CN113249384A - 可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用。其中，所述sgRNA序列如Sequence NO.1或SequenceNO.2所示，使用设计的引物对进行PCR扩增制备所述sgRNA的转录模板，然后进行转录得所述sgRNA序列。将该sgRNA用于提高了CRISPR‑Cas9系统，提高了靶向HBV基因组C区的CRISPR‑Cas9系统的特异性，降低脱靶效应。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌中的一种RNA向导的免疫防御系统，由高度保守的、短的DNA正向重复序列组成特殊的重复序列家族，通过两个非编码RNA(即crRNA和反式激活tracrRNA)和RNA向导的Cas9核酸酶识别并切割靶位点DNA。根据Cas蛋白的种类和同源性，CRISPR系统被分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等五种类型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是当前的研究热点。在该系统中链球菌(S.pyogenes,Sp)Cas9是目前应用最广泛的基因编辑工具。2013年张锋教授在《Science》上首次报道了CRISPR/Cas9可在真核细胞中起作用，开启了人类基因编辑的新纪元。2014年Lin等率先证实CRISPR/Cas9可体外靶向切割HBV基因组，初步探索了CRISPR/Cas9在HBV治疗上的可能性。同年Seeger等研究发现，CRISPR/Cas9可显著抑制HepG2-NTCP细胞模型中HBV的感染。2015年Karimova等研究发现，用于靶向HBV基因组保守区域的CRISPR/Cas9既能作用于cccDNA又能编辑整合在宿主基因组上的HBV DNA。2016年Zhu等研究发现CRISPR/Cas9可抑制HBV转基因小鼠中乙肝病毒的复制。2020年Yang等在体外研究证实通过CRISPR/Cas9介导的非切割碱基编辑策略可永久灭活HBV基因组，同时避免脱靶效应的产生。但由于受限无高特异性的sgRNA序列和低免疫原性的递送系统，上述研究常停留在细胞实验阶段。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种sgRNA及制备其转录模板的引物对，所述sgRNA能精准靶向编辑HBV cccDNA。
所述sgRNA的核酸序列包括如Sequence NO.1或Sequence NO.2所示的序列。
具体地，所述Sequence NO.1为序列为ATACCGCCTCAGCTCTGTAT；所述SequenceNO.2的序列为ACTACTGTTGTTAGACGACG。
具体地，在某些具体实施例中，所述sgRNA的设计与筛选方法为：(1)选择HBV不同基因型保守区域(HBV基因组C区)的基因序列作为打靶序列，使用张峰实验室开发的CRISPR-sgRNA在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)和CRISPR MultiTargeter(http://www.multicrispr.net/)网站进行sgRNA的设计和筛选，使用NCBI BLAST与人基因组(HG19)进行比对，剔除具有同源性的sgRNA序列，从sgRNA生物信息学设计层面提高CRISPR-Cas9的特异性，降低脱靶效应(sgRNA序列由华大基因合成)；(2)使用张峰实验室开发的CRISPR-sgRNA在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)和CRISPR MultiTargeter(http://www.multicrispr.net/)网站设计和筛选靶向HBV基因组C区(NC_003977.2(1816-2454nt))的sgRNA，PAM设定为NGG；(3)为最大限度提高CRISPR/Cas9的性能，降低脱靶效应；本研究从生物信息学设计层面严格筛选得分较高的高效特异的sgRNA，从上述网站发现的36条sgRNAs中根据以下原则筛选：必须使序列的5'末端为G，3'末端为“NGG”(保证所筛选的HBV序列能被Cas9内切酶识别和切割)；与人基因组HG19相比，同源性低于1％；GC含量为40-60％，连续T≤3，off-targets≤41(http://crispr.mit.edu/)，MIT/CFD SpecificityScore＞90(http://crispr.mit.edu/)，Score＞0.3(http://www.multicrispr.net/)。最终筛选了2条基于HBV基因组C区(NC_003977.2(1816-2454nt))的sgRNA，如Sequence NO.1或Sequence NO.2所示。
进一步，还提供一种制备所述sgRNA的转录模板的引物对，所述引物对为：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；或
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
具体地，所述核酸序列如Sequence NO.3的模板对应引物对：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；
所述所述核酸序列如Sequence NO.4的模板对应引物对：
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
进一步，制备前述sgRNA的转录模板的方法，所述方法包括：使用引物对进行PCR扩增，所述引物对为：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；或
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
具体地，所述核酸序列如Sequence NO.3的模板对应引物对：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；
所述所述核酸序列如Sequence NO.4的模板对应引物对：
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
具体地，在某些实施例中所述sgRNA的合成方法为：(1)根据BLAST分别设计4条靶向序列的引物，将设计的sgRNA位点的～20bp碱基通过PCR方法制备转录模板；(2)PCR扩增目的片段和纯化；(3)使用上述纯化后的PCR产物作为转录模板进行转录；(4)转录产物(RNA)的纯化。
本发明目的在于还提供一种靶向HBV基因组C区的CRISPR-Cas系统及其在基因编辑中的应用。
所述CRISPR-Cas系统包括前述的sgRNA。
所述CRISPR-Cas系统还包括Cas核酸酶，从理论上讲，所述Cas核酸酶为一切能够剪切DNA会RNA的蛋白。
优选地，所述CRISPR-Cas系统中Cas核酸酶为Cas9核酸酶或突变体；或Cas12核酸酶或其突变体；或Cas13核酸酶或其突变体。
优选地，所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶或突变体。
在某些具体实施例中，所述Cas核酸酶为NLS-Cas9-NLS。
在某些具体实施例中，将所述sgRNA与所述NLS-Cas9-NLS按摩尔质量1:1在室温下共同孵育10min，使其形成复合体CRISPR-Cas9。
所述CRISPR-Cas系统还包括转录激活因子，所述转录激活因子通过与Cas核酸酶直接或间接融合；或者所述转录激活因子通过直接融合或者与一些列肽融合；或者将所述转录激活因子招募到所述sgRNA，这些激活因子启动细胞的转录程序。
进一步，还提供前述的CRISPR-Cas系统基因编辑中的应用，具体为，一种敲除或敲低HBV基因组C区的方法，所述方法包括利用前述的CRISPR-Cas系统进行基因敲除或敲低。
进一步，所述靶向HBV基因组C区的CRISPR-Cas系统在敲除或敲低HBV基因组C区时，识别所述HBV基因组C区的PAM为CGG或AGG。
进一步，还提供一种前述的CRISPR-Cas系统基因编辑中的应用，具体为，一种体外抑制HBV的表达的方法，所述方法包括：利用前述的敲除或敲低HBV基因组C区的方法敲低或敲除HBV基因组C区。
本发明目的在于还提供一种前述的引物对在制备HBV检测试剂盒或制备HBV检测试剂中的应用。
本发明有益效果在于：
本发明提供的sgRNA构成的CRISPR-Cas9系统提高了CRISPR-Cas9系统对的HBV基因组C区特异性，降低脱靶效应。
附图说明
图1为http://crispr.mit.edu/网站设计靶向HBV基因组C区的sgRNA。
图2为http://www.multicrispr.net/网站设计靶向HBV基因组C区的sgRNAs。
图3为sgRNA序列合成示意图。
图4为CRISPR/Cas9系统外源剪切活性验证。
图5为PCR法检测CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV DNA的效率。
图6为Southern-blot法检测CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV DNA的效率。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1靶向HBV基因组的sgRNA设计与制备
选择HBV不同基因型保守区域(HBV基因组C区)的基因序列作为打靶序列，使用张峰实验室开发的CRISPR-sgRNA在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)和CRISPRMultiTargeter(http://www.multicrispr.net/)网站进行sgRNA的设计和筛选，使用NCBIBLAST与人基因组(HG19)进行比对，剔除具有同源性的sgRNA序列，从sgRNA生物信息学设计层面提高CRISPR-Cas9的特异性，降低脱靶效应(sgRNA序列由华大基因合成)。
(1)靶向HBV基因组C区sgRNAs的设计
使用张峰实验室开发的CRISPR-sgRNA在线设计网站(http://crispr.mit.edu/，如图1所示)和CRISPR MultiTargeter(http://www.multicrispr.net/，如图2所示)网站设计和筛选靶向HBV基因组C区(NC_003977.2(1816-2454nt))的sgRNA，PAM设定为NGG。
(2)靶向HBV基因组C区sgRNAs的筛选
为最大限度提高CRISPR/Cas9的性能，降低脱靶效应；本研究从生物信息学设计层面严格筛选得分较高的高效特异的sgRNA，从上述网站发现的36条sgRNAs中根据以下原则筛选：必须使序列的5'末端为G，3'末端为“NGG”(保证所筛选的HBV序列能被Cas9内切酶识别和切割)；与人基因组HG19相比，同源性低于1％；GC含量为40-60％，连续T≤3，off-targets≤41(http://crispr.mit.edu/)，MIT/CFD Specificity Score＞90(http://crispr.mit.edu/)，Score＞0.3(http://www.multicrispr.net/)。最终筛选了2条基于HBV基因组C区(NC_003977.2(1816-2454nt))的sgRNAs(如下表1所示)。
表1生物信息学设计靶向HBV基因组C区的sgRNAs
(3)靶向HBV基因组C区sgRNAs的合成与制备
根据筛选出的sgRNA(Target)参照下图(图3)合成序列设计原理进行sgRNAs的合成。
①根据BLAST分别设计4条靶向序列的引物，将设计的sgRNA位点的～20bp碱基通过PCR(引物序列如表2所示)方法制备转录模板；
表2：靶序列扩增引物
②PCR扩增目的片段和纯化；
③使用上述纯化后的PCR产物作为转录模板进行转录；
④转录产物(RNA)的纯化。
实施例2 CRISPR/Cas9系统的构建
将sgRNA与NLS-Cas9-NLS按摩尔质量1:1在室温下共同孵育10min，使其形成复合体CRISPR/Cas9。
实施例3 CRISPR/Cas9系统外源剪切活性研究
以HBV-CMV质粒为模板，PCR扩增含sgRNA靶向基因序列的目的片段，经测序验证扩增片段无突变；将sgRNA、Cas9以及10×反应缓冲液(200mM HEPES，1M NaCl，50mM MgCl2，1mM EDTA，pH6.5)按照表3所示配置反应体系。然后加入5ul纯化后的PCR产物，于37℃条件下反应2h。最后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率。
表3：CRISPR/Cas9系统外源剪切活性检测反应体系
再将sgRNA、Cas9以及10×反应缓冲液按照表3所示配置反应体系，然后加入5ul纯化后的PCR产物，于37℃条件下反应2h。最后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率(如图4)。不同sgRNA体外活性检测结果显示，2组sgRNA均能将底物进行有效切割；其中sgRNA1剪切活性最高。
实施例4 CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV cccDNA检测
选取HBV细胞感染模型HepG2-NTCP作为CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV cccDNA的研究对象，实验组分别使用pspCas9-sgRNA1和pspCas9-sgRNA2；转染HBV相关质粒5天后收取细胞，并对HBV DNA进行分离和检测；
本研究所构建的2条sgRNA均可显著抑制HBV的表达，为使后续体内外实验效果更加显著，故选取对HBV抑制效果最显著pspCas9-sgRNA1开展后续的细胞和动物实验(如图5和图6所示)。
图5为PCR法检测CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV DNA的效率，图6为Southern-blot法(DNA印迹法)检测CRISPR/Cas9系统靶向抑制HBV DNA的效率。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用
<130> 2021-4-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ataccgcctc agctctgtat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
actactgttg ttagacgacg 20
Claims (10)
1.sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列包括如Sequence NO.1或Sequence NO.2所示的序列。
2.引物对，其特征在于，所述引物对为制备权利要求1所述的sgRNA的转录模板的引物对：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；或
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
3.制备权利要求1所述的sgRNA的转录模板的方法，其特征在于，所述方法包括：使用引物对进行PCR扩增，所述引物对为：
F:TAATACGACTCACTATAGATACCGCCTCAGCTCT，
R:TTCTAGCTCTAAAACATACAGAGCTGAGGCGGT；或
F:TAATACGACTCACTATAGACTACTGTTGTTAGAC，
R:TTCTAGCTCTAAAACCGTCGTCTAACAACAGTA。
4.靶向HBV基因组C区的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括权利要求1所述的sgRNA。
5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统中Cas核酸酶为Cas9核酸酶或突变体；或Cas12核酸酶或其突变体；或Cas13核酸酶或其突变体。
6.根据权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述所述CRISPR/Cas系统还包括转录激活因子，所述转录激活因子通过与Cas核酸酶直接或间接融合；或者所述转录激活因子与所述sgRNA结合。
7.一种敲除或敲低HBV基因组C区的方法，其特征在于，利用权利要求4或5所述的CRISPR-Cas系统进行基因敲除或敲低。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统识别所述HBV基因组C区的PAM，再进行敲除或敲低HBV基因组C区；所述PAM为CGG或AGG。
9.一种体外抑制HBV的表达的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求7或8所述的方法敲低或敲除HBV基因组C区。
10.权利要求2所述的引物对在制备HBV检测试剂盒或制备HBV检测试剂中的应用。
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