CN105561342A - 一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。本发明基因药物所表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下针对HBV的cccDNA进行剪切，进一步破坏cccDNA，进而达到清楚HBV的目的，解决目前的HBV治疗方法无法根除HBV的问题。

Description

一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因药物领域，尤其涉及一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法。
背景技术
肝炎（Hepatitis）是肝脏的炎症，常常由病毒感染而引起。其中，病毒性肝炎又可以分为甲、乙、丙、丁和戊型，虽然病毒种类不同，但都足以对人构成严重危害，其中乙型和丙型肝炎可以导致肝硬化和肝癌的发生，给患者和家庭带来严重的疾病负担。
尤其是乙型肝炎（HepatitisB）在我国分布极为广泛。据权威统计表明我国的乙肝病毒（HepatitisBvirus,HBV）感染率约60%-70%，乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此估算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万人。另据世界卫生组织的权威统计表明，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性HBV感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。
乙肝的发病机制至今尚未完全明确，一般认为与机体免疫功能低下，感染HBV后出现免疫应答或免疫调节功能紊乱，导致肝脏损伤有关，进而进一步可能发展为肝硬化及肝癌等。国内外尚无满意的治疗方法及特效药物，目前对于乙肝而言，主要有几个途径来控制，包括接种乙肝疫苗、药物治疗及其他治疗方式。
乙肝疫苗对于防止HBV感染具有重要的作用，是目前全世界防止HBV的主要手段之一，然而，乙肝疫苗对于已经感染HBV的患者没有任何作用。因此，药物治疗是目前治疗已经感染HBV的患者的主要手段，包括干扰素、胸腺肽、核苷类药物、非核苷类药物、多肽类药物、治疗性疫苗以及中草药等。干扰素主要包括IFN-α，其是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，作用机制是通过与肝细胞膜受体结合，激活靶细胞抗病毒蛋白基因，切断病毒mRNA，抑制病毒蛋白的翻译。胸腺肽主要是指为一种人工合成的含28个氨基酸的多肽，具有较强的免疫调节作用，可增加T细胞前体和IL-2高亲和力受体的数量，促进IL-2生成，利于机体清除HBV。核苷类药物包括替比夫定和恩替卡韦等，主要作用靶点是RNA病毒的逆转录酶或DNA病毒的DNA聚合酶，其主要是模拟天然核苷的结构，竞争性作用于酶活性中心，嵌入正在合成的病毒DNA链中，终止病毒DNA链的延长，从而抑制病毒复制。非核苷类药物包括膦甲酸钠为代表的焦磷酸类似物等，具有一定的治疗潜力。多肽类药物包括硫普罗宁和还原型谷胱甘肽，前者是国内临床常用的肝功能改善剂和代谢解毒剂，具有疗效确切、安全、毒性小的特点，后者对于治疗急性肝炎和药物性肝损害中ALT、血清胆红素(SB)等指标可使之较为迅速地恢复正常。治疗性疫苗是指能打破慢性感染者体内免疫耐受、重建或增强免疫应答的新型疫苗，主要包括蛋白或多肽疫苗、DNA疫苗、免疫佐剂等，其主要是以诱导细胞免疫应答为主，是抗病毒、抗肿瘤新的治疗手段，具有费用低、安全、疗效好的特点，但目前仍处于探索阶段。中草药在乙肝治疗中显示出较好的前景，目前，治疗乙肝的中药品种很多，治疗效果和安全性都很高，主要包括苦参碱、氧化苦参碱磷脂复合物、齐墩果酸、水飞蓟宾等，其作用机制主要有抗病毒作用，调节免疫作用以及保肝作用。
乙肝的其他治疗方式主要包括RNA干扰技术（RNAinterfere,RNAi）以及臭氧自血疗法。RNAi技术实际上是一种基因治疗疗法，经过精心设计的RNAi能够有效地控制HBV的复制，目前RNAi技术治疗乙肝在细胞水平和动物水平显示出了较好的效果，在人体中还需要进一步研究。臭氧自血疗法即通过臭氧及其活性代谢产物诱导人体产生免疫细胞，清除肝炎病毒；其次，臭氧还可诱导人体产生多种细胞因子，如各种内源性干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等，最终利用自身的免疫系统杀灭病毒感染细胞，使肝炎病毒的复制得到抑制，从而延缓和阻止病毒性肝炎的发展。
然而，不管是药物治疗还是基于其他方法的治疗，目前对于HBV感染都是没有办法根治的，只能进行一定的控制。因此，目前的治疗乙肝的方法效果非常有限，亟待开发新的用于治疗HBV的药物。
因此，现有的治疗肝硬化的技术还有待改进和开发。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法，旨在解决现有技术无法直接治疗乙肝的问题。。
本发明的技术方案如下：
一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。
所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述载体包括：质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、附加体质粒载体、慢病毒载体以及转座子载体。
所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述sgRNA序列包括：目标序列，gRNA骨架序列以及终止信号序列。
所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述目标序列包括:Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10，所述目标序列按5'-3'方向如下：
Seq-Target1：GACTTCTCTCAATTTTCTAG；
Seq-Target2：GGCATAGCAGCAGGATGAAG；
Seq-Target3：GCTGCCAACTGGATCCTGCG；
Seq-Target4：GAAGCGAAGTGCACACGGTC；
Seq-Target5：GTTGATAGGATAGGGGCATT；
Seq-Target6：GCCTGCTAGGTTTTATCCAA；
Seq-Target7：CCTCCAAGCTGTGCCTTGGG；
Seq-Target8：TAAAGAATTTGGAGCTACTG；
Seq-Target9：GGGTTGCGTCAGCAAACACT；
Seq-Target10：TCCTCTGCCGATCCATACTG。
所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述Cas9序列经过密码子优化，其序列如序列表SEQIDNO.1所示。
所述的治疗乙肝的基因药物的制备方法，其中，包括步骤：
A、构建重组载体-Cas9质粒：采用EcoRV和NotI对载体进行双酶切，将酶切后的载体与合成的Cas9序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4DNA连接酶buffer溶液，制得重组载体-Cas9质粒；
B、重组载体-Cas9质粒的转化：将重组载体-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的携带有表达Cas9蛋白的重组载体-Cas9质粒；
C、合成U6-Target-gRNA-CMV序列：首先针对HBV的cccDNA设计出Target靶序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA-CMV序列；
D、构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒：采用BamHI和EcoRI对载体-Cas9质粒进行双酶切，然后将酶切后的载体-Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV序列按照摩尔比例1:10混合，在加入T4DNA连接酶buffer溶液，最终制得重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒；
E、重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒的转化：将重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的装载有U6-Target-gRNA-CMV-Cas9表达序列的质粒。
所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，所述步骤B具体包括：
B1、将重组载体-Cas9质粒放置在冰上，并将DH5α细菌放置在冰上解冻，吸取3~5μl重组载体-Cas9质粒加入细菌中混合均匀，放置冰上5~10分钟；
B2、将混合物在42℃水浴热激90秒后放置在冰上冷却2~3分钟，最后加入500μl无菌LB培养基，37℃下振荡培养1小时，之后再涂平板，37℃下培养过夜；
B3、第二天挑取克隆细菌进行测序，测序正确的即为重组载体-Cas9质粒。
有益效果：本发明提供的治疗乙肝的基因药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。本发明基因药物所表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下针对HBV的cccDNA进行剪切，进一步破坏cccDNA，进而达到清楚HBV的目的，解决目前的HBV治疗方法无法根除HBV的问题。
附图说明
图1为本发明一种治疗乙肝的基因药物的制备方法较佳实施例的流程图。
图2为图1所示方法中重组载体-Cas9质粒的转化的具体流程图。
具体实施方式
本发明提供一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明中，治疗乙肝的基因药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。具体地，所述U6启动子是指能够启动sgRNA表达的通用型启动子，所述U6序列（Seq-U6）示于序列表中序列2。所述sgRNA序列包括目标序列、gRNA骨架序列（gRNAscaffoldsequence）以及终止信号序列，其中目标序列(即Target靶序列)需要根据待敲除的序列进行设计。在本发明中，所述目标序列是针对HBV的cccDNA设计的Target靶序列，其具体包括Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10，所述目标序列按5'-3'方向如下：
Seq-Target1：GACTTCTCTCAATTTTCTAG；
Seq-Target2：GGCATAGCAGCAGGATGAAG；
Seq-Target3：GCTGCCAACTGGATCCTGCG；
Seq-Target4：GAAGCGAAGTGCACACGGTC；
Seq-Target5：GTTGATAGGATAGGGGCATT；
Seq-Target6：GCCTGCTAGGTTTTATCCAA；
Seq-Target7：CCTCCAAGCTGTGCCTTGGG；
Seq-Target8：TAAAGAATTTGGAGCTACTG；
Seq-Target9：GGGTTGCGTCAGCAAACACT；
Seq-Target10：TCCTCTGCCGATCCATACTG，上述Seq-Target1-10分别示于序列表中序列3-12，所述gRNA骨架序列以及终止信号序列分别示于序列表中序列13-14。
在本发明中，所述Cas9蛋白是一种核苷酸酶，其具有两个核苷酸结构域，具有能够在特定RNA即sgRNA的引导作用下对特定的DNA序列进行特异剪切的能力，可以分别切割DNA两条单链，并且Cas9序列是经过密码子优化的，其序列如序列表序列1所示。进一步，本发明通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA。所述Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合形成复合物，然后再通过PAM（Protospaceradjacentmotif）序列结合并切入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，而最终利用细胞自身的修复机制造成剪切的DNA部位增加或者缺失DNA序列，进而达到敲除基因表达的目的。
进一步，本发明装载有U6启动子、表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件并使其能够在细胞中表达的载体包括质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、附加体质粒载体、慢病毒载体以及转座子载体。
基于上述一种治疗乙肝的基因药物，本发明还提供一种制备上述治疗乙肝基因药物的制备方法，请参阅图1，图1为本发明治疗乙肝的基因药物的制备方法，如图所示，包括步骤：
S100、构建重组载体-Cas9质粒：采用EcoRV和NotI对载体进行双酶切，将酶切后的载体与合成的Cas9序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4DNA连接酶buffer溶液，制得重组载体-Cas9质粒；
S110、重组载体-Cas9质粒的转化：将重组载体-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的携带有表达Cas9蛋白的重组载体-Cas9质粒；
S120、合成U6-Target-gRNA-CMV序列：首先针对HBV的cccDNA设计出Target靶序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA-CMV序列；
S130、构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒：采用BamHI和EcoRI对载体-Cas9质粒进行双酶切，然后将酶切后的载体-Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV序列按照摩尔比例1:10混合，在加入T4DNA连接酶buffer溶液，最终制得重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒；
S140、重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒的转化：将重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的装载有U6-Target-gRNA-CMV-Cas9表达序列的质粒。
在步骤S100中，先合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有EcoRV和NotI双酶切位点，然后采用EcoRV和NotI对载体进行双酶切，用胶回收试剂盒进行胶回收，再将胶回收的载体与合成的Cas9基因片段按照摩尔比例为1:10混合（20μl体系），在加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2μlT4DNA连接酶，在16℃连接过夜，制得重组载体-Cas9质粒。
在步骤S110中，重组载体-Cas9质粒的转化，如图2所示，其具体包括步骤：
S200、将重组载体-Cas9质粒放置在冰上，并将DH5α细菌放置在冰上解冻，吸取3~5μl重组载体-Cas9质粒加入细菌中混合均匀，放置冰上5~10分钟；
S210、将混合物在42℃水浴热激90秒后放置在冰上冷却2~3分钟，最后加入500μl无菌LB培养基，37℃下振荡培养1小时，之后再涂平板，37℃下培养过夜；
S220、第二天挑取克隆细菌进行测序，测序正确的即为重组载体-Cas9质粒。
在步骤S120中，在完成重组载体-Cas质粒的构建之后，进一步，需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其它元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，即合成U6-Target-gRNA-CMV序列，首先针对HBV的cccDNA设计出Target靶序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA-CMV序列，所述U6-Target-gRNA-CMV序列可分为正反两种，分别为U6-Target-gRNA-CMV-F以及U6-Target-gRNA-CMV-R。进一步，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target-gRNA-CMV双链寡核苷酸。
在步骤S130中，构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒，其构建过程为：采用BamHI和EcoRI对载体-Cas9质粒进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的载体-Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。
在步骤S140中，重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒的转化，将重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升所述质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序，测序正确的质粒即所需重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒。
进一步，对本发明制得的重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒进行纯化，保存备用或者用于人体输入治疗HBV。
以下用具体的实施例对本发明一种治疗乙肝基因药物的制备方法进行说明，下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
质粒载体装载CRISPR/Cas9治疗乙肝
质粒作为最常用的表达基因或者RNA的载体，应用极为广泛。在本实施例中，采用包括骨架质粒载体为最为常见的pcDNA3.1载体。构建完整个载体之后注射HBV感染的人体，在肝脏中Cas9可以对HBV的cccDNA进行剪切，从而消灭HBV病毒。
首先，需要将Cas9基因构建进入pcDNA3.1载体之中。构建过程为：合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有EcoRV以及NotI双酶切位点；采用EcoRV以及NotI对pcDNA3.1载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收；将胶回收的pcDNA3.1载体与合成的Cas9基因片段按照比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。测序正确的质粒称为pcDNA3.1-Cas9质粒。
在完成pcDNA3.1-Cas9质粒构建之后，进一步需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其他元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，合称为：U6-Target-gRNA-CMV。因此，首先需要针对HBV的cccDNA设计Target靶序列，在获取了靶序列之后，我们需要进一步合成U6-Target-gRNA-CMV的序列，其中，U6-Target-gRNA-CMV的序列中的Target序列可以是Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10中的任意一种。在本实施例中，以Seq-Target1为例子，因此，U6-Target-gRNA-CMV的序列就可以称为：U6-Target1-gRNA-CMV的序列，这样可以合成正反两段序列Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R，所述Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R分别示于序列表中序列15-16。进一步地，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到pcDNA3.1-Cas9质粒载体上。构建过程为：采用BamHI和EcoRI对pcDNA3.1-Cas9质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的pcDNA3.1-Cas9质粒载体与合成并退火的U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序，测序正确的质粒即所需重组pcDNA3.1-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒。
实施例2
腺病毒装载CRISPR/Cas9治疗乙肝
腺病毒也是最常用的基因治疗载体，其可以高效表达基因或者RNA的，在研究领域及疾病治疗领域应用非常广泛。在本实施例中，采用腺病毒来介导针对HBV的治疗。在构建完整个腺病毒载体之后，与辅助质粒一起共转染293A细胞系包装腺病毒，然后将纯化的腺病毒注射HBV感染的人体，在肝脏中Cas9可以对HBV的cccDNA进行剪切，从而消灭HBV病毒。
首先，需要将Cas9基因构建进入腺病毒载体pAd-track质粒载体之中。构建过程为：合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有KpnI以及NotI双酶切位点；采用KpnI以及NotI对pAd-track质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收；将胶回收的pAd-track质粒载体与合成的Cas9基因片段按照比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。测序正确的质粒称为pAd-track-Cas9质粒。
在完成pAd-track-Cas9质粒构建之后，进一步需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其他元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，合称为：U6-Target-gRNA-CMV，因此，首先需要针对HBV的cccDNA设计Target靶序列，在获取了靶序列之后，我们需要进一步合成U6-Target-gRNA-CMV的序列，其中，U6-Target-gRNA-CMV的序列中的Target序列可以是Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10中的任意一种。在本实施例中，以Seq-Target1为例子，因此，U6-Target-gRNA-CMV的序列就可以称为：U6-Target1-gRNA-CMV的序列，这样可以合成正反两段序列Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R，所述Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R分别示于序列表中序列15-16。进一步地，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。进一步地，将上述序列两端加上HandIII和EcoRV双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到pAd-track-Cas9质粒载体上。构建过程为：采用HandIII和EcoRV对pAd-track-Cas9质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的pAd-track-Cas9质粒载体与合成并退火的U6-Target1-gRNA-CMV的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒命名为：pAd-track-U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9质粒，纯化质粒，保存备用或者进一步用于表达Cas9的腺病毒包装。其包装过程为：将测序鉴定好的装载U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9表达序列的腺病毒载体质粒20微克、辅助包装质粒10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到培养有293A细胞的培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液；继续在细胞培养箱（37℃，5%CO2浓度）中培养72-80小时后，收集上清液到50ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液；之后采用超速离心（100000r/分钟，4℃，离心3小时）；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9的腺病毒分装并做好标记后放-80℃冰箱保存。进一步根据需要注射HBV患者以便治疗HBV。
实施例3
腺相关病毒装载CRISPR/Cas9治疗乙肝
腺相关病毒（AAV）也是最常用的基因治疗载体，其可以高效表达基因或者RNA的，在研究领域及疾病治疗领域应用非常广泛。在本实施例中，采用AAV病毒来介导针对HBV的治疗。在构建完整个AAV病毒载体之后，与辅助质粒一起共转染AAV-293细胞系包装AAV病毒，然后将纯化的AAV病毒注射HBV感染的人体，在肝脏中Cas9可以对HBV的cccDNA进行剪切，从而消灭HBV病毒。
首先，需要将Cas9基因构建进入AAV病毒载体pAAV质粒载体之中。构建过程为：合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有EcoRI以及BamHI双酶切位点；采用EcoRI以及BamHI对pAAV质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收；将胶回收的pAAV质粒载体与合成的Cas9基因片段按照比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。测序正确的质粒称为pAAV-Cas9质粒。
完成pAAV-Cas9质粒构建之后，进一步需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其他元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，合称为：U6-Target-gRNA-CMV。因此，首先需要针对HBV的cccDNA设计Target靶序列，在获取了靶序列之后，我们需要进一步合成U6-Target-gRNA-CMV的序列，其中，U6-Target-gRNA-CMV的序列中的Target序列可以是Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10中的任意一种。在本实施例中，以Seq-Target1为例子，因此，U6-Target-gRNA-CMV的序列就可以称为：U6-Target1-gRNA-CMV的序列，这样可以合成正反两段序列Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R，所述Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R分别示于序列表中序列15-16。进一步地，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到pAAV-Cas9质粒载体上。构建过称为：采用SalI和HandIII对pAAV-Cas9质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的pAAV-Cas9质粒载体与合成并退火的U6-Target1-gRNA-CMV的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒命名为：pAAV-Cas9-U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9质粒，纯化质粒，保存备用或者进一步用于表达Cas9的AAV病毒包装。其包装过程为：将测序鉴定好的装载U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9表达序列的AAV病毒载体质粒20微克、辅助包装质粒10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到培养有AAV-293细胞的培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液；继续在细胞培养箱（37℃，5%CO2浓度）中培养72-80小时后，收集上清液到50ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液；之后采用超速离心（100000g/分钟，4℃，离心3小时）；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9的AAV病毒分装并做好标记后放-80℃冰箱保存。进一步根据需要注射HBV患者以便治疗HBV。
实施例4
Episomal载体pCEP4装载CRISPR/Cas9治疗乙肝
附加体（episomal）包括常用的pCEP4质粒载体是一种在细胞中或以游离态、或以与染色体相结合的状态存在着的遗传结构，它的存在给细胞带来一定的遗传性状，但它们的缺失并不会造成细胞的死亡。以附加体为载体的表达系统可以有高拷贝的形式存在于真核细胞中，而附加体可以通过利用载体上的抗生素抗性基因作为选择压而得以维持，另一方面，由于附加体不整合到细胞的基因组中，所以对细胞本身的基因组没有像整合型病毒的破坏作用。在本实施例中，采用包括episomal质粒载体为最为常见的pCEP4载体。构建完整个载体之后注射HBV感染的人体，在肝脏中Cas9可以对HBV的cccDNA进行剪切，从而消灭HBV病毒。首先，需要将Cas9基因构建进入pCEP4载体之中。构建过程为：合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有NotI和BamHI双酶切位点；采用NotI和BamHI对pCEP4载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收；将胶回收的pCEP4载体与合成的Cas9基因片段按照比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。测序正确的质粒称为pCEP4-Cas9质粒。
在完成pCEP4-Cas9质粒构建之后，进一步需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其他元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，合称为：U6-Target-gRNA-CMV。因此，首先需要针对HBV的cccDNA设计Target靶序列，在获取了靶序列之后，我们需要进一步合成U6-Target-gRNA-CMV的序列，其中，U6-Target-gRNA-CMV的序列中的Target序列可以是Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10中的任意一种。在本实施例中，以Seq-Target1为例子，因此，U6-Target-gRNA-CMV的序列就可以称为：U6-Target1-gRNA-CMV的序列，这样可以合成正反两段序列Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R，所述Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R分别示于序列表中序列15-16。进一步地，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。然后将上述序列构建到pCEP4-Cas9质粒载体上。构建过称为：采用KpnI和HandIII对pCEP4-Cas9质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的pCEP4-Cas9质粒载体与合成并退火的U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序，测序正确的质粒即所需重组pCEP4-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒。
实施例5
慢病毒装载CRISPR/Cas9治疗乙肝
慢病毒（Lentivirus）也是最常用的基因治疗载体，其可以高效表达基因或者RNA的，在研究领域及疾病治疗领域应用非常广泛。在本实施例中，采用慢病毒来介导针对HBV的治疗。在构建完整个慢病毒载体之后，与辅助质粒pREV、pRRE以及pVSVG一起共转染293T细胞系包装慢病毒，然后将纯化的慢病毒注射HBV感染的人体，在肝脏中Cas9可以对HBV的cccDNA进行剪切，从而消灭HBV病毒。
首先，需要将Cas9基因构建进入慢病毒载体PLVX质粒载体之中。构建过程为：合成Cas9基因，并且合成的Cas9序列两端分别含有XbaI以及BamHI双酶切位点；采用XbaI以及BamHI对PLVX质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收；将胶回收的PLVX质粒载体与合成的Cas9基因片段按照比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。测序正确的质粒称为PLVX-Cas9质粒。
在完成PLVX-Cas9质粒构建之后，进一步需要合成介导Cas9在特定DNA序列剪切的其他元件，即U6序列、Target靶序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列，合称为：U6-Target-gRNA-CMV。因此，首先需要针对HBV的cccDNA设计Target靶序列，在获取了靶序列之后，我们需要进一步合成U6-Target-gRNA-CMV的序列，其中，U6-Target-gRNA-CMV的序列中的Target序列可以是Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10中的任意一种。在本实施例中，以Seq-Target1为例子，因此，U6-Target-gRNA-CMV的序列就可以称为：U6-Target1-gRNA-CMV的序列，这样可以合成正反两段序列Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R，所述Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F以及Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R分别示于序列表中序列15-16。进一步地，将上述序列两端加上EcoRI和BamHI双酶切位点之后分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-F、8μl的Seq-U6-Target1-gRNA-CMV-R以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到U6-Target1-gRNA-CMV双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到PLVX-Cas9质粒载体上。构建过称为：采用EcoRI和SpeI对PLVX-Cas9质粒载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX-Cas9质粒载体与合成并退火的U6-Target1-gRNA-CMV的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒命名为：PLVX-Cas9-U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9质粒，纯化质粒，保存备用或者进一步用于表达Cas9的慢病毒包装。其包装过程为：将测序鉴定好的装载U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9表达序列的慢病毒载体PLVX-Cas9-U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9质粒20微克、辅助包装质粒pREV、pRRE及pVSVG各10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到培养有293A细胞的培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液；继续在细胞培养箱（37℃，5%CO2浓度）中培养72-80小时后，收集上清液到50ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液；之后采用超速离心（50000g/分钟，4℃，离心3小时）；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达U6-Target1-gRNA-CMV-Cas9的慢病毒分装并做好标记后放-80℃冰箱保存。进一步根据需要注射HBV患者以便治疗HBV。
综上所述，本发明提供的治疗乙肝的基因药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。本发明基因药物所表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下针对HBV的cccDNA进行剪切，进一步破坏cccDNA，进而达到清楚HBV的目的，解决目前的HBV治疗方法无法根除HBV的问题。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
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Claims (7)

1.一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述载体包括：质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、附加体质粒载体、慢病毒载体以及转座子载体。
3.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述sgRNA序列包括：目标序列，gRNA骨架序列以及终止信号序列。
4.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述目标序列包括:Seq-Target1、Seq-Target2、Seq-Target3、Seq-Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq-Target7、Seq-Target8、Seq-Target9、Seq-Target10，所述目标序列按5'-3'方向如下：
Seq-Target1：GACTTCTCTCAATTTTCTAG；
Seq-Target2：GGCATAGCAGCAGGATGAAG；
Seq-Target3：GCTGCCAACTGGATCCTGCG；
Seq-Target4：GAAGCGAAGTGCACACGGTC；
Seq-Target5：GTTGATAGGATAGGGGCATT；
Seq-Target6：GCCTGCTAGGTTTTATCCAA；
Seq-Target7：CCTCCAAGCTGTGCCTTGGG；
Seq-Target8：TAAAGAATTTGGAGCTACTG；
Seq-Target9：GGGTTGCGTCAGCAAACACT；
Seq-Target10：TCCTCTGCCGATCCATACTG。
5.根据权利要求1所述的一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述Cas9序列经过密码子优化，其序列如序列表SEQIDNO.1所示。
6.一种如权利要求1所述的治疗乙肝的基因药物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、构建重组载体-Cas9质粒：采用EcoRV和NotI对载体进行双酶切，将酶切后的载体与合成的Cas9序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4DNA连接酶buffer溶液，制得重组载体-Cas9质粒；
B、重组载体-Cas9质粒的转化：将重组载体-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的携带有表达Cas9蛋白的重组载体-Cas9质粒；
C、合成U6-Target-gRNA-CMV序列：首先针对HBV的cccDNA设计出Target靶序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA-CMV序列；
D、构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒：采用BamHI和EcoRI对载体-Cas9质粒进行双酶切，然后将酶切后的载体-Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV序列按照摩尔比例1:10混合，在加入T4DNA连接酶buffer溶液，最终制得重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒；
E、重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒的转化：将重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的装载有U6-Target-gRNA-CMV-Cas9表达序列的质粒。
7.根据权利要求6所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：
B1、将重组载体-Cas9质粒放置在冰上，并将DH5α细菌放置在冰上解冻，吸取3~5μl重组载体-Cas9质粒加入细菌中混合均匀，放置冰上5~10分钟；
B2、将混合物在42℃水浴热激90秒后放置在冰上冷却2~3分钟，最后加入500μl无菌LB培养基，37℃下振荡培养1小时，之后再涂平板，37℃下培养过夜；
B3、第二天挑取克隆细菌进行测序，测序正确的即为重组载体-Cas9质粒。
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