CN109415728A - 逆转录病毒核酸序列的切除 - Google Patents

Abstract

用于体内传递基因编辑CRISPR/Cas9复合物的组合物被开发用于消除来自潜伏感染的人细胞和动物疾病模型的整合的逆转录病毒DNA序列。

Description

逆转录病毒核酸序列的切除

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在美国国家卫生研究院授予的经费号P30MH092177和R01NS087971的部分政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明的具体实施例有关用于预防或治疗逆转录病毒感染的基因编辑复合物和体内传递载体。特别地，基因编辑复合物包含由重组病毒载体编码的簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关的内切核酸酶。

背景技术

艾滋病毒/艾滋病仍然是一个主要的公共健康问题，全世界有4000多万人受到感染，新感染病例持续超过200万/年(Ade jumo OA等，J Int AIDS Soc 2015；18：20049)。组合抗逆转录病毒疗法(cART)有效控制正在进行的病毒复制，并可以恢复已丧失的CD4⁺T细胞数量。然而，治疗无法从潜伏感染的细胞中消除病毒(Kulpa DA，Chomont N.J VirusErad 2015；1：59-66)。在休眠CD4⁺记忆T细胞的子集中，整合的原病毒DNA持续存在，并且可以被重新激活以产生具有复制能力的病毒。当cART停止时，这可导致病毒迅速反弹(CoffinJM.Science 1995；267：483-489；Coffin JM.AIDS,1996；10(Suppl 3)：S75-84)。因此，由于细胞库中的病毒持久性，感染者必须维持终生治疗。

消除潜伏的原病毒DNA仍然是神秘的。在潜伏期间，HIV-1感染的细胞产生很少的或不产生病毒蛋白，从而避免宿主抗病毒免疫清除或直接病毒致细胞病变。除了存在于脾脏、淋巴结、脑、泌尿生殖道和肠道中的其他感染的淋巴细胞和单核细胞-巨噬细胞外，病毒的消除需要其清除和预防潜伏感染细胞的CD4⁺T效应记忆细胞的再感染(Saleh S.等人，Blood 2007；110：4161-4164；Swiggard WJ等人，J Virol 2005；79：141799-14188)，以实现疾病“治愈”(Lusic M，Giacca M.J Mol Biol 2015；427：688-694)。

发明内容

本发明的具体实施例涉及包含对逆转录病毒核酸序列特异的基因编辑复合物，以及将这些基因编辑复合物给药需要这种治疗的受试者的组合物。

在一个具体实施例中，组合物包含编码基因编辑剂的病毒载体和至少一种引导RNA(gRNA)，其中该gRNA与逆转录病毒基因序列的目标核酸序列互补，编码逆转录病毒群组、特异性抗原、编码区、非编码区或其组合的目标核酸序列。

在另一个具体实施例中，病毒载体包含腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。优选地，腺相关病毒载体包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。在一个具体实施例中，AAV载体是AAV血清型9(AAV9)。

在另一个具体实施例中，基因编辑剂是簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶、或其同源物或直系同源物。在一个具体实施例中，CRISPR相关内切核酸酶是Cas9或其同源物或直系同源物。

在另一个具体实施例中，gRNA与逆转录病毒基因序列的长末端重复序列(LTR)、群组特异性抗原或其组合互补。在本发明的一个方面，目标序列包含人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列(LTR)内的序列。优选地，人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列内的序列包含U3、R或U5区内的序列。

在一些具体实施例中，群组特异性抗原包含人类免疫缺陷病毒编码及/或非编码核酸序列。在一个具体实施例中，群组特异性抗原包含至少一种人类免疫缺陷病毒核酸序列，其包含：gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev或其片段。

在一个具体实施例中，组合物还包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。在本发明的一个方面，反式激活小RNA(tracrRNA)序列与编码引导RNA的序列融合。在另一方面，组合物包含编码核定位信号的序列。

在另一个具体实施例中，表达载体包含编码基因编辑剂和至少一种引导RNA(gRNA)的单离的核酸，其中该gRNA与逆转录病毒基因序列的目标核酸、群组特异性抗原的目标核酸序列或其组合序列互补。

在另一个具体实施例中，单离的核酸序列包含簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶；第一引导RNA(gRNA)，其具有与原病毒DNA中的第一目标前间隔序列互补的第一间隔序列；第二gRNA，其具有与原病毒DNA中的第二目标前间隔序列互补的第二间隔区序列，其中该第一目标前间隔序列和该第二目标前间隔序列位于原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中。在一些具体实施例中，单离的核酸序列靶向多个目标序列，并切除两个或更多个目标序列之间的间插病毒序列。

在另一个具体实施例中，编码单离的核酸序列的表达载体包含簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶；编码第一引导RNA(gRNA)的单离的核酸序列，其具有与原病毒DNA中的第一目标前间隔序列互补的第一间隔序列；和编码第二gRNA的单离的核酸序列，该第二gRNA具有与原病毒DNA中的第二靶前间隔序列互补的第二间隔序列，其中该第一目标前间隔序列和该第二目标前间隔序列位于原病毒DNA的长末端重复序列(LTR))。

在另一个具体实施例中，一种使受试者中的逆转录病毒失活的方法，包括向受试者给药包含编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物的表达载体的组合物和一种或多种引导RNA，其中该引导RNA与逆转录病毒中的目标核酸序列互补。

在另一个具体实施例中，一种治疗患有人类免疫缺陷病毒感染的受试者或降低具有人类免疫缺陷病毒感染风险的受试者中人类免疫缺陷病毒感染风险的方法，该方法包括给药受试者治疗有效量的包含编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物和一种或多种引导RNA的表达载体的组合物，其中该引导RNA与逆转录病毒中的目标核酸序列互补。

以下描述本发明的其他方面。

附图说明

图1A和1B描绘了rAAV₉：saCas9/gRNA Tg26 MEF切除HIV-1DNA。图1A是HIV-1的示意图，突出显示Gag和Pol基因(3100bp)之间被除去以产生用于发育Tg26动物的转基因的位置。显示了gRNA LTR1和Gag D的位置及其核苷酸组成。红色字母表示PAM序列。图的左上方显示了用于PCR(P1和P2)和巢式PCR(P1'和P2')的引物与切除前后的预期扩增子的位置。图1B描绘了衍生自Tg26的MEF和来自用增加量的rAAV₉：Cas9/gRNA处理后HIV-1DNA的PCR扩增的凝胶分析的结果。显示了全长(1323bp)和截短(345bp)PCR产物的位置。

图2A至2D描绘了在Tg26小鼠的各种组织中rAAV₉：saCas9/gRNA体内切除HIV-1DNA。图2A是用于接种rAAV₉：Cas9/gRNA的程序和用于分析的器官的示意图。图2B显示了从具有和不具有rAAV9的Tg26小鼠系获得的DNA的PCR结果显示rAAV9处理的样本中的1323bp和截短的345bp的位置(左)。使用两对引物对PCR产物进行凝胶分析；用于检测345bp片段的P1/P2和用于检测160bp片段的巢式引物P1'/P2'。全长PCR产物用箭头(中间)显示。MEF DNA的双引物PCR扩增结果再次显示预期的两个截短的HIV-1DNA片段。显示了全长扩增子(箭头)和非特异性带(星号)的位置。对照(续)说明在不存在引物的情况下的PCR反应(右)。图2C显示了图B中所示的160bp DNA片段的测序结果(中图和右图)。显示了引物以及gRNA LTR1和Gag D的位置。图2D显示来自各种组织(泳道1和2)和MEF(泳道3)的DNA的PCR扩增结果，证明在没有接种rAAV₉：saCas9/gRNA的动物中不存在160bp截短的DNA片段并，且检测到在接受rAAV₉：saCas9/gRNA的动物和细胞中的这条带。

图3A、3B显示在用rAAV₉：saCas9/gRNA接种和病毒RNA的表达后，从大鼠血细胞中消除整合的HIV-1DNA区段。(图3A)制备来自对照(未处理)和实验(用rAAV₉：saCas9/gRNA处理)大鼠的循环淋巴细胞的总DNA，并使用来自5'-LTR和Gag基因的一组引物进行PCR扩增(材料和方法中所示)。凝胶电泳后，在处理的样本中检测到～198bp的短DNA片段，而不是对照样本，然后将其纯化并克隆到TA载体中。选择几个克隆用于DNA测序。将从每只动物获得的四个代表性DNA序列(C1-C4)与HIV-1pNL4-1序列的参考LTR-Gag区域比对。LTR 1和Gag D目标序列的位置和核苷酸组成以绿色突出显示，PAM以红色突出显示，用于PCR的LTR特异性引物以蓝色突出显示。(图3B)从对照(未处理)和用rAAV₉：saCas9/gRNA处理10天的转基因大鼠的循环淋巴细胞和淋巴结制备的总RNA，并用于定量RT-PCR以检测Gag RNA和Env RNA。测定每种测定法中β-肌动蛋白的表达，并将该值用作病毒RNA表达定量的参考值。

图4A至4E显示saCas9/sgRNA有效率地切除HIV-1基因组，并抑制HIV-1荧光素酶报告基因表达。图4A：sgRNA靶位点(红色箭头)和PCR引物(黑色箭头)的位置。图4B、4C：使用EcoHIV-eLuc报告测定法(图4B)和直接PCR基因分型(图4C)的saCas9/sgRNA和spCas9/sgRNA系统之间的效率比较。箭头指出LTR1和LTR3靶位点之间的代表性片段缺失和额外的插入，其通过TA克隆和Sanger测序验证(图4C)。图4D、4E：与病毒结构sgRNA配对的三种LTRsgRNA通过ONE-GLO荧光素酶测定法(图4D)诱导EcoHIV-eLuc活性的强烈抑制(图4D)，并通过用指定的引物直接PCR基因分型而诱导片段缺失/插入(图4E)。用Sanger测序证实了红色框中的代表性片段缺失。用pNL4-3-EcoHIV-萤火虫荧光素酶报告基因(10ng/孔)、pCMV-海肾荧光素酶报告基因(2ng/孔)和指定的表达Cas9/sgRNA的载体：针对spCas9系统(图4B)为pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP(80ng/孔)和指定的sgRNA表达载体(对于各配对的gRNA为60ng/孔)；对于saCas9系统(图4B，4D)为pX601-saCas9/LTR sgRNA表达载体(对于各指定对为100ng/孔)共转染96孔板的6个孔中的HEK293T细胞。48小时后，用ONE-GLO^TM荧光素酶测定系统测量细胞裂解物中的萤火虫荧光素酶活性，并用海肾荧光素酶测定系统测量海肾荧光素酶活性。数据表示4次独立转染的平均值±SD，而海肾荧光素酶标准化后的萤火虫荧光素酶的百分比变化与相应的空pX601载体相比，。将另外2个转染细胞的孔用于直接PCR基因分型(图4C、4E)。类似的实验重复2至3次。

图5A至5J显示了多倍体sgRNA在一体化AAV载体中的功效。图5A、5B：双倍体sgRNA/saCas9表现出对EcoHIV-eLuc活性的更强抑制(图5A)和HIV-1基因组的切除(图5B)。比率表示相较于野生型带的片段缺失带的密度(图5B)。图5C至5J：四倍体sgRNA/saCas9表现出更强的EcoHIV-eLuc活性抑制(图5C)和5'-LTR1/LTR3与GagD(图5D，5E)或GagD/PolB与3'-LTR两者的更高切除效率(图5F至5J)。引物T361/T458(图5D)侦测到5'-LTR1/LTR3和GagD之间的片段缺失(黑色箭头)，并且在双倍体和四倍体群组两者中观察到另外的插入(红色箭头)。T710/T458侦测到5'-LTR3和GagD之间的缺失(图5E)。分别通过引物T758/T363(图5F)和T689/T363(图5G)侦测GagD或PolB与3'-LTR1/LTR3之间的缺失。引物对T689/T711侦测到PolB和3'-LTR1之间的缺失(图5H)。用saCas9和β-肌动蛋白标准化基因组DNA(图5J)。将96孔板中的HEK293T细胞与EcoHIV-eLuc报告基因和两个单独多倍体sgRNA表达载体(各100ng)、一个双倍体sgRNA表达载体(100ng)和具有空的pX601载体(100ng)(等量于sgRNA对照组(200ng，图5A、5B))、或一个双倍体/四倍体sgRNA表达载体和sgRNA对照(各100ng，图5C至5J)共转染。48小时后，如图4A至4E所述，进行ONE-Glo荧光素酶测定(图5A、5C)，并使用指定的引物对进行直接PCR基因分型(图5B、5d至5J)。

图6A至6G显示AAV-DJ介导的多倍体sgRNA/saCas9表达载体的传递有效地切除来自Tg26转基因小鼠的神经干细胞(NSC)中的HIV-1整合基因组。在用10功能性MOI(fMOI)感染后20天，在NSC中的单股(图6A)、双倍体(图6B)和四倍体(图6C)有类似感染效率。用抗HA标签抗体通过免疫荧光细胞化学测定感染的细胞。图6D至6F：直接PCR分析验证转基因saCas9(图6D)和LTR1/GagD(图6E)的剂量依赖性传递和5'-LTR/GagD和GagD/3'-LTR(图6F)在感染后2天的切除。(图6G)在用10fMOI感染后20天，四倍体sgRNA/saCas9显示出比双倍体sgRNA/saCas9更强的切割功效。引物T361/T458检测到5'-LTR1/LTR3和GagD之间的缺失，引物T758/T645检测到GagD和3'-LTR1/LTR3之间的缺失(图6F、6G)。GAPDH用于基因组DNA的标准化。对照-882AAV-DJ病毒是用作非功能性对照。

图7A至7G显示了四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8诱导的HIV-1原病毒DNA切除(图7A至7C)和Tg26转基因小鼠的大多数器官/组织中的HIV-1RNA转录(d-g)的强烈降低。图7A，7B：通过尾静脉向Tg26小鼠注射纯化的AAV-DJ/8病毒(1.535×10¹²GC/小鼠)。注射后两周，对小鼠实施安乐死，并收集牠们的组织以用于基因组DNA提取和PCR基因分型。阳性对照示表在用AAV-saCas9/sgRNA(LTR1+GagD)载体转染的HEK293T细胞中切除EcoHIV-eLuc报告基因。阴性对照表示注射模拟AAV病毒的小鼠。图7C：给药第一次注射后2周的AAV-DJ/8的额外注射，并且2周后收获组织样本以用于用指定的引物进行PCR基因分型。用TA克隆和Sanger测序验证代表性缺失片段(红色框)(参见图16A、16B)。图7D：显示HIV转录物的RT-qPCR引物对的位置的图。图7E至7G：RT-qPCR分析显示与注射模拟AAV病毒的对照小鼠相比，以sgRNA/saCas9处理的小鼠中的HIV-1RNA转录物水平的强烈降低(p<0.001)。数据代表用管家基因Ppia标准化后三重复实验的平均值±SD。

图8A至8D是生物发光成像分析，显示四倍体sgRNA/saCas9 AAV-DJ/8在体内诱导EcoHIV-eLuc的切除。图8A：在EcoHIV-eLuc接种后，通过相同的注射途径，通过眼眶后注射将AAV-DJ/8给药到每只小鼠右眼的血窦(n＝3)中。显示了在EcoHIV接种后第6、9、12和19天的一只小鼠的代表性生物发光成像。测量所有图像的辐射亮度(光子/秒/Sr2)，并用相同的彩虹标度进行伪着色比较以进行公平比较。图8B：在EcoHIV-eLuc接种后的每个指定日，从每组的整个身体(n＝3/组，直到第19天(n＝2))测量的生物发光的总通量(总光子/秒，P/S)。图8C：从右眼上定义的感兴趣区域(region of interest，ROI)测量每只小鼠中EcoHIV-eLuc感染细胞的生物发光输出以用于比较。数据表示平均值±标准偏差，在每次比较中用“*”表示统计学显着性(P<0.05，’学生单侧t检验)。图8D：从每只小鼠颈部淋巴结(n＝3，至第19天(n＝2))的生物发光输出，以用于纵向比较saCas9/gRNA治疗对HIV切除的功效(P值为两侧，使用线性混合效应模型)。

图9A至9I显示PCR基因分型和qPCR分析验证了EcoHIV-eLuc通过四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8在小鼠的各种器官/组织中的基因转导和切除效率。图9A至9C：在用四倍体sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8(上图)或空控制AAV-Cre-DJ/8(下图)感染后第19天，saCas9(图9A)、GagD(图9B)和LTR-1(图9C)的指定组织/器官中的各种程度的基因转导。图9D至9F：常规PCR基因分型显示与阴性对照(下图)相比，在每个指定的组织/器官(上图)中GagD和3'-LTR之间的各种程度的EcoHIV DNA切除。图9G至9I：选自B1M1(图9G)、B1M2(图9H)和B1M3(图9I)的不同组织/器官中的三种指示片段切除类型的定量PCR分析。数据代表三重复反应的平均值±SD，并表示为相同组织/器官中EcoHIV DNA的内部未切割(非靶向)区域的相对水平。BxMx表示框和小鼠编号。

图10A至10F显示在AAV处理后第2(图10A至10C)、3(图10D)和4周(图10E、10F)，由四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ在以HIV_NL-BAL-eLuc接种的人源化BLT小鼠中进行的HIV原病毒DNA的切除。使用引物对T361/T458(用于扩增5'-LTR/Gag)的常规PCR(35个循环)用于侦测HIV原病毒DNA的存在，其在没有saCas9/sgRNA处理的B6M3阴性对照的肺组织中显示弱的野生型带(1.4kb)(图10C)。使用引物对T361/T946(对于5'-LTR/Gag)与来自第一轮PCR的模板(具有引物对T361/T458的22个循环)的巢式PCR(35个循环)，识别在每只BLT小鼠的大多数(如果不是全部)器官/组织中的HIV-1原病毒DNA(图10A-10F)和在用saCas9/sgRNA处理的HIV感染的BLT小鼠的心脏、结肠和阴道中HIV-1切除产生的片段缺失的PCR产物(图10A)中的野生型DNA片段(1.13kb)。使用来自第一轮PCR的模板(25循环，T758/T425)的巢式PCR用引物对T758/T363(对于Gag的/3'-LTR)识别saCas9/sgRNA处理的BLT小鼠的组织/器官中的片段缺失带(图10A、10B、10D、10E)但在未处理的BLT小鼠中无法识别(图10C、10F)。由saCas9编辑产生的片段缺失带以红色框起，然后进行TA克隆和Sanger测序以进行验证(参见图20A，20B，21A，21B)。BxMx表示框和小鼠编号。阳性对照表示在用AAV-saCas9/sgRNA(LTR1+GagD)载体转染的HEK293T细胞中切除EcoHIV-eLuc报告基因。

图11A至11C显示使用TA-克隆和Sanger测序分析验证EcoHIV-eLuc基因组的预期片段缺失。图11A：sgRNA目标位点和PCR引物位置的示意图。图11B：在LTR1和GagD中从PAM(红色文本)算起的第三核苷酸处精确切割后的984个核苷酸缺失的比较分析。图11C：代表性Sanger序列追踪显示LTR1和GagD之间的编辑/重新连接位点。

图12A、12B显示携带HEK293T细胞中的多倍体sgRNA和saCas9的AAV-DJ的功能效价。图12A：单倍体(质体822)、双倍体(质体924和938)和四倍体(质体962)sgRNA/saCas9AAV-DJ的基因组和功能效价的总结。图12B：在96孔板上铺板的HEK293T细胞中的0.1μl AAV-DJ病毒感染后2天，用抗HA抗体进行免疫荧光染色的代表性图像。在三个孔中的每一者中计数阳性细胞，并以每ml的转导单位(TU)计算功能效价。通过使用标准样本的拷贝数的定量PCR分析，由1ml病毒样本(GC/ml)中的病毒基因组拷贝数确定基因组效价。

图13A至13E显示了用双倍体和四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ感染的Tg26转基因小鼠的不同器官/组织中转基因表达和HIV-1基因组切除的类似效率。图13A、13B：感染后1周经尾静脉(图13A)静脉内注射AAV-DJ病毒和第一次注射后1周再注射一次的Tg26小鼠(在100μl PBS中总共为4.15至4.20×10¹²GC/小鼠)的肝脏和脾脏中saCas9和代表性sgRNALTR-1表达卡匣的高效率AAV传递。在第一次注射后1周(图13A)和2周(图13B)收集组织样本。图13C、13D：巢式PCR分析识别了肝脏、心脏、骨髓和脾脏中的片段缺失。用TA克隆和Sanger测序验证代表性缺失片段(红色框)(图13E)。

图14A至14C显示HIV Tg26转基因小鼠的各种器官/组织中的四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8诱导的有效率转基因转导(图14A、14B)和RT-qPCR分析验证的Tat转录。经尾静脉向Tg26小鼠注射纯化的AAV-DJ/8病毒(1.535×10¹²GC/小鼠)一次(图14A)或两次(间隔两周)(图14B)。在最后一次注射后两周，对小鼠实施安乐死并收集牠们的组织，以用于基因组DNA提取和针对编码所示的sgRNA和saCas9的cDNA的PCR基因分型。图14C：代表性的扩增曲线，显示Tat转录的相对Ct值。

图15A和15B显示静脉内注射四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8后2周(图15A)和4周(图15B)的Tg26小鼠的器官/组织中的saCas9蛋白质的表达。用RNeasy Mini试剂盒提取指定器官/组织的总RNA，并通过用RNase-Free DNase Set进行柱内DNA酶消化除去残留的基因组DNA。从总RNA逆转录(RT)的cDNA的实时PCR分析是用于测量转基因saCas9的表达，其主要定位于肝和肺。不使用RT用作基因组DNA污染的阴性对照。没有使用模板作为PCR对照。用兔抗HA标签抗体(红色)免疫染色，并用鬼笔环肽(绿色)处理的组织冷冻切片的代表性显微照片显示saCas9蛋白质在肝和肺中的表达。阴性对照仅使用二抗。白色箭头指出在细胞核中存在saCas9样免疫反应性。比例尺＝10μm。

图16A和16B显示在静脉内给药四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ8后2周，Tg26转基因小鼠的脑(图16A)和肝脏(图16B)中的HIV-1基因组的GagD至3'-LTR1片段缺失的验证。在TA克隆的PCR产物的大多数细菌克隆(在少数克隆中有小插入或缺失)中观察到，切割从PAM算起的第三个核苷酸后预测的4992bp片段缺失(突出显示为红色)。提供代表性的Sanger序列示踪以显示GagD和3'-LTR1之间的切割/重新连接位点(红色箭头)。

图17A至17F是来自T7E1错配切割测定的结果，其显示接受单次静脉内注射四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ8的Tg26小鼠的肝组织中没有脱靶效应。使用从sgRNA/saCas9处理后4周的Tg26小鼠的肝组织中提取的基因组DNA扩增的PCR产物进行T7E1错配切割测定测定法，以检验LTR1(图17A、17B)、LTR3(图17C、17D)和GagD(图17E、17F)的最具潜在脱靶位点的代表。在。靶向PCR产物用作阳性对照。箭头表示用LTR1的引物对T361/T363(图17A)、LTR3的T361/T458(图17C)和GagD(图17E)产生的阳性对照PCR产物的插入缺失突变模式。图17B、17D、17F：包含小鼠基因组DNA中预测的潜在脱靶位点的PCR产物的代表性序列。PAM序列以红色突出显示，并且PCR引物以绿色突出显示。

图18A至18C显示了四倍体sgRNA/saCas9在NCr裸鼠的心脏和肺组织中切除EcoHIV-eLuc。小鼠经右眼的眼眶后注射接受EcoHIV-eLuc给药，然后经相同的注射途径注射携带四倍体sgRNA/saCas9的AAV-DJ8。注射后2周牺牲小鼠。图18A：用引物T758/T363进行的PCR基因分型扩增了具有GagD和3'-LTR1之间缺失的预期片段。从凝胶中提取由红色框表示的心脏和肺中的缺失片段以用于TA克隆和Sanger测序。图18B、18C：代表性的Sanger序列，显示GagD和3'-LTR1之间的预期切割/重新连接位点(红色箭头)。缺失恰好发生在心脏(图18B)和肺(图18C)中从PAM(突出显示为红色)算起的第三个核苷酸处。

图19显示了用于侦测HIV切除效率的qPCR策略。表显示了用于表示未切割、切割和内部EcoHIV DNA水平的所有qPCR引物对，以及显示所有引物位置的图表。

图20A、20B显示了saCas9/sgRNA基因组编辑后，人源化BLT小鼠的器官/组织中5'-LTR1和GagD位点之间HIV-1原病毒DNA的片段缺失的验证。图20A：插入预测的切割位点之间的连接序列和意外序列的示意图。将使用引物T361/T946(来自第一轮PCR的模板，具有引物T361/T458)的巢式PCR产物从凝胶中提取以用于TA克隆，并从每个样本测序2至5个克隆。用剪刀指示从PAM算起的第三个核苷酸处的精确切割位点(突出显示为红色)。识别了5'-LTR1和GagD之间的预测缺失以及各种额外插入(绿色)或缺失(黑点线)。蓝色和粉红色实心条表示切割的残留序列。片段上方的数字表示核苷酸位点的开始和结束。选择具有星形的TA克隆以显示序列细节和追踪。图20B：克隆B5M3-心脏-1的代表性Sanger测序示踪显示5'-LTR1和GagD之间的切割/降解位点(由箭头指示)。5'-LTR1和GagD之间的连接序列分别用橙色和绿色突出显示。引物T361和T946序列分别用蓝色和黄色突出显示。

图21A和21B显示了在基因组编辑后人源化BLT小鼠的器官/组织中GagD和3'-LTR1位点之间HIV-1基因组的片段缺失的验证。图21A：在用引物T758/T458进行第一轮PCR扩增后使用引物T758/T363的巢式PCR产物。PAM序列以红色突出显示。剪刀指示从PAM算起的第三个核苷酸处的精确切割位点。显示GagD和3'-LTR1之间的预测缺失以及以绿色突出显示的额外缺失或意外插入。黑点线表示删除的部分。蓝色和粉红色实心条表示切割位点的位置。片段上方的数字表示核苷酸位点的开始和结束。选择具有星形的TA克隆以显示序列细节。图10B中用绿色箭头指示的小鼠B5M3的hThymus组织的下片段通过测序鉴定为非特异性，而上带是切割的残余序列。图21B：克隆B5M3-hThymus-1的代表性Sanger序列示踪，显示由GagD和3'-LTR1之间的箭头指示的切割/降解位点。切割后的GagD和3'-LTR1序列在删除后连接在一起。切割位点分别用紫色和蓝色突出显示。引物T758和T363序列分别用红色和黄色突出显示。

图22A和22B显示了HIVNL-BaL-eLuc和EcoHIV-eLuc的示意图。图22A：为了保留完整的HIV-1Nef在发病机制和早期HIV感染中的表达，P2A肽(为一种可在上游和下游基因之间切割的自切割肽)以及5'Nef的一部分在框内各报告者的3’-端克隆。2A肽的切割位点是精确且明确的，在这种情况下，预期在Nef的N末端仅有一个额外的氨基酸。图22B：在EcoHIV-eLuc中，HIV gp120被来自亲嗜性鼠白血病病毒的gp80替换以仅感染小鼠细胞，而不是人类细胞。

具体实施方式

基因编辑技术被开发并基于RNA引导的Cas9(称为CRISPR/Cas9)以特异性靶向HIV-1基因组，并消除原病毒DNA的整合拷贝。识别了HIV-1长期重复(LTR)的U3区域内的几个特定序列，其用作产生特异性引导RNA(gRNA)的目标，以通过单个和多倍体Cas9/gRNA复合物编辑其目标序列。该策略可导致潜伏感染的CD4⁺T细胞和单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突细胞)中病毒复制的完全消除(Hu W等人,Proc Natl Acad SciUSA 2014；111:11461-11466；Khalili K等人,J Neurovirol 2015；21:310-321；通过引用并入本文)。CRISPR/Cas9没有遗传毒性作用或宿主基因组的脱靶编辑，但这是第一次显示该技术能够精确切除跨越5'和3'HIV-1LTR的整合原病毒基因组的9709bp DNA片段的能力。多倍体gRNA和Cas9的存在还可以防止随后的HIV-1感染并且成功地用于人类疾病的细胞模型中(Ebina H等人,Sci Rep 2013；3:2510；Liao HK等人,Nat Commun 2015；6:6413；Zhu W等人,Retrovirology 2015；12:22)。

然而，一个重要的挑战涉及功能性CRISPR/Cas9向携带病毒DNA的组织和细胞的体内传递。近年来，腺病毒相关病毒载体(AAV)作为用于治疗由基因缺失或突变引起的人类疾病的基因传递系统而备受关注(Mittermeyer G等人,Hum Gene Ther 2012；23:377-381)。AAV传递方案的优点包括其低毒性和持续的基因表达，其可以在单次给药后延长至12个月(Boudreau RL等人,Hum Mol Genet 2011；20:R21-R27；Naldini L.Nature 2015；526:351-360)。AAV传递系统靶向的最常见疾病包括癌症、心脏衰竭、神经退行性疾病、关节炎、肌营养不良、囊性纤维化和Canavan病等(Bennett J等人,Sci Transl Med.2012；4:120ra15；Janson C等人,Hum Gene Ther 2002；13:1391-1412)。

本发明首次提供了在体内鼠模型中产生整合的HIV基因组部分的切除的组合物和方法。具体地，根据本发明的组合物包括基于AAV的CAs9/gRNA基因编辑传递系统。

因此，本发明的具体实施例涉及用于有效率体内细胞内传递CRISPR/Cas9基因编辑系统的组合物，该系统被开发以用于消除整合的逆转录病毒DNA序列，例如，来自潜伏感染的人类细胞和动物疾病模型的人类免疫缺陷病毒(HIV)。编辑整合的原病毒DNA和消除病毒的方法包括给药CRISPR/Cas9系统的组合物。

本文揭示的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于来自本文揭示的组合物和方法适用的任何物种的同源物。应当理解，当揭示来自特定物种的基因或基因产物时，本揭示内容仅旨在是例示性，并且不应解释为限定条件，除非显示该内容的上下文清楚地表明。因此，本文揭示的基因或基因产物旨在包括来自其他物种的同源及/或直系同源基因和基因产物。

以下对优选具体实施例的描述本质上仅是例示性的，绝不是要限制本发明、其应用或用途。可以在没有呈现理论方面的情况下实践本发明的具体实施例。此外，理论方面是在理解申请人不寻求受所提出的理论约束的情况下提出的。

应该理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的完全理解。然而，本领域的普通技术人员将容易认识到，可以在没有一个或多个具体细节或其他方法的情况下实践本发明。本发明不受所示出的动作或事件的排序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序发生及/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有示出的动作或事件都是实现根据本发明的方法所必需的。

除非另外定义，否则这里使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。将进一步理解，诸如在常用词典中定义的那些术语应当被解释为具有与其在相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且将不被理解为理想化或过于正式的含义，除非在此明确定义。

定义

本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意图限制本发明。如这里所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，在具体实施方式及/或权利要求中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的范围，这些术语旨在是以与“包含”一词类似的方式包含在内。

如本文所使用的，关于对象、组合物、装置、方法、程序、系统等的定义或描述的元素，术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”或“包含(comprised)”及其变体意味着包括在内或者开放式，允许附加元素，从而表明定义或描述的对象、组合物、装置、方法、程序、系统等包括那些指定元素-或者，视情况而定，包括其等同物-并且可以包含其他元素但仍落入定义的对象、组合物、装置、方法、程序、系统等的范畴/定义。

术语“约”或“近似”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。或者，“约”可表示给定值或范围的最多20％，最多10％，最多5％或最多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或程序，该术语可以表示在一个值的5倍内，并且也在2倍内。在申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。

如本文所用，术语“剂”意指包括能够预防、改善或治疗疾病或其他医学病症的任何分子、化学实体、组合物、药物、治疗剂、化学治疗剂或生物剂。该术语包括小分子化合物、反义试剂、siRNA试剂、抗体、酶、肽有机或无机分子、天然或合成化合物等。可以在临床试验期间，预试验期间或FDA批准之后的任何阶段根据本发明的方法测定剂。

如本文所用的术语“抗病毒剂”是指用于治疗病毒的任何分子，并且包括减轻与病毒相关的任何症状的剂，例如，抗热剂、抗炎剂、化学治疗剂等。抗病毒剂包括，但不限于：抗体、适体、佐剂、反义寡核苷酸、趋化因子、细胞因子、免疫刺激剂、免疫调节剂、B细胞调节剂、T细胞调节剂、NK细胞调节剂、抗原呈递细胞调节剂、酶、siRNA、利巴韦林(ribavirin)、核酶、蛋白酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、嘌呤核苷、趋化因子受体拮抗剂、白细胞介素或其组合。

关于核苷的“类似物”包括具有修饰的碱基部分(moiety)及/或修饰的糖部分的合成核苷，例如，通常由Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier&Altmann,Nucl.Acid.Res.,1997,25(22),4429-4443,Toulmé,J.J.,Nature Biotechnology19:17-18(2001)；Manoharan M.,Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139(1999)；Freier S.M.,Nucleic Acid Research,25:4429-4443(1997),Uhlman,E.,DrugDiscovery&Development,3:203-213(2000),Herdewin P.,Antisense&Nucleic Acid DrugDev.,10:297-310(2000))；2'-O，3'-C-链接的[3.2.0]双环阿拉伯糖核苷(see e.g.N.KChristiensen等人,J.Am.Chem.Soc.,120:5458-5463(1998)。此类类似物包括设计用于增强结合特性的合成核苷，例如双倍体或三股稳定性、特异性等。

本文所用的术语“抗体”包括一个或多个病毒特异性结合结构域，其结合并有助于免疫介导的破坏和清除病毒，例如，HIV病毒。抗体或其片段包含IgA、IgM、IgG、IgE、IgD或其组合。

术语“确定”、“测量”、“评估”、“侦测”、“评估”和“测定”在本文中可互换使用，以指代任何形式的测量，并且包括确定元素是否存在。这些术语包括定量及/或定性测定两者。评估可以是相对的或绝对的。“评估存在”包括确定存在的东西的数量，以及确定它是否存在。

本文所用的“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。如本文所定义，“有效”量的化合物或剂(即有效剂量)是指足以产生(例如临床)所需结果的量。

“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，用作在具有确定的核苷酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板(即，rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(其用作基因或cDNA转录的模板)可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。“编码”氨基酸序列的“核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可含有内含子。

如本文所用，术语“根除”逆转录病毒，例如HIV病毒，意指该病毒不能复制，基因组被删除、片段化、降解、遗传失活，或任何其他物理、生物、化学或结构表现，以防止病毒被传播或感染任何细胞或受试者而导致体内病毒清除。在某些情况下，病毒基因组的片段可能是可检测的，但病毒不能复制或感染等。

术语“外源的”表示核酸或多肽是重组核酸构建体的一部分或由其编码，或者不在其天然环境中。例如，外源核酸可以是引入另一物种的一种物种的序列，即异源核酸。通常，经重组核酸构建体将这种外源核酸引入其他物种中。外源核酸也可以是生物体现有的，并且已经重新引入该生物体的细胞中的序列。包含天然序列的外源核酸通常可以通过与外源核酸链接的非天然序列的存在与天然存在的序列区分开，例如，重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。另外，稳定转化的外源核酸通常整合在除了发现天然序列的位置之外的位置。

如本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或翻译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地链接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用组件以表达；用于表达的其他组件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如粘粒、质体(例如，裸露的或包含在脂质体中)和并入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“免疫调节”或“免疫细胞调节剂”是指具有免疫原性(即刺激或增加免疫应答)或免疫抑制(即减少或抑制免疫应答)的化合物、组合物或物质。“免疫系统细胞”或“免疫细胞”意指包括可以测定或参与产生免疫应答的任何免疫系统细胞，包括但不限于B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、干细胞、树突细胞、外周血单核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、基因修饰的免疫细胞(包括杂交瘤)、药物修饰的免疫细胞，以及上述细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。对抗原的功能或反应可以通过任何类型的测定来测量，例如，RIA、ELISA、FACS、蛋白质印迹法等。

术语“诱导或增强免疫应答”是指引起统计学上可测量的诱导或免疫应答的增加超过未给药肽、多肽或蛋白质的对照样本。相反，免疫应答的“抑制”是对已给药肽、多肽或蛋白质的对照样本的免疫应答的可测量的降低，例如，如在自身免疫情境中抑制免疫应答的情况。优选地，免疫应答的诱导或增强导致受试者的预防或治疗反应。免疫应答的实例是I型IFN的产生增加，对病毒和其他病原体的其他类型的感染的抗性增加。增强对病毒的免疫反应(抗病毒反应)，或开发预防病毒感染或消除现有病毒的疫苗。

“单离的”意指从自然状态改变或移除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“单离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全单离的相同核酸或肽是“单离的”。单离的核酸或蛋白质可以以实质上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。

“单离的核酸”是指与天然存在状态下位于其侧翼的序列分离的核酸区段或片段，即已从通常与片段相邻的序列(即，与天然存在的基因组中的片段相邻的序列)除去的DNA片段。该术语也适用于已从天然伴随核酸的其他组分(即在细胞中天然伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质)实质上纯化的核酸。因此，该术语包括，例如，重组DNA，其并入载体、自主复制的质体或病毒实质或原核生物或真核生物的基因组DNA，或作为与其他序列无关的单独的分子存在(即，作为cDNA或者通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)。它还包括：重组DNA(其为编码另外多肽序列的杂合基因的一部分)、互补DNA(cDNA)、天然及/或修饰的单体或链结的线性或环状低聚物或聚合物(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代的和α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯，甲基膦酸酯等)。

术语“调节”是指任何所提及的活性，例如，增加、增强、增加、激动(充当激动剂)、促进、减少(decrease)、减少(reduce)、抑制阻断或拮抗(充当激动剂)。调节可以比基线值增加活性超过1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调制也可以将其活动降低到基线值以下。调制还可以将活动标准化为基线值。

如本文所用，“核酸”、“单离的核酸序列”或“核酸序列”或“cDNA”是指已经与天然存在状态下位于其侧翼的序列分离的核酸区段或片段，例如已从通常与片段相邻的序列除去的DNA片段(例如与其天然存在的基因组中的片段相邻的序列)，并且是指其中已经存在一个或多个内含子的核酸序列)。该术语也适用于已从天然伴随核酸的其他组分(即在细胞中天然伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质)实质上纯化的核酸。因此，该术语包括，例如，重组DNA，其并入载体、自主复制的质体或病毒实质或原核生物或真核生物的基因组DNA，或作为与其他序列无关的单独的分子存在(即，作为cDNA或者通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)。它还包括重组DNA，例如作为编码另外多肽序列的杂合基因的一部分的DNA。

在本文中，术语“核碱基”涵盖天然存在的核碱基以及非天然存在的核碱基。本领域技术人员应该清楚，随后已在自然界中发现了先前被认为是“非天然存在的”的各种核碱基。因此，“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括其杂环类似物和互变异构体。核碱基的说明性实例是腺嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟苷、N⁴,N⁴-乙酸胞嘧啶、N⁶,N⁶-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C₃-C₆)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异胍、肌苷和描述于Benner等人(美国专利号5,432,272)中的“非天然存在”的核碱基，。术语“核碱基”旨在涵盖这些实例中的每一个和及其类似物和互变异构体。特别令人感兴趣的核碱基是被认为是与人类的治疗和诊断应用相关的天然存在的核碱基的腺嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。

如本文所用，术语“核酸序列”、“多核苷酸”和“基因”在整个说明书中可互换使用，并且包括互补DNA(cDNA)、线性或环状低聚物或天然及/或修饰的单体或链结的聚合物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其经取代和α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。

核酸序列可以是“嵌合的”，即由不同区域组成。在本发明的上下文中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其含有两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每个化学区域是由至少一个单体单元(即核苷酸)所组成。这些序列通常包含至少一个区域，其中该序列修饰成显示一种或多种所需特性。

如本文所用，“核苷”包括天然核苷，包括2'-脱氧和2'-羟基形式，例如，如Kornberg和Baker，DNA Replication，第2版中所述(Freeman，旧金山，1992年)。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可发生或不发生，并且该描述包括事件或情况发生的实例和不发生的实例。

免疫原性组合物的“肠胃外”给药包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射，或输注技术。

术语“患者”或“个体”或“受试者”在本文中可互换使用，并且是指待治疗的哺乳动物受试者，优选为人类患者。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物，兽医应用和疾病的动物模型的开发，包括但不限于啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠，以及灵长类动物。

如本文所用，除非另有说明，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指不同大小的氨基酸聚合物。这些术语并不意味着氨基酸聚合物的特定长度。因此，例如，无论是使用重组技术、化学或酶促合成产生的、还是天然存在的，术语寡肽，蛋白质和酶包括在多肽或肽的定义内。该术语还包括已经修饰或衍生化的多肽，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等。

术语“多核苷酸”是核苷酸链，也称为“核酸”。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方法获得的所有核酸序列，并且包括天然存在的和合成的核酸。

当在多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可以包括与野生型基因相关的多核苷酸序列。该定义还可包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可以与参考分子具有显着的同一性，但由于mRNA加工过程中外显子的交替剪接，将通常具有更多或更少数量的多核苷酸。相应的多肽可具有额外的功能结构域或不存在结构域。物种变体是不同物种有所不同的多核苷酸序列。在本发明中特别有用的是野生型目标基因产物的变体。变体可以由核酸序列中的至少一个突变产生，并且可以导致改变的mRNA或在其结构或功能可以改变或不改变的多肽中。任何给定的天然或重组基因可以没有、或有一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。这些类型的变化中的每一种可以在给定序列中单独或发生，与其他变化组合发生一次或多次。

所得多肽通常将相对于彼此具有显着的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态变体还可以包括“单核苷酸多态性”(SNP)或其中多核苷酸序列变化一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可以表示，例如，具有疾病状态倾向的某些群体，即易感性与抗性。

术语“目标核酸”是指来自逆转录病毒的核酸序列，借此寡核苷酸或引导核酸序列(如gRNA)设计成与其特异性地杂交。存在或不存在待检测的目标核酸，或待定量的目标核酸的量。目标核酸具有与靶向目标的相应寡核苷酸的核酸序列互补的序列。术语目标核酸可以指寡核苷酸所针对的较大核酸或整个序列(例如基因或mRNA)的特定子序列。

如本文所用，多肽的“变体”是指被一个或多个氨基酸残基改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用异亮氨酸置换亮氨酸)。更罕见的是，变体可能具有“非保守”变化(例如，用色氨酸置换甘氨酸)。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入，或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，在确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的引导。

“治疗”是为了预防病症的发展或改变疾病的病理或症状而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防性措施。“治疗”也可以指定为姑息治疗。需要治疗的患者包括那些已经患有疾病的患者以及需要预防病症的患者。因此，对状态、病症或病况的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防或延迟可能患病或易有状态、病症或病况但尚未经历或展现该状态、病症或病况(但尚未经历或展现该状态、病症或病况的临床或亚临床症状)的人或其他哺乳动物中发展的状态、病症或病况的临床症状的出现；(2)抑制状态、病症或病况，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解疾病，即造成状态、病症或病况或其临床或亚临床症状中的至少一者的消退。对于要治疗的个体的益处是统计学上显着的或至少对患者或医生可察觉。

如本文所定义，“治疗有效”量的化合物或剂(即有效剂量)是指足以产生治疗(例如，临床)所需结果的量。该组合物可以每天一次或多次给药至每周一次或多次；包括每隔一天一次。技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况及/或年龄、以及其他疾病存在。此外，用治疗有效量的本发明化合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。

如本文所用，术语“试剂盒”是指用于传递材料的任何传递系统。包括术语“试剂盒”是用于研究和临床应用的试剂盒。在反应测定法的背景下，此类传递系统包括允许反应试剂(例如，在适当的容器中的寡核苷酸、酶等)及/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行测定法的书写说明)从一个位置到另一个位置的储存、运输或传递的系统。。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关反应试剂及/或支持材料的外壳(例如盒子)。如本文所用，术语“片段化试剂盒”是指包含两个或更多个个别容器的传递系统，每个容器包含总试剂盒组分的子部分。容器可以一起或分开地传递到预期的接收者。例如，第一容器可含有用于测定法的酶，而第二容器含有寡核苷酸或脂质体。术语“片段化试剂盒”旨在涵盖包含根据美国联邦食品、药物和化妆品法案的第520(e)部分规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。实际上，包括两个或更多个个别容器(每个容器包含总试剂盒组分的子部分)的任何传递系统包括在术语“片段化试剂盒”中。相反，“组合的试剂盒”是指在单个容器中的反应测定中包含所有组分的传递系统。(例如，在容纳每个所需组分的单个盒子中)。术语“试剂盒”包括片段化和组合的试剂盒。

术语“序列同一性百分比”或具有“序列同一性”是指任何给定查询序列与主题序列之间的同一性程度。

术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指当适当地给药动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括可以使用的任何和所有作为药学上可接受的物质的介质的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

范围：贯穿本揭示内容，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范畴的硬性限制。因此，应该认为范围的描述具体揭示了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应该认为对诸如1至6的范围的描述具有特别揭示的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6，3至6以及在该范围内的个别数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

任何氨基酸序列具体由Swiss Prot.或GENBANK登录号提及时，该序列通过引用方式并入本文。与登录号相关的信息，例如信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域、启动子序列和翻译起始的识别，也通过引用方式全部并入本文。

一般技术

为了进一步阐述可用于实施本发明的一般技术，从业者可参考细胞生物学、组织培养、胚胎学和生理学的标准教科书和综述。

分子和细胞生物化学中的一般方法可以在诸如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd Ed.(Sambrook等人，Harbor Laboratory Press 2001)；ShortProtocols in Molecular Biology，4^th Ed.(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for GeneTherapy(Wagner等人编辑，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编辑，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑，Academic Press1997)；以及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths，John Wiley&Sons 1998)等标准教科书中找到。本揭示内容中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。

组合物

本发明的具体实施例涉及用于在体外或体内从感染细胞切除及/或根除逆转录病毒核酸序列的组合物。治疗或预防感染的方法包括使用本文所体现的组合物。

简言之，将具有识辨识病毒长末端重复序列(LTR)和群组特异性抗原(Gag)的引导RNA(gRNA)的Cas9内切核酸酶通过重组腺相关病毒9(rAAV9)载体传递至Tg26转基因小鼠。鼠细胞携带整合到染色体8中的多个HIV-1拷贝。表达saCas9/gRNA的Tg26胚胎鼠成纤维细胞的rAAV9证实了编辑HIV-1DNA整合拷贝的能力和功效。rAAV9：saCas9/gRNA导致整合的HIV-1DNA的切割。侦测到跨越脾脏、肝脏、心脏、肺、肾、脑和循环淋巴细胞中HIV-1LTR和Gag基因之间的940bp DNA片段的切除。这些结果证明了rAAV9有效地将功能活性的CRISPR/saCas9传递至含有病毒的组织的能力。

因此，本发明的特征在于包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸和与逆转录病毒(例如HIV)中的目标序列互补的引导RNA的组合物，以及包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸的药物制剂。还有的特征在于包含与CRISPR相关的内切核酸酶多肽和与HIV中的目标序列互补的引导RNA的组合物，以及包含与CRISPR相关的内切核酸酶多肽和与HIV中的目标序列互补的引导RNA的药物制剂。

还有的特征在于施用组合物以治疗逆转录病毒感染(例如HIV感染)的方法，以及消除病毒复制的方法和预防HIV感染的方法。本文所述的治疗方法可以与其他抗逆转录病毒疗法(例如HAART)联合进行。

本发明的方法可用于从宿主生物中除去病毒或其他外来遗传物质，而不干扰宿主遗传物质的完整性。核酸酶可用于靶向病毒核酸，从而干扰病毒复制或转录或甚至从宿主基因组中切除病毒遗传物质。当病毒核酸作为细胞内的颗粒存在时或当其整合到宿主基因组中时，核酸酶可以被特异性地靶向以仅去除病毒核酸而不作用于宿主材料。靶向病毒核酸可以使用靶向病毒基因组材料的序列特异性部分(例如引导RNA)进行，以便被核酸酶破坏，并且不靶向宿主细胞基因组。在一些具体实施例中，使用共同靶向并选择性编辑或破坏病毒基因组材料的CRISPR/Cas核酸酶和引导RNA(gRNA)。CRISPR(簇状规则间隔短回文重复)是细菌免疫系统中天然存在的元素，可保护细菌免受噬菌体感染。引导RNA将CRISPR/Cas复合物定位于病毒目标序列。复合物的结合将Cas内切核酸酶定位于病毒基因组目标序列，导致病毒基因组中断。可以使用其他核酸酶系统，包括例如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或可用于降解或干扰病毒核酸而不干扰宿主的遗传物质的常规功能的任何其他系统。

该组合物可用于以病毒生命周期的任何形式或任何阶段靶向病毒核酸。靶向的病毒核酸可以作为独立的颗粒存在于宿主细胞中。在优选的具体实施例中，病毒感染是潜伏的，病毒核酸整合到宿主基因组中。可以靶向任何合适的病毒核酸以进行切割和消化。

在具体实施例中，本发明的组合物包括编码基因编辑试剂的核酸和至少一种与逆转录病毒中的目标序列互补的引导RNA(gRNA)。在具体实施例中，基因编辑剂包括：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活因子、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节子、同源物、直系同源物或其组合。

在一个具体实施例中，组合物包含编码基因编辑试剂的病毒载体和至少一种引导RNA(gRNA)，其中该gRNA与逆转录病毒基因序列的目标核酸序列互补，包含：编码及/或非编码逆转录病毒基因序列的目标核酸序列、逆转录病毒群特异性抗原的目标核酸序列或其组合。gRNA与逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、组特异性抗原或其组合互补。在该具体实施例中，基因编辑剂是簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物。CRISPR相关核酸内切酶的实例是Cas9或其同源物或直系同源物。

在另一个具体实施例中，表达载体包含编码基因编辑试剂的单离的核酸和至少一种引导RNA(gRNA)，其中该gRNA与逆转录病毒基因序列的目标核酸序列互补、群组特异性抗原的目标核酸序列或其组合。在具体实施例中，基因编辑剂包括：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活因子、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节子、同源物、直系同源物或其组合。在一个具体实施例中，基因编辑剂是簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶、或其同源物或直系同源物。在另一个具体实施例中，CRISPR相关内切核酸酶是Cas9或其同源物或直系同源物。在一个具体实施例中，gRNA与逆转录病毒基因序列的长末端重复序列(LTR)、群组特异性抗原或其组合互补。

在一些具体实施例中，逆转录病毒是慢病毒，其中该慢病毒包含：人类免疫缺陷病毒；猿猴免疫缺陷病毒；猫科动物免疫缺陷病毒；牛免疫缺陷病毒或人类T细胞白血病病毒。因此，在一个具体实施例中，目标序列包含人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列(LTR)内的序列。人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列内的序列的实例包括U3、R或U5区内的序列。

在具体实施例中，病毒载体包含腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。在一些具体实施例中，病毒载体是腺相关病毒载体，其包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。在一个具体实施例中，AAV载体是AAV血清型9(AAV₉)。

在一些具体实施例中，表达载体编码反式激活小RNA(tracrRNA)，其中该反式激活小RNA(tracrRNA)序列与编码引导RNA的序列融合。

在另一个具体实施例中，表达载体还包含编码核定位信号的序列。

基因编辑剂：本发明的组合物包括至少一种基因编辑剂，其包含CRISPR相关核酸酶，例如Cas9和Cpf1gRNA、Argonaute内切核酸酶家族，簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN))、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切或外切核酸酶或其组合。参见通过引用方式并入的Schiffer,2012,J Virol 88(17):8920-8936。

该组合物还可以包括仅靶向RNA的C2c2-第一的天然存在的CRISPR系统。第2类VI-A CRISPR-Cas效应物“C2c2”表现出RNA引导的RNase功能。来自细菌沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的C2c2提供对RNA噬菌体的干扰。体外生化分析显示C2c2是由单个crRNA引导，并且可以被编程以切割携带互补前间隔的ssRNA目标。在细菌中，C2c2可以被编程以减弱(knock down)特定的mRNA。切割是由两个保守的HEPN结构域中的催化残基介导，其为其中产生催化失活的RNA结合蛋白的突变。这些结果证明了C2c2作为新的RNA靶向工具的能力。

可以对C2c2进行编程以切割细菌细胞中的特定RNA序列。C2c2的RNA聚焦作用互补了靶向DNA(即细胞识别和功能的基因组蓝图)的CRISPR-Cas9系统。仅靶向RNA的能力(其有助于执行基因组指令)提供了以高通量方式特异性操纵RNA的能力与更广泛地操纵基因功能。

CRISPR/Cpf1是一种类似于CRISPR/Cas9系统的DNA编辑技术，由来自麻省理工学院和Broad Institute的Feng Zhang团队特征化。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA引导的内切核酸酶。这种获得性免疫机制存在于普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属(Francisella)中。它可以防止病毒的遗传损害。Cpf1基因与CRISPR基因座相关，编码使用引导RNA来发现和切割病毒DNA的核酸内切酶。Cpf1是一种比Cas9更小且更简单的核酸内切酶，克服了一些CRISPR/Cas9系统的限制。CRISPR/Cpf1可以具有多种应用，包括遗传性疾病和退行性疾病的治疗。如上所述，Argonaute是另一种潜在的基因编辑系统。

CRISPR相关内切核酸酶：在具体实施例中，组合物包含CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9)，或其同源物和与逆转录病毒(例如HIV)中的目标序列互补的引导RNA。

CRISPR(簇状规则间隔短回文重复)存在于细菌中，被认为可保护细菌免受噬菌体感染。它最近被用作改变真核生物DNA中基因表达的手段，但尚未提出作为抗病毒疗法或更广泛地作为破坏基因组物质的方法。相反，它已被用于引入插入或缺失，以作为增加或减少目标细胞或细胞群的DNA中的转录的方式。例如，参见Horvath等人,Science(2010)327:167-170；Terns等人,Current Opinion in Microbiology(2011)14:321-327；Bhaya等人,Annu Rev Genet(2011)45:273-297；Wiedenheft等人,Nature(2012)482:331-338)；JinekM等人,Science(2012)337:816-821；Cong L等人,Science(2013)339:819-823；Jinek M等人,(2013)eLife 2:e00471；Mali P等人(2013)Science 339:823-826；Qi L S等人(2013)Cell 152:1173-1183；Gilbert L A等人(2013)Cell 154:442-451；Yang H等人(2013)Cell154:1370-1379；以及Wang H等人(2013)Cell 153:910-918)。

CRISPR方法使用核酸酶(即CRISPR相关(Cas))，其与小RNA复合作为引导(gRNA)以在任何基因组位置的前间隔相邻基序(PAM)上游以序列特异性方式切割DNA。CRISPR可以使用称为crRNA和tracrRNA的单独的引导RNA。将这两种单独的RNA组合成单个RNA，以通过设计短引导RNA而可进行使特定位点的哺乳动物基因组切割。Cas和引导RNA(gRNA)可通过已知方法合成。Cas/引导-RNA(gRNA)使用非特异性DNA切割蛋白Cas和RNA寡核苷酸与目标杂交，并募集Cas/gRNA复合物。参见Chang等人,2013,Cell Res.23:465-472；Hwang等人,2013,Nat.Biotechnol.31:227-229；Xiao等人,2013,Nucl.Acids Res.1-11。

通常，CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别及/或RNA结合结构域。RNA识别及/或RNA结合结构域与引导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域(即DNase或RNase结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNase结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。CRISPR/Cas9诱导的突变可使原病毒失活的机制不同。例如，突变可以影响原病毒复制和病毒基因表达。突变可包含一个或多个缺失。缺失的大小可以从单个核苷酸碱基对到约10,000个碱基对不等。在一些具体实施例中，缺失可包括全部或实质上全部的原病毒序列。在一些具体实施例中，缺失可以根除原病毒。突变还可以包含一个或多个插入，即向原病毒序列添加一个或多个核苷酸碱基对。插入序列的大小也可以变化，例如从约一个碱基对到约300个核苷酸碱基对。突变可以包含一个或多个点突变，即用另一个核苷酸置换单个核苷酸。有用的点突变是那些具有功能性后果的突变，例如，导致氨基酸密码子转化为终止密码子的突变，或导致产生非功能性蛋白质的突变。

在实施例中，CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白，或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。可修饰CRISPR/Cas样蛋白以增加核酸结合亲和力及/或特异性、改变酶活性及/或改变蛋白质的另一性质。例如，可修饰、缺失或失活CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即DNase，RNase)结构域。或者，可截短CRISPR/Cas样蛋白以除去对融合蛋白功能不是必需的结构域。还可以截短或修饰CRISPR/Cas样蛋白以优化融合蛋白的效应结构域的活性。

在一些具体实施例中，CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白质或其片段。在其他具体实施例中，CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自修饰的Cas9蛋白质。例如，可以修饰Cas9蛋白质的氨基酸序列以改变蛋白质的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。或者，可以从蛋白质中除去不涉及RNA引导的切割的Cas9蛋白质的结构域，使得修饰的Cas9蛋白质小于野生型Cas9蛋白质。

已经识别了三种类型(I至III)的CRISPR系统。CRISPR簇包含间隔物，其序列与先前的移动组件互补。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR RNA(crRNA)。在具体实施例中，CRISPR/Cas系统可以是I型、II型或III型系统。合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG，CasH、Csy1、Csy2，Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)，Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。

在一个具体实施例中，RNA引导的内切核酸酶衍生自II型CRISPR/Cas系统。CRISPR相关核酸内切酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，具有强内切核酸酶活性以切割靶DNA。Cas9由含有约20个碱基对(bp)的独特目标序列(称为间隔区)的成熟crRNA和作核糖核酸酶III辅助加工前crRNA的引导反式激活的小RNA(tracrRNA)所引导。crRNA：tracrRNA双倍体经crRNA上的间隔区与靶DNA上的互补序列(称为前间隔)之间的互补碱基配对将Cas9引导至目标DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)前间隔相邻基序(PAM)以指定切割位点(从PAM算起的第3个核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或经合成茎环(AGAAAU)工程化到人工融合小引导RNA(sgRNA)中以模拟天然crRNA/tracrRNA双倍体。尽管人工sgRNA的切割效率低于具有分别表达的crRNA和tracrRNA的系统的切割效率，这样的sgRNA，如shRNA，可以合成或体外转录以用于直接RNA转染或由U6或H1促进的RNA表达载体表达。

CRISPR相关核酸内切酶Cas9核酸酶可具有与野生型化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)序列相同的核苷酸序列。CRISPR相关内切核酸酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌属，例如嗜热生物。Cas9核酸酶序列可以衍生自其他物种，包括但不限于：达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、粉红链链霉菌(Streptomyces roseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、海洋微颤蓝菌(Microscilla marina)、伯克氏细菌(Burkholderialesbacterium)、食萘极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属(Polaromonassp.)海洋固氮蓝藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯醋酸喜盐菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、南非金矿菌(Candidatus desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficle)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、硫细菌酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、亚硝化球菌嗜盐菌(Nitrosococcus halophilus)、亚硝化球菌(Nitrosococcus watsonii)、海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、成簇细枝菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestig atum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)，泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、蓝菌念珠藻属(Nostoc sp.)、极大螺旋藻(Arthrospiramaxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、螺旋藻属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoriasp.)、运动石孢菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、或海滨蓝藻菌(Acaryochloris marina)。铜绿假单胞菌、大肠杆菌或其他测序的细菌基因组和古细菌或其他原核微生物也可以是本文揭示的具体实施例中使用的Cas9序列的来源。

可以修饰野生型酿脓链球菌Cas9序列。可以对核酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。序列可以是例如由Genbank登录号KM099231.1GI：669193757；KM099232.1GI：669193761；或KM099233.1GI：669193765中列出的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者，Cas9核酸酶序列可以是例如包含在商业上可获得的载体中的序列，例如来自Addgene(Cambridge，MA)的PX330或PX260。在一些具体实施例中，Cas9内切核酸酶可具有氨基酸序列，其是Genbank登录号KM099231.1GI：669193757；KM099232.1GI：669193761；或KM099233.1GI：669193765的任何Cas9内切核酸酶序列的变体或片段；或PX330或PX260的Cas9氨基酸序列(Addgene，Cambridge，MA)。可以修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物学活性变体，并且这些变体可以具有或可以包括例如由于含有一个或多个突变(例如，添加、缺失或取代突变或这些突变的组合)而与野生型Cas9不同的氨基酸序列。一个或多个取代突变可以是取代(例如，保守氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可与野生型Cas9多肽具有至少或约50％(例如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性)序列同一性的氨基酸序列。保守氨基酸取代通常包括落入以下群组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括那些由遗传密码自然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如，具有D-构型，而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括作为标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如，可以使用吡咯赖氨酸代替赖氨酸，并且可以使用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未发现，但符合氨基酸的基本式并且可以并入肽中的残基。这些包括D-别异亮氨酸(2R，3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他示例，可以查阅教科书或全球网络(目前由加州理工学院维护的站点显示已经成功并入功能性蛋白质的非天然氨基酸的结构)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变，其参与链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)对DNA切口(而不是切割)以产生单链断裂，随后通过HDR的优先修复可能会降低来自脱靶双链断裂的不想要的插入缺失突变的频率。

Cas9可以是直系同源的。已经使用了六个较小的Cas9直系同源物，并且报吿显示来自金黄色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9可以编辑基因组，其效率类似于SpCas9，同时短于1千个碱基。

除了所述的野生型和变体Cas9内切核酸酶之外，本发明的具体实施例还包括CRISPR系统，其包括新开发的骤然减少脱靶切割的“增强特异性”化脓性链球菌Cas9变体(eSpCas9)。这些变体用丙氨酸取代工程改造，以中和与非靶DNA链相互作用的凹槽中的带正电荷的位点。该修饰的目的是减少Cas9与非靶链的相互作用，从而促进目标和非目标链之间的再杂交。这种修饰的效果是gRNA和目标DNA链之间更严格的Watson-Crick配对的要求，这限制了脱靶的切割(Slaymaker,I.M.等人(2015)DOI:10.1126/science.aad5227)。

在某些具体实施例中，将发现三种变体具有最佳的切割效率和最少的脱靶效应：SpCas9(K855A)、SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)(亦称为eSpCas9 1.0)和SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)(亦称为eSPCas9 1.1)用于组合物中。本发明不限于这些变体，还包括所有Cas9变体(Slaymaker,I.M等人(2015))。

本发明还包括另一种类型的增强特异性Cas9变体，“高保真”spCas9变体(HF-Cas9)(Kleinstiver,B.P.等人,2016,Nature.DOI:10.1038/nature16526)。

如本文所用，术语“Cas”意指包括所有包含变体、突变体、直系同源物、高保真变体等的Cas分子。

引导核酸序列：根据本发明的引导RNA序列可以是正义或反义序列。gRNA的特定序列可以变化，但是，无论序列如何，有用的引导RNA序列将是那些使脱靶效应最小化同时实现病毒的高效率和完全消融的序列。引导RNA序列通常包括前间隔区相邻基序(PAM)。PAM的序列可以根据所用CRISPR内切核酸酶的特异性需求而变化。在源自化脓性链球菌的CRISPR-Cas系统中，目标DNA通常紧接在5'-NGG–前间隔区相邻基序(PAM)之前。因此，对于化脓性链球菌Cas9，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其他Cas9直系同源物可能具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌的Cas9对于CRISPR 1需要5'-NNAGAA，对于CRISPR3需要5'-NGGNG，并且脑膜炎奈瑟球菌(Neiseria meningitidis)需要5'-NNNNGATT。引导RNA的特定序列可以变化，但是无论序列如何，有用的引导RNA序列将是那些使脱靶效应最小化同时实现逆转录病毒(例如HIV病毒)的高效率和完全消融的序列。引导RNA序列的长度可以在约20至约60或更多个核苷酸之间变化，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40，约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。

引导RNA序列可以配置为单个序列或一个或多个不同序列的组合，例如多倍体构型。多倍体构型可包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的引导RNA的组合。在某些具体实施例中，组合物包含多种不同的gRNA分子，每种分子靶向不同的目标序列。在某些具体实施例中，该多倍体策略提供增加的功效。这些多倍体gRNA可以在不同载体中单独表达或在单个载体中表达。

本发明的组合物包括编码引导RNA(gRNA)的序列，其包含与逆转录病毒中的目标序列互补的序列。逆转录病毒可以是慢病毒，例如人类免疫缺陷病毒；猿猴免疫缺陷病毒；猫科动物免疫缺陷病毒；牛免疫缺陷病毒或人类T细胞白血病病毒。人类免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。目标序列可包括来自任何HIV的序列，例如HIV-1和HIV-2，及其任何循环重组形式。HIV的遗传变异性反映在已描述的多个群体和亚型中。在洛斯阿拉莫斯(LosAmos)HIV数据库和纲要中汇编了一系列HIV序列。本发明的方法和组合物可以应用于来自任何这些不同群组、亚型和循环重组形式的HIV。这些包括例如HIV-1主要群组(通常称为M组)和次要群组N、O和P群组，以及但不限于以下任何亚型A、B、C、D、F、G、H、J和K或HIV群组(例如，但不限于以下任何群组N、O和P)。该方法和组合物还可以应用于HIV-2和任何A、B、C、F或G进化枝(也称为“亚型”或“组”)，以及任何循环重组形式的HIV-2。

引导RNA可以是与编码序列或非编码序列互补的序列。例如，引导RNA可以与HIV序列互补，例如长末端重复序列(LTR)、蛋白质编码序列或调节序列。在一些具体实施例中，引导RNA包含与HIV长末端重复(LTR)区互补的序列。HIV-1LTR的长度约为640bp。HIV-1长末端重复序列(LTR)分为U3、R和U5区。LTR含有基因表达所需的所有信号，并涉及原病毒整合到宿主细胞基因组中。例如，在U3内发现基础或核心启动子、核心增强子和调节区，而在R内发现反式激活反应组件。在HIV-1中，U5区包括几个子区，例如，涉及转录激活的TAR或反式激活响应组件；参与二聚化和基因组包装的多聚腺苷酸，；PBS或引物结合位点；Psi或包装信号；DIS或二聚体起始位点。

有用的引导序列与LTR的U3、R或U5区互补。引导RNA序列可包含例如与序列或共有序列的目标前间隔序列互补的序列。然而，本发明不限于此，可以选择引导RNA序列以靶向任何变体或突变HIV序列。在一些具体实施例中，使用超过一种的引导RNA序列，例如第一引导RNA序列和第二引导RNA序列，其中该第一和第二引导RNA序列与任何上述逆转录病毒区域中的目标序列互补。在一些具体实施例中，引导RNA可包括变体序列或准物种序列。在一些具体实施例中，引导RNA可以是对应于经受治疗的受试者携带的病毒基因组中的序列的序列。因此，例如，可以获得受试者携带的HIV病毒中特定U3、R或U5区的序列，并且可以使用与患者特定序列互补的引导RNA。

在一些具体实施例中，引导RNA可以是与蛋白质编码序列(例如，编码一种或多种病毒结构蛋白的序列(例如、gag、pol、env和tat))互补的序列。因此，该序列可以与gag多蛋白内的序列互补，例如MA(基质蛋白，p17)；CA(衣壳蛋白，p24)；SP1(间隔肽1，p2)；NC(核衣壳蛋白，p7)；SP2(间隔肽2，p1)和P6蛋白质；pol，例如逆转录酶(RT)和RNase H，整合酶(IN)和HIV蛋白酶(PR)；例如，gp160，或gp160的切割产物，例如gp120或SU，和gp41或TM；或tat，例如72-氨基酸的一个外显子Tat或86至101个氨基酸的两个外显子Tat。在一些具体实施例中，引导RNA可以是与编码辅助蛋白的序列互补的序列，包括例如vif、nef(阴性因子)vpu(病毒蛋白U)和tev。

在一些具体实施例中，如上所述，序列可以是与结构或调节组件互补的序列，例如LTR；TAR(病毒反式激活的目标序列)、Tat蛋白质和细胞蛋白质的结合位点，由HIV-1中病毒mRNA的大约前45个核苷酸(或HIV-2中的前100个核苷酸)组成发夹茎环结构；RRE(Rev响应组件)，在HIV-1的env区域内编码的RNA组件，由大约200个核苷酸组成(从HIV-1转录起始位置7710至8061，跨越gp120和gp41的边界)；PE(Psi组件)，一组4个茎环结构位于Gag起始密码子之前并与之重叠；SLIP，一个TTTTTT“光滑的位点”，接着是一个茎环结构；CRS(顺式激活抑制序列)；INS抑制/不稳定RNA序列，其在例如HIV-1的gag区域的核苷酸414至631处发现。

引导RNA序列可以是正义或反义序列。引导RNA序列通常包括原间隔区相邻基序(PAM)。PAM的序列可以根据所用CRISPR内切核酸酶的特异性要求而变化。在源自化脓性链球菌的CRISPR-Cas系统中，目标DNA通常紧接在5'-NGG原间隔区相邻基序(PAM)之前。因此，对于化脓性链球菌Cas9，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其他Cas9直系同源物可具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌的Cas9对于CRISPR 1需要5'-NNAGAA，而对于CRISPR3需要5'-NGGNG，并且脑膜炎奈瑟球菌需要5'-NNNNGATT。引导RNA的特定序列可以变化，但是无论序列如何，有用的引导RNA序列将是那些使脱靶效应最小化同时实现基因组整合的HIV-1原病毒的高效率和完全消融的序列。引导RNA序列的长度可以在约20至约60或更多个核苷酸之间变化，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。有用的选择方法识别外源病毒基因组和宿主细胞基因组(包括内源性逆转录病毒DNA)之间具有极低同源性的区域，包括使用12碱基对+NGG目标选择标准进行生物信息学筛选以排除脱靶的人类转录组或(甚至很少)未翻译的基因组位点；避免HIV-1LTR启动子内的转录因子结合位点(可能在宿主基因组中为保守的)；选择LTR-A和-B引导的30碱基对gRNA以及前crRNA系统，反映原始的细菌免疫机制以提高特异性/效率对(vs.)20碱基对gRNA-、基于嵌合crRNA-tracRNA的系统和WGS、Sanger测序和SURVEYOR测定法，以识别和排除潜在的脱靶效应。

引导RNA序列可以配置为单个序列或一个或多个不同序列的组合，例如多倍体构型。多倍体构型可包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的引导RNA的组合，例如U3、R或U5中序列的任何组合。在一些具体实施例中，可以使用LTR A、LTR B、LTR C和LTR D的组合。当组合物以表达载体给药时，引导RNA可以由单一载体编码。或者，可以设计多种载体，每种载体包括两种或更多种不同的引导RNA。有用的配置将导致在切割位点之间切除病毒序列，导致HIV基因组的消除或HIV蛋白表达。因此，使用两种或更多种不同的引导RNA促进了由CRISPR内切核酸酶识别的切割位点之间的病毒序列的切除。切除区域的大小可以从单核苷酸到数千核苷酸变化。示例性切除区域在实施例中描述。

在一些具体实施例中，gRNA包含与SEQ ID NO：1至76中的任一者具有至少60％序列同一性的序列。在一些具体实施例中，gRNA包含SEQ ID NO：1至76中的任一者。

当组合物作为核酸给药或包含在表达载体内时，CRISPR内切核酸酶可以由与引导RNA序列相同的核酸或载体编码。或者，或另外，CRISPR内切核酸酶可以在与引导RNA序列物理上分开的核酸中或在单独的载体中编码。

在一些具体实施例中，RNA分子例如将crRNA、tracrRNA、gRNA工程化为包含一个或多个修饰的核碱基。例如，RNA分子的已知修饰可以在例如Genes VI,Chapter 9(“Interpreting the Genetic Code”),Lewis,ed.,(1997年，牛津大学出版社，纽约)和Modification and Editing of RNA,Grosjeanand Benne eds.(1998年，ASM Press，华盛顿特区)。修饰的RNA组分包括以下：2'-O-甲基胞苷；N4甲基胞苷；N⁴-2'-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰基胞苷；5-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；2'-O-甲基-5-甲酰基胞苷；3-甲基胞苷；2-硫代胞苷；甲基二氢咪唑；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；2-硫代2'-O-甲基尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；4-硫代尿苷；核糖基胸腺嘧啶；5,2'-O-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；；尿苷5-羟基乙酸；尿苷5-羟基乙酸甲酯；5-羧甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基-2'-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基2'-O-甲基尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基2'-O-甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；二氢尿苷；二氢核糖基胸腺嘧啶；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N⁶N-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2'-O-三甲基腺苷；2-甲硫基-N⁶N-异戊烯基；N⁶-(顺式羟基异戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N⁶-(顺式羟基异戊烯基)腺苷；N⁶-甘氨酰氨基甲酰基)腺苷；N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-羟基去甲氨基甲酰胺腺苷；2-甲硫基-N⁶-羟基正缬胺酰基氨基甲酰基腺苷；2'-O-核糖腺苷(磷酸盐)；肌苷；2'O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1；2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2'-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；7-甲基鸟苷；N²；7-二甲基鸟苷；N²；N²；7-三甲基鸟苷；Y核苷(wyosine)；甲基Y核苷；修饰不足的羟基丁醚；怀丁苷；羟基怀丁苷；过氧基怀丁苷；辫苷；环氧基辫苷；半乳糖辫苷；甘露糖基-辫苷；7-氰基-7-脱氮鸟苷；古菌苷(arachaeosine)[也称为7-甲酰胺基-7-脱氮鸟苷]；和7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。

修饰的或突变的核酸序列：在一些具体实施例中，任何核酸序列可以被修饰或衍生自天然核酸序列，例如，通过引入突变、缺失、取代、修饰核碱基、骨架等。核酸序列包括载体、基因编辑剂、gRNA、tracrRNA等。本发明设想的一些修饰核酸序列的实例包括那些含有修饰骨架者，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间链接或短链杂原子或杂环的糖间链接。在一些具体实施例中，修饰的寡核苷酸包含那些具有硫代磷酸酯骨架者和那些具有杂原子骨架者、CH₂-NH-O-CH₂、CH,-N(CH₃)-O-CH₂[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、CH₂-O-N(CH₃)-CH₂、CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂和O-N(CH3)-CH2-CH₂骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH，)。De Mesmaeker等人,Acc.Chem.Res.1995,28:366-374)揭露的酰胺骨架也在此体现。在一些具体实施例中，具有吗啉基骨架结构的核酸序列(Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)、肽核酸(PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架置换，且核碱基直接或间接地结合聚酰胺骨架的氮杂氮原子(Nielsen等人,Science 1991,254,1497)。核酸序列还可包含一个或多个取代的糖部分。核酸序列也可以具有糖模拟物，例如以环丁基替代戊呋喃糖基。

核酸序列还可以另外地或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟苷(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中偶尔或短暂发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，并且在本领域中通常被称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖HMC，以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟苷、7-脱氮鸟苷、N⁶(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；Gebeyehu,G.等人Nucl.Acids Res.1987,15:4513)。可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5-Me-C取代使核酸双倍体稳定性增加0.6℃至1.2℃。(Sanghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRCPress,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

本发明核酸序列的另一种修饰涉及化学连接核酸序列的一个或多个部分或缀合物，其增强寡核苷酸的活性或细胞摄取。这些部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆固醇基部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,6553)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.1994,4,1053),、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.1992,660,306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.1993,3,2765)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.AcidsRes.1992,20,533)、脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.1991,10,111；Kabanov等人FEBS Lett.1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie1993,75,49),、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3H-膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.1995,36,3651；Shea等人,Nucl.AcidsRes.1990,18,3777)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides1995,14,969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.1995,36,3651)。

对于给定核酸序列中的所有位置不必均匀地修饰，并且实际上可以将超过一种前述修饰并入单个核酸序列中或甚至并入核酸序列内的单个核苷内。

修饰的蛋白质或肽：包含多肽或其片段的杂合蛋白质可以与其他类型的多肽连接。这些另外的多肽可以是任何可用于蛋白质或肽的纯化、鉴定、总电荷及/或肽的治疗性或预防性应用的氨基酸序列。此外，另外的多肽可以是信号肽或靶向肽等。

在一些具体实施例中，本发明的组合物可包括由上述任何核酸序列编码的CRISPR相关内切核酸酶多肽。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，但通常它们是指不同大小的肽序列。本文中可以将本发明的基于氨基酸的组合物称为“多肽”，以表明它们是氨基酸残基的线性聚合物，并有助于将它们与全长蛋白质区分开。本发明的多肽可以“构成”或“包括”CRISPR相关内切核酸酶的片段，并且本发明涵盖构成或包括CRISPR相关内切核酸酶的生物学活性变体的多肽。将理解多肽因此可以仅包括CRISPR相关内切核酸酶的片段(或其生物活性变体)，但也可以包括另外的残基。生物活性变体将保留足够的活性以切割靶DNA。

在一些情况下，CRISPR相关核酸内切酶多肽可以包括添加、取代或缺失，可以增加多肽的稳定性(包括但不限于对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其结合蛋白的亲和力。在一些情况下，添加、取代或缺失可以增加多肽的溶解度。在一些具体实施例中，选择用天然编码或非天然氨基酸取代的位点以及用于并入非天然氨基酸的另一位点，以便在重组宿主细胞中表达后增加多肽溶解度。在一些具体实施例中，所述多肽包含另一种添加、取代或缺失，其调节对相关配体、结合蛋白及/或受体的亲和力，调节(包括但不限于，增加或减少)受体二聚化，稳定受体二聚体，调节循环半衰期，调节释放或生物利用度，促进纯化，或改善或改变特定的给药途径。类似地，非天然氨基酸多肽可包含化学或酶切割序列、蛋白酶切割序列、反应基团、抗体结合结构域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或可改善检测(包括但不限于GFP)、纯化、通过组织或细胞膜转运、前药释放或多肽的活化、大小减小或其他性状的链接分子(包括但不限于生物素)。

本文描述的方法和组合物包括将一种或多种非天然氨基酸并入多肽中。可以在一个或多个特定位置并入一个或多个非天然氨基酸，其不破坏多肽的活性。这可以通过进行“保守”取代来实现，包括但不限于用非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用非天然或天然大体积氨基酸取代大体积氨基酸，用非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸)及/或将非天然氨基酸插入活性不需要的位置。

可以采用多种生物化学和结构方法来选择用多肽内的非天然氨基酸取代的所需位点。多肽链的任何位置都适合于选择并入非天然氨基酸，并且选择可以基于合理设计或通过随机选择用于任何或没有特定的所需目的。所需位点的选择可以基于产生具有任何所需特性或活性的非天然氨基酸多肽(可以进一步修饰或保持未修饰)，包括但不限于激动剂、超激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂与结合配偶体结合的调节剂、结合配偶体活性调节剂、结合配偶体构象调节剂、二聚体或多聚体形成、与天然分子相比没有活性或性质变化或操纵多肽的任何物理或化学性质，例如溶解度，聚集性或稳定性。例如，可以使用包括但不限于点突变分析、丙氨酸扫描或同源物扫描方法的方法识别多肽生物活性所需的多肽中的位置。除了那些通过包括但不限于丙氨酸或同源物扫描诱变的方法识别为对生物活性关键的残基之外，取决于所需的多肽活性，残基可以是用非天然氨基酸取代的良好候选物。或者，同样取决于所需的多肽活性，识别为对生物活性至关重要的位点也可以是用非天然氨基酸取代的良好候选物。另一种选择是在多肽链的每个位置用非天然氨基酸进行连续取代，并观察对多肽活性的影响。用于选择用非天然氨基酸取代成任何多肽的位置的任何手段、技术或方法适用于本文所述的方法、技术和组合物。

氨基酸残基之间的键可以是常规肽键或另一种共价键(例如酯键或醚键)，并且多肽可以通过酰胺化、磷酸化或糖基化来修饰。修饰可以影响多肽骨架及/或一个或多个侧链。化学修饰可以是在编码多肽的mRNA(例如，细菌宿主中的糖基化)的翻译或体外制备的合成修饰后在体内进行的天然发生的修饰。CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体可包括由天然存在(即，体内天然制备)和合成修饰(即，天然存在的或体外制备的非天然存在的修饰)的任何组合产生的一种或多种结构修饰。修饰的实例包括但不限于酰胺化(例如，用氨基取代C-端的游离羧基)；生物素化(例如，用生物素分子酰化赖氨酸或其他反应性氨基酸残基)；糖基化(例如，对天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基添加糖基以产生糖蛋白或糖肽)；乙酰化(例如，加入乙酰基，通常在多肽的N-端)；烷基化(例如，加入烷基)；异戊二烯化(例如，添加类异戊二烯基团)；脂肪酰化(例如硫辛酸部分的附接)；和磷酸化(例如，对丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸添加磷酸基团)。

如上所述，生物活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括那些由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如，具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括作为标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如可以使用吡咯赖氨酸代替赖氨酸，并且可以使用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未发现，但符合氨基酸的基本式并且可以并入肽中的残基。这些包括D-异亮氨酸(2R，3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。至于其他示例，可以查阅教科书或世界范围的网站(该网站目前由加州理工学院维护并且显示已经成功并入功能性蛋白质的非天然氨基酸的结构)。

或者，或另外，生物活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是天然存在的残基，其不同于野生型序列中相应位置中发现的天然存在的残基。换句话说，生物活性变体可包括一个或多个氨基酸取代。吾等可以将氨基酸残基的取代、添加或缺失称为野生型序列的突变。如上所述，取代可以用非天然存在的残基或仅仅是不同的天然存在的残基取代天然存在的氨基酸残基。此外，取代可以构成保守或非保守取代。保守氨基酸取代通常包括以下群组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。

作为CRISPR相关内切核酸酶的生物活性变体的多肽可以根据其序列与相应的野生型多肽相似或相同的程度来特征化。例如，生物活性变体的序列可以与野生型多肽中的相应残基至少或约80％相同。例如，CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体可与CRISPR相关的内切核酸酶或其同源物或直系同源物具有至少或约80％序列同一性的氨基酸序列(例如，至少或约85％、90％、95％、97％、98％、或者99％序列同一性)。

CRISPR相关内切核酸酶多肽的生物学活性变体将保留足够的生物活性以用于本发明方法。生物活性变体将保留足够的活性以在目标DNA切割中起作用。可以以本领域普通技术人员已知的方式评估生物活性，该方式包括但不限于体外切割测定或功能测定。

传递

如本文所用的传递载体包括用于体外或体内传递传递本文所体现的组合物的任何类型的分子。实例包括但不限于：表达载体、纳米颗粒、胶体组合物、脂质、脂质体、纳米脂质体、碳水化合物、有机或无机组合物等。

在一些具体实施例中，传递载体是表达载体，其中该表达载体包含编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶和至少一种引导RNA(gRNA)的单离的核酸序列，该gRNA是与逆转录病毒基因组中的目标核酸序列互补的。

本文还提供了重组构建体，其可用于转化细胞以表达Cas9及/或与HIV中的目标序列互补的引导RNA。重组核酸构建体包含编码Cas9的核酸及/或与本文所述的HIV中的目标序列互补的引导RNA，其可操作地链接至适于表达Cas9的调节区及/或与细胞中HIV的目标序列互补的引导RNA。将理解，许多核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性在本领域中是众所周知的。对于许多氨基酸，存在超过一个核苷酸三联体作为氨基酸的密码子。例如，可以修饰Cas9的编码序列中的密码子，使得使用该生物的适当密码子偏倚表获得特定生物体中的最佳表达。

还提供了含有核酸的载体，例如那些本文所述的核酸。“载体”是复制子，例如质体、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。通常，当与适当的控制组件相关联时，载体能够复制。合适的载体骨架包括，例如，那些本领域常规使用者，例如质体、病毒、人工染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调节区的载体。广泛多种宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的核酸序列。合适的表达载体包括但不限于衍生自例如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质体和病毒载体。许多载体和表达系统可从诸如Novagen(Madison,Wis.)、Clontech(Palo Alto,Calif.)、Stratagene(La Jolla,Calif.)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad,Calif.)等公司商购获得。

本文提供的载体还可包括例如复制起点、支架附加区(SAR)及/或标记。标记基因可赋予宿主细胞可选择的表型。例如，标记物可赋予杀生物剂抗性，例如对抗生素(例如卡那霉素(kanamycin)、G418、博来霉素或潮霉素(hygromycin))的抗性。如上所述，表达载体可包括设计用于促进表达多肽的操作或检测(例如，纯化或定位)的标签序列。标签序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素或Flag TM标签(Kodak,New Haven,Conn.)序列通常表达为与编码的多肽的融合。此类标签可以插入多肽内的任何位置，包括羧基或氨基末端。

在一个具体实施例中，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。腺相关病毒载体包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。在一个具体实施例中，AAV载体是AAV血清型9(AAV₉)。

另外的表达载体还可包括例如染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。合适的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质体，例如大肠杆菌质体col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质体如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体1的众多衍生物，例如NM989，和其它噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质体，例如2μ质体或其衍生物，可用于真核细胞的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；衍生自质体和噬菌体DNA组合的载体，例如已被修饰以使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质体。

也可以使用酵母表达系统。例如，仅举两例为非融合pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1和HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI和HindIII克隆位点，用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。酵母双杂交表达系统也可以根据本发明制备。

载体还可以包括调节区。术语“调节区”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性及/或迁移率的核苷酸序列。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应组件、蛋白质识别位点、诱导型组件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、核定位信号和内含子。

如本文所用，术语“可操作地链接”是指调节区和待在核酸中转录的序列的定位，以便影响这种序列的转录或翻译。例如，为了使编码序列处于启动子的控制下，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游的1至约50个核苷酸之间。然而，启动子可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子通常包含至少核心(基础)启动子。启动子还可包括至少一种控制组件，例如增强子序列、上游组件或上游激活区域(UAR)。待包括的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、选择性、可诱导性、所需表达水平和细胞或组织优先表达。通过适当地选择和相对于编码序列定位的启动子和其他调节区，调节编码序列的表达是本领域技术人员的常规事项。

载体包括，例如，病毒载体(例如腺病毒(“Ad”)、腺相关病毒(AAV)和水泡性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其他含脂质复合物，以及其他能够介导多核苷酸向宿主细胞传递的大分子复合物。复制缺陷型重组腺病毒载体可根据已知技术生产。参见，Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等人,J.Clin.Invest.,90:626-630(1992)；和Rosenfeld等人,Cell,68:143-155(1992).

在具体实施例中，病毒载体包含腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。在一些具体实施例中，病毒载体是腺相关病毒载体，其包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。在一个具体实施例中，AAV载体是AAV血清型9(AAV9)。

载体还可以包含其他组分或功能，其进一步调节基因传递及/或基因表达，或者以其他方式为靶细胞提供有益特性。如下文更详细描述和说明的，此类其他组分包括例如影响细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的成分；影响摄取后细胞内多核苷酸定位的成分(如介导核定位的药剂)；和影响多核苷酸表达的组分。此类组分还可包括标记物，例如可检测的及/或可选择的标记物，其可用于检测或选择已经摄取并表达由载体传递的核酸的细胞。这些组分可以提供为作为载体的天然特征(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或者可以修饰载体以提供这些功能。其他载体包括Chen等人；Bio Techniques,34:167-171(2003)描述的载体。多种这样的载体是本领域已知的并且通常是可获得的。

“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装相关的大小限制，通常通过替换病毒基因组的一个或多个部分来引入异源基因产物或序列。此类病毒可能变得有复制缺陷，需要在病毒复制和衣壳化过程中以反式提供缺失的功能(通过使用例如辅助病毒或携带复制及/或衣壳化所必需的基因产物的包装细胞系)。还描述了其中待传递的多核苷酸携带在病毒颗粒外部的经修饰的病毒载体(参见，例如，Curiel,D T等人,PNAS 88:8850-8854,1991)。

合适的核酸传递系统包括重组病毒载体，通常来自腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、辅助依赖性腺病毒、逆转录病毒或日本脂质体(HVJ)复合物的血细胞凝集病毒中的至少一种的序列。在这种情况下，病毒载体包含与多核苷酸可操作链接的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。重组病毒载体可在其中包含一种或多种多核苷酸，优选为约一种多核苷酸。在一些具体实施例中，用于本发明方法的病毒载体具有约10⁸至约5×10¹⁰pfu(噬菌斑形成单位)。在多核苷酸与非病毒载体一起施用的具体实施例中，使用约0.1纳克至约4000微克将通常是有用的，例如约1纳克至约100微克。

另外的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种基于HIV的病毒载体包含至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组，env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体包括痘病毒载体，如水牛痘或禽痘载体、疱疹病毒载体，如单纯疱疹病毒(HSV)载体[Geller,A.I.等人,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,等人,in DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(OxfordUniv.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:90 7603(1993)；Geller,A.I.,等人,Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990)],Adenovirus Vectors[LeGal LaSalle等人,Science,259:988(1993)；Davidson,等人,Nat.Genet.3:219(1993)；Yang,等人,J.Virol.69:2004(1995)]and Adeno-associatedVirus Vectors[Kaplitt,M.G.,等人,Nat.Genet.8:148(1994)].

痘病毒载体将基因导入细胞质中。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些发明具体实施例的表示。腺病毒载体导致比腺相关病毒短期的表达(例如，少于约一个月)，在一些具体实施例中，可表现出更长期的表达。选择的特定载体将取决于目标细胞和所治疗的病症。可以容易地完成适当启动子的选择。合适的启动子的实例是763个碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子。可用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于劳氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等,Hum Gene Ther4:151(1993))、SV40早期启动子区域、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调控序列、原核表达载体如β-内酰胺酶启动子、tac启动子、酵母中的启动子组件或其他真菌如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶))启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；具有组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰脏腺泡细胞中活跃的的弹性蛋白酶I基因控制区、在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区、在淋巴细胞中活跃的免疫球蛋白基因控制区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞活跃的的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区、在肝脏中活跃的的白蛋白基因控制区、在肝脏中活跃的α甲胎蛋白基因控制区、在肝脏中活跃的α1-抗胰蛋白酶肝脏活跃的基因控制区、骨髓细胞中活跃的β球蛋白基因控制区、在脑中的寡树突胶细胞中活跃的髓鞘碱性蛋白基因控制区、在骨骼肌中活跃的肌球蛋白轻链-2基因控制区以及在下丘脑中活跃的促性腺激素释放激素基因控制区。某些蛋白质可以使用其天然启动子表达。还可以包括可以增强表达的其他组件，例如增强子或导致高水平表达的系统，例如tat基因和tar组件。然后可以将该卡匣插入载体，例如质体载体，例如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质体载体，其包括例如大肠杆菌复制起点。参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory press,(1989)。质体载体还可以包括选择标记，例如用于氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，条件是标记多肽不会不利地影响被治疗的生物的代谢。卡匣也可以在合成传递系统中与核酸结合部分结合，例如WO 95/22618中公开的系统。

如果需要，本发明的多核苷酸也可以与微传递载体一起使用，例如阳离子脂质体和腺病毒载体。关于脂质体制备、靶向和传递内容的程序的回顾，参见Mannino and Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988).亦参见Feigner and Holm,BethesdaRes.Lab.Focus,11(2):21(1989)and Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)。

另一种传递方法是使用单链DNA产生载体，其可以在细胞内产生表达的产物。例如，参见Chen et al,Bio Techniques,34:167-171(2003)，其全部内容通过引用并入本文。

另一种传递方法是使用单链DNA产生载体，其可以在细胞内产生表达的产物。例如，参见Chen et al,BioTechniques,34:167-171(2003)其全部内容通过引用方式并入本文。

可以将本发明的核酸序列传递至受试者的适当细胞。这可以通过例如使用聚合性、生物可降解的微粒或微胶囊传递载体来实现，其尺寸适于优化吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可以使用直径约1至10μm的PLGA(聚乳酸-共-乙交酯)微粒。多核苷酸被包封在这些微粒中，其被巨噬细胞摄取并在细胞内逐渐生物降解，从而释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒不是直接被细胞摄取，而是主要用作核酸的缓释储库，其仅在通过生物降解从微粒释放时被细胞摄取。因此，这些聚合物颗粒应足够大以排除吞噬作用(即，大于5μm，优选大于20μm)。实现摄取核酸的另一种方法是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独并入这些传递载体或与组织特异性抗体共并入，例如，靶向通常是感染艾滋病毒的潜伏感染的储存(reservoir)细胞类型例如抗体，例如，脑的巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、和肠相关的淋巴细胞。或者，可以通过静电或共价力制备附接聚-L-赖氨酸的质体或其他载体的分子复合物。聚-L-赖氨酸与可与目标细胞上的受体结合的配体结合。将“裸DNA”(即，没有传递载体)传递至肌肉内、皮内或皮下位点是实现体内表达的另一种方式。如上所述，在相关的多核苷酸(例如，表达载体)中，编码单离的核酸序列的核酸序列包含编码CRISPR相关内切核酸酶的序列和与逆转录病毒的目标序列互补的引导RNA。

在一些具体实施例中，本发明的组合物可以配制成纳米颗粒，例如，包含与DNA复合的高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)核心并且被聚乙二醇改性(PEG化)低分子量LPEI壳包围的纳米颗粒。

在一些具体实施例中，组合物可以配制成局部凝胶，用于阻断例如HIV病毒的性传播。在性活动之前，可将局部凝胶直接施用于男性或女性生殖器区域的皮肤或粘膜。或者，或另外，局部凝胶可施用于表面或包含在男性或女性避孕套或隔膜内。

在一些具体实施例中，组合物可以配制为包封本文所包含的组合物的纳米颗粒。

无论组合物是作为核酸还是多肽给药，它们以促进哺乳动物细胞摄取的方式配制。有用的载体系统和制剂如上所述。在一些具体实施例中，载体可以将组合物传递至特定细胞类型。然而，本发明不限于此，并且还考虑了使用例如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合物、表面活性剂和全氟化学液体的其他DNA传递方法、例如化学转染，以及物理传递方法，例如作为电穿孔、微注射、弹道粒子和“基因枪”系统。

在其他具体实施例中，组合物包含已经用一种或多种Cas/gRNA载体转化或转染的细胞。在一些具体实施例中，本发明的方法可以离体应用。也就是说，可以从体内取出受试者的细胞，并用培养的组合物处理，以切除例如HIV病毒序列，并将处理过的细胞返回受试者体内。细胞可以是受试者的细胞，或者它们可以是单倍型匹配的或细胞系。可以照射细胞以防止复制。在一些具体实施例中，细胞是人类白细胞抗原(HLA)匹配的、自体的、细胞系或其组合。在其他具体实施例中，细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从许多动物物种(包括人类)建立了胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞、iPS细胞)。这些类型的多能干细胞将是再生医学中最有用的细胞来源，因为这些细胞能够通过适当诱导其分化而分化成几乎所有器官，同时保持它们在保持其多能性的同时主动分裂的能力。特别地，iPS细胞可以从自身衍生的体细胞建立，因此与通过破坏胚胎产生的ES细胞相比，不太可能引起伦理和社会问题。此外，作为自身来源细胞的iPS细胞可以避免排斥反应，这是再生医学或移植治疗的最大障碍。

单离的核酸可以通过本领域已知的方法容易地传递至受试者，例如传递siRNA的方法。在一些方面，Cas可以是其中包含Cas分子的活性结构域的片段，从而减少分子的大小。因此，Cas9/gRNA分子可以在临床上使用，类似于当前基因治疗所采用的方法。特别地，可以开发用于细胞移植治疗以及疫苗接种的Cas9/多倍体gRNA稳定表达干细胞或iPS细胞用于受试者。

根据已建立的方法制备转导的细胞用于再输注。在培养约2至4周后，细胞数量可以在1×10⁶和1×10¹⁰个之间。在这方面，细胞的生长特征因患者和细胞类型而异。在再输注转导细胞之前约72小时，取等分试样用于分析表型和表达治疗剂的细胞百分比。对于给药，本发明的细胞可以以由细胞类型的LD₅₀确定的速率和各种浓度的细胞类型的副作用给药，如应用于患者的质量和总体健康。给药可以通过单剂量或分剂量完成。成人干细胞也可以使用刺激它们从组织或空间的产生和流出的外源给药因子而流动，所述，该组织或空间可以包括但不限于骨髓或脂肪组织。

联合疗法

在某些具体实施例中，用于体外或体内根除逆转录病毒的组合物包含治疗有效量的：编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶的单离的核酸序列；至少一种引导RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组中的目标核酸序列互补；抗病毒剂或其组合。另外，一种或多种减轻可能与病毒感染有关的其他症状的药剂，例如，发烧、发冷、头痛、继发感染，可与药物组合物一起或作为药物组合物的一部分或在不同时间给药。这些试剂包括但不限于抗热剂，抗炎剂，化学治疗剂或其组合。

在某些具体实施例中，抗病毒剂包含治疗有效量的抗体、适体、佐剂、反义寡核苷酸、趋化因子、细胞因子、免疫刺激剂、免疫调节分子、B细胞调节剂、T细胞调节剂、NK细胞调节剂、抗原呈递细胞调节剂、酶、siRNA的、干扰素、利巴韦林、核酶、蛋白酶抑制剂、反义寡核苷酸、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、嘌呤核苷、趋化因子受体拮抗剂、白细胞介素、疫苗或其组合。

免疫调节分子包括但不限于细胞因子、淋巴因子、T细胞共刺激配体等。免疫调节分子正向及/或负面地影响体液及/或细胞免疫系统，特别是其细胞及/或非细胞组分、其功能及/或其与其他生理系统的相互作用。免疫调节分子可选自包括细胞因子、趋化因子、巨噬细胞移动抑制因子(MIF；如Bernhagen(1998),Mol Med 76(3-4)；151-61或Metz(1997),Adv Immunol 66,197-223(其中所述))、T细胞受体或可溶性MHC分子所组成的群组。此类免疫调节效应分子是本领域熟知的，尤其描述于Paul,“Fundamental immunology”,RavenPress,New York(1989)中。特别地，已知的细胞因子和趋化因子描述于Meager,“TheMolecular Biology of Cytokines”(1998),John Wiley&Sons,Ltd.,Chichester,WestSussex,England；(Bacon(1998).Cytokine Growth Factor Rev 9(2):167-73；Oppenheim(1997).Clin Cancer Res 12,2682-6；Taub,(1994)Ther.Immunol.1(4),229-46 orMichiel,(1992).Semin Cancer Biol 3(1),3-15)中。

可以测量的免疫细胞活性包括但不限于(1)通过测量DNA复制的细胞增殖；(2)增强细胞因子的产生，包括细胞因子(如IFN-γ、GM-CSF或TNF-α)的特异性测量；(3)细胞介导的目标杀死或裂解；(4)细胞分化；(5)免疫球蛋白的产生；(6)表型变化；(7)趋化因子或趋化性的产生，其意指具有趋化性的趋化因子的响应能力；(8)免疫抑制，通过抑制其他一些免疫细胞的活性；(9)细胞凋亡，其是指在某些情况下活化的免疫细胞的片段化，其作为异常激活的指示。

还感兴趣的是裂解包(package)中存在的酶，其由细胞毒性T淋巴细胞或LAK细胞传递至其目标。穿孔素，穿孔素(其为一种成孔蛋白)和Fas配体是这些细胞中的主要细胞溶解分子(Brandau等人,Clin.Cancer Res.6：3729,2000；Cruz等人,Br.J.Cancer 81:881,1999)。CTL还表达至少11种称为颗粒酶的丝氨酸蛋白酶家族，其具有四种主要底物特异性(Kam等人,Biochim.Biophys.Acta 1477:307,2000)。低浓度的链球菌溶血素O和肺炎球菌溶血素促进颗粒酶B依赖性细胞凋亡(Browne等人,Mol.Cell Biol.19:8604,1999)。

其他合适的效应子编码具有对细胞本身无毒的活性的多肽，但使细胞通过代谢改变细胞，或通过将无毒前药改变为致死药物而对其他无毒化合物敏感。示例性的是胸苷激酶(tk)，例如可以源自单纯疱疹病毒和催化等同变体。HSV tk将抗疱疹剂更昔洛韦(ganciclovir，GCV)转化为毒性产物，其干扰增殖细胞中的DNA复制。

在某些具体实施例中，抗病毒剂包括天然或重组干扰素-α(IFNα)、干扰素-β(IFNβ)、干扰素-γ(IFNγ)、干扰素τ(IFNτ)、干扰素ω(IFNω)或其组合。在一些具体实施例中，干扰素是IFNγ。可以稳定或修饰任何这些干扰素以改善耐受性和生物稳定性或其他生物学特性。一种常见的修改是聚乙二醇化(用聚乙二醇修饰)。

药物组合物

如上所述，本发明的组合物可以以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。无论它们的原始来源或获得它们的方式如何，本发明的组合物可根据其用途配制。例如，上述核酸和载体可以配制在组合物中，以用于组织培养中的细胞应用或给药患者或受试者。本发明的任何药物组合物可以配制而用于制备药物，并且特定用途在下文的治疗内容中指出，例如治疗患有HIV感染或有感染风险的受试者和HIV感染。当用作药物时，任何核酸和载体都可以以药物组合物的形式给药。这些组合物可以以药学领域熟知的方式制备，并且可以通过各种途径给药，取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。给药可以是局部给药(包括眼科和粘膜，包括鼻内、阴道和直肠给药)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、眼部、口服或肠道。用于眼部传递的方法可包括局部给药(滴眼剂)、结膜下、眼周或玻璃体内注射或通过外科手术放置在结膜囊中的球囊导管或眼科插入物引入。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内给药。肠胃外给药可以是单次推注剂量的形式，或者可以是例如通过连续灌注泵。用于局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末等。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。

本发明还包括药物组合物，其含有作为活性成分的本文所述的核酸和载体与一种或多种药学上可接受的载体的组合。术语药学上可接受的载体包括可用作药学上可接受物质的介质的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。在制备本发明的组合物时，活性成分通常与赋形剂混合，以用赋形剂稀释或以例如胶囊、片剂、小药囊、纸或其它容器的形式包封在这种载体中。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是充当活性成分的载体(vehicle)、载体(carrier)或介质的固体、半固体或液体物质(例如，生理盐水)。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉末、锭剂、小袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气溶胶(作为固体或液体介质)、乳液、乳膏、软膏、凝胶、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末。如本领域所知，稀释剂的类型可根据预期的给药途径而变化。所得组合物可包含其他试剂，例如防腐剂。在一些具体实施例中，载体可以是或可包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些具体实施例中，载体材料可以是配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如上所述，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。

可以将本发明的核酸序列传递至受试者的适当细胞。这可以通过例如使用聚合性、生物可降解的微粒或微胶囊传递载体来实现，其大小适于优化吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可以使用直径约1至10μm的PLGA(聚乳酸-共-乙交酯)微粒。多核苷酸被包封在这些微粒中，其被巨噬细胞吸收并在细胞内逐渐生物降解，从而释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒不是直接被细胞摄取，而是主要用作核酸的缓释储库，其仅在通过生物降解从微粒释放时被细胞吸收。因此，这些聚合物颗粒应足够大以排除吞噬作用(即，大于5μm，优选大于20μm)。实现核酸摄取的另一种方法是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独并入这些传递载体或与组织特异性抗体共并入，例如，对于靶向通常是艾滋病毒感染的潜伏感染的储层的细胞类型例如抗体，例如，脑的巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、和肠相关的淋巴细胞。或者，可以通过静电或共价力制备由与聚-L-赖氨酸附接的质体或其他载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸与可与目标细胞上的受体结合的配体结合。将裸DNA(即，没有传递载体)传递至肌内、皮内或皮下位点是实现体内表达的另一种方式。在相关的多核苷酸(例如，表达载体)中，编码包含编码CRISPR相关内切核酸酶和引导RNA的序列的单离的核酸序列的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合可操作地链接。上文描述了启动子和增强子。

核酸和载体也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或其他药物传递装置内。本发明的核酸和载体可以在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)存在下，单独或以混合物形式给药。基于给药方式和途径选择赋形剂或载体。合适的药物载体以及用于药物制剂的药物必需品描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(EWMartin)，其为该领域USP/NF(美国药典和国家处方集)中的着名参考文献)。

在一些具体实施例中，组合物可以配制成用于阻断HIV性传播的局部凝胶。在性活动之前，可将局部凝胶直接施用于男性或女性生殖器区域的皮肤或粘膜。或者，或另外，局部凝胶可施用于表面或包含在男性或女性避孕套或隔膜内。

在一些具体实施例中，组合物可以配制为包封编码Cas9或变体Cas9的核酸和与目标HIV互补的引导RNA序列的纳米颗粒，或包含编码Cas9的核酸和与目标HIV互补的引导RNA序列的载体。或者，可以将组合物配制成包封CRISPR相关内切核酸酶多肽的纳米颗粒，例如Cas9或变体Cas9和与目标互补的引导RNA序列。

本发明的制剂可包括编码Cas9的载体和与目标HIV互补的引导RNA序列。引导RNA序列可包括与单个区域互补的序列，例如，LTR A、B、C或D或可以包括与LTR A、B、C和D互补的序列的任何组合。或者，编码Cas9的序列和编码引导RNA序列的序列可以在不同的载体上。

治疗方法

本文揭示的组合物通常和广泛用于治疗患有逆转录病毒感染的受试者，例如HIV感染。该方法可用于靶向任何HIV，例如HIV-1、HIV-2及其任何循环重组形式。只要临床上有益的结果发生，就可以有效地治疗受试者。这可能意味着，例如，疾病症状的完全消退、疾病症状严重程度的降低、或疾病进展的减缓。这些方法可以进一步包括以下步骤：a)识别患有HIV感染的受试者(例如，患者，更具体地，人类患者)；b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶的核酸(例如Cas9)和与HIV目标序列(例如，HIV LTR)互补的引导RNA的组合物。可以使用标准临床试验鉴定受试者，例如，免疫试验以侦测受试者血清中HIV抗体或HIV多肽p24的存在，或通过HIV核酸扩增试验。提供给受试者的这种组合物的量导致感染症状的完全消退、感染症状的严重性降低或感染进展的减慢被认为是治疗有效量。本方法还可以包括监测步骤以帮助优化给药和调度以及预测结果。在本发明的一些方法中，可以首先确定患者是否具有潜伏的HIV-1感染，然后确定是否用本文所述的一种或多种组合物治疗患者。监测还可用于侦测抗药性的发作，并快速区分有反应的患者和无反应的患者。在一些具体实施例中，所述方法可以进一步包括确定患者携带的特定HIV的核酸序列，然后将引导RNA设计为与那些特定序列互补的步骤。例如，可以确定受试者的LTR U3、R或U5区域的核酸序列，然后设计一种或多种引导RNA以与患者的序列精确互补。

该组合物还可用于治疗(例如，作为预防性治疗)具有逆转录病毒感染(例如HIV感染)风险的受试者。这些方法可以进一步包括以下步骤：a)识别有感染HIV的风险的受试者；b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的核酸和与HIV(例如，HIV LTR)目标序列互补的引导RNA的组合物。例如，有感染艾滋病毒风险的受试者可以是任何从事无保护性行为的性活跃个体，即在不使用安全套的情况下从事性活动；有另一种性传播感染的性行为活跃的人；静脉注射吸毒者；或未受割礼的男子。具有HIV感染风险的受试者可以是，例如，其职业可能使他或她与HIV感染的群体接触的个体，例如医护人员或急救人员。有感染艾滋病毒风险的受试者可以是，例如，惩教场所的囚犯或性工作者，即使用性活动进行收入工作的个人或非食品项目，如食品、药品或住所。

该组合物还可以给药患有HIV感染的孕妇或哺乳期妇女，以减少HIV从母亲传染给她的后代的可能性。感染艾滋病毒的孕妇可以在子宫内、通过产道分娩时或通过母乳分娩后将病毒传染给她的后代。本文揭示的组合物可以在母乳喂养期间的产前、围产期或出生后给药HIV感染的母亲，或产前，围产期和产后给药的任何组合给药。可以将组合物与如下所述的标准抗逆转录病毒疗法一起给药母亲。在一些具体实施例中，本发明的组合物还在刚生产后即给药婴儿，并且在一些具体实施例中，在其后以一定时间间隔给药。婴儿也可以接受标准的抗逆转录病毒治疗。

本文揭示的方法和组合物可用于治疗逆转录病毒感染。示例性的逆转录病毒包括人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1、HIV-2；猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；和山羊关节炎/脑炎病毒(CAEV)。本文揭示的方法可以应用于多种物种，例如人类、非人灵长类动物(例如，猴子)、马或其他牲畜、狗、猫、雪貂或作为宠物的其他哺乳动物、大鼠、小鼠或其他实验动物。

本发明的方法可以用药物的制备来表达。因此，本发明包括本文所述的药剂和组合物在制备药物中的用途。本文所述的化合物可用于治疗组合物和方案或用于制备用于治疗本文所述的疾病或病症的药物。

本文所述的任何组合物可以施用于宿主身体的任何部分，以便随后传递至目标细胞。组合物可以传递至哺乳动物的脑、脑脊液、关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔，但不限于此。就传递途径而言，组合物可通过静脉内、颅内、腹膜内、肌肉内、皮下、肌肉内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内或透皮注射，通过口服或鼻腔给予，或通过逐渐灌注给药时间。在另一个实例中，组合物的气溶胶制剂可通过吸入给药宿主。

所需剂量将取决于给药途径、制剂的性质、患者的疾病性质、患者的尺寸、体重、表面积、年龄和性别，其他所用药物以及主治临床医生的判断。考虑到细胞目标的多样性和各种给药途径的不同效率，预期所需剂量的广泛变化。如本领域所熟知的，可以使用标准经验程序调整这些剂量水平的变化以进行优化。给药可以是单次或多次(例如，2或3次、4次、6次、8次、10次、20次、50次、100次、150次或更多次)。将化合物包封在合适的传递载体(例如，聚合物微粒或可植入装置)中可以提高传递效率。

用本文提供的任何组合物治疗的持续时间可以是从短至一天至宿主寿命(例如，多年)的任何长度的时间。例如，化合物可以每周给药一次(例如，4周至数月或数年)；每月给药一次(例如，三至十二个月或多年)；或每年给药一次，为期5年、10年或更长。还应注意，治疗频率可以变化。例如，本发明化合物可以每日、每周、每月或每年给药一次(或两次、三次等)。

可以将有效量的本文提供的任何组合物给药需要治疗的个体。有效量诱导所需的反应，同时不会在患者中引起显着的毒性。这样的量可以通过在给药已知量的特定组合物后评估患者的反应来确定。此外，毒性水平(如果有的话)可以通过在给药已知量的特定组合物之前和之后评估患者的临床症状来确定。应注意，给药患者的特定组合物的有效量可根据所需结果以及患者的反应和毒性水平进行调整。对于每个特定患者，显着毒性可以变化并且取决于多种因素，包括但不限于患者的疾病状态、年龄和对副作用的耐受性。

可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定是否诱导了特定的反应。可以使用可以评估特定疾病状态程度的临床方法来确定是否诱导了反应。用于评估反应的特定方法将取决于患者的病症的性质、患者的年龄和性别、所给药的其他药物以及主治临床医生的判断。

该组合物还可以与HAART中使用的另一种治疗剂，例如抗逆转录病毒剂一起给药。示例性抗逆转录病毒剂包括逆转录酶抑制剂(例如，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、齐多夫定(zidovudine)、恩曲他滨(emtricitibine)、拉米夫定(lamivudine)和替诺福韦(tenofivir)；和非核苷逆转录酶抑制剂，例如依法韦仑(efavarenz)、奈韦拉平(nevirapine)、利那韦林(rilpivirine))；蛋白酶抑制剂，例如，替皮拉佛(tipiravir)、地瑞那韦(darunavir)、茚地那韦(indinavir)；进入抑制剂，例如马拉韦罗(maraviroc)；融合抑制剂，例如，恩夫韦肽(enfuviritide)；或整合酶抑制剂，例如雷特格韦(raltegrivir)、度鲁特韦(dolutegravir)。示例性抗逆转录病毒剂还可包括多类组合剂，例如恩曲他滨、依法韦那和替诺福韦的组合；恩曲他滨的组合；利司韦林和替诺福韦；或埃替拉韦(elvitegravir)、咕必西塔(cobicistat)、恩曲他滨(emtricitabine)和替诺福韦的组合。

两种或更多种治疗剂的同时给药不需要药剂同时或通过相同途径给药，只要在药剂发挥其治疗效果的时间段内存在重叠即可。预期同时或顺序给药，以及在不同天或周给药。治疗剂可以在固定(metronomic)方案下给药，例如连续低剂量的治疗剂。

此类组合物的剂量、毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法测定，例如，用于测定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(50％治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为LD₅₀/ED₅₀比。

从细胞培养法和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。这种组合物的剂量优选在包括ED₅₀的循环浓度范围内，其毒性很小或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，取决于所用的剂型和所用的给药途径。对于本发明方法中使用的任何组合物，最初可以从细胞培养法估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围(其包括在细胞培养中测定的IC₅₀)(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这些信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。

如上所述，治疗有效量的组合物(即有效剂量)是指足以产生治疗(例如，临床)所需结果的量。该组合物可以每天一次或多次给药至每周一次或多次；每隔一天包括一次。技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况及/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。

本文所述的组合物适用于上述各种药物传递系统。另外，为了增强所给药化合物的体内血清半衰期，可以将组合物包封，引入脂质体腔，制备为胶体，或者可以使用提供延长的血清半衰期的其它常规技术。有多种方法可用于制备脂质体，如Szoka等人，美国专利第4,235,871、4,501,728和4,837,028号，其各自通过引用方式并入本文。此外，可以在目标药物传递系统中给药药物，例如，在涂有组织特异性抗体的脂质体中。脂质体将被器官靶向并选择性地摄取。

还提供了在哺乳动物细胞中失活逆转录病毒，例如慢病毒如人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒的方法。人类免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。人类免疫缺陷病毒可以是染色体整合的原病毒。哺乳动物细胞可以是被HIV感染的任何细胞类型，包括但不限于CD4⁺淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突细胞如朗格汉斯细胞和滤泡树突细胞、造血干细胞、内皮细胞、脑小胶质细胞和胃肠上皮细胞。此类细胞类型包括在初次感染期间通常被感染的那些细胞类型，例如CD4+淋巴细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞以及构成潜伏HIV储库的那些细胞类型(即潜伏感染的细胞)。

所述方法可包括向受试者给药包含编码基因编辑复合物的表达载体的组合物，该基因编辑复合物包含CRISPR相关内切核酸酶和一种或多种引导RNA，其中该引导RNA与逆转录病毒中的目标核酸序列互补。在一个优选的具体实施例中，如前所述，失活整合到用逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞基因组中的原病毒DNA的方法包括通过向受试者给药包含CRISPR相关内切核酸酶和两种或更多种不同的引导RNA(gRNA)的组合物来处理宿主细胞的步骤，其中至少两个gRNA中的每一个与原病毒DNA中的不同目标核酸序列互补；以及使原病毒DNA失活。该至少两个gRNA可以配置为单个序列或一个或多个不同序列的组合，例如多倍体配置。多倍体构型可包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的gRNA的组合，例如U3、R或U5中的任何序列组合。在一些具体实施例中，可以使用LTR A、LTR B、LTR C和LTR D的组合。在实施例中描述的实验中，使用两种不同的gRNA导致在CRISPR内切核酸酶识别的切割位点之间切除病毒序列。切除的区域可包括整个HIV-1基因组。处理步骤可以在体内进行，即，组合物可以直接给药患有HIV感染的受试者。然而，该方法不限于此，并且处理步骤可以离体进行。例如，可以从患有HIV感染的受试者中取出细胞或复数个细胞或组织外植体并置于培养物中，然后用包含CRISPR相关核酸内切酶和引导RNA的组合物处理，其中该引导RNA与人类免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。如上所述，组合物可以是编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸和引导RNA，其中该引导RNA与人类免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；包含核酸序列的表达载体；或包含编码CRISPR相关内切核酸酶和引导RNA的核酸的药物组合物，其中该引导RNA与人类免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；或包含该核酸序列的表达载体。在一些具体实施例中，基因编辑复合物可包含CRISPR相关内切核酸酶多肽和引导RNA，其中该引导RNA与人类免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。

无论组合物是作为核酸还是多肽施用，它们以促进哺乳动物细胞摄取的方式配制。有用的载体系统和制剂如上所述。在一些具体实施例中，载体可以将组合物传递至特定细胞类型。然而，本发明不限于此，并且还考虑了其他DNA传递方法，例如使用例如磷酸钙，DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合物、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染，以及物理传递方法，例如作为电穿孔、微注射、弹道粒子和“基因枪”系统。

标准方法，例如，用于侦测CRISPR相关核酸内切酶的免疫测定法，或基于核酸的测定法，例如用于检测gRNA的PCR，可用于确认该复合物已经被其已引入的细胞摄取和表达。然后可以将工程细胞重新引入受试者，如下所述。

基因编辑复合物包含CRISPR相关核酸酶，例如Cas9或其同源物，以及与逆转录病毒目标序列互补的引导RNA，例如HIV目标序列。基因编辑复合物可以在原病毒DNA中引入各种突变。这种突变使病毒失活的机制可以变化，例如突变可以影响原病毒复制、病毒基因表达或原病毒切除。突变可位于调节序列或结构基因序列中，并导致HIV的缺陷产生。突变可包含缺失。缺失的大小可以从单核苷酸碱基对到约10,000碱基对不等。在一些具体实施例中，缺失可包括全部或实质上全部的原病毒序列。在一些具体实施例中，缺失可包括整个原病毒序列。突变可包括插入；即向病毒前序列添加一个或多个核苷酸碱基对。插入序列的大小也可以变化，例如从约一个碱基对到约300个核苷酸碱基对。突变可以包括点突变，即用另一个核苷酸替换单个核苷酸。有用的点突变是具有功能性后果的突变，例如，导致氨基酸密码子转化为终止密码子或导致产生非功能性蛋白质的突变。

在一个具体实施例中，用于失活整合到部署了两种不同的gRNA序列宿主细胞基因组中的原病毒DNA的方法，，其中每种gRNA序列靶向原病毒DNA中的不同位点。也就是说，该方法包括将宿主细胞暴露于包含单离的核酸的组合物的步骤，例如，单离的核酸。AAV₉表达载体，编码：CRISPR相关核酸内切酶；编码第一gRNA的单离的核酸序列，该第一gRNA具有与原病毒DNA中的第一目标前间隔序列互补的第一间隔序列；和单离的核酸，其编码具有第二间隔序列的第二gRNA，该第二间隔序列与原病毒DNA中的第二目标前间隔区序列互补；在宿主细胞中表达CRISPR相关核酸内切酶、第一gRNA和第二gRNA；在宿主细胞中组合包含CRISPR相关内切核酸酶和第一gRNA的第一基因编辑复合物；和包括CRISPR相关内切核酸酶和第二gRNA的第二基因编辑复合物；通过第一间隔区序列和第一目标前间隔序列之间的互补碱基配对，将第一基因编辑复合物导向第一目标前间隔序列；通过第二间隔区序列和第二目标前间隔序列之间的互补碱基配对，将第二基因编辑复合物导向第二目标前间隔序列；用CRISPR相关核酸内切酶切割第一目标前间隔序列上的原病毒DNA；用CRISPR相关内切核酸酶切割第二目标前间隔序列上的原病毒DNA；以及在原病毒DNA中诱导至少一个突变。相同的多倍体方法易于结合到治疗患有人类免疫缺陷病毒的受试者的方法中，并且用于降低人类免疫缺陷病毒感染的风险。将理解，术语“组合物”不仅可包括组分的混合物，还可包括不必同时给药的单独组分。作为非限制性实例，根据本发明的组合物可包括核酸序列的个别组分制剂，例如，编码Cas9核酸酶，第一gRNA和第二gRNA的AAV₉表达载体，其中每种组分在导致宿主细胞暴露于所有三种组分的时间范围内输注中顺序给药。

在其他具体实施例中，组合物包含已经用一种或多种Cas/gRNA载体转化或转染的细胞。在一些具体实施例中，本发明的方法可以离体应用。也就是说，可以从体内除去受试者的细胞，并用培养的组合物处理以切除HIV序列，并使处理过的细胞返回到受试者的身体。细胞可以是受试者的细胞，或者它们可以是单倍型匹配的或细胞系。可以照射细胞以防止复制。在一些具体实施例中，细胞是人白细胞抗原(HLA)匹配的、自体的、细胞系或其组合。在其他具体实施例中，细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从许多动物物种(包括人类)建立了胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞，iPS细胞)。这些类型的多能干细胞将是再生医学中最有用的细胞来源，因为这些细胞能够通过适当诱导其分化而分化成几乎所有器官，同时保持它们在保持其多能性的同时主动分裂的能力。特别地，iPS细胞可以从自身衍生的体细胞建立，因此与通过破坏胚胎产生的ES细胞相比，不太可能引起伦理和社会问题。此外，作为自身来源细胞的iPS细胞可以避免排斥反应，这是再生医学或移植治疗的最大障碍。

可以通过本领域已知的方法(例如，传递siRNA的方法)将gRNA表达卡匣容易地传递至受试者。在一些方面，Cas可以是其中包含Cas分子的活性结构域的片段，从而减少分子的大小。因此，Cas9/gRNA分子可以在临床上使用，类似于当前基因治疗所采用的方法。特别地，将开发用于细胞移植治疗以及HIV-1疫苗接种的Cas9/多倍体gRNA稳定表达干细胞或iPS细胞以用于受试者。

根据已建立的方法制备转导的细胞以用于再输注。在培养约2至4周后，细胞数量可以在1×10⁶和1×10¹⁰个之间。在这方面，细胞的生长特征因患者和细胞类型而异。在转导转导细胞之前约72小时，取等分试样用于分析表型和表达治疗剂的细胞百分比。对于给药，为了施用于患者的质量和总体健康本发明的细胞可以以由细胞类型的LD₅₀确定的速率和各种浓度的细胞类型的副作用给药。给药可以通过单剂量或分剂量完成。成体干细胞也可以使用刺激它们的产生和从组织或空间流出的外源给药因子而移动，该组织或空间可以包括但不限于骨髓或脂肪组织。

套件

本文所述的组合物可包装在合适的容器中，例如用作治疗患有逆转录病毒感染的受试者的疗法，例如HIV感染或感染逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者。容器可包括含有核酸序列的组合物，例如编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9内切核酸酶)，与人类免疫缺陷病毒中的目标序列互补的引导RNA的AAV₉表达载体、或编码该核酸的载体、和一种或多种合适的稳定剂、适合于预期用途的分子、调味剂及/或类似物的载体。因此，包装的产品(例如，含有一种或多种本文所述组合物并且以浓缩或即用浓度包装用于储存、运输或销售的无菌容器)和试剂盒包括至少一种本发明的组合物，例如，编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列，与人类免疫缺陷病毒中的目标序列互补的引导RNA，或编码该核酸的载体和使用说明书也在本发明的范畴内。产品可包括含有一种或多种本发明组合物的容器(例如小瓶、广口瓶、瓶子、袋等)。此外，制品还可包括，例如，包装材料、使用说明、注射器、传递装置、缓冲液或其他控制试剂、用于治疗或监测需要预防或治疗的病况。

在一些具体实施例中，试剂盒可包括一种或多种另外的抗逆转录病毒剂，例如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或进入抑制剂。可以将另外的试剂一起包装在与编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列和与人类免疫缺陷病毒中的目标序列互补的引导RNA、或编码该核酸的载体的相同容器中，或着它们可以分开包装。编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列与人类免疫缺陷病毒中的目标序列互补的引导RNA、或编码该核酸的载体和其他药剂可在使用前组合或个别给药。

产品还可以包括图例(例如，印刷标签或插入物或描述产品使用的其他介质(例如，音频或录像带))。图例可以与容器相关联(例如，固定在容器上)，并且可以描述其中应该给药组合物的方式(例如，给药的频率和途径)、其适应症和其他用途。组合物可以准备好给药(例如，以剂量适当的单位存在)，并且可以包括一种或多种另外的药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂及/或另外的治疗剂。或者，组合物可以浓缩形式与稀释剂和用于稀释的说明书一起提供。

虽然上面已经描述了本发明的各种实施例，但是应该理解，它们仅以示例的方式呈现，而不是限制。在不悖离本发明的精神或范畴的情况下，可以根据本文的揭示内容对所揭示的实施例进行许多改变。因此，本发明的广度和范畴不应受任何上述实施例的限制。

本文提及的所有文件均通过引用并入本文。本申请中引用的所有出版物和专利文件通过引用并入，出于所有目的达到其如同每个单独的出版物或专利文献如此单独地表示的程度。通过引用本文件中的各种参考文献，申请人不承认任何特定的参考文献是其发明的“现有技术”。在以下实施例中说明了本发明组合物和方法的具体实施例。

实施例

实施例1：通过基因编辑切除HIV-1DNA：体内研究

开发了CRISPR/Cas9基因编辑策略以消除来自潜伏感染的人类细胞和动物疾病模型的整合的HIV-1DNA序列。从携带病毒基因组的小鼠组织中研究了HIV-1DNA消除的效率。

材料和方法

构建AAV9传递载体。用于产生AAV传递系统的背景质体是px601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::Bsa1-sgRNA，缩写为“pX601”(Ran FA等人,Nature 2015；520):186-191)。将包含对应于LTR和Gag目标的DNA序列的寡核苷酸克隆到pX601中Bsa1位点的U6启动子前面。靶向LTR和Gag的gRNA序列示于图1A中，如下所示，PAM序列以粗体表示：gRNA LTR-1：GGA TCA GAT ATC CAC TGA CCT TTG GAT；gRNA Gag D：GGA TAG ATG TAA AAGACA CCA AGG AGG。通过测序确认后，将20ng的pX601 saCas9 gRNA HIV-1 LTR1/GagD质体提供给Penn Vector Core,Gene Therapy Program(Perelman School of Medicine，宾夕法尼亚大学)，以用于质体DNA产生、DNA结构/序列分析、包装在AAV血清型和高效价生产中。

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。HIV-1Tg26小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)通过机械和酶促解离从17天妊娠胚胎制备，并保持在补充有10％胎牛血清的DMEM中。如前所述制备MEF细胞(Behringer等人,Manipulating the mouse embryo:A laboratory manual,Fourthedition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2014)，并使用特异于HIV转基因的引物通过PCR进行基因分型(Kopp JB等人,Proc Natl Acad Sci USA 1992；89:1577-1581；Dickie P等人,Virology 1991；185:109-119)。

Tg26 MEF的体外转导。AAV-CRISPR/Cas9以MOI 10⁵和10⁶的转导Tg26MEF细胞。在Opti-Mem中制备病毒接种物，将细胞与病毒一起以最小体积(0.5ml/孔，在6孔板中)培养1小时，然后加入1ml生长培养基并放置过夜。第二天，除去接种物，用PBS洗涤细胞并喂食新鲜生长培养基。转导后一周收获细胞用于DNA分析。

体内rAAV₉：saCas9/gRNA给药。在第0天和第5天，经由尾静脉将用于对照动物的100μl PBS的100μl AAV9CRISPR/Cas9注射到小鼠中。在第5天，对一对(AAV和PBS)动物进行眼眶后出血以取血液样本、安乐死和组织收获。第二对动物接受第二尾静脉注射AAV-Cas9或PBS，并且在眼眶后出血后7天对其进行安乐死以收获组织。收获的组织是脑、心脏、肺、肝、肾、脾和外周血，以用于淋巴细胞恢复。

DNA分析。根据制造商的实验方案(protocol)，使用NUCLEOSPIN组织试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞/组织中单离基因组DNA。使用Terra PCR直接聚合酶混合物(Takara，Clontech)在以下PCR条件下对25ng基因组DNA进行PCR：98℃3分钟，35个循环(98℃10秒，68℃1.30分钟)，68℃保持5分钟，用1％琼脂糖凝胶溶解。使用5μl的第一PCR反应在相同条件下进行巢式PCR。纯化PCR产物，克隆到TA载体(Invitrogen)中并送至Sanger测序(Genewiz,South Plainfield,NJ,USA)，并使用HIV-1NL_4-3序列作为参考在Clustal Omega(EMBL-EBI)软件(Cambridgeshire，UK)中比对。

RNA分析。使用TRIzol试剂(Ambion,Foster City,CA,USA)根据制造商的实验方案从组织制备总RNA，然后使用RNeasy Mini Prep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行DNAse I处理和RNA净化。接下来，将1μgRNA用于M-MLV逆转录反应(Invitrogen)。稀释cDNA，并使用对HIV-1Gag和Env基因特异的TaqMan qPCR和细胞大鼠β-肌动蛋白基因作为参考而定量(对于于引物，参见表1)。qPCR条件：98℃5分钟，45个循环(98℃5分钟，45个循环(98℃15秒，62℃30秒，收集，72℃1分钟)。进行反应，并在下面分析数据使用相对定量模式的LightCycler480(Roche,Basel,Switzerland)。

结果

使用HIV-1Tg26转基因小鼠的作为测试平台，该小鼠携带来自HIV-1NL4-3基因组的转基因，但有跨越Gag的C端和Pol基因的N端的3.1kb缺失(使用图1A)。虽然没有报道有效的HIV-1复制，但是在疾病发作之前已经在各种组织中检测到低水平的病毒转录物的表达(Curreli S等人,Retrovirology 2013；10:92；Kopp JB等人,Proc Natl Acad Sci USA1992；89:1577-1581；Santoro TJ等人,Virology,1994；201:147-151)。选择HIV-1感染和艾滋病的临床特征，包括HIV相关性肾病(HIVAN)(Barisoni L等人,Kidney Int 2000；58:173-181；Dickie P等人,Virology 1991；185:109-119)。由于小鼠的早期致死性，将Tg26小鼠杂交到C57BL/6L背景中以产生其中继发疾病是有限的并且小鼠可以存活至12个月大的动物。为了传递表达Cas9和gRNA的基因，选择AAV9载体。与使用AAV载体相关的主要挑战之一涉及其基因组接受能力。为了缓解这个问题，选择了较小Cas9或同源物saCas9(3.3kDa)(其来自于金黄色葡萄球菌，且可以与来自热带链球菌(spCas9)的原始Cas9的效率相似的效率编辑基因组，但是超过缩短1kb)(Ran FA等人.Nature 2015；520:186-191)。将编码saCas9的基因连同对应于靶向HIV-1LTR(gRNA LTR 1)和Gag基因(gRNA Gag D)的两种gRNA的DNA序列克隆到AAV₉载体DNA中。图1A显示了HIV-1基因组的结构组织，突出了在Tg26小鼠中产生转基因而缺失的病毒基因区域以及gRNA LTR 1和gRNA Gag D的位置。作为第一步，离体研究是通过从Tg26动物开发小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养物，并用它们评估含有saCas9/gRNA，rAAV9：saCas9/gRNA的重组AAV₉(rAAV₉)在整合的HIV-1DNA的切除部分中的能力。图1B说明了利用一对引物(P1和P2)的PCR基因扩增的结果，其对于LTR跨越-413/-391并且对于Gag基因跨越+888/+910(图1A)。

除了预期的1323bp的全长扩增子外，在rAAV9处理的细胞中检测到345bp的较小片段。在对照未处理的细胞中未观察到这些。测序数据的结果证实切除了跨越两个引导RNA之间的978bp DNA片段，并在切除后重新连接残留的病毒DNA(如图1A中所示)。对于体内研究，选择两只Tg26动物和两只年龄匹配(2个月)对照小鼠进行10¹²功能性效价的rAAV9：saCas9/gRNA的尾静脉注射。五天后，重复注射，5天后牺牲动物并收获肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和血液淋巴细胞(图2A)。在第一次通过实验中，使用P1和P2引物通过PCR扩增来分析来自肝脏的DNA。与MEF细胞培养的结果一致，PCR产物的凝胶分析结果显示，来自rAAV9：saCas9/gRNA处理的动物扩增后，存在全长(1323bp)和截短的(345bp)DNA片段，但不在年龄匹配的对照动物(图2B左侧)。在一对嵌套引物P1'(-375/-354)和P2'(+755/+763)(图1A中所示)存在下DNA扩增的延长产生另一个160bp的较小DNA片段(图2B，中间和右侧图)。160bp DNA的DNA测序结果证实切除了跨越gRNA LTR 1和gRNA Gag D之间的978bp DNA序列(图2C)。评估了rAAV9：saCas9/gRNA对其他组织中HIV-1DNA的影响。如图2D所示，在rAAV9的所有组织中观察到不同的160bp DNA片段，其表示通过DNA测序验证在LTR和Gag基因之间切除HIV-1DNA：saCas9/gRNA处理的动物中的gRNA LTR1和gRNAs Gag D(泳道2)。在对照未处理的动物中未观察到这些(泳道1)。用rAAV9处理MEF后产生的160bp扩增子作为另外的对照(泳道3)。在平行研究中，在另一种小动物模型中评估切除策略的效果，即大鼠，其涵盖用于开发小鼠模型的相同转基因。这里采用了rAAV₉接种的眶后路径。30天龄的大鼠每隔5天注射两次2.73×10¹²的rAAV9：saCas9/gRNA导致切除跨越5'-LTR的HIV-1DNA区段和来自循环淋巴细胞的Gag基因，其通过目标特异性PCR产生的扩增子的直接测序而检验。如图3A、3B所示，对来自切除的片段的几种PCR产物的测序数据及其与参考HIV-1DNA的比对的详细分析证实了病毒DNA的切除，其中来自用rAAV9：saCas9/gRNA处理的动物的组织中有一些变化。通过使用定量RT-PCR测量Gag和Env转录物的水平来检查病毒基因表达水平。如图3A、3B所示，来自用rAAV9：Cas9/gRNA处理的动物获得的循环血细胞中病毒RNA的水平急剧下降，表示病毒基因组的切除对来自HIV-1DNA的整合拷贝的病毒基因表达水平具有显着影响。对淋巴结中病毒RNA的检验也显示了治疗大鼠中病毒RNA的抑制。

表1显示了所用PCR引物的核苷酸序列。

讨论

本文已经证明，基于AAV₉的saCas9/gRNA基因编辑传递系统可以在携带HIV-1DNA序列的转基因小鼠中切除HIV-1基因组的整合拷贝片段。这些结果显示rAAV₉在HIV-1感染的人源化小鼠中传递saCas9/gRNA以编辑HIV-1DNA的相似能力。此外，这些结果证明在用治疗性rAAV处理的动物中抑制病毒RNA产生，并且在血液和淋巴结中通过saCas9/gRNA在病毒基因组的指定区段中表现出切除。

这项工作是朝着利用CRISPR/Cas9平台技术作为强大的HIV-1基因消除策略迈出的一步。原则上，该技术可以进一步改进和使用，与抗逆转录病毒方案相结合以增强编辑功效，并因此导致受感染动物和人类不可避免的类似有利结果。CRISPR/Cas9技术的AAV传递的简易性以及CRISPR/Cas9在开发用于靶向具有少量核苷酸变异的HIV-1的DNA序列的新gRNA的灵活性为该治疗平台带来了额外的价值，如果认为合适的话，用于个性化治愈策略。

实施例2：在临床前动物模型中通过SaCas9和多倍体sgRNA体内根除HIV原病毒。

在这项研究中，使用saCas9/sgRNA系统有效地根除HIV-1基因组的靶向保守的HIV-1调控和结构区域的sgRNA的组合进行了优化，并测试了具有HIV的双倍体相对四倍体sgRNA以saCas9切除在HIV-1Tg26转基因小鼠和EcoHIV增强的萤火虫荧光素酶(eLuc)感染的小鼠体内的1种原代动物的可行性和效率(Rabinovich,B.A.等人(2008)Proc Natl AcadSci USA 105,14342-14346；Potash,M.J.等人Proc Natl Acad Sci USA 102,3760-3765,doi:10.1073/pnas.0500649102(2005))。此外，证明了由一体化AAV载体传递的多倍体sgRNA/saCas9可以在体内用作暴露前预防(PrEP)。

材料和方法

高效gRNA的生物信息学设计。使用Broad Institute gRNA设计工具进行高效gRNA设计(broadinstitute.org)，因为该工具还为spCas9系统提供了扩展的间隔序列(NNNN[20个核苷酸]NGGNNN)。用于最佳靶向切割的SaCas9PAM序列是NNGRRT。仅使用NGGRRT，因为它包含NGG PAM，因此可以与完善的spCas9系统一起使用。为了测试这一点，选择靶向HIV-1LTR启动子区域的3个sgRNA、靶向Gag的3个sgRNA和靶向Pol的1个sgRNA。这些sgRNA目标的寡核苷酸列于表2中。

质体和多倍体gRNA表达AAV载体的克隆。如前所述构建pNL4-3-EcoHIV-eLuc报告病毒(Yin,C.等人AIDS,doi:10.1097/QAD.0000000000001079(2016)；Zhang,Y等人Scientific reports 5,16277,doi:10.1038/srep16277(2015))。从AlphaDNA(Montreal，Canada)获得具有5'-CACC和3'-AAAC突出端的每个靶向位点的一对寡核苷酸(表2)。通过BsaI位点将目标种子序列克隆到pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA(Addgene#61591；Ran,FA等人Nature 520,186-191),doi：10.1038/nature14299(2015))。用BsaI消化pX601AAV，用南极磷酸酶处理，并用Quick核苷酸去除试剂盒(Qiagen)纯化。将等量的互补寡核苷酸在T4多核苷酸激酶(PNK)缓冲液中混合以用于退火。用T4PNK将这些退火的种子对磷酸化，并用T7DNA连接酶连接到BsaI消化的AAV中。将连接混合物转化到Stabl3感受态细胞中。通过PCR筛选识别阳性克隆，并通过Sanger测序验证。对于多倍体sgRNA克隆，建立了两种方法：双重消化传统克隆和In-Fusion无缝PCR克隆。在双重消化策略中，首先用KpnI消化目标AAV载体并使其钝化，然后用EcoRI消化；而携带预期的sgRNA表达盒的转移插入物首先用NotI消化并钝化，然后用EcoRI消化。用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化插入物和载体，然后进行标准的突出端/平末端克隆。通过NotI和BamHI或EcoRI的双重消化识别表达阳性双倍体sgRNA的AAV克隆。在In-Fusion PCR克隆策略中，目标AAV载体用EcoRI和KpnI线性化。使用具有3'-端KpnI位点突变(用于进一步添加新sgRNA)和转移sgRNA AAV载体作为模板的一对引物T795/T796(表2)经由PCR产生插入片段。纯化后，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)连接线性化载体和插入PCR产物。通过NotI和BamHI或EcoRI的双重消化识别表达阳性双倍体sgRNA的AAV克隆。对于两种克隆策略使用类似的原理证明，双倍体sgRNA/saCas9载体可以用作插入额外的1-n sgRNA表达卡匣的目标载体。只有一个注意事项是确保在所选sgRNA的种子序列中不存在这些消化位点(KpnI、NotI、EcoRI)。

细胞培养、转染和萤火虫荧光素酶报告分析。将HEK293T细胞在含有10％FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的高葡萄糖DMEM中，在含有5％CO₂的潮湿气氛中于37℃培养。对于荧光素酶报告基因测定法，将细胞在96孔板(3×10⁴个细胞/孔)中培养，并使用标准磷酸钙沉淀方案用指定的质体转染。48小时后，裂解细胞，并用2104ENVISION多标记读数器(PerkinElmer)中的ONE-GLO荧光素酶测定系统(Promega)测定。

TERRA^TM PCR直接基因分型和巢式PCR。为了使用PCR进行高通量基因分型，将细胞接种在96孔板中并用指定的载体转染。48小时后，除去培养基，每孔用45μl的50mM NaOH处理细胞，并在95℃培养温10分钟。用5μl的1M Tris-HCl(pH8.0)中和后，使用TERRA^TM PCR直接聚合酶混合物(Clontech)和指定的引物，在10μl PCR反应中使用0.5μl的DNA提取物。为了对来自EcoHIV-eLuc接种小鼠的单离组织和器官的切除的HIV原病毒DNA进行基因分型，每个组织用个别剪刀进行研磨以避免交叉污染，然后在在55℃水浴中由1％SDS、10mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA和100mM NaCl组成的裂解缓冲液中用蛋白酶K消化。。然后使用常规酚/氯仿提取方法从组织裂解物中提取基因组DNA。为了从特定的Tg26小鼠组织中提取基因组DNA、RNA和蛋白质，用研杵和研钵机械分解组织样本，然后根据制造商的提取基因组DNA、RNA和蛋白质的方案，以 Tissue试剂盒和 RNA/蛋白质试剂盒(CLONTECH)进行处理。为了进行PCR基因分型，将DNA样本在98℃变性3分钟，然后进行两步常规PCR，进行35个循环，退火/延伸步骤在68℃以1分钟/kb进行。对于巢式PCR，第一轮反应用指定的引物进行22至25个循环，第二轮PCR用巢式PCR引物进行35个循环。

定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)。根据制造商的说明书，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取来自指定器官/组织的总RNA。通过使用RNase-free DNase Set(Qiagen)的柱上DNA酶消化除去潜在残留的基因组DNA。使用具有High Capacity cDNA ReverseTranscription Kit(Invitrogen，Grand Island，NY)的随机六核苷酸引物，将每个样本的1μgRNA逆转录成cDNA。cDNA或HIV基因组DNA的定量PCR(qPCR)分析使用 GreenPCRMaster Mix Kit(Applied Biosystems)在LightCycler480(Roche)中进行。设计saCas9、Gag、Env、Tat的引物对，如表2所示。人类β2微球蛋白和小鼠Ppia管家基因的引物获自RealTimePrimers(Elkins Park，PA)。设计用于HIV切除定量的引物，如图18A至18C所示。每个样本以三重复进行测试。针对目标基因和管家基因以图形方式获得循环阈值(Ct)。管家基因和目标基因之间Ct值的差异表示为ΔCt值。通过从实验样本的ΔCt值中减去对照样本的ΔCt值来获得ΔΔCt值。基因表达或HIV DNA切除的相对倍数或百分比变化计算为2^-ΔΔCt。在一些情况下，扩增曲线和解链峰曲线用于比较分析。

AAV和EcoHIV-eLuc包装和纯化。按照已公布的实验方案(Zolotukhin，S。等人，Gene Ther 6,973-985(1999))，经由ViGene Biosciences Inc.(Rockville，MD)的AAV生产服务进行AAV-DJ和AAV-DJ/8的小规模和大规模制备。简言之，用三种载体共转染HEK293T细胞，收获病毒颗粒并通过碘克沙醇梯度超速离心纯化。将病毒浓缩并配制在磷酸盐缓冲盐水中。使用实时PCR，以线性化基因组质体作为标准品，通过1ml样本(GC/ml)中的病毒基因组拷贝数确定病毒效价。

为了包装复制型EcoHIV-eLuc和HIV_NL-BaL-eLuc，使用LIPOFECTAMINE 3000(Invitrogen)将编码携带BLI报告基因的EcoHIV或HIV-1的全长分子克隆的质体DNA(图22A，22B)转移到HEK293T细胞(Invitrogen)中。在转染后24小时，抽吸含有转染试剂和DNA的培养基，用PBS洗涤细胞两次。添加新鲜媒体。在转染后48和60小时，收集上清液并通过0.45μm过滤器过滤。使用Lenti-X Concentrator(Clontech，CA，USA)，按照制造商的说明书或使用20％蔗糖密度离心在20,000xg，4℃浓缩慢病毒上清液4小时。对于EcoHIV-eLuc，根据制造商的实验方案，通过ELISA(XpressBio,Frederick,MD)测定p24的量。在GHOST(3)X4/R5上测定HIV_NL-BaL-eLuc的效价，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析而分析GFP表达。

人源化BLT小鼠的病毒接种。所有动物护理和程序均经匹兹堡大学或坦普尔大学机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。基于从同源肝脏单离的人胎肝、胸腺和CD34⁺细胞移植的菌株的人源化BLT小鼠购自Jackson Lab(Bar Harbor，ME)。对于感染，经由吸入异氟醚(2至2.5％，氧气流速为2L/min)麻醉小鼠。阴道内接种(每只小鼠总共为1×10⁶TCIU的HIV_NL-BaL-eLuc)通过用中型移液管尖端将20μL病毒上清液缓慢移液到阴道腔中来进行。通过用29号针头和胰岛素注射器将100μL指定的病毒效价注射到腹腔内来进行腹膜内接种(每只小鼠总共1×10 5TCIU的HIVNL-BaL-eLuc)。使用体内BLI显现BLT小鼠中的HIV感染以揭示纵向HIV传播。先前确定所选择的HIV感染的BLT小鼠显示在AAV-DJ/8/Cas9-sgRNA给药之前至少70天或更长时间内，没有可检测的HIV-报吿基因活性的可能潜伏期。

体内AAV注射。对于Tg26转基因小鼠中的sgRNA/saCas9基因传递效率和功能测定法，将100μl未纯化的AAV-DJ血清型或5μl纯化的AAV-DJ/8血清型稀释于1X DMEM中(不含血清)至总体积为100μl，经由尾静脉注射到动物体内。对于注射AAV-DJ的小鼠，在第一次注射后一周牺牲群组1并进行另外注射群组2。第二次注射后一周牺牲群组2。对照小鼠注射携带空载体的AAV病毒。对于注射AAV-DJ/8的小鼠，群组1和群组2之间的间隔时间为2周。用研杵和研钵机械破碎所选器官的组织样本，然后按照用户手册用 Tissue试剂盒和 RNA/蛋白质试剂盒(CLONTECH)处理，以提取基因组DNA、RNA和蛋白质。

对于AAV-DJ/8的在体内注射以EcoHIV-eLuc接种NCR裸鼠，将总共10μl的含有saCas9/sgRNA(3.07×10¹⁴GC/ml)的纯化AAV-DJ/8先于90μl的PBS稀释以用于在每个小鼠右眼的血窦中眼眶后注射总共100μl含有总共250ng p24的EcoHIV-eLuc上清液后(通过ELISA(ZeptoMetrix)确定)，在同样注射部位眼眶内注射。

BLT小鼠中的四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8传递经由阴道内或静脉内或经由两种途径进行。阴道接种与上述HIV接种相似，每个BLT小鼠含有总共20μl含有总共6.14×10¹²GC的AAV-DJ/8/saCas9-sgRNA的PBS。对于每只BLT小鼠，静脉接种是使用带有29号针头的胰岛素注射器通过右眼血窦(眼眶后注射)100μl含有总共6.14×10¹²GC的AAV-DJ/8/saCas9-sgRNA的PBS进行静脉接种。

生物发光成像(BLI)。在病毒接种后的指定时间点开始成像。在所有成像过程中，通过吸入异氟醚(2至2.5％，氧气流速为2L/min)麻醉小鼠。将D-荧光素钾盐(GoldBioTechnology,Olivette,MO)溶解在无菌PBS中，并以150mg/kg体重的剂量腹膜内注射。使用IVIS Lumina XR小动物光学成像系统(Perkin Elmer,Hopkinton,MA)获取生物发光图像2分钟(开放式滤光器，合并8×8，f/光阑1，视场100mm)。

图像分析。使用Living Image 4.3.1进行所有图像分析。在测量区域周围或整个动物周围绘制感兴趣区域(ROI)以用于比较，并且将平均辐射值(单位：p/s/cm²/str)用于所有图像评估。为了显示，将图像加窗，以便看到在小鼠附近的背景水平之上的所有光输出。对于成像标度的高端选择最大辐射值110,000p/s/cm²/str，并且将背景截止设定为6,000p/s/cm²/str，这是在病毒接种前的两个不同时间点所成像的小鼠的平均光发射。。

基因组DNA、RNA和蛋白质提取。用研杵和研钵机械破碎所选器官的组织样本，然后按照用户手册用 Tissue试剂盒和 RNA/蛋白质试剂盒(CLONTECH)处理，以提取基因组DNA、RNA和蛋白质。用无菌和无污染的剪刀将提取的组织切碎，并将得到的组织加入含有蛋白酶K和1％SDS的裂解缓冲液(2.5mM Tris-Base，5mMEDTA，5mM NaCl，pH8.0)中，并在55℃培养过夜。培养后，将所得混合物用1体积的苯酚：CHCl₃：异戊醇(25：24：1)经由倒置提取10分钟。将混合物以12,000RPM离心10分钟，除去水层，用一体积的CHCl₃：异戊醇(24：1)再次萃取，并通过离心分离。为了沉淀提取的DNA，将一体积的异丙醇加入到除去的水层中，并将混合物倒转15分钟。经由以12,000RPM离心15分钟而沉淀DNA。然后用75％乙醇洗涤DNA沉淀，并空气干燥。一旦接近干燥，将TE缓冲液(pH8.0)加入到沉淀中，并在55℃分解(resolve)过夜。

TA克隆和Sanger测序。将目标带以凝胶纯化并直接克隆到pCRII T-A载体(Invitrogen)中，并通过使用通用T7及/或SP6引物在Genewiz测序以确定个别克隆的核苷酸序列。

免疫细胞化学和免疫组织化学：用4％多聚甲醛固定细胞，然后用单克隆抗HA抗体(1：200，Proteintech，目录号66006-1-Ig)进行标准免疫细胞化学。saCas9-HA阳性细胞与Hoechst阳性细胞核的比率在3个孔中的每孔6个随机视野中定量。对于免疫组织化学，快速冷冻的组织/器官在10μm下进行低温切片，并用4％多聚甲醛固定10分钟。洗涤、用0.5％Triton X-100渗透并用10％正常驴血清封闭后，将切片与兔抗HA多克隆抗体(1：100，Proteintech，目录号51064-2-AP)在含有0.1％Triton X-100的PBS中在4℃过夜。每次洗涤三次各10分钟后，将切片与相应的ALEXA 缀合的驴二抗(1：500；Invitrogen，GrandIsland，NY)和鬼笔环肽(100nM；目录号PHDR1细胞骨架，Inc.)一起在室温1培养小时。Hoechst 33258用于核复染。

统计分析。定量数据代表来自2至4个独立实验的平均值±标准偏差(SD)，并通过学生t-检验评估。p值<0.05或0.01被认为是统计学上显着的差异。对于EcoHIV感染小鼠模型中的BLI数据，学生的t检验和线性混合效应模型用于比较saCas9+EcoHIV与EcoHIV之间的总光子通量随时间的变化，这是分别通过BLI从背侧和腹侧测量的。

结果

saCas9/sgRNA系统有效切除HIV-1原病毒DNA。为了确定saCas9系统的效率，使用最佳PAM NNGRRN选择靶向HIV-1LTR的三种sgRNA(图4A)。如所述，进行EcoHIV-eLuc报告基因测定法和直接PCR基因分型(Yin,C等人,AIDS,doi：10.1097/QAD.0000000000001079(2016))。使用sgRNA配对方法是因为通过功能性报吿分子测定法和PCR基因分型识别成功切除HIV-1更为可靠。如图4B所示，在saCas9存在下所选择的三种LTR sgRNA之间的所有组合几乎完全消除了EcoHIV-eLuc活性(95至99％)。由于用于这些设计的sgRNA的saCas9PAM利用与spCas9系统相同的PAM(NGG)，因此将这些种子序列克隆到慢病毒(LV)-WG载体中(Yin,C等人,Functional screening of guide RNAs targeting the regulatory andstructural HIV-1 viral genome for a cure of AIDS.AIDS,doi:10.1097/QAD.0000000000001079(2016))其中含有不同于saCas9的sgRNA序列的crRNA-环-tracRNA(＝sgRNA)序列(Ran,FA等人(2015).Nature 520:186-191；Nishimasu,H等人(2015).Cell162:1113-1126)2,21，并比较了saCas9/sgRNA和spCas9/sgRNA之间的HIV-1切除效率。并行转染和EcoHIV-eLuc报告研究显示，使用这三种配对方法的spCas9在降低荧光素酶活性方面表现出更低的效率(图4B)。saCas9优于spCas9的表现与先前的报道一致(Ran,F.A.等人Nature 520,186-191(2015)；Friedland,A.E.等人Genome Biol 16,257(2015))。与spCas9相比，saCas9的更高效率可归因于几个因素：(1)sgRNA和saCas9在相同细胞中的共表达较高，因为它们在单一载体中；(2)较小的saCas9可能使基因传递效率更高；(3)saCas9的内在核酸酶在制备DSB时可具有更好的活性(Ran,F.A.等人Nature 520,186-191(2015)；Nishimasu,H等人Cell 162,1113-1126(2015))。通过PCR基因分型和Sanger测序进一步验证了通过在saCas9和spCas9中配对LTR sgRNA的有效根除(图4C)。

LTR sgRNA与Gag或Pol sgRNA的组合诱导有效的根除。使用spCas9/sgRNA系统证明了更容易的PCR基因分型，并且通过LTR sgRNA与病毒结构基因(例如Gag、Pol)配对的更有效的HIV-1根除。((Yin,C.等人,AIDS,doi：10.1097/QAD.0000000000001079(2016))。为了测试这是否也适用于saCas9/sgRNA系统，靶向Gag或Pol的sgRNA与三种LTR sgRNA中的一种配对。LTR-1或-3与Gag或Pol sgRNA的所有组合诱导细胞培养物中EcoHIV-eLuc活性的强烈降低(图4D)。LTR-2和GagD的配对也诱导强烈降低，但与GagB、GagC和PolB在降低报告基因活性方面表现出较低的效率(图4D)。用5'-LTR或3'-LTR引物对的直接PCR基因分型验证了所有sgRNA组合的切割效率(图4E)。进一步验证片段缺失并为四倍体sgRNA提供合理性(见下文)，选择LTR-1和GagD的组合作为TA克隆和Sanger测序的代表。结果显示两个目标位点切割后片段的预期序列(图11A–至11C)。这些数据证明选择用于saCas9系统的所有sgRNA在其预测的目标位点处制造DSB都是高效率的，并且LTR sgRNA与靶向病毒结构区域的sgRNA的配对诱导了不同程度的功能性切除。

一体化AAV载体中的多倍体sgRNA诱导更有效的根除。对于如上所述的两个sgRNA的配对，在共转染期间两个单独的质体可能不被传递到相同的细胞中。为了确保HIV-1根除和抑制的最大效率，选择LTR-1和GagD对，并比较两个单个sgRNA表达载体的共转染与一个双倍体sgRNA表达载体的转染之间的报告子还原效率。较小尺寸的saCas9(3.159kb)允许单个AAV载体携带用于有效的AAV包装和基因传递的两个表达sgRNA的卡匣和表达saCas9的卡匣(Friedland,A.E.等人，Genome Biol 16,257(2015))。如图5A所示，与共转染两种单独的单一sgRNA/saCas9载体相比，双倍体sgRNA/saCas9载体的转染诱导荧光素酶报吿基因活性的进一步降低。通过PCR基因分型证实了报告DNA的切割，并且切割的片段带与野生型带的比率表现出比两个单独的sgRNA/saCas9载体更强的双倍体sgRNA/saCas9载体的切割能力(图5B)。双倍体sgRNA/saCas9的超强效果可能最有可能来自相同细胞中这三种组分的共表达。

如上所述，除了两种LTR的片段缺失外，两种LTR sgRNA能够切除整个HIV-1基因组，并且LTR sgRNA与sgRNA靶向结构基因的组合导致更高的原病毒切割效率和更容易的PCR基因分型。为了将这两个特征结合起来进行根除效率优化，选择LTR-1、LTR-3、GagD和PolB sgRNA的组合，并使用新型可互换的输注克隆策略将它们的表达卡匣克隆到一体化saCas9AAV载体中。通过用等量的双倍体或四倍体sgRNA/saCas9表达单一质体瞬时转染，发现四倍体sgRNA/saCas9质体在降低EcoHIV-eLuc报吿活性方面更有效(图5C)。这通过PCR基因分型验证，显示跨越5'-LTR和Gag的PCR引物产生的野生型带的更强降低(图5D、5E)。引物T361/T458(图4A)检测到LTR-1和GagD之间的片段缺失以及双倍体和四倍体群组中的额外插入，而在四倍体群组中观察到LTR-3和GagD之间预期的另一片段缺失(图5D)。引物对T710/T458在5'-LTR-3和GagD位点之间连接后检测到预测的片段(图5E)。覆盖Gag/Pol和3'-LTR的进一步PCR基因分型分析显示，四倍体对于切割整个HIV-1基因组具有更强的潜力。引物T758/T363在GagD和3'-LTR-1或-3之间检测到两个缺失(图5F)，而T689/T363在PolB和LTR-1或-3之间检测到两个缺失(图5G)。引物T689/T711如预测的那样检测到一个缺失(图5H)。对片段缺失的带强度的比较分析显示LTR-1和GagD最有效，而LTR-3在四倍体sgRNA/saCas9系统中效率较低(图5D，5F，5G)。这些切割模式证明，由于多倍体片段缺失和目标序列周围的多个插入删除突变，四倍体混合(cocktail)策略在根除HIV-1整个基因组方面最有效。

四倍体sgRNAs/saCas9可以包装在单个AAV-DJ载体中，以进行更有效的基因组编辑。最近已经报导了单股和双倍体sgRNA/saCas9 AAV载体的成功包装(Friedland,A.E.等人，Genome Biol 16,257(2015))。表达双倍体sgRNA/saCas9的卡匣(4.969kb)接近AAV病毒的包装极限((通常为5至5.2kb)(Wu,Z.等人,Mol Ther 18,80-86(2010))。然而，据报导，在一些转基因体外和体内有效的AAV包装和基因传递的基因组大小范围为5.2至8.9kb(Allocca,M.等人J Clin Invest 118,1955-1964(2008)；Grieger,J.C.和Samulski,R.J.JVirol 79,9933-9944(2005)；Wu,J.等人,Hum Gene Ther 18,171-182(2007))。测试了四倍体sgRNA/saCas9表达卡匣(5.716kb)是否可以有效地包装到AAV病毒中。选择AAV-DJ血清型是因为：(1)它结合了8种天然AAV血清型(AAV-2、AAV-4、AAV-5、AAV-8、AAV-9、禽AAV、牛AAV和山羊血清型)的特征AAV)，并且实现更好的转导效率和更广范围的靶向细胞/组织(Grimm,D.等人J Virol 82,5887-5911(2008))；(2)能够逃避抗体中和(Bartel,M.等人Front Microbiol 2,204(2011))；(3)它为体内Cas9/sgRNA介导的HIV-1根除提供了最高的肝脏转导效率。肝脏富集是证明HIV-1原病毒可以在体内切除的概念验证的必要条件。对于双倍体sgRNA/saCas9，HEK293T细胞中的病毒效价如预期的那样实现，而通过PCR测定的基因组效价为4.15至4.3×10¹³基因组拷贝(GC)/ml(未纯化的粗裂解物)，且以通过检测HA标记的saCas9蛋白质的抗HA抗体的免疫细胞化学测定的功能效价为4.4至的9.7×10⁸转导单位(TU)/ml。对于四倍体sgRNA/saCas9，成功实现了4.2×10¹³GC/ml的类似基因组效价，与双倍体sgRNA/saCas9相比，仅实现低于2.5x10⁸TU/ml的功能效价的1.8至3.9倍(图11A、11B)。这些数据证明产生的具有5.7kb基因组的四倍体sgRNA/saCas9AAV可以成功地包装到AAV-DJ病毒中，该AAV-DJ病毒可以通过saCas9蛋白质的功能性表达有效地感染哺乳动物细胞。

AAV介导的多倍体sgRNA/saCas9的基因传递有效地根除了HIV-1Tg26转基因小鼠的神经干细胞中的HIV-1原病毒DNA。先前已建立HIV-1Tg26转基因小鼠含有与超过10个拷贝的pNL4-3原病毒基因组整合的基因座，其中3.1kb缺失跨越部分Gag和Pol基因以使病毒复制不能胜任(Dickie,P.等人,Virology 185,109-119(1991))。Tg26小鼠产生良好表征的肾病(Kopp,J.B.等人Proc Natl Acad Sci USA 89,1577-1581(1992)；Haque,S.等人Am JPathol 186,347-358(2016))，以及潜在的未表征的神经和心血管缺陷(Cheung,J.Y.等人,Clin Transl Sci 8,305-310(2015))和其他者。在体内研究之前，使用从Tg26转基因小鼠单离的神经干/祖细胞(NSC/NPC)评估多倍体sgRNA/saCas9的HIV-1切除效率。使用NSC/NPC的理由是NSC/NPC中HIV感染/潜伏期的积累证据，其可能与HIV相关的神经认知障碍(HAND)有关。在sgRNA/saCas9AAV-DJ感染后，小鼠NSC/NPC中的抗HA抗体的免疫细胞化学显示，在10个功能性MOI(fMOI)接种后20天，单股sgRNA/saCas9AAV-DJ感染92.3％细胞。等于1.8×10⁵gMOI，证明AAV-DJ病毒在感染NSC/NPC方面非常有效。双倍体(＝6.5×10⁵gMOI)或四倍体(＝2.1×10⁶gMOI)sgRNA/saCas9AAV-DJ(图12A、12B)的相等fMOI分别产生约87.63％和90.52％的相似感染效率(图6A至6C))。然后，测定双倍体和四倍体sgRNA/saCas9在切割培养的NSC/NPC中的整合的HIV-1原病毒DNA中的效率。在AAV-DJ感染后2天，通过PCR分析验证saCas9和sgRNA的剂量依赖性传递(图6D、6E)。然后，通过PCR基因分型评估HIV-1切除功效。双倍体和四倍体sgRNA/saCas9在AAV感染后2天诱导预测的DNA片段的剂量依赖性缺失，而当使用相等的fMOI时，四倍体sgRNA/saCas9诱导更高的切割效率(图6F)。感染后20天的切割效率显着增加(图6G)，因为长期AAV转导导致saCas9/sgRNA的持续表达和累积的基因组编辑。同样，尽管感染效率相似(图6B、6C)，但四倍体诱导了更高的HIV-1切除效率(图6G)。这些数据证明AAV介导的多倍体sgRNA/saCas9可有效切除HIV-1Tg26转基因小鼠培养的NSC/NPC中整合的HIV-1原病毒基因组，超大型四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ保留了高效基因转导和功能基因组编辑。

多倍体sgRNA/saCas9在HIV-1Tg26转基因小鼠的各种组织/器官中有效地根除HIV-1原病毒DNA。为了测试Cas9/sgRNA是否能够在体内根除整合的HIV-1原病毒DNA，选择AAV-DJ血清型是因为它能够感染肝脏中具有最高感染性的广泛组织(Grimm,D.等人JVirol 82,5887-5911(2008)；Mao,Y.等人BMC Biotechnol 16,1(2016))。如图13A所示，经由尾静脉注射一次单剂量的AAV-DJ病毒(4.15至4.20×10¹²GC)可以在第一周内有效地将表达sgRNA和saCas9的cDNA传递到肝脏和脾脏中。肝脏的组织病理学和免疫组织化学检查未发现任何与AAV相关的组织毒性。观察到的高转导效率和最小组织毒性与先前在成年小鼠中使用相似剂量的报导一致。然而，在第一次注射后1周另外注射相同剂量确实显示出一致的基因传递模式(图13B)。携带双倍体或四倍体sgRNA以及saCas9的AAV-DJ在大多数器官中产生相似的基因传递效率(图13A、13B)，即使四倍体sgRNA/saCas9的插入物似乎超出AAV包装容量的限制。如上所述，为了确定sgRNA/saCas9在动物组织/器官中切割整合的HIV-1基因组的功效，用一对引物可以扩增片段缺失并确定根除事件的引物进行PCR基因分型。对于5'-LTR/Gag缺失，即使使用巢式PCR扩增，在感染后1周未观察到片段缺失，这可能是由于体内AAV传递后第一周中Cas9的低表达水平。然而，在进行巢式PCR分析(图13C)后，在大多数器官/组织中观察到不同程度的片段缺失，特别是在肝脏、骨髓和脾脏中(图13D)。在第一次感染后第7天另外的AAV感染增加了大多数器官/组织中的切割效率(图13D)。碎片缺失的大小随组织/器官而变化，暗示组织/器官之间DNA修复事件的潜在差异。通过代表性带的T-A克隆和Sanger测序验证这些片段缺失(图13E)。同样，双倍体和四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ均主要在肝脏中诱导类似的片段缺失模式，而其他器官显示可变的片段缺失模式(图13D)。

为了扩展Tg26转基因小鼠中HIV-1根除的组织范围和潜在细胞类型，将四倍体sgRNA/saCas9一体化载体包装到AAV-DJ/8病毒中。为了最大化体内转导效率，使用大规模制备纯化和浓缩AAV-DJ/8病毒(Holehonnur,R.等人(2014).BMC Neurosci 15:28)。超大型四倍体sgRNAs/saCas9的包装效率达到3.07×10¹⁴GC/ml，接近携带同时制备的3kb插入物的对照AAV-Cre-rLuc载体的并列包装的效价(4.21×10¹⁴GC/ml)。单尾静脉内注射纯化的四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8(1.5×10¹²GC)诱导收集的大多数器官/组织中saCas9基因的有效转导(图14A)。通过RT-qPCR用靶向saCas9的引物和用抗HA抗体的免疫组织化学验证saCas9mRNA和蛋白在转导的器官/组织中的表达(图15A)。对于5'-LTR/Gag引物对，使用常规PCR条件观察到设计大小的可见片段缺失(图7A)。使用Gag/3'-LTR引物对，在常规PCR条件下观察肝脏、肺和脑组织中的片段缺失(图7B)。TA克隆和Sanger测序验证了脑和肝脏中设计大小的片段缺失(图16A、16B)。在第一次注射后2周，另外一次感染(1.5×10¹²GC)扩大了转导组织/器官的范围，并在第一次注射后4周增加了saCas9和sgRNA的基因转导效率(图14B、15B)。用Gag/3'-LTR引物对的片段缺失所示的切除效率在肝脏和肺中也增加，并扩展到其他器官如肾脏和脾脏(图7C)。RT-qPCR分析显示结构病毒蛋白Gag和Env在脑、肾脏、肝脏和肺中的mRNA表达显着降低(图7D至7F)以及脑和肾中的调节蛋白Tat(图7G、14C))。总之，携带双倍体或四倍体sgRNA/saCas9的AAV-DJ和AAV-DJ/8病毒在体内诱导了足够的基因传递感染，随后在Tg26转基因小鼠的各种器官/组织中根除了整合的HIV-1基因组。

全基因组测序和脱靶分析(Ebina,H.等人，(2013).Scientific reports 3:2510；；Kaminski,R等人(2016).Sci Rep 6:22555；Yin,C等人(2016).AIDS 30:1163-1174)没有检测到spCas9与培养的原代细胞或细胞系中的多倍体sgRNA的任何明显的脱靶效应。为了检查本研究中任何潜在的体内脱靶效应，使用来自用四倍体sgRNA/saCas9处理的Tg26小鼠的组织/器官的基因组DNA进行T7E1测定。基于生物信息学分析预测的潜在脱靶位点，为每个sgRNA目标(LTR-1、LTR-3和GagD)选择2至3个预测位点，具有最高的特异性评分，并进行高保真PCR而产生500至800bp以用于T7E1评估的产物。如图17A至17F所示，在小鼠基因组内的7个预测的脱靶位点中未发现突变，但在目标PCR产物中检测到明显的突变。

在用无细胞EcoHIV-eLuc报告病毒接种的实验小鼠模型中可视化体内HIV-1切除。如上所述，在Tg26小鼠中，四倍体sgRNA混合物可以有效地包装到AAV病毒中，并在体外和体内有效地从宿主基因组中切除整个HIV-1原病毒DNA。这些结果促使经由AAV-sgRNA/saCas9方法进一步测试全身HIV感染的可行性和效率。然而，就HIV-1原病毒拷贝/基因座、随机整合、罕见感染细胞类型和高速率突变而言，这并未概括临床HIV感染/潜伏期。为了进一步检测经由AAV-sgRNA/saCas9方法全身感染HIV-1后HIV-1切除的可行性和效率，利用EcoHIV-eLuc报告病毒感染裸鼠模型的常规NCr株(Potash,M.J.等人Proc Natl Acad Sci USA102,3760-3765(2005)；Kelschenbach,J.L.等人J Neuroimmune Pharmacol 7,380-387(2012))。在经由右眼的眼眶后注射的EcoHIV-eLuc接种(总共250ng的HIV p24/小鼠，n＝3)后，，在EcoHIV接种后立即经由相同的注射途径在每只小鼠(n＝3)中注射单剂AAV-DJ/8(3.07×10¹²GC/小鼠)。另外三只NCr小鼠仅注射与阴性对照组相同剂量的EcoHIV-eLuc。在接种后第6天开始的EcoHIV-eLuc接种后19天内进行活动物的纵向生物发光成像(BLI)。(图8A至8D)。与没有AAVDJ/8感染的对照组(n＝3)相比，在发生注射的颈部淋巴结和右眼的周围组织中观察到EcoHIV-eLuc报导活性的显着降低(图8A))。经由体内测量来自整只小鼠或右眼区域的成像信号，在第9天和第19天，saCas9处理的小鼠中EcoHIV感染的细胞群的减少是统计学显着的(p<0.05)(图8B和8C)。使用线性混合效应模型获得统计学显着性，比较了整个19天的saCas9/gRNA治疗对HIV-1切除的疗效。与阴性对照组相比，AAV-sgRNA/saCas9治疗对EcoHIV-eLuc感染的减少具有统计学意义(其为在整个实验过程中通过颈背淋巴结(p<0.011)和腹侧的生物发光输出(p<0.014)而测量)(图8D)。

为了验证体内根除效率，使用如在实验的终点(SaCas9/gRNA的AAV转导后19天)所述的建立的PCR条件进行PCR基因分型。通过AAVDJ/8对saCas9、GagD和LTR1转基因的有效转导验证为主要在肝脏中，而在其他器官和组织中具有稍微不同的分布(图9A至9C)。使用常规PCR，在大多数组织/器官中观察到预测片段的有效且稳健的切除，其在注射的右眼区域、心脏、血液、肝脏、脾脏和淋巴结中具有最高功效(图9D至9F)。来自不同动物的编辑组织的可变性可能源于ecoHIV-eLuc感染、AAV介导的基因传递和Cas9介导的切除的随机细胞/组织分布。同样，一些片段缺失通过TA克隆和Sanger测序验证(图18A至18C)。为了量化四倍体sgRNA/saCas9在体内的切除效率，使用三种不同的引物组合进行切除的片段的qPCR分析(图19)。熔解峰曲线分析清楚地识别了所设计的三种类型的原病毒DNA切除：5'-LTR1至GagD，以及GagD至3'-LTR1或3'-LTR3。尽管由于各种切除组合而可能使个体数量低估了效率使用未切割(非靶向)区域(两个靶位点在两侧)作为内部标准化，在选定的组织/器官中评估切除效率(图9G至9I)。结果显示切除效率(图9G至9I)与PCR基因分型一致(图9D至9F)。切除类型和效率随着不同的器官/组织而变化(图9G至9I)。有趣的是，所有三种类型的切除都发生在B1M3小鼠肝脏中GagD/3'-LTR的效率为96％(图9I)。这些数据证明，四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ/8在体内全身HIV感染期间即使在新感染的细胞中也非常有效地切除HIV原病毒基因组。

在人源化BLT小鼠中检测到来自潜伏感染的人类细胞的HIV-1原病毒的体内切除。为了证明saCas9/sgRNA基因组编辑在更为临床相关的动物模型中切除HIV-1原病毒的可行性，将携带sgRNA/saCas9的AAV-DJ/8给药经由阴道粘膜传递(n＝3，小鼠ID＝B5M2、B5M3和B6M3)或腹膜内注射(n＝3，小鼠ID＝B7M2、B7M4和B10M4)的而以R5-，M-向性HIV_NL-BaL-eLuc报告病毒接种的人源化BLT小鼠。以一个小生境(niche)中可视化5个单细胞的敏感度，经由全身BLI纵向视化和分析这些BLT小鼠中HIV-1传播的时空动态(Song,J.等人(2015).J GenVirol 96:3131-3142)。这些BLT小鼠显示出一定程度的局部或全身HIV传播，但是感染减少并且在最初的60天后完全停止，在接下来的70天或更长时间内没有通过全身BLI检查确定的任何可见感染。这种现象可能归因于T细胞耗竭，HIV-1潜伏期或HIV-1复制期间突变可能使eLuc报告基因沉默。由于在一些组织中通过巢式PCR未检测到HIV-1基因组(图7A至7F)，突变不太可能贡献于沉默的报告基因表达。经由静脉内和阴道内途径将四倍体sgRNA/saCas9AAV-DJ8给药HIV感染的BLT小鼠B5M2和B5M3。与阴性对照小鼠B6M3一起，B5M2和B5M3经由阴道粘膜接种HIV-1，或仅将静脉内注射AAV-DJ8到HIV感染的BLT小鼠B7M2和B7M4中。与阴性对照小鼠B10M4一起，B7M2和B7M4经由腹膜内注射接种HIV-1。在AAV传递后2至4周，牺牲BLT小鼠，并从主要器官/组织中提取基因组DNA样本以用于如上所述的PCR基因分型。使用5'-LTR/Gag引物对(T361/T458，然后T361/T946)，用巢式PCR验证收获的器官/组织中HIV-1原病毒DNA的存在(图7A至7F)。重要的是，在阴道、心脏、肺、右眼(AAV注射部位)、结肠和左肾囊下的人胸腺类器官用5'-LTR/Gag引物对T361/T946和Gag/3'-LTR引物对T758/T363(图7A、7B、7D、7E)观察到片段缺失。特别地，在针对相同组织中的完整原病毒DNA的一个上观察到代表片段缺失的更高强度的带，例如，B5M3小鼠的心脏和阴道(图7B)。该结果清楚地证明经由单次静脉内注射四倍体sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8在实体组织内的潜伏感染的人细胞中有效切除HIV-1原病毒DNA。这些PCR产物的TA克隆和Sanger测序使用引物对T361/T946验证来自5'-巢式PCR的PCR产物的片段缺失(图20A、20B)；图21A和21B为使用引物对T758/T363的3'-巢式PCR的PCR产物。在5'-LTR/Gag区域(图20A、20B)和Gag/3'-LTR区域(图21A、21B)的切割的残留序列内，在预测的切割位点之间于从靶向sgRNA的PAM算起的第三核苷酸处观察到不同程度的插入或缺失。(图20A，21A)。这些临床前数据集证明了原则证明AAV-DJ8可以将四倍体sgRNA/saCas9传递到人源化小鼠模型中主要组织和器官中的常驻HIV-1潜伏感染的人类细胞中，以切除整合HIV-1原病毒DNA。

讨论

本研究中的显着发现是使用saCas9和由一体化AAV-DJ或AAV-DJ/8载体传递的多倍体sgRNA在动物模型中从宿主基因组中有效根除HIV-1原病毒DNA。这些病毒在HIV-1Tg26转基因小鼠和EcoHIV-eLuc急性感染小鼠中体外和体内诱导有效的基因传递和HIV-1原病毒根除。基于AAV在基因治疗中的临床应用，该研究为治疗HIV-1/AIDS患者提供了一种新型治疗方法。此外，简易多倍体sgRNA克隆、快速报告筛选、可靠的直接PCR基因分型和高效的AAV病毒生产提供了saCas9/sgRNA基因组编辑在个性化和精准医学中的临床应用。使用多倍体sgRNA同时靶向多个HIV原病毒DNA有利于防止HIV在HIV-1复制期间从高突变率中逃逸，因为在相同HIV原病毒基因组中两个不同目标序列中双突变的可能性相对较低。最后，证明了四个sgRNA/saCas9策略结合两个LTR靶向位点(在5'和3'末端)和两个结构靶向位点(在Gag和Pol中保守)是HIV-1根除的有前景的治疗候选者。尽管在HIV-1感染的临床患者中具有高突变率，但由于最大化了整个HIV-1基因组中多个插入缺失突变和片段缺失的可能性，因此在个性化医疗中。这种四重策略还提供了额外的优势：(a)大大降低了HIV-1逃逸的可能性；(b)尽管临床HIV-1患者群体中存在持续的原病毒突变，但HIV-1切除的可能性很高，(c)可靠由于去除了大部分目标基因或基因组而导致的功能丧失成就和(d)最佳切除效率。

体内基因组编辑效率及其临床应用主要依赖于有效的基因传递。对于基础研究，常规质体的转染和各种病毒载体(特别是慢病毒、腺病毒和AAV载体)的转导已广泛用于分别或组合传递Cas9和sgRNA。由于大多数目标细胞的高转导效率和长期但可逆/可诱导的基因表达，慢病毒介导的Cas9/gRNA传递在大多数实验室中已被优先和广泛使用。然而，慢病毒和腺病毒的安全性和免疫原性限制了它们的临床可行性。已经测试了整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)用于ZFN传递(Cecilia,A.P.等人,Current Gene Therapy 14,365-376(2014)；Pelascini，LP等人Human Gene Therapy Method,24,399-411(2013))；Lombardo,A等人,Nat Biotechnol 25,1298-1306(2007))及其对Cas9和TALEN传递的应用仍然存在问题(Wang,X.等人Nat Biotechnol 33,175-178(2015))。由于没有诱变、毒性弱、宿主免疫反应低和长期疗效，AAV介导的基因治疗正在成为临床试验中非常有前景的方法(Hastie,E.&Samulski,R.J.Hum Gene Ther 26,257-265(2015)；Mingozzi,F.&High,K.A.Blood 122,23-36(2013))。一些研究已经在体外和体内测试了AAV介导的Cas9传递的可行性和效率。广泛使用的spCas9(1368个氨基酸)大小为4.1kb，留下非常小的空间用于克隆AAV载体(其可以有效地包装并有效地感染细胞或组织)。然而，使用最小启动子和poly-A序列的四个实验室已经报导了在培养细胞和动物模型中应用AAV-spCas9的成功(Swiech,L等人NatBiotechnol 33,102-106(2015)；Platt,R.J.等人Cell 159,440-455(2014)；Senis,E.等人Biotechnol J 9,1402-1412(2014)；Howes,R.&Schofield,C.Method Mol Biol 1239,75-103(2015))。为了提高AAV传递效率，最近报道了将spCas9分裂成功能性N端和C端部分(Wright,A.V.等人，Proc Natl Acad Sci USA,doi:10.1073/pnas.1501698112(2015)；Zetsche,B.Nat Biotechnol 33,139-142(2015))，其提供了在临床前动物模型中更有效地传递spCas9的新方法。还报道了使用GyrA内含肽系统的AAV-split-spCas9切口酶载体增加了基因组编辑的特异性(Fine,E.J.等人,Scientific reports 5,10777(2015))。最近已经识别了几种较小的Cas9直系同源物，其中saCas9已被充分特征化表并且在动物研究和临床应用中表现出极大的前景。这些较小的Cas9不仅使AAV基因治疗在临床试验中使用一体化载体系统成为可行，而且提高了IDLV系统的包装和转导效率，这也对临床试验具有广泛的吸引力(Liu,K.C.等人Current gene therapy14,352-364(2014))。几项动物研究已经证明了使用saCas9加一个或两个sgRNA表达卡匣在一体化AAV载体中的AAV包装和基因转导的高效率。在这项研究中，证明了在一体化AAV-DJ载体中具有saCas9的双倍体HIV-sgRNA也能够在培养的细胞中，特别是在Tg26转基因小鼠的各种器官/组织中传递转基因和根除HIV-1基因组。此外，首次证明了编码四倍体sgRNA和saCas9的超大型一体化AAV载体同样能够实现高效价包装，并诱导HIV-1基因组在培养的HIV整合NSC/NPC中的有效根除以及HIV-1潜伏性Tg26转基因小鼠和急性感染的EcoHIV-eLuc小鼠的各种器官/组织中。这些新颖和令人兴奋的发现为开发针对HIV-1LTR和结构蛋白区域的多倍体sgRNA混合物铺平了一种新方法，用于在临床前和临床环境中根除HIV-1的最佳基因疗法。

已经报导了将多倍体sgRNA表达卡匣置于一体载体中的几种方法。使用Csy4蛋白或核酶的RNA加工特性，可以将Pol II启动子下的单个转录物加工成多个sgRNA(Nissim,L.等人,Mol Cell 54,698-710(2014)；Gao,Y.&Zhao,Y.J Integr Plant Biol 56,343-349(2014))。使用Golden Gate克隆方法成功构建了在相同U6启动子下具有多达7个sgRNA的多倍体载体，并且其多倍体靶向效率已经被测试用于多倍体基因组/表观基因组编辑，同时激活/抑制多个基因(Sakuma,T.等人Scientific reports 4,5400(2014))。为了降低由于重复DNA序列导致重组的潜在风险并最大化每个sgRNA的表达效率，已经使用Golden Gate组装方法(其允许将多达四种sgRNA稳健且快速地克隆到单一慢病毒载体中)测试了由四个独立的Pol III启动子(人类U6启动子、小鼠U6启动子、7SK和H1)驱动的多倍体sgRNA(Kabadi,A.M.等人,Nucleic Acids Res 42,e147(2014))。这里开发了一种新的In-Fusion克隆策略，使用两种限制酶的询问交换，使任何数量的多倍体sgRNA易于快速克隆到单个载体中。该概念证明适用于任何Pol III启动子和各种病毒基因传递系统下的任何多倍体sgRNA。尽管已显示4个相同的U6启动子下的4个sgRNA显示出足够的活性以诱导目标DNA切割，但发现四倍体sgRNA/saCas9系统中的sgRNA LTR1、GagD和PolB是最佳的，但LTR-3在切割HIV-1原病毒中较弱(虽然它在双倍体sgRNA系统中具有高切割效力)。

本研究建立了使用四倍体sgRNA/saCas9AAV基因治疗切除Tg26转基因小鼠和人源化BLT小鼠两者中的整合HIV-1原病毒，以及在接种不含细胞的EcoHIV-eLuc报告病毒的常规小鼠的急性感染期间可能的游离HIV-1DNA的可行性，其中sgRNAs/saCas9可被视为暴露前预防(PrEP)。AAV-DJ或AAV-DJ/8的静脉内给药在大多数组织/器官中实现了广泛的基因转导和HIV-1根除，其中以肝脏、脾脏和淋巴结最高。本研究表明，在HIV感染的人源化BLT小鼠中，通过单次AAV-DJ/8给药，在小鼠多器官/组织中潜伏感染的人细胞中明显切除Gag/3'-LTR和5'-LTR/Gag片段。这一发现也证实了大量含有HIV-1病毒的组织储库。本文报告的研究结果为进一步临床前开发Cas9/sgRNA方法在HIV-1根除预防和改善HIV-1疾病方面提供了理由。

总之，小的saCas9蛋白质大小允许在一体化AAV载体中携带双倍体或甚至四倍体sgRNA表达卡匣，以用于高效价包装和细胞培养物和动物模型中的稳健基因转导。具有靶向5'和3'端LTR和结构Gag和Pol区域的四倍体sgRNA的saCas9诱导小的插入删除突变和大的片段缺失的多种模式，因此提供HIV-1基因组根除的最佳效率。经由AAV基因治疗在动物中根除HIV-1的可行性和效率为不久的将来的临床前研究和临床试验铺平了道路。

表2.靶向HIV-1LTR、Gag和Pol以及PCR引物的sgRNA的寡核苷酸。

Claims (46)

1.一种组合物，其包含：编码基因编辑试剂和至少一种引导RNA(gRNA)的病毒载体，其中所述gRNA与逆转录病毒的目标核酸序列互补，所述逆转录病毒包含：编码及/或非编码逆转录病毒基因序列的目标核酸序列、逆转录病毒群组特异性抗原的目标核酸序列或其组合。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述腺相关病毒载体包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述AAV载体是AAV血清型9(AAV₉)。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述基因编辑剂是簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述CRISPR相关内切核酸酶是Cas9或其同源物。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述gRNA与逆转录病毒基因序列的长末端重复序列(LTR)、群组特异性抗原或其组合互补。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述逆转录病毒是慢病毒。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述慢病毒包含：人类免疫缺陷病毒；猿猴免疫缺陷病毒；猫科动物免疫缺陷病毒；牛免疫缺陷病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、马传染性贫血病毒或人类T细胞白血病病毒。

10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述目标序列包含人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列(LTR)内的序列。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述人类免疫缺陷病毒的所述长末端重复序列内的序列包含U3、R或U5区内的序列。

12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述群组特异性抗原包含人类免疫缺陷病毒编码及/或非编码核酸序列。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述群组特异性抗原包含至少一种人类免疫缺陷病毒核酸序列，所述人类免疫缺陷病毒核酸序列包含gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev或其片段。

14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，还包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述反式激活小RNA(tracrRNA)序列与编码所述引导RNA的序列融合。

16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，还包含编码核定位信号的序列。

17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述gRNA包含与SEQ ID NO：1至76中的任一者具有至少60％序列同一性的序列。

18.如权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO：1至76中的任一者。

19.一种表达载体，其包含：编码基因编辑试剂和至少一种引导RNA(gRNA)的单离的核酸，其中所述gRNA与逆转录病毒基因序列的目标核酸序列互补，所述逆转录病毒基因序列包含：编码及/或非编码逆转录病毒基因序列的目标核酸序列、逆转录病毒群组特异性抗原的目标核酸序列或其组合。

20.如权利要求19所述的表达载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)或其衍生物。

21.如权利要求19或20的表达载体，其中所述腺相关病毒载体包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、DJ或DJ/8。

22.如权利要求21的表达载体，其中所述AAV载体是AAV血清型9(AAV₉)。

23.如根据权利要求19至22中任一项所述的表达载体，其中所述基因编辑试剂是簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物。

24.如如权利要求23所述的表达载体，其中所述CRISPR相关内切核酸酶是Cas9或其同源物。

25.如权利要求19至24中任一项所述的表达载体，其中所述gRNA与所述逆转录病毒基因序列的长末端重复序列(LTR)、基团特异性抗原或其组合互补。

26.如权利要求19至25中任一项所述的表达载体，其中所述逆转录病毒是慢病毒。

27.如权利要求26所述的表达载体，其中所述慢病毒包含：人类免疫缺陷病毒；猿猴免疫缺陷病毒；猫科动物免疫缺陷病毒；牛免疫缺陷病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、马传染性贫血病毒或人类T细胞白血病病毒。

28.如权利要求19至27中任一项所述的表达载体，其中所述目标序列包含所述人类免疫缺陷病毒的长末端重复序列(LTR)内的序列。

29.如权利要求28所述的表达载体，其中所述人类免疫缺陷病毒的所述长末端重复序列内的序列包含U3、R或U5区内的序列。

30.如权利要求19至29中任一项所述的表达载体，其中所述群组特异性抗原包含人类免疫缺陷病毒编码及/或非编码核酸序列。

31.如权利要求28至30中任一项所述的表达载体，其中所述群组特异性抗原包含至少一种人类免疫缺陷病毒核酸序列，所述人类免疫缺陷病毒核酸序列包含：gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev或其片段。

32.如权利要求19至31中任一项所述的表达载体，还包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。

33.如权利要求32所述的表达载体，其中所述反式激活小RNA(tracrRNA)序列与编码所述引导RNA的序列融合。

34.如权利要求19至33中任一项所述的表达载体，还包含编码核定位信号的序列。

35.如权利要求19至34中任一项的表达载体，其中所述gRNA包含与SEQ ID NO：1至76中的任一者具有至少60％序列同一性的序列。

36.如权利要求19至35中任一项的表达载体，其中所述gRNA包含SEQ ID NO：1至76中的任一者。

37.一种单离的核酸序列，其包含：簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶；第一引导RNA(gRNA)，其具有与原病毒DNA中的第一目标前间隔序列互补的第一间隔序列；第二gRNA，其具有与所述原病毒DNA中的第二目标前间隔序列互补的第二间隔区序列，其中所述第一目标前间隔序列和所述第二目标前间隔序列位于所述原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中。

38.如权利要求37的单离的核酸序列，其中所述单离的核酸序列靶向两个或更多个目标序列，并切除两个或更多个目标序列之间的间插病毒序列。

39.一种编码单离的核酸序列的表达载体，所述单离的核酸序列包含簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶；编码第一引导RNA(gRNA)的单离的核酸序列，所述第一引导RNA(gRNA)具有与原病毒DNA中的第一目标前间隔序列互补的第一间隔序列；以及编码第二gRNA的单离的核酸序列，所述第二gRNA具有与所述原病毒DNA中的第二目标前间隔区序列互补的第二间隔序列，其中所述第一目标前间隔序列和所述第二目标前间隔序列位于所述原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中。

40.一种使受试者中的逆转录病毒失活的方法，其包括:向所述受试者施用包含编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物和一种或多种引导RNA的表达载体的组合物，其中所述引导RNA与所述逆转录病毒中的目标核酸序列互补。

41.一种治疗患有人类免疫缺陷病毒感染的受试者或降低具有人类免疫缺陷病毒感染风险的受试者中人类免疫缺陷病毒感染风险的方法，所述方法包括:给所述受试者施用治疗有效量的包含编码簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶或其同源物和一种或多种引导RNA的表达载体的组合物，其中所述引导RNA与所述逆转录病毒中的目标核酸序列互补。

42.一种包含单离的核酸序列组合物，其包含：簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)相关内切核酸酶；第一导向RNA(gRNA)，其具有与原病毒DNA中的第一目标核酸序列互补的核酸序列；第二gRNA，其具有与所述原病毒DNA中的第二目标核酸序列互补的第二核酸序列，其中所述第一目标核酸序列和所述第二核酸序列位于所述原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中；第三gRNA，其具有与所述原病毒DNA中的第三目标核酸序列互补的第三核酸序列；第四gRNA，其具有与所述原病毒DNA中的第四目标核酸序列互补的第四核酸序列，或其组合，其中所述第三和第四目标核酸序列位于编码结构蛋白的核酸序列中。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述单离的核酸序列靶向两个或更多个目标序列，并切除所述两个或更多个目标序列之间的间插病毒序列。

44.如权利要求42或43所述的组合物，其中编码结构蛋白的核酸序列包括：gag、pol、env、tat、rev、nef、vpr、vif、vpu、tev或其组合。

45.如权利要求42至44中任一项所述的组合物，其中所述gRNA包含与SEQ ID NO：1至76中的任一者具有至少60％序列同一性的序列。

46.如权利要求42至45中任一项所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO：1至76中的任一者。