CN113528514B

CN113528514B - 基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术

Info

Publication number: CN113528514B
Application number: CN202010321783.9A
Authority: CN
Inventors: 李轩; 张牛冰; 荆新云
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN113528514A

Abstract

本发明揭示了一种基于CRISPR‑Cas12a干预阻断逆转录生物体的逆转录转座的技术，以及用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系及其应用。本发明还揭示了用于有效检测逆转录生物体在细胞内转座情况的测试模型及测试方法，以Tf1这一逆转录病毒的模型体系进行了研究和论证。本发明的技术方案不仅首次利用Cas12a实现对逆转录转座的抑制，而且其阻断逆转录转座的效率非常高。

Description

基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术

技术领域

本发明属于病毒学领域，更具体地，本发明涉及基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术。

背景技术

基因编辑技术是利用核酸酶对细胞中的核酸序列进行靶向修饰的技术。现已开发出一系列基因组编辑工具，转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术和CRISPR-Cas技术等，利用各类核酸酶靶向切割DNA引发双链DNA断裂(DSB)，进而诱发细胞中天然存在的DNA损伤修复机制，从而实现DNA编辑。目前最新发展的由RNA介导的CRISPR-Cas核酸内切酶技术是生物学领域的研究热点。CRISPR(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)是规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。对CRISPR系统的研究开发出了一系列基于CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1等酶的基因编辑工具，用于对各宿主基因组进行编辑。

众所周知，内源性和外源性逆转录病毒是引起人们重大健康问题的原因，也是器官移植和异种移植的危险因素，比如由HIV-1引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和与HIV相关的神经系统疾病(HAND)，由人类嗜T淋巴球病毒一型(HTLV-1)引起的白血病/淋巴瘤和自身免疫性疾病等。近年来，CRISPR-Cas9有被研究和尝试作为对抗病毒病原体的工具。然而，随着研究的不断深入，CRISPR-Cas9却暴露了它的缺陷和局限性，例如抑制效果欠佳，严重的脱靶效应等。在实际应用中，CRISPR-Cas9对靶点的结合不精确，其次是识别序列以后的切割操作并不精确。例如中国科学家编辑人类胚胎的尝试就发现了很多非特异性切割，但造成了许多突变。所以，科学家们在提高Cas9蛋白精准度的同时，也在寻找新的更高效的基因编辑系统。

综上，本领域中，尽管已有运用Cas9进行基因编辑的较多的应用，但是在病毒抑制，特别是抑制逆转录病毒如HIV等方面，亟待进行进一步的研究和探索，以其开发出更有效的抗病毒药物。此外，本领域也缺乏检测逆转录生物体在细胞内转座情况的测试模型。

发明内容

本发明的目的在于提供基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术，本发明还提供了用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系及其应用。

在本发明的第一方面，提供用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系，其包括Cas12a表达盒与crRNA表达盒；其中，所述的crRNA靶向于所述逆转录生物体的必需基因、长末端重复序列(LTR)或它们的邻近区域。

在一个优选例中，所述的必需基因包括选自下组的基因：结构基因，调控基因。

在另一优选例中，所述结构基因或调控基因包括(但不限于)：Gag，PR，RT，IN，Env，Tat、Rev，Vpu，Nef，Vpr或Vpx的编码基因。

在另一优选例中，所述体系中，Cas12a表达盒与crRNA表达盒位于同一或不同表达构建体(表达载体)中；较佳地，两个表达盒位于不同表达构建体中，Cas12a表达盒整合到所述真核细胞的基因组中表达，crRNA表达盒在所述真核细胞中游离表达。

在另一优选例中，所述的阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座包括：阻止逆转录生物体通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃。

在另一优选例中，所述的逆转录生物体包括：逆转录病毒(反转录病毒)，逆转录病毒的模拟体；较佳地，所述逆转录病毒的模拟体为逆转录转座子Tf1。

在另一优选例中，所述的逆转录转座子Tf1包括：逆转座元件，用于检测逆转录转座情况的筛选基因。

在另一优选例中，所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致；较佳地，所述crRNA靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当Cas12a与crRNA均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。

在另一优选例中，所述的内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第24～59位所示。

在另一优选例中，所述逆转座元件包括选自下组的操作性连接的基因：长末端重复序列(LTR)，Gag，PR，RT，IN；所述长末端重复序列包括5’LTR和3’LTR。

在另一优选例中，所述筛选基因为抗性筛选基因、标记基因(Marker基因)或报告基因；较佳地，所述抗性基因为Neo；更佳地，所述内含子插入到NEO的基因的第346、299、203、154位的3’位置。

在另一优选例中，所述的标记基因包括但不限于：Nat(nourseothricin，诺尔丝菌素基因)。

在另一优选例中，所述的报告基因包括但不限于：荧光蛋白，如GFP，mCherry，荧光素酶等。

在另一优选例中，所述的筛选基因位于3’LTR的上游。

在另一优选例中，所述筛选基因位于长末端重复序列的邻近位置。

在另一优选例中，所述的逆转录病毒的模拟体还包括与所述逆转录转座子操作性连接的启动子，其驱动所述逆转录转座子的转座；较佳地，所述启动子为可调控型启动子；更佳地，该可调控型启动子为nmt1启动子，其受硫胺素抑制。

在另一优选例中，所述crRNA表达盒包括操作性连接的以下元件：直接重复序列(DR)，gRNA；较佳地，包括操作性连接的以下元件：启动子，直接重复序列(DR)，gRNA和核酶(HDVR)；较佳地，所述启动子为rrk1启动子；较佳地，所述gRNA选自：SEQ ID NO:6、8、10、12或14所示序列中第4～28位的核苷酸序列，或它们的反向互补序列；较佳地，所述直接重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，其经由本发明人根据本发明的设计方案而设计，充分结合所述Cas12a的特点。所述直接重复序列与所述gRNA相连，作为crRNA表达盒的元件，使得Cas12a蛋白与crRNA良好地发生结合，有利于Cas12a/CrRNA的靶向切割作用。

在另一优选例中，所述Cas12a为来源于新凶手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)的Cas12a(FnCas12a)；较佳地，所述真核细胞为酵母时，所述Cas12a表达盒整合于酵母II号染色体LEU1位点。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的体系的用途，用于制备阻断病毒在真核细胞内逆转录转座的试剂(包括科研用试剂)或组合物(包括药物组合物)。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的体系的用途，用于进行逆转录生物体在真核细胞内转座的实验测试或制备实验测试体系。

在本发明的另一方面，提供一种阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的方法，包括：(1)提供前面任一所述的体系；(2)将(1)的体系引入到真核细胞内，从而该真核细胞具有阻断逆转录生物体逆转录转座的能力。

在本发明的另一方面，提供一种进行逆转录生物体在真核细胞内转座的实验测试的方法，包括：(a)提供前面任一所述的体系；(b)将(a)的体系引入到真核细胞内，检测逆转录转座情况。

在一个优选例中，所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致；较佳地，所述crRNA靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当Cas12a与crRNA均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。

在另一优选例中，所述的真核细胞为酵母细胞，植物细胞，动物细胞；较佳地，所述酵母细胞包括裂殖酵母细胞。

在本发明的另一方面，提供一种用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的试剂盒，其包括前面任一所述的体系。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pDUAL-HFF1-FnCas12a(FnCpf1)质粒构建流程图。

图2、Tf1逆转座报告系统构建流程图。

图3、psk-(FnCas12a gRNA)-Neo-Intron质粒构建流程图。

图4、pHL414-Tf1-Neo-Intron-(FnCas12a gRNA)-靶标质粒构建流程图。

图5、基于CRISPR-Cas12a干扰逆转录转座子Tf1转座的技术，统计转座效率。其中，上图为基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的表达体系的示意图；下图为crRNA-crNEO346的集落形成法测定结果。

具体实施方式

针对现有技术中在病毒抑制、特别是抑制逆转录病毒这方面尚不够成功的现状，本发明人经过深入的研究，揭示了一种基于CRISPR-Cas12a干预阻断逆转录生物体逆转录转座的技术，以及用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系及其应用；本发明还揭示了用于有效检测逆转录生物体在细胞内转座情况的测试模型及测试方法。本发明的技术方案不仅首次利用Cas12a实现对逆转录转座的抑制，而且其阻断逆转录转座的效率非常高。

术语

如本文所用，所述的“逆转录转座子(Retrotransposon)”是指由RNA介导转座的转座子，它通过转录合成mRNA，再反转录合成新的元件整合到基因组中以完成转座。逆转录病毒和转座子通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃。所述的“逆转录”也可被称为“反转录”。

如本文所用，所述的“逆转录生物体”是指会发生逆转录转座的生物体，包括生物细胞。在本发明的一些优选方式中，该“逆转录生物体”为逆转录病毒或为逆转录病毒的模拟体。除非另外说明，所述的“逆转录病毒的模拟体”为LTR类逆转录转座子，其具有类似于逆转录病毒的结构和转座方式。在本发明的更具体的方式中，所述逆转录病毒的模拟体为逆转录转座子Tf1。

如本文所用，所述“导向RNA(gRNA)”序列是与被编辑位点靶向序列反向相互补的一段序列。

如本文所用，所述“crRNA”为功能性的发挥靶向切割作用的分子；较佳地，其发挥作用需要两部分：(1)gRNA序列部分和(2)与Cas12a互作的DR序列部分，两者构成crRNA表达盒；DR使得Cas12a蛋白与crRNA良好地发生结合。

如本文所用，所述的“用于检测逆转录转座情况的筛选基因”是指对于逆转录转座事件的发生与否具有报告功能或能由人工检测到的基因。例如，其可以是一些抗性筛选基因，或在其表达后呈现显色或荧光的基因，或标记基因。

如本文所用，所述的“内含子”是指一段不表达的核酸序列，其插入目标基因后，可以阻止该目的基因的表达，但是其自身不会表达出有意义的蛋白。

所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子。此外，还可选择性地包括抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“逆转录病毒(反转录病毒)”为会发生逆转录转座的病毒。例如，所述的逆转录病毒包括(但不限于)：逆转录病毒包括(但不限于)：人类免疫缺陷病毒(HIV)，内源性逆转录病毒(ERVs)，人类T淋巴细胞病毒(HTLV)等。

如本文所用，所述的“阻断”包括“抑制”、“阻滞”等。

阻断逆转录转座的体系及其应用

本发明中，基于CRISPR-Cas12a来建立干预阻断病毒在真核细胞(包括酵母细胞)中逆转录转座的体系。所述的Cas12a为一种二类V型CRISPR效应蛋白Cas12a，该Cas12a蛋白常在细菌、植物和哺乳动物细胞中调节异源DNA编辑。

本发明所述的用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系，其包括Cas12a表达盒与crRNA表达盒。

Cas12a蛋白与Cas9蛋白虽都属于CRISPR家族，但两者蛋白结构截然不同、分子量不同；同时，二者作用机制也有很大不同。Cas12a蛋白缺乏HNH结构域，单个的RuvC核酸酶结构域负责DNA双链的切割，Cas12a具有内源RNase活性，而Cas9并非如此；Cas9识别的PAM序列位于靶标序列3’端且富含鸟嘌呤(G)，而Cas12a识别的PAM序列位于靶标序列5’端且富含胸腺嘧啶(T)；Cas9剪切位点在PAM序列上游且靠近PAM序列切割DNA形成平末端，而Cas12a在远离PAM序列的下游切割DNA形成5个核苷酸突出的黏性末端。鉴于两者具有很大的差异，它们的基因编辑原理、胞内工作方式及编辑结果也差异显著，无法相互套用或进行效果推断。

在本发明的优选方式中，所利用的是Cas12a蛋白的一个亚种，即来源于新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)的FnCas12a，其氨基酸序列可以如GenBank登录号WP_003040289所示，或其保守性变异多肽。所述的“保守性变异多肽”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述的“保守性变异多肽”可以是(i)有一个或多个(如1-50个、1-30个、1-20个、1-10个或1-5个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述crRNA靶向于一些基因靶点，包括：所述逆转录生物体的必需基因、长末端重复序列(LTR)等，或它们的邻近区域。

所述逆转录生物体的必需基因例如但不限于其结构基因、其调控基因等。例如但不限于：Gag，PR，RT，IN，Env，Tat、Rev，Vpu，Nef，Vpr，Vpx等。根据所述逆转录生物体的种类的不同，所述的必需基因可以是不同的。较为优选的是靶向位于两个LTR之间的基因，更特别地可以为位于LTR附近的基因。例如，本发明的实施例中，将靶向的基因设置于必需基因与LTR之间的位置。

所述Cas12a表达盒与crRNA表达盒可位于同一达构建体(表达载体)或不同表达构建体中。作为本发明的优选方式，所述体系中，两个表达盒位于不同表达构建体中，Cas12a表达盒整合到所述真核细胞的基因组中表达，crRNA表达盒在所述真核细胞中游离表达。这一设置有利于稳定地表达以及准确地阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座。

本发明所建立的阻断逆转录转座的体系，能够有效地阻止逆转录生物体(逆转录病毒或转座子)通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃。在本发明的具体实施例中，实现了通过诱导Cas12a和crRNA的同时表达，干预制止的病毒/转座子的逆转座，并且获得了高的抑制逆转录转座的效率。

本发明所建立的阻断逆转录转座的体系，可被制成用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的试剂盒，从而便于人们运用。较佳地，所述的试剂盒中还可包含适用说明书等。

阻断逆转录转座的测试体系及其应用

为了较为准确地了解本发明的体系对于逆转录的阻断作用，本发明人经过深入研究后，还建立了一种阻断逆转录转座的测试体系。

所述阻断逆转录转座的测试体系含有逆转录转座子Tf1。Tf1是一种来自裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的逆转录转座子，编码一个长的多聚蛋白，其侧翼为385个碱基的长末端重复序列(LTRs)。LTR逆转录转座子和逆转录病毒在基因组结构、复制机制和生命周期方面有许多共同的特征。LTR逆转录转座子和逆转录病毒都通过逆转录进行复制，并通过整合到宿主基因组中进行繁殖，而宿主基因组则依赖于宿主的转录和翻译机制。Tf1与逆转录病毒二者均以RNA为中间体，通过转录合成mRNA，再反转录合成新的元件整合到基因组中以完成对宿主基因组的干扰。因此，LTR逆转录转座子可以作为研究逆转录病毒的一个有效模型。在本发明的优选方式中，选用了一种在裂殖酵母细胞内表达Tf1的质粒pHL414，并对其进行修饰。

作为本发明的优选方式，所述Tf1包括逆转座元件(可包括两端的LTR，Gag，PR，RT，IN)以及用于检测逆转录转座情况的筛选基因。所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致；较佳地，所述crRNA靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当Cas12a与crRNA均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。

在更为优选的方式中，驱动所述逆转座元件表达的启动子为可调控型地(如可被诱导或被抑制)。利用这一体系，本发明人可以可控地调控逆转录转座体系的表达(例如，利用可调控型启动子如nmt1，其受硫胺素抑制，当撤去硫胺素后则可以表达)，发生逆转录转座；同时，表达Cas12a和crRNA，观测逆转录转座的变化情况。

本发明所述的测试体系可以在真核细胞(如酵母细胞)中进行测试。在本发明的具体实施例中，利用裂殖酵母细胞为技术发展的平台、提供了一种基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒/转座子的逆转录转座的技术，其具体操作方法如下：

(1)表达CRISPR-Cas12a蛋白

本发明人构建表达FnCas12a蛋白的载体(实施例中为pDUAL-HFF1-FnCas12a)；通过将线性化质粒转化至裂殖酵母，利用同源重组将FnCas12a蛋白表达盒插入酵母II号染色体LEU1位点，进而生成了在酵母基因组中表达单拷贝FnCas12a基因的酵母菌株；之后，使用MM培养基培养裂殖酵母，使其表达FnCas12a蛋白。

(2)表达CRISPR-Cas12a切割DNA靶标的crRNA

本发明选用了一个裂殖酵母的三型启动子rrk1，在该启动子后是CRISPR-Cas12a的DR序列；在DR序列之后接入了gRNA占位序列(place holder with BspQI)，gRNA可以连入到BspQI酶切位点；在gRNA插入位置的后面接一个可以对自身5’端进行切割的核酶(HDVR)；该设计可以产生具有准确序列的gRNA。合成该表达盒，并将其克隆在pBluescript II KS载体的ClaI/EcoRV酶切位点之间，产生pSK-(FnCas12a gRNA)-骨架载体。之后，设计gRNA引物，构建表达gRNA的中间载体pSK-(FnCas12a gRNA)-靶标。本发明中优选的gRNA长度为25±2bp。

(3)逆转座模型系统的建立

本发明人利用一种裂殖酵母LTR逆转录转座子Tf1作为模型系统；更具体地，本发明人选用了一种在裂殖酵母细胞内表达Tf1的质粒pHL414。其中Tf1序列包含一个与逆转座子转录方向相反的新霉素(Neomycin，Neo)抗药基因。人工设计的内含子(Intron)以与Neo基因转录相反的方向插入其中，打断Neo基因。内含子的转录方向与Tf1转录本一致，转录过程中能被剪接掉。通过抗药基因的表达，筛选出发生转座事件的酵母菌株。具体地，本发明人用基因合成的方法(金唯智)合成了上述含有人工设计内含子的“minigene”(～250bp)，其中包含Neo基因部分序列以及插入在PAM序列(FnCas12a识别)附近选择位点处的Intron序列(GTAGGTGCTATTTTACTAGTCTAAGCTAATCAATAG)。基于此，本发明人构建了pHL414-Tf1-Neo-Intron逆转座报告系统质粒。该报告系统可区分原始Tf1DNA(质粒携带)和反转录后Tf1DNA(cDNA或整合入裂殖酵母基因组)，并进行特异性靶向。

运用所建立的逆转座模型系统，在其中诱导Cas12a和crRNA的同时表达，可以测得逆转座被阻断(抑制)的情况。

本发明所建立的阻断逆转录转座的测试体系，可被制成用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的试剂盒，从而便于人们运用。较佳地，所述的试剂盒中还可包含适用说明书等。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明首次利用Cas12a，实现对病毒/转座子的逆转录转座的抑制，Cas12a通过靶向逆转录过程中的DNA产物来实现功能。本领域尚没有利用CRISPR-Cas12a成功干预制止的病毒/转座子的逆转座的先例。

(2)本发明充分运用了CRISPR-Cas12a的特点(蛋白分子量较小，自身具有内源RNase活性，能将pre-crRNA剪切加工为成熟crRNA，且该crRNA(～41nt)较短)，简化了实验设计。本发明人发现，由于Cas12a识别的PAM序列富含胸腺嘧啶(T)，CRISPR系统的靶标范围是较宽的。这使得本发明开发的基于CRISPR-Cas12a的DNA编辑技术更有优势，成为基因组编辑的强有力的系统。

(3)本发明中，基于CRISPR-Cas12a的DNA编辑技术首次在真核细胞，(裂殖酵母体为例)构建并实施CRISPR-Cas12a基因编辑系统，对于干预制止的病毒/转座子的逆转座效率效果卓著。

(4)本发明的基于CRISPR-Cas12a的DNA编辑技术显著抑制了真核细胞(裂殖酵母体为例)病毒/逆转录转座子的转座活性。同时，该技术还可以用来进行操作和干扰逆转录病毒的研究，为RNA病毒的研究提供一个有效的工具。

(5)本发明的技术方案操作方法简单，阻断效率高(实验体系验证，达到几乎100％的抑制率)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

pHSN-FnCpf1质粒构建：利用引物对pHSN-Fn-F(tgtatggccgcggccgctctagatggactataaggaccacg(SEQ ID NO:18))和pHSN-Fn-R(ccaatacttgtatggaggcctgagcttactttttcttttttgcctg(SEQ ID NO:19))，从FnCpf1-OsU6质粒(来自普渡大学，Dr.Jiankang Zhu’sLab)中PCR扩增带有C-端核定位信号(NLS)和3×FLAG标签的密码子优化的F.novicidaCas12a(FnCas12a)片段；再用StuI/XbaI限制性内切酶消化pHSN6I01质粒(Addgene:#50587)，酶切产物作为载体骨架；然后使用

II一步克隆试剂盒(Vazyme)分别将上述扩增得到的FnCas12a片段与载体骨架组装在一起，生成pHSN-FnCpf1质粒。

pHL414-2质粒：含有Tf1阅读框，获自Professor Henry L.Levin实验室(TheEunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and HumanDevelopment,National Institutes of Health)。

psk-(FnCpf1gRNA)骨架质粒构建：首先利用引物对psk-FnCpf1-2-P5(gctcttctATCTACAACAGTAGAAATTAttcttcggtacaggttatg(SEQ ID NO:20))和psk-HindIII-P3(taaatgacgaaggcatatagaagctttgaa(SEQ ID NO:21))，从pKS-rrk1-crRNA-backbone质粒(Jing,X.et al.Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast andits repurposing for precise RNA editing.Nucleic Acids Res.46,90(2018))中PCR扩增得片段1；然后以片段1为模板，再以引物对psk-FnCpf1-1-P5(gctgggaccatgccggcctgaagagctga attcagctcttctATCTACAACAG(SEQ ID NO:22))和psk-HindIII-P3(taaatgacgaaggcatatagaagctttgaa(SEQ ID NO:23))PCR扩增得片段2；再用HindIII/BspQI限制性内切酶消化pKS-rrk1-crRNA-backbone质粒，酶切产物作为载体骨架；然后使用

II一步克隆试剂盒(Vazyme)分别将上述扩增得到的片段2与载体骨架组装在一起，生成psk-(FnCpf1gRNA)骨架质粒。

psk-(FnCpf1gRNA)骨架质粒中，DR序列为：TAATTTCTACTGTTGTAGAT(SEQ ID NO:28)。本发明人发现，该DR序列与gRNA相连，适合于使得Cas12a蛋白与crRNA良好地发生结合，有利于Cas12a/CrRNA的靶向切割作用。

裂殖酵母菌株S.pombe FY7652,h-leu1-32 ura4-D18，来自National BioResource Project(日本生物资源中心：https://jcm.brc.riken.jp/en/nbrp_e日文：https://nbrp.jp/)。

实施例1、在真核细胞内表达CRISPR-Cas12a蛋白

表达CRISPR-Cas12a蛋白的细胞表达体系的建立，以及在真核细胞内表达CRISPR-Cas12a蛋白的方法如下：

1、构建表达FnCas12a蛋白的载体pDUAL-HFF1-FnCas12a

如图1所示，从pHSN-FnCpf1(FnCpf1即FnCas12a)质粒上切下FnCpf1，将之克隆到经过NdeI/NcoL酶切的pDUAL-HFF1质粒中，利用同源重组酶进行连接，从而获得pDUAL-HFF1-FnCas12a。

2、质粒的转化

将质粒pDUAL-HFF1-FnCas12a转化至裂殖酵母：用醋酸锂/PEG/热休克方法转化500ng线性pDUAL-HFF1-FnCas12a片段对数生长初期的裂殖酵母细胞，并使FnCas12a基因整合至酵母基因组的LEU1位点。

3、蛋白表达

使用MM培养基培养转化有重组质粒裂殖酵母，使之表达FnCas12a蛋白。

实施例2、建立适于在真核细胞表达的模拟病毒转座机制的逆转座子转座报告系统

1.设计含有人工内含子的Neo-Intron片段。

经反复研究，本发明人在新霉素抗性基因(Neo)的若干个序列位置插入Intron序列，主要包括其第299位之后(第299-300位之间)，第203位之后(第203-204位之间)，第154位之后(第154-155位之间)，第346位之后(第346-347位之间)。

所设计的“minigene”序列如下(实线下划线部分为Intron序列；非实线下划线部分为Neo的序列、且其中曲线下划线为gRNA设计位点)：

Neo-Intron299(SEQ ID NO:1)：

Neo-Intron203(SEQ ID NO:2)：

Neo-Intron154(SEQ ID NO:3)：

Neo-Intron346-P5(SEQ ID NO:4)：

Neo-Intron346-P3(SEQ ID NO:5)：

以上，Neo-Intron346是以两条引物单链退火的方式合成“minigene”。

2.构建pHL414-Tf1-Neo-Intron逆转座子系统质粒。

如图2，合成前述的Neo-Intron片段，利用引物对Neo-TYCZ-P5和Neo-TYCZ-P3(序列分别为：catcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggat(SEQ ID NO:24)和atgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattg(SEQ ID NO:25))进行扩增，之后插入到pHL414-2的NruI/EcoNI位点中，获得pHL414-Tf1-Neo-Intron质粒。

实施例3、建立基于CRISPR-Cas12a的gRNA表达系统

经反复研究，本发明人优化了靶向Neo基因的gRNA。其制备如下：

设计引物共6对(5个靶标和1个非靶标)，其中对于NEO-intron154位点设计了两条靶向序列，序列分别如下(序列中前3位的碱基为与骨架质粒相匹配的碱基)：

crNEO346-P5：GAT acctgaatcaggatattcttctaat(SEQ ID NO:6)；

crNEO346-P3：GCC attagaagaatatcctgattcaggt(SEQ ID NO:7)；

crNEO299-P5：GAT ccggggatcgcagtggtgagtaacc(SEQ ID NO:8)；

crNEO299-P3：GCC ggttactcaccactgcgatccccgg(SEQ ID NO:9)；

crNEO203-P5：GAT gtctgaccatctcatctgtaacatc(SEQ ID NO:10)；

crNEO203-P3：GCC gatgttacagatgagatggtcagac(SEQ ID NO:11)；

crNEO154-1-P5：GAT ccatgtttcagaaacaactctggcg(SEQ ID NO:12)；

crNEO154-1-P3：GCC cgccagagttgtttctgaaacatgg(SEQ ID NO:13)；

crNEO154-2-P5：GAT agaaacaactctggcgcatcgggct(SEQ ID NO:14)；

crNEO154-2-P3：GCC agcccgatgcgccagagttgtttct(SEQ ID NO:15)；

crNEO-Control-P5：gat AACAGCGCCTTAAAAGAACTAGAAA(SEQ ID NO:16)；

crNEO-Control-P3：gcc TTTCTAGTTCTTTTAAGGCGCTGTT(SEQ ID NO:17)。

2.构建质粒pSK-(FnCas12a gRNA)-Neo-Intron，具体操作方法如下：

如图3，根据上述提供的引物序列，分别合成crNEO-P5和crNEO-P3引物，退火形成crNEO，将之插入到经BspQI酶切的psk-(FnCpf1gRNA)骨架中，获得pSK-(FnCas12a gRNA)-Neo-Intron质粒。

实施例4、建立靶标质粒及真核细胞的转化

如图4，以pHL414-NheI-T7和pHL414-NheI-T3引物(序列分别为TGCAGCCCGGGGGATCCCAGCTGTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:26)和ATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTtctagaAATTAACCCTCACTAAAG(SEQ ID NO:27))扩增实施例3中构建的pSK-(FnCas12a gRNA)-Neo-Intron质粒中的gRNA的表达盒，克隆到前述实施例2构建的逆转座子Tf1的转座报告系统pHL414-Tf1-Neo-Intron载体的NheI酶切位点中，产生pHL414-Tf1-Neo-Intron-(FnCas12a gRNA)靶标质粒。

转化pHL414-Tf1-Neo-Intron-(FnCas12a gRNA)-靶标质粒至裂殖酵母衍生菌株中(即实施例1建立的能整合表达FnCas12a蛋白的菌株)。用醋酸锂/PEG/热休克的方法转化100ng pHL414-Tf1-Neo-Intron-(FnCas12a gRNA)靶标质粒至对数生长初期的裂殖酵母细胞，使质粒游离存在。

实施例5、在真核细胞内CRISPR-Cas12a干扰病毒/逆转录转座子的转座

本实施例中，利用前述建立的基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的模型体系，验证干扰转座的效果。

实验操作步骤如下：

1.细胞培养

在MM+硫胺素(Thiamine；10μM)平板上培养前述实施例4建立的整合表达FnCas12a蛋白、游离表达gRNA-Neo质粒的转基因裂殖酵母细胞(共6种)，32℃培养4天。其中，Thiamine可抑制nmt1启动子启动Tf1的转座。

2.定性测定逆转座子Tf1的转座活性

(1)挑取MM+thiamine平板中单克隆，划线至PMG+thiamine(10μM)平板上孵育3天；

(2)然后将菌落转移到PMG平板上(去掉Thianmie以启动转录和逆转座)，使其生长4天；

(3)再将菌落转移到含有PMG+5-FOA+Uracil+Thiamine平板中(去除游离的质粒)，生长3天；

(4)最后将菌落转移到含有YES+5-FOA+Uracil+G418平板中。通过观察G418平板上本发明人设计的含有5个靶标和1个非靶标游离质粒的衍生酵母菌株是否能够继续生长，来监测Tf1的转座活性。

3.定量测量逆转座子Tf1的转座频率

(1)挑MM+Thiamine转化板上单克隆并转接到PMG+Thiamine(10μM)平板上孵育3天；

(2)挑单克隆并以初始光密度(OD₆₀₀)～0.05转移至液体PMG培养基(充分去除Thianmie以启动转录和逆转座)，使培养物在32℃，200rpm下生长4天；

(3)接种一定体积培养物至PMG+5-FOA+Uracil液体培养基，以初始OD₆₀₀～0.1开始培养36h。

(4)随后将培养物用10⁷、10⁶和10⁵个细胞/mL的进行梯度稀释，然后将100μL梯度稀释液分别接种到YES+5-FOA或YES+5-FOA+G418平板上，32℃下培养2-3天。

(5)计算在两种平板上形成的单克隆个数，通过比较含G418+5-FOA的平板以及仅含5-FOA的平板的菌落数，估算Tf1逆转座的频率。

转座频率(％)＝(YES培养板克隆数+5-FOA+G418)×100/(YES培养板克隆数+5-FOA)×稀释差(dilution differential)

观测平板上的单克隆的生长情况，本发明人发现crRNA-crNEO299体系、crRNA-crNEO203体系、crRNA-crNEO154体系的干扰效果非常理想，没有观测到可见的单克隆生长。crRNA-crNEO346具有极少的单克隆生长，本发明人进一步对其进行集落形成计数。

crRNA-crNEO346的集落形成法测定结果如图5的下图，crNEO346的标准化转位频率为0.1％(±0.009％)(平均值±s.e.m.)。与非靶向对照组(1％±0.156％)相比，crRNA-crNEO346对Tf1转位有90％的抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术

<130> 202257

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(250)

<223> Neo-Intron299

<400> 1

gaatgctgtt ttcccgggga tcggtaggtg ctattttact agtctaagct aatcaatagc 60

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 120

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 180

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 240

tgtcgcacct 250

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(250)

<223> Neo-Intron203

<400> 2

gaatgctgtt ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat 60

aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctg 120

taggtgctat tttactagtc taagctaatc aatagcatct gtaacatcat tggcaacgct 180

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 240

tgtcgcacct 250

<210> 3

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(250)

<223> Neo-Intron154

<400> 3

gaatgctgtt ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat 60

aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc 120

atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaagt aggtgctatt 180

ttactagtct aagctaatca atagctctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 240

tgtcgcacct 250

<210> 4

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(77)

<223> Neo-Intron346-P5

<400> 4

tcaacaatat tttcacctga gtaggtgcta ttttactagt ctaagctaat caatagatca 60

ggatattctt ctaatac 77

<210> 5

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (1)..(77)

<223> Neo-Intron346-P3

<400> 5

gtattagaag aatatcctga tctattgatt agcttagact agtaaaatag cacctactca 60

ggtgaaaata ttgttga 77

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gatacctgaa tcaggatatt cttctaat 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gccattagaa gaatatcctg attcaggt 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gatccgggga tcgcagtggt gagtaacc 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gccggttact caccactgcg atccccgg 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gatgtctgac catctcatct gtaacatc 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

gccgatgtta cagatgagat ggtcagac 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

gatccatgtt tcagaaacaa ctctggcg 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

gcccgccaga gttgtttctg aaacatgg 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

gatagaaaca actctggcgc atcgggct 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

gccagcccga tgcgccagag ttgtttct 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

gataacagcg ccttaaaaga actagaaa 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

gcctttctag ttcttttaag gcgctgtt 28

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

tgtatggccg cggccgctct agatggacta taaggaccac g 41

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

ccaatacttg tatggaggcc tgagcttact ttttcttttt tgcctg 46

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

gctcttctat ctacaacagt agaaattatt cttcggtaca ggttatg 47

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

taaatgacga aggcatatag aagctttgaa 30

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

gctgggacca tgccggcctg aagagctgaa ttcagctctt ctatctacaa cag 53

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

taaatgacga aggcatatag aagctttgaa 30

<210> 24

<211> 67

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 60

cggggat 67

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattg 59

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

tgcagcccgg gggatcccag ctgtaatacg actcactata 40

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

agtcactatg gcgtgcttct agaaattaac cctcactaaa g 41

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> DR序列

<400> 28

taatttctac tgttgtagat 20

Claims

1.一种体系在制备阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的组合物中的用途，所述的阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座包括：阻止逆转录生物体通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃；

所述体系包括Cas12a表达盒与crRNA表达盒，所述Cas12a为来源于新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida) 的FnCas12a；Cas12a表达盒整合到所述真核细胞的基因组中表达，crRNA表达盒在所述真核细胞中游离表达；

所述的crRNA靶向于所述逆转录生物体的必需基因、长末端重复序列或它们的邻近区域。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的必需基因包括选自下组的基因：结构基因，调控基因。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述结构基因或调控基因包括：Gag，PR，RT，IN，Env，Tat、Rev，Vpu，Nef，Vpr或Vpx的编码基因。

4.如权利要求1～3任一所述的用途，其特征在于，所述的逆转录生物体包括：逆转录病毒，逆转录病毒的模拟体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录病毒的模拟体为逆转录转座子Tf1。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的逆转录转座子Tf1包括：逆转座元件，用于检测逆转录转座情况的筛选基因。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述crRNA靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当Cas12a与crRNA均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。

9. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述逆转座元件包括选自下组的操作性连接的基因：长末端重复序列，Gag，PR，RT，IN；所述长末端重复序列包括5’ LTR和3’LTR。

10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述筛选基因为抗性筛选基因、标记基因或报告基因。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述抗性筛选基因为Neo。

12.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述内含子插入到NEO的基因的第346、299、203、154位的3’位置。

13.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的逆转录病毒的模拟体还包括与所述逆转录转座子操作性连接的启动子，其驱动所述逆转录转座子的转座。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述启动子为可调控型启动子，该可调控型启动子为nmt1启动子，其受硫胺素抑制。

15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述crRNA表达盒包括操作性连接的以下元件：直接重复序列，gRNA。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述crRNA表达盒包括操作性连接的以下元件：启动子，直接重复序列，gRNA和核酶。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述启动子为rrk1启动子。

18. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述gRNA选自：SEQ ID NO: 6、8、10、12或14所示序列中第4～28位的核苷酸序列，或它们的反向互补序列。

19. 如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述直接重复序列的核苷酸序列如SEQID NO: 28。

20.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述真核细胞为酵母时，所述Cas12a表达盒整合于酵母II号染色体LEU1位点。

21.一种阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的方法，所述的阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座包括：阻止逆转录生物体通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃；所述方法包括：

(1) 提供一种体系；所述体系包括Cas12a表达盒与crRNA表达盒，所述Cas12a为来源于新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida) 的FnCas12a； Cas12a表达盒整合到所述真核细胞的基因组中表达，crRNA表达盒在所述真核细胞中游离表达；所述的crRNA靶向于所述逆转录生物体的必需基因、长末端重复序列或它们的邻近区域；

(2) 将(1)的体系引入到真核细胞内，从而该真核细胞具有阻断逆转录生物体逆转录转座的能力。