성요소의 개변을 통하여 프로모터를 또한 개변할 수도 있다. 감소된 전사를 달성하기 위한 하나의 수단은 프로모터 활성을 제어한다고 알려진 프로모터 내에서의 서열 구성요소를 개변하는 것이다. 예를 들면 Proximal Sequence Element (PSE) 가 인간 U6 프로모터의 활성을 유효하게 한다고 알려져 있다 (Domitrovich,　et al.,　Nucleic Acids Res　31:　2344-2352　(2003)참조). 강한 프로모터, 예컨대 인간 U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터내에 존재하는 PSE 구성요소를 약한 프로모터, 예컨대 인간 U6-7 프로모터로부터의 구성요소로 대체함으로써 하이브리드　U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터의 활성을 감소시킨다. 이러한 접근법이 본 출원에 기재된 실시예에서 사용되었지만 이러한 결과를 달성하기 위한 다른 수단도 관련 분야에 알려져 있다.
본 개시의 어떤 예에서 유용한 프로모터는 조직-특이적이거나 세포-특이적일 수 있다. 용어 "조직 특이적"이란 프로모터에 적용될 때는 상이한 유형의 조직(예컨대 근육)에서는 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없이 특이적 유형의 조직(예컨대 간 조직)으로 관심있는 핵산의 선택적 전사를 유도할 수 있는 프로모터를 말한다. 프로모터에 적용되는 용어 "세포 특이적"이란 동일 조직 내에서 상이한 유형의 세포에서는 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없이 특정 유형의 세포에 관심있는 핵산의 선택적 전사를 유도할 수 있는 프로모터를 말한다.
일 예에서 본 개시의 ddRNAi 구조체는 여기에 기재된 핵산에 의해 코딩된shmiR들 또는 shRNA들의 발현을 증가시키기 위해 하나 이상의 인핸서들을 추가로 포함해도 된다. 본 개시의 예에서 사용하기에 적당한 인핸서는 Apo E HCR 인핸서, CMV 인핸서 (Xia et al, Nucleic Acids Res 31-17(2003)), 및 관련 분야에서 알려진 다른 인핸서를 내포한다. 본 개시의 ddRNAi 구조체에서 사용하기에 적합한 인핸서는 미국특허 제 8,008,468호에 기재되어 있다.
추가적인 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 본 개시의 shmiR 또는 shRNA를 코딩하는 핵산에 연결된 전사 종결자(transcriptional terminator)를 포함해도 된다. 여기에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체, 즉 다중 shmiR들 및/또는 shRNAs 를 코딩하는 경우, 각각의 핵산에 연결된 종결자들은 동일하거나 상이할 수 있다. RNA pol III 프로모터가 채용되는 예에 따르면 종결자는 4 이상 또는 5 이상 또는 6 이상 T 잔기의 근접한 쭉 뻗은 연속 스트레치 줄(contiguous stretch)이어여도 된다.
어떤 예에서, 상이한 프로모터가 사용되는 곳에서는 종결자가 상이할 수 있으며 그 종결자가 유래한 유전자로부터의 프로모터와 매치된다. 그런 종결자는 SV40 poly A, AdV VA1 유전자, 5S 리보좀 RNA 유전자, 및 인간 t-RNA들을 위한 종결자들을 포함한다. 게다가, RNA pol II 프로모터 및 종결자에서 흔히 이루어지는 바와 같이, 프로모터와 종결자는 혼합되고 매치될 수 있다.
일 예에서, 구성요소 간의 DNA 재조합이 일어나는 일의 가능성을 감소시키기 위해서는 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체 내에서 각각의 핵산에 사용되는 프로모터와 종결자 조합은 상이하다.
본 개시의 하나의 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들면 본 개시의ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다.
본 개시의 또 다른 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어 본 개시의 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다.
본 개시의 또 다른 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어 본 개시의 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다
본 개시의 또다른 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 49에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어 본 개시의 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 65에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다
본 개시의 또다른 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 137에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어 본 개시의 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 149에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다.
본 개시의 또 다른 예시적인 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 141에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어 본 개시의 ddRNAi 구조체는 U6 프로모터 예컨대, U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 153에서 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진 핵산을 포함한다.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 하나의 예에 따르면 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 또다른 예에 따르면, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 153 (shmiR-24를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 더욱 또 다른 예에 따르면 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 149 (shmiR-20을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 세개의 핵산을 포함하는 하나의 예에 따르면 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 57 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 73 (shmiR-15를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70(shmiR-12를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 세개의 핵산을 포함하는 또다른 예에 따르면 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 149 (shmiR-20을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 153 (shmiR-24를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 세개의 핵산을 포함하는 더욱 또다른 예에 따르면 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 49 (shmiR-7)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산.
예를 들어, 그 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 65 (shmiR-7을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70 (shmiR-12를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시의 예시적 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 73에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
본 개시의 예시적 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 149에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 159에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
본 개시의 또다른 예시적 ddRNAi 구조체는 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
(b) 서열번호 65에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
(c) 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
본 개시의 ddRNAi 구조체가 여기에 기재된 바와 같이 shmiR을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 여기에 기재된 바와 같이 HBV를 표적으로 하는 shRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 또 다른 예에 따르면, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 92에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shRNA를 코딩하는 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산.
예를 들어, ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 108에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산.
본 개시는 또한 두 개 이상의 ddRNAi 구조체를 포함하는 복수의 ddRNAi 구조체를 제공하는데 각각은 여기에 기재된 바와 같이 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 개시의 shmiR을 코딩하는 핵산을 포함하는 것이다.
일 예에서 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70 (shmiR-12을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
일 예에서 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 57 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 73 (shmiR-15를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
일 예에서 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 57 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 73 (shmiR-15를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
일 예에서 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 149 (shmiR-20을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
일 예에서 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 153 (shmiR-24를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
복수의 ddRNAi 구조체가 세개의 ddRNAi 구조체를 포함하는 예에 따르면 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 57 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 73 (shmiR-15를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70 (shmiR-12를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
복수의 ddRNAi 구조체가 세개의 ddRNAi 구조체를 포함하는 또 다른 예에 따르면 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 49 (shmiR-7)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 a ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 65 (shmiR-7을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70 (shmiR-12를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
또다른 예에 따르면 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 92 (shmiR-15)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 54 (shmiR-12)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 a ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 108 (shmiR-15를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 a ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 70 (shmiR-12를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 a ddRNAi 구조체.
복수의 ddRNAi 구조체가 세개의 ddRNAi 구조체를 포함하는 또다른 예에 따르면 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함한다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 48 (shmiR-6)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 137 (shmiR-20)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 141 (shmiR-24)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 shmiR 을 코딩하는 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조체는 다음을 포함할 수 있다:
(a) U6 프로모터, 예컨대 U6-9 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 64 (shmiR-6을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체;
(b) U6 프로모터, 예컨대 U6-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 149 (shmiR-20을 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 a ddRNAi 구조체; 및
(c) U6 프로모터, 예컨대 U6-8 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 153 (shmiR-24를 코딩하는 것)에 제시된 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 포함하는 ddRNAi 구조체.
게다가 ddRNAi 구조체 또는 각각의 ddRNAi 구조체는 하나 이상의 다중 클로닝 자리 및/또는 독특한 제한효소 자리를 포함할 수 있는데 이것들은 프로모터, the shmiR 또는 shRNA 및/또는 다른 조절 구성요소를 코딩하는 핵산이 쉽게 제거되거나 교체되도록 전략적으로 위치하는 것이다. ddRNAi 구조체 또는 각각의 ddRNAi 구조체는 전략적으로 위치된 제한효소 자리 및/또는 상보적인 접합말단(sticky ends)을 이용하여 보다 작은 올리고뉴클레오티드 구성분으로부터 조립될 수 있다. 본 개시에 따른 하나의 접근법을 위한 기초 벡터는 (비록 이것이 절대적인 요건은 아니지만) 모든 자리가 독특한 멀티링커를 갖는 플라스미드를 포함한다. 연속적으로, 각각의 프로모터는 그 지정된 독특한 자리 사이에 삽입되어 결과적으로 하나 이상의 프로모터를 갖는 기초 카세트를 만드는데, 모든 프로모터는 다양한 방향성을 가질 수 있다. 재차 연속적으로, 어닐링된 프라이머 쌍은 개별적 프로모터 각각의 하류에서 독특한 자리에 삽입되어 단일, 이중 또는 다중의 발현 카세트 구조체를 결과적으로 만든다. 삽입물은 예컨대 AdV 골격 또는 AAV 골격으로 옮겨질 수 있는데 이는 단일, 이중 또는 다중 발현 카세트 삽입처에 인접하는 두개의 독특한 제한효소 자리(동일하거나 상이한 것들)를 이용하는 것이다.
구조체나 각각의 구조체는 관련분야에서 알려진 적절한 유전공학적 기술을 이용하여 만들 수 있는데 이는 PCR 기준 기술, 올리고뉴클레오티드 합성, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 라이게이션, 형질전환(transformation), 플라스미드 정제, 및 DNA 시퀀싱을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 구조체나 각각의 구조체가 바이러스 구조체인 경우 그 구조체는 예를 들어 바이러스 입자에 ddRNAi 구조체를 포장하기에 필요한 서열 및/또는 ddRNAi 구조체를 표적 세포 게놈에 통합되도록 하는 서열을 포함한다. 어떤 예에서 바이러스의 구조체나 그 각각은 바이러스의 복제 및 증식을 하게 하는 유전자를 더 함유하지만 그러한 유전자는 trans 로 공급될 것이다. 또한 바이러스의 구조체나 그 각각은 자연적 형태 또는 개변된 형태로 합병된 임의의 알려진 유기체의 게놈에서 유래한 유전자나 유전 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어 바이러스의 구조체는 박테리아 내에서 구조체의 복제에 유용한 서열을 포함할 수 있다.
구조체나 각각의 구조체가 추가적인 유전 구성요소들을 함유할 수 있다. 구조체가 포함하는 구성요소의 타입은 어떤 식으로든 제한되는 것이 아니며 관련분야 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 유전 구성요소들은 리포터 유전자를 내포할 수 있는데, 리포터 유전자는 예를 들어 GFP나 RFP과 같이 형광마커 단백질; 베타-갈락토시다아제, 루시페라제, 베타-글루큐로니다제, 클로람페니칼 아세틸 트렌스페라아제 또는 분비된 태아 알칼라인 포스페이타제와 같이 쉽게 어세이되는 효소; 또는 호르몬이나 사이토카인과 같이 면역분석이 쉽게 적용가능한 단백질을 위한 하나 이상의 유전자 같은 것들이 있다.
본 개시의 구체화시 사용될 수 있는 수 있는 기타 유전 구성요소들은 아데노신 디아미나제, 아미노글리코딕 포스포트랜스페라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 히그로마이신-B-포스포트랜스페라제, 약제내성과 같이 세포에 선택적인 성장 잇점을 수여하는 단백질을 코딩하는 것들, 또는 영양요구체(auxotroph)에서 결여된 생합성 능력을 제공하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 포함한다. 만일 리포터 유전자가 구조체나 각각의 구조체와 함께 내포되는 경우, 내부 리보좀 출입 자리(internal ribosomal entry site (IRES)) 서열도 포함될 수 있다. 일 예에서, 추가적인 유전 구성요소들은 독립적인 프로모터/인핸서와 작동가능하게 연결되고 이것에 의해 제어된다. 또한 박테리아 내에서 구조체의 증식을 위한 적합한 복제 원점(origin)이 채용될 수 있다. 복제 원점의 서열은 일반적으로 ddRNAi 구조체 및 다른 유전 서열과는 분리되어 있다. 그러한 복제의 원점은 관련 분야에 알려져 있으며 pUC, ColE1, 2-미크론 또는 SV40 복제 원천을 내포하고 있다.
발현 벡터
일 예에서, 본 개시의 ddRNAi 구조체는 발현 벡터 내에 내포되어 있다.
일 예에서, 발현 벡터는 예컨대 관련 분야에서 알려져 있는 바와 같이 플라스미드이다. 일 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pSsh 벡터로서, 예컨대 U6 프로모터 및 근위 서열 요소 (proximal sequence element) 7 (PSE7)을 갖는 pSsh 벡터이다.
일 예에서, 발현 벡터는 미니-서클 DNA이다. 미니-서클 DNA는 미국 특허 공개 공보 제2004/0214329호에 기재되어 있다. 미니-서클 DNA는 핵산 전사를 높은 수준으로 꾸준히 하기 위해 유용하다. 원형 벡터는 발현-침묵 박테리아 서열이 없는 것이 특징이다. 예를 들어, 미니-서클 벡터는 복제의 원점이 없고, 박테리아 플라스미드에서 흔히 발견되는 약물 선택 마커, 예컨대 β-락타마아제, tet, 등등이 결여되어 있다는 점에서 박테리아 플라스미드 벡터와 상이하다. 결과적으로 미니서클 DNA는 크기가 더 작아져 더 효율적인 전달이 가능하다.
일 예에서, 발현 벡터는 바이러스의 벡터이다.
임의의 적절한 바이러스에 기초한 바이러스의 벡터가 본 개시의 ddRNAi를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스성 전달 시스템의 선택은 다양한 파라미터, 예컨대 전달을 위해 표적된 조직, 시스템의 형질도입(transduction) 효율, 병원성(pathogenicity), 면역학적 및 독성학적 관련성 등등에 따라 달라질 것이다.
유전자 치료에서 사용되는 바이러스 시스템 중 흔히 사용되는 부류는 그 게놈이 숙주 세포 크로마틴으로 통합되는가(온코레트로바이러스 및 렌티바이러스) 또는 염색체외 에피좀으로서 세포의 핵에 대부분 유지되는가(아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스)에 따라 두 개의 군으로 카테고리화할 수 있다. 일 예에서, 본 개시의 바이러스성 벡터는 숙주 세포의 크로마틴에 통합된다. 또 다른 예에서 본 개시의 바이러스성 벡터는 염색체외 에피좀으로서 숙주 세포의 핵에서 유지된다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성(AdV) 벡터이다. 아데노바이러스는 중간 크기의 이중가닥, 비외피형(non-enveloped) DNA 바이러스로서 26-48 Kbp의 선형 게놈을 갖는다. 아데노바이러스는 수용체 매개성 결합 및 내포화(internalization)에 의해 표적 세포에 들어가며 비분열 및 분열 세포 둘다에서 핵을 투과하게 된다. 아데노바이러스는 생존과 복제를 위해 숙주 세포에 매우 의존적이며 숙주의 복제 기계를 이용하여 척추동물 세포의 핵에서 복제될 수 있다.
일 예에서 바이러스성 벡터는 파보비리대(Parvoviridae)과이다. 파보비리대는 작은 단일가닥형, 비외피성 DNA 바이러스과이며 게놈은 약 5000뉴클레오티드 길이다. 그 과에 속하는 것으로서 아데노-관련 바이러스(AAV)가 있다. 일 예에서, 본 개시의 바이러스성 벡터는 AAV이다. AAV는 일반적으로 다른 바이러스(전형적으로는 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)와 공동감염하여야 생산적인 감염 사이클을 시작하고 유지할 수 있는 의존성 파보바이러스이다. 그런 도움자(helper) 바이러스가 없는 경우 AAV는 여전히 수용체 매개성 결합 및 내포화(internalization)에 의해 표적 세포를 감염하거나 형질도입할 수 있으며 비분열 및 분열 세포 둘다에서 핵을 투과하게 된다. 도움자 바이러스가 없는 경우 AAV 감염으로부터 자손 바이러스가 생산되지 않으므로 형질도입의 정도는 그 바이러스로 감염된 초기의 세포에만 제한된다. 바로 이점이 AAV를 본 개시의 이상적 벡터로 만드는 것이다.
더욱이 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 단순헤르페스 바이러스와 달리, AAV는 인간에 대한 병원성 및 독성이 없는 것으로 나타난다(Kay, et al., Nature. 424: 251 (2003)). 게놈이 보통 단지 두 개의 유전자만을 코딩하므로 전달 운반체로서 AAV가 4.5 단일가닥 킬로베이스(kb)의 포장 능력으로 제한되는 것도 놀라운 일이 아니다. 그러나 이러한 크기 제한이 대체 유전자 치료에서 전달할 수 있는 유전자를 제한하더라도 shmiR들 및 shRNA들과 같은 짧은 서열의 포장과 발현에 악영향를 주지는 않는다.
본 개시의 ddRNAi 구조체에 유용한 또 다른 바이러스성 전달 시스템은 레트로비리대(Retroviridae)과의 바이러스에 기초한 시스템이다. 레트로바이러스는 두가지 독특한 특징을 갖는 단일 가닥성 RNA 동물 바이러스이다. 첫째, 레트로바이러스의 게놈은 이배체(diploid)이고 RNA의 두 카피로 구성되어 있다. 둘째, 이 RNA는 비리온-연계 효소인 역전사효소에 의해 이중 가닥 DNA로 전사된다. 이 이중가닥 DNA 또는 프로바이러스는 이 때 숙주 게놈으로 통합되며 숙주 게놈의 안정적으로 통합된 구성원으로서 부모 세포로부터 자손 세포에게 전달된다.
어떤 예에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 종종 수포성 구내염 바이러스(vesicular steatites virus) (VSV-G)로 위형화(pseudotyped)되며 인간 면역결핍성 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV); 양에게 뇌염 (visna) 또는 폐렴을 유발하는 비산매디(visan-maedi); 말에게 자가면역성 용혈성 빈혈 및 뇌병(encephalopathy)을 유발하는 말전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus) (EIAV); 고양이에게 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍성 바이러스(feline immunodeficiency virus) (FIV); 소에게 임파선염(lymphadenopathy) 및 림프구증가증(lymphocytosis)을 유발하는 소 면역결핍성 바이러스(bovine immunodeficiency virus) (BIV); 및 비인간 영장류에게 면역 결핍성 및 뇌병을 유발하는 원숭이 면역결핍성 바이러스 (simian immunodeficiency virus) (SIV)로부터 유래되었다. HIV에 기초하는 벡터는 부모 게놈의 <5%를 보유하고 게놈의 <25%가 포장 구조체에 통합되는데, 이는 복귀하는 복제 가능 HIV의 발생 가능성을 최소화한다. 하류의 긴 말단 반복 서열(long-terminal-repeat sequence)에서 조절 구성요소(regulatory elements)의 결핍을 함유하여 벡터 동원에 요구되는 포장 신호의 전사를 제거하는 자가-비활성형 벡터를 개발함으로써 바이오 안전성은 더 증가되었다. 렌티바이러스성 벡터를 사용하는 주된 잇점의 하나는 형질도입된 세포의 세포 분열 이후라도 유전자 전이가 대부분의 조직이나 세포 유형에서 지속적이라는 점이다.
본 개시의 핵산 및 ddRNAi 구조체로부터의 shmiR들 및/또는 shRNA들을 발현하기 위해 사용되는 렌티바이러스계 구조체는 렌티바이러스의 5' 및 3' 긴 말단 반복서열 (LTRs) 로부터의 서열을 포함한다. 일 예에서, 바이러스성 구조체는 렌티바이러스로부터의 비활성된 또는 자가-비활성 3'LTR을 포함한다. 3' LTR은 관련 분야에서 알려진 임의의 방법으로 자가 비활성화될 수도 있다. 예를 들어 3' LTR의 U3 구성요소는 그 인핸서 서열, 예컨대 TATA box, Sp1 및 NF-kappa B 자리들의 결실을 함유한다. 3' LTR을 자가 비활성화한 결과로서, 숙주 게놈에 통합되는 프로바이러스는 비활성화된 5' LTR을 함유한다. LTR 서열은 임의의 종으로부터의 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 렌티바이러스계 구조체는 또한 MMLV 또는 MSCV, RSV 또는 포유류 유전자에 대한 서열을 통합할 수 있다. 게다가 렌티바이러스성 5LTR로부터의 U3 서열은 바이러스성 구조체 내 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 포장 세포주로부터 회수되는 바이러스의 역가(titer)를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열도 또한 포함될 수 있다.
관련 분야 통상의 기술자에게 알려진 기타 바이러스성 및 비바이러스성 시스템이 본 발명의 ddRNAi 또는 핵산을 관심있는 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있는데 이는 유전자-결실형 아데노바이러스-트랜스포손 벡터(Yant, et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002) 참조); 신드비스 바이러스 또는 셈리키삼림열 바이러스(Semliki forest virus)에서 유래된 시스템 (Perri, et al, J. Virol. 74(20):9802-07 (2002) 참조); 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus) 또는 센다이 바이러스에서 유래된 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 핵산 및 ddRNAi 구조체의 시험
세포 배양 모델
HBV는 배양시 세포를 감염시키지 않는다. 그러나 HuH7 또는 Hep G2 간세포로의 HBV DNA의 (머리-꼬리 다이머로서 또는 >100%의 "과장(overlength)" 유전자로서) 형질주입(transfection)은 바이러스 유전자의 발현과 HBV 비리온이 생산되어 매질에 방출되게 한다. 그러한 세포주의 한 예가 HepG2.2.15인데, 이는 완전한 HBV 게놈 (serotype ayw, genotype D)을 안정적으로 품고 있는 HepG2 인간 간세포 암종 세포주의 부세포주이다. HepG2.2.15는 모든 HBV 바이러스 RNA 및 단백질을 발현하고 바이러스 게놈을 생산하며 바이러스-유사 입자를 분비한다. 여기서 예시되는 바와 같이, 본 개시의 핵산 또는ddRNAi 구조체로부터 발현되는 shmiR의 활성은 그 핵산 또는ddRNAi 구조체를 세포에 투여하고 후속적으로 HBV 게놈에 의해 코딩되는 RNA나 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 세포내 HBV 유전자 발현은 TaqmanTM 어세이 또는 HBV RNA에 대한 여타 실시간 PCR 어세이로 또는 HBV 단백질에 대한 ELISA로 어세이될 수 있다. 세포외 바이러스는 DNA에 대해 PCR 또는 단백질에 대해 ELISA로 어세이될 수 있다. HBV 표면 항원 및 코어 단백질에 대해 항체가 상업적으로 이용가능하다. 형질주입 효율 및 샘플 회수시의 차이를 정규화(normalizing)하기 위해 다양한 수단이 관련분야에 알려져 있다. 일차 인간 간세포를 이용하는 세포 배양 시스템에서 최근의 진전은 HBV 치료법의 활성을 결정하는 것에 신뢰성을 보여준다.
본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체가 없는 경우에 비하여 50% 이상 HBV에 의해 코딩되는 RNA나 단백질의 발현을 감소시키는, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체로부터 발현된 shmiR 및/또는 shRNA는 본 개시의 방법에 유용하다고 생각된다.
동물 모델
HBV 복제를 연구하기에 용이한 몇가지 작은 동물 모델들이 있다. 하나가 방사능 처리된 마우스에 HBV-감염 간 조직을 이식한 것이다. 바이러스혈증(Viremia)(PCR에 의해 HBV DNA를 측정하여 입증)이 이식 후 8일에 처음으로 검출되어 18 - 25일에 피크를 이룬다 (Ilan et al., 1999, Hepatology, 29, 553-562).
HBV를 발현하는 트랜스제닉 마우스도 잠재적인 항 바이러스제를 평가하기 위한 모델로서 또한 사용되어 왔다. HBV DNA는 트랜스제닉 마우스의 간과 혈청 둘다에서 검출가능하다 (Morrey et al., Antiviral Res., 42, 97-108, 1999).
추가 모델은 HBV로 형질주입된 Hep G2 세포를 갖는 누드 마우스에서 피하 종양을 확립한 것이다. 종양은 접종 후 2주 후 발발하여 HBV 표면 및 코어 항원을 발현한다. HBV DNA 및 표면 항원은 종양을 가진 마우스의 순환계에서도 검출된다 (Yao et al., J. Viral Hepat., 3, 19-22, 1996).
추가적인 모델은 여기에 기재된 바와 같이 PXB 마우스를 사용하는 것인데, 이는 간 질환을 가진 면역결핍 마우스 (uPA/SCID)가 인간 간세포로 이식된 마우스의 키메라 군이다. uPA/SCID 마우스는 심각한 간 독성을 나타내기 때문에 건강한 인간 세포를 이식하면 인간 간세포가 70 내지 90 퍼센트로 된 건강하고 기능적인 간을 갖는 마우스를 생산할 수 있게 된다. PXB 마우스는 간에서 정상의 조직학적 구조를 나타내고 인 간 간 세포의 많은 특징을 나타내기 때문에 키메라 간 조직에서 활성 HBV 감염을 견뎌낼 수 있다.
추가적인 모델은 인간 간세포가 모델에 공급되어 인간 간의 구조와 생리를 흉내내도록 집합되는 3차원 세포 배양 플랫폼인 Quantum B 모델을 사용하는 것이다. 이 모델은 전적으로 간세포로 이루어져 있기 때문에 B형 간염에 있어서 최초로 장기간의 안정되고 완벽한 인간 바이러스 생명주기(life cycle) 모델이 되며 HBV 감염 생명주기의 몇가지 중요 특징에 대해 개요를 말해주고 있다고 생각된다.
전술한 동물 모델은 어느 것이든 HBV 감염을 처리하거나 감소시키는 데 있어서 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체의 효율성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
담체
어떤 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 담체와 함께 조성물로 제공된다.
어떤 예에서, 담체는 지질계 담체, 양이온성 지질, 또는 리포좀 핵산 복합체, 리포좀, 마이셀, 비로좀, 지질 나노입자 또는 이들의 혼합물이다.
어떤 예에서, 담체는 양이온성 폴리머-핵산 복합체와 같이 폴리머계 담체이다.
추가적인 예에서, 담체는 시클로덱스트린 폴리머-핵산 복합체와 같이 시클로덱스트린계 담체이다.
추가적인 예에서, 담체는 양이온성 펩티드-핵산 복합체와 같이 단백질계 담체이다.
또다른 예에서, 담체는 지질 나노입자이다. 예시적인 나노입자는 예를 들어, US7514099에 기재되어 있다.
어떤 예에서 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 양이온성 지질/콜레스테롤/ PEG-C-DMA/DSPC (예컨대, 40/48/2/10의 비), 양이온성 지질/콜레스테롤 /PEG-DMG/DSPC (예컨대, 40/48/2/10의 비), 또는 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG (예컨대, 60/38/2의 비)를 포함하는 지질 나노입자 조성물로 제제화 된다. 어떤 예에서, 양이온성 지질은 DMA내 Octyl CL, DMA내 DL, L-278, KC2DMA내 DL, 또는 MC3이다.
또 다른 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 WO 2010/021865; WO 2010/080724; WO 2010/042877; WO 2010/105209 또는 WO 2011/022460에 기재된 임의의 양이온성 지질 제제로 제제화된다.
또 다른 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 예컨대 RNA 또는 ddRNAi 또는 또는 발현 벡터 구조체의 전달을 용이하게 하기 위해 또 다른 화합물에 콘쥬게이트되거나 그것들과 복합체를 이루고 있다. 그러한 콘쥬게이트의 비제한적 예들이 US 2008/0152661 및 US 2004/0162260 (예컨대, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG, 등등)에 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터에 공유결합적으로 부착된다. 상기 부착되는 PEG는 예컨대 약 100 내지 50,000달톤(Da) 중의 임의의 분자량일 수 있다.
더욱 다른 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 예컨대 WO 96/10391; WO 96/10390; 또는 WO 96/10392에 개시되어 있는 바와 같이 폴리(에틸렌 글리콜) 지질 (PEG-개변, 또는 긴-순환 리포좀 또는 스텔스 리포좀)를 함유하는 표면-개질 리포좀을 함유하는 담체로 제제화된다.
어떤 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 폴리에틸렌이민 또는 그 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토자민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N- 아세틸갈락토자민 (PEI-PEG-triGAL) 유도체와 함께 또한 제제화되거나 복합체를 이룰 수 있다. 일 예에서, 본 개시의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 구조체는 미국특허출원공개 제2003/0077829호에 기재된 바와 같이 제제화된다.
다른 예에서, 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 미국특허출원공개 제2001/0007666호에 기재된 것과 같이 막파괴제(membrane disruptive agent)와 함께 복합체를 이룬다.
기타 담체는 시클로덱스트린 (예컨대 Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; 또는 WO 03/46185 참조), 폴리(락틱-코-글리콜릭)산 (PLGA) 및 PLCA 미세구(microspheres) (예컨대 US 2002130430참조)를 포함한다.
조성물 및 치료 방법
본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상은 HBV 감염을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 조성물은 단독으로 또는 다른 항바이러스제를 포함하는 하나 이상의 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 최근 에테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 디피복실, 및 인터페론 알파(예컨대, 페그 일터페론 알파)가 HBV를 처리하기 위해 승인되었다. 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 여타 승인된 약물과는 상이한 메커니즘을 통해 HBV에 작용하므로 본 발명의 제제와 여타 항바이러스제의 조합적인 치료는 약제 내성, 예컨대 장기간의 라미부딘 치료시 주된 관심의 문제인 라미부딘 내성을 상당히 감소시키면서 치료의 효능을 유의적으로 증가시킬 것으로 기대된다.
조성물은 바람직하게는 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터의 생물학적 안정성을 증가시키는 물질 및/또는 간세포를 선택적으로 투과하는 조성물의 능력을 증가시키는 물질을 포함할 것이다. 본 개시의 치료 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체(예컨대, 생리식염수) 중에서 투여될 수 있는데, 이 담체들은 투여 방법 및 투여 경로, 그리고 표준 약제 실무에 기초하여 선택된다. 관련분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 쉽게 제제화할 수 있다. 어떤 경우에 등장성(isotonic) 제제가 사용된다. 일반적으로 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱트프로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 인산 완충 식염수처럼 등장액이 바람직하다. 안정화제는 젤라틴과 알부민을 내포한다. 어떤 예에서, 혈관수축제가 제제에 부가된다. 본 개시에 따른 조성물은 멸균 및 파이로젠 프리(sterile and pyrogen free)로 제공된다. 약제학적 제제에서 사용하기 위한 약제학적 필수품뿐만 아니라 적합한 약제학적 담체가 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (전 Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., 이 분야의 표준 참고 텍스트 및 USP/NF에 기재되어 있다.
투여 경로는 근육 내, 복강 내, 피부내(intradermal) 또는 피하(subcutaneous), 정맥 내, 척추강내, 동맥 내, 안구 내(intraocularly) 및 경구 내 뿐만 아니라 경피 또는 흡입 또는 좌약을 내포하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 투여경로는 정맥 내, 근육 내, 구강, 복강 내, 피내, 동맥 내 및 피하 주사를 내포한다. 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터의 전달을 위해서 인 비보에서 간세포의 표적화된 형질주입(transfection)은 여기에 기재된 바와 같이 락토실 스퍼민 (모노 또는 트리악토실화) 및 콜레스테릴 스퍼민 (전하비 0.8로 스퍼민 대 DNA를 함유)의 혼합물(예컨대, 35%/65%의 비)로 복합체를 이루어 하나 이상의 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터를 포함하는 조성물로써 IV 주사를 통해 성취될 수 있다. 그러한 조성물은 약제학적 적용에 유용하며, 비경구적 투여를 위해, 예를 들어 IV(IV 주입 포함), IM, SC 및 복강내 투여를 위해 적합한 멸균된, 비발열성 운반체(sterile, non-pyrogenic vehicle), 중에 용이하게 제제화될 수 있다. 어떤 조성물에서는 본 개시의 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 스퍼민을 표적하지 않고 단독의 콜레스테릴 스퍼민과 같이 엔도조몰라이틱 스퍼민과 복합체를 이룬다; 어떤 투여경로는 복강 내 주사 또는 수액과 같이 효과적인 간세포 전달 및 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터의 형질주입을 할 수 있다.
특별하게 제형화된 전달 운반체 내에 있는 본 개시의 하나 이상의 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터를 포함하는 멸균된 약제학적 조성물을 복강 내 투여하는 것(예컨대 초음파 가이드된 복강내 주사)은 간세포(hepatocyte)를 비롯하여 간의 세포에 의한 흡수를 촉진하기 위해 유리한 전달 경로일 수 있다.
투여 요법(dosage regimen) 뿐만 아니라 약제학적 조성물의 부피, 농도, 및 제제는 염증 반응과 같은 독성을 최소화하면서 세포적 전달을 극대화하기 위해 구체적으로 조정할 수 있다. 예컨대 상대적으로 큰 부피 (5, 10, 20, 50 ml 이상)와 이에 따른 저농도의 활성 성분 뿐만 아니라 코르티코스테로이드와 같은 항-염증 화합물도 포함 등이 원한다면 사용될 수 있다.
HBV 감염된 개체에서 본 개시의 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 바이러스에 대한 면역성을 진작시키도록 디자인된 치료 백신 프로토콜과 연계하여 전처리할 때에 유용할 것으로 예상된다. 직업적 또는 잠재적 노출로 인해 HBV에 노출위험이 높은 상황이라고 생각되는 개체에 대한 주기적 투여 요법(regimen)을 이용한 예방에 본 개시의 핵산, ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터가 유용할 것으로 또한 예상된다.
키트
본 개시는 또한 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 및/또는 발현 벡터를 키트 형태로 제공한다. 키트는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상을 그 투여 지시사항과 같이 포함한다. 어떤 예에서, 키트는 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상 및/또는 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 또다른 것을 함유한다. 어떤 예에서, 키트는 (여기 개지된 바와 같이) HBV 감염 처리를 위한 또다른 화합물과 함께 포장된 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터 중 하나 이상을 함유한다. 예를 들어, HBV 감염을 처리하기 위해 알려진 다른 치료제가 엔테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 및/또는 페그인터페론으로부터 선택될 수 있다.
실시예
실시예 1 - shmiR들을 발현하는 ddRNAi 발현 구조체의 제조
본 개시의 단일 shmiR들을 발현할 수 있는 ddRNAi 구조체를 생산하기 위하여 shmiR들을 코딩하는 DNA 서열을 합성하고 U6 프로모터 (예컨대, U6-1, U6-8, 또는 U6-9)의 하류에 클로닝한다. ddRNAi 구조체에 대해 HBV-shmiR1 내지HBV-shmiR16로 각각 지정한다.
본 개시의 shmiR들에 해당하는 단일 shmiR들을 발현할 수 있는 ddRNAi 구조체도 또한 생산한다. 간단히 shmiR들을 코딩하는 DNA 서열을 합성하고 근위 서열 요소 7(PSE7)을 갖는 U6 프로모터 (예컨대, U6-1, U6-8, 또는 U6-9)의 하류에 클로닝한다. ddRNAi 구조체에 대해 HBV-shRNA1 내지HBV-shRNA16으로 각각 지정한다.
또한 삼중 HBV shmiR 발현 카세트를 포함하고 본 개시의 세가지 shmiR들을 발현할 수 있는 ddRNAi 구조체를 제조한다. 제 1 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체( HBV-shmiRx3-v1로 지정됨) 는 5'-3' 방향으로 U6-9 프로모터, shmiR6 (서열번호 64), U6-1 프로모터, shmiR15 (서열번호 73), U6-8 프로모터, 및 shmiR12 (서열번호 70)를 코딩하는 DNA 서열을 포함시켜 합성한다. 제 2 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체( HBV-shmiRx3-v2로 지정됨) 도 또한 5'-3' 방향으로 U6-9 프로모터, shmiR6 (서열번호 64), U6-1 프로모터, shmiR7 (서열번호 65), a U6-8 프로모터, 및 shmiR12 (서열번호 70) 를 코딩하는 DNA 서열을 포함시켜 합성한다.
HBV-shmiRx3-v1로 지정된 구조체에 의해 발현되는 세가지 shmiR들에 해당하는 세가지 shRNA들을 발현할 수 있는 삼중 HBV shRNA 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 구조체도 또한 제조한다. 구체적으로, 삼중 HBV shRNA ddRNAi 구조체( HBV-shRNAx3-v1로 지정됨) 는 5'-3' 방향으로 U6-9 프로모터 및 PSE7, shRNA6 (서열번호 99), a U6-1 프로모터 및 PSE7, shRNA15 (서열번호 108), a U6-8 프로모터 및 PSE7, 및 shRNA12 (서열번호 105) 를 코딩하는 DNA 서열을 포함시켜 합성한다.
실시예 2 - 듀얼-루시페라제 리포터 어세이에서 ddRNAi 발현 구조체의 활성
HBV 전사체를 낙다운(knockdown)시키기 위한 본 개시의 shmiR들 또는 shRNA들을 발현하는 ddRNAi 구조체 의 효능(efficacy)은 HEK293세포에서 듀얼-루시페라제 리포터 어세이를 이용하여 결정한다.
pGL3 루시페라제 리포터 벡터에 기초한 플라스미드 리포터 구조체를 본 개시의 shmiR들 및 shRNA들 각각에서 유래한 효과기 및 효과기 상보 서열에 대해 구축한다. 루시페라제 리포터 구조체, 예컨대 반딧불이(firefly) 루시페라제 리포터 구조체를, 각각의 말단에 (적절하게) 20bp 인접 서열을 가진 shmiR들 또는 shRNA들의 각각의 효과기 서열 또는 효과기 상보 서열을 pGL3-제어 벡터 (Promega, Madison, WI)에 삽입함으로써 제조한다. 그 삽입체를 루시페라제 리포터 유전자 다음의 FseI 및 XbaI 제한효소 자리를 이용하여 서브클로닝한다.
듀얼-루시페라제 리포터 어세이는 HEK293 세포 (ATCC)에서 수행한다. HEK293 세포는 5% CO2을 갖는 37℃ 휴머노이드 인큐베이터에서 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민, 페니실린(100U/mL), 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한다. HEK293 세포는 형질주입(transfection) 하루 전에 96-웰 배양판으로 웰 당 2x104 세포의 밀도로 접종한다.
실시예 1 에 기재된 ddRNAi 발현 구조체(즉, HBV-shmiR1 내지 HBV-shmiR16, HBV-shmiRx3-v1 및 HBV-shmiRx3-v2로 지정된 ddRNAi 구조체들)를 합성하고 적절한 플라스미드 벡터, 예컨대 pSsh 벡터로, 선택적으로는 shRNAs를 발현하는 구조체를 위한 근위 서열 요소 7 (PSE7)과 함께 삽입한다.
ddRNAi 발현 구조체를 포함하는 발현 벡터는 HEK293 세포로 루시페라제 리포터 구조체, 예컨대 반딧불이 루시페라제 리포터 구조체와 함께 형질주입(co-transfect)하여 제조자 지시사항에 따라 0.3uL 의 Lipofectamine 2000 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 해당하는shmiR 또는 shRNA의 효과기 서열 또는 효과기 상보 서열을 (적절하게) 10:1 (ddRNAi 발현 구조체 : 루시페라제 리포터 구조체)의 비율로 발현한다. 또한 1ng 의 Renilla 리포터 구조체(형질주입 대조군으로 작용)로 세포를 형질주입한다. 48시간 형질주입 후, 세포 용해물을 수거하고 듀얼 루시페라제 리포터 어세이 시스템 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 분석한다. 반딧불이/레닐라 활성비는 각 형질주입에 대해 결정한다. 리포터 발현의 저해 백분율은 음성 대조군, 예컨대 랜덤 비표적 서열을 발현하는 구조체에 상대적으로 계산한다. 실험은 이중으로(in replicate) 수행된다.
각각의 루시페라제 리포터 구조체로부터 본 개시의 shmiR들을 발현하고 루시페라제 단백질의 발현을 저해하는 ddRNAi 발현 구조체의 능력을 결정한다.
또한, 세 개의 ddRNAi shmiR 구조체 (즉 각각 shmiR6, shmiR15 및 shmiR12를 발현하는 ddRNAi shmiR 구조체)를 그것들의 shRNA 발현 대상체(counterparts)에 대해 상대적인 가닥(strand) 선호 활성에 대해 비교하였다. 도 1a에 나타낸 데이터는 shmiR들이 해당하는 shRNA들에 비해 높은 안티센스(효과기) 가닥 활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 3 - shmiR들을 발현하는 ddRNAi 구조체의 고기능적 특성
HEK293세포에서 세 가지 ddRNAi 구조체 들(즉, 각각 shmiR6, shmiR15 및shmiR12을 발현하는 ddRNAi shmiR 구조체들)의 고기능적 특성을 평가하였다.
세가지 ddRNAi 발현 구조체 각각에 대해, 웰에 함유된HEK293 세포를 (i) 100ng, 50ng, 20ng, 5ng, 1.67ng, 0.56ng, 0.19ng, 0.06ng, 또는 0.03ng 의 각각의 ddRNAi 발현 구조체, (ii) 최종 DNA 함량을 100ng로 조정하기 위한 다양한 분량의 필러 플라스미드 , 및 (iii) 10ng 의 해당하는 반딧불이 루시페라제 리포터 구조체로 공동-형질주입하였으며, 제조자의 지시사항에 따라 0.3uL 의 Lipofectamine 2000 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하였다. 세포는 또한 1ng 의 Renilla 리포터 구조체(로딩 콘트롤로 작용)로 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 세포 용해물을 수거하고 듀얼 루시페라제 리포터 어세이 시스템 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 분석하였다. 반딧불이/레닐라 활성비를 각 웰에 대해 결정하였고 ddRNAi 발현 구조체의 저해 효능을 계산하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이 shmiR6, shmiR15 또는 shmiR12 (각각 서열번호 64, 서열번호 73, 또는 서열번호 70)를 발현하는 구조체의 활성을 결정하고 shRNA6, shRNA15 및 shRNA12 (각각 서열번호 99, 서열번호 108, 또는 서열번호 105)을 발현하는 해당하는 구조체와 직접 비교하였다. 이러한 데이터는 shmiR 구조체가 이러한 실험 조건 하에서 해당하는shRNA 구조체보다 더 효과적임을 나타낸다 (도 1a).
고기능적 어세이를 이용하여 구조체의 상대적 활성을 더 규명하였다. 고기능성 어세이는 고정량의 반딧불이 리포터로 공동-형질주입된 shmiR들을 발현하는 구조체의 양을 줄여가면서(100ng 내지 0.02ng) 수행되하였다. 이러한 데이터(도 1b - 1d)는 세 가지 ddRNAi shmiR 구조체 전부가 저농도에서 shRNA들을 발현하는 해당 구조체에 비하여 훨씬 활성임을 보여주는데 이는 증가된 생물학적 활성의 지표이다.
실시예 4 - shmiR 변이체를 발현하는 ddRNAi 구조체의 디자인 및 시험
shmiR-12 (서열번호 54) 및 shmiR-15 (서열번호 57) 의 가닥 선호 활성을 개선하기 위하여, 상류 또는 하류에서 1 또는 2 뉴클레오티드로 효과기 상보(센스) 서열을 쉬프팅(shifting)함으로써 shmiR-12 및 shmiR-15의 변이체를 생산하였다. shmiR-15의 변이체들은 shmiR-17 내지 shmiR-22 (각각 서열번호: 134-139)로 지정하고 shmiR-12의 변이체들을 shmiR-23 내지shmiR-28 (각각 서열번호: 140-145)로 지정한다.
센스 서열의 3' 말단에서 'A' 뉴클레오티드 또는 5'말단에서 'G' 뉴클레오티드의 부가시shmiR 변이체의 열역학상의 영향에 대해서도 또한 평가하였다. 기능적인 RNAi 활성을 위해, 안티센스(또는 효과기) 가닥을 바람직하게 RISC 복합체에 로딩될 수 있도록 하기 위한 생각이다.
shmiR-12 의 변이체(즉 shmiR-23 내지 shmiR28)에 대해, 여섯개의 shmiR 변이체 전부는 부모의 shmiR-12보다 더 나은 기준 선호를 나타냈다(도 2a). shmiR-15 의 변이체(즉 shmiR-17 내지 shmiR22)에 대해, 여섯개의 shmiR 변이체 중 네개는 부모의 shmiR-15보다 더 나은 기준 선호를 나타냈다(도 2b). 이러한 결과에 기초하여, shmiR-12 및 shmiR-15를 코딩하는 HBV-shmiRx3-v1 내의 서열을 각각 shmiR-24 (서열번호 153) 및 shmiR-20 (서열번호 149)을 코딩하는 서열로 교체하여 제 3 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체(HBV-shmiRx3-v3로 지정됨)를 형성함으로써 추가적인 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체를 디자인하였다.
실시예 5 - HBV shmiR AdV 벡터를 이용한 HepG2.2.15 세포 내 HBV 전사체의 낙다운
실시예 1에 기재된 ddRNAi 발현 구조체(즉, HBV-shmiR1 내지 HBV-shmiR16, HBV-shmiRx3-v1 및 HBV-shmiRx3-v2로 지정된 ddRNAi 구조체)를 바이러스 생산을 위한 아데노바이러스(AdV) 구조체에 서브클로닝(Vector Biolabs, Malvern PA )함으로써 단일 및 삼중 shmiR AdV 벡터를 제조한다.
HBV 유전자의 발현을 낙다운하는 여기에 기재된 shmiR AdV 벡터의 효능을 시험하기 위하여 HepG2.2.15를 본 개시의 shmiR AdV 벡터로 감염시키고 HBV 유전자 발현의 저해를 어세이한다.
HepG2.2.15는 완전한 HBV 게놈(혈청형 ayw, 유전형 D)를 안정적으로 품고 있는 HepG2 인간 간세포 암종세포주(human hepatocellular carcinoma cell line)의 서브세포주이다. HepG2.2.15 세포는 모든 HBV 바이러스 RNA 및 단백질을 발현하고, 바이러스 게놈을 생산하며 바이러스 유사 입자를 분비한다. HepG2.2.15 세포는 4% 소태아 혈청, 4mM 글루타민, 페니실린 (100U/mL), 및 스트렙토마이신 (100 mg/mL)으로 보충된 RPMI1640 배지 내에 유지하며 37℃ 휴머노이드 인큐베이터내에서 5% CO2 대기 중에서 증식시킨다.
HepG2.2.15 세포를 세포 현탁액 중에서 HBV shmiR AdV 벡터로 감염시키고 다중 웰 플레이트 상에서 배양한다. 각 웰은 약 1.0 x 105 HepG2.2.15 세포 및, 다음 MOI들 중 하나의 본 개시의 단일 또는 삼중 HBV shmiR AdV 벡터 중 하나의 현탁액을 함유한다: 6, 15, 30, 60, 90, 또는 120. 형질도입(transduction)에 이어, 각각 Qiagen miRNeasy mini kit 및 QiAmp DNA mini kit (Valencia, CA)을 이용하여 RNA와 DNA추출을 위해 수확하기 전에, 세포를 37℃에서 5% CO2 에서 72시간 동안 배양한다.
총 RNA는 miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 단리한다. 총 RNA는 NanoDrop 1000 분광광도계 (Thermo Scientific)를 이용하여 정량하고 10 ng/ml의 작용농도(working concentration)로 희석한다.
Qiagen's miScript PCR 시스템을 이용하여 다양한 MOIs에서 단일 또는 삼중 HBV shmiR AdV 벡터로부터 HepG2.2.15 cells 내에서 발현되었을 때 본 개시의 각각의 shmiR에 대하여 세포 당 shmiR 카피수를 결정한다. 각각의 RT-qPCR 분석에 대해 50ng의 총RNA가 Qiagen's miScript II RT kit를 이용하여 cDNA로 전환된다. 각각의 shmiR들을 위해 디자인된 커스텀 프라이머와 다음의 리얼타임 PCR 조건으로 Qiagen miScript SYBR green PCR kit를 이용하여 shmiR들의 정량적 PCR를 수행하였다: 95℃, 15분에서 개시 변성(initial denaturation), 이후 40 사이클의 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 70℃에서 30초.
각각의 샘플에 대해 GAPDH mRNA에 상대적인 각각의 HBV mRNA 전사체 수준을 정규화함으로써 HBV 항원 HBsAg, HBcAg 및 HbxAg 에 해당하는영역에서 GAPDH mRNA의 수준에 상대적인 HBV 전사체의 저해 수준이 결정된다. 간략히는 제조자의 지시사항에 따라 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하되 100ng의 총 RNA를 사용하여 cDNA를 합성한다. 이후 Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) 및 표 1에서 목록화된 프라이머 세트를 이용하여 HBV 항원 HBsAg, HBcAg, HbxAg 및 GAPDH 내 영역의 정량적 PCR 증폭을 수행한다. 기준 실시간 PCR 조건은 다음과 같이 이용된다: 95℃에서 10분동안 개시 변성, 이후 40사이클의 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분.
RT-qPCR을 위한 프라이머 세트
[표 1]
Figure 112018122027636-pct00001
본 개시의 각각의 shmiR에 대해 HBV 항원 HBsAg, HBcAg 및 HbxAg 에 해당하는 영역에서 GAPDH mRNA의 수준에 상대적인 HBV 전사체의 저해 수준(개별적으로 발현되거나 또는 삼중 구조체의 부분으로서 발현됨)을 다양한 MOI들에서 결정한다.
실시예 6 - HBV shmiR AdV 벡터를 이용한 HepG2.2.15 세포에서 HBV 전사체의 낙다운
실시예 1에서 기재된 ddRNAi 발현 구조체(즉 HBV-shmiR1 내지 HBV-shmiR16, HBV-shRNA1-HBV-shRNA16, HBV-shmiRx3-v1, HBV-shmiRx3-v2 및 HBV-shRNAx3-v1로 지정된 ddRNAi 구조체)를 바이러스 생산을 위해 아데노바이러스(AdV) 구조체에 서브클로닝(Vector Biolabs, Malvern PA)함으로써 단일 및 삼중 shmiR 또는 shRNA AdV 벡터를 제조한다.
HBV 유전자의 발현을 낙다운하는 여기에 기재된 shmiR AdV 벡터의 효능을 시험하기 위하여 HepG2.2.15를 본 개시의 shmiR AdV 벡터로 감염시키고 HBV 유전자 발현의 저해를 어세이한다.
HepG2.2.15는 완전한 HBV 게놈(혈청형 ayw, 유전형 D)를 안정적으로 품고 있는 HepG2 인간 간세포 암종세포주(human hepatocellular carcinoma cell line)의 서브세포주이다. HepG2.2.15 세포는 모든 HBV 바이러스 RNA 및 단백질을 발현하고, 바이러스 게놈을 생산하며 바이러스 유사 입자를 분비한다. HepG2.2.15 세포는 4% 소태아 혈청, 4mM 글루타민, 페니실린 (100U/mL), 및 스트렙토마이신 (100 mg/mL)으로 보충된 RPMI1640 배지 내에 유지되며 37℃ 휴머노이드 인큐베이터내에서 5% CO2 대기중에서 증식시킨다.
HepG2.2.15 세포는 세포 현탁액 중에서 HBV shmiR AdV 벡터 또는 HBV shRNA AdV 벡터로 감염시키고 다중 웰 플레이트 상에서 배양한다. 각 웰은 약 1.25 x 105 HepG2.2.15 세포 및 MOI-100의 단일 또는 삼중 HBV shmiR AdV 벡터 중 하나, 또는 단일 또는 삼중 HBV shRNA AdV 벡터 중 하나의 현택액을 함유한다. 형질도입(transduction)에 이어, 세포는 37℃에서 5% CO2 에서 3-7일간 배양하고 형질주입후(post-transfection) 3, 4, 5, 및 6일에 Qiagen miRNeasy mini kit (Valencia, CA)을 이용하여 총 RNA단리를 위해 수확하였다.
총 RNA는 NanoDrop 1000 분광광도계 (Thermo Scientific)를 이용하여 정량하고 10 ng/ml의 작용농도로 희석하였다.
Qiagen's miScript PCR 시스템(shmiR 또는 shRNA로부터 프로세스된 RNA 효과기 분자를 정량하도록 디자인됨)을 이용하여 단일 또는 삼중 HBV shmiR AdV 벡터로부터 HepG2.2.15 cells 내에서 발현되었을 때 shmiR-12 및 shmiR-15(각각 도 3a 및 3b)에 대하여 세포 당 카피로서 발현된 RNAi 효과기 분자를 결정하였다. ShmiR 발현은 단일 및 삼중 구조체의 상황에서 해당하는shRNA들에 의해 유도된 효과기 RNAi 분자의 수준에 대비되었다. 각각의 RT-qPCR 분석에 대해 50ng의 총RNA가 Qiagen's miScript II RT kit를 이용하여 cDNA로 전환되었다. 각각의 RNAi 분자를 위해 디자인된 커스텀 프라이머와 다음의 리얼타임 PCR 조건으로 Qiagen miScript SYBR green PCR kit를 이용하여 RNAi 분자의 정량적 PCR를 수행하였다: 95℃, 15분의 개시 변성, 이후 40사이클의 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 70℃에서 30초. 결과는 shmiR들-12 및 shmiR-15에 의해 발현된 HBV 게놈의 영역에 대한 효과기 RNAi의 수준이 해당하는shRNA들 즉, 각각 shRNA-12 및 shRNA-15보다 높다는 것을 제시한다(도 3).
GAPDH mRNA의 수준에 상대적인, HBV 항원 HBsAg, HBcAg 및 HbxAg 에 해당하는 영역에서 HBV 전사체의 저해 수준을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 결정하였다.
본 개시의 각각의 shmiR에 대해 HBV 항원 HBsAg, HBcAg 및 HbxAg 에 해당하는 영역에서 GAPDH mRNA의 수준에 상대적인 HBV 전사체의 저해 수준(개별적으로 발현되거나 또는 삼중 구조체의 부분으로서 발현됨)이 100의 MOI에서 HBV shmir 또는 shRNA AdV 벡터로 감염 후 3, 4, 5 및 6일에 결정하였다. 도 4a 및 4b에서 보이는 바와 같이, shmiR-12 및 shmiR-15는 해당하는shRNA 발현 구조체에 비하여 HBV RNA들의 더 큰 사일런싱을 나타내었다.
실시예 7 - HBV shmiR들을 발현하는 자가-상보적 AAV계 플라스미드 구조체 및 바이러스의 생성
실시예 1의 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체를 scAAV2 골격으로 서브클론함으로써 본 개시의 세가지 shmiR들을 발현하는 자가-상보적 아데노-관련 바이러스 타입 2 (scAAV2) 플라스미드를 생성한다.
간략히, 실시예 1의 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체 (즉, HBV-shmiRx3-v1 및 HBV-shmiRx3-v2로 지정된 ddRNAi 구조체)를 pAAV2 벡터 골격에 클로닝하여 각각 pAAV-HBV-shmiRx3-v1 및pAAV-HBV-shmiRx3-v2로 지정된 벡터를 생산한다. 비표적 shmiR (pAAV- control-shmiR)를 발현하는 AAV 바이러스 플라스미드 대조군도 또한 생산할 수 있다.
이어 AAV8 캡시드를 이용하여 재조합 유사타입 AAV 벡터 스톡이 생성한다. 간략히, HEK293T 세포를 롤러 병 내10% FBS로 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하고 37℃ 및 5% CO2로 인큐베이션한다. 각각의 pAAV-삼중 HBV shmiR 바이러스 플라스미드(pAAV-HBV-shmiRx3-v1 및 pAAV-HBV-shmiRx3-v2) 및 pAAVhelpercap8 플라스미드(pDP8r)를 제조자의 지시사항에 따라 폴리에틸렌이민(PEI)과 복합체를 형성시킨다. 이어서 HEK293T 세포 내에서 pDP8r 및 pAAV-삼중 HBV shmiR 바이러스 플라스미드 (pAAV-HBV-shmiRx3-v1 및 pAAV-HBV-shmiRx3-v2) 중 하나로 이중-형질주입(Double-transfections)을 수행한다. HEK293T 세포는 37℃ and 5% CO2에서 72시간 동안 배양하며 이후 세포를 용해하여 바이러스 플라스미드 각각에 대한 scAAV shmiR-발현 입자를 이오딕사놀(Sigma-Aldrich) 단계적-구배 초원심분리에 의해 정제한다. 벡터 게놈의 수는 발현 카세트 사이의 영역에 대해 디자인한 프라이머와 프루브로 타크만 정량적 중합효소 연쇄 반응(Q-PCR)를 이용하여 결정한다.
pAAV-HBV-shmiRx3-v1, pAAV-HBV-shmiRx3-v2 및 pAAV- control-shmiR로 지정된 바이러스 플라스미드에 대해 해당하는scAAV8 바이러스 제조물은 각각 scAAV-HBV-shmiRx3-v1, scAAV-HBV-shmiRx3-v2 및 scAAV- control-shmiR로 지정한다.
본 개시의 세가지 shmiR들을 발현하는 단일 가닥 아데노-연계 바이러스 (ssAAV) 플라스미드도 실시예 1의 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체를 ssAAV 벡터 골격에 서브클로닝함으로써 또한 생성한다.
실시예 8 - HBV shmiR들 또는 shRNA들을 발현하는 자가-상보적 및 단일 가닥 AAV8계 플라스미드 구조체 및 바이러스의 생성
HBV-shmiRx3-v1로 지정된 실시예 1의 삼중 HBV shmiR ddRNAi 구조체를 ssAAV8 골격에 서브클로닝함으로써 본 발명의 세가지 shmiR들을 발현하는 단일-가닥 아데노-연계 바이러스 타입 2 (ssAAV2) 플라스미드를 생성시켰다. 마찬가지로, HBV-shRNAx3-v1으로 지정된 실시예 1의 삼중 HBV shRNA ddRNAi 구조체를 ssAAV2 또는 scAAV2 골격에 서브클로닝함으로써 HBV-shRNAx3-v1의 shmiR들에 해당하는 세가지 shRNAs 를 발현하는 ssAAV8 및 자가-상보적 아데노-연계 바이러스 타입 2 (scAAV2) 플라스미드를 생성시켰다. 도 5에서 보이는 바와 같이 DNA는 재조합 AAV 단일 가닥 DNA 게놈으로서 발현하도록 디자인하였다.
이어서 실시예 7에서 기재된 방법에 따라 상업적으로 수득된 AAV8 capsid (Vector Biolabs, Malvern PA; Nationwide Children's Hospital, Columbus OH; Powell Gene Therapy Center, University of Florida)를 이용하여 AAV2 플라스미드 각각에 대해 재조합 유사타입 AAV 벡터 스톡을 생성시켰다. 유사타입 AAV 벡터 스톡은 각각 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1, sAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1로 지정하였다.
실시예 9 - 인 비보( in vivo )에서 HBV 파라미터의 저해
scAAV-HBV-shmiRx3-v1 및 scAAV-HBV-shmiRx3-v2로 지정된 scAAV shmiR-발현 입자의 (i) HBV 바이러스 전사체의 발현, (ii) 세포외 HBsAg 및 HBeAg, (iii) 세포외 및 세포내 HBV DNA, 및 (iv) cccDNA의 형성에 관한 인 비보 효과를 HBV 접종물로 새로이 감염된 PXB 마우스 모델에서 결정한다.
방법
scAAV-HBV-shmiRx3-v1 및 scAAV-HBV-shmiRx3-v2로 지정된 scAAV shmiR-발현 입자를 실시예 7에 따라 제조한다.
PhoenixBio로부터 키메라 PXB 마우스 (PXB-mice®)를 수득한다. 모든 마우스를 개별적으로 23±5℃ 및 습도 55±25%에 수용하고 12시간 명/암 주기에 노출하며 실험을 통틀어 무제한 급이 및 급수한다.
PXB 마우스는 HBV 유전형 C로 접종하여 4 주간 인큐베이션하여 기저 HBV 감염(baseline HBV infection)을 확립하도록 한다. 기저 HBV 감염을 결정하기 위하여 마우스로부터 혈액을 -28, -21, -14 및 -7일 (즉 접종후 각각 0, 7, 14 및 21 일)에 채취하는데, 이로부터 인간 알부민 (h-Alb) 농도 및 HBV DNA, HBsAg 및 HBeAg의 혈청 농도를 결정할 수 있다.
IntramedicTM Polyethylene Tubing (Becton, Dickinson and Company, NJ, USA)를 이용하여 retro-orbital plexus/sinus를 통하여 예컨대 isoflurane anesthesia (Escain®, Mylan, Osaka, Japan) 에 의해 매 시간 지점에서 마취하에 동물로부터 채혈하였다.
수집된 혈액으로부터 전체 혈액중 2 μL를 식염수내에서 희석하고 임상 화학 분석기(BioMajestyTM Series JCA-BM6050, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 라텍스 응집 면역혼탁계측기(latex agglutination immunonephelometry) (LZ Test "Eiken" U-ALB, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 의해 혈액 h-Alb 농도를 측정한다.
남아있는 전체 혈액은 원심분리하여 HBV DNA 정량, HBsAg 및 HBeAg 분석을 위해 혈청을 분리한다.
혈청HBV DNA을 측정하기 위하여, HBV DNA 는 SMITESTEX-R&D Nucleic Acid Extraction Kit (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD., Nagoya, Japan)을 이용하여 혈청 5 μL로부터 추출된다. 이후 정제된 DNA는 20μL 무뉴클레아제 수 (Ambion)에 용해한다. HBV-감염된 PXB-마우스로부터의 혈청은 HBV DNA 기준으로서 사용한다. 합성 HBV DNA는 HBV DNA 기준의 농도를 결정하기 위해 사용되는데 이것은 이후에 혈청 HBV DNA 수준을 정량할 때에 사용한다. HBV DNA는 HBV DNA 기준으로부터 추출되며 적절한 희석 이후 실시간 PCR을 위해 사용한다. 사용되는 기준의 범위는 예를 들어 4.0E+04 과 2.0E+09 copies/mL 사이일 수 있다.
이어 예컨대 TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 ABI Prism 7500 서열 검출기 시스템 (Applied Biosystems)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 혈청 HBV DNA 농도를 측정한다. PCR 반응 혼합물은 5 μL의 추출된 DNA에 가한다. 50℃에서2분간 uracil-N-glycosylase의 개시 활성화 후에 95℃에서 20초간 중합효소 활성화를 한다. 후속되는 PCR 증폭은 ABI 7500 서열 검출기 내에서 95℃에서 3초간 53 사이클의 변성 및 사이클 당 60℃에서 32초간 어닐링 및 신장반응으로 구성된다. 평균 혈청 HBV DNA 수준은 두개의 분리된 웰의 값으므로부터 계산한다.
실시간 PCR을 위해 사용되는 프라이머 및 프루브는 다음과 같다:
[표 2]
Figure 112018122027636-pct00002
혈청 HBsAg 및 HBeAg 농도는 ChemiLuminescence ImmunoAssay (CLIA) 예컨대 Abbott (ARCHITECT® SYSTEM)에 의해 개발된 것을 이용하여 결정된다.
동물이 다음의 기준을 만족한다면 동물을 후속 처리 실험에 포함시킬 수 있다:
(i) -1 일(즉 HBV 접종 후 27일)에서 무게 15g 이상;
(ii) -7 일(즉 HBV 접종 후 21일)에서 적어도 1.0E+6 copies/mL의 혈청 HBV DNA 농도 가짐; 및
(iii) -7 일(즉 HBV 접종 후 21일)에서 10mg/mL 이상의 h-Alb 측정값 가짐.
기저 HBV 감염이 확립되고 상기 기준에 맞는 마우스를 치료 그룹에 두었다. 그룹 간의 변이를 최소화하기 위해 그룹 조성은 체중에 대한 산술 평균값 및 혈액 h-Alb 농도와 혈청 HBV DNA 농도에 대한 기하 평균값에 기초하여 랜덤하게 할 수 있다.
치료 그룹은 다음과 같다:
그룹 1: 오로지 생리식염수의 단일 200 μl 1회분(bolus);
그룹 2: 2.0E+13 (vg/kg) ssAAV-HBV-shmiRx3-v1 바이러스 입자를 함유하는 생리식염수의 단일 200 μl 1회분(bolus)을 IV 주사로 꼬리 정맥에 전달; 및
그룹3: 2.0E+13 (vg/kg) scAAV-HBV-shmiRx3-v2 바이러스 입자를 함유하는 생리식염수의 단일 200 μl 1회분(bolus)을 IV 주사로 꼬리 정맥에 전달.
모든 마우스는 처리 바로 전에 2-4% 이소플루란 으로 마취한다.
처리의 투여(0일)에 이어 동물은 추가로 56일간 인큐베이트션 한다. 이시간 동안 혈액을 8 주 단위로(처리 후 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 및 56일) 채취하며, 기재된 방법론을 이용하여 실시간 PCR로 세포외 HBsAg, 세포외 HBeAg 및 세포외 HBV DNA의 혈청 농도를 결정한다.
56일에 혈액 샘플링을 완료한 후, 생존한 동물 전부를 이소플루란 마취 하에 두고 심장천자 및 방혈로 희생시킨다.
일단 희생되면 마우스로부터 전체 간을 수거하여 무게를 잰다. 두께 3 내지 5 mm의 간의 슬라이스를 좌엽(left lateral lobe)으로부터 수득하여 옆으로 약 1 내지 2 mm의 큐브로 절단한다. 이러한 간 큐브는 라벨을 붙인 튜브로 옮기고 가능한 조속히 RNAlater® 용액 (Ambion, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 담근다. 간 샘플은 RNAlater®의 5 이상 부피 내에서 밤새 4℃로 인큐베이션하여 그 용액이 조직을 투과하도록 한다. 인큐베이션 후에 RNAlater® 용액을 제거하고 간 조각은 간세포의 HBV DNA 수준에 관한 후속적 정량을 위해 -80℃에 보관한다.
처리 이후 간세포의 HBV DNA 수준을 결정하기 위해 DNeasy® Blood & Tissue Kits (Qiagen K.K., Tokyo, Japan)를 이용하여 동결된 RNAlater®-보존된 간 조직으로부터 HBV DNA를 추출한다. DNA를 200 μL의 무뉴클레아제수에 용해하고 그 이후 DNA 용액의 농도를 BioPhotometer 6131 (Eppendorf Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 결정한다. DNA 용액의 농도는 무뉴클레아제수를 이용하여 20 ng/μL로 조정한다.
이후 TaqMan Fast Advanced Master Mix 및 ABI Prism 7500 서열 검출기 시스템을 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 간 HBV cccDNA 농도를 측정한다. 간략히, PCR 반응 혼합물을 5 μL의 추출된 DNA에 가한다. PCR 반응은 Takkenber의 조건에 기초하여 수행한다. 50℃에서2분간 uracil-N-글리코실라제의 개시 활성화 후에 95℃에서 20초간 중합효소 활성화를 한다. 후속 PCR 증폭의 55 사이클은 ABI 7500 서열 검출기 내에서 사이클 당 95℃에서 3초간 및 60℃에서 32초간으로 수행한다. 평균 HBV cccDNA 수준은 두개의 분리된 웰의 값으므로부터 계산한다. HBV 전체 게놈 서열을 함유하는 플라스미드를 HBV cccDNA 정량을 위한 기준 샘플로서 사용한다. 사용되는 기준의 범위는 1.0E+02 과 1.0E+05 copies/100 ng DNA 사이일 수 있다.
실시간 PCR을 위해 사용되는 프라이머 및 프루브는 다음과 같다:
[표 3]
Figure 112018122027636-pct00003
실시예 10 - 키메라 마우스 모델에서 HBV 파라미터의 저해
항 -HBV shmiR 또는 shRNA-발현 AAV 입자의 인 비보 효과를 HBV 접종물로 새로이 감염된 PXB 키메라 마우스 모델에서 결정하였다(도 5에 도시한 바와 같음). 다양한 HBV 파라미터의 저해를 평가하였다: (i) HBV 바이러스 전사체의 발현, (ii) 세포외 HbsAg, HBcAg 및 HBeAg, (iii) 세포외 및 세포내 HBV DNA, 및 (iv) cccDNA의 형성.
실시예 8에 기재된 항-HBV shmiR 또는 shRNA-발현 AAV8 입자를 PXB 키메라 마우스 모델에서 평가하였다 (도 6). 시험된 세가지 항-HBV AAV8 입자는 다음과 같다:
(1) HBV-shRNAx3-v1 (ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1)을 함유하는 ssAAV8;
(2) HBV-shRNAx3-v1 (scAAV8-HBV-shRNAx3-v1) 을 함유하는 scAAV8; 및
(3) HBV-shmiRx3-v1 (ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1)을 함유하는 ssAAV8.
이와 같은 인 비보 연구는 PXB 마우스 모델에서 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1의 단일 투여의 활성을 단일치료법(monotherapy)으로 투여될 때 또는 엔테카비르 (ETV) 또는 페그인터페론 (PEG-IFN)과 같은 HBV 표준 치료약물과 조합하여 사용될 때로 평가하였다.
방법
키메라 PXB 마우스 (PXB-mice®)를 PhoenixBio로부터 수득하였다. 모든 마우스를 개별적으로 23±5℃ 및 습도 55±25%에 수용하고 12시간 명/암 주기에 노출하였으며 실험을 통틀어 무제한 급이 및 급수하였다. 간세포(hepatocyte) 이식 후 약 10주에 인간 혈청 알부민 측정을 사용하여 초기 간이 적어도 80%의 인간 간세포로 이루어져 있는 것을 보장하도록 하였다. 이러한 인간 간세포 조성의 역치를 초과하는 모든 키메라 동물은 HBV 유전형 C로 감염시키고 4 주간 인큐베이션하여 baseline HBV 감염이 확립되도록 하였다. 기저 HBV 감염을 결정하기 위하여 마우스로부터 혈액을 -28, -21, -14 및 -7 일 (즉 접종후 각각 0, 7, 14 및 21 일)에 채취하였는데, 이로부터 인간 알부민 (h-Alb) 농도 및 HBV DNA, HBsAg 및 HBeAg의 혈청 농도를 결정하였다. 이러한 것에 따르면 시험 동물 내 간 손상을 검출할 수 있었고 이상반응(adverse reactions)은 검출되지 않았다.
IntramedicTM Polyethylene Tubing (Becton, Dickinson and Company, NJ, USA)를 이용하여 retro-orbital plexus/sinus를 통하여 이소플루란 마취제(Escain®, Mylan, Osaka, Japan) 에 의해 매 시간 지점에서 마취 하에 동물로부터 채혈하였다. 수집된 혈액으로부터 전체 혈액중 2 μL를 식염수 내에서 희석하고, 임상 화학 분석기(BioMajestyTM Series JCA-BM6050, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 라텍스 응집 면역혼탁계측기 (LZ Test "Eiken" U-ALB, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 의해 혈액 h-Alb 농도를 측정하였다.
HBV DNA 정량, HbsAg, HBcAg 및 HBeAg 분석을 위해, 남아있는 전체 혈액을 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청HBV DNA을 측정하기 위하여, HBV DNA를 SMITESTEX-R&D Nucleic Acid Extraction Kit (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD., Nagoya, Japan)을 이용하여 혈청 5 μL로부터 추출하였다. 그런 다음, 정제된 DNA를 이후 20μL 무뉴클레아제 수 (Ambion)에 용해하였다. HBV-감염된 PXB-마우스로부터의 혈청은 HBV DNA 기준으로서 사용하였다. 합성 HBV DNA는 HBV DNA 표준의 농도를 결정하기 위해 사용되는데, 이 HBV DNA 표준은 이후에 혈청 HBV DNA 수준을 정량할 때에 사용하였다. HBV DNA는 HBV DNA 표준으로부터 추출하였으며 적절한 희석 이후 실시간 PCR을 위해 사용되었다. 사용되는 표준의 범위는 예를 들어 4.0E+04 과 2.0E+09 copies/mL 사이일 수 있다.
이어 예컨대 TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 ABI Prism 7500 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 혈청 HBV DNA 농도를 측정하였다. PCR 반응 혼합물은을 5 μL의 추출된 DNA에 가하였다. 50℃에서 2분간 우라실-N-글리코실라제의 개시 활성화 후에 95℃에서 20초간 중합효소 활성화하였다. 후속되는 PCR 증폭은 ABI 7500 서열 검출기 내에서 95℃에서 3초간 53 사이클의 변성 및 사이클 당 60℃에서 32초간 어닐링 및 신장반응으로 구성되었다. 평균 혈청 HBV DNA 수준은 두개의 분리된 웰의 값으로부터 계산하였다.
실시간 PCR을 위해 사용되는 프라이머 및 프루브는 다음과 같다:
[표 4]
Figure 112018122027636-pct00004
혈청 HBsAg 및 HBeAg 농도는 ChemiLuminescence ImmunoAssay (CLIA) 예컨대 Abbott (ARCHITECT® SYSTEM)에 의해 개발된 것을 이용하여 결정하였다.
동물이 다음의 기준을 만족한다면 동물을 후속 처리 실험에 포함시켰다:
(i) -1 일(즉 HBV 접종 후 27일)에서 무게 15g 이상;
(ii) -7 일(즉 HBV 접종 후 21일)에서 적어도 1.0E+6 copies/mL의 혈청 HBV DNA 농도 가짐; 및
(iii) -7 일(즉 HBV 접종 후 21일)에서 10mg/mL 이상의 h-Alb 측정값 가짐.
기저 HBV 감염이 확립되고 상기 기준에 맞는 마우스를 치료 12그룹에 배치하였으며 각 그룹은 4 또는 5 마우스로 구성되었다. 그룹 간의 변이를 최소화하기 위해 그룹 조성은 체중에 대한 산술 평균값 및 혈액 h-Alb 농도와 혈청 HBV DNA 농도에 대한 기하 평균값에 기초하여 랜덤하게 하였다.
치료군은 다음과 같이 하였다:
[표 5]
Figure 112018122027636-pct00005
*: ETV 및 Pegasys에 대한 mg/kg; BB-101. BB-102 및 BB-103에 대한 vg/kg
**: ETV 및 Pegasys에 대한 mg/mL
***: 목표 투여수준을 달성하기 위해 체중에 기초하여 투여일에 제조
n/a: 적용불가 (Not applicable)
식염수로 처리된 HBV-감염 마우스는 음성 대조군으로 작용하였다. HBV에 대해 치료 제제의 기준으로 처리한 군은 양성 대조군으로 작용하였다: 엔테카비르를 매일 6 μg/kg로 투여하거나 페그인터페론을 매주 두번 30 μg/kg로 주었다. 항-HBV ddRNAi 투여군에 대해서는 ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1를 0일에 저압 꼬리 정맥 주사로 2x10E+13 vg/kg의 투여량으로 한번 투여하였다. 병용-투여(Co-treated) 동물은 1일에 ETV 매일 투여를 시작거나 4일에 처음으로 PEG-IFN이을 투여하였다.
치료 바로 직전에 모든 마우스는 2-4% 이소플루란으로 마취되었다.
치료 투여 후에(0 일), 동물들은 추가 91일간 인큐베이션하였다. 이기간 동안 매주 단위로 13주 동안 주 단위로 (치료 후 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 및 91일) 채혈하였고 세포외 HBV DNA (바이러스 타이터) 및 세포외 HBsAg의 혈청 농도를 측정하였다. HBeAg를 70일 통틀어 격주 단위로 측정하였고 이후에는 91일 실험 결론까지 매주 측정하였다.
91일에 혈액 샘플링이 완료된 후, 생존한 동물 전부를 이소플루란 마취하에 두고 심장천자 및 방혈로 희생시켰다. 일단 희생되면 마우스로부터 전체 간을 수거하여 무게를 재었다. 두께 3 내지 5 mm의 간 슬라이스를 좌엽(left lateral lobe)으로부터 수득하여 옆으로 약 1 내지 2 mm의 큐브로 절단하였다. 이러한 간 큐브는 라벨을 붙인 튜브로 옮기고 가능한한 조속히 RNAlater® 용액 (Ambion, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 담궜다. 간 샘플은 RNAlater®의 5 이상의 부피 내에서 밤새 4℃로 인큐베이션하여 용액이 조직을 투과하도록 하였다. 인큐베이션 후에 RNAlater® 용액을 제거하고 간 조각은 shRNA 또는 shmiR RNAs 에서 유래된 재조합체의 발현 수준 뿐만 아니라 다양한 간세포 HBV DNA 및 RNA에 관한 후속적 정량을 위해 -80℃에 보관하였다.
처리 이후 간세포의 HBV DNA 수준을 결정하기 위해 DNeasy® Blood & Tissue Kits (Qiagen K.K., Tokyo, Japan)를 이용하여 동결된 RNAlater®-보존된 간 조직으로부터 HBV DNA를 추출하였다. DNA를 200 μL의 무뉴클레아제수에 용해하고 그 이후 DNA 용액의 농도를 BioPhotometer 6131 (Eppendorf Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 결정하였다. DNA 용액의 농도는 무뉴클레아제수를 이용하여 20 ng/μL로 조정하였다.
이후 TaqMan Fast Advanced Master Mix 및 ABI Prism 7500 서열 검출기 시스템을 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 간 HBV cccDNA 농도 측정을 수행하였다. 간략히는, PCR 반응 혼합물을 5 μL의 추출된 DNA에 가하였다. PCR 반응은 Takkenberg의 조건에 기초하여 수행하였다. 50℃에서2분간 uracil-N-glycosylase의 개시 활성화 후에 95℃에서 20초간 중합효소 활성화를 하였다. 후속적으로 PCR 증폭 55사이클을 예컨대 ABI 7500 서열 검출기 내에서 사이클 당 95℃에서 3초간 그리고 60℃에서 32초간으로 수행하였다. 평균 HBV cccDNA 수준을 계산하였다. HBV 전체 게놈 서열을 함유하는 플라스미드는 HBV cccDNA 정량을 위한 기준 샘플로서 사용하였다. 사용되는 기준의 범위는 1.0E+02 과 1.0E+05 copies/100 ng DNA 사이일 수 있다.
실시간 PCR을 위해 사용되는 프라이머 및 프루브는 다음과 같다:
[표 6]
Figure 112018122027636-pct00006
실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 항-HBV 효과기 RNAi 분자의 간 생산 및 HBV mRNA 전사체의 저해를 정량하기 위하여 실시간 PCR이을 사용되었하였다.
결과:
간결성을 위해 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1에 대해 수득된 주요 데이터 포인트만 제시된다.
식염수 처리된 동물에서 바이러스 타이터는 1E+08 HBV DNA copies/ml 보다 많게 실험 13주에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지되었다(도 7). ETV 매일 투여로만 구성된 치료는 혈청 HBV DNA 수준에서 2.63 로그로 저하되는 것을 유발하였다. 다른 항바이러스제 없이 투여되어된 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 및 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1는 해당 혈청 HBV DNA의 수준의 최대 저하가 각각 2.17 로그 및 1.87 log 로그 감소를 나타내었다. 그러나 이후의 치료 63일에 HBV DNA 수준이 완만한 반등을 보였다. 다만 엔테카비르 매일 투여와 조합시 단일 투여의 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 및 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1는 혈청 HBV DNA 수준을 3.72 로그 아래로 떨어뜨렸는데 이는 어세이를 최저정량한계 (lower limit of quantification (LLOQ))이다. HBV DNA 수준을 정확히 정량하는 것은 어려우나 바이러스의 부담에 있어서 감소는 실험 91일의 끝까지 계속하여 감소하는 것으로 나타난다.
s-항원 (HBsAg)은 면역억제(immunosuppression) 및 HBV 만성(chronicity)에 대한 알려진 기여자이다. 활성 감염에서 발생하는 고수준의 HBsAg 발현은 치료를 달성하는데에 문제라고 여겨진다. "치료"란 항-HBsAg 항체의 발현으로 정의되는 HBV 감염 환자의 혈청전환(seroconversion)으로 종종 정의된다. ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 + ETV 또는 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 + ETV로 감염된 키메라 마우스를 처리할 경우 HBsAg 수준을 각각 2.14 로그 및 1.86 로그 떨어뜨렸다(도 8). 단독치료로서 ETV를 처리하면 HBsAg 수준을 단지 0.46 로그 떨어뜨렸다.
ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 + ETV로 처리할 경우 HBeAg 수준을 1.90 로그 떨어뜨렸고, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 + ETV로 처리할 경우 HBeAg 수준을 1.42 로그 떨어뜨렸다. 엔케카비르만으로 처리하면 HBsAg 수준을 단지 0.37 로그 떨어뜨렸다 (도 9).
ETV와의 공동처리(co-treatment)에 더하여 본 연구는 PEG-IFN와 공동 투여할 때 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 또는 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1의 조합에 관해 시험하였다. 매주 두번 주어지는 페그인터페론으로 구성되는 치료법(regimen)에 더하여 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 나 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1를 단일 투여할 경우 HBV 혈청 DNA 수준이 각각 2.67과 3.27 로그로 상당히 감소하였다(도 10).
약 처리의 91일의 결과로서 마우스를 희생하고 간을 회수하고 이의 조직으로부터 DNA 및 RNA를 정제하여 간세포 파라미터의 수를 구하였다. 예를 들어 RNA 간섭제제(RNA interference agent)로서, ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1가 세포에 존재하는 HBV 바이러스 전사체의 수준을 감소시킬 것으로 기대된다.
개개의 RNAi-유도된 절단 자리 근처에 위치한 프라이머/프루브 세트를 이용하여 RT-QPCR로 HBV RNA의 수준을 평가하였다(도 11). 비록 페그인터페론이 단일치료법으로서 강한 활성 수준을 가지고 있었으나 HBV RNA 수준에 대한 엔테카비르의 효과는 온화했고, 13주 처리를 통하여 대략 50% 감소를 달성했다. 단일치료법으로서 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1는 바이러스 RNA에 대한 강력한 억제효과(suppression)를 가져 HBV 전사체의 94% 초과의 감소를 유발하였다. 두개의 항바이러스제 중 어느 하나와 조합하면 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1는 바이러스 RNA를 저해하는 능력을 강화하여 98.6% 만큼 높은 억제 수준에 도달하였다.
정량적 PCR을 이용하여 cccDNA뿐만 아니라 세포내 HBV DNA도 간 샘플로부터 평가하였다. 엔테카비르 또는 페크인터페론 단독으로 처리한다면 세포내 DNA 수준을 2 로그 떨어뜨릴 수 있었다(도 12, 좌측 패널). 그러나 치료법에 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1를 단일 첨가하면 세포내 DNA 수준을 3로그 더 감소시켰다. 비록 RNA 간섭이 세포내 HBV DNA를 직접 공격하지는 않으나 RNA 및 해당하는 전사체의 감소는 pgRNA 틀을 DNA 중간체로 전환하는 역전사 과정의 능력을 감소시켜 DNA 중간체의 감소에 이르게 한다. cccDNA의 온화한 감소는 ETV를 이용 시 하나의 로그 감소보다 약간 더 많이 발생하였으나 ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1의 부가가 cccDNA 수준의 추가적인 감소를 유의적으로 유발하지는 않았다(도 12, 우측 패널).
RT-QPCR (도 13) 및 차세대 시퀀싱 (NGS, 도 14-16)을 통하여 PXB 마우스의 간 조직으로부터 RNAi 효과기 분자의 발현을 또한 결정하였다. shmiR (ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1)로부터 생산될 때 우세한 RNAi 효과기 종들의 수는 2 내지 3으로 제한된다는 것을 NGS 데이터가 보여준다. 효과기 종들의 수는 shRNA (ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1 및 scAAV8-HBV-shRNAx3-v1)로부터 생산될 때 극적으로 증가한다. shmiR 전구체로서 작은 RNA 전사체는 Drosha가 제1 절단을 수행하고 RNAi 이중체의 한 말단을 정의하는 RNAi 경로 상류로 들어간다. 이 말단은 특징적인 2nt 3' 돌출부를 함유하는데 이는 다이서(dicer)에 대한 최적의 기질로서 제시되는 것으로서 상기 다이서는 루프를 절단하여 최종 siRNA 이중체를 생산하는 것이다. 드로샤 및 다이서에 의한 공정은 매우 정확하며 서열 중 오직 최소의 수만이 심도있는 서열화(deep sequencing)을 통하여 발견되는 바이다. 반면에 제1세대 shRNA는 RNAi 이중체의 한 말단을 규정하는 서열 내에 만들어진 전사 종결자(즉, polyT)에 의존적이다. 이 메커니즘은 부정확하고 2 내지 5 nt 3' 돌출부를 생산하는데 이는 다이서 매개 절단에 대해 최적이 아니다. 다이서에 의한 낮은 신뢰성의 절단 결과로서, 많은 수의 종들이 심도있는 시퀀싱를 통해 관찰된다. 더욱 중요하게는 (shmiR들에 대조적으로) shRNA로부터 생산되는 효과기 종들의 이처럼 넓은 분포는 원하는 종의 활성을 감소시킬 수 있으며 비효율적인 항- HBV RNAi 분자의 원하지 않는 생산은 표적 이탈 효과(off target effects)의 가능성을 증가시킬 수 있다는 것이다.
관련 분야 통상의 기술자는 본 개시의 넓고도 일반적인 범위로부터 벗어나지 않으면서도 상기 구체예에 대해 수많은 변형 및/또는 변경이 있을 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서 본 구체예는 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Benitec Biopharma Limited <120> Reagents for treatment of hepatitis B virus (HBV) infection and use thereof <130> 177887 <150> US 62/332,245 <151> 2016-05-05 <150> PCT/AU2017/050413 <151> 2017-05-05 <160> 229 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 cauccugcug cuaugccuca 20 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 2 uuugcugacg caacccccac ugg 23 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 3 aagccuccaa gcugugccuu 20 <210> 4 <211> 28 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 4 gcaggucccc uagaagaaga acucccuc 28 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 5 caagguaugu ugcccguuug ucc 23 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 6 cucguggugg acuucucuca 20 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 7 cucguguuac aggcgggguu uuu 23 <210> 8 <211> 29 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 8 ccgugugcac uucgcuucac cucugcacg 29 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> 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actgcctcgg acttcaa 107 <210> 65 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-7 <400> 65 ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaagg tatgttgccc gtttgtactg tgaagcagat 60 gggtacaaac gggcaacata ccttgcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 66 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-8 <400> 66 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcgt ggtggacttc tctcaaactg tgaagcagat 60 gggtttgaga gaagtccacc acgagcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 67 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-9 <400> 67 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcgt gttacaggcg gggtttactg tgaagcagat 60 gggtaaaccc cgcctgtaac acgagcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 68 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-10 <400> 68 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacact tcgcttcacc tctgcaactg tgaagcagat 60 gggttgcaga ggtgaagcga agtgccgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 69 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-11 <400> 69 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgtc ccgtcggcgc tgaatcactg tgaagcagat 60 gggtgattca gcgccgacgg gacgacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 70 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-12 <400> 70 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtcc cgtcggcgct gaatccactg tgaagcagat 60 gggtggattc agcgccgacg ggacgcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 71 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-13 <400> 71 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacaaa tgcccctatc ttatcaactg tgaagcagat 60 gggttgataa gataggggca tttggcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 72 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-14 <400> 72 ggtatattgc tgttgacagt gagcgaacct atgggagtgg gcctcaactg tgaagcagat 60 gggttgaggc ccactcccat aggtacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 73 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-15 <400> 73 ggtatattgc tgttgacagt gagcgaagtg gttcgtaggg ctttccactg tgaagcagat 60 gggtggaaag ccctacgaac cactgcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 74 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-16 <400> 74 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagaac ctttaccccg ttgcccactg tgaagcagat 60 gggtgggcaa cggggtaaag gttcacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 75 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stemloop <400> 75 acugugaagc agaugggu 18 <210> 76 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-30a backbone 5' flanking sequnece <400> 76 gguauauugc uguugacagu gagcga 26 <210> 77 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-30a backbone 3' flanking sequnece <400> 77 cgccuacugc cucggacuuc aa 22 <210> 78 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-1 sequence <400> 78 cauccugcug cuaugccuca caagagauga ggcauagcag caggaug 47 <210> 79 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-2 sequence <400> 79 gcugacgcaa cccccacugg caagagacca guggggguug cgucagc 47 <210> 80 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-3 sequence <400> 80 aagccuccaa gcugugccuu ugugcuuaag gcacagcuug gaggcuu 47 <210> 81 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-4 sequence <400> 81 gguccccuag aagaagaacu ccaagagaga guucuucuuc uaggggacc 49 <210> 82 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-5 sequence <400> 82 cccuagaaga agaacucccu ccaagagaga gggaguucuu cuucuaggg 49 <210> 83 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 sequence <400> 83 gcaggucccc uagaagaaga acaagagauu cuucuucuag gggaccugc 49 <210> 84 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-7 sequence <400> 84 caagguaugu ugcccguuug ucaagagaac aaacgggcaa cauaccuug 49 <210> 85 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-8 sequence <400> 85 cucguggugg acuucucuca caagagauga gagaagucca ccacgag 47 <210> 86 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-9 sequence <400> 86 cucguguuac aggcgggguu uugugcuuaa accccgccug uaacacgag 49 <210> 87 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-10 sequence <400> 87 gcacuucgcu ucaccucugc acaagagaug cagaggugaa gcgaagugc 49 <210> 88 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-11 sequence <400> 88 acgucccguc ggcgcugaau cugugcuuga uucagcgccg acgggacgu 49 <210> 89 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 sequence <400> 89 cgucccgucg gcgcugaauc cugugcuugg auucagcgcc gacgggacg 49 <210> 90 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-13 sequence <400> 90 aaaugccccu aucuuaucau gugcuuugau aagauagggg cauuu 45 <210> 91 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-14 sequence <400> 91 auaccuaugg gagugggccu cacaagagau gaggcccacu cccauaggua u 51 <210> 92 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 sequence <400> 92 cagugguucg uagggcuuuc cccaagagag ggaaagcccu acgaaccacu g 51 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Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-6 <400> 99 gcaggtcccc tagaagaaga acaagagatt cttcttctag gggacctgc 49 <210> 100 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-7 <400> 100 caaggtatgt tgcccgtttg tcaagagaac aaacgggcaa cataccttg 49 <210> 101 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-8 <400> 101 ctcgtggtgg acttctctca caagagatga gagaagtcca ccacgag 47 <210> 102 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-9 <400> 102 ctcgtgttac aggcggggtt ttgtgcttaa accccgcctg taacacgag 49 <210> 103 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-10 <400> 103 gcacttcgct tcacctctgc acaagagatg cagaggtgaa gcgaagtgc 49 <210> 104 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-11 <400> 104 acgtcccgtc ggcgctgaat ctgtgcttga ttcagcgccg acgggacgt 49 <210> 105 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-12 <400> 105 cgtcccgtcg gcgctgaatc ctgtgcttgg attcagcgcc gacgggacg 49 <210> 106 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-13 <400> 106 aaatgcccct atcttatcat gtgctttgat aagatagggg cattt 45 <210> 107 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-14 <400> 107 atacctatgg gagtgggcct cacaagagat gaggcccact cccataggta t 51 <210> 108 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-15 <400> 108 cagtggttcg tagggctttc cccaagagag ggaaagccct acgaaccact g 51 <210> 109 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shRNA-16 <400> 109 gaacctttac cccgttgccc ggcaagagac cgggcaacgg ggtaaaggtt c 51 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-17 effector <400> 110 gggaaagccc uacgaaccac a 21 <210> 111 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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uuucccacug ugaagcagau 60 gggugggaaa gcccuacgaa ccacacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 135 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-18 sequence <400> 135 gguauauugc uguugacagu gagcgauggu ucguagggcu uuccccacug ugaagcagau 60 ggguggggaa agcccuacga accaccgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 136 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-19 sequence <400> 136 gguauauugc uguugacagu gagcgagugg uucguagggc uuuccaacug ugaagcagau 60 ggguuggaaa gcccuacgaa ccacacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 137 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-20 sequence <400> 137 gguauauugc uguugacagu gagcgacagu gguucguagg gcuuucacug ugaagcagau 60 gggugaaagc ccuacgaacc acugacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 138 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-21 sequence <400> 138 gguauauugc uguugacagu gagcgaucag ugguucguag ggcuuuacug ugaagcagau 60 ggguaaagcc cuacgaacca cugaacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 139 <211> 107 <212> RNA <213> 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ugaagcagau 60 gggugauuca gcgccgacgg gacgacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 144 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-27 sequence <400> 144 gguauauugc uguugacagu gagcgaacgu cccgucggcg cugaauacug ugaagcagau 60 ggguauucag cgccgacggg acguacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 145 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-28 sequence <400> 145 gguauauugc uguugacagu gagcgagcgu cccgucggcg cugaauacug ugaagcagau 60 ggguauucag cgccgacggg acgcacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 146 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-17 <400> 146 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtgg ttcgtagggc tttcccactg tgaagcagat 60 gggtgggaaa gccctacgaa ccacacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 147 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-18 <400> 147 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatggt tcgtagggct ttccccactg tgaagcagat 60 gggtggggaa agccctacga accaccgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 148 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-19 <400> 148 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtgg ttcgtagggc tttccaactg tgaagcagat 60 gggttggaaa gccctacgaa ccacacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 149 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-20 <400> 149 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacagt ggttcgtagg gctttcactg tgaagcagat 60 gggtgaaagc cctacgaacc actgacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 150 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-21 <400> 150 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcag tggttcgtag ggctttactg tgaagcagat 60 gggtaaagcc ctacgaacca ctgaacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 151 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-22 <400> 151 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagcag tggttcgtag ggctttactg tgaagcagat 60 gggtaaagcc ctacgaacca ctgcacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 152 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-23 <400> 152 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatccc gtcggcgctg aatcccactg tgaagcagat 60 gggtgggatt cagcgccgac gggaccgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 153 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-24 <400> 153 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacccg tcggcgctga atcccgactg tgaagcagat 60 gggtcgggat tcagcgccga cgggacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 154 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-25 <400> 154 ggtatattgc tgttgacagt gagcgatccc gtcggcgctg aatccaactg tgaagcagat 60 gggttggatt cagcgccgac gggaccgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 155 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-26 <400> 155 ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgtc ccgtcggcgc tgaatcactg tgaagcagat 60 gggtgattca gcgccgacgg gacgacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 156 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-27 <400> 156 ggtatattgc tgttgacagt gagcgaacgt cccgtcggcg ctgaatactg tgaagcagat 60 gggtattcag cgccgacggg acgtacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 157 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding for shmiR-28 <400> 157 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagcgt cccgtcggcg ctgaatactg tgaagcagat 60 gggtattcag cgccgacggg acgcacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV forward primer <400> 158 cacatcagga ttcctaggac c 21 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV reverse primer <400> 159 aggttggtga gtgattggag 20 <210> 160 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV TaqMan probe <400> 160 cagagtctag actcgtggtg gacttc 26 <210> 161 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV cccDNA forward primer <400> 161 ctccccgtct gtgccttct 19 <210> 162 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV cccDNA reverse primer <400> 162 gccccaaagc cacccaag 18 <210> 163 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV cccDNA TaqMan probe <400> 163 cgtcgcatgg araccaccgt gaacgcc 27 <210> 164 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 DNA sequence with flanking region <400> 164 caacggatcc gcaggtcccc tagaagaaga acaagagatt cttcttctag gggacctgct 60 tttttagat 69 <210> 165 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 1 <400> 165 ttcttctagg ggacct 16 <210> 166 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 2 <400> 166 ttcttctagg ggacctg 17 <210> 167 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 3 <400> 167 ttcttctagg ggacctgc 18 <210> 168 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 4 <400> 168 ttcttctagg ggacctgct 19 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 5 <400> 169 ttcttctagg ggacctgctt 20 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 6 <400> 170 ttcttctagg ggacctgctt t 21 <210> 171 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 7 <400> 171 cttcttctag gggacctg 18 <210> 172 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 8 <400> 172 cttcttctag gggacctgc 19 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 9 <400> 173 cttcttctag gggacctgct 20 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 10 <400> 174 cttcttctag gggacctgct t 21 <210> 175 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-6 effector species 11 <400> 175 cttcttctag gggacctgct tt 22 <210> 176 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 DNA sequence with flanking region <400> 176 ttgacagtga gcgacaggtc ccctagaaga agaaactgtg aagcagatgg gtttcttctt 60 ctaggggacc tgccgcctac 80 <210> 177 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 effector species 1 <400> 177 ttcttctagg ggacctgc 18 <210> 178 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 effector species 2 <400> 178 cttcttctag gggacctgc 19 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 effector species 3 <400> 179 tttcttcttc taggggacct g 21 <210> 180 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 effector species 4 <400> 180 tttcttcttc taggggacct gc 22 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-6 effector species 5 <400> 181 tttcttcttc taggggacct gcc 23 <210> 182 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 DNA sequence plus flanking region <400> 182 gaaaggacga ggatccgcag tggttcgtag ggctttcccc aagagaggga aagccctacg 60 aaccactgtt tttct 75 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 1 <400> 183 agccctacga accactgttt 20 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 2 <400> 184 agccctacga accactgttt t 21 <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 3 <400> 185 aagccctacg aaccactgt 19 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 4 <400> 186 aagccctacg aaccactgtt 20 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 5 <400> 187 aagccctacg aaccactgtt t 21 <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 6 <400> 188 aagccctacg aaccactgtt tt 22 <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 7 <400> 189 aaagccctac gaaccactg 19 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 8 <400> 190 aaagccctac gaaccactgt 20 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 9 <400> 191 aaagccctac gaaccactgt t 21 <210> 192 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 10 <400> 192 aaagccctac gaaccactgt tt 22 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 11 <400> 193 aaagccctac gaaccactgt ttt 23 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 12 <400> 194 gaaagcccta cgaaccactg 20 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 13 <400> 195 gaaagcccta cgaaccactg t 21 <210> 196 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 14 <400> 196 gaaagcccta cgaaccactg tt 22 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 15 <400> 197 gaaagcccta cgaaccactg ttt 23 <210> 198 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 16 <400> 198 gaaagcccta cgaaccactg tttt 24 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 17 <400> 199 ggaaagccct acgaaccact 20 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 18 <400> 200 ggaaagccct acgaaccact g 21 <210> 201 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-15 effector species 19 <400> 201 ggaaagccct acgaaccact gt 22 <210> 202 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 DNA sequence plus flanking region <400> 202 gttgacagtg agcgaagtgg ttcgtagggc tttccactgt gaagcagatg ggtggaaagc 60 cctacgaacc actgcgccta c 81 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 1 <400> 203 gaaagcccta cgaaccactg 20 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 2 <400> 204 ggaaagccct acgaaccact g 21 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 3 <400> 205 tggaaagccc tacgaaccac 20 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 4 <400> 206 tggaaagccc tacgaaccac t 21 <210> 207 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 5 <400> 207 tggaaagccc tacgaaccac tg 22 <210> 208 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-15 effector species 6 <400> 208 tggaaagccc tacgaaccac tgc 23 <210> 209 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 DNA sequence plus flanking region <400> 209 ctcaacggat ccgcgtcccg tcggcgctga atcctgtgct tggattcagc gccgacggga 60 cgttttttc 69 <210> 210 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 1 <400> 210 ttcagcgccg acgggac 17 <210> 211 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 2 <400> 211 ttcagcgccg acgggacg 18 <210> 212 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 3 <400> 212 ttcagcgccg acgggacgt 19 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 4 <400> 213 ttcagcgccg acgggacgtt 20 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 5 <400> 214 ttcagcgccg acgggacgtt t 21 <210> 215 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 6 <400> 215 ttcagcgccg acgggacgtt tt 22 <210> 216 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 7 <400> 216 attcagcgcc gacggga 17 <210> 217 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 8 <400> 217 attcagcgcc gacgggac 18 <210> 218 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 9 <400> 218 attcagcgcc gacgggacg 19 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 10 <400> 219 attcagcgcc gacgggacgt 20 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 11 <400> 220 attcagcgcc gacgggacgt t 21 <210> 221 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 12 <400> 221 attcagcgcc gacgggacgt tt 22 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 13 <400> 222 attcagcgcc gacgggacgt ttt 23 <210> 223 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA-12 effector species 14 <400> 223 tggattcagc gccgacggga cgtt 24 <210> 224 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 DNA sequence plus flanking region <400> 224 acagtgagcg agtcccgtcg gcgctgaatc cactgtgaag cagatgggtg gattcagcgc 60 cgacgggacg cgcct 75 <210> 225 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 effector species 1 <400> 225 tggattcagc gccgacgg 18 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 effector species 2 <400> 226 tggattcagc gccgacggga 20 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 effector species 3 <400> 227 tggattcagc gccgacggga c 21 <210> 228 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 effector species 4 <400> 228 tggattcagc gccgacggga cg 22 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shmiR-12 effector species 5 <400> 229 tggattcagc gccgacggga cgc 23

Claims (43)

  1. 짧은 헤어핀 마이크로-RNA (shmiR)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 shmiR은
    길이상으로 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 서열;
    효과기 상보 서열;
    스템루프 서열; 및
    1차 마이크로 RNA(pri-miRNA) 골격;을 포함하고,
    여기서 상기 효과기 서열은 서열번호 22, 34, 및 40 중 어느 하나에서 제시된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 것인 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 shmiR은
    서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
    서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
    로 이루어진 군에서 선택되는 핵산.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 shmiR은 5'에서 3' 방향으로
    (i) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
    효과기 상보 서열;
    스템루프 서열;
    효과기 서열; 및
    pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열; 또는
    (ii) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
    효과기 서열;
    스템루프 서열;
    효과기 상보 서열; 및
    pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열
    을 포함하는 것인 핵산.
  4. 청구항 1에 있어서,
    (i) 상기 스템루프 서열은 서열번호 75에서 제시된 서열이거나;
    (ii) 상기 pri-miRNA 골격은 pri-miRNA-30a 백본이거나;
    (iii) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열은 서열번호 76에서 제시된 서열이고, pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열은 서열번호 77에서 제시된 서열이거나; 또는
    (iv) 상기 (i), (ii), 및 (iii)의 임의의 조합
    인 것인 핵산.
  5. 청구항 1에 있어서,
    (i) shmiR은 서열번호 48, 54, 및 57 중 어느 하나에서 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    (ii) shmiR을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 64, 70, 및 73 중 어느 하나에 제시되어 있는 것인 핵산.
  6. 다음을 포함하는 복수의 핵산:
    (a) 청구항 1에 따른 핵산 중 하나 이상; 및
    (b) shmiR를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 shmiR은
    길이상으로 17 뉴클레오티드 이상의 효과기 서열;
    효과기 상보 서열;
    스템루프 서열; 및
    pri-miRNA 골격;을 포함하고,
    여기서 상기 효과기 서열은 서열번호 22, 34, 및 40 중 어느 하나에서 제시된 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인 것인 핵산을 포함하는,
    하나 이상의 추가적인 핵산;
    여기서 상기 (a)의 핵산이 코딩하는 상기 shmiR 및 상기 (b)의 핵산이 코딩하는 상기 shmiR은 상이한 효과기 서열을 포함한다.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 (a) 및 (b)에서의 shmiR은
    서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR; 및
    서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR;
    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 복수의 핵산.
  8. 청구항 6에 있어서,
    서열번호 21에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 22에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA를 포함하는 핵산;
    서열번호 33에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 34에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA를 포함하는 핵산; 및
    서열번호 39에서 제시된 효과기 서열 및 서열번호 40에서 제시된 효과기 상보 서열을 포함하는 shmiR을 코딩하는 DNA를 포함하는 핵산;
    을 포함하는 것인 복수의 핵산.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 (a) 및 (b)에서의 shmiR은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함하는 복수의 핵산:
    (i) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
    효과기 상보 서열;
    스템루프 서열;
    효과기 서열; 및
    pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열; 또는
    (ii) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열;
    효과기 서열;
    스템루프 서열;
    효과기 상보 서열; 및
    pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열
    을 포함하는 것인 복수의 핵산.
  10. 청구항 6에 있어서,
    (i) 상기 스템루프 서열은 서열번호 75에서 제시된 서열이거나;
    (ii) 상기 pri-miRNA 골격은 pri-miRNA-30a 백본이거나;
    (iii) pri-miRNA 골격의 5' 인접 서열은 서열번호 76에서 제시된 서열이고, pri-miRNA 골격의 3' 인접 서열은 서열번호 77에서 제시된 서열이거나; 또는
    (iv) 상기 (i), (ii), 및 (iii)의 임의의 조합
    인 것인 복수의 핵산.
  11. 청구항 6에 있어서,
    (i) 상기 shmiR은 서열번호 48, 54, 및 57 중 어느 하나에서 제시된 서열을 포함하는 shmiR에서 선택되거나; 또는
    (ii) 상기 shmiR을 코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 64, 70, 및 73에 제시된 서열로부터 선택되는 것인
    복수의 핵산.
  12. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 핵산 중 적어도 하나 또는 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항의 복수의 핵산을 포함하는 DNA-유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 구조체.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 ddRNAi 구조체는 다음을 포함하는 ddRNAi 구조체:
    (a) 서열번호 48에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산;
    서열번호 57에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 및
    서열번호 54에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 shmiR을 코딩하는 핵산; 또는
    (b) 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산;
    서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산; 및
    서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산.
  14. 청구항 12에 있어서, shmiR을 코딩하는 핵산 또는 각각의 핵산의 RNA pol III 프로모터 상류를 포함하는 것인 ddRNAi 구조체.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 RNA pol III 프로모터 또는 각각의 RNA pol III 프로모터는 U6-9 프로모터, U6-1 프로모터 및 U6-8 프로모터로부터 선택되는 U6 프로모터, 및 H1 프로모터로부터 선택되는 것인 ddRNAi 구조체.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 ddRNAi 구조체는 다음을 포함하는 ddRNAi 구조체:
    서열번호 64에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-9 프로모터 상류;
    서열번호 73에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-1 프로모터 상류; 및
    서열번호 70에서 제시된 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된 핵산의 U6-8 프로모터 상류.
  17. 청구항 12의 ddRNAi 구조체를 포함하는 발현 벡터.
  18. (i) 청구항 12에 따른 DNA 유도 RNA 간섭 (ddRNAi) 구조체, 또는 그 ddRNAi 구조체를 포함하는 발현 벡터; 및 (ii) 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는,
    B형 간염 바이러스(HBV)을 앓고 있는 개체에서 HBV 감염의 치료, HBV로 감염된 개체에서 HBV 로드의 감소, HBV를 앓고 있는 개체의 HBV 감염과 관련된 증상의 중증도를 감소, 또는 HBV로 감염된 개체의 HBV 전염력 감소에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, HBV 감염을 치료용으로 알려진 하나 이상의 다른 치료제를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  20. 청구항 18에 있어서,
    (i) 상기 개체는 급성 또는 만성 HBV 감염을 앓거나;
    (ii) 하나 이상의 HBV 유전자의 발현이 감소되서나 억제되거나;
    (iii) 상기 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 추가적인 HBV 감염 치료제와 조합하여 사용하기 위한 것이거나; 또는
    (iv) 상기 ddRNAi 구조체 또는 발현 벡터는 엔테카비르, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르 및 페그인터페론(pegylated interferon)으로 구성된 군에서 선택된 추가적인 치료제와 조합하여 사용하기 위한 것이거나; 또는
    (v) 상기 (i) 내지 (iv)의 임의의 조합
    인 것인 약학적 조성물.
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