JP2019504868A - レトロウイルス核酸配列の切除 - Google Patents
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Abstract
Description
(連邦政府資金による研究開発の記載)
本発明は、国立保健研究所によってP30MH092177およびR01NS087971を基に連邦政府の一部支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
〔背景技術〕
世界で4000万人以上が感染し、毎年200万人以上の新たな感染が続いているため、HIV/AIDSは主要な公衆衛生問題のままである(Adejumo OA, et al. J Int AIDS Soc 2015; 18:20049)。多剤併用療法(cART)によって、進行中のウイルス複製を効果的に制御し、CD4+T細胞の消失数を回復させることができる。しかしながら、この処置は潜伏感染細胞のウイルスを除去することができない(Kulpa DA, Chomont N. J Virus Erad 2015; 1:59-66)。増殖していないCD4+記憶T細胞のサブセットにおいて、組み込まれたプロウイルスDNAは存続し、再活性化して複製可能なウイルスを産生することができる。これは、cARTを中止するとき、急速なウイルスの回復をもたらすという結果になり得る(Coffin JM. Science 1995; 267:483-489; Coffin JM. AIDS 1996; 10 (Suppl 3):S75-84)。したがって、感染した人々は、細胞保有体(cell reservoir)でのウイルス存続により、長期間の処置を維持しなければならない。
〔発明の概要〕
本発明の実施形態は、レトロウイルス核酸配列に特異的な、遺伝子編集複合体を含む組成物、および治療の必要がある対象へのこれらの遺伝子編集複合体の投与に関する。
〔図面の簡単な説明〕
図1Aおよび1Bは、rAAV9:saCas9/gRNA Tg26 MEFによるHIV−1 DNAの切除を示す。図1Aは、Tg26動物を開発する導入遺伝子を作成するために除去された、GagおよびPol遺伝子間(3100bp)の位置を強調したHIV−1の模式図である。gRNA LTR1およびGagDの位置、ならびにそれらのヌクレオチドの組成を示す。赤字はPAM配列を示す。左上の図は、切除前後の予測される増幅産物と共に、PCR(P1とP2)およびネステッドPCR(P1’とP2’)で使用したプライマーの位置を示す。図1Bは、Tg26由来MEFの図と、rAAV9:Cas9/gRNAの量の増加に伴う、処置後のHIV−1 DNAのPCR増幅のゲル分析の結果を示す。全長(1323bp)および短縮型(truncated)(345bp)のPCR産生物の位置を示す。
〔発明を実施するための形態〕
遺伝子編集技術は、特にHIV−1ゲノムを標的とし、プロウイルスDNAが組み込まれたコピーを切除するためのRNA−誘導Cas9(CRISPR/Cas9として知られている)に基づいて発展してきた。特異的ガイドRNA(gRNA)の作成の標的として機能し、単一または多重(multiplex)Cas9/gRNA複合体によってその標的配列を編集する、HIV−1の長い末端反復(LTR)に属するU3領域を含むいくつかの特異配列が同定された。この戦略によって、潜在感染CD4+T細胞および単核の食細胞(単核白血球、マクロファージ、ミクログリア、および樹枝状細胞)におけるウイルス複製の完全な切除が可能になる(Hu W, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111:11461-11466; Khalili K, et al. J Neurovirol 2015; 21:310-321、当該文献は参照によって本明細書に援用される)。CRISPR/Cas9は遺伝毒性作用をもたない、または、ホストゲノムのオフターゲット編集を行わない。さらに、プロウイルスゲノムの組込みにおける、HIV−1のLTRの5’末端と3’末端との間の9709bpのDNA断片を正確に切除するという、この技術能力を初めて示した。多重gRNAおよびCas9の存在もまた、後のHIV−1感染から保護し、ヒトの疾患における細胞モデルに首尾よく用いられた(Ebina H, et al. Sci Rep 2013; 3:2510; Liao HK, et al. Nat Commun 2015; 6:6413; Zhu W, et al. Retrovirology 2015; 12:22)。
本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明するという目的でのみ使用され、本発明を限定する意図は無いということも理解されたい。
Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310(2000)によって概説的に記載されたもの;2'-O, 3'-C-linked [3.2.0]bicycloarabinonucleosides (例えば、N.K Christiensen., etal., J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463 (1998)を参照))を含んでいる。そのようなアナログには、結合特性が向上するよう設計された合成ヌクレオシド(例えば、2倍または3倍の安定性や特異性など)が含まれる。
本発明のプラクティスにおいて有益な、一般的技術のさらなる詳細のために、当業者は一般的な本を参照し、細胞生物学、組織培養、発生学および生理学について見直すことができる。
(組成物)
本発明の実施形態は、インビボおよびインビトロにおいて感染した細胞からレトロウイルスの核酸配列を切除および/または根絶するための組成物について開示する。感染の処置または予防の方法は、本明細書で開示される組成物を用いることを含む。
本発明の組成物は少なくとも1つの遺伝子編集剤を含み、当該少なくとも1つの遺伝子編集剤にはCRISPR関連ヌクレアーゼ(例えばCas9やCpf1 gRNA)、エンドヌクレアーゼのアルゴノートファミリー、clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組合わせが含まれる。Schiffer, 2012, J Virol 88(17):8920-8936を参照されたい。当該文献は参照によって本明細書に援用される。
shahii)細菌から得られたC2c2は、RNAファージに対する干渉を提供する。インビトロの生化学的分析により、C2c2は単一のcrRNAによってガイドされ、相補的なプロトスペーサーを有するssRNA標的を切断するようプログラムできることがわかる。細菌中で、C2c2は特定のmRNAをノックダウンするようプログラムできる。切断は、2つのコンセンサスHEPNドメイン(触媒不活性RNA結合タンパク質を生成する変異)中の触媒残留物によって媒介される。これらの結果は、C2c2が新たなRNA標的ツールとなりうることを実証する。
一実施形態において、組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(例えばCas9)またはそのホモログと、レトロウイルス(例えばHIV)の標的配列に相補的なガイドRNAとを含む。
本発明に係るガイドRNA配列は、センス配列またはアンチセンス配列であってもよい。gRNAの具体的な配列は変わり得る。しかし有用なガイドRNA配列とは、配列に関係なく、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれたウイルスの除去を完遂する配列である。ガイドRNA配列は概して、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含んでいる。PAMの配列は、使用されるCRISPRエンドヌクレアーゼの特異性要求に応じて変わり得る。S. pyogenesに由来するCRISPR−Casシステムにおいて、標的DNAは典型的には、5’−NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の直前にある。それゆえ、S. pyogenesのCas9の場合、PAM配列は、AGG、TGG、CGGまたはGGGであり得る。他のCas9オルソログは、異なるPAM特異性を有し得る。例えば、S. thermophilusに由来するCas9は、CRISPR1に対して5’−NNAGAAが必要であり、CRISPR3に対して5’−NGGNGが必要である。Neiseria meningitidisに由来するCas9は、5’−NNNNGATTが必要である。ガイドRNAの具体的な配列は変わり得るが、配列に関係なく、有用なガイドRNA配列とは、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれているレトロウイルス(例えばHIVウイルス)の除去を完遂する配列である。ガイドRNA配列の長さは、約20から約60ヌクレオチド、またはそれ以上であり、例えば、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約45、約50、約55、約60ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。
いくつかの実施形態において、核酸配列はいずれも、天然核酸配列から(例えば、変異、欠失、置換、核酸塩基、骨格の改変などによって)改変または誘導され得る。核酸配列は、ベクター、遺伝子編集剤、gRNA、tracrRNAなどを含んでいる。本発明で想像されるいくつかの改変核酸配列の例は、改変骨格(例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖内結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖内結合)を含むものを含んでいる。いくつかの実施形態において、改変オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を備えるもの、およびヘテロ原子骨格、CH2--NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2 [メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られている]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2およびO--N(CH3)--CH2--CH2骨格(ここで、ネイティブなホスホジエステル骨格はO--P--O--CHと表される)を備えるものを含んでいる。De Mesmaekeret al. Acc. Chem. Res. 1995, 28:366-374によって開示されているアミド骨格も、本明細書において具体化される。いくつかの実施形態において、モルホリノ骨格構造を有する核酸配列(Summerton and Weller, U.S. Pat. No. 5, 034,506)、ペプチド核酸(PNA)骨格(オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置き換えられており、核酸塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している)を有する核酸配列(Nielsen et al. Science 1991, 254, 1497)。核酸配列はまた、1つ以上の置換された糖部分を含み得る。核酸配列はまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチル等の糖疑似体を有し得る。
Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,
Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533))、脂肪鎖(例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111;Kabanov et al. FEBS Lett. 1990, 259, 327;Svinarchuket al. Biochimie 1993, 75, 49))、リン脂質(例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホナート(Manoharanet al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651;Shea et al.Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3777))、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharanet al. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651)が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドまたはその断片を含むハイブリッドタンパク質は、他のタイプのポリペプチドと結合し得る。これらの追加のポリペプチドは、精製、同定、タンパク質またはポリペプチドの全体的な投与量、および/またはペプチドの治療学的または予防学的な用途のために有用な任意のアミノ酸配列で有り得る。加えて、追加のポリペプチドは、シグナルペプチドまたは標的ペプチドなどであり得る。
上述のように、生物学的活性バリアントにおける一またはそれ以上のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基であってもよい。天然アミノ酸残基は、遺伝子コードによって天然にコードされたものに加えて、標準的でないアミノ酸(例えば、L型ではなくD型のアミノ酸)も含む。本発明のペプチドは、標準的な残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基も含んでもよい(例えば、ピロリジンをリジンの代わりに使用してもよく、セレノシステインをシステインの代わりに使用してもよい)。非天然アミノ酸残基は、天然に存在しないが、アミノ酸の基本式に合致するものであり、ペプチドに組み込まれることができる。これらには、D−アロイソロイシン((2R,3S)−2−アミノ−3−メチル吉草酸)およびL−シクロペンチルグリシン((S)−2−アミノ−2−シクロペンチル酢酸)が含まれる。他の例は、教科書またはワールドワイドウェブで調べることができる(現在カリフォルニア工科大学が運営しているサイトでは、機能タンパク質に正常に組み込まれた非天然アミノ酸の構造が公開されている)。
本明細書で使用される送達ビヒクルは、本明細書において具現化されている組成物の、インビトロ送達用またはインビボ送達用両方の、送達のためのあらゆる型の分子を含む。例としては、非限定的に、発現ベクター、ナノ粒子、コロイド組成物、脂質、リポソーム、ナノソーム、糖質、有機もしくは無機組成物などを含む。
いくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボにおいてレトロウイルスを根絶する組成物は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列;レトロウイルスゲノムの標的核酸配列と相補的である、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA);抗ウイルス剤またはそれらの組合わせを、有効量含む。さらに、ウイルス感染と関連し得る他の任意の症状(例えば、発熱、さむけ、頭痛、二次感染)を緩和する1つ以上の剤を、上記薬学的組成物に合わせて、または上記薬学的組成物の一部として、または別々の時間に、投与してよい。これらの剤として、抗発熱剤、抗炎症剤、抗真菌剤、駆虫剤、化学療法剤、抗生物質、免疫調節剤、またはそれらの組合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
上述した通り、本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法によって調製することができる。その原材料またはそれを得る方法にかかわらず、本明細書に記載の組成物は、その用途に合わせて製剤化され得る。例えば、上述した核酸およびベクターは、組織培養の細胞に適用するための組成物、または、患者もしくは対象に投与するための組成物として、製剤化できる。本発明の薬学的組成物はいずれも、医薬品の調製への使用のために製剤化され得る。特定の用途は、治療(例えば、HIV感染を患う対象またはHIV感染のリスクがある対象の治療)という文脈の中で後述されている。医薬として用いられる場合、任意の核酸およびベクターを、薬学的組成物の形態で投与してもよい。それらの組成物は、薬学の分野において周知の方法で調製することが可能である。また、局所的治療と全身治療のいずれが望まれるかに応じて、さらに治療される部位に応じて、様々な経路で投与することができる。投与としては、局所投与(点眼および粘膜(鼻腔、膣、および直腸を含む)への送達を含む)、肺内投与(例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送(噴霧器によるものを含む)による;気管内、鼻腔内、表皮、および経皮)、点眼投与、経口投与、または非経口投与が挙げられる。目への送達方法としては、(i)局所投与(点眼)、(ii)結膜下、眼周囲もしくは硝子体内への注射、または(iii)バルーンカテーテルもしくは手術により結膜嚢に配置された眼内挿入物による導入、が挙げられる。非経口投与としては、(i)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入、または(ii)頭蓋内投与(例えば、クモ膜下投与またはは脳室内投与)が挙げられる。非経口投与は、単回のボーラス投与の形態で行われてもよい。または、例えば、連続潅流ポンプによって行われてもよい。局所投与用の薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、座薬、スプレー、液体、粉末、などが挙げられる。従来の薬学的担体(水系、粉末系または油系の基剤、増粘剤など)が、必要であるかまたは望ましい場合がある。
的HIVに相補的なgRNA配列をコードする核酸、または、Cas9と標的HIVと相補的なガイドRNA配列をコードする核酸を含むベクターを内包しているナノ粒子として製剤化され得る。あるいは、組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9またはバリアントCas9)と、標的に相補的なガイドRNA配列を内包しているナノ粒子として製剤化され得る。
本明細書に記載の組成物は、概して、HIV感染症等のレトロウイルス感染を患う対象の治療にとって、様々な形で有用である。当該方法は、任意のHIV(例えば、HIV−1およびHIV−2)、およびそれらの組換え流行株を標的とするのに有用である。臨床的に有益な結果が得られる場合は常に、対象は効果的に処置されている。これは、例えば、疾患の症状の完全な解消、疾患の症状の重篤度の低減、または疾患の進行の減速を意味し得る。これらの方法はさらに、以下の工程を含んでもよい:a)HIV感染症を患う対象を特定する工程(例えば患者、より具体的にはヒト患者);およびb)Cas9等のCRISPR関連エンドヌクレアーゼと、HIV LTR等のHIV標的配列に相補的であるガイドRNAとをコードする核酸を含む組成物を対象に与える工程。対象は、標準的な臨床テストを用いて特定することができる。当該標準的な臨床テストとしては、例えば、対象の血清におけるHIV抗体またはHIVポリペプチドp24の存在を検出するイムノアッセイ、またはHIV核酸増幅アッセイが挙げられる。対象に与えられる組成物の量であって、感染症の症状の完全解消、感染症の症状の重篤度の低減、または感染症の進行の減速をもたらす量を、治療上有効な量とみなす。本発明の方法は、投与量および投与計画を最適化するための監視工程に加えて、結果を予測する工程も含んでもよい。本発明のいくつかの方法において、まず患者が潜伏期のHIV感染症であるか否かを判定し、その後、本明細書に記載の1つ以上の組成物を用いて患者を処置するか否かを決定してもよい。薬物耐性の発症を検出し、応答性患者を非応答性患者と迅速に区別するためにも、監視工程を利用することができる。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、患者が保有する特定のHIVの核酸配列を決定する工程、および次いでそれらの特定の配列に相補的になるようにガイドRNAを設計する工程を含んでいてもよい。例えば、対象のLTRのU3領域、R領域もしくはU5領域を決定し、次いで患者の配列に正確に相補的になるように1つ以上のガイドRNAを設計または選択し得る。
出産前、周産期もしくは出産後の授乳期に投与してもよいし、または(ii)出産前投与、周産期投与および出産後投与の、任意の組合わせであってもよい。組成物は、標準的な抗レトロウイルス療法(後述)と共に、母に投与してもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、分娩後すぐの乳児に投与してもよい。また、いくつかの実施形態において、その後一定の期間ごとに投与してもよい。上記の乳児は、標準的な抗レトロウイルス療法も受けてもよい。
ル調製物を、吸入によって宿主に与えてもよい。
本明細書に記載の組成物は、例えば、「レトロウイルス感染症(例えばHIV感染症)を患う対象またはレトロウイルス感染症(例えばHIV感染症)に罹患している対象を治療するための療法用」とラベル付けした、適切な容器に入れられてもよい。容器は、上述したとおり、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9エンドヌクレアーゼ)をコードする、例えば、AAV9発現ベクターの核酸配列を含む組成物を、収容していてもよい。配列はさらに、HIV中の標的配列に相補的なガイドRNA、またはその核酸をコードするベクター、および1つ以上の適切な安定剤、担体分子、および/または香料などを、適宜目的の用途に合わせてコードしていてもよい。したがって、パッケージ化された製品(例えば、本明細書に記載された組成物であって、保管、出荷、または販売のために、濃縮状態で、またはすぐに使用可能な濃度でパッケージ化されている組成物の1つ以上を含む滅菌容器)およびキット(本発明の少なくとも1つの組成物(例えば、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9エンドヌクレアーゼ)をコードする核酸配列と、ウイルス中の標的配列に相補的なガイドRNAまたは上記核酸をコードするベクター)、および使用上の注意書きを含む)も、本発明の範囲に含まれる。製品は、本発明の1つ以上の組成物を含む容器(例えば、ビン、ジャー、ボトル、袋など)を含みうる。それに加えて、製品はさらに、例えば、パッケージ材料、使用上の注意書き、注射器、送達装置、緩衝剤、または予防または処置が求められる状態を処置または監視する調整試薬を含んでよい。
〔実施例〕
〔実施例1:遺伝子編集によるHIV−1 DNAの切除:インビボ研究〕
潜伏感染ヒト細胞および動物疾患モデルから組み込まれたHIV−1 DNA配列を除去するために、CRISPR/Cas9遺伝子編集戦略を開発した。HIV−1 DNAの除去効率について、ウイルスゲノムを保有するマウス組織を調査した。
(AAV9送達ベクターの構築)
AAV送達システムを作成するバックグラウンドプラスミド(background plasmid)は、px601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::Bsa1-sgRNAだった(「px601」と略記する)(Ran FA, et al. Nature 2015; 520:186-191)。LTRおよびGag標的に対応するDNA配列を包含するオリゴヌクレオチドを、px601におけるBsal部位のU6プロモーターの前にクローニングした。LTRおよびGagを標的とするgRNAを図1Aに示し、さらに以下にも示し、PAM配列を太字で示す。
HIV−1 Tg26マウス胚線維芽細胞(MEF)を、妊娠17日目の胚から機械的および酵素的分離によって調製し、10%ウシ胎児血清が補充されたDMEMに維持した。MEF細胞を上述のように調製し(Behringer et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014)、HIV導入遺伝子に特異的なプライマーを使用したPCRによって遺伝子型を決定した(genotyped)(Kopp JB, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1577-1581; Dickie P, et al. Virology 1991; 185:109-119)。
Tg26 MEF細胞に、AAV−CRISPR/Cas9をMOIが105および106で形質導入させた。ウイルス接種材料はOpti-Memで調製し、最小量(6ウェルプレートにおいて、0.5mL/ウェル)で1時間ウイルスをインキュベーションし、1mLの増殖培地を加え、一晩放置した。翌日、接種材料を除去し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な増殖培地を供給した。形質導入してから1週間後、DNA分析のために細胞を回収した。
100μLのAAV9 CRISPR/Cas9またはコントロール動物へは100μLのPBSをマウスの尾静脈を通じて0日目と5日目に注入した。5日目において、1対(AAVおよびPBS)の動物について、血液試料用に眼窩後方出血させ、安楽死させて組織を回収した。別の対の動物については、AAV−Cas9またはPBSの2回目の尾静脈からの注入を行い、眼窩後方出血させてから7日目に組織の回収のために安楽死させた。組織として、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、およびリンパ球回収用末梢血を回収した。
製造業者のプロトコールにしたがって、NUCLEOSPIN Tissue kit(Macherey-Nagel)を使用して、細胞/組織からゲノムDNAを単離した。25ngのゲノムDNAについて、Terra PCR direct polymerase mix(Takara, Clontech)を用いて、次に示す条件でPCRを行った:98℃において3分間、35サイクル(98℃において10秒、68℃において1.30分)、68℃において5分間、そして1%アガロースゲルで分離させた。5μLの最初のPCR反応物を使用して、同じ条件下で、ネステッドPCR(nested PCR)を行った。PCR産生物を精製し、TAベクター(Invitrogen)にクローニングして、Sanger sequencing(Genewiz, South Plainfield, NJ, USA)に送り、参照配列としてHIV−1 NL4−3配列を使用して、Clustal Omega(EMBL-EBI)ソフトウェア(Cambridgeshire, UK)でアライメントした(aligned)。
製造業者のプロトコールに従い、TRIzol試薬(Ambion, Foster City, CA, USA)を使用して組織から全RNAを調製し、次に、RNeasy Mini Prep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用してDNAse I処理およびRNAクリーンアップを行った。次に、1μgのRNAを使用して、M-MLV逆転写反応(Invitrogen)を行った。cDNAを希釈し、細胞ラットβ−アクチン遺伝子を参照して、HIV−1 GagおよびEnv遺伝子に特異的なTaqMan qPCRを使用して定量した(プライマーについては表1を参照されたい)。qPCR条件:98℃で5分間、45サイクル(98℃で5分間、45サイクル(98℃で15秒間、取得と共に(with acquition)62℃で30秒間、72℃で1分間)。反応を行い、データは相対定量モードを使用して、LightCycler480(Roche, Basel, Switzerland)で分析した。
試験プラットフォームとして、GagのC末端およびPol遺伝子のN末端に及ぶ3.1kbの欠失(図1A)を有するHIV−1NL4−3のゲノム由来の導入遺伝子を保有する、HIV−1 Tg26トランスジェニックマウスを使用した。増殖性HIV−1複製は報告されていない一方、低レベルのウイルス転写物の発現は、疾患発症前に様々な組織で検出されている(Curreli S, et al. Retrovirology 2013; 10:92; Kopp JB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1577-1581; Santoro TJ, et al., Virology,1994; 201:147-151)。HIV−1関連腎症(HIVAN)を含む、HIV−1感染およびAIDSの選択的な臨床的特徴が観察されている(Barisoni L, et al. Kidney Int 2000; 58:173-181; Dickie P, et al. Virology 1991; 185:109-119)。マウスの早期致死性により、TgマウスをC57BL/6Lバックグラウンドと交配し、二次疾患が制限され、12月齢まで生存することができる動物を作成した。Cas9およびgRNAを発現する遺伝子の送達に関し、AAV9ベクターを選択した。AAVベクターの使用に関連する主要な課題の1つは、そのゲノム受容能力に関する。この課題を軽減するために、より小さなCas9またはホモログであるsaCas9(3.3kDa)を選択した。それは、Staphylococcus aureus由来であり、Streptococcus pyrogens由来の元のCas9(spCas9)の効率と同様の効率でゲノムを編集することができ、spCas9に比べて1kb以上短い(Ran FA, et al. Nature 2015; 520:186-191)。HIV−1 LTR(gRNA LTR 1)およびGag遺伝子(gRNA Gag D)を標的とする2つのgRNAに対応するDNA配列と共に、saCas9をコードする遺伝子をAAV9ベクターDNAにクローニングした。図1Aは、Tg26マウスにおいて導入遺伝子を作成するために除去したウイルス遺伝子領域を強調したHIV−1ゲノムの構造組織と、gRNA LTR 1およびgRNA Gag Dの位置を示す。最初のステップとして、エクスビボ研究を行い、Tg26動物由来のマウス胚線維芽細胞(MEF)の培養物を調製(develop)し、組込みHIV−1 DNA部位の切除における、saCas9/gRNAを含む組換えAAV9(rAAV9)である、rAAV9:saCas9/gRNAの能力を評価するために使用した。図1Bは、LTRについて−413/−391およびGag遺伝子について+888/+910に及ぶプライマー対(P1およびP2)を利用したPCR遺伝子増幅の結果を示す(図1A)。
160bpの増幅産物が、追加コントロールとして担う、rAAV9によるMEFの処置において産生した(レーン3)。並行研究において、切除戦略効果を、別の小動物モデル、すなわち、ラットで評価した。ラットは、マウスモデルの構築で使用した同一の導入遺伝子を包含する。ここで、rAAV9の眼窩後方経路からの接種を利用した。標的特異的PCRによって生成した増幅産物のダイレクトシークエンシングによって確認したように、30日齢のラットに5日間隔で、2.73×1012のrAAV9:saCas9/gRNAを2回注入し、循環血球の5’−LTRおよびGag遺伝子におよぶHIV−1 DNAセグメントの切除を導いた。図3A、3Bに示すように、切除されたフラグメントのいくつかのPCR産生物のシークエンシングデータの詳細な分析およびHIV−1 DNAを参照としたアラインメントによって、rAAV9:saCas9/gRNAで処置したマウスの組織において、ウイルスDNAの切除にいくつか変異が見られることを確認した。ウイルス遺伝子発現量は、定量RT−PCRを用いてGagおよびEnv転写物量を測定することによって調べた。図3A、3Bに示すように、ウイルスRNA量は、rAAV9:Cas9/gRNAで処置した動物から得られた循環血球において劇的に減少し、ウイルスゲノム切除は、HIV−1 DNAの組込みコピーのウイルス遺伝子発現量に顕著な影響を与えることを示した。リンパ節におけるウイルスRNAの結果はまた、処置ラットにおけるウイルスRNAの抑制を示した。
本明細書において証明したように、AAV9系saCas9/gRNA遺伝子編集戦略システムは、HIV−1 DNA配列を保有するトランスジェニックマウスにおける、HIV−1ゲノムの組込みコピーのセグメントを切除することができる。これらの結果は、HIV−1感染ヒト化マウスのHIV−1 DNAを編集する、saCas9/gRNAの送達におけるrAAV9の同様の能力を示す。さらに、これらの結果は、治療的rAAVで処置した動物におけるウイルスRNA産生の抑制、および血液およびリンパ節におけるsaCas9/gRNAによるウイルスゲノムの特定セグメントの切除を証明する。
本研究において、saCas9/sgRNAシステムと、効率的にHIV−1ゲノムを根絶する、保存されたHIV−1調節および構造領域を標的とするsgRNAとの組合せを最適化し、HIV−1 Tg26トランスジェニックマウスおよびEcoHIV増強ホタルルシフェラーゼ(eLuc)感染マウス(Rabinovich, B. A. et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 14342-14346; Potash, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 3760-3765, doi:10.1073/pnas.0500649102 (2005))の両方において、インビボでのHIV−1プロウイルス切除に関し、二重(duplex)対四重(quadreplex)sgRNAとsaCas9との実行可能性および有効性を試験した。さらに、オールインワン(all-in-one)AAVベクターによって送達された多重sgRNA/saCas9がインビボにおいて暴露前予防投与(PrEP)として使用し得ることを証明した。
(高効率であるgRNAのバイオインフォマティクス設計)
spCas9システムに関する拡張スペーサー配列(NNNN[20nt]NGGNNN)を提供するので、高効率のgRNA設計のために、Broad Institute gRNA designer tool(broadinstitute.org)を使用した。最適のオンターゲット切断に対するSaCas9 PAM配列は、NNGRRTである。NGG PAMを含み、確立されたspCas9システムを用い得るので、NNGRRTのみを使用した。これを試験するために、HIV−1 LTRプロモーター領域を標的とする3つのsgRNA、Gagを標的とする3つのsgRNA、およびPolを標的とする1つのsgRNAを選択した。これらのsgRNA標的に対するオリゴヌクレオチドを表2に列挙した。
pNL4-3-EcoHIV-eLuc レポーターウイルスを上述の通りに構築した(Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016); Zhang, Y. et al. Scientific reports 5, 16277, doi:10.1038/srep16277 (2015))。5’-CACCおよび3’-AAACオーバーハングを有する、各標的部位に対するオリゴヌクレオチド対(表2)は、AlphaDNA(Montreal, Canada)から得た。標的シード配列を、BsaI部位を介して、pX601- AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::BsaI-sgRNA(Addgene # 61591; Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191, doi:10.1038/nature14299 (2015))にクローニングした。pX601 AAVをBsaIで消化し、Antarctic Phosphataseで処理し、Quick nucleotide removal kit(Qiagen)で精製した。等量の相補的オリゴヌクレオチドをアニーリング用T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)バッファーに混合させた。これらのアニールしたシード対をT4 PNKでリン酸化し、T7DNAリガーゼを使用してBsaI消化AAVにライゲーションした。陽性クローンをPCRスクリーニングによって特定し、サンガーシークエンシングによって確認した。多重sgRNAクローニングに関し、2つのアプローチを構築した:2種類の制限酵素による従来のクローニングおよびIn-FusionシームレスPCRクローニングである。2種類の制限酵素による戦略において、まず標的AAVベクターをKpnIで消化および末端平滑化し、EcoRIで消化した。一方、予測されるsgRNA発現カセットを保有する伝達挿入物(transfer insert)をまず、NotIで消化および末端平滑化し、EcoRIで消化した。挿入物およびベクターをQIAquick Gel Extraction Kitによって精製後、標準のオーバーハング/平滑末端クローニングを行った。ポジティブクローンである、二重sgRNAを発現しているAAVクローンを、NotIおよびBamHIまたはEcoRIによる2種類の制限酵素によって特定した。In-Fusion PCRクローニング戦略において、標的AAVベクターをEcoRIおよびKpnIで線形化した。(新しいsgRNAのさらなる追加のために)3’末端KpnI部位に変異を有するプライマー対T795/T796(表2)および伝達sgRNA AAVベクターをテンプレートとして使用したPCRによって、挿入フラグメントを産生した。精製後、線形ベクターおよび挿入PCR産生物を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いてライゲーションした。ポジティブクローンである、二重sgRNAを発現しているAAVクローンを、NotIおよびBamHIまたはEcoRIによる2種類の制限酵素によって特定した。クローニング戦略の両方に対して同様の概念実証を用いて、二重sgRNA/saCas9ベクターは、さらなる1−nのsgRNA発現カセットを挿入する標的ベクターとして機能し得る。選択sgRNAのシード配列において、消化部位(KpnI、NotI、EcoRI)の非存在の確認が唯一1つの注意である。
HEK293T細胞を、37℃および5%CO2の加湿雰囲気下における、10%FBSおよび抗生物質(100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン)を含む高グルコースDMEMにおいて培養した。ルシフェラーゼレポーターアッセイについて、細胞を96ウェルプレートで培養(3×104細胞/ウェル)し、標準のリン酸カルシウム沈殿プロトコールを使用して、図示する(indicated)プラスミドをトランスフェクションした。48時間後、細胞を溶解し、2104 ENVISION(登録商標)Multilabel Reader(PerkinElmer)でONE-GLOルシフェラーゼアッセイシステムを用いて分析した。
PCRを使用した高スループットジェノタイピング(genotyping)を行うために、細胞を96ウェルプレートに播き、図示するベクターをトランスフェクションした。48時間後、培地を除去し、1ウェル当たり45μLの50mM NaOHで細胞を処置し、95℃で10分間インキュベートした。5μLの1M Tris−HCl(pH8.0)で中和後、0.5μLのDNA抽出物を用いて、TERRA(商標)PCR Direct Polymerase Mix(Clontech)および図示するプライマーを使用した10μLのPCR反応に使用した。EcoHIV−eLuc接種マウスから単離した組織および臓器の切除されたHIVプロウイルスDNAのジェノタイピングに関し、二次汚染を避けるために別個のはさみにより各組織を粉々にし、55℃の水浴において、1%SDS、10mMのTris(pH8.0)、5mM EDTAおよび100mM NaClから成る溶解バッファー中のプロテイナーゼKで消化させた。そしてゲノムDNAを、従来のフェノール/クロロホルム抽出法によって組織溶解物から抽出した。特定のTg26マウス組織からゲノムDNA、RNA、およびタンパク質を抽出するために、組織サンプルをすり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、製造業者のプロトコールにしたがって、NUCLEOSPIN(登録商標)Tissue kitおよびNUCLEOSPIN(登録商標)RNA/Protein kit(CLONTECH)を用いて処理し、ゲノムDNA、RNAおよびタンパク質を抽出した。PCRジェノタイピングを行うために、DNAサンプルを98℃で3分間変性させてから、1分/kbで68℃において35サイクルのアニーリング/伸長ステップを行う従来の2ステップPCRを行った。ネステッドPCRに対して、図示するプライマーを用いて22〜25サイクルの1回目の反応を行い、ネステッドPCRプライマーを用いて35サイクルの2回目のPCR反応を行った。
図示する臓器/組織の全RNAは、製造業者の指示に従って、RNeasy Mini kit(Qiagen)を使用して抽出した。残留する可能性があるゲノムDNAを、RNase-Free DNase Set (Qiagen)を使用したオンカラムDNase消化によって除去した。各サンプルにつき1μgのRNAについて、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Invitrogen, Grand Island, NY)を使用して、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーを用いてcDNAに逆転写させた。cDNAまたはHIVゲノムDNAの定量PCR(qPCR)分析を、SYBR(登録商標)Green PCR Master Mix Kit(Applied Biosystems)を使用して、LightCycler480(Roche)で行った。saCas9、Gag、Env、Tatに対するプライマー対を表2に示すように設計した。ヒトβ2ミクログロブリンおよびマウスPpiaハウスキーピング遺伝子に対するプライマーはRealTimePrimers(Elkins Park, PA)から得た。HIV切除定量に対するプライマーは図18A〜18Cに示すように設計した。各サンプルは3連で試験した。サイクル閾値(Ct)値は、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子に関する図から得た。ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子間のCt値の違いは、ΔCt値として示した。ΔΔCt値は、実験サンプルのΔCt値から、コントロールサンプルのΔCt値を引いて得られた。遺伝子発現またはHIV DNA切除における相対倍率または割合は2−ΔΔCtとして計算した。いくつかの場合において、増幅曲線および融解ピーク曲線を、比較分析に使用した。
AAV−DJおよびAAV−DJ/8の少量および大量の調製は、公開されているプロトコール(Zolotukhin, S. et al. Gene Ther 6, 973-985 (1999))に従って、ViGene Biosciences Inc.(Rockville, MD)でのAAV産生サービスによって行った。簡潔に示すと、HEK293T細胞に3つのベクターをコトランスフェクションし、イオジキサノール勾配超遠心分離によってウイルス粒子を回収および精製した。ウイルスを濃縮し、リン酸緩衝食塩水で製剤化した。ウイルス力価は、線形ゲノムプラスミドを標準としたリアルタイムPCRを使用して、1mLのサンプル中のウイルスゲノムコピー数(GC/mL)によって決定した。
すべての動物実験および手順は、ピッツバーグ大学またはテンプル大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認された。ヒト胎児肝臓、胸腺および同性の肝臓から単離されたCD34+細胞が移植された、NSG(登録商標)株を基にしたヒト化BLTマウスをJackson Lab(Bar Harbor, ME)から購入した。感染に関し、イソフルラン吸入を通じて(2L/分の酸素流量と共に、2〜2.5%)、マウスを麻酔した。中サイズのピペットチップを使用して、膣管に20μLのウイルス上清をゆっくりとピペッティングすることによって、膣内接種(マウス1匹当たり全量1×106TCIUのHIVNL−BaL−eLuc)を行った。29ゲージのニードルおよびインスリンシリンジを使用して、100μLの図示するウイルス力価を腹腔内に注入することによって、腹腔内接種(マウス1匹当たり全量1×105TCIUのHIVNL−BaL−eLuc)を行った。BLTマウスにおけるHIV感染は、インビボBLIを用いて可視化し、長期的なHIV伝播を示した。AAV-DJ/8/Cas9-sgRNA投与前の少なくとも70日間以上、インビボで検出できるHIV−レポーター活性が存在しない可能性のある潜伏を示すために、選択したHIV感染BLTマウスを予め測定した。
Tg26トランスジェニックマウスにおけるsgRNA/saCas9遺伝子送達効率および機能アッセイについて、100μLの未精製AAV−DJ血清型、または、全量100μLである、血清を含まない1×DMEMで希釈した5μLの精製AAV−DJ/8血清型を、尾静脈を通じて動物に注入した。AAV−DJを注入したマウスについて、グループ1を犠牲にし、グループ2には最初の注入から1週間後にさらに注入した。グループ2は2回目の注入から1週間後に犠牲にした。コントロールマウスには、空ベクターを有するAAVウイルスを注入した。AAV−DJ/8を注入したマウスについて、グループ1およびグループ2間の間隔は2週間だった。選択した臓器の組織サンプルを、すり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、ユーザーマニュアルに従って、NUCLEOSPIN(登録商標)Tissue kitおよびNUCLEOSPIN(登録商標)RNA/Protein kit(CLONTECH)を用いて処理し、ゲノムDNA、RNAおよびタンパク質を抽出した。
ウイルス接種してから図示する時点でイメージングを開始した。すべてのイメージング中、イソフルラン吸入を通じて(2L/分の酸素流量と共に、2〜2.5%)、マウスを麻酔した。D−ルシフェリンカリウム塩(Gold BioTechnology, Olivette, MO)を滅菌PBSに溶解し、150mg/kg体重の用量で腹腔内注入した。生物発光イメージを、IVIS Lumina XR小動物光学イメージングシステム(Perkin Elmer, Hopkinton, MA)を用いて、2分間得た(光フィルター開、ビニング8×8、f/stop 1、視野100mm)。
すべてのイメージ分析は、Living Image 4.3.1を用いて行った。関心領域(ROI)は、測定領域のまわりまたは比較用に動物全体のまわりに設定し、平均輝度値(ユニット:p/s/cm2/str)をすべてのイメージ評価に用いた。画像に関し、イメージをウインドーに表示させ、マウスに隣接する背景レベル上の光出力すべてを見た。最大輝度値110,000p/s/cm2/strをイメージングスケールの最高位(high end)として選択し、背景カットオフを6,000p/s/cm2/strに設定し、これはウイルス接種前の2つの異なる時点においてイメージングした、マウスの平均光放出だった。
選択した臓器の組織サンプルを、すり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、ユーザーマニュアルに従ったゲノムDNA、RNAおよびタンパク質の抽出に続いて、NUCLEOSPIN(登録商標)Tissue kitおよびNUCLEOSPIN(登録商標)RNA/Protein kit(CLONTECH)を使って処理した。抽出した組織を、殺菌し、汚染物質が存在しないはさみを使って細かく刻み、プロテイナーゼKおよび1%SDSを含む溶解バッファー(2.5mM Tris−塩基、5mM EDTA、5mM NaCl、pH8.0)に加え、55℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、得られた混合物を、一定量のフェノール:CHCl3:イソアミルアルコール(25:24:1)で10分間反転(inversion)させて抽出を行った。混合物を10分間12,000RPMで遠心分離させ、水相を除去し、再度一定量のCHCl3:イソアミルアルコール(24:1)で抽出を行い、遠心分離で分離した。抽出したDNAを沈殿させるために、一定量のイソプロパノールを除去した水相に加え、混合物を15分間反転させた。DNAを10分間12,000RPMで遠心分離させて、ペレット化した。次に、DNAペレットを、75%エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。ほぼ乾燥させて、TEバッファー(pH8.0)をペレットに加え、55℃で一晩分離した(resolved)。
関心があるバンドをゲル精製し、pCRII T−Aベクター(Invitrogen)内にダイレクトクローニングし、個々のクローンの核酸配列をユニバーサルT7および/またはSP6プライマーを使用して、Genewizにおけるシークエンシングによって決定した。
細胞を4%パラホルムアルデヒドで、続いてモノクローナル抗HA抗体(1:200、Proteintech, Cat# 66006-1-Ig)による標準の免疫細胞化学で固定した。Hoechst陽性核と比較した、saCas9−HA陽性細胞の割合を、3ウェルに対して、1ウェル当たり6つの無作為領域において定量した。免疫組織化学に関し、急速凍結した組織/臓器を10μmのクリオスタット切片にし、10分間4%パラホルムアルデヒドで固定した。洗浄後、0.5%のTriton X-100で透過させ、10%正常ロバ血清でブロッキングし、0.1%のTriton X-100を含むPBS中のウサギ抗HAポリクローナル抗体(1:100、Proteintech, Cat# 51064-2-AP)で、切片を一晩4℃でインキュベートした。10分間で3回洗浄後、切片を対応するALEXA FLOUR(登録商標)コンジュゲートロバ二次抗体(1:500;Invitrogen, Grand Island, NY)およびファロイジン(100nM;Cat. # PHDR1 cytoskeleton, Inc.)を用いて、室温で1時間インキュベーションした。核の対比染色にHoechst 33258を用いた。
定量データは2〜4の独立した試験からの平均±標準偏差(SD)を示し、スチューデントt検定によって評価した。<0.05または<0.01であるp値は、統計学的に有意に異なるとした。EcoHIV感染マウスモデルにおけるBLIデータに関し、スチューデントt検定および線形混合効果モデルを、背側および腹側の両方それぞれからのBLIによって測定された、saCas9+EcoHIVおよびEcoHIV間の経時の全光子流速変化の比較に使用した。
(saCas9/sgRNAシステムは効率的にHIV−1プロウイルスDNAを切除する)
saCas9システムの有効性を測定するために、HIV−1 LTR(図4A)を標的とする3つのsgRNAを、最適のPAM NNGRRNを使用して選択した。EcoHIV−eLucレポーターアッセイおよびダイレクトPCRジェノタイピングを記載のとおり行った(Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016))。機能的レポーターアッセイおよびPCRジェノタイピングによるHIV−1の成功した切除をより確実に特定するために、sgRNA組合せ法を採用した。図4Bに示すように、saCas9の存在下、選択した3つのLTR sgRNA間のすべての組合せで、EcoHIV−eLuc活性がほぼ完全になくなった(95〜99%まで)。これらの設計したsgRNAに対するsaCas9 PAMがspCas9システムと同じPAM(NGG)を利用しているので、これらのシード配列をレンチウイルス(LV)−WGベクターにクローニングした(Yin, C. et al. Functional screening of guide RNA targeting the regulatory and structural HIV-1 viral genome for a cure of AIDS. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016))。これは、saCas9のsgRNA配列とは異なるcrRNA-loop-tracRNA(=sgRNA)配列を保有する(Ran, FA, et al. (2015). Nature 520: 186-191; Nishimasu, H, et al. (2015). Cell 162: 1113-1126)2, 21。そして、saCas9/sgRNAとspCas9/sgRNAとのHIV−1切除効率を比較した。並列の(side-by-side)トランスフェクションおよびEcoHIV−eLucレポーター研究は、これらの3つの組合せ法とのspCas9は、ルシフェラーゼ活性の減少に対して大きく効果を示さなかった(図4B)。spCas9と比較したsaCas9のすばらしい結果は、これまでの報告と一致する(Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191 (2015); Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015))。spCas9と比較したsaCas9の高効率は、次のいくつかの要因に起因し得る:(1)単一のベクターに存在することによる、同じ細胞におけるsgRNAとsaCas9の高い共発現;(2)小さなサイズであるsaCas9により高い遺伝子送達効率が可能であり得る;(3)saCas9の内在性ヌクレアーゼは、DSB作製の点で活性が強い(Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191 (2015); Nishimasu, H. et al. Cell 162, 1113-1126 (2015))。saCas9およびspCas9の両方におけるLTR sgRNAの組合せによる効率的な根絶は、PCRジェノタイピングおよびサンガーシークエンシングによってさらに確認された(図4C)。
spCas9/sgRNAシステムを用いて、より容易なPCRジェノタイピング、および、Gag、Pol等のウイルス構造遺伝子(Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016))とのLTR sgRNA組合せによるより効率的なHIV−1根絶を立証した。これがさらにspCas9/sgRNAシステムに応用可能か試験するために、GagまたはPolを標的とするsgRNAを、3つのLTR sgRNAのうちの1つと組み合わせた。GagまたはPol sgRNAと、LTR−1または−3とのすべての組合せにおいて、細胞培養物中でEcoHIV−eLuc活性の強力な減少を誘導した(図4D)。LTR−2およびGagDの組合せも強力な減少を誘導したが、GagB、GagCおよびPolBとの組合せは、レポーター活性の減少への効果は低かった(図4D)。5’−LTRまたは3’−LTRのプライマー対によるダイレクトPCRジェノタイピングによって、すべてのsgRNA組合せの切断効率を確認した(図4E)。フラグメント欠失をさらに確認し、四重sgRNA(以下を参照されたい)の合理性を提供するために、LTR−1およびGagDとの組合せを、TAクローニングおよびサンガーシークエンシングの典型として選択した。結果は、2つの標的部位の切断後の、フラグメントの予測配列を示した(図11A〜11C)。これらのデータは、saCas9システムに対して選択されたすべてのsgRNAが、予測される標的部位においてDSBを作製するうえで効率が高かったことを示す。また、LTR sgRNAとウイルス構造領域を標的とするsgRNAとの組合せが、機能的切除の様々な程度を誘導したことを示す。
上述に示した2つのsgRNAの組合せについて、2つの個別のプラスミドは、コトランスフェクションの間、同じ細胞内に送達され得ない。HIV−1根絶および抑制の最大効率を確実にするために、LTR−1およびGagDの組合せを選択した。そして、レポーター低減の効率を、2つの単一sgRNAを発現しているベクターのコトランスフェクションと、二重sgRNAを発現しているベクターのトランスフェクション間で比較した。より小さなサイズのsaCas9(3.159kb)は、効率的なAAVパッケージングおよび遺伝子送達のために、単一のAAVベクターが、2つのsgRNAを発現するカセットおよびsaCas9発現カセットを保有することを可能にする(Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015))。図5Aに示すように、二重sgRNA/saCas9ベクターのトランスフェクションによってさらに、2つの独立した単一sgRNA/saCas9ベクターのコトランスフェクションと比べて、ルシフェラーゼレポーター活性の減少を誘導した。レポーターDNAの切断をPCRジェノタイピングによって確認した。そして、野生型バンドと比較した切断されたフラグメントバンドの割合は、2つの独立したsgRNA/saCas9ベクターよりも、二重sgRNA/saCas9ベクターにおいて、より強い切断能力を示した(図5B)。二重sgRNA/saCas9の際立った効果はおそらく、同じ細胞においてこれらの3つの組成の共発現に起因し得る。
一重(monoplex)および二重sgRNA/saCas9 AAVベクターのパッケージングの成功は近年報告されている(Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015))。二重sgRNA/saCas9が発現しているカセット(4.969kb)は、AAVウイルスのパッケージング限界に近い((一般的に5〜5.2kb)Wu, Z., et al. Mol Ther 18, 80-86 (2010))。しかしながら、5.2〜8.9kbに及ぶゲノムサイズについて、いくつかの導入遺伝子において、インビトロおよびインビボの両方で効率的なAAVパッケージングおよび遺伝子送達が報告されている(Allocca, M. et al. J Clin Invest 118, 1955-1964 (2008); Grieger, J. C. & Samulski, R. J. J Virol 79, 9933-9944 (2005); Wu, J. et al. Hum Gene Ther 18, 171-182 (2007))。四重sgRNA/saCas9発現カセット(5.716kb)がAAVウイルス内に効率的にパッケージングされるか否かを試験した。次の理由でAAV−DJ血清型を選択した:(1)8つの天然AAV血清型(AAV−2、AAV−4、AAV−5、AAV−8、AAV−9、トリAAV,ウシAAV、およびヤギAAV)の特徴を組み合わせ、よりよい形質導入効率を導き、標的細胞/組織の範囲を広げる(Grimm, D. et al. J Virol 82, 5887-5911 (2008));(2)抗体中和化を避けることができる(Bartel, M., et al. Front Microbiol 2, 204 (2011));(3)インビボにおけるCas9/sgRNA媒介HIV−1根絶に対して、肝臓への最も高い形質導入効率を提供する。肝濃縮は、HIV−1プロウイルスがインビボにおいて切除し得る概念実証を証明するのに不可欠である。二重sgRNA/saCas9に対して、HEK293T細胞のウイルス力価は予測されるとおり、PCRによって決定された4.15〜4.3×1013ゲノムコピー(GC)/mL(未精製粗溶解物)のゲノム力価、および、HAタグsaCas9タンパク質を検出する抗HA抗体を用いた免疫細胞化学による、4.4〜9.7×108導入ユニット(TU)/mLの機能的力価だった。四重sgRNA/saCas9に対して、同様のゲノム力価である4.2×1013GC/mLが、二重sgRNA/saCas9と比較して、2.5×108TU/mLの機能的力価の1.8〜3.9倍のみだった(図11A、11B)。これらのデータは、生成した5.7kbのゲノムである四重sgRNA/saCas9 AAVが、saCas9タンパク質の機能的発現を有して、哺乳動物細胞に効率的に感染し得るAAV−DJウイルス内へのパッケージングが成功し得ることを示す。
HIV−1 Tg26トランスジェニックマウスは、部分的なGagおよびPol遺伝子におよぶ3.1kbの欠失を有する、pNL4−3プロウイルスゲノムの10を超えるコピー数が組み込まれた座を含むように以前構築され、ウイルス複製が不能の状態である(Dickie, P. et al. Virology 185, 109-119 (1991))。Tg26マウスは、よく特徴づけられた腎臓疾患(Kopp, J. B. et al. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1577-1581 (1992); Haque, S. et al. Am J Pathol 186, 347-358 (2016))、発症の可能性がある特徴づけられていない神経および心血管欠陥(Cheung, J. Y. et al. Clin Transl Sci 8, 305-310 (2015))、および他の疾患を発症する。インビボ研究の前に、Tg26トランスジェニックマウスから単離した神経幹/前駆細胞(NSC/NPC)を使用して、多重sgRNA/saCas9のHIV−1切除効率を評価した。NSC/NPCを使用する論理的証拠は、NSC/NPCにおけるHIV感染/潜伏に対する累積証拠であり、HIV関連神経認知障害に関連し得る。sgRNA/saCas9 AAV−DJ注入後のマウスNSC/NPCにおける抗HA抗体による免疫細胞化学は、一重sgRNA/saCas9 AAV−DJが、10の機能的MOI(fMOI)による接種後20日目における測定によって92.3%の細胞を感染させ、この数字は1.8×105gMOIと等しく、NSC/NPCの感染においてAAV−DJウイルスが高効率であることを示した。二重(=6.5×105gMOI)または四重(=2.1×106gMOI)sgRNA/saCas9 AAV−DJの等量のfMOI(図12A、12B)は、それぞれ、約87.63%および90.52%の同様の感染効率であった(図6A〜6C)。その後、培養NSC/NPCでの組込みHIV−1プロウイルスDNAの切除における二重および四重sgRNA/saCas9の両方の効率を測定した。saCas9およびsgRNAの用量依存的送達は、AAV−DJ感染してから2日目のPCR分析によって確認した(図6D、6E)。そして、HIV−1切除効率をPCRジェノタイピングによって評価した。二重および四重sgRNA/saCas9の両方とも、AAV感染から2日目において予測されるDNAフラグメントが用量依存的に欠失したが、四重sgRNA/saCas9は、等量のfMOIを使用したときに切断効率が高かった(図6F)。saCas9/sgRNAの持続的な発現および累積的なゲノム編集を導く、長期AAV導入によって、感染後20日目において切断効率が劇的に上昇した(図6G)。再び、四重は、類似の感染効率にもかかわらず、高効率のHIV−1を誘導した(図6B、6C)。これらのデータは、AAV媒介多重sgRNA/saCas9が、HIV−1 Tg26トランスジェニックマウス由来培養NSC/NPCにおいて組込みHIV−1プロウイルスゲノムを効率的に切除でき、特大の四重sgRNA/saCas9 AAV−DJが高効率の遺伝子導入および機能的なゲノム編集を保有することが示す。
Cas9/sgRNAが、インビボにおける組込みHIV−1プロウイルスDNAを根絶することができるか否かを試験するために、肝臓において最も高い伝染力で組織の広範囲を感染させることができるAAV−DJ血清型を選択した(Grimm, D. et al. J Virol 82, 5887-5911 (2008); Mao, Y. et al. BMC Biotechnol 16, 1 (2016))。図13Aに示すように、尾静脈注入によるAAV−DJウイルス(4.15〜4.20×1012GC)の単回投与は、sgRNAおよびsaCas9が発現しているcDNAを1週間のみで肝臓および脾臓に効率的に送達できた。肝臓の組織病理学的および免疫組織学的調査によって、いかなるAAV関連組織毒性は特定されなかった。観察された高形質導入効率および最小組織毒性は、成熟マウスで同様の用量を使用した報告と一致している。しかしながら、最初の注入から1週間後のさらなる同じ用量の注入によって、遺伝子送達の一致したパターンは見られなかった(図13B)。saCas9と共に二重または四重sgRNAを保有するAAV−DJは、四重sgRNA/saCas9の挿入物がAAVパッケージング能力の限界を超えていると思われるにもかかわらず、多くの臓器において同様の遺伝子送達効率が得られた(図13A、13B)。動物組織/臓器の組込みHIV−1ゲノムの切断におけるsgRNA/saCas9の効率を測定するために、フラグメント欠失を増幅することができ、上述で証明した根絶事象を確認することができるプライマー対を用いてPCRジェノタイピングを行った。5’−LTR/Gag欠失に関し、ネステッドPCR増幅を用いたときでさえ、感染から1週間後にフラグメント欠失は観察されず、これはインビボAAV送達してから1週間においてCas9の発現量が低かったことによる可能性がある。しかしながら、ネステッドPCR分析を行った後(図13C)、様々な程度のフラグメント欠失の様々な程度が多くの臓器/組織、特に肝臓、骨髄、および脾臓において観察された(図13D)。最初の感染から7日目におけるさらなるAAV感染によって、多くの臓器/組織において切断効率が上昇した(図13D)。フラグメント欠失のサイズは組織/臓器で変動し、組織/臓器間におけるDNA修復事象が異なる可能性が暗示された。これらのフラグメント欠失を典型的なバンドのT−Aクローニングおよびサンガーシークエンシングによって確認した(図13E)。再び、二重および四重sgRNA/saCas9 AAV−DJの両方において、主に肝臓でフラグメント欠失の同様のパターンを誘導した一方、他の臓器ではフラグメント欠失のパターンが変動した(図13D)。
Tg26マウスについて上述に示すように、四重sgRNAカクテルはAAVウイルスに効率的にパッケージングされ得、インビトロおよびインビボの両方において宿主ゲノムのHIV−1プロウイルスDNA全体を効率的に切除する。これらの結果は、AAV−sgRNA/saCas9アプローチによる全身のHIV感染の実行可能性および有効性のさらなる試験を促進させた。しかしながら、これは、HIV−1プロウイルスコピー/座、ランダム組込み、感染細胞種の稀有および高頻度の変異の点で、臨床HIV感染/潜伏を繰り返していない。AAV−sgRNA/saCas9アプローチによる全身のHIV感染後のHIV−1切除の実行可能性および有効性をさらに試験するために、EcoHIV−eLucレポーターウイルスを、ヌードマウスモデルである従来のNCr株に感染させるために使用した(Potash, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 102, 3760-3765 (2005); Kelschenbach, J. L. et al. J Neuroimmune Pharmacol 7, 380-387 (2012))。右眼における眼窩後方注入によるEcoHIV−eLuc接種(全量250ngのHIV p24/マウス、n=3)後すぐに、単回投与のAAV−DJ/8(3.07×1012GC/マウス)を、EcoHIV接種後すぐに同じ注入部位による各マウス(n=3)に注入した。別の3つのNCrマウスには、ネガティブコントロール群として、同じ用量のEcoHIV−eLucのみを注入した。生きている動物における長期的な生物発光イメージング(BLI)を、接種後6日目から開始し、EcoHIV−eLuc接種後19日間にわたって行った(図8A〜8D)。AAVDJ/8感染なしのコントロール群(n=3)と比較して、EcoHIV−eLucレポーター活性の有意な減少が、首リンパ節および注入を行った右眼の周囲組織で観察された(図8A)。saCas9処置マウスにおけるEcoHIV感染細胞集団の減少は、マウス全体または右眼領域からのイメージングシグナルのインビボ測定によって、9日目と19日目の両方において、統計学的に有意(p<0.05)である(図8Bおよび8C)。統計学的な有意性に対する線形混合モデルを使用して、19日間全体に対するHIV−1切除のsaCas9/gRNAの有効性を比較した。ネガティブコントロール群と比較して、AAV−sgRNA/saCas9処置によるEcoHIV−eLuc感染の減少は、実験全体コース間の、背側(p<0.011)および腹側(p<0.014)における首リンパ節からの生物発光出力によって測定されるように、統計学的に有意である(図8D)。
より臨床的に関連がある動物モデルにおいてHIV−1プロウイルスを切除するsaCas9/sgRNAゲノム編集の実行可能性を実証するために、saCas9/sgRNAを保有するAAV−DJ/8を、R5−、M向性HIVNL−BaL−eLucレポーターウイルスを膣粘膜伝播(n=3、マウスID=B5M2、B5M3およびB6M3)または腹腔内注入(n=3、マウスID=B7M2、B7M4およびB10M4)を介して接種したヒト化BLTマウスに投与した。これらのBLTマウスにおけるHIV−1播種の時空間的動態を可視化し、ニッチにおける可視化した5つの単一細胞の感度を用いて、全身BLIから長期的に分析した(Song, J, et al. (2015). J Gen Virol 96: 3131-3142)。これらのBLTマウスは、局所または全身のHIV伝播いずれかについて一定の度合いを示したが、感染は縮小し、最初の60日後には完全になくなり、続く70日以上において全身のBLI調査によって測定されたいかなる目で分かる感染はなかった。この現象はおそらく、T細胞枯渇、HIV−1潜在またはHIV−1複製中の変異によるeLucレポーターのサイレンシングの可能性に起因し得る。いくつかの組織においてネステッドPCRによって検出されたHIV−1ゲノムがなかったので(図7A〜7F)、サイレンスレポーター発現への変異の寄与は少ないと考えられる。四重sgRNA/saCas9 AAV−DJ8を、HIV感染BLTマウスであるB5M2およびB5M3に、静脈内経路および膣内経路の両方によって投与した。ネガティブコントロールマウスであるB6M3と併せて、B5M2およびB5M3に膣粘膜を通じてHIV−1を接種し、HIV感染BLTマウスであるB7M2およびB7M4マウスには、AAV−DJ8の静脈内注入のみ行った。ネガティブコントロールマウスであるB10M4と併せて、B7M2およびB7M4に腹腔内注入によってHIV−1を接種した。AAV送達してから2〜4週間後に、BLTマウスを犠牲にし、上述のとおり、PCRジェノタイピング用に、主要な臓器/組織からゲノムDNAサンプルを抽出した。回収した臓器/組織におけるHIV−1プロウイルスDNAの存在を、5’−LTR/Gagプライマー対(T361/T458およびT361/T946)を使用したネステッドPCRによって確認した(図7A〜7F)。重要なことは、膣、心臓、肺、右眼(AAV注入部位)、結腸、および残った腎被膜下のヒト胸腺オルガノイドにおいて、5’−LTR/Gagプライマー対T361/T946およびGag/3’−LTRプライマー対T758/T363の両方でフラグメント欠失が観察されたことである(図7A、7B、7D、7E)。特に、完全なプロウイルスDNAと比較して、フラグメント欠失を示すより高い強度のバンドが、B5M3マウスの心臓および膣管等の、同じ組織で観察された(図7B)。この結果は、四重sgRNA/saCas9 AAV−DJ/8の単回のi.v.注入による、固体組織内の潜伏感染ヒト細胞における、HIV−1プロウイルスDNAの効率的な切除を明らかに示す。これらのPCR産生物のTAクローニングおよびサンガーシークエンシングによって、フラグメントの欠失が確認された:(図20Aおよび20B)プライマー対T361/T946を使用した5’−ネステッドPCRからのPCR産生物;(図21Aおよび21B)プライマー対T758/T363を使用した3’−ネステッドPCRからのPCR産生物。5’−LTR/Gag領域(図20A、20B)およびGag/3’−LTR領域の両方における切断して残留する配列内に、様々な長さの挿入物または欠失物が、標的sgRNAのPAMから3番目のヌクレオチドにおける予測される切断部位間で観察された(図20A、21A)。前臨床データのこれらのセットは、四重sgRNA/saCas9がAAV−DJ8によって、ヒト化マウスモデルの多くの組織/臓器に残留するHIV−1潜伏感染ヒト細胞内に送達されて、組込みHIV−1プロウイルスDNAを切除し得るという概念実証を証明する。
本研究において際立った知見は、オールインワンAAV−DJまたはAAV−DJ/8ベクターにより送達されるsaCas9および多重sgRNAを用いた、動物モデルにおける、宿主ゲノムのHIV−1プロウイルスDNAの効果的な根絶である。これらのウイルスは、HIV−1 Tg26トランスジェニックマウスおよびEcoHIV−eLuc急性感染マウスにおいて、インビトロおよびインビボ両方において、効果的な遺伝子送達およびHIV−1プロウイルス根絶を誘導した。遺伝子治療におけるAAVの臨床応用を基に、本研究は、HIV−1/AIDS患者を処置する新規の治療方法を提供する。さらに、容易な多重sgRNAのクローニング、急速なレポータースクリーニング、確実なダイレクトPCRジェノタイピング、および高効率であるAAVウイルス産生は、個別化医療およびプレジションメディシン(precision medicine)におけるsaCas9/sgRNAゲノム編集の臨床応用を提供する。多重sgRNAを用いて同時に複数のHIVプロウイルスDNAを標的とすることは、同じHIVプロウイルスゲノムにおいて2つの異なる標的配列の二重変異の可能性が比較的低いので、HIV−1複製中高い割合の変異によるHIVの逃避(escape)を防ぐのに有益である。最後に、2つのLTR標的部位(5’末端および3’末端の両方)と、2つの構造標的部位(GagおよびPolに保存されている)を組み合わせた、四重sgRNA/saCas9戦略は、HIV−1感染の臨床患者において変異の割合が高いにもかかわらず、HIV−1ゲノム全体中の複数のInDel変異およびフラグメント欠失の可能性を最大化するために、個別化医療においてHIV−1根絶のための有望な療法の候補である。この四重の戦略(quadruplex strategy)はさらに、次の利点を提供する:(a)HIV−1逃避の可能性を大幅に減少させる、(b)継続的なプロウイルス変異にかかわらず、臨床HIV−1患者人口におけるHIV−1切除の高確率、(c)標的遺伝子またはゲノムのかなりの部分の除去による、確実な機能喪失、および(d)最適な切除効率である。
Claims (46)
- 遺伝子編集剤と、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)とをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、当該gRNAが、コードおよび/または非コードレトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、レトロウイルス群に特異的な抗原の標的核酸配列、またはそれらの組合せを含む、レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、組成物。
- 上記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、またはそれらの誘導体である、請求項1に記載の組成物。
- 上記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJまたはDJ/8である、請求項1または2に記載の組成物。
- 上記AAVベクターが、AAV血清型9(AAV9)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記遺伝子編集剤が、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ、またはそのホモログである、請求項1に記載の組成物。
- 上記CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、Cas9またはそのホモログである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記gRNAが、上記レトロウイルス遺伝子配列の長い末端反復(LTR)、群に特異的な抗原、またはそれらの組合せに相補的である、請求項1に記載の組成物。
- 上記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項1に記載の組成物。
- 上記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナウイルス、馬伝染性貧血ウイルスまたはヒトT細胞白血病ウイルスである、請求項8に記載の組成物。
- 上記標的配列が、上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復(LTR)内の配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復(LTR)内の配列が、U3、R、またはU5領域内の配列を含む、請求項10に記載の組成物。
- 上記群に特異的な抗原が、ヒト免疫不全ウイルスコードおよび/または非コード核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記群に特異的な抗原が、gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev、またはそれらの断片を含む少なくとも1つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- トランス活性化小RNA(tracrRNA)をコードする配列をさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 上記トランス活性化小RNA(tracrRNA)配列が、上記ガイドRNAをコードする配列と融合する、請求項14に記載の組成物。
- 核局在シグナルをコードする配列をさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 遺伝子編集剤と、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)とをコードする単離核酸を含む発現ベクターであって、当該gRNAが、コードおよび/または非コードレトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、レトロウイルス群に特異的な抗原の標的核酸配列、またはそれらの組合せを含む、レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、発現ベクター。
- 上記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、またはそれらの誘導体である、請求項19に記載の発現ベクター。
- 上記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJまたはDJ/8である、請求項19または20に記載の発現ベクター。
- 上記AAVベクターが、AAV血清型9(AAV9)である、請求項21に記載の発現ベクター。
- 上記遺伝子編集剤が、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ、またはその相同体である、請求項19〜22のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記CRISPR関連エンドヌクレアーゼが、Cas9またはその相同体である、請求項23に記載の発現ベクター。
- 上記gRNAが、上記レトロウイルス遺伝子配列の長い末端反復(LTR)、群に特異的な抗原、またはそれらの組合せに相補的である、請求項19〜24のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項19〜25のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナウイルス、馬伝染性貧血ウイルスまたはヒトT細胞白血病ウイルスである、請求項26に記載の発現ベクター。
- 上記標的配列が、上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復(LTR)内の配列を含む、請求項19〜27のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復(LTR)内の配列が、U3、R、またはU5領域内の配列を含む、請求項28に記載の発現ベクター。
- 上記群に特異的な抗原が、ヒト免疫不全ウイルスコードおよび/または非コード核酸配列を含む、請求項19〜29のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記群に特異的な抗原が、gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev、またはそれらの断片を含む少なくとも1つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項28〜30のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- トランス活性化小RNA(tracrRNA)をコードする配列をさらに含む、請求項19〜31のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 上記トランス活性化小RNA(tracrRNA)配列が、上記ガイドRNAをコードする配列と融合する、請求項32に記載の発現ベクター。
- 核局在シグナルをコードする配列をさらに含む、請求項19〜33のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む、請求項19〜34のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つを含む、請求項19〜35のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ;プロウイルスDNAの第1標的プロトスペーサー配列に相補的である第1スペーサー配列を有する第1ガイドRNA(gRNA);当該プロウイルスDNAの第2標的プロトスペーサー配列に相補的である第2スペーサー配列を有する第2gRNAを含む、単離核酸配列であって、当該第1標的プロトスペーサー配列および当該第2標的プロトスペーサー配列が当該プロウイルスDNAの長い末端反復(LTR)に位置する、単離核酸配列。
- 上記単離核酸配列が2つ以上の標的配列を標的とし、当該2つ以上の標的配列間の介在ウイルス配列を切除する、請求項37に記載の単離核酸配列。
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ;プロウイルスDNAの第1標的プロトスペーサー配列に相補的である第1スペーサー配列を有する第1ガイドRNA(gRNA)をコードする単離核酸配列;当該プロウイルスDNAの第2標的プロトスペーサー配列に相補的である第2スペーサー配列を有する第2gRNAをコードする単離核酸配列、を含む単離核酸配列をコードする発現ベクターであって、当該第1標的プロトスペーサー配列および当該第2標的プロトスペーサー配列が当該プロウイルスDNAの長い末端反復(LTR)に位置する、発現ベクター。
- 対象のレトロウイルスを不活性化する方法の方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、1つ以上のガイドRNAをコードする発現ベクターとを含む組成物を、上記対象に投与する工程を含み、当該ガイドRNAが当該レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、方法。
- ヒト免疫不全ウイルス感染を患う対象を治療する、またはヒト免疫不全ウイルス感染のリスクがある対象のヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを低減する方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、1つ以上のガイドRNAとをコードする発現ベクター含む組成物を治療上有効な量、当該対象に投与する工程を含み、当該ガイドRNAがレトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、方法。
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ;プロウイルスDNAの第1標的核酸配列に相補的である核酸配列を有する第1ガイドRNA(gRNA);当該プロウイルスDNAの第2標的核酸配列に相補的である第2核酸配列を有する第2gRNA;当該プロウイルスDNAの第3標的核酸配列に相補的である第3核酸配列を有する第3gRNA;当該プロウイルスDNAの第4標的核酸配列に相補的である第4核酸配列を有する第4gRNA、またはそれらの組合せを含む単離核酸配列を含む組成物であって、当該第1標的核酸配列および当該第2標的核酸配列が当該プロウイルスDNAの長い末端反復(LTR)に位置し、当該第3および第4標的核酸配列が構造タンパク質をコードする核酸配列に位置する、組成物。
- 上記単離核酸配列が2つ以上の標的配列を標的とし、当該2つ以上の標的配列間の介在ウイルス配列を切除する、請求項42に記載の組成物。
- 構造タンパク質をコードする上記核酸配列が、gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev、またはそれらの組合せを含む少なくとも1つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項42または43に記載の組成物。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性を有する配列を含む、請求項42〜44のいずれか1項に記載の組成物。
- gRNAが配列番号1〜76のいずれか1つを含む、請求項42〜45のいずれか1項に記載の組成物。
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