CN105647922A - 基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用 - Google Patents

基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组S基因保守区域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，并在HBV稳转细胞模型、HBV水动力小鼠模型中均成功破坏HBV？cccDNA和整合状态的HBV？DNA，并取得显著的抑制HBV复制与表达的效果。本发明还提供了含有上述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用。

Description

基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种gRNA序列及通过CRISPR-Cas9系统对乙肝病毒进行基因编辑的技术，属于基因突变和基因工程技术领域。
背景技术
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)引起的严重传染性疾病。全球共有20亿人感染过乙肝病毒，其中约4亿人为乙肝病毒慢性感染者，HBV持续感染会导致其中部分患者恶化为肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV引起的肝脏相关疾病的人数达到一百万人。我国是乙肝大国，现有HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年用于乙肝治疗的直接费用超过1000亿元，乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的重大问题。虽然目前乙肝疫苗已广泛应用，在一定程度上预防了HBV新发感染，降低了乙肝发病率。但对于慢性HBV感染者，仍需通过有效的抗病毒治疗来缓解病情、延缓或阻断肝硬化进程、防止出现肝衰竭或肝细胞癌变等严重后果。目前，常用的乙肝抗病毒治疗药物有干扰素和核苷类似物等。干扰素(Interferon,IFN)具有直接的抗病毒和免疫调节作用并可有效提高机体免疫力，但干扰素治疗有严格的适应证和禁忌证，适于干扰素的患者仅1/3获得持续应答，而且副作用较多。核苷类似物(NucleostideAnalogues，NAs)可通过抑制DNA逆转录酶活性从而抑制乙肝病毒的复制，然而，乙肝患者在口服NAs抗病毒治疗过程中会出现诸多问题:疗程难以确定，大多数患者需要长期治疗甚至终身治疗，而随着治疗时间的延长，产生HBV耐药性突变的风险也随之增加。重要的是，肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA)的持续存在是HBV慢性感染和复发的根源。此外，HBV在复制过程中还能够与细胞基因组进行整合，而这种整合改变了内源性基因的功能或者染色体不稳定，从而诱导肝细胞癌的发生。长期以来，一直未能找到以cccDNA和整合的HBVDNA为靶点的药物或其他治疗方法。NAs虽然能明显抑制病毒复制水平，使病毒DNA含量下降或消失，但由于肝细胞核内产生新病毒的根源(病毒复制模板cccDNA)未能根除，即使患者在达到治疗终点后停药，残存的病毒也可能以cccDNA为模板再次大量复制，激发强烈的免疫应答，导致短期内广泛肝组织损伤，病情复发，严重者可以导致重型肝炎或肝衰竭。
近年来出现的DNA编辑技术可以对任何物种进行DNA的精确编辑，使得从根本上清除cccDNA和整合的HBVDNA成为了可能。目前主要的基因编辑技术包括：锌指核酸酶(ZincFingernucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TranseriptionAetivator-likeEffectorNueleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)/Cas9系统。ThomasJCradick等构建了针对HBVC基因的ZFNs系统，并使得HBV前基因组RNA(pgRNA)降低了约29％，BloomK等利用TALENs有效干扰相应的HBV靶序列并抑制了病毒的复制，在HepG2.2.15中，经过3次转染，导致约35％的cccDNA发生突变，在水动力法转染HBV小鼠模型体内也显著抑制了病毒复制。然而ZFNs和TALENs系统组装与筛选复杂，存在细胞毒性、易脱靶、构建成本偏高等问题，加之TALENs可能引起的免疫反应限制了其应用和发展。CRISPR-Cas9技术的出现有望克服上述不足，实现从根本上破坏或清除HBV的目标。
CRISPR系统是新发现的原核生物获得性免疫机制。2012年Matthew等在II型CRISPR系统中发现了一种双链RNA，并将这种双链RNA改造为一种能指导Cas9蛋白对几乎所有DNA序列进行剪切的工具，即一种全新的基因定点改造技术——CRISPR-Cas9编辑技术，随后Naure、Science、Cell等权威期刊竞相报道其最新研究进展。Nature杂志将CRISPR-Cas9编辑技术评为过去十年对生物学研究影响最深的十大技术之一，Science、MITTechnologyReview等杂志也将其评为2014年十大突破性技术。CRISPR-Cas9编辑技术仅需设计sgRNA就可实现对含有原间区毗邻序列PAM(ProtospacerAdjacentMotif)的任意靶DNA序列进行敲除、插入与定点突变等修饰。同时，CRISPR-Cas9系统还可实现对多个不同DNA序列的编辑。利用CRISPR位点本身的特点，设计对应不同靶DNA序列的间隔序列插入到重复序列之间，经过转录加工后形成多个可定位于不同靶序列的双引导RNA(tracrRNA:crRNA)，或者串联不同的sgRNA均可对哺乳动物细胞基因组多个不同基因同时进行编辑。Wang等设计了5个不同基因的gRNA的质粒同时转染到小鼠胚胎干细胞内，结果发现Tet1，Tet2，Tet3和Sry，Uty同时被编辑且效率很高，这对于开发出多位点抗病毒策略至关重要，同样的结果在斑马鱼，人体细胞，线虫，大鼠，和猴中也得到了验证。此外，CRISPR-Cas9系统也为基因治疗提供了一个新的、有力的技术手段。例如，李劲松等就利用CRISPR-Cas9系统成功将小鼠白内障遗传病治愈，Schwank等利用该技术校正人干细胞中一种与囊肿性纤维化相关联的基因缺陷，Ebina等利用该技术将HIV-1启动子沉默，在转染CRISPR-Cas9质粒的人干细胞细胞中发现HIV-1的表达明显下降。Kennedy等利用CRISPR-Cas9靶向HPV中的E6、E7基因，达到了抑制病毒复制以及癌细胞增殖的效果。
目前已有研究证实CRISPR-Cas9系统在根治HBV感染等方面具有重大潜力，SuRuLin等分别在Huh-7细胞内和水动力法转染HBV小鼠模型内利用CRSIPR-Cas9系统对带有HBV基因组(A基因型)的重组质粒进行了破坏，并在一定程度上抑制了HBV质粒的表达；ChristophSeeger等通过设计针对cccDNA的CRISPR-Cas9系统，证明了CRISPR-Cas9系统具有对cccDNA序列的破坏以及对HBV感染的抑制作用；SZhen等在HBV稳定转染模型HepG2.2.15中利用CRISPR-Cas9降低了乙肝表面抗原和cccDNA的含量。VyasRamanan、EdwardM.Kennedy、XingLiu、DongC、LuFM等人也先后利用CRISPR-Cas9靶向HBV基因组，并分别在HBV细胞及HBV水动力小鼠模型中实现了对HBVcccDNA以及HBV相关抗原表达的抑制；MadinaKarimova等人利用CRISPR-Cas9靶向破坏HBV基因组的S区和X区实现了对HBV复制和表达的抑制，同时在HeLa和HEK293细胞中证实了该系统对整合的HBV基因组的破坏，然而并未在HBV稳转肝癌细胞模型中以及HBV转基因小鼠模型中对整合状态的HBVDNA进行破坏或完全清除。然而，已有的研究同时表明，靶向HBV不同区域的gRNA对HBV复制的抑制效果也存在大不相同。此外，现有研究也均未涉及CRISPR-Cas9系统对整合的HBVDNA的破坏及清除作用。而且，以上研究均未能阐明CRISPR-Cas9的脱靶效应和细胞毒性对结果的影响。因此，寻找高效破坏HBVcccDNA及整合状态HBVDNA、抑制HBV复制与表达并且不存在脱靶效应的CRISPR-Cas9靶点，成为了目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于通过设计、构建、筛选，最终提供一段能同时靶向不同血清型HBV保守序列的CRISPR-Cas9系统靶点序列，利用该靶点构建的CRISPR-Cas9系统能够高效地抑制HBV在细胞中的表达和复制，以及对HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA具有破坏作用。
为实现上述目的，本发明以CRISPR-Cas9系统的原理及靶序列的选择原则为基础，通过比对根据保守区域设计了8条gRNA并以PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro(AddgeneID：48139)为载体构建了相应的CRISPR-Cas9系统。通过筛选和一系列分析测试，最终选出1个有效的gRNA及其组合。
由此，本发明首先提供了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组S基因保守区域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述靶序列存在一个原间区毗邻序列CGG。
优选地，所述gRNA序列如SEQIDNO:2所示。
本发明还提供了一种含有上述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统，所述gRNA序列与能表达Cas9蛋白的表达载体相连接。
优选地，所述gRNA序列与PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro质粒相连接。
在一个优选的技术方案中，所述连接为，先在所述gRNA其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC，之后再与所述质粒连接。
本发明又提供了一种上述的CRISPR-Cas9系统序列在在制备治疗乙肝药物中的应用。
最后，本发明提供了一种含有上述CRISPR-Cas9系统的组合物，所述组合物还含有制药学上可接受的载体。
优选地，所述组合物被制备为注射剂。
本发明最初所构建的8套CRISPR-Cas9系统通过SSA外源活性检测和T7E1内源活性检测，筛选出了高效的gRNA-S4系统(即S4靶点)。并在HBV稳转细胞模型及HBV水动力小鼠模型中高效抑制了HBV的复制和表达，同时并未对细胞的增殖活性产生明显的抑制，也未检测出明显的脱靶效应。相比S4位点未突变的HBV稳转细胞系，在由gRNA-S4系统引起的S4位点突变的细胞株上清中的HBsAg的含量降至了阴性临界值以下；上清中的HBVDNA的含量降低了99.95±0.01％；细胞内的HBV复制中间体的含量降低了99.87±0.25％；细胞内HBVcccDNA的含量降低了95.37±0.64％。含有S4靶点的CRISPR-Cas9系统gRNA-S4同时也将HBV水动力小鼠模型血清中的HBsAg的含量由平均2.35×104IU/ml降至18.93IU/ml；将血清中的HBVDNA的含量由平均6.25×104IU/ml降至1000IU/ml以下。
因此，本发明提供了一个在CRISPR-Cas9特异性抑制HBV复制和表达的过程中高效的gRNA靶点，同时含有S4靶点的CRISPR-Cas9系统(PX459)能对HBV稳转细胞模型中HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA进行破坏。
本发明利用所述的CRISPR-Cas9系统能对HBV稳转细胞中整合的HBVDNA和HBVcccDNA进行剪切，并使得细胞上清中的病毒载量下降了99.95±0.01％(n＝3)，细胞中cccDNA的含量下降了95.37±0.64％(n＝3)。此外，本发明还通过在线预测工具，对该系统可能存在的3个位点进行了SURVEYOR分析，发现该系统并未对可能的脱靶位点造成明显影响。并在水动力法转染HBV小鼠体内，利用该系统将血清中的乙肝表面抗原从注射后7天平均23504±3065IU/ml降至18.93±9.50IU/ml，降低99.91±0.05％，而目前已报道的抑制HBV的CRISPR-Cas9系统最多仅能将小鼠血清中的HBsAg降低93％(文献：ZhenS,HuaL,LiuYH,GaoLC,FuJ,WanDY,etal.Harnessingtheclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)/CRISPR-associatedCas9systemtodisruptthehepatitisBvirus.Genetherapy.2015.Epub2015/02/06.)；HBVDNA在注射后第5天从49905±19417IU/ml降至202±200IU/ml(n＝5)，而目前已报道的抑制HBV的CRISPR-Cas9系统最多仅能将小鼠血清中的HBVDNA降至105IU/ml(文献：RamananV,ShlomaiA,CoxDB,SchwartzRE,MichailidisE,BhattaA,etal.CRISPR/Cas9cleavageofviralDNAefficientlysuppresseshepatitisBvirus.Scientificreports.2015；5:10833.Epub2015/06/04；Liu,X.,Hao,R.,Chen,S.,Guo,D.&Chen,Y.InhibitionofHepatitisBVirusbyCRISPR/Cas9SystemviaTargetingtheConservedRegionsofViralGenome.TheJournalofgeneralvirology(2015).)。一方面，本发明筛选出的高效靶点弥补了现有技术抑制HBV复制与表达效果不显著、未分析脱靶效应及细胞毒性等作用机制方面的不足；另一方面，此靶点还能够使剪切整合在人基因组中的HBVDNA，使得从根本上破坏和抑制HBV成为了可能。
附图说明
图1.gRNA序列与HBV四种不同血清型序列的比对图；
图2.候选靶序列在HBV基因组的位置分布示意图；
图3.Cas9/gRNA外源活性SSA活性检测图谱；
图4.T7E1酶切检测HepG2.A64细胞HBVDNA突变效应结果图；
图5.gRNA-S4转染细胞后上清中HBV表面抗原定量检测结果图；
图6.gRNA-S4转染细胞后上清中HBVDNA定量检测结果图；
图7.gRNA-S4转染细胞后细胞内HBV复制中间体含量检测结果图；
图8.gRNA-S4转染细胞后细胞增殖活性检测结果图；
图9.6株细胞在S4位点发生的突变示意图；
图10.S4位点突变后细胞上清中HBV表面抗原定量检测结果图；
图11.S4位点突变后细胞上清中HBVDNA定量检测结果图；
图12.S4位点突变后细胞内HBV复制中间体含量检测结果图；
图13.A1AT检测细胞染色体DNA污染的基因扩增图谱；
图14.S4位点突变后HBVcccDNA检测结果图；
图15.细胞内乙肝表面抗原免疫荧光检测结果图；
图16.S4位点突变后细胞内不同状态HBVDNA突变分析图；
图17.gRNA在靶位点造成indel的深度测序分析图；
图18.gRNA-S4抑制HBV水动力小鼠模型中HBV复制及表达的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明的技术路线如下：
一、靶向4种不同血清亚型的HBV保守性序列的gRNA序列的设计、合成以及相应CRISPR-Cas9系统的构建和筛选
以adr血清型的HBV序列(GenebankID：AB299858)为参考序列，通过CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)寻找得分较高的靶序列，靶序列的形式为5’-N(20)NGG-3’或者5’-CCNN(20)-3’(N为gRNA的碱基序列，即可为A、T、C、G中任何一种，20为gRNA碱基数，C为胞嘧啶。随后将HBV主要的4种不同的血清亚型的基因序列进行比对，包括：adr(GenBankaccessionnumber.HQ638218)、ayw(U95551)、ayr(NC003977)、adw(EF103278)和adr(AB299858)，从选出的靶序列中挑选位于HBV保守区的8条靶序列(参见图1和图2)。
根据选择的gRNA，在其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列通过磷酸化、变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段。
正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
反向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’
退火后将形成的双链DNA连接至PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro(AddgeneID：48139)表达载体上，以下简称PX459。得到带有针对HBVDNA靶点的CRISPR-Cas9系统。
将上述步骤得到的连接产物转化stbl3感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇菌过夜，质粒小体试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到PX459-U6-HBVgRNA重组质粒。
使用北京唯上立德的SSA活性报道质粒构建试剂盒在293T细胞中对构建好的8套gRNA/Cas9系统的外源剪切活性进行检测，检测结果见图3，并筛选出SSA活性大于3的系统进行后续的验证。
以HBV稳转细胞HepG2.A64为模型，HepG2.A64细胞(C基因型/adr亚型ETV耐药HBV稳定复制细胞系)由解放军302医院病毒性肝炎研究室构建(中国专利号ZL201010586554.6，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号C201163，Hepatology,2011,54(4Suppl):1082A.)。将筛选出的gRNA/Cas9转染至HepG2.A64中，于转染后第3天的细胞提取细胞总DNA，扩增相应的靶位点，利用错配酶T7E1对其相应靶点的突变情况进行检测，检测发现仅gRNA-S4对相应靶点造成了突变，而其他4套系统均未对相应靶点造成突变。检测结果见图4。图4为其中外源活性较高的4条gRNA在HBV稳转细胞系HepG2.A64中内源活性(T7E1)检测结果，其中A图显示除gRNA-S4外，其余4条gRNA内源剪切活性较低；B图显示gRNA-S4有效地对HBV基因组上S4靶点进行了剪切(图中箭头所指)，并且gRNA-S4系统对其最可能的三个脱靶位点并无明显的剪切作用。
二、分别在HBV稳转细胞HepG2.A64中检测gRNA-S4转染后HBV表面抗原、HBVDNA和HBV复制中间体的变化，并用gRNA-空白转染的HepG2.A64细胞作为对照。
将gRNA-S4转染HepG2.A64后，连续培养9天并使用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法检测9天内细胞上清中乙肝表面抗原含量的变化。同时为了进一步检测gRNA-S4系统对HBV复制的影响，我们还利用qPCR的方法检测了连续9天细胞上清中HBVDNA的含量和第9天细胞中HBV复制中间体的含量，可以看出gRNA-S4对HBV表面抗原、HBVDNA和HBV复制中间体均有明显的抑制作用。
三、检测筛选出的gRNA-S4对HepG2.A64细胞增殖活性的影响以及是否存在的脱靶效应。
为了进一步证实这种抑制作用并非由于gRNA-S4抑制细胞增殖或存在脱靶效应而导致，又进行了细胞增殖活性及gRNA-S4脱靶效应的检测，即，将gRNA-S4转染HepG2.A64后，连续培养3天并使用CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒检测细胞的增殖活性，结果显示gRNA-S4并未对细胞增殖活性产生影响。利用脱靶位点在线预测工具(http://crispr.mit.edu/)预测gRNA-S4系统最可能存在的20个脱靶位点，选取评分高的脱靶位点进行扩增后T7E1酶切验证，结果显示gRNA-S4并未对三个最可能的脱靶位点造成可检测到的突变。
为了确认gRNA-S4能够对HBV稳转细胞模型中HBVDNA进行破坏，利用高通量深度测序的方法对S4位点进行了深度测序，结果进一步证实了gRNA-S4系统对HBV稳转细胞模型中HBVDNA的破坏作用，并详细分析了其产生突变的频率及类型以及证实了绝大多数的突变均可导致HBVS基因ORF的移码突变(参见图17A、B、C、D)。
四、证实S4位点的突变能够全面抑制HBV的复制与表达
为了进一步证实S4位点突变能够抑制HBV复制及表达，利用gRNA-S4造成了S4位点的突变，并从转染了gRNA-S4系统的HepG2.A64细胞中筛选出了S4位点突变的细胞株T11，并以S4位点未突变的细胞株N1作为对照。对两组细胞进行连续9天的培养，并使用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法检测9天内细胞上清中乙肝表面抗原含量的变化，利用qPCR的方法检测连续9天细胞上清中HBVDNA的含量和第9天细胞中HBV复制中间体、HBVcccDNA的含量，可以看出gRNA-S4对HBV表面抗原、HBVDNA、HBV复制中间体和HBVcccDNA的含量已低至阴性临界值(参见图10，图11，图12)。此外，为了进一步检测S4位点突变对HBV表达的抑制，发明人还利用免疫荧光检测了细胞内HBsAg的表达情况，结果显示S4位点发生突变的细胞株中HBV的复制与表达几乎停滞(图15A，B)。
为了探究gRNA-S4对HBV稳转细胞内不同状态HBVDNA的破坏作用，分别提取了转染gRNA-S4细胞中HBV总DNA、HBV复制中间体DNA、HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA，并分别对其中的S4位点进行测序，发现转染gRNA-S4系统的细胞中HBV总DNA、HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA均在S4位点处发生了缺失插入突变，而核心颗粒中的HBVDNA序列未见明显改变，测序结果图16A。
五、gRNA-S4抑制HBV高压水动力小鼠模型中HBV复制与表达
选取4-6周龄的C57BL/6小鼠，其中一组同时注射含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBV1.2和CRISPR质粒gRNA-S4各10ug，对照组同时注射含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBV1.2和CRISPR对照质粒gRNA-空白各10ug(图18A)。分别于注射后的第1天，第3天，第5天和第7天对10只小鼠进行眼眶静脉丛取血，随后用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法和qPCR方法定量检测两组小鼠血清中HBV表面抗原和HBVDNA含量的变化。结果显示，相比对照组，gRNA-S4在注射3天后将小鼠血清中的HBsAg含量降低约1000倍，而小鼠血清中的HBVDNA从注射后第3天起就降至并维持在阴性临界值以下(参见图18B、C)。
实施例1
靶向4种不同血清亚型的HBV保守性序列的gRNA序列的设计、合成以及相应CRISPR-Cas9系统的构建和筛选
1、特异性的gRNA的选择和设计
以adr血清型的HBV序列(GenebankID：AB299858)为参考序列，通过CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)寻找得分较高的靶序列，靶序列的形式为5’-N(20)NGG-3’或者5’-CCNN(20)-3’。随后我们将HBV主要的4种不同的血清亚型的基因序列进行比对，包括：adr(GenBankaccessionnumber.HQ638218)、ayw(U95551)、ayr(NC003977)、adw(EF103278)和adr(AB299858)，从选出的靶序列中挑选位于HBV保守区的8条靶序列(图1，图2)。
表1.候选gRNA序列
2、靶序列的合成及CRISPR-Cas9系统的构建
根据选择的gRNA，在其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列通过磷酸化、变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段。
正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
反向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’
磷酸化退火体系为：
反应条件：37℃30分钟；
95℃5分钟；
缓慢降至室温
将退火后的产物稀释200倍。
退火后将形成的双链DNA连接至PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro(AddgeneID：48139)表达载体上，以下简称PX459。得到带有针对HBVDNA靶点的CRISPR-Cas9系统。
连接体系：
消化未连接的线性DNA
消化体系：
反应条件：37℃30分钟
70℃30分钟
将上述步骤得到的连接产物转化stbl3感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇菌过夜，质粒小体试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到PX459-U6-HBVgRNA重组质粒。
3、细胞培养和转染
a、细胞的传代培养
1)肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75％的酒精擦拭双手。同时，用酒精棉球擦拭超净台。
2)将培养液放置室温，备用。
3)打开超净台内的紫外灯，照射30分钟；同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌。
4)倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
5)关闭超净台的紫外灯，打开风机。
6)点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。
7)在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。
8)将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶；不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。
9)加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。
10)加入含有10％血清的培养基，用吹打管轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。
b、细胞转染(LipofectamineLTX(ThermoFisher))
1)待细胞贴壁生长到约铺满90％的直径10cm细胞培养皿时进行转染。
2)转染体系(每孔)：
Medium500μl+LTXReagent22.5μl
3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加puro筛选以提高转染效率。
4、luciferaseSSA重组修复检测Cas9/gRNA活性
使用北京唯上立德的SSA活性报道质粒构建试剂盒进行检测(Catalog.No.VK002)，LuciferaseSSA重组修复检测Cas9/gRNA活性的原理：一个终止子在luciferase的编码区中央，truncatedluciferase没有活性。为检测Cas9/gRNA剪切活性，将一个Cas9/gRNA的靶点位置序列插在终止子后,构建SSA活性报道质粒。在Cas9/gRNA的作用下，靶点位置被剪切产生DSB(双链断裂，double-strandbreak)，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase。通过与参照的比值变化反应Cas9/gRNA剪切DNA的活性水平。
构建报告质粒的步骤：
设计引物：
例如某gRNA的靶点位置：aGGACTTGTGCTGCTAAGTTAc(斜体：PAM序列)，则合成序列为：
Target-Sense:5’-GATCAGGACTTGTGCTGCTAAGTTAC
Target-Anti:5’-TCGAGCCTTAACTTAGCAGCACAAGTCCT
b、报告质粒的构建
步骤一：将合成的引物各稀释成100μM
体系：
步骤二：
体系：
反应条件：16℃反应2小时后，插至冰上
c、转化
(1)取上述步骤二的反应产物加入到50μl感受态细胞(如DH5a)中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。
(2)42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加500μl无抗SOC或LB溶液，于170转37℃孵育1小时。
(3)取100μl均匀地涂于卡那霉素抗性平板上，37℃培养过夜。
d、阳性克隆的鉴定--菌落PCR方法鉴定阳性克隆
挑选克隆至10μl灭菌水中，涡旋混合。取1μl为模板进行PCR，反应条件为94℃10分钟，94℃30秒，55℃退火30秒，72℃延伸(根据片段的大小确定延伸时间)，30个循环，72℃10分钟。菌落PCR使用引物及测序引物使用Sq-FP(VK002-7)和Sq-RP(VK002-8)引物。若载体自连，自连带大小约为160bp。
e、SSA活性的检测
将构建好的CRISPR-Cas9质粒与上述构建好的reporter质粒pSSA-luc-target和Renillaluciferase质粒按CRISPR-Cas9质粒200ng：pSSA-luc-target质粒30ng：Renillaluciferase质粒5ng的比例共转染到48孔板的人类293T细胞中，24小时后检查luciferase酶活性。每个实验重复3组，其中control组用阴性参照质粒补齐。通过luciferase提高的倍数反应出Cas9/gRNA的活性。同时转染阳性Cas9/gRNA和相应的报导质粒作为阳性参照。图3结果显示不同gRNA所具有的剪切效率各不相同，其中gRNA-S4的外源剪切效率最高。
5、提取HBVDNA以及测序和酶切检测CRISPR-Cas9引起的突变效率
a、提取HepG2.A64细胞系基因组(Biomed)
1)收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
2)13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。
3)加200μl1×PBS重悬洗涤细胞，13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,将细胞沉淀重悬于180μl1XPBS中。
4)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀(可选步骤：为清除RNA，加入5μlRNaseA(10mg/ml)，振荡混匀，可选择室温放置5分钟)，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。
5)冷却后加100μl异丙醇(或200μl无水乙醇)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
7)加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。
8)加入500μl漂洗液WB(先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
9)加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
10)将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
12)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
b、测序和T7E1酶切检测突变情况
表2.PCR扩增所需引物：
1)PCR扩增(Takara)：
2)PCR产物退火，使用PCR仪进行退火处理，设置程序如下：
3)T7E1酶切反应：
上述反应体系分别加入0.5μlT7E1酶(NEB)，37℃反应30分钟后，立刻加2μlDNA6×LoadingBuffer，混匀后65℃反应10分钟，利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。并利用退火后未酶切的产物作为阳性对照(参见图4A，4B)。A图显示除gRNA-S4外，其余4条gRNA内源剪切活性较低；B图显示gRNA-S4有效地对HBV基因组上S4靶点进行了剪切(图中箭头所指)，并且gRNA-S4系统对其最可能的三个脱靶位点并无明显的剪切作用。
实施例2：gRNA-S4靶点抑制HBV复制效果的评价
1、检测gRNA-S4转染HBV稳转细胞后HBV表面抗原、HBVDNA和HBV复制中间体
a、细胞转染带有S4靶点的CRISPR-Cas9系统及不带靶点的CRISPR-Cas9系统(对照)
1)待细胞贴壁生长到约铺满90％的直径10cm细胞培养皿时进行转染。
2)转染体系(每孔)：
Medium500μl+LTXReagent22.5μl
3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加puro筛选以提高转染效率
5)将筛选后的两组细胞按每孔2×104个细胞分至3个24孔板，每组30个孔，每组每天收取3个孔的细胞及上清，连续收9天，期间不换液。
b、检测细胞上清中HBV表面抗原
使用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法检测连续9天细胞上清中的乙肝表面抗原(图5)。结果显示，在转染后连续9天中，细胞上清中乙肝表面抗原均有明显下降。
c、检测细胞上清中HBVDNA(鑫诺美迪HBVDNA荧光定量检测试剂盒)
取出试剂盒中组分，室温放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离心；
根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I～IV的数量按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
HBVPCR反应液30μl
HBV酶混合物1.5μl
取3μl核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性质控品、HBV定量标准品I～IV各3μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀3-5次，静置5分钟；
反应条件
连续9天细胞上清中HBVDNA的检测结果见图6。转染后连续9天，细胞上清中HBVDNA均有明显下降。
d、检测细胞内HBV复制中间体
提取培养第9天细胞中核心颗粒：
1.细胞传代至6孔板72h后，每孔加1ml1×PBS轻洗，吸弃PBS后加入500μl含0.5％NP-40的PBS，冰上静置30分钟以裂解细胞；
2.细胞裂解液转移到新的EP管中，10000rpm离心5分钟，将细胞碎片沉淀；
3.转移450μl上清至新的EP管中，加入5μl1MMgC12，使终浓度达到10mmol/L，然后加入1μlDNaseI(10U)和0.5μlRNaseA(20U)，37℃水浴至少1h，去除游离的HBVDNA和RNA模板；
4.配制蛋白酶K混合溶液，总体积按600μl计算：60μl0.5MEDTA(终浓度50mmol/L)+60μl1MTris(PH8.0)(终浓度50mmol/L)+30μl10％SDS(终浓度0.5％)+15μl20mg/mLProteinaseK(终浓度50mmol/L)+10μl5MNaCl(终浓度为100mmol/L)，分至各样品管；
5.涡旋混匀，短暂离心后42℃消化过夜，
6.加等体积的酚氯仿溶液抽提，上下颠倒数次，10000rpm离心15分钟；
7.转移上层均匀相到新EP管中，加1/10体积的3MNaAc，等体积的异丙醇，混合后4℃下12000rpm离心45分钟；
8.500μl75％的乙醇洗一次，4℃下12000rpm离心15分钟；
9.自然干燥，加入30μlTE溶解核酸，-80℃冻存备用。
实时荧光PCR检测方法同细胞上清中HBVDNA定量检测(鑫诺美迪HBVDNA荧光定量检测试剂盒)，检测结果见图7，结果显示，转染后第9天，细胞中HBV复制中间体显著下降。
2、检测gRNA-S4转染HBV稳转细胞后的细胞增殖活性
1.收集细胞，加细胞悬液100μl(约5,000-10,000个细胞)到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。设置空白孔(有培养基，无细胞)和对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3-5复孔。
2.置37℃，5％CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10μl待检测药物溶液，37℃孵育。
4.每孔加入10μlCCK-8溶液，37℃孵育1-4小时。
5.测定450nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。
6.结果分析：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％
转染后连续3天的检测结果见图8，结果显示，gRNA-S4位点并未对细胞的增殖活性造成影响。
3、检测gRNA-S4系统稳转细胞后的脱靶效应
利用脱靶位点在线预测工具(http://crispr.mit.edu/)预测gRNA-S4系统最可能存在的20个脱靶位点，
表3.gRNA-S4系统可能存在的脱靶位点
序号 序列 得分 错配 UCSC基因 位点
1 GCCCTCTCTGGATGTGTCTGAGG 1.6 3MMs[3:4:7] chr11:+75047287
2 GCTGTTGCTAGATGTGTCTGAAG 1.4 3MMs[4:6:10] chr8:+47864962
3 TGTTTCGTTGGATGTGTCTGAGG 1.4 4MMs[1:2:4:8] chr17:-74488431
4 AATTTCGTTGGATGTGTCTGTGG 1.4 4MMs[1:2:4:8] chr10:-36941610
5 CCTAGCGCTGGATGTGACTGTGG 1.3 3MMs[1:5:17] chr22:+49133545
6 CCTGTCGCTGGAGGTGTCTGTGG 1.2 3MMs[1:4:13] NR_024527 chr11:-118015895
7 TCTAGCATTGGATGTGTCTGTGG 0.9 4MMs[1:5:7:8] chr7:-20747255
8 ACTTTCCCTTGATGTGTCTGAAG 0.9 4MMs[1:4:7:10] chr5:-125646588
9 CTAATGGCTGGATGTGTCTGGGG 0.8 4MMs[1:2:3:6] chr5:+178213889
10 TCCGTGGCTGGATGTGTCTGAGG 0.8 4MMs[1:3:4:6] chr18:-10706739
11 GCAGGTGCTGGATGTGTCTGGGG 0.8 4MMs[3:4:5:6] NM_020676 chr3:+58279310
12 GCATTTGCTTGATGTGTCTGGGG 0.8 4MMs[3:4:6:10] chr1:+194264939
13 GGTGTCGCTCGCTGTGTCTGTAG 0.7 4MMs[2:4:10:12] chr2:+69959464
14 GCGGACGCTGGATGTGGCTGCAG 0.6 4MMs[3:4:5:17] chr2:+129349323
15 CCTCTCCCCGGATGTGTCTGGGG 0.6 4MMs[1:4:7:9] chr8:+99952106
16 CCTAAAACTGGATGTGTCTGTGG 0.6 4MMs[1:5:6:7] chr7:-57842027
17 GAAATAACTGGATGTGTCTGCAG 0.5 4MMs[2:3:6:7] chr3:+2365959
18 GATAACCCTGCATGTGTCTGAGG 0.5 4MMs[2:5:7:11] chr8:-115773972
19 GCTGCACCTGGATGTGTCTGGGG 0.5 4MMs[4:5:6:7] chr10:+50257134
20 CCTGTTGCAGGATGTGTCTGCAG 0.5 4MMs[1:4:6:9] chr14:+99788041
选取评分高的脱靶位点进行扩增后T7E1酶切验证
表4.PCR扩增引物如下：
1)PCR扩增(Takera)：
2)PCR产物退火，使用PCR仪进行退火处理，设置程序如下：
3)T7E1酶切反应：
上述反应体系分别加入0.5μlT7E1酶(NEB)，37℃反应30分钟后，立刻加2μlDNA6×LoadingBuffer，混匀后65℃反应10分钟，利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。并利用退火后未酶切的产物作为阳性对照，结果显示gRNA-S4并未对三个最可能的脱靶位点造成可检测到的突变(参见图4B)。
4、深度测序检测gRNA-S4系统转染细胞后S4位点的突变情况
1)PCR扩增S4位点(Takara)：
引物见实施例1中S4-F、S4-R
2)文库构建(按照Nextera方法，取100ngPCR产物构建文库)
3)IlluminaMiSeq测序(北京奥维森基因)
4)测序结果与参考序列进行比对(Burrows–WheelerAligner软件)，同时统计出gRNA在靶位点造成indel的频率(图17A)，类型(图17B、C)以及可能造成移码突变的概率(图17D)。结果显示gRNA-S4在相应位点造成了缺失和插入突变，而这些缺失插入的碱基绝大多数将引起该ORF的移码突变。
实施例3：S4位点缺失后HBV稳转细胞中HBV复制检测
1、S4位点突变单克隆细胞株的筛选
1.1细胞转染带有S4靶点的CRISPR-Cas9系统及不带靶点的CRISPR-Cas9系统(对照)
1)待细胞贴壁生长到约铺满90％的直径10cm细胞培养皿时进行转染。
2)转染体系(每孔)：
Medium500μl+LTXReagent22.5μl
3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加puro筛选以提高转染效率
5)将筛选后的两组细胞按每孔1个细胞分至10个96孔板，每组5个孔板，传代培养至48孔板，提取每个孔中的细胞总DNA。
6)用实施例一中的引物S4-F，S4-R进行扩增
7)对PCR产物进行纯化后测序(华大基因)，筛选出S4位点突变的6株细胞，结果见图9。
2、检测S4位点突变后细胞上清中HBV表面抗原、HBVDNA，细胞内HBV复制中间体、HBV表面抗原、和cccDNA
将筛选出的两组细胞(对照株N1和突变株T11)按每孔2×104个细胞分至3个24孔板，每组30个孔，每组每天收取3个孔的细胞及上清，连续收9天，期间不换液。
a、检测细胞上清中HBV表面抗原
使用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法检测连续9天细胞上清中的乙肝表面抗原(见图10)。结果显示，在S4位点突变的细胞株上清中连续9天乙肝表面抗原的含量已低至阴性临界值以下(0.05IU/ml)。
b、检测细胞上清中HBVDNA(鑫诺美迪HBVDNA荧光定量检测试剂盒)
取出试剂盒中组分，室温放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离心；
根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I～IV的数量按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
HBVPCR反应液30
HBV酶混合物1.5
取3μl核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性质控品、HBV定量标准品I～IV各3μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀3-5次，静置5分钟；
反应条件
连续9天细胞上清中HBVDNA的检测结果见图11。结果显示，S4位点突变的细胞株上清中连续9天HBVDNA的含量已低至阴性临界值(1000IU/ml)。
c、检测细胞内HBV复制中间体
提取培养第9天细胞中核心颗粒：
1.细胞传代至6孔板72h后，每孔加1ml1×PBS轻洗，吸弃PBS后加入500μl含0.5％NP-40的PBS，冰上静置30分钟以裂解细胞；
2.细胞裂解液转移到新的EP管中，10000rpm离心5分钟，将细胞碎片沉淀；
3.转移450μl上清至新的EP管中，加入5μl1MMgC12，使终浓度达到10mmol/L，然后加入1μlDNaseI(10U)和0.5μlRNaseA(20U)，37℃水浴至少1h，去除游离的HBVDNA和RNA模板；
4.配制蛋白酶K混合溶液，总体积按600μl计算：60μl0.5MEDTA(终浓度50mmol/L)+60μl1MTris(PH8.0)(终浓度50mmol/L)+30μl10％SDS(终浓度0.5％)+15μl20mg/mLProteinaseK(终浓度50mmol/L)+10μl5MNaCl(终浓度为100mmol/L)，分至各样品管；
5.涡旋混匀，短暂离心后42℃消化过夜，
6.加等体积的酚氯仿溶液抽提，上下颠倒数次，10000rpm离心15分钟；
7.转移上层均匀相到新EP管中，加1/10体积的3MNaAc，等体积的异丙醇，混合后4℃下12000rpm离心45分钟；
8.500μl75％的乙醇洗一次，4℃下12000rpm离心15分钟；
9.自然干燥，加入30μlTE溶解核酸，-80℃冻存备用。
实时荧光PCR检测方法同细胞上清中HBVDNA定量检测(鑫诺美迪HBVDNA荧光定量检测试剂盒)，检测结果见图12，结果显示，S4位点突变的细胞株中连续9天培养后HBV复制中间体的含量相比对照组降低了99.87±0.25％。
d、检测HBVcccDNA
细胞总DNA的提取(BiomedDN0712)
1)收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
2)13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。
3)加200μl1×PBS重悬洗涤细胞，13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,将细胞沉淀重悬于180μl1XPBS中。
4)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀(可选步骤：为清除RNA，加入5μlRNaseA(10mg/ml)，振荡混匀，可选择室温放置5分钟)，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。
5)冷却后加100μl异丙醇(或200μl无水乙醇)，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
7)加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。
8)加入500μl漂洗液WB(先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
9)加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
10)将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
12)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃PSAD酶消化。
反应体系：
反应条件：消化30℃30分钟，酶灭活70℃30分钟；
滚环扩增反应
反应中所用的引物R1～R8见下表，均为HBV基因保守区序列，
表5.RCA引物
引物名称 核苷酸序列(5’-3’) 位置(nt)
RCA1 AATCCTCACAATACC 99–113
RCA2 ACCTATTCTCCTCCC 1758–1744
RCA3 CCTATGGGAGTGGGC 510–524
RCA4 CCTTTGTCCAAGGGC 2689–2675
RCA5 ATGCAACTTTTTCAC 1686–1700
RCA6 CTAGCAGAGCTTGGT 29–15
RCA7 TAGAAGAAGAACTCC 2240–2254
RCA8 GGCCCACATATTGT 2599–2585
在反应前配制成引物混合溶液，反应步骤如下：
反应体系
反应混合物经如下过程逐步降温
置于冰上，再在如下体系中反应：
将混合反应液置于30℃水浴中，过夜反应16小时，取出产物，置于65℃水浴10分钟，以灭活Phi29DNA聚合酶。
A1AT检测细胞染色体DNA污染
分别用A1AT基因特异性引物和HBS特异性引物对PSAD消化产物进行扩增检测
引物名称序列(5’-3’)
A1AT-FTTCCCTGGTCTGAATGTGTG
A1AT-RACTGTCCCAGGTCAGTGGTG
HBSFTCACAATACCGCAGAGTC
HBSRACATCCAGCGATAACCAG
扩增结果见图13，结果显示，提取的cccDNA用HBV特异性引物扩增出相应条带，而用染色体特异引物则未见扩增条带。提示提出的cccDNA中不含有染色体DNA的污染。
跨缺口荧光定量PCR。内参基因β-actin同时扩增，原始DNA模板量1μl，不足体积由双蒸水补足。扩增引物及探针序列(表6)。
表6.cccDNA及内参检测的探针和引物
引物名称 核苷酸序列(5’-3’) 位置(nt)
cccup GGGGCGCACCTCTCTTTA 1523-1540
cccdown AGGCACAGCTTGGAGGC 1886-1870
cccProbe FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA 1825-1845
β-up ACGGCCAGGTCATCACCAT 661-678
β-down AGGCAGCTCGTAGCTCTT 802-785
βprobe FAM-CGGGAAATCGTGCGTGAC-TAMRA 689-706
反应体系：
反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，58℃45秒×40。
HBVcccDNA定量检测结果见图14，结果显示，S4位点突变的细胞株中连续9天培养后HBVcccDNA的含量相比对照组降低了95.37±0.64％。
e、免疫荧光(IF)检测细胞内乙肝表面抗原
1)细胞准备(S4位点突变株T11和对照株N1)。在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；
2)固定，根据需要选择适当的固定剂固定细胞。PBS洗涤3×5分钟。
3)通透，使用0.5％TritonX100通透20分钟。通透后用PBS洗涤3×5分钟。
4)封闭，使用封闭液(碧云天)对细胞进行封闭30分钟。
5)一抗结合，小鼠源抗HBsAg抗体(Abcam)1:200稀释,室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5分钟。
6)二抗结合，FITC羊抗鼠二抗(康为世纪)室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5分钟后，再用蒸馏水漂洗一次。
7)封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
检测结果见图15A和B，其中A图显示，相比对照组S4位点产生突变的单克隆细胞株中细胞内HBsAg含量明显下降，B图通过量化后显示S4位点突变的细胞株中连续9天培养后细胞内HBsAg的含量相比对照组降低了82.86±4.01％。
2、检测S4位点突变后细胞内不同状态HBVDNA的突变情况(图16A)
a、PCR扩增整合状态的HBVDNA
1)引物的设计：
根据构建HepG.A64细胞系的pTriexHBV1.1质粒中HBV的侧翼序列设计特异性引物(图16B，C，B图为整合状态HBVDNA的示意图；C图为构建HBV稳转细胞系HepG2.A64时使用的HBV质粒示意图)：
正向：A64F5’CGCTCCGAAAGTTTCCTT3’
反向：A64R5’CGCTCTAACATACCACCCTAAA3’
2)PCR扩增(Takera)：
扩增结果见图16D，利用特异性引物成功扩增出1.1倍整合状态HBVDNA及两端侧翼序列，约为4000bp。
为确认引物A64F和A64R扩增产物为染色体基因组中整合状态的HBVDNA，而非游离状态下的HBVDNA，使用PSAD消化后的细胞DNA为模版，用引物A64F、A64R和HBV特异性引物HBSF、HBSR进行扩增，结果证实了引物A64F、A64R扩增整合状态HBVDNA的特异性，结果见图16F。结果显示，A64F和A64R扩增产物为染色体基因组中整合状态的HBVDNA，而非环状的HBVDNA。
在分别扩增得到HBV总DNA、HBV复制中间体DNA、HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA之后，利用引物S4-F、S4-R(引物序列见表2)进行测序，发现S4位点突变的HBV稳转细胞中HBV总DNA、HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA均在S4位点处发生了缺失插入突变，而核心颗粒中的HBVDNA序列未见明显改变，测序结果见图16A。结果显示，S4位点突变的HBV稳转细胞中HBV总DNA、HBVcccDNA和整合状态的HBVDNA均在S4位点处发生了缺失插入突变，而核心颗粒中的HBVDNA序列未见明显改变。
实施例4：gRNA-S4抑制HBV高压水动力小鼠模型中HBV复制与表达
a、选取4-6周龄的C57BL/6小鼠10只，分成两组，每组各5只，其中实验组同时注射含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBV1.2和CRISPR质粒gRNA-S4各10ug，对照组同时注射含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBV1.2和CRISPR对照质粒gRNA-空白各10ug(图18A)。具体方法如下：
(1)将小鼠放在金属笼或鼠夹中，通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴，用左手抓住小鼠尾巴中部。
(2)采用左右两侧的静脉进行注射，拔去沿尾部静脉走向的毛，置尾巴于45～50℃温水中浸泡几分钟或用75％酒精棉球反复擦拭尾部，以达到消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的。
(3)以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉更为充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指夹住尾巴的末梢,右手持4号针头注射器，使针头与静脉平行(小于30°角)，从尾巴的下1/4处进针，开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，可正式注入药物。拔出针头后，用拇指按住注射部位轻压1～2分钟，防止出血。
(4)分别于注射后的第1天，第3天，第5天和第7天对10只小鼠进行眼眶静脉丛取血，随后定量检测两组小鼠血清中HBV表面抗原和HBVDNA含量的变化。
b、检测小鼠血清中HBV表面抗原的含量
使用罗氏诊断HBsAgII定量检测方法检测注射后的第1天，第3天，第5天和第7天小鼠血清中的乙肝表面抗原(图18B)。结果显示，相比注射gRNA-空白的小鼠，注射gRNA-S4的小鼠血清中的乙肝表面抗原从平均23504±3065IU/ml降至18.93±9.50IU/ml，降低99.91±0.05％。
c、检测小鼠血清中HBVDNA(鑫诺美迪HBVDNA荧光定量检测试剂盒)
取出试剂盒中组分，室温放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离心；
根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I～IV的数量按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
HBVPCR反应液30
HBV酶混合物1.5
取3μl核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性质控品、HBV定量标准品I～IV各3μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀3-5次，静置5分钟；
反应条件：
注射后的第1天，第3天，第5天和第7天小鼠血清中HBVDNA的检测结果见图18C，结果显示，相比注射gRNA-空白的小鼠，注射5天后gRNA-S4的小鼠血清中的HBVDNA从49905±19417IU/ml降至202±200IU/ml(n＝5)。

Claims (8)

1.一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组S基因保守区域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述靶序列存在一个原间区毗邻序列CGG。
2.根据权利要求1所述的gRNA序列，其特征在于，所述gRNA序列如SEQIDNO:2所示。
3.一种含有权利要求1或2所述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述gRNA序列与能表达Cas9蛋白的表达载体相连接。
4.根据权利要求3所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述载体为质粒PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro。
5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述连接为，先在所述gRNA的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC，之后再与所述质粒连接。
6.根据权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用。
7.一种含有权利要求5所述系统的组合物，其特征在于，所述组合物还含有制药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备为注射剂。
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