KR102243243B1 - 신규한 cho 통합 부위 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

진핵 세포에서 향상되고 안정한 재조합 단백질 발현을 가능케 하는, 진핵 발현 시스템을 위한 발현-향상 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 진핵 세포에서 관심 유전자의 발현을 위한, 향상된 발현을 제공하는 게놈 통합 부위 및 이의 사용 방법이 제공된다. 진핵 세포에서 향상되고 안정한 유전자 발현을 위한, 염색체 유전자좌, 서열 및 벡터가 제공된다.

Description

신규한 CHO 통합 부위 및 이의 용도{NOVEL CHO INTEGRATION SITES AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 그 내용 전체가 참조로서 본원에 통합되는 2014년 10월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/067,774호의 우선권의 혜택을 주장한다.

참조로서 서열 목록 포함

2015년 10월 20일에 생성되고, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 32353_T0045US01_ SequenceListing.txt 로 명명된 28 KB의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로서 본원에 포함된다.

기술 분야

본 발명은 진핵 세포에서 재조합 단백질의 안정한 통합(integration) 및/또는 발현을 제공한다. 특히, 본 발명은 진핵 세포, 특히 차이니즈 햄스터(중국 햄스터(Cricetulus griseus)) 세포주에서 발현-향상 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써 단백질의 향상된 발현을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명은 재조합-매개 카세트 교환(recombination-mediated cassette exchange)(RMCE)을 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 및 변형된 세포를 포함한다. 본 발명의 방법은, 변형된 세포에 의해 재조합 단백질의 향상되고 안정한 발현을 용이하게 하기 위하여, 차이니즈 햄스터 세포 게놈의 특정 염색체 유전자좌에서 외인성 핵산을 통합시킨다.

세포 발현 체계의 개발은 연구 또는 치료용으로 주어진 단백질의 제조에 있어 신뢰성 있고 효율적인 공급원을 제공하기 위한 중요한 목표이다. 포유류 세포에서 재조합 단백질 발현은, 예를 들어, 재조합 단백질을 적절하게 번역후 변형하는 포유류 발현 체계의 능력 때문에 치료용 단백질의 제조에 선호된다.

몇몇 세포 체계는 단백질을 발현하는 것이 가능하며, 각각은 짧은 배양 시간으로 높은 수준의 재조합 단백질을 달성하기 위해 시스- 및, 일부의 경우에는 트랜스- 조절 요소의 다양한 조합을 함유한다. 수많은 체계를 이용할 수 있음에도 불구하고, 재조합 단백질 발현을 위한 효율적인 유전자 전달 및 통합된 유전자의 안정성에 대한 도전이 여전히 존재한다. 다중 지역 유전 인자는 관심 표적 유전자가 발현될 때뿐만 아니라, 세포가 유전자의 전사체를 생산적인 결과물로 기능적으로 유도할 수 있는지, 또는 발현이 장기간 지속될 지 여부를 결정할 것이다. 염색체 통합 부위, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 통합 부위 및 특정 유전자 내에 있거나 이에 인접한 유전자좌 제어 영역이 당업계에서 특성분석 되었다 국제공개특허 제WO2012/138887A1호; Li, Q. 등, 2002 Blood. 100:3077-3086). 이와 같이, 표적화된 조절 영역은 전형적으로 내인성 단백질을 암호화하는 영역에서 확인된다. 그러나, 표적 전이유전자의 장기적인 발현을 위해서는, 세포주 표현형의 변형을 피하기 위해 세포 유전자를 최소한으로 파괴하는 것이 주요 고려사항이다.

발현을 위한 추가 유전자, 예컨대 다중특이성 항체에서와 같이 추가 항체 쇄를 수용하기 위해 안정한 세포주를 조작하는 것은 특히 어렵다. 통합된 유전자의 발현 수준은 광범위하게 다양할 수 있다. 추가 유전자의 통합은 지역의 유전적 환경(즉, 자리 효과(position effect))에 기인하여 발현이 보다 크게 변하고 불안정성을 야기할 수 있다. 따라서, 당해 기술 분야에서는 향상된 포유류 발현 체계가 요구된다.

일 측면에서, 본 발명은 유전자좌 내의 특정 부위에서 통합된 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하며, 이때, 이러한 유전자좌는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자좌는 서열번호 1과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자좌는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 제2 핵산 서열(예컨대, 본 발명의 유전자좌) 내의 특정 부위로 통합된 제1핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 제2핵산 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2핵산 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

하나의 구현예에서, 제2핵산 서열은 서열번호 1과 90% 이상의 핵산 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 발현-향상 서열, 또는 이의 발현-향상 단편이다. 하나의 구현예에서, 제2핵산 서열은 서열번호 4와 90% 이상의 핵산 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 발현-향상 서열, 또는 이의 발현-향상 단편이다. 또 다른 구현예에서, 발현-향상 서열은 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 향상시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 전형적으로 게놈 내로 무작위 통합에 의해 관찰되는 발현과 비교하여, 발현-향상 서열은 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 약 1.5배 이상 내지 약 3배 이상의 발현향상을 향상시킬 수 있다.

또 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 4 내의 임의의 위치의 특정 부위 내로 통합된다.

일부 구현예에서, 서열번호 1 내의 위치에 있거나 서열번호 1 내의 위치에 인접한 특정 부위는 서열번호 1의 10~4,000; 100~3,900; 200~3,800; 300~3,700; 400~3,600; 500~3,500; 600~3,400; 700~3,300; 800~3,200; 900~3,100; 1,000~3,000; 1,100~2,900; 1,200~2,800; 1,300~2,700; 1,200~2,600; 1,300~2,500; 1,400~2,400; 1,500~2,300; 1,600~2,200; 1,700~2100; 1,800~2050; 1850~2050, 1,900~2040; 1950~2,025, 1990~2021, 2002~2021 및 2,010~2,015번 뉴클레오티드 스패닝(spanning) 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 서열번호 1 내의 위치에 있거나 서열번호 1 내의 위치에 인접한 특정 부위는 서열번호 1의 1990~1991, 1991~1992, 1992~1993, 1993~1994, 1995~1996, 1996~1997, 1997~1998, 1999~2000, 2001~2002, 2002~2003, 2003~2004, 2004~2005, 2005~2006, 2006~2007, 2007~2008, 2008~2009, 2009~2010, 2010~2011, 2011~2012, 2012~2013, 2013~2014, 2014~2015, 2015~2016, 2016~2017, 2017~2018, 2018~2019, 2019~2020, 및 2020~2021번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 구현예에서, 서열번호 1 내의 위치에 있거나 서열번호 1 내의 위치에 인접한 특정 부위는 서열번호 1의 10~500; 500~1,000; 500~2,100; 1,000~1,500; 1,000~2,100; 1,500~2,000; 1,500~2,500; 2,000~2,500; 2,500~3,000; 2,500~3,500; 3,000~3,500; 3,000~4,000; 및 3,500~4,000번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 전술된 임의의 하나 이상의 특정 부위 내 또는 그 근처에서 통합된다.

또 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은, 발현-향상 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 4의 발현-향상 서열과 약 90% 이상 동일, 약 91% 이상 동일, 약 92% 이상 동일, 약 93% 이상 동일, 약 94% 이상 동일, 약 95% 이상 동일, 약 96% 이상 동일, 약 97% 이상 동일, 약 98% 이상 동일, 또는 약 99% 이상 동일한 서열, 이의 발현-향상 단편을 포함하는 경우, 전술된 발현-향상 서열 내에 위치한 인식 부위를 포함한다.

하나의 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66, LoxFas 및 frt 부위로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 더 포함한다. 하나의 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 발현-향상 서열 내에 통합된다. 또 다른 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 유전자 카세트의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드와 5' 방향으로 바로 인접해 있거나, 유전자 카세트의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드와 3' 방향으로 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위 및 유전자 카세트는 발현-향상 서열 내에 통합된다.

하나의 구현예에서, 2개 이상의 재조합효소 인식 부위가 발현-향상 서열 내에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 반대 배향의 2개 이상의 재조합효소 인식 부위가 발현-향상 서열 내에 통합된다. 또 다른 구현예에서, 3개의 재조합효소 인식 부위가 발현-향상 서열 내에 통합된다.

하나의 양상에서, 서열번호 1의 조작된 발현-향상 서열 또는 이의 발현-향상 단편을 포함하는 단리된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 제공된다. 하나의 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 안정한 변이체를 포함하는 발현-향상된 서열은 전술된 바와 같이 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위해 조작된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 발현-향상 서열 또는 이의 안정한 변이체를 포함하는 유전자좌에 삽입된 외인성 핵산 서열을 포함하는 단리된 CHO 세포를 제공한다.

하나의 구현예에서, CHO 세포는 발현-향상 서열 내에 하나 이상의 재조합효소 인식 서열을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 서열은 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66, LoxFas 및 frt 부위로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 유전자 카세트의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드와 5' 방향으로 바로 인접해 있거나, 유전자 카세트의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드와 3' 방향으로 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위 및 유전자 카세트는 본원에 기술된 CHO 세포 게놈의 발현-향상 서열 내에 통합된다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는, 유전자 카세트가 서열번호 1의 1001 내지 2001 뉴클레오티드(서열번호 2)와 90% 이상의 동일성, 약 91% 이상의 동일성, 약 92% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 94% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 96% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 98% 이상의 동일성, 또는 약 99% 이상의 동일성을 포함하는 발현-향상 서열 또는 이의 발현-향상 단편을 포함한다는 단서와 함께 전술된 바와 같이 위치한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는, 유전자 카세트가 서열번호 1의 2022 내지 3022 뉴클레오티드(서열번호 3)와 90% 이상의 동일성, 약 91% 이상의 동일성, 약 92% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 94% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 96% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 98% 이상의 동일성, 또는 약 99% 이상의 동일성을 포함하는 발현-향상 서열 또는 이의 발현-향상 단편을 포함한다는 단서와 함께 전술된 바와 같이 위치한다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는 서열번호 1의 1990~1991, 1991~1992, 1992~1993, 1993~1994, 1995~1996, 1996~1997, 1997~1998, 1999~2000, 2001~2002, 2002~2003, 2003~2004, 2004~2005, 2005~2006, 2006~2007, 2007~2008, 2008~2009, 2009~2010, 2010~2011, 2011~2012, 2012~2013, 2013~2014, 2014~2015, 2015~2016, 2016~2017, 2017~2018, 2018~2019, 2019~2020, 2020~2021 또는 2021~2022 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 CHO 세포 게놈에 삽입된다.

또 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 서열번호 1의 1990~1991, 1991~1992, 1992~1993, 1993~1994, 1995~1996, 1996~1997, 1997~1998, 1999~2000, 2001~2002, 2002~2003, 2003~2004, 2004~2005, 2005~2006, 2006~2007, 2007~2008, 2008~2009, 2009~2010, 2010~2011, 2011~2012, 2012~2013, 2013~2014, 2014~2015, 2015~2016, 2016~2017, 2017~2018, 2018~2019, 2019~2020, 2020~2021 또는 2021~2022 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 CHO 게놈에 삽입된다.

또 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 서열번호 1의 2001~2022 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 CHO 게놈에 삽입된다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 서열번호1의 2001~2002 뉴클레오티드 또는 2021~2022 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 삽입되고, 이러한 삽입의 결과로서 서열번호 1의 2002~2021 뉴클레오티드가 결실된다. 마찬가지로, 외인성 핵산은 서열번호 4의 9302~9321 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 CHO 게놈에 삽입된다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 서열번호 4의 9301~9302 뉴클레오티드 또는 9321~9322 뉴클레오티드에서 또는 그 안에서 삽입되고, 이러한 삽입의 결과로서 서열번호 4의 9302~9321 뉴클레오티드가 결실된다.

일부 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 같이 유전자좌 내의 특정 부위에서 통합된 외인성 핵산 서열은 관심 유전자(GOI)(예컨대, 관심 단백질 또는 "POI"를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 관심 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관심 유전자는 제1GOI, 제2GOI 및 제3GOI로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 같이 유전자좌 내의 특정 부위에서 통합된 외인성 핵산 서열은 하나의 GOI 및 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1GOI는 전술된 바와 같이, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 발현-향상 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 발현-향상 서열, 또는 이의 발현-향상 단편 내에 삽입되고, 제1GOI는 선택적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이때, 프로모터에 연결된 GOI(또는 GOI)는 제1재조합효소 인식 부위에 의해 5' 측부 및 제2재조합효소 인식 부위에 의해 3' 측부에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 제2GOI는 제2재조합효소 인식 부위의 3'에 삽입되고, 제2GOI는 제3재조합효소 인식 부위에 의해 3' 측부에 위치한다.

또 다른 구현예에서, GOI는 GOI의 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이때, 프로모터는 활성화인자 또는 저해인자에 의해 조절될 수 있는 진핵생물 프로모터를 포함한다. 다른 구현예에서, 진핵생물 프로모터는 원핵생물 오퍼레이터에 작동가능하게 연결되고, 진핵 세포는 선택적으로 원핵생물 억제 단백질을 더 포함한다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 선택성 마커가 제1과 제2 및/또는 제2와 제3 재조합효소 인식 부위 사이에 포함된다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 관심 유전자 및/또는 하나 이상의 선택성 마커는 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 이때, 프로모터는 동일하거나 다를 수 있다. 또 다른 구현예에서, 프로모터는 진핵생물 프로모터(예컨대, CMV 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터)를 포함하며, 선택적으로 원핵생물 오퍼레이터(예컨대, tet 오퍼레이터)에 의해 제어된다. 다른 구현예에서, 세포는 원핵생물 억제인자(예컨대 tet 억제인자)를 암호화하는 유전자를 더 포함한다.

또 다른 구현예에서, 세포는 재조합효소를 발현할 수 있는 유전자를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다.

일 측면에서, CHO 숙주 세포가 제공되며, 이는 서열번호 1 또는 서열번호 4로부터 선택되는 발현-향상 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 발현-향상 서열, 또는 이의 발현-향상 단편을 포함하고, 제1재조합효소 인식 부위 다음에 제1진핵생물 프로모터, 제1선택성 마커 유전자, 제2진핵생물 프로모터, 제2선택성 마커 유전자, 및 제2재조합효소 인식 부위를 포함한다. 추가의 구현예에서, CHO 숙주 세포는 제3진핵생물 프로모터, 제3마커 유전자 및 제3재조합효소 인식 부위를 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 발현-향상 서열은 전술된 바와 같이 서열번호 1 또는 서열번호 4 내에 있다.

하나의 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 재조합효소 인식 부위는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66, LoxFas 및 frt 부위로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 제1선택성 마커 유전자는 약물 내성 유전자이다. 또 다른 구현예에서, 약물 내성 유전자는 네오마이신 내성 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 또 다른 구현예에서, 제2 및 제3선택성 마커 유전자는 2개의 상이한 형광 단백질을 암호화한다. 하나의 구현예에서, 2개의 상이한 형광 단백질은 디스코소마 산호(Discosoma coral, DsRed), 녹색 형광 단백질(GFP), 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP), 시안 형광 단백질(CFP), 향상된 시안 형광 단백질(eCFP), 황색 형광 단백질(YFP), 향상된 황색 형광 단백질(eYFP) 및 원-적색 형광 단백질(예컨대, mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry 또는 E2- crimson)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 제1, 제2 및 제3프로모터는 동일하다. 또 다른 구현예에서, 제1, 제2 및 제3프로모터는 서로 상이하다. 또 다른 구현예에서, 제1프로모터는 제2 및 제3프로모터와 상이하고, 제2 및 제3프로모터는 동일하다. 추가의 구현예에서, 제1프로모터는 SV40 후기 프로모터이고, 제2 및 제3프로모터는 각각 인간 CMV 프로모터이다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2프로모터는 원핵생물 오퍼레이터에 작동가능하게 연결된다.

하나의 구현예에서, 숙주 세포주는 이의 게놈 내로 통합된 재조합효소를 암호화하는 외래적으로 추가된 유전자를 가지며, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 구현예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 이의 게놈 내로 통합된 조절 단백질을 암호화하는 유전자를 가지며, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 추가의 구현예에서, 조절 단백질은 tet 억제 단백질이다.

하나의 구현예에서, 제1GOI 및 제2GOI는 항체의 경쇄 또는 이의 단편, 또는 항체의 중쇄 또는 이의 단편을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 제1GOI는 항체의 경쇄를 암호화하고, 제2GOI는 항체의 중쇄를 암호화한다.

특정 구현예에서, 제1, 제2 및 제3GOI는 제1경쇄 또는 이의 단편, 제2경쇄 또는 이의 단편 및 중쇄 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 제1, 제2 및 제3GOI는 경쇄 또는 이의 단편, 제1중쇄 또는 이의 단편 및 제2중쇄 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화한다.

일 측면에서, (a) 서열번호 1 또는 서열 번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 특정 유전자좌 내로 통합되는 관심 유전자(GOI)를 CHO 숙주세포에 도입하는 단계; (b) GOI가 발현될 수 있는 조건하에 (a)의 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 관심 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 관심 단백질을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 관심 단백질은 면역글로불린 서브유닛 또는 이의 단편 및 수용체, 또는 이의 리간드-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 항체 경쇄, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, GOI는 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 위한 표적화 벡터를 사용하여 세포 내로 도입되고, CHO 숙주 세포 게놈은 특정 유전자좌 내에 하나 이상의 외인성 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, CHO 숙주 세포 게놈은 특정 유전자좌 내에 하나 이상의 외인성 인식 서열 및 선택적으로 프로모터에 연결된 선택성 마커, IRES 및/또는 폴리아데닐화(폴리A) 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, CHO 숙주 세포 게놈은 전술된 바와 같은 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하고, GOI는 재조합효소 인식 부위를 인식하는 재조합효소의 작용을 통해 특정 유전자좌 내로 도입된다.

또 다른 구현예에서, GOI는 상동 재조합을 위한 표적화 벡터를 사용하여 세포 내로 도입되고, 이때, 표적화 벡터는 특정 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 5' 상동성 팔, GOI 및 특정 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 3' 상동성 팔을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 벡터는 2, 3, 4 또는 5개 이상의 관심 유전자를 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 관심 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

또 다른 측면에서, 표적화 벡터가 제공되며, 이때, 표적화 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 5' 상동성 팔, GOI, 및 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 3' 상동성 팔을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 벡터는 2, 3, 4 또는 5개 이상의 관심 유전자를 더 포함한다.

또 다른 측면에서, 벡터를 포함하는 비히클을 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위한 CHO 세포 게놈의 변형 방법이 제공되며, 이때, 상기 벡터는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상기 외인성 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈의 유전자좌 내에 통합된다.

일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈의 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 5' 상동성 팔, 외인성 핵산 서열, 및 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈의 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 3' 상동성 팔을 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터 내의 외인성 핵산 서열은

하나 이상의 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 하나 이상의 GOI, 예컨대 선택성 마커 또는 POI를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 하나 이상의 GOI 및 하나 이상의 인식 서열을 포함한다.

하나의 구현예에서, 비히클은 하나 이상의 추가 벡터 또는 mRNA를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 추가 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 통합 파지 벡터, 비-바이러스 벡터, 전이인자(transposon) 및/또는 전이효소, 통합효소 기질, 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 추가 벡터는 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위한 부위-특이적 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 촉진제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, 또는 RNA-유도된 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.

또 다른 측면에서, 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위해 CHO 세포 게놈을 변형하기 위한 비히클이 제공되며, 상기 비히클은 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈의 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 5' 상동성 팔, 외인성 핵산 서열, 및 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈의 유전자좌에 존재하는 서열과 상동성인 3' 상동성 팔을 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 GOI, 예컨대 선택성 마커 또는 POI를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 하나 이상의 GOI 및 하나 이상의 인식 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 치료제의 발현을 위한 서열을 포함하는 외인성 핵산을 게놈 내에 도입하기 위한 비히클을 포함하는 치료제를 발현하기 위해 CHO 세포 게놈을 변형시키는 방법이 제공되며, 이때, 상기 비히클은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동성인 5' 상동성 팔, 치료제를 암호화하는 핵산, 및 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동성인 3' 상동성 팔을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 본 발명은 변형된 CHO 게놈을 포함하는 변형된 CHO 숙주 세포를 제공하며, 이때, 상기 CHO 게놈은 서열번호 1과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 게놈의 유전자좌 내에 외인성 인식 서열이 삽입됨으로써 변형된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 변형된 진핵생물 게놈을 포함하는 변형된 진핵생물 숙주 세포를 제공하며, 이때, 상기 진핵생물 게놈은 외인성 핵산을 삽입하기 위해 게놈의 비-암호화 영역의 표적 통합 부위에서 변형된다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 인식 서열이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포이다. 다른 구현예에서, 표적 통합 부위는 서열이 임의의 내인성 단백질을 암호화하지 않는다면, 발현-향상 서열, 예컨대 서열번호 1을 포함한다. 본 발명은 또한 이와 같이 변형된 진핵생물 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

전술된 임의의 측면 및 구현예에서, 발현-향상 서열은 서열번호 1의 지시된 배향 또는 서열번호 1의 역배향에 배치될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면 및 구현예는 달리 명시되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본 발명의 임의의 다른 측면 또는 구현예와 관련하여 사용될 수 있다.

다른 목적 및 이점은 후속하는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

도 1a 및 1b. 도 1a: GOI(예컨대, 다중-쇄 항체) 및 선택성 마커의 다수의 복사본을 발현하는 핵산 분자의 세포의 게놈, 예컨대 표적 유전자좌를 동정하기 위한 CHO 게놈 내로의 무작위 도입을 이용한 작동가능한 작제물의 개략도. 예시된 작제물은 중쇄; 제1 복사본 선택성 마커, 예컨대 하이그로마이신 내성 유전자(Hyg); 제1복사본 경쇄(LC); 제2복사본 선택성 마커(예컨대, Hyg), 제2복사본 경쇄(LC); 제3복사본 선택성 마커(예컨대, Hyg)를 포함한다. 도 1b: 서열번호 1로 동정된 천연 유전자좌 내로 상동 재조합을 통해 통합하기 위한 공여자 벡터의 예시. 5' 및 3' 상동성 팔은 서열번호 1로부터 유도된다.
도2a 내지 도 2c는 관심 유전자(GOI)에 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 유전자좌(1번 유전자좌)가, 1번 유전자좌에 작동가능하게 연결되지 않고 대신 대조군 유전자좌에 연결된 동일한 GOI와 비교하여, GOI의 향상된 mRNA 발현을 나타냄을 보여준다. 도 2a: 관심 항체 유전자를 암호화하는 세포, 즉 동등한 수의 유전자 복사본이 대조군 유전자좌 대 1번 유전자좌에 작동가능하게 연결된 하나의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)에 대해 나타난 등가 유전자 복제 수. 도 2b: 대조군 유전자좌 mRNA와 비교하여, 1번 유전자좌에서 발현된 GOI의 경우 mRNA 수준이 보다 높음을 보여준다. 도 2c: 대조군 유전자좌에서 동일한 GOI를 발현하는 세포로부터 생산된 단백질 역가와 비교하여, 1번 유전자좌 에서 GOI를 발현하는 세포의 경우 단백질 역가는 3배 더 높다.
도 3a 및 3b는 대조군 유전자좌에서 통합된 동일한 카세트(상이한 형광 마커, 예컨대 lox 부위에 의해 측부에 위치한 dsRed2와 교환된)와 비교하여, 1번 유전자좌에서 통합된 형광 마커 및 GOI(예컨대, eYFP 및 GOI로 교환되도록 lox 부위에 의해 측부위 위치한 mKate)를 포함하는 예시적인 카세트를 나타낸 것이며, 이때, 이러한 통합은 Cre 재조합효소 및 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 사용한다. 이러한 카세트는 재조합 효율 및 GOI의 전사를 측정하기 위해 실험에서 사용되었다.
도 4는 동일한 조절 조건이지만 대조군 유전자좌, 즉 EESYR 내에 통합된 동일한 GOI를 발현하는 CHO 세포 풀(pool)의 mRNA와 비교하여, 1번 유전자좌(서열번호1)에서 GOI를 발현하는 CHO 세포 풀에서 측정된 관심 유전자(GOI)의 보다 높은 mRNA 수준을 보여준다.

본 발명의 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 설명된 실험 조건이 다양하여 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항에 의해 제한되므로 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하고자할 뿐 제한하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 단수 형태는 다수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 참조는 하나 이상의 방법 및/또는 본 발명에서 설명 및/또는 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해질 종류의 단계를 포함한다.

달리 정의되거나 규정되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 특정 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본 발명에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 본 발명에 참조로 인용되어 있다.

정의

DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 연관되어 있을 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 상기 서열의 전사에 참여할 수 있으면 암호화 서열에 작동가능하게 연결되고; 리보솜-결합 부위는 번역이 가능하도록 배치되는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된다는 것은 인접성을 포함하나, 반드시 필요하지는 않다. 분비 리더(leaders)와 같은 서열의 경우, 접근 및 해독 틀(reading frame)에서 적절한 배치는 일반적인 특징이다. 관심 유전자좌의 발현-향상 서열은 관심 유전자(GOI)와 작동가능하게 연결되며, 이는 GOI와 기능적으로 연관되어 있고, 예컨대, 이의 존재로 인해 GOI의 향상된 발현 및/또는 안정한 통합이 야기된다.

용어 "향상된"은 향상된 발현을 설명하기 위해 사용되는 경우 예컨대, 동일한 발현 작제물의 단일 복사본의 무작위 통합체의 풀과 비교할 때, 외인성 서열을 게놈 내로 무작위로 통합 또는 상이한 유전자좌에서의 통합에 의해 전형적으로 관찰되는 것에 비해, 발현 향상에 있어 약 1.5 배 내지 약 3배의 발현 향상을 포함한다. 실질적으로 동일한 조건에서, 본 발명의 서열의 부재에서 동일한 유전자의 발현 수준에 비해, 예컨대 동일한 종의 게놈 내의 또 다른 유전자좌에서 통합시키는 경우에 비해, 본 발명의 서열을 사용할 때 배수의(fold)-발현 향상이 관찰되었다. 향상된 재조합 효율은 재조합을 할 수 있는 유전자좌의 능력 향상을 포함한다(예를 들어, 재조합효소-인식 부위 이용). 향상은 예컨대 재조합효소-인식 부위 등을 사용하지 않은 무작위 재조합을 넘어선 재조합 효율을 지칭하며, 전형적으로 0.1%이다. 바람직한 향상된 재조합 효율은 무작위보다 약 10배 또는 약 1%이다. 명시되지 않은 한, 청구된 발명은 특정한 재조합 효율에 제한되지 않는다.

어구 "외래적으로 추가된 유전자" 또는 "외래적으로 추가된 핵산"이 관심 유전자좌와 관련하여 사용되는 경우, 이러한 어구는 유전자좌가 자연에서 발견될 때 관심 유전자좌 내에 존재하지 않는 임의의 DNA 서열 또는 유전자를 지칭한다. 예컨대, CHO 유전자좌(예컨대, 서열번호 1의 서열을 포함하는 유전자좌) 내에 "외래적으로 추가된 유전자"는 자연에서 특정 CHO 유전자좌 내에서 발견되지 않는 햄스터 유전자(즉, 햄스터 게놈의 또 다른 유전자좌의 햄스터 유전자), 임의의 다른 종(예컨대, 인간 유전자)의 유전자, 키메릭 유전자(예컨대, 인간/마우스), 또는 CHO 관심 유전자좌 내에 존재하는 자연에서 발견되지 않는 임의의 다른 유전자일 수 있다.

관심 유전자좌, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 4 또는 이의 단편을 기술할 때, 동일성 %는 연속적인 상동성의 영역을 따라 인용된 동일성을 표시하는 상동 서열을 포함하는 것을 의미하지만, 비교된 서열에는 상동성이 없는 갭, 결실 또는 삽입의 존재는 동일성 %를 계산할 때 고려되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 예컨대 종 동족체(homolog)를 갖는 서열번호 1 또는 이의 단편 사이의 "동일성 %" 결정은 종 동족체가 정렬에서 비교될 상동 서열을 갖지 않는 경우 서열의 비교를 포함하지 않을 것이다(즉, 서열번호 1 또는 이의 단편은 그 지점에 삽입을 갖거나, 종 동족체는 경우에 따라 갭 또는 결실을 갖는다). 따라서, "동일성 %"는 갭, 결실 및 삽입에 대한 불이익을 포함하지 않는다.

핵산 서열의 문맥에서 "상동 서열"은 참조 핵산 서열과 실질적으로 상동인 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은 잔기의 관련 구간에 걸쳐 상응하는 뉴클레오티드가 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 경우 실질적으로 상동인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한(즉, 전장) 서열이다.

"표적화된 삽입"은 유전자 또는 핵산 서열을 게놈상의 특정 위치에 직접 삽입 또는 통합을 지시, 즉, DNA를 연속적인 폴리뉴클레오티드 쇄의 2개 뉴클레오티드 사이의 특정 부위에 지시하는데 사용되는 유전자 표적화 방법을 지칭한다. 표적화된 삽입은 또한 다중 유전자, 조절 요소 및/또는 핵산 서열을 포함하는 특정 유전자 카세트에 대해서도 수행될 수 있다. "삽입" 및 "통합"은 상호교환적으로 사용된다. 유전자 또는 핵산 서열(예컨대, 발현 카세트를 포함하는 핵산 서열)의 삽입은 이용되는 유전자 편집 기법에 따라 하나 이상의 핵산의 치환, 또는 결실을 야기할 수 있다(또는 이를 위해 조작될 수 있다).

"인식 부위" 또는 "인식 서열"은 뉴클레아제 또는 다른 효소에 의해 인식되어 DNA 골격의 결합 및 부위-특이적인 절단을 지시하는 특이적인 DNA 서열이다. 엔도뉴클레아제는 DNA 분자 내의 DNA를 절단한다. 인식 부위는 또한 당업계에서 인식 표적 부위로도 지칭된다.

"재조합효소 인식 부위"는 재조합효소, 예컨대 Cre 재조합효소(Cre) 또는 플립파아제(flp)에 의해 인식되는 특이적인 DNA 서열이다. 부위-특이적인 재조합효소는 하나 이상의 이의 표적 인식 서열이 유기체의 게놈 내에 전략적으로 배치되는 경우 결실, 도치 및 전좌를 비롯하여 DNA 재배열을 수행할 수 있다. 하나의 예시에서, Cre는 8-bp 스페이서에 의해 분리된 2개의 13-bp 역위 반복으로 이루어진 이의 DNA 표적 인식 부위 loxP에서 재조합 사건을 특이적으로 매개한다. 예컨대, DNA의 재조합-매개 교환을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 재조합효소 인식 부위가 사용될 수 있다. 재조합효소 인식 부위, 예컨대, lox 부위의 변이체 또는 돌연변이가 또한 사용될 수 있다(Araki, N. 등, 2002, Nucleic Acids Research, 30:19, e103).

"재조합효소-매개 카세트 교환"은 게놈 표적 카세트를 공여자 카세트로 정확하게 치환하는 공정과 관련이 있다. 이러한 공정을 수행하기 위해 전형적으로 제공되는 분자 조성물은 (1) 특정 재조합효소에 특이적인 인식 표적 부위에 의한 5' 및 3' 둘 다의 측부에 위치한 게놈 표적 카세트, (2) 인식 표적 부위의 매칭에 의해 측부에 위치한 공여자 카세트, 및 (3) 부위-특이적인 재조합효소를 포함한다. 재조합효소 단백질이 당업계에 널리 공지되어 있으며(Turan, S. 및 Bode J., 2011, FASEB J., 25, pp. 4088-4107), 뉴클레오티드의 수득 또는 손실 없이 특정 인식 표적 부위(DNA 서열) 내에서 DNA의 정확한 절단을 가능케 한다. 통상적인 재조합효소/부위 조합은 비제한적으로 Cre/lox 및 Flp/frt를 포함한다.

"비히클"은 세포 내 도입을 위해 외인성 핵산을 운반하는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 조성물이다. 비히클은 널리-공지된 형질감염 방법에 의해 세포로 전달되는 벡터, 플라스미드 및 mRNA를 포함한다. 하나의 예시에서, 세포 내로 도입된 mRNA는 일시적일 수 있고, 게놈에 통합되지 않지만, mRNA는 통합 공정이 일어나기 위해 필수적인 외인성 핵산을 운반할 수 있다.

일반적인 설명

본 발명은 게놈의 다른 영역 또는 서열보다 효율적인 재조합, 삽입 안정성 및 보다 높은 수준의 발현을 나타내는, 게놈 내의 독특한 서열, 즉 유전자좌의 발견에 최소한 부분적으로 기초한다. 본 발명은 또한 이러한 발현-향상 서열이 동정된 경우, 적절한 유전자 또는 작제물이 서열 내 또는 그 근처에 외래적으로 추가될 수 있고, 외래적으로 추가된 유전자는 추가의 게놈 변형을 위해 유리하게 발현되거나 사용될 수 있음을 발견한 것에 최소한 부분적으로 기초한다. 발현-향상 서열이라는 명칭의 이러한 서열은 안정한 것으로 간주되고, 게놈의 암호화 영역 내에 위치하지 않는다. 이러한 발현-향상 및 안정성 영역은 미래의 복제 또는 게놈 편집 사건을 위해 조작될 수 있다. 따라서, 신뢰할 수 있는 발현 체계가 세포의 게놈 골격 내에 만들어진다.

본 발명은 또한 외인성 유전자를 통합 부위로 특이적으로 표적화하는 것에 기초한다. 본 발명의 방법은, 예컨대 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 사용함으로써 유용한 복제 카세트로 세포 게놈을 효율적으로 "전환"하는 것을 가능케 한다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 재조합 단백질 생산을 위해, 고도로 생산적인 세포주를 생성하기 위한 관심 유전자의 배치를 위해, 세포 게놈 재조합효소 인식 부위를 사용한다.

본 발명의 조성물은 또한 발현 작제물, 예컨대 복제 및 새로운 세포주를 조작하기 위한 발현 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는, 단백질을 일시적으로 발현하는데 사용될 수 있거나, 예컨대 상동 재조합 또는 특정 재조합 부위를 인식하는 재조합 효소에 의해 매개된 또는 재조합(예를 들어, Cre-lox-매개 재조합)과 같이 무작위 또는 표적 재조합에 의해 게놈에 통합될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 또한 다른 DNA 서열, 예컨대 시스-작용 조절 서열의 효율을 평가하는데 사용될 수 있다.

통합 부위는 전형적으로 무작위 통합 또는 레트로바이러스 통합 사건 분석에 의해 확인된다. 본원에 상세하게 기술된 CHO 통합 부위는 다중-쇄 항체를 암호화하는 DNA의 무작위 통합에 의해 확인되고, 발현된 단백질은 향상된 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

하나의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC) 복사본을 포함하는 예시적인 다중-쇄 항체는 교대하는 하이그로마이신 내성 유전자(예컨대, 도 1a에 도시되어 있는 3개의 동일한 Hyg 유전자 참조)를 함유하는 발현 카세트의 게놈 내로 무작위로 통합된다. 하나의 안정하고 높은 발현 클론은 서열번호 1로 확인되는 유전자좌 내의 발현 카세트의 통합에 기인한다.

CHO 게놈의 또 다른 영역(제어 통합 부위)으로의 통합과 비교하여, 예시적인 다중-쇄 항체는 서열번호 1의 유전자좌 내에 통합되는 경우 보다 높은 발현 수준을 나타낸다. 흥미롭게도, 유전자 복사본 수는 대조군 통합 부위 대 서열번호 1 내에 통합된 항체 -발현 폴리뉴클레오티드와 비슷하지만, 단백질 역가는 서열번호 1 내에 통합된 항체-발현 폴리뉴클레오티드가 3배 더 높았다.

CHO 세포 게놈을 재조합효소 인식 부위를 함유하는 복제 작제물로 변환시키기 위해 표적화된 재조합 방법을 사용하였다(예컨대, 도 3a 내지 3b 참조).

필수적으로, 서열번호 1의 통합 부위를 동정한 후에, 재조합효소 인식 부위(예컨대, lox 부위)를 임의의 다른 바람직한 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 마커, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위(예컨대, 내부 리보솜 진입 부위) 등과 함께 발현가능한 GOI, 예컨대 선택성 마커(예컨대, 도 3a 내지 도 3b 참조)를 포함하는 발현 카세트를 도입하기 위한 유전자좌에서 사용하였다.

서열번호 1 내에서 lox 부위의 표적화된 통합을 위해 사용된 예시적인 공여자 작제물의 예시가 도 1b에 나타나 있다. 공여자 작제물은 네오마이신(neo) 내성 유전자 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 유도되는 발현 카세트를 포함하며, 이때, 상기 카세트는 형광 마커(mKate)를 포함하고, 재조합효소 인식 부위 및 5' 및 3' 상동성 팔(서열번호 1과 상동)과 함께 5' 및 3' 말단의 측부에 위치한다. 서열번호 1의 유전자좌 내에 삽입이 나타났으며, 이때, 삽입은 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하는 발현 카세트를 공여자 neo/mKate 작제물로 대체시고, 이때, 서열번호 1의 유전자좌 내의 발현 카세트는 5' 및 3' 상동성 팔(서열번호 1과 상동)에 연결되어 있는 재조합효소 인식 부위에 의해 이의 5' 및 3' 말단의 측부에 위치한다(도 1b 참조).

핵산 서열을 진핵 세포로 안정하게 통합하기 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 이때, 상기 핵산 서열은 서열번호 1 또는 이의 발현-향상 단편에 통합되어 발현을 향상시킬 수 있다. GOI로부터 관심 단백질의 발현을 달성하기 위해, GOI를 삽입하기에 편리한 서열번호 1 내의 재조합효소 인식 서열을 함유하는 세포가 제공된다. 발현 작제물, 예컨대 발현 벡터와 연결되어 통합 부위를 표적화하고, 관심 CHO 세포 내로 외인성 핵산을 첨가하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.

CHO 통합 부위의 물리적 및 기능적 특성 분석

서열번호 1의 핵산 서열(및 서열번호 4의 보다 넓은 핵산 서열)을 단백질을 높은 수준으로 발현하는 세포주의 핵산 작제물(발현 카세트 포함)의 통합 부위의 상류 및 하류 서열에 의해 경험적으로 동정하였다. 본 발명의 핵산 서열은 핵산의 향상된 발현 및 안정성과 관련된 신규한 기능을 갖는 서열을 제공하며(예컨대, GOI를 포함하는 외인성 핵산), 임의의 하나의 이론에 구속됨 없이, 시스-작용 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 유전자좌 제어 영역, 지지체 부착 영역 또는 기질 부착 영역에 대해 이전에 기술된 것과 동일하거나 상이하게 기능할 수 있다. 서열번호 1은 임의의 개방형 해독 틀(ORF)을 갖지 않는 것으로 보이므로, 유전자좌가 신규한 트랜스-활성인자 단백질을 암호화하는 것 같지는 않다. 추정상의 징크 핑거(Zinc finger) 단백질이 서열번호 4의 3' 게놈 유전자좌(하류)에서 동정되었다.

발현-향상 활성이 CHO 게놈 DNA의 비-암호화 영역의 독특한 부위 내에서 제1하이그로마이신(Hyg) 유전자, 제1GOI, 제2Hyg 유전자, 제2GOI, 제3Hyg 유전자 및 제3GOI 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트의 통합과 관련하여 동정되었다. 예컨대, 발현 카세트를 발현하는 GOI와 관련하여, CHO 게놈 DNA의 비암호화 영역으로부터 동정된 5' 단리된 1 kb 영역 및 3' 단리된 1 kb 영역을 포함하는 발현 벡터는 CHO 세포가 이로 형질감염되면 재조합 단백질의 높은 수준의 발현을 제공할 수 있었다.

본 발명은 역배향의 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 4의 단편을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 본원에 기술된 단편의 다른 조합이 또한 개발될 수 있다. 역시 개발될 수 있는 본 발명에 기술된 단편의 다른 조합 예는 본원에 기술된 발현-향상 서열의 다수의 복사본, 또는 최적의 조절 요소 조합을 얻기 위해 다른 뉴클레오티드 서열과 함께 개시된 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 4의 단편을 조합하여 유도된 서열을 포함한다. 이러한 조합은 연속적으로 연결되거나 배열되어 서열번호 1 또는 서열번호 4의 단편의 최적의 스페이스를 제공한다(예컨대, 스페이서 뉴클레오티드를 단편사이에 도입함으로써). 조절 요소는 또한 조절 요소와 관련하여 서열번호 1의 단편의 최적의 스페이스를 제공하기 위해 배열될 수 있다.

본원에 개시된 서열번호 1 및 서열번호 4는 CHO 세포로부터 단리되었다. 다른 포유류 종(예컨대 인간 또는 마우스)는 동정된 발현-향상 영역과 제한된 상동성을 갖는 것으로 확인되었지만, 상동 서열은 중국 햄스터의 다른 조직 유형 또는 다른 상동의 종으로부터 유래된 세포주에서 발견될 수 있고, 당업계에 널리 공지된 기법에 의해 단리될 수 있다. 예컨대, 종간 혼성화 또는 PCR-기반 기법에 의해 다른 상동 서열을 동정할 수 있다. 또한, 당업계에 널리 공지된 부위-지시적 또는 무작위 돌연변이 유발 기법에 의해 서열번호 1, 서열번호 4 또는 이들의 단편에 기술된 뉴클레오티드 서열에서 변화가 발생할 수 있다. 이어서, 생성된 서열 변이체는 본원에 기술된 바와 같이 발현-향상 활성에 대해 시험될 수 있다. 발현-향상 활성을 갖는 서열번호 1, 서열번호 4 또는 이들의 단편과 핵산 동일성이 90% 이상인 DNA는 통상적인 실험에 의해 단리되고, 발현 -향상 활성을 나타낼 것으로 기대된다. 서열번호 1 또는 서열번호 4의 단편에 대하여, 동일성 %는 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 4의 단편에서 발견되는 참조 천연 서열의 부분을 지칭한다. 따라서, 서열번호 1, 서열번호 4 또는 이들의 단편의 상동체 및 이들의 변이체가 또한 본 발명의 구현예에 포함된다.

특정 구현예에서, 서열번호 1의 단편은 서열번호 1의 10~4,000; 100~3,900; 200~3,800; 300~3,700; 400~3,600; 500~3,500; 600~3,400; 700~3,300; 800~3,200; 900~3,100; 1,000~3,000; 1,100~2,900; 1,200~2,800; 1,300~2,700; 1,200~2,600; 1,300~2,500; 1,400~2,400; 1,500~2,300; 1,600~2,200; 1,700~2100; 1,800~2050; 1850~2050, 1,900~2040; 1950~2,025, 1990~2021, 2002~2021 및 2,010~2,015번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 서열번호 1의 단편은 서열번호 1의 10~500; 500~1,000; 500~2,100; 1,000~1,500; 1,000~2,100; 1,500~2,000; 1,500~2,500; 2,000~2,500; 2,500~3,000; 2,500~3,500; 3,000~3,500; 3,000~4,000; 및 3,500~4,000번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 전술된 단편 내의 특정 부위에서 또는 그 근처에서 통합된다.

또 다른 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 전술된 바와 같이 서열번호 1 또는 이의 단편내, 또는 서열번호 1의 발현-향상 서열 또는 이의 발현-향상 단편과 약 90% 이상 동일, 약 91% 이상 동일, 약 92% 이상 동일, 약 93% 이상 동일, 약 94% 이상 동일, 약 95% 이상 동일, 약 96% 이상 동일, 약 97% 이상 동일, 약 98% 이상 동일, 또는 약 99% 이상 동일한 서열 내에 위치한다.

향상된 수준의 관심 단백질을 발현하는 세포 집단은 본원에 제공된 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 절대 발현 수준은 단백질이 세포에 의해 얼마나 효율적으로 처리되는지에 따라, 특이적 단백질에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 발현-향상 서열 내에 통합된 외인성 서열로 개발된 세포 집단은 시간의 경과에 따라 안정하고 대부분의 목적을 위해 안정한 세포주로 취급될 수 있다. 재조합 단계는 또한 본 발명의 세포주 개발 공정에서 나중까지 연기될 수 있다.

CHO 발현-향상 유전자좌 및 이의 단편

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상 동일, 약 91% 이상 동일, 약 92% 이상 동일, 약 93% 이상 동일, 약 94% 이상 동일, 약 95% 이상 동일, 약 96% 이상 동일, 약 97% 이상 동일, 약 98% 이상 동일, 또는 약 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현-향상 단편을 포함한다. 본 발명은 일시적 또는 안정한 형질감염을 포함하여, 서열번호 1의 10~4,000; 100~3,900; 200~3,800; 300~3,700; 400~3,600; 500~3,500; 600~3,400; 700~3,300; 800~3,200; 900~3,100; 1,000~3,000; 1,100~2,900; 1,200~2,800; 1,300~2,700; 1,200~2,600; 1,300~2,500; 1,400~2,400; 1,500~2,300; 1,600~2,200; 1,700~2100; 1,800~2050; 1850~2050, 1,900~2040; 1950~2,025, 1990~2021, 2002~2021 및 2,010~2,015번 스패닝 위치의 단편을 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 이와 같은 단편을 포함하는 진핵 세포를 포함하며, 이때, 상기 단편은 세포에 대해 외인성이고 세포 게놈 내로 통합되며, 상기 세포는 단편 내, 바로 5' 또는 바로 3'에 있는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 갖는 이와 같은 단편을 포함한다.

하나의 구현예에서, 서열번호 1의 발현-향상 단편은 서열번호 1 이내의 위치에서 서열번호 1의 10~500; 500~1,000; 500~2,100; 1,000~1,500; 1,000~2,100; 1,500~2,000; 1,500~2,500; 2,000~2,500; 2,500~3,000; 2,500~3,500; 3,000~3,500; 3,000~4,000; 또는 3,500~4,000번 서열번호 1번 스패닝 위치에 위치한다.

안정한 통합 및/또는 통합된 폴리뉴클레오티드의 향상된 전사가 지원되는 경우, 예시된 부위에 대한 유전자좌 삽입(예컨대, 통합) 부위의 정확한 위치는 필수적이지 않다. 오히려, 통합 부위는 본원에 기술된 바와 같은 서열번호 1 또는 서열번호 1의 단편, 또는 서열번호 4 또는 서열번호 4의 단편 내 또는 이에 인접한 임의의 위치일 수 있다. 관심 유전자좌 내 또는 이에 근접한 특정 염색체 위치가 통합된 외인성 유전자의 안정한 통합 및 효율적인 전사를 지원하는지 여부는 당업계에 널리 공지된 표준 절차 또는 본원에 예시된 방법에 따라 결정될 수 있다.

본원에서 고려되는 통합 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자좌내, 또는 관심 유전자좌 근접 이내에, 예컨대 염색체 DNA에서 서열번호 1의 위치에 대하여 약 1 kb 미만, 500 염기쌍(bp), 250 bp, 100 bp, 50 bp, 25 bp, 10 bp, 또는 약 5 bp 미만의 상류(5') 또는 하류(3')에 위치한다. 또 다른 일부 구현예에서, 사용된 통합 부위는 염색체 DNA에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 위치에 대하여 약 1000, 2500, 5000 이상의 염기쌍 상류(5') 또는 하류(3')에 위치한다.

큰 게놈 영역, 예컨대 지지체/기질 부착 영역이 염색체 DNA의 효율적인 복제 및 전사를 위해 사용되는 것으로 당 업계에서 이해된다. 지지체-부착 영역(SAR) 또는 기질-결합 또는 기질 부착 영역(MAR)으로도 일컬어지는 것으로 공지된 지지체/기질 부착 영역(S/MAR)은 핵 기질이 부착되는 진핵생물 게놈 DNA 영역이다. 임의의 하나의 이론에 구속됨이 없이, S/MAR은 전형적으로 비-암호화 영역에 도표화(mapping)되고, 주어진 전사 영역(예컨대, 염색질 도메인)을 이의 인접으로부터 분리하고, 전사를 가능하게 하는 인자, 예컨대 DNAses 또는 중합효소 인식 부위를 위한 기구 및/또는 결합을 위한 플랫폼이 또한 제공된다. 몇몇 S/MAR은 길이가 약 14 내지 20 kb인 것으로 특성분석 되었다(Klar 등, 2005, Gene 364:79-89). 이와 같이, 1번 유전자좌(서열번호 1 또는 서열번호 4 내 또는 그 근처)에서 유전자의 통합은 향상된 발현을 제공할 것으로 기대된다.

당업자는 몇몇 요소가 대상 유전자좌에서 높은 전사 활성을 위해 최적화될 수 있고, 이에 따라 관심 단백질을 암호화하는 삽입된 유전자의 높은 발현을 야기한다는 것을 알 것이다. 고려되는 요소는 전사를 유도하는 강력한 프로모터, 적절한 전사 기구 및 개방되고 접근가능한 배치(configuration)를 갖는 DNA를 포함한다. 대상 유전자좌에서의 삽입은 서열번호 1 또는 서열번호 4 내에서 선택된 통합 부위를 표적화함으로써 당업자의 기술 내에서 최적화될 수 있다.

하나의 구현예에서, 서열번호 1의 발현-향상 서열은 GOI의 발현을 향상시키기 위해 사용된다. 도 2a는 CHO 세포 게놈(대조군 유전자좌)의 상이한 유전자좌에서 삽입된 동일한 GOI와 비교한 서열번호 1(1번 유전자좌)에 작동가능하게 연결된 GOI의 결과를 보여준다. 각 세포주에서 측정된 유전자 복사본 수는 동일하지만, 실험은 GOI를 발현하는 세포의 mRNA 수준 및 단백질 역가가 1번 유전자좌에 작동가능하게 연결된 GOI에 대해 3배 더 높음을 보여준다.

다양한 구현예에서, GOI의 발현은 GOI를 서열번호 1 또는 서열번호 4 내에 배치함으로써 향상될 수 있다. 다양한 구현예에서, 발현 향상은 약 1.5배 내지 약 3배 이상이다.

표적 유전자좌를 유전적으로 변형

특정 위치(즉, 표적 유전자좌)에서 세포 게놈을 유전적으로 조작하는 방법이 몇몇 방법으로 달성될 수 있다. 핵산 서열을 진핵 세포 내로 안정하게 통합시키기 위해 유전적 편집 기법이 사용되었으며, 이때, 핵산 서열은 이러한 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 외인성 서열이다. 복제 확장은 세포 자손이 조작된 세포주의 동일한 유전형 및 표현형 특성을 공유할 것을 보장하기 위해 필요하다. 일부 실시예에서, 천연 세포는 서열번호 1 또는 서열번호 4 내에서 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위한 상동 재조합 기술에 의해 변형된다. 다른 실시예에서, 외인성 핵산 서열 또는 관심 유전자를 통합시키기에 편리한 서열번호 1 또는 서열번호 4 내에 하나 이상의 재조합효소 인식 서열을 함유하는 세포가 제공된다.

일부 실시예에서, 제1재조합효소 인식 서열 및 제2재조합효소 인식 서열을 함유하는 세포가 제공되며, 이때, 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 각각은 LoxP, Lox511, Lox5171, Lox2272, Lox2372, Loxm2, Lox-FAS, Lox71, Lox66 및 이의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 경우에, 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE)이 바람직한 경우에, 부위 특이적 재조합효소는 Cre 재조합효소 또는 이의 유도체이다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 각각은 FRT, F3, F5, FRT 돌연변이-10, FRT 돌연변이+10 및 이의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이와 같은 경우, RCME가 바람직한 경우에, 부위 특이적 재조합효소는 Flp 재조합효소 또는 이의 유도체이다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 각각은 attB, attP 및 이의 돌연변이를 포함하는 군으로부터 선택되며, 이와 같은 경우, RCME가 바람직한 경우에, 부위 특이적 재조합효소는 phiC31 통합효소 또는 이의 유도체이다.

일 측면에서, 서열번호 1 또는 서열번호 4 또는 이의 발현-향상 단편 내에 핵산 서열을 안정하게 통합시키기 위한 방법 및 조성물은 상동 재조합을 통한다. 핵산 분자, 즉 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합에 의하거나 통합 부위에서 서열을 특이적으로 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제 방법을 사용함으로써 표적화된 유전자좌(즉, 서열번호 1) 내로 삽입될 수 있다. 상동 재조합의 경우, 상동 폴리뉴클레오티드 분자(즉, 상동성 팔)가 정렬되어 이들의 서열 구간을 교환한다. 전이유전자가 상동성 게놈 서열에 의해 측부에 위치할 경우, 이러한 교환 동안 전이 유전자가 도입될 수 있다. 하나의 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 통합 부위에서 숙주 세포 게놈 내로 도입될 수 있다.

진핵 세포에서 상동 재조합은 상기 통합 부위에서 염색체 DNA 내 절단을 도입하여 촉진될 수 있다. 모델 시스템은 염색체 표적 서열 내 이중 가닥 절단이 도입되면 유전자 표적화시 상동 재조합 빈도가 증가한다는 것을 증명하였다. 이는 통합 특정 부위에 특정 뉴클레아제를 표적화하여 수행될 수 있다. 상기 표적 유전자좌에서 DNA 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 유전자 표적화 벡터는 또한 상동 재조합을 용이하게 하는데 사용된다. 상동성 지시된 수선을 위한 유전자 표적화 벡터의 부재시, 상기 세포는 상기 절단 부위에서 다수의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 야기할 수 있는 비-상동 말단-연결(NHEJ)에 의해 상기 이중 가닥 절단을 종종 폐쇄한다. 이와 같이 삽입 또는 결실(InDel)이 발생하면, 소수의 뉴클레오티드가 절단 부위에서 무작위로 삽입 또는 결실되며, 이러한 InDel은 표적 유전자좌 내 유전자의 임의의 개방형 해독 틀(ORF)을 이동시키거나 파괴할 수 있다. 서열번호 1(또는 서열번호 4)로 확인되는 유전자좌가 유전자 암호화 영역이 아님이 이해된다. 따라서, 내인성 유전자 전사의 파괴는 이러한 유전자좌에서의 삽입 및/또는 결실에 의해 계획되지 않는다.

상동성 지시 수선(또는 상동성 지시 재조합)(HDR)이 대상 유전자좌에서 유전자를 삽입 또는 통합시키기에 특히 유용하다. 공여자 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 서열번호 1 또는 서열번호 4로부터 유래한 상동성 팔이다.

유전자 표적화 벡터 제작 및 뉴클레아제 선택은 본 발명이 속하는 기술자의 기술 범위 이내에 의한다.

일부 실시예에서, 모듈러 구조를 가지며 개별 징크 핑거 도메인을 함유하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 상기 표적 서열(예를 들어, 표적화 통합 부위) 내 특정 3-뉴클레오티드 서열을 인식한다. 몇몇 구현예는 다수의 표적 서열을 표적화하는 개별 징크 핑거 도메인의 조합과 함께 ZFN을 사용할 수 있다.

전사 촉진제-유사(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 또한 부위-특이적 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인은 일반적으로 FokI과 같은 제한 뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인과 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인 및 제한 뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질은 본 발명의 유전자좌 내 표적 서열에서 DNA를 인식하고 절단하는데 사용된다(Boch J 등, 2009 Science 326:1509-1512).

RNA 유전자가위(RNA-guided endonucleases; RGEN)는 세균의 적응 면역 기구로부터 개발된 도구를 조작하는 프로그램할 수 있는 게놈이다. 이 시스템-간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체(the clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR)/CRISPR-관련(Cas) 면역 반응-에서 두 개의 RNA로 복합체를 형성할 때 상기 단백질 Cas9은 서열-특이적 엔도뉴클레아제를 형성하며 이들 RNA중 하나는 표적 선택을 유도한다. RGEN은 구성성분(Cas9 및 tracrRNA) 및 표적-특이적 CRISPR RNA(crRNA)로 이루어진다. DNA 표적 절단 효율 및 절단 부위의 위치 모두는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif; PAM)의 위치, 표적 인식에 대한 추가 요건에 따라 다양하다(Chen, H. 등, J. Biol . Chem. 원고 M113.539726로 2014년 3월 14일자 온라인 출판).

서열번호 1의 유전자좌의 특이적 표적에 대해 독특한 서열을 동정하는 전략이 당업계에 공지되어 있지만, 이들 서열 중 다수를 CHO 세포 게놈에 정렬함으로써 16 내지 17 염기쌍 매치를 갖는 잠재적인 비표적 부위를 밝힐 수 있다. 하나의 예로써, 서열번호 5에 기재된 서열(서열번호 1의 1990 내지 2001 뉴클레오티드에 해당)에 의해 암호화된 20 bp의 가이드 RNA가 서열번호 1 또는 서열번호 4의 RNA-유도된 CRISPR/Cas 유전자 편집에 유용하다. 작은 유도된 RNA 및 tracrRNA(예컨대, 서열번호 6)의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하고, 프로모터 제어하에 적절한 Cas9 효소를 포함하는 플라스미드가 이러한 방법에 의해 표적화된 통합을 사용하도록 공여자 벡터(5' 및 3' 상동성 팔에 의해 측부에 위치한 관심 유전자를 운반함)로 동시에 형질감염될 수 있다. 본원에 전술된 것들 이외에 RNA 분자의 다양한 변형 및 변이체가 당업자로에게 명백하며, 본 발명의 범위 이내에 속하는 것으로 의도된다.

일부 구현예에서, 관심 유전자 또는 인식 서열 또는 유전자 카세트를 암호화하는 서열을 포함하는 외인성 핵산을 게놈 내에 도입하기 위한 비히클은, 경우에 따라 외인성 핵산 및 하나 이상의 추가 벡터 또는 mRNA를 운반하는 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 추가 벡터 또는 mRNA는 비제한적으로 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 촉진제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질 및 RNA-유도된 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하여, 부위-특이적 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 벡터 또는 mRNA는 가이드 RNA, tracrRNA 및 Cas 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1벡터, 및 공여자(외인성) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 이러한 공여자 서열은 관심 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 인식 서열, 또는 표적화된 삽입을 위한 임의의 하나의 이러한 외인성 요소를 포함하는 유전자 카세트를 포함한다. mRNA가 사용되는 경우, mRNA는 당업자에게 공지된 통상의 형질감염 방법에 의해 세포 내로 형질감염될 수 있으며, 효소, 예컨대 전이효소 또는 엔도뉴클레아제를 암호화할 수 있다. 세포 내로 도입되는 mRNA는 일시적일 수 있고 게놈 내로 통합되지 않지만, mRNA는 통합이 발생하기 위해 필수적이거나 유익한 외인성 핵산을 운반할 수 있다. 일부 예에서, mRNA는 부속 폴리뉴클레오티드의 임의의 장기 지속 부작용 위험을 제거하기 위해 선택되며, 이때, GOI의 바람직한 통합을 달성하기 위해서는 단지 단기간의 발현만이 요구된다.

정확한 DNA-결합 특이성을 가진 BuD-유래 뉴클레아제(BuDN) 와 같은 상동 재조합의 또 다른 방법은 당업자가 이용할 수 있다(Stella, S. 등, Acta Cryst. 2014, D70, 2042-2052). 정확한 게놈 변형 방법을 서열 번호 1 내에서 독특한 표적 서열과 호환가능한 도구에 따라 선택하여 세포 표현형의 파괴를 피할 수 있다.

유전자 표적화 작제물

숙주 게놈 내로 통합될 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 산업적으로 유용한 DNA 서열, 예컨대 세포 발현 시스템을 제조하기 위한 인식 서열일 수 있다. 숙주 게놈 내로 통합될 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 치료적 또는 산업적으로 유용한 단백질 또는 본원에 기술된 바와 같은 단백질을 암호화할 수 있다. 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위해 표적 유전자좌 내에서 표적 서열을 동정하는 것은 다수의 요인에 의존한다. 사용되는 상동 재조합 방법에 따라, 서열번호 1 또는 서열번호 4와 상동인 서열을 선택하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 부위-특이적인 뉴클레아제 벡터는, 사용되는 경우, DNA 절단을 위해 의도된 특이적 부위를 인식하는 추가적인 구성성분(서열 조성물)을 필요로 한다.

이와 같이, 유전자 표적화 작제물은 전형적으로 외인성 핵산 서열을 관심 유전자좌 내로 표적화된 통합을 용이하게 하는 이와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 제1 상동성 팔 및 제2상동성 팔을 포함한다. 다른 구현예에서, 작제물(예컨대, 유전자 카세트)은 서열번호 1 또는 서열번호 4로부터 유래된 상동성 팔을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 팔은 서열번호 1 또는 서열번호 4에 존재하는 뉴클레오티드 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 작제물은 서열번호 2(서열번호 1의 1001 내지 2001 뉴클레오티드에 해당)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5' 상동성 팔, 및 서열번호 3(서열번호 1의 2022 내지 2001 뉴클레오티드에 해당)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 3' 상동성 팔을 포함한다. 상동성 팔, 예컨대 제1상동성 팔(5' 상동성 팔이라고도 일컬어짐) 및 제2상동성 팔(3' 상동성 팔이라고도 일컬어짐)은 유전자좌 내에서 표적화된 서열과 상동이다. 5'에서 3'까지의 상동성 팔은 1 kb 이상, 또는 약 2 kb 이상, 또는 약 3 kb 이상, 또는 약 4 kb 이상, 또는 5 kb 이상, 또는 약 10 kb 이상을 포함하는 유전자좌 내에 영역 또는 표적화된 서열을 확장시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2상동성 팔로부터 선택된 표적화된 서열의 총 뉴클레오티드 수는 1 kb 이상, 또는 약 2 kb 이상, 또는 약 3 kb 이상, 또는 약 4 kb 이상, 또는5 kb 이상, 또는 약 10 kb이상이다. 일부 예에서, 5' 상동성 팔과 3' 상동성 팔(표적화된 서열과 상동) 사이의 거리는 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp 이상, 또는 1 kb 이상, 또는 약 2 kb 이상, 또는 약 3 kb 이상, 또는 약 4 kb 이상, 또는 5 kb 이상, 또는 약 10 kb이상을 포함한다. 예시에서, 서열번호 2 및 서열번호 3이 5' 및 3' 상동성 팔로 선택되는 경우, 두 상동성 팔 사이의 거리는 20 뉴클레오티드(서열번호 1의 2002 내지 2021 뉴클레오티드에 해당)이고; 이러한 상동성 팔은 서열번호 1을 포함하는 유전자좌내, 예컨대 서열번호 1의 1990 내지 2021 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 2002 내지 2021 뉴클레오티드 내에 외인성 핵산 서열의 통합 및 서열번호 1의 2002 내지 2021 뉴클레오티드의 동시 결실을 매개할 수 있다.

다른 구현예에서, 작제물은 제1상동성 팔 및 제2상동성 팔을 포함하며, 이때, 상기 결합된 제1및 제2상동성 팔은 유전자좌 내에서 내인성 서열을 치환하는 표적화된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1및 제1상동성 팔은 유전자좌 내의 내인성 서열 내에서 통합 또는 삽입되는 표적화된 서열을 포함한다.

변형된 세포주는 서열번호 1 내의 위치에서 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 통합시킴으로써 생성되었다. 이러한 변형된 세포주는 또한 발현된 관심 유전자의 음성 또는 양성 선택을 위한 추가의 외인성 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 비히클을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 CHO 세포 게놈의 변형 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 비히클은 통합을 위한 서열을 포함하는 외인성 핵산, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 5' 상동성 팔, 및 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 3' 상동성 팔을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 통합 부위에서 부위-특이적 DNA 절단을 위한 뉴클레아제 및 조성물을 포함하는 하나 이상의 비히클을 추가로 제공한다.

변형된 세포주는 재조합효소-매개 카세트 교환(RMCE)을 위한 편리하고 안정한 발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 예컨대 RMCE 공정을 통해, 서열번호 1 또는 이의 발현-향상 단편을 포함하고, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 갖는 변형된 세포 내로 편리하게 통합될 수 있다.

재조합 발현 벡터는 포유류, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 단백질을 암호화하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 아래에서 상세히 기술된 바와 같이, 전사 프로모터, 인핸서, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 포유류 발현 벡터는 복제 기원, 다른 5' 또는 3' 측부에 위치하는 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 스플라이스 공여자 및 수여자 부위 같은 비-전사 요소를 포함할 수도 있다. 형질감염체의 인식을 용이하게 하기 위한 선택성 마커 유전자가 포함될 수도 있다.

형광 마커는 경우에 따라 성공적으로 삽입 및/또는 치환이 이루어지거나 이루어지지 않는 유전자 카세트의 인식을 위한 적절한 선택성 마커 유전자이다. 형광 마커의 예가, 비제한적으로 디스코소마 산호(DsRed), 녹색 형광 단백질(GFP), 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP), 시안 형광 단백질(CFP), 향상된 시안 형광 단백질(eCFP), 황색 형광 단백질(YFP), 향상된 황색 형광 단백질(eYFP) 및 원-적색 형광 단백질(예컨대, mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry 또는 E2- crimson)을 비롯하여 당업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대, Nagai, T., 등 2002 Nature Biotechnology 20:87-90; Heim, R. 등 23 February 1995 Nature 373:663-664; 및 Strack, R.L. 등 2009 Biochemistry 48:8279-81을 참조.

척추동물 세포를 형질감염시키는 데 유용한 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 출처에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV40) 및 인간 세포거대바이러스(CMV)와 같은 바이러스로부터 유래한다. 이러한 제어 서열이 선택된 숙주 세포와 양립할 수 있다면, 바이러스 게놈 프로모터, 제어 및/또는 신호 서열이 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 재조합 단백질이 발현되어야 하는 세포 유형에 따라, 비-바이러스 세포 프로모터(예컨대, b글로빈 및 EF-1a 프로모터)가 사용될 수도 있다.

SV40 바이러스 게놈, 예를 들어 SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열을 사용해서 이종 DNA 서열의 발현에 유용한 다른 유전 요소를 제공할 수 있다. 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 포함하는 단편으로서 SV40 바이러스에서 쉽게 얻어지기 때문에 특히 유용하다(Fiers 등, Nature 273:113, 1978). 더 작거나 더 큰 SV40 단편 또한 사용될 수 있다. 통상적으로, Hind III 부위로부터 SV40 복제 기점에 위치하는 BglI 부위 쪽으로 연장되는 약 250bp 서열이 포함된다.

다중 전사체의 발현에 사용되는 바이시스트론(Bicistronic) 발현 벡터는 이전에 기술되어 있으며(Kim S. K. 및 Wold B. J., Cell 42:129, 1985), 본 발명의 발현 향상 서열, 예컨대 서열번호 1 또는 이의 단편과 조합하여 사용될 수 있다. 다른 유형의 발현 벡터도 또한 유용할 것이며, 예를 들어 미국 특허 제4,634,665호(Axel 등 및 미국 특허 제4,656,134호(Ringold 등)에 기재된 것이다.

관심 단백질

진핵 세포에서 발현에 적절한 임의의 관심 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 관심 단백질은 비제한적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메릭 항체 또는 이의 항원-결합 단편, ScFv 또는 이의 단편, Fc-융합된 단백질 또는 이의 단편, 성장 인자 또는 이의 단편, 사이토카인 또는 이의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 관심 단백질은 단일 서브유닛으로 이루어진 단순 폴리펩티드이거나, 2개 이상의 서브유닛을 포함하는 복합 다중유닛 단백질일 수 있다.

숙주 세포 및 형질감염

본 발명의 방법에서 사용된 숙주 세포는 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 마우스 세포를 포함하는 포유류 숙주 세포이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 CHO 세포에서 발현-향상 서열을 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열 단편을 제공한다. 통합 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 1의 임의의 단편 내에서 발견될 수 있다. 예컨대, 통합 부위는 서열번호 1 또는 서열번호 1의 임의의 단편 내에 배치된 재조합효소 인식 부위일 수 있다. 적절한 통합 부위의 한 예는 Lox p 부위이다. 적절한 통합 부위의 또 다른 예는 2개의 재조합효소 인식 부위, 예컨대 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위 및 Lox5171 부위로 이루어진 군으로부터 선택된 부위이다. 다른 구현예에서, 통합 부위는 서열번호 1의 10~4,000; 100~3,900; 200~3,800; 300~3,700; 400~3,600; 500~3,500; 600~3,400; 700~3,300; 800~3,200; 900~3,100; 1,000~3,000; 1,100~2,900; 1,200~2,800; 1,300~2,700; 1,200~2,600; 1,300~2,500; 1,400~2,400; 1,500~2,300; 1,600~2,200; 1,700~2100; 1,800~2050; 1850~2050, 1,900~2040; 1950~2,025, 1990~2021, 2002~2021 및 2,010~2,015번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 내에 위치하거나 이에 인접해 있다. 특정 구현예에서, 서열번호 1 내의 위치에 있거나 서열번호 1 내의 위치에 인접한 통합 부위는 서열번호 1의 1990~1991, 1991~1992, 1992~1993, 1993~1994, 1995~1996, 1996~1997, 1997~1998, 1999~2000, 2001~2002, 2002~2003, 2003~2004, 2004~2005, 2005~2006, 2006~2007, 2007~2008, 2008~2009, 2009~2010, 2010~2011, 2011~2012, 2012~2013, 2013~2014, 2014~2015, 2015~2016, 2016~2017, 2017~2018, 2018~2019, 2019~2020, 및 2020~2021번 뉴클레오티드 스패닝 위치로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 본 발명의 발현 벡터 또는 mRNA로 형질감염시킨 포유류 숙주 세포를 포함한다. 임의의 포유류 세포가 사용될 수 있지만, 하나의 특정 구현예에서 숙주 세포는 CHO 세포이다.

형질감염된 숙주 세포는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 mRNA 분자로 형질감염된 세포를 포함한다. 발현된 단백질은 선택된 핵산 서열에 따라 배양 배지로 분비될 수 있을 것이나, 상기 세포 내에 유지 또는 세포막 내에 침전될 수 있다. 다양한 포유류 세포 배양 시스템은 재조합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 서열번호 1과 80% 이상 상동성을 갖는 표적 유전자좌가 동정되는 경우, 특정 선별 또는 증폭 계획을 위해 개발된 다른 세포주가 또한 본원에서 제공된 방법 및 조성물과 함께 유용할 것이다. 하나의 구현예에서, 세포주는 K1로 지정된 CHO 세포주이다. 재조합 단백질의 고부피 생산이라는 목표를 달성하기 위해, 상기 숙주 세포주는 적합한 경우에 생물 반응기 배지에 사전 적응된다.

여러 형질감염 프로토콜이 당해 기술 분야에 알려져 있고, Kaufman(1988) Meth. Enzymology 185:537에서 검토된다. 선택된 형질감염 프로토콜은 숙주 세포 종류 및 상기 GOI의 성질에 의존하며 통상적인 실험을 기반으로 선택될 수 있다. 이러한 프로토콜의 기본 요건은 상기 관심 단백질을 암호화하는 DNA를 적합한 숙주 세포로 도입한 다음, 상대적으로 안정하고, 발현가능한 방식으로 상기 이종 DNA를 혼입하는 숙주 세포를 동정 및 단리시키는 것이다. 숙주 세포 게놈 내에 통합시키는 데 유용한 단백질을 암호화하는 mRNA 분자 또는 다른 기능은 일시적일 수 있으므로 시간 제한적일 수 있다.

형질감염 프로토콜 및 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 프로토콜은 다양할 수 있다. 비제한적인 형질감염 방법은 화학-기반 형질감염 방법을 포함하고, 이는 리포좀; 나노입자; 칼슘 포스페이트(Graham 등 (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti 등 (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 및, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 양이온 중합체, 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 비화학적인 방법은 전기천공법; 초음파천공법; 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자-기반 형질감염은 유전자 총의 자석 보조 형질감염을 포함한다(Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 바이러스 방법이 또한 형질감염에 사용될 수 있다. mRNA 전달은 트랜스메신저(TransMessenger™) 및 트랜스아이티(TransIT®)를 사용하는 방법을 포함한다(Bire 등 BMC Biotechnology 2013, 13:75).

이종 DNA를 세포 내로 도입하는데 통상적으로 사용되는 방법 중 하나는, 예컨대 Wigler 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980)에 의해 기술된 바와 같은 칼슘 포스페이트 침전이다. 이러한 방법에 의해 숙주 세포로 도입되는 DNA는 종종 재배열을 겪으므로, 이러한 과정은 독립적인 유전자의 동시 형질감염에 유용하다.

박테리아 원형질체와 포유류 세포의 폴리에틸렌-유도된 융합(Schaffner 등, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163)은 이종 DNA를 도입하는 또 다른 유용한 방법이다. 원형질 융합 프로토콜은 종종 포유류 숙주 세포 게놈에 통합된 플라스미드 DNA의 다수의 복사본을 만들며, 이러한 기법은 선별 및 증폭 마커가 GOI와 동일한 플라스미드상에 있을 것을 필요로 한다.

전기천공법이 또한 DNA를 숙주 세포의 세포질 내로 직접 도입하기 위해 사용될 수 있으며, 예컨대 Potter 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161, 1988) 또는 Shigekawa 등(BioTechniques 6:742, 1988)에 기술되어 있다. 원형질 융합과는 달리, 전기천공법은 선별 마커 및 GOI가 동일한 플라스미드상에 있어야 할 것을 필요로하지 않는다.

이종 DNA를 포유류 세포로 도입하는데 유용한 어떤 시약은 리포펙틴(Lipofectin™) 시약 및 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)을 포함한다. 이들 시약은 모두 지질-핵산 복합체(또는 리포좀)를 형성하는데 사용되는 상업적으로 이용가능한 시약으로, 배양된 세포에 적용시, 핵산을 상기 세포 내로 쉽게 흡수시킨다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것은 전기천공법, 세포질 내 주입, 바이러스 감염, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 형질감염, 지질-매개 형질감염에 의해 매개되거나, 뉴클레오펙션(Nucleofection™)을 통해 매개된다.

GOI를 증폭시키는 방법은 또한 재조합 단백질의 발현에 바람직하고, 전형적으로 선별 마커의 사용을 수반한다(전술된 Kaufman 검토). 세포독성 약물에 대한 내성은 선별 마커로서 가장 빈번하게 사용되는 특성이며, 우성 형질(예컨대, 숙주 세포 유형과 독립적으로 사용될 수 있음) 또는 열성 형질(예컨대, 어떤 활성이 선택되든간에 결핍된 특정 숙주 세포 유형에서 유용함)의 결과일 수 있다. 몇몇 증폭가능한 마커가 본 발명의 발현 벡터에서 사용하기 위해 적절하다(예컨대, Sambrook, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; pgs 16.9-16.14에 기술되어 있음).

약물-내성 포류유 세포에서 유전자 증폭을 위해 유용한 선택성 마커가 전술된 Kaufman, R. J의 표1에 나타나 있으며, DHFR-MTX 내성, P-당단백질 및 다중 약물 내성(MDR)-다양한 친유성 세포독성 제제(예컨대, 아드리아마이신 콜히친, 빈크리스틴), 및 아데노신 탈아미노효소(ADA)-Xyl-A 또는 아데노신 및 2'-디옥시코포르마이신을 포함한다.

다른 우성 선별 마커는 미생물에 의해 유도된 항생제 내성 유전자, 예컨대 네오마이신, 카나마이신 또는 하이그로마이신 내성을 포함한다. 그러나, 이러한 선별 마커는 증폭되는 것으로 나타나지 않는다(전술된 Kaufman, R. J.). 포유류 숙주에 대해 몇몇 적절한 선별 시스템이 존재한다(전술된 Sambrook, pgs 16.9-16.15). 2개의 우성 선별 마커를 사용하는 동시-형질감염 프로토콜이 또한 기술되어 있다(Okayama 및 Berg, Mol. Cell Biol 5:1136, 1985).

이전에 기술되었거나 당업계에 공지된 유용한 조절 요소는 또한 포유류 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 선택된 형질감염 프로토콜 및 본 발명에서 사용되도록 선택된 구성요소는 사용된 숙주 세포의 종류에 의존할 것이다. 당업자는 수많은 다른 프로토콜 및 숙주 세포를 알고 있으며, 사용된 세포 배양 시스템의 요건을 기준으로 목적하는 단백질의 발현을 위한 적합한 시스템을 선택할 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 설명을 위해 제공된 바람직한 실시예에 대한 이하의 설명 과정에서 명백해질 것이나 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예

하기 실시예는 당해 기술 분야의 당업자에게 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공하기 위해 제시되나 발명자가 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 언급이 없는 한, 부(parts)는 중량부, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도, 압력은 대기압 또는 그 주변을 의미한다.

실시예 1. 관심 유전자좌의 동정 및 통합 부위 특성 분석

CHO K1 세포를 항체 서열 및 선별 마커로서 선택성 항생제 내성 유전자를 함유하는 2개의 플라스미드로 형질감염 시켰다. 항생제의 존재하에 세포를 팽창시켜 안정한 형질감염체 선별을 수행하였다. 높은 수준의 항체를 발현하는 개별적인 세포 클론을 FASTR® 분류 기법으로 단리하였다(예컨대, 미국특허 제8673589B2호 참조). 가장 높은 항체 발현 수준을 나타내는 몇몇 클론을 동정하였다.

이러한 클론의 게놈 DNA를 Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA)™ 기법으로 단편화시켰다(Fisher, S. 등 2011, Genome Biology 12:R1). DNA 라이브러리를 생성하고 (Agilent SureSelectXT #G9612A), CHO 세포 내로 도입된 전체 플라스미드 서열에 대해 고안된 맞춤-제작된 비오티닐화된 RNA 베이트(Agilent SureSelectXT #5190-4811)와 함께 배양하였다. 플라스미드 서열을 함유하는 게놈 DNA 단편을 자성 스트렙타비딘(Streptavidin) 비드로 농축하고 일루미나 마이시크(Illumina MiSeq) 서열분석을 수행하여 플라스미드 통합 부위를 확인하였다. 플라스미드 서열 및 CHO 게놈 서열 둘 다를 함유하는 융합 서열을 분석하고 CHO 세포에 대해 정렬하였다. 단일 통합 부위를 서던 블랏 분석 및 PCR에 이어 서열분석을 통해 확인하였다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 통합 부위는 발현 핫스팟으로 확인되었다(예컨대, 유전자은행 유전자좌 번호 AFTD01150902.1, nt35529:39558 또한 참조). 통합 부위를 분석하여 세포주의 추가 생성에 대한 이들의 적절성을 결정하였다. 통합 부위는 세포의 정상적인 게놈 기구, 예컨대 단백질 번역 또는 세포의 표현형 변경을 파괴하지 않는 비-암호화 영역 내에 위치하는 것이 바람직했다

블라스트(Blast) 검색(Kent WJ., BLAT - BLAST-유사 정렬 도구. Genome Res. 2002 Apr;12(4):656-64) 정렬에서, 서열번호 1은 마우스 및 인간 게놈 서열과 매우 낮은 상동성을 공유하였다. CHO-1[ATCC]_refseq_transcript (www.chogenome.org)에 대한 서열번호 1의 서열 블라스트는 확인된 유전자좌 서열이 임의의 공지된 유전자에 대한 임의의 암호화 영역을 함유하지 않는다는 것을 보여주었다. 서열번호 1을 포함하는 서열번호 4의 보다 넓은 서열이 또한 표적화된 통합에 적절한 유전자좌로 확인되었다.

통합 부위 서열은 CHO 및 마우스 게놈의 비-암호화된 영역에 위치하는 것으로 결정되었고, 하기 기술된 실험에서 추가로 이용하였다.

실시예 2. 숙주 세포 통합 부위에 혼입된 외인성 DNA 효율

TALE 뉴클레아제(TALEN)를 사용하여 서열번호 1로 식별된 CHO 게놈의 특정 유전자좌에 외인성 유전자를 표적화하여 삽입하였다. 실시예 1에서와 같이, 세포 게놈 내에 무작위로 통합된 항체 중쇄 및 경쇄 서열을 함유하는 작제물을 TALEN에 의해 표적화시켰다. TALEN을 항체 발현 작제물의 3개의 동일한 Hyg 유전자 내의 위치에 표적화 시켰다(도 1a 참조). Hyg 서열의 TALEN 표적 절단 부위는 ZiFit.partners.org(ZiFit Targeter Version 4.2)에 기초하였다. TALEN을 공지된 방법에 기초하여 고안하였다(Boch J 등, 2009 Science 326:1509-1512).

공여자 mKate 벡터(도 1b 참조) 및 TALEN-암호화 벡터를 표준 리포펙틴(Lipofectin) 프로토콜(리포펙타민(LIPOFECTAMINE), Life Technologies, 메릴랜드 게이더스버그 소재)을 사용하여 CHO 숙주 세포 내로 형질감염 시켰다. 세포를 배양하고 목적하는 특징을 갖는 안정한 클론을 동정하고 FACS로 분류하였다. 서던 블랏과 PCR에 의해 목적하는 유전자좌내에서의 단일 통합을 확인하였다.

실시예 3. RMCE에 의한 관심 유전자좌에서 조작된 세포의 표적화된 재조합

높은 수준의 형광 유전자, 예컨대mKate(이때, 상기 유전자는 관심 유전자좌 내의 lox 부위에 의해 측부에 위치함)를 발현하는 CHO 세포주를 단리하기 위해 선별하였다. 제2형광 유전자 dsRed(이때, 상기 유전자는 lox 부위에 의해 측부에 위치함)를 발현하는 제2CHO 세포주를 대조군 유전자좌, 즉 EESYR(2013년 3월 5일에 발행된 미국특허 제8389239B2호) 내에 위치시켰다.

형질감염된 CHO 세포를 무혈청 생산 배지에서 현탁으로 성장하도록 적응시켰다. 이어서, 세포를 공여자 발현 벡터 및 Cre 재조합효소를 암호화하는 플라스미드로 10 cm 플레이트에서 형질감염시켰다. 공여자 발현 벡터는 Lox 부위에 의해 측부에 위치하는 Fc 융합 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유한다(도 3a 또는 도 3b 참조). 감염 후 2주 동안 세포를 400 μg/ml의 하이그로마이신이 포함된 배양 배지에서 배양하고, eYFP를 발현하지만 mKate(또는 EESYR 유전자좌 통합일 경우 dsRed)는 발현하지 않는 세포를 유세포 분석기를 사용하여 단리하였다. eYFP를 발현하는 세포를 무혈청 생산 배지에서 현탁 배양으로 팽창시키고, Fc 융합 단백질을 암호화하는 각 세포 풀에 대한 표준 방법을 사용하여 qRT-PCR에 의해 mRNA의 수준을 결정하였다(도 4 참조).

재조합 교환 효율(적색 마커, 즉 mKate 또는 dsRed와 교환된 공여자 카세트 마커, 즉 eYFP로부터 발현되는 생존 세포 집단 %)을 세포 풀사이에서 비교하였다(표 1). 각 유전자좌에서 높은 재조합 교환 효율이 관찰되었다.

재조합 효율

	적색 마커	교환 효율(%) (적색 마커 +/eYFP-)	무작위 통합(%) (적색 마커+/eYFP+)
1번 유전자좌 (서열 번호 1)	mKate	72	27
대조군 유전자좌(EESYR)	dsRed	92	7

대조군 유전자좌(도 4)와 비교하여 조작된 1번 유전자좌를 갖는 세포 풀에서 보다 높은 비율로(1.5배 더 높음) 전사가 관찰되었다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NOVEL CHO INTEGRATION SITES AND USES THEREOF <130> 32353 (T0045US01) <150> 62/067,774 <151> 2014-10-23 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 ccaagatgcc catcaactga ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat 60 tattcagttt ttaagaaaaa tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa 120 acaaccattc cccattatat tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta 180 gtggatctac taatcttttg ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa 240 ttggtaacaa cagcacatgg gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca 300 ttttttagga gataatggag gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg 360 atggttagag aaggcaatat gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac 420 atagagaaaa tactattgta gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag 480 agctcagatg gagttaccct ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa 540 catcctgaac agagcaacat agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg 600 ataaaaattc atgatgaaag aatgaatatg 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ggaaattcaa attaaaacta tttacatatt acccctgaaa 7020 taataactaa tacccaataa aaataatata aacaaaaaat ggcaatgcat gccatcatgg 7080 atttgggaga gagaatgttc attgcagttc tgaatggata ctggtgccac cacggtgaaa 7140 atctctgtat aggtccttcc aaaagctgaa aatagacata tcacaagacc tgccacacat 7200 ttttcaagca aatacccaaa ggactctacc tgactgcaga gacactttct cataaaatat 7260 tattgttgat ctattcataa tatctggaaa atagaaacag ccaagatgcc catcaactga 7320 ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat tattcagttt ttaagaaaaa 7380 tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa acaaccattc cccattatat 7440 tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta gtggatctac taatcttttg 7500 ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa ttggtaacaa cagcacatgg 7560 gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca ttttttagga gataatggag 7620 gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg atggttagag aaggcaatat 7680 gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac atagagaaaa tactattgta 7740 gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag agctcagatg gagttaccct 7800 ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa catcctgaac agagcaacat 7860 agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg ataaaaattc atgatgaaag 7920 aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga agcaggtgag agctcacatc 7980 ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat gaccagaaaa tgcttttgga 8040 tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc tgaacaaata aaactcccca 8100 aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta ggggtatttc ttattcaaac 8160 cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca ctacacacag acaaataaaa 8220 actctagtaa ctggaatgga ttgacttatt tgaattactt gccagtggag ctacatagag 8280 cacaattatt gtatttaaat taccctttat gatcttacaa aacttgacag taagatcata 8340 ttgctaaaga aaccacatat ttgaatcagg gaacatggtg atatctagtt gttcttcaac 8400 tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg aaagagcaat gtacactacc 8460 agtgtagaaa ttaaatcatc aatcttatca agatgtggat cctataagtt acaataaaaa 8520 ttagcctgat aagatatccc caccagaaga atattcacat aaatgctatg ggagcaacaa 8580 gctattttct aaattagctt taatcctatt ctacaagaga gaatccatat ctagaatagt 8640 tatagggatc aagaacccat ggcttgattg gtcataggcc caatgggaga tcctaatatt 8700 attgttctac aaaatgaaaa taactcctaa tgacttgttg ctgcagtaat aagttagtat 8760 gttgctcaac tctcacaaga gaagttttgt cttacaataa atggcaatta aagcagcccc 8820 acaagattta tatcataccg atctcctcat ggcctatgca tctagaagct aggaaacaaa 8880 gaggacccta agagagacat acatggtccc cctggagaag gggaaggggg caagacctcc 8940 aaagctaatt gggagcatgg gggaggggag agggagttag aagaaagaga aggggataaa 9000 aggagggaga ggaggacaag agagagaagg aagatctagt caagagaaga tagaggagag 9060 caagaaaaga gataccatag tagagggagc cttgtatgtt taaatagaaa actggcacta 9120 gggaattgtc caaagatcca caaggtccaa ctaataatct aagcaatagt cgagaggcta 9180 ccttaaaagc ctttctctga taatgagatt gatgactacc ttatatacca tcctagagcc 9240 ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca gctaaacact gagctagttg 9300 cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg gagaaacaca cagaaacagc 9360 agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata gctgggagtc cagcatagga 9420 cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt ctggttaatc tatggggaca 9480 ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga atttgggtac ccattccaca 9540 tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt ctaggtcctg ctccaaataa 9600 tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc tccctgggga gcagaaaggg 9660 gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag ggtgagggaa ctgggattga 9720 caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg aaaagtaaaa gaagaaaaga 9780 aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg actataaaga aacactatta 9840 tctaaataaa aatatgtcag aagcacacat gaacttatag tgtttatgaa agtatgtata 9900 ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt tcagtgatga aggtgatttt 9960 atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa ttatcttcaa aaggttgaaa 10020 atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca tgttcacaat acacatgatg 10080 ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca gtttgtagat aaactcacaa 10140 tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca tctgttattc agaataattc 10200 ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag aatttgaaga aaacctagac 10260 cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga tgttgttcac atcttctcta 10320 ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc ctcattttac agagagagga 10380 aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc aaaatttgca tcattgctca 10440 gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc caaagtccct ctgtcatgtt 10500 tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata tctaatgtct tatatagatt 10560 aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt aatttaaaaa tccattaatt 10620 gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata agcctgatga tctgaatttg 10680 aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat tttcctatta cttccacact 10740 tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa atgaaataaa aaattaagtc 10800 tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag taaaaatggc agcttaagct tgctttatgg 10860 ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat catggcagaa ctatgctgtt 10920 attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct taatgtggac acctaaacta 10980 tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa acctcaggac agagggaatc 11040 ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca aatatacatg aaacaagtga 11100 tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt aggttcaata ttaagcttca 11160 atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg caataaggga tttttagaag 11220 aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc aaataaatct aagcaatcca 11280 ctctagaatt aaatagtttc ctaagggcac agctatgaat agagctcaat ttacatataa 11340 aattttgttc accatttatg tcattccagt tttcattagt acaaggaaaa tacaaaatat 11400 ttagatgtca atatcaagtg aatagttcat ctcctttttt aatatatatc acctaaatca 11460 ccattttctc agaaaaatct ggcctgaagt tctgtctgga acttcaacat gaaaaatatg 11520 cacagcttgc tattataaat cctagttgat ttttaagatt catgtctggt gtctgactca 11580 gaggggccag aggctagaca aatatttttt gaatcttcat tgtgaagatt tttaatgatt 11640 attttaatat aaataacaaa gatgatggat aatgtaactt tgtacagttc atagacgctg 11700 aactactttg tgcttaaaat gttagttccc tatcataaat gataggtgat aagtgtatgt 11760 ttaatacttt ccctctgagc tatattcatg tactagagaa ttattttaaa catgaaaaga 11820 ctgtgtttat agtctcagct cctgagaact ggtccaacct taggcaggtg aatgccagga 11880 gcaacgtttt tcttctacag aggatgcttt gctgccaagc aacctggttg tgtggaaatg 11940 ttcctttttt aatcaagttt aaagggtctt catcatgctg ttgctccaca tattttcagg 12000 ttagagcttg gtccttggag tattatcttt taccagaaaa ttcatagtat tctttcaata 12060 actaacaact aaacttttcg ataaaaaaga attggaattt caattttaaa gcctgagtaa 12120 aattcttgtg aatcaggata ttttatttta agtcttatct tttaaaaagt tattttattt 12180 tttaaaaaat tataatatac tttcataatt tccctccttc acttttcttt acaaacactt 12240 ctatagatca ccatgtgttt ttttttttac atttatggcc tctttctgtt cattgttatt 12300 acatacaaat agtcttgcct atagaagaac accacaattt gttacctgat aacaaattat 12360 caacccttaa aacctacaaa ctattgatat tactgaaaag actatactta tagatgtaaa 12420 gatatatgtg tgtgcacata tatagataca catatatgta ggatttttaa ttttagattt 12480 tagacatcaa aattatttat atgactgaga aactagacac tataaatgag cattcagtat 12540 tcaacaccgt gattttagat attgtcacaa tgacagaaaa ttttcttata gaaaatttta 12600 agttttgtga ttgctctgtg cacttagtga agtctcacag aaaaagaatc atagtatttt 12660 tagtttataa taaaaagtac atataattaa aatggttggc acaaaacaac atttgagcat 12720 ttttcctatt tactatcaag tagtatcatt ttgaaataat aatttgacta gtttcaaaaa 12780 tgaaaacaaa atttaaacta aatgcctaat ctagcctgat aacattttta tgaatgaaat 12840 tattcaatag tgttatcaat taggggccca aaacttttcc taaaataaaa cttttaattt 12900 ttttccattt ttatttaaat tagaaacaaa attgttttac atgtaaatca gagtttcctc 12960 accctcccct tctccctgtc cctcactaac accctacttg tcccatacca tttctgctcc 13020 ccagggaggg tgaggccttc catggggaaa cttcagagtc tgtctatcct ttcggatagg 13080 gcctaggccc tcacccattt gtctaggcta aggctcacaa agtttactcc tatgctagtg 13140 ataagtactg atctactaca agagacacca tagatttcct aggcttcctc actgacaccc 13200 atgttcatgg ggtctggaac aatcatatgc tagtttccta ggtatcagtc tggggaccat 13260 gagctccccc ttgttcaggt caactgtttc tgtgggtttc accaccctgg tcttgactgc 13320 tttgctcatc actcctccct ttctgtaact gggttccagt acaattccgt gtttagctgt 13380 gggtgtctac ttctactttc atcagcttct gggatggagc ctctaggata gcatacaatt 13440 agtcatcatc tcattatcag ggaagggcat ttaaagtagc ctctccattg ttgcttggat 13500 tgttagttgg tgtcatcttt gtagatctct ggacatttcc ctagtgccag atatctcttt 13560 aaacctacaa gactacctct attatggtat ctcttttctt gctctcgtct attcttccag 13620 acaaaatctt cctgctccct tatattttcc tctcccctcc tcttctcccc ttctcattct 13680 cctagatcca tcttcccttc ccccatgctc ccaagagaga tgttgctcag gagatcttgt 13740 tccttaaccc ttttcttggg gatctgtctc tcttagggtt gtccttgttt cctagcttct 13800 ctggaagtgt ggattgtaag ctggtaatca tttgctccat gtctaaaatc catatatgag 13860 tgatgtttgt ctttttgtga ctgggttacc tcactcaaaa tggtttcttc catatgtctg 13920 tggatttcaa tagcacaaac aacatacagt atcttggggc aacactaacc aaacaagtga 13980 aagaccagta tagcaagaac tttgagttta aagaaagaaa ttaaagaaga taccagaaaa 14040 tggaaagatc tcccatgctc tttgataggc agaatcaaca tagtaaaaat ggcaatcttg 14100 ccaaaatcca tctacagact caatgcaatc cccattaaat accagcacac ttcttcacag 14160 acctgaaaga ataatactta actttatatg gagaaacaaa agacccagga taggccaaac 14220 aaccctgtac aatgaaggca cttccagagg catccccatc cctgacttca agctctatta 14280 tagagtaata atcctgaaaa cagcttggta atggcacaaa aatagacagg tagaccaatg 14340 gaattgagtt gaaaaccctg atattaaccc acatatctat gaacacctga ctttgacaaa 14400 gaagctaagg ttatacaatg taagaaagaa agcatcttca acaaatcgtg ctggcataac 14460 tggatgctgg catgtagaag actgcagata gatccatgtc taatgccatg cacaaaactt 14520 aagtccaaat ggatcaaaaa cctcaacata aatccagcca cactgaacct catagaagag 14580 aaagtgggaa gtatccttga ataaattggt acaggagacc acatcttgaa cttaacacca 14640 gtagcacaga caatcagatc aataatcaat aaatgggacc tcctgaaact gagaagcttc 14700 tgtaaggcaa tggataagtc aacaggacaa aatggcagcc cacggaatgg gaaaagatat 14760 tcaccaatcc tatatctgac agagggctgc tctctatttg caaagaacac aataagctag 14820 tttttaaaac accaattaat ccgattataa agttgggtag agaactaaat aaagaattgt 14880 taacagagca atctaacttg gcagaaagac acataagaaa gtgctcacca t 14931 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 tgagctagtt gcagacaggg 20 <210> 6 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 6 guuuuagagc uagaauagca aguuaaaaua aggcuagucc guuaucaacu ugaaaaagug 60 gcaccgaguc ggugcuuuu 79

Claims (55)

1. 세포의 게놈의 유전자좌 내에 통합된 외인성 핵산 서열을 포함하는 단리된 세포로서, 유전자좌는
   (a) 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일하고,
   (b) 전형적으로 게놈으로의 무작위 통합에 의해 관찰되는 발현과 비교하여 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 적어도 1.5배 향상시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포.
2. 제1 항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
3. 제1 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열을 포함하며,
   선택적으로 외인성 핵산 서열은 2개 이상의 재조합 인식 서열 및 2개의 재조합 인식 서열 사이에 위치한 선택성 마커를 포함하고,
   선택적으로 하나 이상의 재조합 인식 서열은 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, LoxFas 부위, 및 frt 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 제1 외인성 관심 유전자 (GOI) 및 제1 외인성 프로모터를 포함하며, 제1 외인성 GOI는 제1 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 세포.
5. 제4 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은
   (a) 제2 외인성 GOI 및 제2 외인성 프로모터 (제2 외인성 GOI는 제1 GOI의 3'에 위치하고 제2 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다); 및
   (b) 제1 외인성 GOI의 5' 제1 재조합 인식 서열, 제1 외인성 GOI의 3' 제2 재조합 인식 서열; 및 제2 외인성 GOI에 대해 3' 제3 재조합효소 인식 서열
   을 더 포함하며,
   선택적으로 제1 및 제2 재조합 인식 서열은 상이하고, LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, LoxFas 부위, 및 frt 부위로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 세포.
6. 제5 항에 있어서, (i) 제1 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하거나, 또는 (ii) 제1 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 세포.
7. 제5 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 제3 외인성 GOI를 더 포함하며,
   선택적으로 제3 외인성 GOI는 제2 외인성 GOI의 3'에 위치하고,
   선택적으로 제1, 제2 및 제3 GOI는 (i) 항체의 제1 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편, 항체의 제2 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 (ii) 항체의 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편, 항체의 제1 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항체의 제2 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 세포.
8. CHO 세포 게놈을 변형시키는 방법으로서, 외인성 핵산을 CHO 세포로 도입시키는 단계를 포함하며, 외인성 핵산은 세포의 게놈의 유전자좌로 통합되고, 유전자좌는
   (a) 서열번호 1 또는 서열번호 4와 90% 이상 동일하고,
   (b) 전형적으로 게놈으로의 무작위 통합에 의해 관찰되는 발현과 비교하여 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 적어도 1.5배 향상시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
9. 제8 항에 있어서, 외인성 핵산은 하나 이상의 재조합 인식 서열을 포함하며,
   선택적으로 외인성 핵산은 2개 이상의 재조합 인식 서열 및 2개의 재조합 인식 서열 사이에 위치한 선택성 마커를 포함하고,
   선택적으로 하나 이상의 재조합 인식 서열은 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, LoxFas 부위, 및 frt 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9 항에 있어서, 외인성 핵산은 제1 외인성 관심 유전자 (GOI)를 포함하며,
    선택적으로 외인성 핵산은 제2 외인성 GOI를 더 포함하고 제1 외인성 GOI의 3'에 위치하고,
    선택적으로 (i) 제1 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하거나, 또는 (ii) 제1 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제8 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산은 벡터를 포함하는 비히클을 사용하여 도입되며, 벡터는
    a) 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 5' 상동성 팔
    b) 외인성 핵산, 및
    c) 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 3' 상동성 팔
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11 항에 있어서, 외인성 핵산은 적어도 추가 벡터 또는 mRNA 분자를 포함하는 비히클을 사용하여 도입되며,
    선택적으로 추가 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 통합 파지 벡터, 비-바이러스 벡터, 전이인자 및/또는 전이효소, 통합효소 기질, 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및/또는 추가 벡터는 부위-특이적 뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함하고, 부위-특이적 뉴클레아제는 선택적으로 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 촉진제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, 및 RNA-유도된 DNA 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제8 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산을 도입하기 전에, CHO 세포는 상기 유전자좌에서 통합된 하나 이상의 재조합 인식 서열을 포함하고, 외인성 핵산은 상기 유전자좌에서 하나 이상의 재조합 인식 서열로 통합되고,
    선택적으로 외인성 핵산을 도입하기 전에, CHO 세포는 상기 유전자좌에서 통합된 2개 이상의 재조합 인식 서열, 및 2개의 재조합 인식 서열 사이에 위치한 선택성 마커를 포함하고, 선택적으로 2개 이상의 재조합 인식 서열은 상이하고, LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, LoxFas 부위, 및 frt 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제8 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산은 제1 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 외인성 관심 유전자 (GOI), 제1 외인성 프로모터의 5'에 위치한 제1 재조합 인식 서열, 및 제1 외인성 GOI의 3'에 위치한 제2 재조합 인식 서열을 포함하고, 제1 및 제2 재조합 인식 서열은 각각 외인성 핵산을 도입하기 전에 게놈의 유전자좌에 존재하는 2개 이상의 재조합 인식 서열과 동일하고,
    선택적으로 제1 및 제2 재조합 인식 서열은 상이하고, LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, LoxFas 부위, 및 frt 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14 항에 있어서, 외인성 핵산은 제2 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 외인성 GOI를 더 포함하며, 제2 외인성 GOI는 제1 외인성 GOI의 3' 및 제2 재조합 인식 서열의 5'에 위치하고,
    선택적으로 (i) 제1 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하거나, 또는 (ii) 제1 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 세포에서 관심 유전자 (GOI)를 발현하는 방법으로서,
    a) 세포의 게놈의 유전자좌 내에서 통합된 외인성 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계로서, 외인성 핵산 서열은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 외인성 (GOI)를 포함하고, 유전자좌는 (i) 서열번호 1 또는 서열 번호 4와 90% 이상 동일하고, (ii) 전형적으로 게놈으로의 무작위 통합에 의해 관찰되는 발현과 비교하여 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 적어도 1.5배 향상시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 제1 외인성 GOI는 제1 관심 단백질 (POI)을 암호화하는, 단계;
    b) 제1 외인성 GOI가 발현될 수 있는 조건하에 단계 a)의 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 제1 POI를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
17. 제16 항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16 항 또는 제17 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 외인성 GOI를 더 포함하고, 조건은 제1 외인성 GOI 및 제2 외인성 GOI의 발현을 허용하며,
    선택적으로 (i) 제1 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하거나, 또는 (ii) 제1 외인성 GOI는 항체 중쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고, 제2 외인성 GOI는 항체 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. CHO 세포 게놈을 변형시켜 (i) 관심 단백질을 발현하거나 (ii) 인식 서열을 통합시키기 위한 비히클로서,
    a. 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 5' 상동성 팔
    b. 각각 (i) 관심 단백질을 암호화하거나 (ii) 인식 서열을 포함하는 외인성 핵산 서열, 및
    c. 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열과 상동인 3' 상동성 팔
    을 포함하는 벡터를 포함하는, 비히클.
20. 제19 항에 있어서, 외인성 핵산 서열은 선택성 마커의 측부에 위치하는 하나 이상의 재조합 인식 서열을 포함하며, 및/또는 제1 외인성 관심 유전자 (GOI)를 포함하고,
    선택적으로 비히클은 적어도 추가 벡터 또는 mRNA 분자를 포함하고, 추가 벡터는 선택적으로 인식 서열의 통합을 위한 부위-특이적 뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함하고, 부위-특이적 뉴클레아제는 선택적으로 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 촉진제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질, 또는 RNA-유도된 DNA 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비히클.
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