JP2021512617A - CorynebacteriumにおいてCRISPRを使用するゲノム編集 - Google Patents
CorynebacteriumにおいてCRISPRを使用するゲノム編集 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021512617A JP2021512617A JP2020542549A JP2020542549A JP2021512617A JP 2021512617 A JP2021512617 A JP 2021512617A JP 2020542549 A JP2020542549 A JP 2020542549A JP 2020542549 A JP2020542549 A JP 2020542549A JP 2021512617 A JP2021512617 A JP 2021512617A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- host
- plasmid
- sequence
- corynebacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
CRISPR系は、Corynebacterium属の種などのグラム陽性細菌のゲノムを改変するために首尾よく使用される。Corynebacterium種を改変するための方法は、遺伝子欠失および/または挿入を生じさせる単一ヌクレオチド変化を含む。2つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードする1つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での複数の編集の導入のための方法もまた例示される。
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は、2018年2月8日出願の米国仮出願第62/628,166号および2018年7月23日出願の米国仮出願第62/701,979号の利益を主張し、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、2018年2月8日出願の米国仮出願第62/628,166号および2018年7月23日出願の米国仮出願第62/701,979号の利益を主張し、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
連邦支援の研究または開発に関する陳述
本開示は、U.S.Government Defense Advanced Research Projects Agency(DARPA)によって授与された、契約書番号HR0011−15−9−0014の下での政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本開示は、U.S.Government Defense Advanced Research Projects Agency(DARPA)によって授与された、契約書番号HR0011−15−9−0014の下での政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
配列表の組込み
コンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む、名称「ZYMR_038_02WO_SeqList_ST25.txt」のファイルは、2019年2月6日に作成された。このファイルは、約12.9KBであり(MS−Windows(登録商標)で測定)、(United States Patent Office EFS−Web提出システムを使用して)電子申請によって同時に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれている。
コンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む、名称「ZYMR_038_02WO_SeqList_ST25.txt」のファイルは、2019年2月6日に作成された。このファイルは、約12.9KBであり(MS−Windows(登録商標)で測定)、(United States Patent Office EFS−Web提出システムを使用して)電子申請によって同時に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれている。
発明の分野
本開示は一般に、グラム陽性細菌Corynebacterium glutamicum(C.glutamicum)のゲノムを改変するためにCRISPR媒介性編集を使用する、in vivoおよびin vitroでのガイド型遺伝子配列編集のために使用される系、方法および組成物に関する。本開示は、とりわけ、改善されたDNAクローニング、オリゴヌクレオチドのアセンブリーおよび微生物の改善のために、ガイド型配列編集複合体を使用する方法を記載する。
本開示は一般に、グラム陽性細菌Corynebacterium glutamicum(C.glutamicum)のゲノムを改変するためにCRISPR媒介性編集を使用する、in vivoおよびin vitroでのガイド型遺伝子配列編集のために使用される系、方法および組成物に関する。本開示は、とりわけ、改善されたDNAクローニング、オリゴヌクレオチドのアセンブリーおよび微生物の改善のために、ガイド型配列編集複合体を使用する方法を記載する。
発明の背景
ゲノムを改変し微生物を改善する能力は、過去数十年にわたって顕著に増加した。初期のアプローチには、機能的ノックアウトおよび小さい変更(例えば、一塩基多型即ちSNP)を典型的には生じる、UVまたは化学的変異誘発およびトランスポゾンが関与していた(Karberg et al., 2001;Perutka et al., 2004;Yao and Lambowitz, 2007)。インテグラーゼおよびリコンビナーゼが関与する部位特異的組込み技法は、遺伝子および経路の挿入を可能にしたが、ゲノム中の特定の既存の配列または「ランディングパッド」に制限された(Kilby et al., 1993;Sternberg et al., 1981;Turan et al., 2011)。
ゲノムを改変し微生物を改善する能力は、過去数十年にわたって顕著に増加した。初期のアプローチには、機能的ノックアウトおよび小さい変更(例えば、一塩基多型即ちSNP)を典型的には生じる、UVまたは化学的変異誘発およびトランスポゾンが関与していた(Karberg et al., 2001;Perutka et al., 2004;Yao and Lambowitz, 2007)。インテグラーゼおよびリコンビナーゼが関与する部位特異的組込み技法は、遺伝子および経路の挿入を可能にしたが、ゲノム中の特定の既存の配列または「ランディングパッド」に制限された(Kilby et al., 1993;Sternberg et al., 1981;Turan et al., 2011)。
SNP、欠失および挿入を生じさせるために目的のゲノム領域を正確に操作するために相同組換え(HR)を利用する能力は、バイオテクノロジーのすべての領域(治療薬、新規化学物質の産生、代謝操作など)における大きな進歩を可能にした。初期のテクノロジーは、内在性宿主相同組換えマシナリーを利用することによって、またはウイルス組換えタンパク質を補充することによって、二本鎖DNAならびに一本鎖オリゴヌクレオチドドナーDNAを宿主ゲノムに導入した(Datsenko and Wanner, 2000;van Pijkeren and Britton, 2012;Yu et al., 2000;Zhang et al., 1998)。しかし、残念ながら、これらの方法は、低頻度の事象に依存し、導入されている変化について選択するための選択マーカーの使用を必要とし、この選択マーカーは次いで、複数の変異を組み込むために、操作の各ラウンドの前に除去される必要がある。
操作されている部位またはその近傍において二本鎖切断(DSB)を生成することは、その部位における組換え事象の頻度を有意に増加させることができることが、続いて発見された。組換え能がある生物、例えば、Saccharomyces cerevisiaeでは、例えば、二本鎖切断は、相同組換えマシナリーを誘導し、これが、続くDNA組込みの効率を増加させる(Symington, 2002)。これは、「ランディングパッド」にメガヌクレアーゼ(例えば、I−SceIおよびI−CeuI)を事前に設置し、適切なホーミングエンドヌクレアーゼを発現させることによってDSBを誘導し、導入されている変化に隣接する相同末端を有する適切なドナー核酸を供給することによって、最初に開拓された(Kuhlman and Cox, 2010)。後に、テクノロジーは、任意の所与のゲノム場所における二本鎖切断の生成を可能にすることによってプログラム可能なマーカーなし編集を可能にする、ヌクレアーゼドメイン(例えば、FokIヌクレアーゼに融合された結合ドメインである、ジンクフィンガーヌクレアーゼ即ちZFNおよび転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ即ちTALEN)に融合された結合ドメインを利用した(Hockemeyer et al., 2011;Li et al., 2011;Miller et al., 2011;Urnov et al., 2005)。
さらに最近、新しいクラスのRNAガイド型エンドヌクレアーゼが、侵入してくるウイルスおよびプラスミドからの保護を提供するように一緒になって機能するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)ゲノム遺伝子座およびCRISPR関連(Cas)タンパク質に依存する一部の細菌および古細菌において同定された。II型CRISPR−Cas系では、Cas9タンパク質は、二本鎖DNA切断(DSB)を一緒になって生成する2つのヌクレアーゼ活性部位が関与する機構による標的の認識および切断のために、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)からなるデュアルガイドRNAを使用する、RNAガイド型エンドヌクレアーゼとして機能する。Jinek et al.は後に、crRNAおよびtracrRNAが、シングルガイドRNA(sgRNA)として組み合わされ転写され得、sgRNA内の短い20ntの「スペーサー」配列が、Cas9タンパク質にそのDNA標的への指向性を付与することを示した(Jinek et al., 2012)。
機能的には、Cas9タンパク質は、ガイドRNAを認識してそれと複合体化し、次いで、得られたリボ核タンパク質複合体は、スペーサー配列に対して相補的な配列(「プロトスペーサー」)とその後ろのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を求めてゲノムを探索する。1つのモデルの下では、標的配列への結合の際に、Cas9は二本鎖切断を生成し、次いで、変化が、非相同末端接合(NHEJ)によって、または供給されたドナー核酸のHRによって、導入され得る。NHEJは、短い挿入または欠失を生じ、これらは、オープンリーディングフレーム(ORF)におけるフレームシフト変異によって機能的ノックアウトを生じさせる際に有用であり得る。対照的に、HRは、適切に設計されたドナー核酸の組込みによって、ゲノム中により正確なシームレスの変化を導入するために利用され得る。
しかしながら、相同組換えのための限定的な内在性マシナリーを有するまたは内在性マシナリーを有さない宿主では、ゲノム中のCas9により標的化される二本鎖切断は、毒性および細胞死をしばしば生じ得る。これらの生物では、一本鎖ニックを誘導するための代替的ストラテジーが開発されたが、それは、これらの切断が致死性ではないからである。例えば、Clostridium cellulolyticumでは、野生型Cas9タンパク質の発現は致死性であり、これは、Xu et al. (2015)による研究において、供給されたドナーDNAとの増加したHRのための部位として次いで機能するゲノム中の一方のDNA鎖中にニックを生じさせるためのCas9D10Aニッカーゼ(nickase)の発現を介して回避された。遺伝子欠失を、この方法論に従って合理的な効率で得ることができたが、より大きい(例えば、>1kbの)挿入物の組込みには大きな制限があった。
C.glutamicumは、HRのための限定的な内在性マシナリーを有し(Resende et al., Gene. 2011;482:1−7;1−7;Nakamura et al., Gene. 2003 Oct 23;317(1−2):149−55)、したがって、CRISPR/Cas9媒介性遺伝子編集に関して不確かな結果を有する、別の原核生物である。C.glutamicumにおけるCRISPR/Cas9の使用を記載するいくつかの刊行物が現在存在している(Jiang et al. Nat Commun. 2017 May 4;8:15179;Cho et al. Metab Eng. 2017 Jul;42:157−167;Peng et al. Microb Cell Fact.; 2017 Nov 14;16(1):201;Liu et al. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205)。これらの刊行物は、いくつかの編集構成およびC.glutamicum株を試験している。しかし興味深いことに、これらの刊行物は、Cas9の毒性、編集の有効性、試験した具体的な株ならびに試験したドナー構成に関して、その結論が大きく異なっている。さらに、特に多重遺伝子編集に関して、C.glutamicum技術は、複数の編集の同時導入に対してもっぱら焦点を当てているが、連続するポリヌクレオチド領域の非常に低い編集効率を達成したに過ぎない。例えば、Liu et al.は、それぞれrfp指向性およびrpsL指向性のガイドRNAを使用した、第1(rfp)および第2(rpsL)の遺伝子座の同時編集を記載している。しかしながら、非常に低い編集効率が達成されたに過ぎず、連続する領域のみが各遺伝子座内で編集された。よって、より高い効率、1つまたは複数の遺伝子座内の非連続的な編集、および他の利点を提供する改善された多重遺伝子編集法を含む、C.glutamicumにおけるゲノム編集のための改善されたRNAガイド型エンドヌクレアーゼツールおよび方法が、依然必要とされている。
C.glutamicumは、HRのための限定的な内在性マシナリーを有し(Resende et al., Gene. 2011;482:1−7;1−7;Nakamura et al., Gene. 2003 Oct 23;317(1−2):149−55)、したがって、CRISPR/Cas9媒介性遺伝子編集に関して不確かな結果を有する、別の原核生物である。C.glutamicumにおけるCRISPR/Cas9の使用を記載するいくつかの刊行物が現在存在している(Jiang et al. Nat Commun. 2017 May 4;8:15179;Cho et al. Metab Eng. 2017 Jul;42:157−167;Peng et al. Microb Cell Fact.; 2017 Nov 14;16(1):201;Liu et al. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205)。これらの刊行物は、いくつかの編集構成およびC.glutamicum株を試験している。しかし興味深いことに、これらの刊行物は、Cas9の毒性、編集の有効性、試験した具体的な株ならびに試験したドナー構成に関して、その結論が大きく異なっている。さらに、特に多重遺伝子編集に関して、C.glutamicum技術は、複数の編集の同時導入に対してもっぱら焦点を当てているが、連続するポリヌクレオチド領域の非常に低い編集効率を達成したに過ぎない。例えば、Liu et al.は、それぞれrfp指向性およびrpsL指向性のガイドRNAを使用した、第1(rfp)および第2(rpsL)の遺伝子座の同時編集を記載している。しかしながら、非常に低い編集効率が達成されたに過ぎず、連続する領域のみが各遺伝子座内で編集された。よって、より高い効率、1つまたは複数の遺伝子座内の非連続的な編集、および他の利点を提供する改善された多重遺伝子編集法を含む、C.glutamicumにおけるゲノム編集のための改善されたRNAガイド型エンドヌクレアーゼツールおよび方法が、依然必要とされている。
Resende et al., Gene. 2011;482:1−7;1−7
Nakamura et al., Gene. 2003 Oct 23;317(1−2):149−55
Jiang et al. Nat Commun. 2017 May 4;8:15179
Cho et al. Metab Eng. 2017 Jul;42:157−167
Peng et al. Microb Cell Fact.; 2017 Nov 14;16(1):201
Liu et al. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205
発明の要旨
本発明は、これらの満たされていない要求および不確実性に、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチド、ガイドRNAおよびドナーポリヌクレオチドを含むCRISPR系を使用してCorynebacteriumを遺伝子改変するための首尾よい方法で対処し、ここで、このドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、複製性プラスミド中にコードされる。特定の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドの、同時または順次的なプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での多重遺伝子改変のための方法が例示される。本発明のある特定の実施形態は、Coates, et al., ”Systematic investigation of CRISPR−Cas9 configurations for flexible and efficient genome editing in Corynebacterium glutamicum NRRL−B11474”, J Ind Microbiol Biotechnol, published online 2018 Nov 27 (doi: 10.1007/s10295−018−2112−7)に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、これらの満たされていない要求および不確実性に、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチド、ガイドRNAおよびドナーポリヌクレオチドを含むCRISPR系を使用してCorynebacteriumを遺伝子改変するための首尾よい方法で対処し、ここで、このドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、複製性プラスミド中にコードされる。特定の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドの、同時または順次的なプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での多重遺伝子改変のための方法が例示される。本発明のある特定の実施形態は、Coates, et al., ”Systematic investigation of CRISPR−Cas9 configurations for flexible and efficient genome editing in Corynebacterium glutamicum NRRL−B11474”, J Ind Microbiol Biotechnol, published online 2018 Nov 27 (doi: 10.1007/s10295−018−2112−7)に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ある特定の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードする1つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での複数の編集の導入のための方法が例示される。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド(単数または複数)(プラスミドベースの提示によって提供されるのであれ直線状断片として提供されるのであれ)は、2つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードし、このとき、2つもしくはそれよりも多くのゲノム改変のうちの少なくとも2つ、または2つもしくはそれよりも多くの改変のうちのすべては、例えば、非連続的であり、ゲノム中で互いに近傍にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある改変は、150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対または10もしくは5塩基対以内、あるいは約150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対または10もしくは5塩基対以内にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある改変は、ゲノム中で互いに、約10〜約100塩基対または約25〜約75塩基対の距離にある。
さらに、C.glutamicumにおけるCRISPR/Cas9の使用に関する最近の刊行物の多くは、pBL1複製起点を有するプラスミドを利用している。本明細書に記載の研究の過程の間に、pCG1およびpCASE1プラスミドが、試験株NRRL−B11474においてpBL1ベースのプラスミドよりも予期せぬことに優れていたことが決定された。理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、pBL1ベースのプラスミドと比較した、pCG1ベースのプラスミドおよびpCASE1ベースのプラスミドの予期せぬことに改善された形質転換有効性が、他のC.glutamicum株を含む広い範囲の商業的に適切なCorynebacterium株に適用可能であると仮説を立てている。また、理論に束縛されることは望まないが、予期せぬことに改善された編集が、pBL1ベースのプラスミドと比較して、pCG1およびpCASE1プラスミドを使用して得られた形質転換効率における予期せぬ増加に少なくとも一部起因するとさらに仮説が立てられる。したがって、1つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのpCG1および/またはpCASE1プラスミドコーディングを使用するドナー構成が挙げられるがこれらに限定されない、より有効なRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)編集系および可能なドナー構成の拡張されたツールボックスの構築もまた、本明細書に記載される。
一態様では、本発明は、Corynebacterium宿主を遺伝子改変するための方法であって、Corynebacterium宿主を、第1のガイドRNAを発現させるための配列に作動可能に連結した第1のプロモーター、例えば、誘導性または構成的プロモーターを含むプラスミドで形質転換するステップと、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドを提供するステップと、前記第1のガイドRNAを、宿主中のRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドと併せて発現させるステップとを含む方法を提供する。一部の場合では、前記ドナーポリヌクレオチドは、プラスミド上にコードされる。
一態様では、本発明は、Corynebacterium宿主を遺伝子改変するための方法であって、Corynebacterium種を、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第1のプロモーターを含む第1のプラスミドで形質転換するステップと、第1のガイドRNAを提供するステップと、前記宿主中で、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドと併せて発現させるステップであって、前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、ステップとを含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1およびMAD7、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼはCas9である。
一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、前記Corynebacterium種のゲノムに組み込まれる。
一部の実施形態では、Corynebacterium種は、Corynebacterium glutamicumである。一部の実施形態では、Corynebacterium種は、Corynebacterium glutamicum株NRRL−B11474である。
一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点およびpCG1複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点を含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCG1複製起点を含む。
一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、ガイドRNAと同じプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、異なる、例えば、第2または第3のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、線形の一本鎖または二本鎖DNA断片として提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドを含むまたはコードするプラスミドまたは線形もしくは環状断片は、1つもしくは複数の、または2つもしくはそれよりも多くの追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含むまたはコードする。
一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第1のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、直線状断片として提供される。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、第1のプロモーターに作動可能に連結した第1のガイドRNAまたは1つもしくは複数の追加のガイドRNA、あるいは第2のプロモーターに作動可能に連結した1つまたは複数の追加のガイドRNAをさらにコードする。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは、示差的に誘導性である。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第1のプラスミド上に提供され、第1のプラスミドは、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列(単数または複数)および右の相同性アーム配列(単数または複数)を有する1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、追加のドナーポリヌクレオチド(単数または複数)は各々、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供され、第2のプラスミドは、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列(単数または複数)および右の相同性アーム配列(単数または複数)を有する1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、追加のドナーポリヌクレオチド(単数または複数)は各々、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドまたは第2のプラスミドは、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、前記第1のドナーポリヌクレオチドは、前記左の相同性アーム配列および前記右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む。少なくとも1つの変異配列は、有利には、単一ヌクレオチド挿入;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;単一ヌクレオチド欠失;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;1つまたは複数のコード配列の欠失;単一ヌクレオチドの置換;ならびに2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換からなる群から選択される変異を含み得る。具体的な実施形態では、少なくとも1つの変異配列は、Cas9のPAMまたはシード領域の変異を含む。ある特定の実施形態では、前記少なくとも1つの変異配列は、前の文に従う複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、複数の変異は、同じドナーポリヌクレオチド配列上にコードされる。
一部の実施形態では、少なくとも1つの変異配列は、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはシード領域の変異を含む。一部の実施形態では、Corynebacterium宿主は、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに発現する。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列をさらに含む。
一部の実施形態では、Corynebacterium宿主は、構成的または誘導性プロモーターに連結した配列を含み、この配列は、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した配列を含み、この配列は、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドは、Cas9エンドヌクレアーゼポリペプチドである。
一部の実施形態では、左および/または右の相同性アーム配列またはドナーポリヌクレオチドは、少なくとも25塩基対、好ましくは少なくとも75塩基対、より好ましくは少なくとも150、200、250または300塩基対、なおより好ましくは少なくとも350、400、450、500または2,000塩基対である。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、内在性、異種、合成、誘導性および/または構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターはPcg2613である。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、シングルgRNA(sgRNA)を含む。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)ならびに少なくとも20ヌクレオチドの第1のスペーサー配列を含み、第1のスペーサー配列は、Corynebacterium標的配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%相補的である。一部の実施形態では、方法は、2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNAの発現を順次誘導するステップであって、それによって、Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む。一部の実施形態では、2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも1つは、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む;または2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの2つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む。一部の実施形態では、方法は、2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNA/ドナーポリヌクレオチド対を、異なる誘導性プロモーターの制御下で順次発現させるステップであって、それによって、Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入するステップを含み、一連の編集が、一連のガイドRNA/ドナーポリヌクレオチド対の各対の発現を連続的に誘導することによって導入される。一部の実施形態では、方法は、Corynebacterium宿主において2つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドを発現させるステップと、宿主中に既に存在する修復断片に対応するgRNA(単数または複数)を順次提供するステップであって、それによって、Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入する、ステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNAを同時に発現させるステップであって、それによって、Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドが、対抗選択マーカーを含み、方法は、対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第1のプラスミドのCorynebacterium宿主をキュアリングする、ステップを含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドの対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップは、宿主中で、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第1のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変した後、かつ宿主中で、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第2のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変する前に実施される。一部の実施形態では、2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも1つが、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含み;または2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの2つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む。一部の実施形態では、方法は、宿主において1つまたは複数の異種組換え系からタンパク質のセットを発現させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ラムダレッド組換え系、Rec ET組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはRec ET組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを発現させるステップを含む。ある特定の実施形態では、Corynebacterium宿主は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、プラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列をさらに発現する。一部の場合では、Cas9プロモーターは、ガイドRNAに作動可能に連結した構成的または誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。ある特定の実施形態では、前記第1のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列をさらに含む。
一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、宿主ゲノムに組み込まれる。Cas9を有する複製性プラスミドを形質転換するための以前の試みは、細胞に対するCas9遺伝子および/またはポリペプチドの毒性に潜在的に起因して、形質転換体をほとんど生じないこと、または低減された成長速度を示すことが報告されている(Cho et al. Metab Eng. 2017 Jul;42:157−167;Peng et al. Microb Cell Fact.; 2017 Nov 14;16(1):201)。本明細書で初めて例示されるように、本発明者らは、機能的なCas9ポリペプチドが、宿主に対する毒性なしに、かつCas9自体の毒性を低減させる必要なしに、Corynebacteriumゲノムに首尾よく組み込まれ得ることを決定した。一部の場合では、プラスミドによってコードされるものであれ、ゲノムに組み込まれた遺伝子によってコードされるものであれ、Cas9ポリペプチドの毒性は、Cas9ポリペプチドが、非誘導状態で発現されないまたは最小限に発現され、次いでゲノム編集を実施するために誘導状態で発現されるように、誘導性プロモーターを使用することによって低減される。一部の場合では、Cas9プロモーターは、ガイドRNAに作動可能に連結した誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。
一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、プラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、第1のプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、第2のプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、ガイドRNAコード配列、例えば、第1のガイドRNAコード配列を含むプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列は、ドナーポリヌクレオチド、例えば、第1のドナーポリヌクレオチドを含むプラスミド中にある。一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なCas9ポリペプチドコード配列を含むプラスミドは、対抗選択マーカー(counterselection)をさらに含む。一部の場合では、Cas9ポリペプチドコード配列を含むプラスミド中の前記対抗選択マーカーは、異なる(例えば、第1または第2の)プラスミド上の別の対抗選択マーカーと比較して、示差的に対抗選択され得る。一部の場合では、本方法は、Corynebacterium宿主の1回もしくは複数の、または2回のまたはより好ましくは順次的なゲノム編集を実施した後に、機能的なCas9ポリペプチドコード配列を含むプラスミドが不利になるように対抗選択するステップであって、それによって、Cas9ポリペプチドコード配列のCorynebacterium宿主をキュアリングする、ステップを含む。
一部の実施形態では、ガイドRNAは、単一分子ガイドRNA(sgRNA)である。一部の実施形態では、ガイドRNAは、二重分子ガイドRNA、例えば、crRNAおよびtracrRNAである。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、前記第1のプロモーターに作動可能に連結した第1のガイドRNAまたは1つもしくは複数の追加のガイドRNA、あるいは第2のプロモーターに作動可能に連結した1つまたは複数の追加のガイドRNAをさらにコードする。一部の場合では、前記第1のプロモーターは、構成的である。一部の場合では、前記第1のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、第2のプロモーターは、構成的である。一部の場合では、第2のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、前記第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、前記第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは、示差的に誘導性である。一部の場合では、前記第1のガイドRNAに作動可能に連結した前記第1のプロモーターが誘導され、Corynebacterium宿主のゲノムが改変され、次いで、第2のプロモーターが誘導され、Corynebacterium宿主の異なる遺伝子改変が行われる。一部の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、約25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、少なくとも25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、または少なくとも約25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む。
ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約25塩基対と約2000塩基対との間、約25塩基対と約1000塩基対との間、約25塩基対と約600塩基対との間、約25塩基対と約500塩基対との間、約25塩基対と約250塩基対との間、約25塩基対と約200塩基対との間、約25塩基対と約100塩基対との間または約25塩基対と約50塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約100塩基対と約2000塩基対との間、約100塩基対と約1000塩基対との間、約100塩基対と約600塩基対との間、約100塩基対と約500塩基対との間、約100塩基対と約250塩基対との間、約100塩基対と約200塩基対との間または約100塩基対と約150塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約0塩基対と約2000塩基対との間、約0塩基対と約1000塩基対との間、約0塩基対と約600塩基対との間、約0塩基対と約500塩基対との間、約0塩基対と約250塩基対との間、約0塩基対と約200塩基対との間、約0塩基対と約100塩基対との間、約0塩基対と約50塩基対との間または約0塩基対と約25塩基対との間を含む。
一部の実施形態では、ガイドRNAに作動可能に連結したプロモーターは、天然のCorynebacteriumプロモーターである。一部の実施形態では、ガイドRNAに作動可能に連結したプロモーターは、宿主細胞に対して異種のプロモーターである。一般に、プロモーターは、そのプロモーターが、宿主細胞原産であれ、異なる生物由来であれ、合成であれ、作動可能に連結したガイドRNAに対して異種である。一部の実施形態では、ガイドRNAに作動可能に連結したプロモーターは、合成プロモーターである。天然の、異種のまたは合成のプロモーターは、構成的であり得る。あるいは、天然の、異種のまたは合成のプロモーターは、誘導性であり得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Pcg2613またはPcg0007またはPcg0047またはPcg1133またはPTet1またはPTet3またはPLac1またはPLac2またはPAra1またはPTrcからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Pcg2613である。ある特定の実施形態では、プロモーターは、任意の内在性Corynebacteriumプロモーター、異種生物由来の任意のプロモーター、任意の合成プロモーター、任意の誘導性プロモーターまたは任意の構成的プロモーターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ガイドRNAは、対抗選択マーカーを含む第1のプラスミドによってコードされ、本方法は、対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第1のプラスミドのCorynebacterium宿主をキュアリングする、ステップを含む。一部の場合では、第1のプラスミドの対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップは、前記宿主中で、Cas9ポリペプチドと併せて、第1のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変した後、かつ前記宿主中で、Cas9ポリペプチドと併せて、第2のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変する前に実施される。
別の態様では、Cas9ポリペプチドと併せて、第1のプラスミドから発現される第1のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変するステップと、第1のプラスミド上に存在する対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第1のプラスミドの宿主をキュアリングする、ステップと、Cas9ポリペプチドと併せて、第2のプラスミドから発現される第1のガイドRNAを用いてCorynebacterium宿主を遺伝子改変するステップと、第2のプラスミド上に存在する対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第2のプラスミドの宿主をキュアリングする、ステップと、所望のゲノム編集を完了するまで、必要に応じて反復するステップとを含む、多重遺伝子編集の改善された方法が提供される。一部の場合では、第1および/または第2のプラスミドは、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを含む(例えば、このとき、第1および第2のプラスミドのドナーポリヌクレオチドは異なる)。本明細書で初めて確証的に実証されるように、この順次的なゲノム編集アプローチは、Corynebacterium宿主における遺伝子編集効率を劇的に改善する。
別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に開示のプロモーターの制御下に、CRISPR/Cas9編集において使用されるガイドRNAを配置することによって、グラム陽性細菌においてCRISPR/Cas9編集を改善する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、a)第1のガイドRNAに作動可能に連結したプロモーターを含む第1のプラスミド;ならびにb)右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Corynebacteriumゲノム中の標的配列に相同である、第1のドナーポリヌクレオチドを含むCorynebacterium宿主であって、前記宿主が、Cas9ポリペプチドと併せて前記第1のガイドRNAを発現する、Corynebacterium宿主を提供する。一部の場合では、Corynebacterium宿主は、Corynebacterium glutamicum宿主である。一部の場合では、Corynebacterium glutamicum宿主は、Corynebacterium glutamicum株NRRL−B11474である。
一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点およびpCG1複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点を含む。一部の実施形態では、前記第1のドナーポリヌクレオチドは、前記第1のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、前記第1のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、前記第1のドナーポリヌクレオチドは、直線状核酸断片として提供される。一部の実施形態では、前記第1のプラスミドは、前記第1のプロモーターに作動可能に連結した1つもしくは複数の追加のガイドRNA、または1つもしくは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した1つもしくは複数の追加のガイドRNAをさらに含む。
一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第1のプラスミド上に提供され、前記第1のプラスミドは、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、前記第1のドナーポリヌクレオチドは、第1のプラスミド上に提供され、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1、第2、第3などのドナーポリヌクレオチドの各々は、単一ヌクレオチド挿入;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;単一ヌクレオチド欠失;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;1つまたは複数のコード配列の欠失;単一ヌクレオチドの置換;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの変異配列を含む。
一部の実施形態では、前記少なくとも1つの変異配列は、Cas9のPAMまたはシード領域の変異を含む。一部の場合では、少なくとも1つの変異配列は、Cas9のPAMの変異を含む。一部の場合では、少なくとも1つの変異配列は、Cas9のシード領域の変異を含む。一部の場合では、少なくとも1つの変異配列は、Cas9のシード領域の変異を含み、配列の少なくとも1つの変異は、Cas9のPAMの変異を含む。
一部の実施形態では、前記Cas9ポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結したCas9ポリペプチドコード配列から発現される。一部の場合では、Cas9プロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、構成的Cas9プロモーターは、Pcg2613またはPcg0007またはPcg0047またはPcg1133またはPTrcからなる群から選択される。一部の場合では、Cas9プロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、誘導性Cas9プロモーターは、PTet1またはPTet3またはPLac1またはPLac2またはPAra1からなる群から選択される。一部の場合では、Cas9プロモーターは、ガイドRNAに作動可能に連結した誘導性プロモーターおよび/またはドナーポリヌクレオチドに作動可能に連結した誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。一部の実施形態では、前記Cas9ポリペプチドコード配列は、プラスミド中にある。一部の実施形態では、前記第1のプラスミドは、プロモーターに作動可能に連結した前記Cas9ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記第2のプラスミドは、プロモーターに作動可能に連結した前記Cas9ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記Cas9ポリペプチドコード配列を含む前記プラスミドは、対抗選択マーカーを含む。一部の場合では、前記対抗選択マーカーは、異なる(例えば、第1または第2の)プラスミド上の別の対抗選択マーカーと比較して、示差的に対抗選択され得る。一部の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結した前記Cas9ポリペプチドコード配列は、Corynebacterium宿主のゲノムに組み込まれる。一部の場合では、前記Cas9ポリペプチドコード配列は、Corynebacterium種における発現のために最適化されたコード配列を含む。
一部の実施形態では、前記右および左の相同性アーム配列は、少なくとも25塩基対、好ましくは少なくとも150、200、250または300塩基対、より好ましくは少なくとも350、400、450、500、550または600塩基対である。一部の実施形態では、前記第1、第2および/または追加のプロモーターは、Pcg2613またはPcg0007またはPcg0047またはPcg1133またはPTet1またはPTet3またはPLac1またはPLac2またはPAra1またはPTrcからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記第1、第2および/または追加のプロモーターは、内在性Corynbacteriumプロモーター、Corynebacterium宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記第1および/または第2のプロモーターは、Pcg2613である。一部の実施形態では、前記第1のプロモーターは、Pcg2613である。一部の実施形態では、ガイドRNAは、単一分子ガイドRNA(sgRNA)である。一部の実施形態では、ガイドRNAは、二重分子ガイドRNA、例えば、crRNAおよびtracrRNAである。一部の実施形態では、前記第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)ならびに少なくとも20ヌクレオチドの第1のスペーサー配列を含み、前記第1のスペーサー配列は、前記Corynebacterium標的配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%相補的である。一部の実施形態では、前記第1のガイドRNAは、sgRNAを含む。一部の実施形態では、前記第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む。一部の実施形態では、前記第1のガイドRNAは、シングルgRNA(sgRNA)を含む。
一部の実施形態では、宿主は、少なくとも2つの異なるガイドRNA配列に作動可能に連結した少なくとも2つの異なる誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、対抗選択マーカーを含む。
一部の実施形態では、本発明は、第1のガイドRNAに作動可能に連結したプロモーターを含む第1のプラスミド;ならびに右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Corynebacteriumゲノム中の標的配列に相同である、第1のドナーポリヌクレオチドを含むCorynebacterium宿主であって、前記宿主が、前記第1のガイドRNAを、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて発現する、Corynebacterium宿主を提供する。別の実施形態では、本発明は、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第1のプラスミド;および第1のガイドRNAを含むCorynebacterium宿主であって、宿主が、宿主中で、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドと併せて、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現し、第1のドナーポリヌクレオチドが、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、Corynebacterium宿主を提供する。一部の実施形態では、Corynebacterium宿主は、Corynebacterium glutamicum宿主である。一部の実施形態では、Corynebacterium glutamicum宿主は、Corynebacterium glutamicum株NRRL−B11474である。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1およびMAD7、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9である。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、前記Corynebacterium種のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点およびpCG1複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、pCASE1複製起点を含む。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、前記第1のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、直線状核酸断片として提供される。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、前記第1のプロモーターに作動可能に連結した第1のガイドRNAまたは1つもしくは複数の追加のガイドRNA、あるいは1つまたは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した1つまたは複数の追加のガイドRNAをさらにコードする。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、前記第1のプラスミド上に提供され、前記第1のプラスミドは、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第1のドナーポリヌクレオチドは、第2のプラスミド上に提供され、前記第2のプラスミドは、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、本発明は、ドナーポリヌクレオチドが、単一ヌクレオチド挿入;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;単一ヌクレオチド欠失;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;1つまたは複数のコード配列の欠失;単一ヌクレオチドの置換;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;2つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/または置換;ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの変異配列を含む、本明細書に記載のCorynebacterium宿主を提供する。一部の実施形態では、宿主は、第2のドナーポリヌクレオチドを含み、第2のドナーポリヌクレオチドは、単一ヌクレオチド挿入;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;単一ヌクレオチド欠失;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;1つまたは複数のコード配列の欠失;単一ヌクレオチドの置換;2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;2つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/または置換;ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの変異配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの変異配列は、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはシード領域の変異を含む。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結したRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列から発現される。一部の実施形態では、第1のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列は、Corynebacterium種における発現のために最適化されたコード配列を含む。一部の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は、少なくとも25塩基対、好ましくは少なくとも150、200、250または300塩基対、より好ましくは少なくとも350、400、450、500、550または600塩基対である。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、内在性Corynebacteriumプロモーター、Corynebacterium宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターはPcg2613である。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、シングルgRNA(sgRNA)を含む。一部の実施形態では、第1のガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)ならびに少なくとも20ヌクレオチドの第1のスペーサー配列を含み、第1のスペーサー配列は、Corynebacterium標的配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%相補的である。
発明の詳細な説明
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
用語「a」または「an」は、そのエンティティの1つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「a」または「an」、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「a」または「an」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、1つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
特に示さない限り、用語「約」は、示されたパラメータにおける±10%の変動を指す。
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のCRISPR媒介性の方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主Corynebacterium細胞であって、それが由来した天然に存在するまたは微生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および/または表現型(例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき)を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。この用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、このような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
用語「遺伝子操作された(genetically engineered)」は、宿主Corynebacterium細胞のゲノムの任意の操作(manipulation)(例えば、核酸の挿入、欠失または置換による)を指すことができる。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で互換的に使用され、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖DNA、ならびに二本鎖および一本鎖RNAを含む。これらは、修飾核酸、例えば、メチル化および/またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したDNAの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および/またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現DNAセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「ホモログ」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の差が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変更しない1つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語「相同の」または「ホモログ」または「オルソログ」または「実質的に同様の」または「実質的に対応する」は、1つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述し得る。
本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、(a)配列同一性の程度および/または(b)同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか1つにおいて示され得る。好ましくは、(a)および(b)の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、デフォルトパラメータを使用するNCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)などを使用して決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および/または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、当技術分野で十分理解されるように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失および/または挿入を指す。
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特徴を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの1つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の適用に依存する。ハイブリダイゼーションプローブまたはガイドRNAの標的化領域として有用な核酸の部分は、12ヌクレオチドという短さであり得;一部の態様では、それは、15、20または25ヌクレオチドであるか、または約15、20または25ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、4アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、4アミノ酸より長いはずである。一部の場合では、全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの一部は、Nおよび/またはC末端から欠失された1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるDNA配列であり、プロモーターの元からあるエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。本明細書の方法における使用に適切な非限定的なプロモーター配列は、表1:ガイドRNA発現を駆動するための例示的なプロモーターにおいて以下に提供される。
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」および「天然の」は、遺伝子またはプロモーターの天然に存在するコピーを指す。
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」は、天然に存在する源に由来する遺伝子を指す。一部の態様では、天然に存在する遺伝子は、源生物内のその内在性背景に位置するのであれ、「異種」背景に配置される場合であれ、異なる生物に導入される場合であれ、野生型(非導入遺伝子)遺伝子の遺伝子を指す。よって、本開示の目的のために、「天然に存在しない」遺伝子は、公知の天然の遺伝子とは異なる配列を有するように、変異されたもしくは他の方法で改変された、または合成された、遺伝子である。一部の態様では、改変は、タンパク質レベル(例えば、アミノ酸置換)であり得る。他の態様では、改変は、タンパク質配列に対するいずれの影響も伴わない、DNAレベル(例えば、コドン最適化)であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「異種の」は、特定の生物において天然には見出されないまたは特定の生物において特定の状況(例えば、ゲノムまたはプラスミド場所)では天然には見出されない、アミノ酸または核酸配列(例えば、遺伝子またはプロモーター)を指す。例えば、C.glutamicumの天然のプロモーターまたは他の核酸配列は、野生型C.glutamicumでは作動可能に連結していない核酸配列に作動可能に連結した場合、または異種プラスミドもしくは異種核酸断片などにおいて非天然の形態で送達される場合、異種であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その天然源以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。内在性遺伝子の人工的に変異された改変体は、本開示の目的のために、「外因性」とみなされる。
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えDNAコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。
当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし(Jonesら(1985年)、EMBO J.、4巻:2411〜2418頁;De Almeidaら(1989年)、Mol. Gen. Genetics、218巻:78〜86頁)、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系(line)を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、DNAのサザンブロット分析、mRNA発現のノーザンブロット分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内のDNAおよびRNAの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートDNAまたはRNA、ペプチドコンジュゲートDNAまたはRNA、リポソームコンジュゲートDNAなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、mRNAまたはタンパク質(前駆体または成熟)の産生を指す。
用語「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連鎖配列(sequential arrangement)を意味する。一部の態様では、本開示のプロモーター配列は、遺伝子の5’UTRまたはオープンリーディングフレームの直前に挿入される。他の態様では、本開示の作動可能に連結したプロモーター配列および遺伝子配列は、1つまたは複数のリンカーヌクレオチドによって分離される。
細胞は、外因性DNA、例えば、組換え発現ベクターが細胞の内側に導入されている場合、そのようなDNAによって、「遺伝子改変され」または「形質転換され」または「トランスフェクトされ」ている。外因性DNAの存在は、永続的または一過的な遺伝子変化を生じる。形質転換性DNAは、細胞のゲノム中に組み込まれ(共有結合的に連結され)ても組み込まれ(共有結合的に連結され)なくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換性DNAは、エピソームエレメント、例えば、プラスミド上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように、形質転換性DNAが染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、形質転換性DNAを含む娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたってin vitroでの安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。
「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、DNA)である。用語「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件が提供された場合に、対象ガイド核酸の標的化セグメントが結合する標的核酸中に存在する核酸配列を指すために、本明細書で互換的に使用される。適切なハイブリダイゼーション条件は、細胞中に通常存在する生理的条件を含む。二本鎖標的核酸について、ガイド核酸に対して相補的でありそれとハイブリダイズする標的核酸の鎖は、「相補鎖」と呼ばれる;一方、「相補鎖」に対して相補的である(したがって、ガイド核酸に対して相補的でない)標的核酸の鎖は、「非相補鎖(noncomplementary strand)」または「非相補鎖(non−complementary strand)」と呼ばれる。標的核酸が一本鎖標的核酸(例えば、一本鎖DNA(ssDNA)、一本鎖RNA(ssRNA))である実施形態では、ガイド核酸は、一本鎖標的核酸に対して相補的でありそれとハイブリダイズする。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9ポリペプチド)に結合し、標的核酸内の特定の場所にこのポリペプチドを標的化する核酸分子は、本明細書で「ガイド核酸」と呼ばれる。ガイド核酸がRNA分子である場合、これは、「ガイドRNA」または「gRNA」と呼ばれ得る。ガイド核酸は、2つのセグメント、第1のセグメント(本明細書で「標的化セグメント」と呼ばれる);および第2のセグメント(本明細書で「タンパク質結合性セグメント」と呼ばれる)を含む。「セグメント」は、分子のセグメント/セクション/領域、例えば、核酸分子中のヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。セグメントは、セグメントが1つよりも多くの分子の領域を含み得るような、複合体の領域/セクションもまた意味し得る。例えば、一部の実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメント(以下に記載される)は、1つの核酸分子(例えば、1つのRNA分子)であり、したがって、タンパク質結合性セグメントは、その1つの分子の領域を含む。他の実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメント(以下に記載される)は、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする2つの別々の分子を含む。例示的な非限定的な例として、2つの別々の分子を含むガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、(i)100塩基対長である第1の分子(例えば、RNA分子、DNA/RNAハイブリッド分子)の塩基対40〜75;および(ii)50塩基対長である第2の分子(例えば、RNA分子)の塩基対10〜25を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈において具体的に他の定義がされない限り、総塩基対の具体的な数に限定されず、所与の核酸分子由来の塩基対の任意の特定の数に限定されず、複合体内の別々の分子の特定の数に限定されず、任意の総長さの核酸分子の領域を含み得、他の分子に対する相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよい。
ガイド核酸(例えば、ガイドRNAまたはgRNA)の第1のセグメント(標的化セグメント)は、標的核酸(例えば、標的ssRNA、標的ssDNA、二本鎖標的DNAの相補鎖など)内の特定の配列(標的部位)に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメント(または「タンパク質結合性配列」)は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドと相互作用する。標的核酸の部位特異的結合および/または切断は、ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)と標的核酸との間での塩基対合相補性によって決定される場所において生じ得る。
対象ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖RNA二重鎖(dsRNA二重鎖)を形成する、ヌクレオチドの2つの相補的ストレッチを含む。
ドナーポリヌクレオチドに連結した対象ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、対象のRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)と複合体を形成する(即ち、非共有結合的相互作用を介して結合する)。ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、標的核酸の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。よって、複合体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)は、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントとのその会合によって、部位特異的または「標的化された」活性を提供する。
一部の実施形態では、対象ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、2つの別々の核酸分子を含み、本明細書で「デュアルガイド核酸」と呼ばれる。一部の実施形態では、対象ガイド核酸は、単一の核酸分子(単一のポリヌクレオチド)であり、本明細書で「シングルガイド核酸」と呼ばれる。用語「ガイド核酸」は、包括的であり、デュアルガイド核酸およびシングルガイド核酸の両方を指し、用語「ガイドRNA」もまた包括的であり、デュアルガイドRNA(dgRNA)およびシングルガイドRNA(sgRNA)の両方を指す。
一部の実施形態では、ガイド核酸は、DNA/RNAハイブリッド分子である。そのような実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、RNAであり、RNA二重鎖を形成する。しかしながら、ガイド核酸の標的化セグメントは、DNAであり得る。よって、DNA/RNAハイブリッドガイド核酸がデュアルガイド核酸である場合、標的化セグメントはDNAであり得、二重鎖形成性セグメントはRNAであり得る。そのような実施形態では、「アクチベーター」分子の二重鎖形成性セグメントは、(例えば、標的化セグメントの二重鎖形成性セグメントとRNA二重鎖を形成するために)RNAであり得るが、二重鎖形成性セグメントの外側にある「アクチベーター」分子のヌクレオチドは、DNAであり得(この場合、アクチベーター分子がハイブリッドDNA/RNA分子である)、またはRNAであり得る(この場合、アクチベーター分子がRNAである)。DNA/RNAハイブリッドガイド核酸がシングルガイド核酸である場合、標的化セグメントは、DNAであり得、二重鎖形成性セグメント(これは、タンパク質結合性セグメントを構成する)は、RNAであり得、標的化セグメントおよび二重鎖形成性セグメントの外側のヌクレオチドは、RNAまたはDNAであり得る。
例示的なデュアルガイド核酸は、CRISPR−RNA(crRNA)分子および対応するトランス活性化crRNA(tracrRNA)分子を含む。crRNA分子は、ガイド核酸の標的化セグメント(一本鎖)およびガイド核酸のタンパク質結合性セグメントのdsRNA二重鎖の一方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ(「二重鎖形成性セグメント」)の両方を含む。対応するtracrRNA分子は、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントのdsRNA二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ(二重鎖形成性セグメント)を含む。言い換えれば、crRNA分子のヌクレオチドのストレッチは、ガイド核酸のタンパク質結合性ドメインのdsRNA二重鎖を形成するように、tracrRNA分子のヌクレオチドのストレッチに対して相補的でありそれとハイブリダイズする。crRNA様分子は、一本鎖標的化セグメントをさらに提供する。よって、crRNAおよびtracrRNA(対応する対として)は、デュアルガイド核酸を形成するようにハイブリダイズする。所与のcrRNAまたはtracrRNA分子の正確な配列は、それらのRNA分子が見出される種に特徴的である。
用語「プロトスペーサー」は、crRNAガイド鎖によって標的化されるDNA配列を指す。一部の態様では、プロトスペーサー配列は、CRISPR複合体のcrRNAガイド配列とハイブリダイズする。
「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「PAM」配列は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)によって標的化されるDNA配列の直後の2〜6塩基対のDNA配列である。PAM配列は、標的核酸の切断のために必要とされ、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)の源に依存して変動する。例えば、Streptococcus pyogenes Cas9の場合、PAM配列はNGGである。本開示の態様では、PAM配列は、標的部位のさらなる切断が防止されるように、ドナーポリヌクレオチドによって変異される。
一部の例では、コンポーネント、例えば、核酸コンポーネント(例えば、ガイド核酸など);タンパク質コンポーネント(例えば、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、Cas9ポリペプチド、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼ、改変体Cas9ポリペプチド)など)は、標識部分を含む。用語「標識」、「検出可能な標識」または「標識部分」は、本明細書で使用される場合、シグナル検出を提供する任意の部分を指し、アッセイの特定の性質に依存して広く変動し得る。目的の標識部分としては、直接的に検出可能な標識(例えば、蛍光標識)および間接的に検出可能な標識(間接的標識、例えば、結合対メンバー)の両方が挙げられる。蛍光標識は、任意の蛍光標識、例えば、蛍光色素(例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ALEXAFLUOR(登録商標)標識など)、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度GFP(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、mCherry、mTomato、mTangerine、およびそれらの任意の蛍光誘導体など)であり得る。
本方法における使用に適切な(直接的または間接的に)検出可能な標識部分としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって検出可能な任意の部分が挙げられる。例えば、適切な間接的標識としては、ストレプトアビジン(これ自体、直接的または間接的に標識され得る)が結合し得るビオチン(結合対メンバー)が含まれる。標識としては、以下もまた挙げられ得る:放射能標識(直接的標識)(例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P);酵素(間接的標識)(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼなど);蛍光タンパク質(直接的標識)(例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質およびそれらの任意の簡便な誘導体);金属標識(直接的標識);比色標識;結合対メンバーなど。「結合対メンバー」とは、第1の部分および第2の部分のうちの一方を意味し、この第1の部分および第2の部分は、互いに対して特異的な結合親和性を有する。適切な結合対としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる:抗原/抗体(例えば、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル(DNP)/抗DNP、ダンシル−X−抗ダンシル、フルオレセイン/抗フルオレセイン、ルシファーイエロー/抗ルシファーイエローおよびローダミン/抗ローダミン)、ビオチン/アビジン(またはビオチン/ストレプトアビジン)およびカルモジュリン結合タンパク質(CBP)/カルモジュリン。任意の結合対メンバーが、間接的に検出可能な標識部分としての使用に適切であり得る。
任意の所与のコンポーネント、またはコンポーネントの組合せは、非標識であってもよく、標識部分で検出可能に標識されてもよい。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのコンポーネントが標識される場合、これらは、互いに識別可能な標識部分で標識され得る。
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999);Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996);Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999);Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995);Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997);Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998);およびCurrent Protocols in Molecular Biolgoy (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 2003), including supplements 1−117などの標準的な教科書中に見出され得、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド
RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド
少なくとも5つの主要なCRISPR系の型(I型、II型、III型、IV型およびV型)および少なくとも16個の別個のサブタイプが存在する(Makarova, K.S., et al., Nat Rev Microbiol. 2015. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722−736)。CRISPR系は、それらのエフェクタータンパク質に基づいても分類される。クラス1の系は、マルチサブユニットcrRNA−エフェクター複合体を有し、一方で、クラス2の系では、エフェクター複合体のすべての機能が、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)によって実行される。実施例に記載されるように、本開示は、II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9ポリペプチド、その改変体および/またはそのオルソログを有利に使用する。当業者は、本開示の態様が、Cas9を含むものに加えて、他のCRISPR/Cas系(例えば、Cpf1)にも適用可能であることを理解する。したがって、適切なRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼは、例えば、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1およびMAD7、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログから選択され得る。
本発明における使用に適切なRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)としては、天然に存在するRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド、例えば、Cas9ポリペプチド(例えば、細菌および/または古細菌細胞中に天然に存在する)、または以下で論じられる改変体Cas9ポリペプチドが挙げられる。好ましい一実施形態では、Cas9ポリペプチドは、Streptococcus pyogenes由来である。特に好ましい実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、Cobb et al. ACS Synth. Biol. 4, 723−728 (2015)に記載されるように、Streptomycesのためにコドン最適化されている。
本明細書に詳述するように、天然に存在するRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、ガイド核酸に結合し、それによって、標的核酸内の特定の配列(標的部位)への指向性を付与され、標的核酸を切断する(例えば、dsDNAを切断して二本鎖切断を生じる、ssDNAを切断する、ssRNAを切断するなど)。したがって、適切なRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、2つの部分、RNA結合部分および活性部分を含む。RNA結合部分は、対象ガイド核酸と相互作用し、活性部分は、部位特異的酵素活性(例えば、ヌクレアーゼ活性、DNAおよび/またはRNAメチル化の活性、DNAおよび/またはRNA切断の活性、ヒストンアセチル化の活性、ヒストンメチル化の活性、RNA改変の活性、RNA結合の活性、RNAスプライシングの活性など)を示す。一部の実施形態では、活性部分は、野生型のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)の対応する活性部分と比較して低減されたヌクレアーゼ活性を示し得る。
タンパク質が対象ガイド核酸と相互作用するRNA結合部分を有するかどうかを決定するためのアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合について試験する任意の簡便な結合アッセイであり得る。例示的な結合アッセイとしては、ガイド核酸およびRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)を標的核酸に添加することが関与する、結合アッセイ(例えば、ゲルシフトアッセイ)が挙げられる。
タンパク質が活性部分を有するかどうかを決定するため(例えば、ポリペプチドが標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性を有するかどうかを決定するため)のアッセイは、核酸切断について試験する任意の簡便な核酸切断アッセイであり得る。例示的な切断アッセイとしては、これらに限定されないが、ガイド核酸およびRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)を標的核酸に添加すること、および標的核酸の切断が生じたかどうかを、任意の適切な分析技法、例えば、シーケンシングまたはPCR増幅を介して試験することが挙げられる。
本発明における使用に適切なRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)としては、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)が挙げられる。改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、野生型のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)のアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸が異なる(例えば、欠失、挿入または置換を有する)アミノ酸配列を有し、ヌクレアーゼ活性の改変を生じる。
一部の実施形態では、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断する能力は低減されている。例えば、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、RuvCドメインの機能を低減させる変異(アミノ酸置換)を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、改変体Cas9ポリペプチドは、D10A変異(例えば、配列番号3の核酸配列によってコードされるCas9ポリペプチドの10位に対応するアミノ酸位置における、アスパラギン酸からアラニンへの変異)を有し、したがって、二本鎖標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断する能力が低減されている(よって、改変体Cas9ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断する場合、二本鎖切断(DSB)の代わりに一本鎖切断(SSB)を生じる)(例えば、Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816−21を参照されたい)。
一部の実施形態では、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低減されている。例えば、改変体のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、HNHドメインの機能を低減させる変異(アミノ酸置換)を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、改変体Cas9ポリペプチドは、H840A変異(例えば、Streptococcus pyogenesの840位に対応するアミノ酸位置における、ヒスチジンからアラニンへの変異)を有し得、したがって、標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低減されている(よって、改変体Cas9ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断する場合、DSBの代わりにSSBを生じる)。
他の実施形態では、本開示のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ペプチド)は、Fonfara et al. Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2577−90;Nishimasu H. et al. Cell. 2014 Feb 27;156(5):935−49;Jinek M. et al. Science. 2012 337:816−21;Jinek M. et al. Science. 2014 Mar 14;343(6176);およびChen et al. Nature. 2017 Oct 19;550(7676):407−410に記載される機能的変異が挙げられるがこれらに限定されない、文献中に記載される変異のうちの1つまたは複数を含み得る;米国特許公開第2014/0068797号;および同第2016/0168592号もまた参照されたい;PCT特許公開第WO2017/155717;WO2017/147056;WO2017/066175;WO2017/040348;WO2017/035416;WO2017/015101;WO2016/186953;およびWO2016/186745もまた参照されたい;さらに、米国特許第8,697,359号;同第8,771,945号;同第8,795,965号;同第8,865,406号;同第8,871,445号;同第8,889,356号;同第8,895,308号;同第8,906,616号;同第8,932,814号;同第8,945,839号;同第8,993,233号;同第8,999,641号;同第9,840,713号;同第9,840,699号;および同第9,771,600号を参照されたい。上述の特許および刊行物の各々は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれており、それらの目的としては、これらに限定されないが、RNAガイド型ヌクレアーゼ、ガイドRNA、CRISPR関連タンパク質、ドナー核酸および/またはCRISPR系のコンポーネントを用いて、1つまたは複数の核酸を標的化、切断、編集、改変しまたはその発現をモジュレートするための方法および組成物が挙げられる。
よって、一部の実施形態では、本明細書に開示の系および方法は、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)、一本鎖ニッカーゼとして作用するRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9改変体)、または改変されたヌクレアーゼ活性を有する他の変異体と使用され得る。したがって、本発明における使用に適切なRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、酵素的に活性なRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)であり得、例えば、標的核酸において一本鎖もしくは二本鎖切断を行うことができ、またはあるいは、野生型のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)と比較して低減された酵素活性を有し得る。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9ポリペプチド)は、様々な適切なフォーマットで、細胞に、または細胞中に提供され得る。一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼは、プラスミドによってコードされる。プラスミドは、複製コンピテントであっても複製インコンピテントであってもよく、好ましくは、複製コンピテントである。プラスミドは、ガイドRNAをコードするプラスミドおよび/またはドナーポリヌクレオチドをコードするプラスミドと同じプラスミドであっても異なるプラスミドであってもよい。一部の場合では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼは、第1のプラスミドによってコードされ、ガイドRNAは、第2のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第1のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第2のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第3のプラスミドによってコードされる。
本発明のプラスミドは、C.glutamicumおよび/またはE.coli適合性の複製起点を含み得る。一部の場合では、プラスミドは、CG1またはCASE1起点を含む。一部の場合では、プラスミドは、colE1、p15aまたはR6k起点を含む。一部の場合では、プラスミドは、CG1およびCASE1から選択される起点ならびにcolE1、p15aおよびR6kから選択される起点を含む。
本明細書に記載のように、一部の場合では、ドナー断片、RNAガイド型エンドヌクレアーゼおよび/またはガイドRNAのうちの1つまたは複数は、線形または環状の非プラスミド核酸断片中にコードされる。1つまたは複数の断片は、ゲノムに組み込まれ得る。よって、一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼは、編集される細胞のゲノムに組み込まれた核酸断片中にコードされ得る。一部の場合では、プラスミドまたは組み込まれた断片は、陰性選択のための配列(例えば、mazF、ccdB、gata−1、lacY、thyA、pheS、tetAR、rpsL、sacB、温度感受性複製起点など)および/またはRNAガイド型エンドヌクレアーゼコード配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組換え配列、例えば、FLP、loxP配列などをさらに含む。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸(例えば、線形もしくは環状断片またはプラスミド)は、選択マーカーを含み得る。適切な選択マーカーとしては、これらに限定されないが、抗生物質耐性遺伝子、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、Zeocin耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子およびKm(カナマイシン耐性遺伝子)、tetA(テトラサイクリン耐性遺伝子)、G418(ネオマイシン耐性遺伝子)、van(バンコマイシン耐性遺伝子)、tet(テトラサイクリン耐性遺伝子)、アンピシリン(アンピシリン耐性遺伝子)、メチシリン(メチシリン耐性遺伝子)、ペニシリン(ペニシリン耐性遺伝子)、オキサシリン(オキサシリン耐性遺伝子)、エリスロマイシン(エリスロマイシン耐性遺伝子)、リネゾリド(リネゾリド耐性遺伝子)、ピューロマイシン(ピューロマイシン耐性遺伝子)またはハイグロマイシン(ハイグロマイシン耐性遺伝子)が挙げられる。
一部の場合では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼコード核酸(例えば、線形もしくは環状断片またはプラスミド)中の選択マーカーは、ガイドRNAおよび/またはドナーポリヌクレオチドをコードする異なる核酸において使用されるものと同じ選択マーカーである。一部の場合では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼコードプラスミド中の選択マーカーは、ガイドRNAおよび/またはドナーポリヌクレオチドをコードする異なる核酸中の選択マーカーと比較して、異なる選択マーカーである。1つまたは複数の陽性および/または陰性選択マーカーの使用は、個々のCRISPRコンポーネントについての特異的かつ示差的な選択を可能にすることができる。例えば、細胞は、細胞中に、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド、第1のガイドRNA、および必要に応じて第1のドナー断片を提供することによって編集され得;次いで、第2の編集が、第1のガイドRNAおよびドナー断片の細胞をキュアリングすること;ならびに細胞中に第2のガイドRNAおよび/またはドナー断片を提供することによって行われ得る。RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、ガイドRNAおよび/またはドナー断片は、CRISPRコンポーネント(単数または複数)をコードする核酸を導入すること、1つもしくは複数のCRISPRコンポーネントの核タンパク質複合体を導入すること、1つもしくは複数のCRISPRコンポーネントの発現を誘導すること、またはそれらの組合せによって、細胞中に提供され得る。
一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、天然のプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、外因性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、合成プロモーターに作動可能に連結している。
ドナーポリヌクレオチド
ドナーポリヌクレオチド
「ドナーポリヌクレオチド」または「修復断片」は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9ポリペプチド)によって誘導される切断部位において挿入される核酸配列を意味する。適切なドナーポリヌクレオチド配列は一般に、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を含み、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列をさらに含む。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの変異配列を含み、この2つもしくはそれよりも多くの変異配列のうちの少なくとも2つもしくはすべてには、共に同じ左および右の相同性アーム配列が隣接し、またはこの2つもしくはそれよりも多くの変異配列のうちの少なくとも2つもしくはすべてには、異なる左および右の相同性アーム配列が隣接する。一般に、2つまたはそれよりも多くの変異配列が同じドナーポリヌクレオチド中にある場合、これらの変異配列は、互いに近傍にある標的ゲノム遺伝子座の変異である。典型的には、ドナーポリヌクレオチド上の2つまたはそれよりも多くの変異配列は、150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対または10もしくは5塩基対以内、あるいは約150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対または10もしくは5塩基対以内にあるゲノム改変をコードする。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にあるゲノム改変をコードする2つまたはそれよりも多くの変異配列は、ゲノム中で互いに、約10〜約100塩基対または約25〜約75塩基対の距離にある。
本明細書で実証されるように、CorynebacteriumにおけるCRISPR/Cas9複合体の編集効率は、相同性アームの長さを増加させると、顕著に増加する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、25;45、50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、約25;45、50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、少なくとも25;45、50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む、または少なくとも約25;45、50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される左および右の相同性アーム配列は各々独立して、25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対以下、または約25;50;75;100;125;150;175;200;225;250;275;300;325;350;375;400;425;450;475;500;525;550;575;600;625;650;675;700;725;750;775;800;825;850;875;900;925;950;975;1,000;1,025;1,050;1,075;1,100;1,125;1,150;1,175;1,200;1,225;1,250;1,275;1,300;1,325;1,350;1,375;1,400;1,425;1,450;1,475;1,500;1;525;1,550;1,575;1,600;1,625;1,650;1,675;1,700;1,725;1,750;1,775;1,800;1,825;1,850;1,875;1,900;1,925;1,950;もしくは2,000塩基対以下を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約45塩基対と約125塩基対との間、約25塩基対と約2000塩基対との間、約25塩基対と約1000塩基対との間、約25塩基対と約600塩基対との間、約25塩基対と約500塩基対との間、約25塩基対と約250塩基対との間、約25塩基対と約200塩基対との間、約25塩基対と約100塩基対との間または約25塩基対と約50塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約100塩基対と約2000塩基対との間、約100塩基対と約1000塩基対との間、約100塩基対と約600塩基対との間、約100塩基対と約500塩基対との間、約100塩基対と約250塩基対との間、約100塩基対と約200塩基対との間または約100塩基対と約150塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約0塩基対と約2000塩基対との間、約0塩基対と約1000塩基対との間、約0塩基対と約600塩基対との間、約0塩基対と約500塩基対との間、約0塩基対と約250塩基対との間、約0塩基対と約200塩基対との間、約0塩基対と約100塩基対との間、約0塩基対と約50塩基対との間または約0塩基対と約25塩基対との間を含む。
一部の場合では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右の相同性アームは、0塩基対の長さを有するが、左の相同性アームは、25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、少なくとも25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、約25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、または少なくとも約25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さを有する。一部の場合では、本明細書に記載のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される左の相同性アームは、0塩基対の長さを有するが、右の相同性アームは、25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、少なくとも25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、約25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さ、または少なくとも約25、45、50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950もしくは2000塩基対の長さを有する。
ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、それが置き換えるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナーポリヌクレオチドは一般に、相同組換え修復を支持するために十分な相同性が存在する限り、少なくとも1つの変異配列、例えば、ゲノム配列に関して、1つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失、反転または再編成を含む。例示的な変異配列は、以下を含む:単一ヌクレオチド挿入;2つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;1つもしくは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;単一ヌクレオチド欠失;2つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;1つもしくは複数のコード配列の欠失;単一ヌクレオチドの置換;2つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;2つもしくはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換;またはそれらの任意の組合せ。具体的な実施形態では、少なくとも1つの変異配列は、Cas9のPAMの変異を含む。
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を有する変異配列を含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドのPAM領域(例えば、Cas9のPAM領域)中の変異、必要に応じてまたは代替的に、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドのシード領域(例えば、Cas9のシード領域)中の変異、および少なくとも5、10、15、20、25、30、45、50、60、90または100ヌクレオチド離れた変異を含み得る。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある非連続的な改変は、200塩基対、175塩基対、150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対もしくは10塩基対もしくは5塩基対以内、または約200塩基対、175塩基対、150塩基対、125塩基対、100塩基対、75塩基対、70塩基対、65塩基対、60塩基対、55塩基対、50塩基対、45塩基対、40塩基対、35塩基対、30塩基対、25塩基対、20塩基対もしくは10塩基対もしくは5塩基対以内にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある非連続的な改変は、ゲノム中で互いに、約10〜約100塩基対または約25〜約75塩基対の距離にある。
一部の場合では、一方のドナーポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を含み、第2のまたは他方のドナーポリヌクレオチドは、異なる遺伝子座における変異を含む。一部の場合では、一方のドナーポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの非連続的な配列を含み、第2のまたは他方のドナーポリヌクレオチドは、異なる遺伝子座における2つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を含む。
変異配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能マーカー(例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など)などを含み得、これらは、切断部位におけるドナー配列の首尾よい挿入について評価するために使用され得、または、一部の実施形態では、他の目的のため(例えば、標的化されたゲノム遺伝子座における発現を示すため)に使用され得る。一部の実施形態では、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列差異は、アミノ酸配列を変化させず、またはサイレントなアミノ酸変化(即ち、タンパク質の構造にも機能にも影響を与えない変化)を起こす。あるいは、これらの配列差異は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組換え配列、例えば、FLP、loxP配列などを含み得る。
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAとして提供され得る。ドナーポリヌクレオチドの末端は、当業者に公知の方法によって、(例えば、エキソヌクレアーゼ分解から)保護され得る。例えば、1つもしくは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線形分子の3’末端に付加され得、および/または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方もしくは両方の末端にライゲーションされ得る。例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959−4963;Nehls et al. (1996) Science 272:886−889を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加の方法としては、これらに限定されないが、末端アミノ基(単数または複数)、リン酸基、メチル基の付加、ならびに改変されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダートおよびO−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの使用が挙げられる。
一部の実施形態では、例えば、追加の配列、例えば、複製起点、1つもしくは複数のプロモーターおよび/または陽性もしくは陰性選択マーカーなど、あるいはそれらのうちの2つ、それらのうちの3つまたはそれらのうちのすべての組合せを有するプラスミドの一部として細胞に導入されるドナーポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、複製コンピテントなプラスミドの一部として提供される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、複製インコンピテントなプラスミドの一部として、細胞に導入される。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として(例えば、線形または環状断片として)、リポソームもしくはポリマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得、またはウイルス(例えば、アデノウイルス、AAV)によって送達され得る。
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの組込みは、組換えタンパク質、例えば、RecE/T、またはファージラムダ由来レッド(Red)組換え系ラムダのエキソヌクレアーゼ、ベータ−タンパク質および/もしくはガンマ−タンパク質のうちの1つもしくは複数のコンポーネントの、同時または順次的な導入によって補助され得る(GENETICS November 1, 2010 vol. 186 no. 3 791−799を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのドナー断片コード核酸は、選択的誘導のために、例えば、宿主細胞ゲノムの連続的編集のために、示差的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結している。
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、ドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示による多重化ゲノム編集が、以下に詳述される機構(1)、(2)、(3)、(4)または(5)のうちの1つまたは複数を介して進行し得ると仮説を立てている。
機構(1)、単一のクロスオーバーループイン(loop−in)と、その後のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)/sgRNA媒介性の切断および修復。細胞内で、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)は、構成的に発現される。sgRNA/修復断片コンストラクトの形質転換後、修復断片遺伝子座におけるループイン事象(即ち、2つの別々の組込み事象)が存在し、それによって、遺伝子座が重複する(即ち、1つの変異体コピー、1つの野生型コピー)。並行して、コンストラクト上のsgRNA(単数または複数)が発現され、フォールディングし、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)」は、野生型遺伝子座を認識し切断する。細胞は、生存するためにこの切断を修復しなくてはならない。ゲノムに既に組み込まれた変異体遺伝子座は、切断部位に隣接し、修復のための組換え鋳型として機能する。次いで、変異はゲノムDNA中で固定され、娘細胞まで存続する。
機構(2)、二重クロスオーバーループイン/ループアウト(loop−out)と、その後のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)/sgRNA媒介性切断。細胞内で、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)は、構成的に発現される。sgRNA/修復断片コンストラクトの形質転換後、修復断片遺伝子座におけるループイン事象(即ち、2つの別々の組込み事象)が存在し、それによって、遺伝子座が重複する(即ち、1つの変異体コピー、1つの野生型コピー)。sgRNA/修復断片コンストラクトのループイン後、修復断片相同性アームによって媒介されるループアウト事象が存在する(理論上、細胞の約50%は、野生型バージョンの遺伝子座にループアウトするはずであり、残りの50%は、変異体バージョンの遺伝子座にループアウトする)。並行して、コンストラクト上のsgRNA(単数または複数)が発現され、フォールディングし、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)」は、野生型にループアウトした細胞を認識して切断し、それらを集団から取り除く。変異体遺伝子座を含む細胞は、「プライミングされたRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)」によって切断されない;次いで、変異はゲノムDNA中で固定され、娘細胞まで存続する。
機構(3)、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)/sgRNA媒介性切断と、その後のプラスミドドナーによる二重クロスオーバー修復。細胞内で、Cas9は、構成的に発現される。sgRNA/修復断片コンストラクトの形質転換後、コンストラクト上のsgRNA(単数または複数)が発現され、フォールディングし、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)」は、野生型遺伝子座を認識し切断する(即ち、染色体DNA中の2つの二本鎖切断)。細胞は、生存するためにこれらの切断を修復しなくてはならない。sgRNA/修復断片コンストラクトは、DNA中の切断を直すための組換え鋳型として機能する(即ち、2つの二重クロスオーバー修復事象)。細胞は、二重クロスオーバー事象を実行し、切断を修復する。変異はゲノムDNA中で固定され、娘細胞まで存続する。
機構(4)、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)/sgRNA媒介性切断と、その後の二本鎖線形ドナーによる二重クロスオーバー修復:細胞内で、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)は、異種組換えタンパク質(例えば、ラムダレッド組換え系からのベータ、ガンマおよびエキソ、またはracプロファージからのRecE/RecT)と共に構成的に発現される。sgRNAコンストラクトおよび線形二本鎖修復断片(単数または複数)の形質転換後、コンストラクト上のsgRNA(単数または複数)が発現され、フォールディングし、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたCas9」は、野生型遺伝子座を認識し切断する(即ち、染色体DNA中の2つの二本鎖切断)。細胞は、生存するためにこれらの切断を修復しなくてはならない。修復断片は、異種組換えタンパク質によってプロセシングされ、染色体修復のための鋳型として使用される。変異はゲノムDNA中で固定され、娘細胞まで存続する。
機構(5)、DNA複製を介した一本鎖線形ドナーの導入と、その後の野生型遺伝子座のRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)/sgRNA媒介性切断。細胞内で、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)は、異種組換えタンパク質(例えば、ラムダレッド組換え系からのガンマまたはracプロファージからのRecT)と共に構成的に発現される。sgRNAコンストラクトおよび線形一本鎖修復断片(単数または複数)の形質転換後、線形一本鎖修復断片(単数または複数)が、DNA複製の間に、岡崎フラグメント伸長を介してゲノムDNAに組み込まれる。sgRNA(単数または複数)が発現され、フォールディングし、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたRNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)」は、野生型遺伝子座を認識して切断し(即ち、染色体DNA中の2つの二本鎖切断)、変更された遺伝子座をインタクトなままにする。変異はゲノムDNA中で固定され、娘細胞まで存続する。
ガイドRNA
ガイドRNA
ガイドRNAは、以下として提供され得る:ガイドRNAをコードする二本鎖DNA、一本鎖RNA、または二本鎖RNA。一部の実施形態では、ガイドRNAは、追加の配列、例えば、複製起点、1つもしくは複数のプロモーターおよび/または陽性もしくは陰性選択マーカーなど、あるいはそれらのうちの2つ、それらのうちの3つまたはそれらのうちのすべての組合せを有するプラスミド中にコードされる。一部の実施形態では、ガイドRNAは、複製コンピテントなプラスミドの一部として提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、複製インコンピテントなプラスミドの一部として提供される。あるいは、ガイドRNAは、裸の核酸として(例えば、線形または環状断片として)、リポソームもしくはポリマーなどの薬剤と複合体化した核酸として提供され得、またはウイルス(例えば、アデノウイルス、AAV)によって送達され得る。
ある特定の実施形態では、2つまたはそれよりも多くのガイドRNAコード核酸は、選択的誘導のために、例えば、宿主細胞ゲノムの連続的編集のために、示差的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結している。示差的に誘導性のガイドRNAは、同じまたは異なるプラスミドまたは核酸断片によってコードされ得る。
DNA修復コンポーネント
DNA修復コンポーネント
ある特定の実施形態では、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種DNA修復経路のコンポーネントをコードする核酸によって宿主細胞ゲノムを編集するための方法が提供される。一部の場合では、本方法は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種DNA修復経路の2つまたはそれよりも多くのコンポーネントをコードする2つまたはそれよりも多くの核酸によって宿主細胞ゲノムを編集するステップを含む。一部の場合では、本方法は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種DNA修復経路の2つまたはそれよりも多くのコンポーネントをコードする核酸を含む。
一部の場合では、修復経路は、RecA/RecBCD修復経路である。一部の場合では、修復経路は、RecE/RecT修復経路である。一部の場合では、修復経路は、Redα/Redβ修復経路である。一部の場合では、修復経路は、ラムダ由来レッド組換え修復経路である。一部の場合では、本方法は、RecAおよび/またはRecBCDの発現を含む。一部の場合では、本方法は、RecEおよび/またはRecTの発現を含む。一部の場合では、本方法は、Redαおよび/またはRedβの発現を含む。一部の場合では、本方法は、ラムダ由来レッド組換え修復経路のベータ、ガンマおよび/またはエキソコンポーネントの発現を含む。異種DNA修復経路のコンポーネントをコードする核酸は、第1、第2または他のプラスミド上にあり得る。一部の場合では、sgRNA(単数または複数)は、第1のプラスミド上にコードされ、異種DNA修復タンパク質(単数または複数)は、第2のプラスミド上にコードされる。
発現、精製および送達
発現、精製および送達
一態様では、本開示は、CRISPR/RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)遺伝子編集複合体をコードするプラスミド、ベクター、コンストラクトおよび核酸配列を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドの同時もしくは順次的な発現および/またはドナーポリヌクレオチドの提示を伴うまたは伴わない、ガイドRNAの一過的な発現のためのプラスミドを提供する。一部の実施形態では、本発明のプラスミドおよびベクターは、ガイドRNAをコードし、本開示のRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドおよび/またはドナーポリヌクレオチドもまたコードする。他の態様では、操作された複合体の異なるコンポーネントは、1つまたは複数の別個のプラスミド中にコードされ得る。
一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、複数のCorynebacterium種を横断して使用され得る。一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、C.glutamicumに特異的に合わせて調整される。一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、一般にCorynebacterium、ならびに/または特にC.glutamicum、および/もしくはその特定の株、例えば、C.glutamicum NRRL−B11474における発現のためにコドン最適化された配列(例えば、プロモーター、ガイドRNA、RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas遺伝子)、複製起点など)であるまたはそれを含む。
一部の実施形態では、本開示のプラスミドおよびベクターは、目的の細胞において選択的に発現される。よって、一部の実施形態では、本出願は、異所的プロモーター、発生的に調節されるプロモーターおよび/または誘導性プロモーターの使用を企図する。一部の実施形態では、本開示は、ターミネーター配列の使用を提供する。
形質転換
形質転換
一部の実施形態では、本明細書は、本明細書に開示のプラスミドおよびベクターの形質転換の使用を提供する。当業者は、本明細書のプラスミドが、本明細書の他の部分に記載されるような任意の公知の系を介して細胞に形質転換され得ることを認識する。例えば、一部の態様では、本明細書は、電気穿孔による形質転換、化学的に誘導される形質転換(例えば、二価カチオン、例えば、Mg2+の存在下での形質転換)、コンジュゲーション、微粒子銃、アグロバクテリウム形質転換、ナノスパイク形質転換およびウイルス形質転換(例えば、ファージ形質転換)を提供する。
一部の実施形態では、本明細書のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi媒介性遺伝子移入を含む様々な技法のいずれかを使用して、Corynebacterium宿主細胞に導入され得る。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔が挙げられる(Davis et al., 1986 ”Basic Methods in Molecular Biology”;Van der Rest et al. Appl Microbiol Biotechnol. 1999 Oct;52(4):541−5)。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietz et al., Nucleic Acids Res. 27:69−74 (1992);Ito et al., J. Bacterol. 153:163−168 (1983);およびBecker and Guarente, Methods in Enzymology 194:182−187 (1991)を参照されたい。一部の実施形態では、形質転換された宿主細胞は、組換えCorynebacterium宿主株と呼ばれる。
一部の実施形態では、本明細書は、Apparatuses and methods for electroporationと題するPCT/US2017/040114に記載されるような96ウェルプレートロボット工学プラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する、細胞のハイスループット形質転換を提供する。
一部の実施形態では、外因性タンパク質(例えば、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチド)を細胞に導入するための方法が必要とされる。タンパク質/RNA/DNAの直接的トランスフェクションまたはDNA形質転換とその後のRNAおよびタンパク質の細胞内発現を含む、これを達成するための様々な方法が、以前に記載されている(例えば、Dicarlo et al., Nucleic Acids Res 41:4336−43 (2013);Ren et al., Gene 195:303−311 (1997);Lin et al. Elife 3:e04766 (2014)を参照されたい)。
一部の実施形態では、本明細書は、上述した1つまたは複数の選択マーカーで形質転換された細胞をスクリーニングすることを提供する。そのような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー(KanR)を含むベクターで形質転換された細胞は、有効量のカナマイシン抗生物質を含む培地上で平板培養される。カナマイシン添加培地上で視認できるコロニー形成単位は、ベクターカセットをそれらのゲノムに組み込んでいると推定される。所望の配列の挿入は、関連する挿入部位のPCR、制限酵素分析および/またはシーケンシングを介して確認することができる。
当業者は、遺伝子発現のためのウイルスベクターまたはプラスミドが、本明細書に開示の配列および/または複合体を送達するために使用され得ることを容易に認識する。ウイルス様粒子(VLP)は、組換え発現のために核酸もしくは核タンパク質複合体をカプセル封入するために使用され得、または本明細書に開示の精製されたリボ核タンパク質複合体は、電気穿孔、細胞(単数または複数)をVLPと接触させること、または注入を介して、細胞に提供および送達され得る。
キット
キット
一部の実施形態では、本開示は、上記方法および組成物において開示された要素のうちのいずれか1つまたは複数を含むキットを提供する。一部の態様では、キットは、CRISPR/RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)系、およびキットを使用するための使用説明書を含む。一部の態様では、CRISPR/RNAガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド(例えば、Cas9)系は、第1のガイドRNAを発現させるための配列に作動可能に連結したプロモーター、ならびに各々がCorynebacterium標的配列に相同な上流の相同性アーム配列および下流の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドであって、前記上流の相同性アーム配列および前記下流の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、前記第1のドナーポリヌクレオチド、ならびに必要に応じて、宿主Corynebacterium株にこれもまた直接組み込まれ得るRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドを含む、プラスミドを含む。ドナーポリヌクレオチドおよび/またはRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチドは、ガイドRNAと同じまたは別々のプラスミド上にコードされ得る。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、線形または環状断片として提供され得る。
要素は、個々にまたは組み合わせて提供され得、任意の適切な容器、例えば、バイアル、ボトル、管またはマルチウェルプレート(例えば、96ウェル、384ウェルまたは1536ウェルプレート)中に提供され得る。一部の態様では、キットは、1つまたは複数の言語、例えば、1つよりも多い言語での使用説明書を含む。
一部の態様では、キットは、本明細書に記載の要素(例えば、精製されたRNAガイド型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)ポリペプチド)のうちの1つまたは複数を利用するプロセスにおける使用のための1つまたは複数の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器中に提供され得る。例えば、キットは、1つまたは複数の反応または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に1つもしくは複数の他のコンポーネントの添加を必要とする形態で(例えば、濃縮または凍結乾燥された形態で)提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Tris緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、およびそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない任意の緩衝液であり得る。一部の態様では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の態様では、緩衝液は、約7〜約10のpHを有する。一部の態様では、キットは、crRNA配列および調節エレメントを作動可能に連結するために、ベクター中への挿入のためのcrRNA配列に対応する1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。
ここまで本発明を一般に記載してきたが、特記しない限り、例として提供され本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解される。
本明細書で引用される各定期刊行物、特許および他の文書または参考文献は、その全体が参照により本出願に組み込まれている。
(実施例1)
Cas9は、機能的なガイドRNAと併せて発現された場合、C.glutamicumにおいて致死DSBを誘導することができる
Streptomycesへのコドンバイアスを有するStreptococcus pyogenes由来のCas9遺伝子(Cobb et al. ACS Synth. Biol. 4, 723−728 (2015))を合成し、Ptrcプロモーターに連結し、Cas9の発現のためにNRRL−B11474 Corynebacterium glutamicumに組み込んだ。
Cas9は、機能的なガイドRNAと併せて発現された場合、C.glutamicumにおいて致死DSBを誘導することができる
Streptomycesへのコドンバイアスを有するStreptococcus pyogenes由来のCas9遺伝子(Cobb et al. ACS Synth. Biol. 4, 723−728 (2015))を合成し、Ptrcプロモーターに連結し、Cas9の発現のためにNRRL−B11474 Corynebacterium glutamicumに組み込んだ。
Cas9活性を、Cas9をcg0443〜cg0444遺伝子座に組み込んだ株において試験した。修復が無効である場合、二本鎖切断(DSB)は致死であるので、数個のエスケープ変異体以外にコロニーは形成しないと予測された(図1)。図1に示されるように、ガイドRNA発現を駆動するプロモーターとしてPcg2613を有するプラスミドの形質転換後、得られたCas9 DSBの致死効果が実証され、よって、Cas9は、NRRL−B11474 C.glutamicumにおいて機能的であった。図2は、機能性sgRNAの致死効果が、目的の様々な遺伝子座で一般化できることを実証している。
(実施例2)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − SNP導入
(実施例2)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − SNP導入
使用するCas9およびガイドRNAの機能性を首尾よく実証した後で、単一のプラスミド上に一緒にコードされる検証されたガイドRNAおよび対応するドナーポリヌクレオチドを使用して、3つの試験遺伝子座においてSNPを導入するためのプラスミドを設計した。SNPを導入するために使用した構成の概略図は、図3のパネルAに示される。標的化されたSNPは、PAM領域を変更する各遺伝子座中の単一の変異であった。PAM領域における標的SNPは、CRISPR/Cas9複合体による改変されたゲノムの続く切断を防止する。これらの結果を、Cas9を含みガイドRNAのみを発現する株、ならびに組み込まれたCas9を有さないがCas9が組み込まれた株において使用されるのと同一のガイドRNAおよびドナー断片を含むプラスミドを有するNRRL−B11474 C.glutamicumと比較した。
ガイドRNA/ドナーDNAプラスミドによる形質転換からのコロニーを、コロニーPCRおよびNGS配列分析を介して試験した。1つのNGSカバレッジプロットの例は、図6に示される。3つの遺伝子座(rpsL、cg0167およびcg3404)を、SNP導入を試験するために選択した。ガイドRNA/PAM部位変異を含むドナーDNAプラスミドで形質転換されたコロニーのパーセントは、44%(rpsL)、87.5%(cg0167)および75%(cg3404)であった(図7)。試験遺伝子座の範囲はゲノムにおよび、既知および未知の機能の様々な遺伝子を示し、これは、ゲノム編集のこの方法が、広い範囲の遺伝子標的に一般化可能であることを示している。
(実施例3)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 遺伝子欠失
(実施例3)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 遺伝子欠失
cg3031遺伝子座からの702bpの欠失を試験した。C.glutamicumにおいてcg3031 ORFをノックアウトするためのストラテジーの概要は、図4のパネルAに提供される。上記実施例と同様、Cas9をゲノムに組み込んだ;cg3031 ORFに対する340bpの左のアーム相同性および400bpの右アーム相同性ならびにガイドRNAカセットを含むドナーポリヌクレオチドを、単一のプラスミド上で導入した。cg3031の702bp領域の除去は、図13に示されるように、PCRによって検出可能であった。1648bpのバンドは、野生型ゲノムを示す;一方で、946bpのバンドは、改変されたゲノムを示す。形質転換後に生じたコロニーの分析により、8つのコロニーのうちの6つにおいて、cg3031遺伝子座からの702bpの欠失の存在が実証された。
(実施例4)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 小さい挿入
(実施例4)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 小さい挿入
ポリヌクレオチドを、図5に示されるように、3つの遺伝子座において100bpを挿入するように設計した。各挿入を、標的化されたプロトスペーサーの20bpを欠失させ、100bpの挿入で置き換えるように設計した。挿入を、3つの遺伝子座(gdhA、cg3031およびcg3404)を標的化するように設計した。ドナー断片は、25、50、75、100、ならびに125、500および2000bpの相同性アームの長さを含んだ。各ドナー断片を有するポリヌクレオチドを、組み込まれたCas9を有するNRRL−B11474 C.glutamicumに形質転換した。3つすべての遺伝子座が、挿入によって首尾よく編集された(図9)。500bpを有する相同性アームは、3つすべての試験遺伝子座において挿入を生じさせることができたが、より短い相同性のアームは、遺伝子座を横断して変動性を示した(図9)。
(実施例5)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 複数の遺伝子座における複数の同じ場所に位置するSNPの首尾よい同時導入
(実施例5)
CRISPR/Cas9ゲノム編集 − 複数の遺伝子座における複数の同じ場所に位置するSNPの首尾よい同時導入
標的SNPがPAM領域の外側の位置にある場合、または複数のSNPが望ましい場合、複数の同じ場所に位置するSNPが、同じドナー断片上に導入され得る。複数の同じ場所に位置するSNPの同時導入を調査するために、ドナー断片を、cg0167およびcg3404試験遺伝子座において2つの同時SNPを導入し、rpsL試験遺伝子座において3つの同時編集を導入するために設計した。cg0167を標的化するドナー断片は、PAM領域をスクランブルする1つのSNPおよびPAMから10bp離れた別のSNPからなる。cg3404を標的化するドナー断片は、PAM領域をスクランブルする1つのSNPおよびPAMから70bp離れた別のSNPを含む。rpsLドナー断片は、PAM領域をスクランブルする1つのSNP、プロトスペーサーのシード領域中の別のSNP(PAMの10bp下流)、およびPAMから65bp離れた別のSNPを含む。PAMおよびシード領域における標的SNPは、CRISPR/Cas9複合体による改変されたゲノムのさらなる切断を防止する。編集されたおよび未編集のコロニーの配列分析からのカバレッジプロットは、図6に示され、rpsL遺伝子座における3つのSNPの首尾よい共導入を実証している。複数のSNPが、3つすべての遺伝子座において首尾よく導入された(図7)。
(実施例6)
CRISPR/Cas9編集効率は、プラスミドにコードされるドナーポリヌクレオチド中の相同性アームの長さに依存して変動する
(実施例6)
CRISPR/Cas9編集効率は、プラスミドにコードされるドナーポリヌクレオチド中の相同性アームの長さに依存して変動する
標的化されたSNPおよび挿入を、異なる長さの相同性アームを用いて3つの遺伝子座において試験した。ドナー断片は、25、50、75、100および125bpの、左および右の対称な相同性アームの長さを含んだ。標的SNPを、3つの試験遺伝子座(cg0167、cg3404およびrpsL)において生成したところ、より長い相同性アームは、編集されたコロニーのより高いパーセンテージを生じた(図8)。SNP編集を、1つの遺伝子座(rpsL)における25bpの小ささの相同性アームを用いて実証した。挿入を、代替的セットの3つの遺伝子座(cg3031、cg3404およびgdhA)においても試験した。より長い相同性アームは、編集されたコロニーのより高いパーセンテージを生じた(図9)。1つの遺伝子座(gdhA)において首尾よい挿入を生じた最も小さい相同性アームの長さは、75bpであった。
(実施例7)
形質転換効率は、複製起点に依存し、C.glutamicumのNRRL−B11474株においてユニークである
(実施例7)
形質転換効率は、複製起点に依存し、C.glutamicumのNRRL−B11474株においてユニークである
5つのC.glutamicum複製起点のパネルを、プラスミドへと構築し、WT NRRL−B11474 C.glutamicumに形質転換して、形質転換効率を試験した(図14)。複製起点pCASE1およびpCG1は、高い数のコロニーおよび許容できる形質転換効率を生じた。起点pBL1、pCC1およびpNG2は、コロニーをほとんど生じず、無視できる形質転換効率を生じた。pBL1、pCC1およびpNG2と比較したpCASE1およびpCG1の形質転換効率における差異は、統計的に有意である。これらの結果は、C.glutamicumの一部の株における前者の複製起点の報告された使用とは対照的である。本明細書に示されるデータは、様々な複製起点が、C.glutamicumの異なる工業的に適切な株において異なる形質転換効率を示すことを示唆している。起点pCASE1およびpCG1を、NRRL−B11474における編集効率に対するプラスミド複製起点の影響を調査するさらなる研究へと進めた。首尾よい形質転換体は、この系における首尾よい編集の必要条件であるので、編集効率は、起点pBL1、pCC1およびpNG2について無視できると予測される。
(実施例8)
複製起点は、編集効率に影響を与える
(実施例8)
複製起点は、編集効率に影響を与える
ポリヌクレオチドコピー数は、ガイドRNAの発現レベルおよびドナー断片の送達に影響を与え得る。複製起点が編集効率に対して影響を有するかどうかを調査するために、2つのC.glutamicum複製起点(pCASE1およびpCG1)を、標的遺伝子座に特異的なガイドRNA、およびSNPのいずれかの側の125bpの相同性または挿入のいずれかの側の500bpの相同性を含むドナー断片を含むポリヌクレオチド中に含めた。プラスミドを、組み込まれた構成的に発現されるCas9遺伝子のコピーを有するC.glutamicum NRRL−B11474株に形質転換し、最大で8つのコロニーを、NGSによるスクリーニングのために選んだ。2つの生物学的再現を、各編集コンストラクトについて平均した。複製起点は、編集効率に対して有意な影響を有し、pCASE1は、pCG1よりも有意に高い編集効率を示した(図12)。
(実施例9)
PCRドナーポリヌクレオチドと併せたRecETの発現は、所望の編集の首尾よい組込みを生じる
(実施例9)
PCRドナーポリヌクレオチドと併せたRecETの発現は、所望の編集の首尾よい組込みを生じる
編集を生成するために使用され得る構成は、複製性プラスミド上のガイドRNAおよびPCR産物としてのドナー断片の送達を含む。これらのコンポーネントを、RecETに作動可能に連結した誘導性プロモーターを含むヘルパープラスミド(pRecET)を含む株バックグラウンドに形質転換した(図10)。PCR産物を、cg3404において2つのSNPを生じさせるように設計した。PCRドナーおよびガイドRNAプラスミドを、WT、組み込まれたCas9、pRecETを含むWT、およびpRecETを含む組み込まれたCas9に形質転換した。コロニーを、コロニーPCRを介してスクリーニングし、Sangerシーケンシングして、SNPまたはノックアウトが首尾よく生じたかどうかを決定した。SNPおよびノックアウトは、組み込まれたCas9およびpRecETを有する株でのみ首尾よく生成された(図11)。
(実施例10)
プラスミドベースのドナーポリヌクレオチドを使用する、cg3404およびrpsLにおける多重化並行SNP編集
(実施例10)
プラスミドベースのドナーポリヌクレオチドを使用する、cg3404およびrpsLにおける多重化並行SNP編集
以前の報告は、複数のCRISPR Cas9媒介性編集を並行して導入することが、非効率的なプロセスであることを示唆している。1つの実験(図15)では、2つの対をなすsgRNAおよびドナー断片を、組み込まれたCas9遺伝子を有する株に形質転換した単一のプラスミド上に含めた。スクリーニングしたコロニーのうち、この実験における2編集コンストラクトのうちの1つからのrpsLおよびcg3404における同時編集が観察された(図15中のNGS読み取りによって示される通り)。別の構成では、異なる誘導性プロモーターの制御下に複数のsgRNA/ドナー断片対を含む単一のプラスミドが、Cas9発現株に形質転換され得る。次いで、一連の編集の各々が、一連のsgRNAの各々の発現を連続的に誘導することによって導入され得る。なお別の構成では、親株は、複数の修復断片を含み対応するgRNAを含まないプラスミドで形質転換され得る。次いで、修復断片を含む形質転換体は、既に存在する修復断片に対応するgRNA(単数または複数)を含むプラスミドで形質転換され得る。
(実施例11)
反復CRISPR編集による積み重ねゲノム編集
(実施例11)
反復CRISPR編集による積み重ねゲノム編集
以前の報告および本発明者らのデータは、複数の編集を導入することが非効率的であること]]、複数のCRISPR Cas9媒介性編集を並行して導入することが、非効率的なプロセスであることを示唆している。
1つの代替法は、複数の編集を順次組み込むことである。1つのそのような構成では、単一のsgRNA/ドナー断片対を有し、プラスミド除去のためのエレメントを含むプラスミドが、Cas9発現株に導入され得る。形質転換および編集の後、プラスミドは除去され得、異なるsgRNA/ドナー断片対を含む第2のプラスミドが、第2の編集を導入するために形質転換され得る。次いで、コロニーは、すべての意図した編集の組込みを検証するためにアッセイされ得る。
* * *
本開示は、好ましい実施形態を参照して記載されてきたが、様々な変化が行われ得、本開示の範囲から逸脱することなしに特定の状況に適合するように、等価物がその要素を置換し得ることが、当業者によって理解される。したがって、本開示は、本開示を実施するために企図されるベストモードとして開示された特定の実施形態に限定されないが、本開示は、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に入るすべての実施形態を含むことを意図する。
* * *
本開示は、好ましい実施形態を参照して記載されてきたが、様々な変化が行われ得、本開示の範囲から逸脱することなしに特定の状況に適合するように、等価物がその要素を置換し得ることが、当業者によって理解される。したがって、本開示は、本開示を実施するために企図されるベストモードとして開示された特定の実施形態に限定されないが、本開示は、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に入るすべての実施形態を含むことを意図する。
Claims (81)
- Corynebacterium宿主を遺伝子改変するための方法であって、Corynebacterium種を、第1のガイドRNAを発現させるための配列に作動可能に連結した第1のプロモーターを含む第1のプラスミドで形質転換するステップと、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、ステップと、前記第1のガイドRNAを、前記宿主中で、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて発現させるステップとを含む、方法。
- Corynebacterium宿主を遺伝子改変するための方法であって、Corynebacterium種を、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第1のプロモーターを含む第1のプラスミドで形質転換するステップと、第1のガイドRNAを提供するステップと、前記宿主中で、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドと併せて発現させるステップであって、前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、ステップとを含む、方法。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1およびMAD7、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のガイドRNAが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項2に記載の方法。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項1または3から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、前記Corynebacterium種のゲノムに組み込まれる、請求項1または3から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Corynebacterium種が、Corynebacterium glutamicumである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Corynebacterium glutamicumが、Corynebacterium glutamicum株NRRL−B11474である、請求項9に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、pCASE1複製起点(配列番号1)およびpCG1複製起点(配列番号2)からなる群から選択される複製起点を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、pCASE1複製起点を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、pCG1複製起点を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記第1のプラスミド上に提供される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、第2のプラスミド上に提供される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、直線状断片として提供される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、前記第1のプロモーターに作動可能に連結した前記第1のガイドRNAまたは1つもしくは複数の追加のガイドRNA、あるいは第2のプロモーターに作動可能に連結した1つまたは複数の追加のガイドRNAをさらにコードする、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが構成的である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが誘導性である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプロモーターが構成的である、請求項17に記載の方法。
- 前記第2のプロモーターが誘導性である、請求項17に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが誘導性である、請求項17に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが、示差的に誘導性である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記第1のプラスミド上に提供され、前記第1のプラスミドが、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列(単数または複数)および右の相同性アーム配列(単数または複数)を有する1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のドナーポリヌクレオチド(単数または複数)が各々、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、請求項14または17から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記第2のプラスミド上に提供され、前記第2のプラスミドが、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列(単数または複数)および右の相同性アーム配列(単数または複数)を有する1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のドナーポリヌクレオチド(単数または複数)が各々、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、請求項15または17から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドまたは前記第2のプラスミドが、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼをコードする、請求項24または25に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの変異配列が、
a.単一ヌクレオチド挿入;
b.2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;
c.1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;
d.単一ヌクレオチド欠失;
e.2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;
f.1つまたは複数のコード配列の欠失;
g.単一ヌクレオチドの置換;
h.2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;
i.2つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/または置換;ならびに
j.それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの変異配列が、a)〜j)に従う複数の変異を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記複数の変異が、同じドナーポリヌクレオチド配列上にコードされる、請求項28に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの変異配列が、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはシード領域の変異を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記Corynebacterium宿主が、構成的または誘導性プロモーターに連結した配列を含み、前記配列が、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した配列を含み、前記配列が、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドが、Cas9エンドヌクレアーゼポリペプチドである、請求項32に記載の方法。
- 前記相同性アーム配列が、少なくとも25塩基対、好ましくは少なくとも75塩基対、より好ましくは少なくとも150、200、250または300塩基対、なおより好ましくは少なくとも350、400、450、500または2,000塩基対である、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターが、内在性、異種、合成、誘導性および構成的プロモーターからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターがPcg2613である、請求項35に記載の方法。
- 前記第1のガイドRNAが、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のガイドRNAが、シングルgRNA(sgRNA)を含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のガイドRNAが、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)ならびに少なくとも20ヌクレオチドの第1のスペーサー配列を含み、前記第1のスペーサー配列が、前記Corynebacterium標的配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%相補的である、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
- 2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNAの発現を順次誘導するステップであって、それによって、前記Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも1つが、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む;または前記2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの2つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む、請求項40に記載の方法。
- 2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNA/ドナーポリヌクレオチド対を、異なる誘導性プロモーターの制御下で順次発現させるステップであって、それによって、前記Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入するステップを含み、一連の編集が、一連のガイドRNA/ドナーポリヌクレオチド対の各対の発現を連続的に誘導することによって導入される、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Corynebacterium宿主において2つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドを発現させるステップと、前記宿主中に既に存在する修復断片に対応するgRNA(単数または複数)を順次提供するステップであって、それによって、前記Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入する、ステップとを含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 2つまたはそれよりも多くの異なるガイドRNAを同時に発現させるステップであって、それによって、前記Corynebacterium宿主の2つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドが、対抗選択マーカーを含み、前記方法が、前記対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、前記第1のプラスミドの前記Corynebacterium宿主をキュアリングする、ステップを含む、請求項1から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプラスミドの前記対抗選択マーカーが不利になるように選択する前記ステップが、前記宿主中で、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、前記第1のガイドRNAを用いて前記Corynebacterium宿主を遺伝子改変した後、かつ前記宿主中で、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第2のガイドRNAを用いて前記Corynebacterium宿主を遺伝子改変する前に実施される、請求項45に記載の方法。
- 前記2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも1つが、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含み;または前記2つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの2つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および/もしくは置換を含む、請求項42から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主において1つまたは複数の異種組換え系からタンパク質のセットを発現させるステップを含む、請求項1から47のいずれか一項に記載の方法。
- ラムダレッド組換え系、Rec ET組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはRec ET組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを発現させるステップを含む、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
- a.第1のガイドRNAに作動可能に連結した第1のプロモーターを含む第1のプラスミド;ならびに
b.右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Corynebacteriumゲノム中の標的配列に相同である、第1のドナーポリヌクレオチド
を含むCorynebacterium宿主であって、
RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて前記第1のガイドRNAを発現する、Corynebacterium宿主。 - a.RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第1のプロモーターを含む第1のプラスミド;および
b.第1のガイドRNA
を含むCorynebacterium宿主であって、
前記宿主が、前記宿主中で、各々がCorynebacterium標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第1のドナーポリヌクレオチドと併せて、前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現し、前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも1つの変異配列を含む、Corynebacterium宿主。 - 前記Corynebacterium宿主が、Corynebacterium glutamicum宿主である、請求項50または請求項51に記載の宿主。
- 前記Corynebacterium glutamicum宿主が、Corynebacterium glutamicum株NRRL−B11474である、請求項52に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1およびMAD7、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される、請求項50から53のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項50から53のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項50、52から55のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼが、前記Corynebacterium種のゲノムに組み込まれる、請求項50、52から55のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプラスミドが、pCASE1複製起点およびpCG1複製起点からなる群から選択される複製起点を含む、請求項50から57のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプラスミドが、pCASE1複製起点を含む、請求項58に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記第1のプラスミド上に提供される、請求項50から59のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、第2のプラスミド上に提供される、請求項50から59のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、直線状核酸断片として提供される、請求項50から59のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプラスミドが、前記第1のプロモーターに作動可能に連結した前記第1のガイドRNAまたは1つもしくは複数の追加のガイドRNA、あるいは1つまたは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した1つまたは複数の追加のガイドRNAをさらにコードする、請求項50から62のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、前記第1のプラスミド上に提供され、前記第1のプラスミドが、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項60または63のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、第2のプラスミド上に提供され、前記第2のプラスミドが、1つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項61または63のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のドナーポリヌクレオチドが、
a)単一ヌクレオチド挿入;
b)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;
c)1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;
d)単一ヌクレオチド欠失;
e)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;
f)1つまたは複数のコード配列の欠失;
g)単一ヌクレオチドの置換;
h)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;
i)2つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/または置換;ならびに
j)それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの変異配列を含む、請求項50から65のいずれか一項に記載の宿主。 - 前記宿主が、第2のドナーポリヌクレオチドを含み、前記第2のドナーポリヌクレオチドが、
k)単一ヌクレオチド挿入;
l)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入;
m)1つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入;
n)単一ヌクレオチド欠失;
o)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失;
p)1つまたは複数のコード配列の欠失;
q)単一ヌクレオチドの置換;
r)2つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換;
s)2つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および/または置換;ならびに
t)それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの変異配列を含む、請求項66に記載の宿主。 - 前記少なくとも1つの変異配列が、RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはシード領域の変異を含む、請求項66または67に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結したRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列から発現される、請求項50から68のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプラスミドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む、請求項50から68のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列が、Corynebacterium種における発現のために最適化されたコード配列を含む、請求項70に記載の宿主。
- 前記右および左の相同性アーム配列が、少なくとも25塩基対、好ましくは少なくとも150、200、250または300塩基対、より好ましくは少なくとも350、400、450、500、550または600塩基対である、請求項50から71のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプロモーターが、内在性Corynebacteriumプロモーター、前記Corynebacterium宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される、請求項50から72のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプロモーターがPcg2613である、請求項73に記載の宿主。
- 前記第1のガイドRNAが、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む、請求項50から74のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のガイドRNAが、シングルgRNA(sgRNA)を含む、請求項50から74のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のガイドRNAが、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化RNA(tracrRNA)ならびに少なくとも20ヌクレオチドの第1のスペーサー配列を含み、前記第1のスペーサー配列が、前記Corynebacterium標的配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または100%相補的である、請求項50から74のいずれか一項に記載の宿主。
- 少なくとも2つの異なるガイドRNA配列に作動可能に連結した少なくとも2つの異なる誘導性プロモーターを含む、請求項50から77のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記第1のプラスミドが、対抗選択マーカーを含む、請求項50から78のいずれか一項に記載の宿主。
- 前記宿主中に1つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む、請求項50から79のいずれか一項に記載の宿主。
- ラムダレッド組換え系、Rec ET組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはRec ET組換え系からのタンパク質の任意の相同体、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項50から80のいずれか一項に記載の宿主。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862628166P | 2018-02-08 | 2018-02-08 | |
US62/628,166 | 2018-02-08 | ||
US201862701979P | 2018-07-23 | 2018-07-23 | |
US62/701,979 | 2018-07-23 | ||
PCT/US2019/017276 WO2019157326A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-02-08 | Genome editing using crispr in corynebacterium |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021512617A true JP2021512617A (ja) | 2021-05-20 |
Family
ID=65494671
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020542549A Pending JP2021512617A (ja) | 2018-02-08 | 2019-02-08 | CorynebacteriumにおいてCRISPRを使用するゲノム編集 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20200362346A1 (ja) |
EP (1) | EP3749764A1 (ja) |
JP (1) | JP2021512617A (ja) |
KR (1) | KR20200119239A (ja) |
CN (1) | CN111699254A (ja) |
CA (1) | CA3087715A1 (ja) |
WO (1) | WO2019157326A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2018229351B2 (en) | 2017-02-28 | 2024-01-04 | Vor Biopharma, Inc. | Compositions and methods for inhibition of lineage specific proteins |
US11389485B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-07-19 | Vor Biopharma Inc. | Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof |
WO2020081438A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Blueallele, Llc | Methods for targeted insertion of dna in genes |
JP2022526982A (ja) * | 2019-04-05 | 2022-05-27 | ダニスコ・ユーエス・インク | 線状組換えDNAコンストラクトを使用してバチルス(Bacillus)のゲノムにドナーDNA配列を組み込むための方法及びその組成物 |
KR20220093324A (ko) * | 2019-11-07 | 2022-07-05 | 칭다오 킹아그루트 케미컬 컴파운드 컴퍼니 리미티드 | 유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법 및 그 활용 |
EP4065701A4 (en) * | 2019-11-27 | 2023-11-29 | Danmarks Tekniske Universitet | CONSTRUCTS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF WITH IMPROVED GENOMEDITING EFFICIENCY AND SPECIFICITY |
AU2022324093A1 (en) * | 2021-08-02 | 2024-02-08 | Vor Biopharma Inc. | Compositions and methods for gene modification |
CN114480467B (zh) * | 2022-02-24 | 2023-08-25 | 江南大学 | 一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR-cpf1筛选工具 |
CN117264990B (zh) * | 2023-11-20 | 2024-02-06 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种时序性调控RecET和Cas12a表达的谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒及编辑方法 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LT3401400T (lt) | 2012-05-25 | 2019-06-10 | The Regents Of The University Of California | Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
PT2921557T (pt) | 2012-12-12 | 2016-10-19 | Massachusetts Inst Technology | Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências |
ES2576128T3 (es) | 2012-12-12 | 2016-07-05 | The Broad Institute, Inc. | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales |
DK2898075T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-27 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION |
WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
EP4234696A3 (en) | 2012-12-12 | 2023-09-06 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
IL243475B2 (en) | 2013-07-09 | 2023-11-01 | Harvard College | Multiplex RNA-guided genome engineering |
US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
US20180142236A1 (en) | 2015-05-15 | 2018-05-24 | Ge Healthcare Dharmacon, Inc. | Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing |
KR20180008572A (ko) | 2015-05-15 | 2018-01-24 | 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 | Cas 엔도뉴클레아제 시스템, pam 서열 및 가이드 rna 요소의 신속한 특성화 |
WO2017015101A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | University Of Washington | Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction |
ES2929110T3 (es) | 2015-08-25 | 2022-11-24 | Univ Duke | Composiciones y métodos para mejorar la especificidad en ingeniería genética usando endonucleasas guiadas por ARN |
JP6799586B2 (ja) | 2015-08-28 | 2020-12-16 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 遺伝子操作CRISPR−Cas9ヌクレアーゼ |
DK3362560T3 (da) | 2015-10-12 | 2022-11-07 | Dupont Us Holding Llc | Beskyttede dna-templater til genmodificering og forøget homolog rekombination i celler og fremgangsmåder til anvendelse |
BR112018010429A2 (pt) | 2015-12-04 | 2018-11-27 | Caribou Biosciences, Inc. | ácidos nucleicos que se direcionam a ácidos nucleicos engenheirados |
WO2017147056A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Caribou Biosciences, Inc. | Methods for modulating dna repair outcomes |
WO2017155717A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel cas9 systems and methods of use |
CN106701810B (zh) * | 2016-12-12 | 2020-04-21 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统及其应用 |
-
2019
- 2019-02-08 CN CN201980012131.2A patent/CN111699254A/zh active Pending
- 2019-02-08 JP JP2020542549A patent/JP2021512617A/ja active Pending
- 2019-02-08 WO PCT/US2019/017276 patent/WO2019157326A1/en unknown
- 2019-02-08 KR KR1020207021542A patent/KR20200119239A/ko unknown
- 2019-02-08 EP EP19706232.6A patent/EP3749764A1/en not_active Withdrawn
- 2019-02-08 CA CA3087715A patent/CA3087715A1/en active Pending
-
2020
- 2020-07-30 US US16/943,761 patent/US20200362346A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-08-03 US US17/817,223 patent/US20230074594A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3749764A1 (en) | 2020-12-16 |
CA3087715A1 (en) | 2019-08-15 |
WO2019157326A1 (en) | 2019-08-15 |
US20230074594A1 (en) | 2023-03-09 |
CN111699254A (zh) | 2020-09-22 |
KR20200119239A (ko) | 2020-10-19 |
US20200362346A1 (en) | 2020-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200362346A1 (en) | Genome editing using crispr in corynebacterium | |
US11555187B2 (en) | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex | |
US10590415B2 (en) | Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids | |
TWI780847B (zh) | 新穎之cho整合位點及其用途 | |
US11713471B2 (en) | Class II, type V CRISPR systems | |
US10913941B2 (en) | Enzymes with RuvC domains | |
JPH11507236A (ja) | 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング | |
WO2018148511A1 (en) | A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts | |
JP2020503899A (ja) | 遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入のための方法 | |
US20230340481A1 (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
WO2019173248A1 (en) | Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids | |
US11685934B2 (en) | Methods for genomic integration for Kluyveromyces host cells | |
US20220220460A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
AU2022284808A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
AU2021333586A1 (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
CN116615547A (zh) | 用于对货物核苷酸序列转座的系统和方法 | |
KR20040036371A (ko) | 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조를 위한선형 dna 단편 및 이를 이용한 염색체의 특정부위가제거된 미생물 변이주의 제조방법 |