CN103911376A - CRISPR-Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法以及用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA。本发明提供了CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法以及用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA。利用本发明制备的特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA能够精确靶向乙型肝炎病毒cccDNA并且实现基因敲除。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒（Hepatitis B VIRUS, HBV）属于嗜肝DNA病毒科，是引发病毒性乙型肝炎的病原体。全球约1/3的人曾感染过HBV，慢性HBV感染者约有3-4亿人，其中25%-40%人死于HBV感染相关疾病，HBV是全球第九大致死性疾病。 我国属于HBV感染的高流行区，一般人群的乙肝病毒感染标志，乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性率接近10%。对现有病毒性乙型肝炎患者及HBsAg携带者的防治工作，在今后几十年里仍会是一项艰巨的任务。
乙型肝炎病毒又是一种逆转录病毒，其基因组是由两条螺旋的DNA链围成的一个环状结构，大小约为3.2KB，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个开放阅读框（open reading frame, ORF），编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L，M，S）。两条螺旋的DNA链，其中一条较长负链已经形成完整的环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。一旦感染肝细胞，病毒DNA就会入核，在核里，这条半环状的DNA链要以负链为模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延伸，最终形成完整的环状。乙肝病毒基因组也就形成了一个完整的环状双链DNA，即共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）。cccDNA可以看做是病毒复制的原始模板，既能转录产生3.5KB的前基因组mRNA，又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的四种病毒蛋白。病毒基因以其中的一条cccDNA为模板转录形成前基因组mRNA之后，前基因组DNA逆转录形成负链DNA，复制出正链，最后再装配到一起形成新的双链乙型肝炎病毒DNA，其中一部分双链DNA会在核里重新形成cccDNA。每个细胞核中大约15-20个拷贝的cccDNA可能会在易错的病毒复制多聚酶的作用下发生病毒的变异，造成抗药性。
目前，治疗乙型肝炎的药物主要包括核苷酸类似物和干扰素等，其中以核苷酸类似物临床应用最广泛。核苷酸类似物可以阻断病毒RNA和新的病毒DNA的产生，但是对于已经存在的病毒cccDNA却没有作用。随着HBV耐药突变株的不断出现，使得现有的抗HBV药物难以达到理想的治疗效果。此外，HBV cccDNA还可能是病毒产生抗药性的关键原因，因此，即使是部分失活HBV cccDNA都具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向HBV cccDNA引起了人们的广泛关注。
2010年，Engineered zinc finger nucleases (ZFNs) 被成功的应用于HBV cccDNA的敲除，效率大约为26%。2013年，Engineered transcription activator-like effectors (TALEs) 也被用于突变HBV cccDNA，效率大约为35%，相应地，HBsAg降低了大约20%。很明显，现有的技术还很难满足需要，人们期待找到更高效的HBV cccDNA的敲除策略。
规律成簇间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR-associated, CRISPR-Cas9）是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂（Double-strand breaks, DSB），在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ），造成移码突变（frameshift mutation），导致基因敲除。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因、可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术（Pennisi, 2013）。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一（http://www.nature.com/news/365-days-nature-s-10-1.14367），在Science推荐的2013十大进展中位列第二位（http://news.sciencemag.org/breakthrough-of-the-year-2013）。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA （CRISPR RNA）和tracrRNA (trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA（single guide RNA）。
与ZFN、TALEN相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。为高效靶向敲除HBV cccDNA，实现乙型肝炎及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除HBV cccDNA，提供相应的技术方案，达到特异性敲除HBV cccDNA的目的。
发明内容
针对现有靶向HBV cccDNA存在的问题：（1）效率低，只能少量敲除HBV cccDNA；（2）只能稍微降低HBsAg表达，等。本发明设计了利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA的策略。设计和合成特异性靶向HBV cccDNA的sgRNA，将该sgRNA与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成pGL3-U6-HBV sg质粒，将pGL3-U6-HBV sg质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒及带有1.2个HBV基因组拷贝的质粒payw1.2一起成功转染HepG2细胞即可实现HBV cccDNA的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除HBV cccDNA的方法。有效解决了特异性敲除HBV cccDNA存在的问题：（1）效率高，HBV cccDNA敲除效率达到70%以上；（2）降低HBsAg表达达到96%；（3）可以多靶点同时敲除。
本申请的技术方案如下：
一、 靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸的设计和选择
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
1、在HBV cccDNA上选择5’-GGN(19)GG 的序列，如果没有 5’-GGN(19)GG 的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
2、sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的ORF。
3、在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。
4、如果在用两个sgRNA来实现靶向HBV cccDNA，选择相隔一定距离（10~30 bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNAs，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，如下：
三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
1、线性化pGL3-U6-sgRNA质粒。
2、将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-HBV sg质粒。
3、转化并涂Amp+平板（50 μg/ml）。
4、用ID NO. 11的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-HBV sg质粒。
四、转染HepG2细胞并检测HBV cccDNA的敲除
1、按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HBV sg质粒（可以为1种或者多种）与序列为SEQ ID NO.13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（结构如图6所示）以及序列为SEQ ID NO.21的payw1.2质粒混匀，共转染HepG2细胞。
2、用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认HBV已经被敲除。
更进一步的，同时利用一对相邻（在HBV cccDNA上的靶向起始位点相距5 bp-12 bp）的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg，在转染细胞获得HBV cccDNA敲除细胞过程中，如下操作：
1、按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将两个分别含1个靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg（这两个载体分别带有的靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸在HBV cccDNA上的互补起始位点相距5 bp-12 bp）与序列为SEQ ID NO.13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒以及序列为SEQ ID NO.21的payw1.2质粒混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认HBV cccDNA已经被敲除。
五、酶联免疫法检测乙型肝炎病毒表面抗原的变化
1、按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HBV sg质粒（可以为1种或者多种）与序列为SEQ ID NO.13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（结构如图6所示）以及序列为SEQ ID NO.21的payw1.2质粒混匀，共转染HepG2细胞。
2、 在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数（波长450 nm），并计算获得乙型肝炎病毒表面抗原。
更进一步的，同时利用一对相邻（在HBV cccDNA上的靶向起始位点相距5 bp-12 bp）的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg，在转染细胞获得HBV cccDNA敲除细胞过程中，如下操作：
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将两个分别含1个靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg（这两个载体分别带有的靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸在HBV cccDNA上的互补起始位点相距5 bp-12 bp）与序列为SEQ ID NO.13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒以及序列为SEQ ID NO.21的payw1.2质粒混匀，共转染细胞。
2、 在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数（波长450 nm），并计算获得乙型肝炎病毒表面抗原。
经过检测发现乙型肝炎病毒表面抗原几乎没有表达。
附图说明
图1 Cas9实现定点切割导致DNA双链断裂过程示意图
CRISPR/Cas9系统的定向识别和剪切从而导致基因敲除是通过sgRNA和Cas9实现的。sgRNA 决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9切割的活性。
图2 T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的乙型肝炎病毒cccDNA特异性切割
以提取的HepG2细胞核cccDNA为模板，使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的HBV test For和HBV test Rev为引物分别进行PCR扩增，PCR产物为666 bp，纯化PCR产物。将上述PCR产物取200 ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如果发生DNA链切割，DNA双链退火过程中出现错配，T7EN1将错配链切断，出现切割条带。
泳道1为DL2000 Marker，泳道2为转入没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，泳道3为加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2 (SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO.30和SEQ ID NO. 31)，泳道4为加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)，可见与对照组相比，加入了针对HBV cccDNA的 sgRNA的样品出现了切割条带切割效率大约70%。
图3 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性切割结果测序
以提取的HepG2细胞核cccDNA为模板，使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO.15的HBV test For和HBV test Rev为引物分别进行PCR扩增。纯化PCR产物，连入TA克隆并送测序。红色序列为PAM序列；(-) 表示剔出。
对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31，以及加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)。可见与对照组相比，处理组都发生了不同形式碱基剔除。
图4 sgRNA/Cas9介导的乙型肝炎病毒cccDNA特异性切割造成HBV表面抗原表达的变化
1、按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将两个分别含1个靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg（这两个载体分别带有的靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸在HBV cccDNA上的互补起始位点相距5 bp-12 bp）与序列为SEQ ID NO. 13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒以及序列为SEQ ID NO.21的payw1.2质粒混匀，共转染细胞。
2、 在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)，以及加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)。可见与对照组相比，处理组乙肝病毒表面抗原的表达都大大减少了。
图5载体pGL3-U6-sgRNA的结构。
图6载体pST1374-NLS-flag-cas9-ZF的结构。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
实施例 1 CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向cccDNA的sgRNA的设计和合成
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应的DNA序列。
1、靶向HBV cccDNA的sgRNA的设计和选择
（1）在HBV cccDNA上选择5’-GGN(19)GG 的序列，如果没有 5’-GGN(19)GG 的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
（2）sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的ORF。
（3）在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的 靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。
（4）在选择两个sgRNA来成对敲除基因时，在HBV cccDNA上选择相隔一定距离（10~30 bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
根据以上方法，我们随机选择了4个符合条件的包含PAM序列的sgRNA（序列为SEQ ID NO. 30，SEQ ID NO. 31，SEQ ID NO. 32，SEQ ID NO. 33）进行后续实验。
2、靶向HBV cccDNA的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建
根据选择的4个sgRNA（分别如序列表SEQ ID NO. 30，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO. 32，SEQ ID NO. 33所示），在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成（合成方法参见文献：Significant improvement of quality for long oligonucleotides by using controlled pore glass with large pores. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005;24(5-7):1037-41.）上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸，模式如下：
变性、退火体系为：
2.5 μl forward Oligo (100 μM)
2.5 μl reverse Oligo (100 μM)
1 μl NEB buffer 2
4 μl 灭菌水
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C /s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
随机选择的第1个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 30所示），其forward oligo和reverse oligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
随机选择的第2个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 31所示），其forward oligo和reverse oligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
随机选择的第3个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 32所示），其forward oligo和reverse oligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 5和6所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
随机选择的第4个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 33所示），其forward oligo和reverse oligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 7和8所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
实施例 2 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA （用于靶向HBV cccDNA的sgRNA如序列表SEQ ID NO. 30所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg1质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 2所示）
1 μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/μl）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg1质粒（如序列表SEQ ID NO. 16所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg1（如序列表SEQ ID NO. 16所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5 M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
9、TA克隆测序
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）将步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector ( TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（3）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.23所示）发现：靶基因cccDNA缺失了sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
10、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg1（如序列表SEQ ID NO. 16所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
结果显示乙型肝炎病毒表面抗原没有表达。
实施例 3 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA （用于靶向HBV cccDNA的sgRNA如序列表SEQ ID NO. 31所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg2质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 4所示）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg2质粒（如序列表SEQ ID NO. 17所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg2（如序列表SEQ ID NO. 17所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
7、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
8、TA克隆测序
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）将步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector (TAKARA, 3271) 连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（3）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.24所示）发现：靶基因cccDNA缺失了sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
9、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg2（如序列表SEQ ID NO. 17所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
结果显示乙型肝炎病毒表面抗原没有表达。
实施例 4 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA （用于靶向HBV cccDNA的sgRNA如序列表SEQ ID NO. 32所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 5和6所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg3质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 5所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 6所示）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg3质粒（如序列表SEQ ID NO. 18所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg3（如序列表SEQ ID NO. 18所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
7、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
8、TA克隆测序
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）将步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector (TAKARA, 3271) 连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（3）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.26所示）发现：靶基因cccDNA缺失了sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
9、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg3（如序列表SEQ ID NO. 18所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
结果显示乙型肝炎病毒表面抗原没有表达。
实施例 5 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA （用于靶向HBV cccDNA的sgRNA如序列表SEQ ID NO.33所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 7和8所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg4质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 7所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 8所示）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg4质粒（如序列表SEQ ID NO. 19所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg4（如序列表SEQ ID NO. 19所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
7、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
8、TA克隆测序
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）将步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector (TAKARA, 3271) 连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（3）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO. 27所示）发现：靶基因cccDNA缺失了sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
9、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg4（如序列表SEQ ID NO. 19所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
结果显示乙型肝炎病毒表面抗原没有表达。
实施例 6 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA
用于靶向HBV cccDNA的sgRNA为两个sgRNA共靶向，其序列如SEQ ID NO. 30和31所示，这两个sgRNA在HBV cccDNA上的靶向起始位点相距12 bp，可以显著提高敲除效率。
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg1质粒。
将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg2质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 2所示）或者（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 4所示）
1 μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/μl）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl灭菌水
16 °C孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg1质粒（如序列表SEQ ID NO. 16所示）和pGL3-U6-HBV sg2（如序列表SEQ ID NO. 17所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg1（如序列表SEQ ID NO. 16所示）和0.5 μg pGL3-U6-HBV sg2（如序列表SEQ ID NO. 17所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（:10.1038/cr.2013.46）
7、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5 M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
8、T7EN1 酶切检测
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）在20 μl体系中加入T7EN1 0.3 μl，37°C 酶切30分钟后，加入2 μl 10X Loading Buffer，用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，泳道1为DL2000 Marker，泳道2为转入没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，泳道3为加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)，可见与对照组相比，加入了针对HBV cccDNA的 sgRNA的样品出现了切割条带切割效率大约70%。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1 酶切检测步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector (TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.25所示）发现：靶基因cccDNA缺失了两个sgRNA靶序列的中间一段，基因敲除成功。
如图3所示，对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO. 30和SEQ ID NO. 31)可见与对照组相比，处理组发生了不同形式碱基剔除。
10、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg1（如序列表SEQ ID NO. 16所示）和0.5 μg pGL3-U6-HBV sg2（如序列表SEQ ID NO. 17所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
如图4所示，对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA1和sgRNA2载体pGL3-U6-HBV sg1和pGL3-U6-HBV sg2(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，对应的sgRNA为SEQ ID NO.30和SEQ ID NO. 31)。如图4所示，与对照组相比，处理组乙肝病毒表面抗原的表达显著减少了。
实施例 7 利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA
用于靶向HBV cccDNA的sgRNA为两个sgRNA共靶向，其序列如SEQ ID NO. 32和33所示，这两个sgRNA在HBV cccDNA上的靶向起始位点相距5bp，可以显著提高敲除效率。
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 μg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/μl）；
1 μl CutSmart Buffer；
1 μl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 μl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 μl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 5和6所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg3质粒。
将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 7和8所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-HBV sg4质粒。
连接体系如下：
3 μl，50 μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 5所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 6所示）或者（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 7所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 8所示）
1 μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/μl）
1 μl T4 ligation Buffer
0.5 μl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 μl灭菌水
16 °C孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-HBV sg3质粒（如序列表SEQ ID NO. 18所示）和pGL3-U6-HBV sg4（如序列表SEQ ID NO. 19所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HepG2细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 μg/ml）。
（2）在转染前分至6孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3）按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg3（如序列表SEQ ID NO. 18所示）和0.5 μg pGL3-U6-HBV sg4（如序列表SEQ ID NO. 19所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（如序列表SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（:10.1038/cr.2013.46）
7、抽提核内cccDNA
细胞用NP-40裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0，1 mM EDTA, 1% NP-40，1 X protease inhibitor）裂解，离心后收取沉淀，将沉淀重悬于1 mL的SDS裂解液（50 μM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 10 μM EDTA, 1% SDS），室温放置5分钟，转移至1.5 mL的EP管，加入0.25 ml，2.5 M KCl混匀，4℃轻摇过夜。14000 xg，20 min，收集上清液，酚-氯仿抽提后溶解到50 μl 去离子水中。
8、T7EN1 酶切检测
（1）使用序列如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物HBV test For和HBV test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 μl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at ?2°C/s；85–25°C at ?0.1°C /s；hold at 4°C。
（2）在20 μl体系中加入T7EN1 0.3 μl，37°C 酶切30分钟后，加入2 μl 10X Loading Buffer，用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，泳道1为DL2000 Marker，泳道2为转入没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，泳道4为加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO. 32和SEQ ID NO.33)，可见与对照组相比，加入了针对HBV cccDNA的 sgRNA的样品出现了切割条带切割效率大约70%。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1 酶切检测步骤（1）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 μl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 μl Mg2+
4 μl dNTP
0.5 μl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 μl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 μl 产物与pMD19-T vector (TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 11的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO. 28所示）发现：靶基因cccDNA缺失了两个sgRNA靶序列的中间一段，基因敲除成功。
如图3所示，对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)可见与对照组相比，处理组发生了不同形式碱基剔除。
10、ELISA法测定HBV表面抗原表达的变化
按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO. 14所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sg3（如序列表SEQ ID NO. 18所示）和0.5 μg pGL3-U6-HBV sg4（如序列表SEQ ID NO. 19所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。对照组设计为，将0.5 μg payw1.2质粒（如序列表SEQ ID NO.21所示），0.5 μg pGL3-U6-HBV sgc（SEQ ID NO. 20所示）与1.5 μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 13所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Research 23, 720-723.（:10.1038/cr.2013.46）
在转染后的第二天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus Surface Antigen (ELISA) 使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。
（1）配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用）。
（2）根据实验要求，选择一定量的反应板条。
（3）加入75 μl待测样本和阴性阳性对照于反应孔中。
（4）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟。
（5）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50 μl酶结合物。
（6）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（7）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（8）取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。
（9）洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50 μl，混匀。
（10）在微孔振荡器上震荡10秒钟。
（11）用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟。
（12）在所有孔内加入50 μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
（13）用酶标仪读数，波长450 nm。
对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc (SEQ ID NO.20，对应的sgRNA为SEQ ID NO.29)，处理组是加入针对HBV cccDNA的 sgRNA3和sgRNA4载体pGL3-U6-HBV sg3和pGL3-U6-HBV sg4(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，对应的sgRNA为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)。如图4所示，与对照组相比，处理组乙肝病毒表面抗原的表达显著减少。
Claims (13)
1.在CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征为：
（1）所述sgRNA在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶序列符合5’-GGN(19)GG、5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列排列规则；
（2）所述sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的ORF；
（3）所述sgRNA在HBV cccDNA的上的靶序列是唯一的。
2.如权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征为：其序列如序列表SEQ ID NO. 30-33任意一条序列所示。
3.CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为包括如下步骤：
（1）权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，在其对应DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，获得其对应DNA序列的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；
（2）线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-HBV sg质粒； pGL3-U6-HBV sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37°C摇床摇阳性克隆菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-HBV sg质粒；
（3）用脂质体装载pGL3-U6-HBV sg质粒和序列为SEQ ID NO. 13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒，共转染携带乙型肝炎病毒cccDNA的细胞；
（4）用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认乙型肝炎病毒cccDNA已经被敲除。
4.如权利要求3所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（3）所述的脂质体为Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent。
5.如权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（1）所述的sgRNA其序列为序列表SEQ ID NO. 30-33任意一条所示，分别对应的步骤（2）和（3）所述的pGL3-U6-HBV sg质粒的序列为序列表SEQ ID NO. 16-19任意一条序列所示，即sgRNA序列为SEQ ID NO. 30对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 16，sgRNA序列为SEQ ID NO. 31对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 17，sgRNA序列为SEQ ID NO. 32对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 18，sgRNA序列为SEQ ID NO. 33对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 19。
6.在如权利要求5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法中用到的pGL3-U6-HBV sg质粒，其特征为序列如序列表SEQ ID NO. 16-19任意一条所示。
7.CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为包括如下步骤：
（1）权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，在其对应的DNA链5’加上CCGG合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；
（2）线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-HBV sg质粒； pGL3-U6-HBV sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37°C摇床摇阳性克隆菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-HBV sg质粒；
（3）用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent装载两种或者两种以上不同的pGL3-U6-HBV sg质粒和序列为SEQ ID NO. 13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒，共转染携带乙型肝炎病毒cccDNA的细胞；
（4）用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认乙型肝炎病毒cccDNA已经被敲除。
8.如权利要求7所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（3）所述的不同的pGL3-U6-HBV sg质粒为两种，且这两种不同的pGL3-U6-HBV sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶向起始位点相距10 -30bp。
9.如权利要求8所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（3）所述的两种不同的pGL3-U6-HBV sg质粒的序列为SEQ ID NO. 16和17，这两个pGL3-U6-HBV sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶向起始位点相距12 bp；或者步骤（3）所述的两种不同的pGL3-U6-HBV sg质粒的序列为SEQ ID NO. 18和19，这两个pGL3-U6-HBV sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶向起始位点相距5 bp。
10.如权利要求1或者2所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA在敲除乙型肝炎病毒cccDNA中的应用。
11.如权利要求3、5或者6任意一项所述的pGL3-U6-HBV sg质粒在敲除乙型肝炎病毒cccDNA中的应用。
12.如权利要求3、5或者6任意一项所述的pGL3-U6-HBV sg质粒在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
13.如权利要求3、5或者6任意一项所述的pGL3-U6-HBV sg质粒和如SEQ ID NO. 13所示的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒的组合物在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
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