KR20220093324A - 유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법 및 그 활용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전 공학 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 인공적인 DNA 주형을 사용하지 않는 유기체의 부위-특이적 돌연변이를 발생시키는 방법과 그의 용도에 관한 것이다. 방법은 다음 단계를 포함한다: 유기체의 지놈의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 이를 각각 자발적으로 복구하는 단계로서, 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초한 것인 단계. 본 발명은, 순차적 편집에 의한 새로운 DNA 복구에 의해 형성된 서열을 기반으로 새로운 표적을 설계함으로써, 지놈의 특정 부위에 돌연변이를 여러 번 순차적으로 발생시킬 수 있어, DNA 절단 이후의 복구 유형을 매우 다양하게 하며, 단일 유전자 편집에서 얻을 수 없는 새로운 염기 치환, 결실 및 삽입 돌연변이를 실현한다.

Description

유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법 및 그 활용
본 발명은 유전 공학 기술 분야에 관한 발명으로, 구체적으로 인공 DNA 주형 없이 유기체에서 부위-특이적 돌연변이를 발생시키는 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
우선권 정보
본 발명은 2019년 11월 7일에 출원된 중국 특허출원 제201911081617.X호, 2020년 8월 15일에 출원된 중국 특허출원 제202010821877.2호, 및 2020년 9월 16일에 출원된 중국 특허출원 제202010974151.2호에 대하여 우선권을 주장한다. 상기 출원은 본 출원에 전체로서 참조로 포함된다.
유기체의 지놈을 변형시키는 유전공학 기술은 제약 및 화학 분야에서 일반적으로 사용되는 유전자 변형 미생물, 농업 분야에서 내충성 및 제초제 저항성을 갖는 유전자 변형 작물과 같이 산업 및 농업 생산에 널리 사용되어 왔다. 부위 특이적 뉴클레아제의 출현으로 수용 유기체의 지놈에 표적 단편화를 도입하고 자발적인 복구를 일으키면서 지놈의 부위 특이적 편집 및 더욱 정확한 지놈 변형을 달성할 수 있게 되었다.
유전자를 편집하는 수단으로 주로 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 및 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 관련 Cas 시스템(CRISPR/Cas 시스템)의 세 가지 유형의 서열 특이적 뉴클레아제(sequence-specific nuclease, SSN)가 포함된다. 서열 특이적 뉴클레아제는 지놈의 특정 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)을 생성할 수 있게 프로그램 될 수 있는 뉴클레아제이다. DNA 이중 가닥 절단은 세포의 DNA 손상을 복구하기 위한 내인성 DNA 복구 경로(endogenous DNA repair pathway)를 활성화하지만, 복구 과정은 쉽게 표적 부위의 DNA 서열 변화로 이어져 관심 부위에 돌연변이가 도입된다. 이 기술을 통해 생물학자는 표적 유전자를 정확하게 표적화하고 편집할 수 있다. 이 중 ZFN과 TALEN은 모두 표적 서열에 대한 특이적 인식 단백질 모듈을 설계해야 하므로 처리량이 낮고 작업이 복잡하다. 그러나 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 보편적이며, 표적부위를 위해 설계된 특정 CRISPR-RNA(crRNA) 단독 또는 전사활성화RNA(tracrRNA)와의 결합으로 가이드RNA(gRNA)가 형성될 수 있으며, 단일가이드RNA(sgRNA)만으로도 충분하며, crRNA와 tracrRNA를 함께 사용하거나 sgRNA 단독으로 Cas 단백질과 조립되어 리보핵단백질 복합체(ribonucleoprotein complex, RNP)를 형성할 수 있으며, 프로토스페이서 인접 모티프(Protospacer Adjacent motif, PAM)를 기반으로 표적서열이 식별되어 지놈에서 부위 특이적 편집을 실현한다. 따라서 간단한 조작, 넓은 적용 범위 및 높은 처리량으로 인해 주요 유전자 편집 수단이 되었다.
서열 특이적 뉴클레아제는 지놈의 특정 부위에서 DNA 이중 가닥 절단을 생성할 수 있다. 이러한 DNA 이중 가닥 절단은 다양한 유형으로 복구될 수 있으며 주로 염기 삽입 또는 결실 유형으로 복구된다. 예를 들어, 가장 일반적인 두 가지 유형의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 이벤트는 DNA 절단부위의 염기 삽입 또는 결실이다(Shen et al. 2018. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature. DOI: 10.1038/s41586-018-0686-x). 유전자 코딩 영역에서 염기의 삽입 또는 결실은 프레임쉬프트 돌연변이(Frameshift mutation)를 일으켜 유전자 기능을 상실시킨다. 따라서 위의 유전자 편집 도구의 주요 목적은 여전히 유전자 녹아웃(gene knockout)이다.
서열 특이적 뉴클레아제 단독으로는 염기 치환 유형의 돌연변이를 달성할 수 없다고 인식되어왔다. 이를 위해 선행기술은 3가지의 해결책을 제안한다:
1) 상동 재조합 복구 경로를 개시하기 위해 외인성 DNA 단편을 복구의 주형으로써 추가하는 방법; 2) 디아미나제를 Cas9과 융합해 염기를 C에서 T로, A에서 G로 바꾸기 위한 단일 염기 편집 수단을 순차적으로 개발하는 것; 3) 역전사효소를 Cas9과 융합하고, pegRNA를 사용해 작은 DNA 가닥의 합성 및 치환을 유도하는 것. 그러나 이들 3가지 해결책의 편집 효율은 유전자 녹아웃의 효율보다 현저히 낮고, 동시에 도입된 외인성 DNA 단편 및 역전사효소는 생물학적 안전성에 대한 우려를 쉽게 야기할 수 있다. 단일 염기 편집의 표적 외 효과(off-target effect)는 또한 세포 치료에서의 잠재적인 적용을 제한한다. 특히 장기 식물 육종 프로젝트의 경우, 유전자 편집 기술 적용시 생물 안전성에 대한 규제 당국의 우려를 줄이는 동시에 대상 부위의 염기 치환 효율을 향상시키는 것이 해결해야 할 문제이다.
요약하면, 세포 치료 및 생물학적 육종 분야에서 외래 DNA 단편을 도입하지 않고 서열 특이적 뉴클레아제의 표적화된 녹아웃만을 이용하여, 특히 비-형질전환적 일시적 편집 시스템을 통한 부위 특이적 염기 치환의 효율적인 완성에 대해 시급한 기술적 요구가 있다.
본 발명은 인공 DNA 주형의 제공 없이 지놈에 이중 가닥 절단을 생성하는 것 만으로 유기체에서 부위-특이적 돌연변이를 발생시키는 방법 및 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명이 채택한 기술적 해결책은 다음과 같다:
유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법으로써, 다음과 같은 단계를 포함하는 방법: 유기체 지놈의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 이를 각각 자발적으로 복구하는 단계로서, 나중의 DNA 절단은 이전 DNA 절단 복구에서 형성된 새로운 서열에 기반한 것인 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "DNA 절단"은 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제를 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉하도록 유기체 세포 내로 전달함으로써 달성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "표적화 특성을 갖는 뉴클레아제"는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성"은 ZFN 또는 TALEN 편집에 의한 이전 DNA 절단 복구로부터 형성된 새로운 서열에 기초하여, 해당 부위를 다시 절단하기 위해 새로운 ZFN 또는 TALEN 단백질이 설계되는 것을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성"은 CRISPR/Cas 시스템에 의한 이전 DNA 절단 복구로부터 형성된 새로운 서열에 기초하여, 해당 부위를 다시 절단하기 위해 새로운 표적RNA가 설계되는 것을 지칭한다. 예를 들어, Cas9 편집의 1차 절단 복구에서 형성된 새로운 서열을 기반으로 새로운 표적RNA를 설계하여 다시 해당 부위에서 2차 절단을 수행한다. 유사한 방식으로 도 1과 같이 2차 절단 복구 등에서 형성된 새로운 서열을 기반으로 새로운 표적RNA를 설계하여 다시 해당 부위에서 3차 절단을 수행한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 상이한 표적화된 뉴클레아제를 상이한 세대의 수용 세포에 순차적으로 전달함으로써 생성되며, 이 때 이전의 편집을 완료한 돌연변이 세포는 이후의 편집에서 표적화된 뉴클레아제의 전달을 받기 위한 수용체로서 사용되고, 이에 따라 두번째 편집을 수행해 부위 특이적 돌연변이가 발생된다. 이 방법은 바람직하게는 ZFN 및 TALEN 편집 시스템에 사용된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 상이한 표적에 대한 상이한 표적화된 뉴클레아제를 동일한 수용 세포 내로 전달함으로써 생성된다. 이 방법은 바람직하게는 CRISPR/Cas 편집 시스템에 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제 및 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적 서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 각각의 gRNA 또는 sgRNA와 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 CRISPR/Cas 뉴클레아제 각각에 의해 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적 서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다. 예를 들어, Streptococcus pyogenes의 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열은 "NGG" 또는 "NAG"이다(Jinek et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacteria immunity", Science 2012, 337:816-821), Staphylococcus aureus의 Cas9이 인식하는 PAM 서열은 "NNGRRT" 또는 "NNGRR(N)"이고, Neisseria meningitidis의 Cas9이 인식하는 PAM 서열은 NNNNGATT이며, Streptococcus thermophilus의 Cas9이 인식하는 PAM 서열은 NNAGAAW이다. 이러한 방식으로 DNA 분자의 편집 가능한 창(window)이 커진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표적화된 뉴클레아제는 지놈 편집을 할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표적화된 뉴클레아제는 DNA 형태이다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표적화된 뉴클레아제는 DNA 대신 mRNA 또는 단백질의 형태이다. 단백질 형태가 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표적화된 뉴클레아제를 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중에서 선택되나 그에 국한되지는 않는다: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 5) 유전자 총 충격; 또는 6) Agrobacterium-매개 형질전환 방법.
본 발명의 방법에 따르면, 이전의 DNA 절단 복구에서 형성된 새로운 서열을 기반으로 새로운 타겟이 설계되므로 지놈의 특정 부위에 여러 번 돌연변이가 순차적으로 형성될 수 있고, DNA 절단 후의 복구 유형을 기하급수적으로 풍부하게 할 수 있으며, 단일 유전자 편집으로는 얻을 수 없는 새로운 형태의 염기 치환, 결실 및 삽입 돌연변이를 발생시켜 새로운 돌연변이를 발생시키는 도구로 사용하기에 적합하다. 이 방법은 프로그램된 순차적인 절단/편집 또는 연속적인 절단/편집 방법으로 간단히 설명될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 새로운 표적이 유기체 지놈의 특정 부위에서 이전의 절단 복구로부터 형성될 것으로 예측된 새로운 특정 서열을 기반으로 설계되고, 이어서 순차적 편집을 수행함으로써, 해당 부위에서 최종적으로 발생가능한 돌연변이를 미리 설계할 수 있고 기대되는 편집을 달성한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 새로운 표적이 유기체 지놈의 특정 부위에서 이전의 절단 복구로부터 형성될 것으로 예측된 새로운 서열을 기반으로 설계되고, 이어서 순차적 편집을 수행함으로써, 기대되는 편집 이벤트 외에, 해당 부위에서 다양한 상이한 돌연변이가 결국 발생될 수 있고, 다양한 상이한 돌연변이를 발생시키는 도구로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법을 추가로 제공한다: 유기체의 지놈 또는 염색체 수준에서 유전자의 특정 부위에 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성, 이에 의한 정확한 염기 치환, 결실 또는 삽입의 달성.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단"은 이전의 DNA 절단 복구로부터 형성된 새로운 서열에 기초하여 새로운 표적RNA가 설계되고, 동일부위에서 절단이 다시 수행되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의"DNA 절단"은 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제에 의해 달성된다.
본 발명은 전술한 방법에 의해 얻어진 새로운 돌연변이를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 새로운 돌연변이를 갖는 단백질 또는 생물학적 활성 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 다음을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다:
(a) 표적RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열으로써, 상기 표적RNA는 최소한 2개의 표적RNAs를 포함하며, 제1 표적RNA는 DNA를 표적하여 DNA 절단을 생성하고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구로 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산은 (b) Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포에 존재한다.
본 발명은 전술한 핵산 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 발현 카세트를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 숙주세포를 이용하여 재생된 유기체를 추가로 제공한다.
본 발명은 표적DNA를 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는 표적DNA 용해 방법을 추가로 제공하며, 상기 복합체는 다음을 포함한다:
(a) Cas 폴리펩타이드; 및
(b) 제1 표적RNA는 DNA를 표적하여 DNA에 절단을 일으키고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구에서 형성된 서열을 표적하여 절단을 다시 생성하는 최소한 2개의 표적RNA.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적DNA는 박테리아 세포, 진핵 세포, 식물 세포 또는 동물 세포에 존재한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적DNA는 염색체 DNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포내에 존재한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 접촉은 다음을 세포내로 도입하는 것을 포함한다: (a) Cas 폴리펩타이드 또는 Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 표적RNA 또는 표적RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드.
본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다:
(a) Cas 폴리펩타이드, 또는 Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및
(b) 최소한 2개의 표적RNA, 또는 표적RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드로써, 제1 표적RNA는 DNA를 표적하여 DNA에 절단을 일으키고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구로부터 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성하는 것.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포에 존재한다.
본 발명은 질병 치료용 약제 제조에서의 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 질환은 유전성 티로신혈증 1형, 페닐케톤뇨증, 조로증, 겸상적혈구병 등과 같은 단일 유전자 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 병원성 돌연변이 부위를 복구하여 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하게 할 것으로 기대되는 Cas 단백질 및 crRNA 또는 sgRNA 조성물을 세포내로 전달함으로써 자발적인 세포 복구가 유도되어 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 키트를 추가로 제공한다:
(a) Cas 폴리펩타이드, 또는 Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및
(b) 최소한 2개의 표적RNA, 또는 표적RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로써, 제1 표적RNA는 DNA를 표적하여 DNA에 절단을 일으키고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구로부터 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성한다.
상기 (a) 및 (b)는 동일한 용기 또는 별도의 용기에 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 RNA는 동일한 용기 또는 별도의 용기에 있다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 외인성 형질전환적 마커와 무관한 편집 이벤트를 선별하는 방법을 제공한다:
1) 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에 순차적으로 2개 이상의 DNA 절단이 생성되고 각각 자발적으로 복구되며, 이전의 DNA 절단 복구로부터 형성된 새로운 서열을 기반으로 나중의 DNA 절단이 생성되는 단계;
2) 제1 표적유전자의 특정 부위가 순차적으로 절단되고 복구된 후 특정 편집 이벤트가 생성되며, 이는 돌연변이 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 표현형으로 선별가능한 형질을 생성할 수 있고, 형질을 선별하기 위해 상응하는 선별압력이 적용되어 편집 이벤트를 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계;
3) 선택적으로, 동시에 다른 표적부위를 편집하기 위하여 제1 표적유전자에 더하여 최소한 1개의 제2 표적유전자에 표적화된 뉴클레아제가 사용되며, 제2 표적유전자의 편집은 제1 표적유전자의 돌연변이에 의해 생성된 선별가능한 형질의 선별을 통해 강화됨과 동시에 선별되며, 제1 표적유전자 및 최소한 하나의 제2 표적유전자의 편집 이벤트를 동시에 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 유전자 좌이며, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자의 특정 부위"는 순차적인 절단 및 복구 후에 특정 유형의 돌연변이가 발생되는 부위를 지칭하며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 유형의 돌연변이"는 단일 염기의 치환, 다수의 염기의 치환, 또는 불특정 수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 선별압력"은 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력일 수 있고; 예를 들어, 환경적 압력은 고온, 저온 또는 저산소증 등이고; 첨가된 화합물에 의한 압력은 염 이온 농도, 항생제, 세포독소, 제초제 등에 의한 압력일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "DNA 절단"은 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉하도록 유기체의 세포 내로 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제를 전달함으로써 달성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "표적화 특성을 갖는 뉴클레아제"는 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단이 특정 부위 서열에서 순차적으로 생성됨"이라는 특징은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 이전 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열을 기반으로 하는 것을 지칭하며, 새로운 표적RNA는 해당 부위를 다시 절단하도록 설계된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 각각 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적 서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다. 이러한 방식으로 DNA 분자의 편집 가능한 창(window)이 더 커진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제2 표적유전자"는 제1 표적 유전자와 코딩이 상이한 또 다른 유전자를 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "최소한 1개의 제2 표적유전자에 대해 표적화된 뉴클레아제" 및 제1 표적유전자의 특정 부위에서 DNA 절단을 생성하는데 사용되는 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 동일하다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, "최소한 1개의 제2 표적유전자에 대해 표적화된 뉴클레아제" 및 제1 표적유전자의 특정 부위에서 DNA 절단을 생성하는데 사용되는 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 상이하다. 이러한 방식으로 제2 표적유전자에 더 많은 선별가능한 편집 부위가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적화된 뉴클레아제는 DNA 형태이다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 표적화된 뉴클레아제는 DNA 대신 mRNA 또는 단백질의 형태이다. 단백질 형태가 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적화된 뉴클레아제를 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중에서 선택되나, 그에 국한되지는 않는다: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 5) 유전자 총 충격; 또는 6) Agrobacterium-매개 형질전환 방법.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 유기체 지놈의 비 형질전환적 일시적 편집 방법을 추가로 제공한다:
1) 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에 대해 최소한 2개의 crRNA 단편의 조합 또는 최소한 2개의 sgRNA 단편의 조합이 설계 및 합성되며, 이 때 tracrRNA와 조합된 crRNA의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합은 상응하는 Cas 단백질이 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 이를 각각 자발적으로 복구하도록 유도할 수 있고, 여기서 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초한 것인 단계;
2) 사전에 위와 같이 설계 및 합성된 부위 특이적 편집을 유도할 수 있는 crRNA 단편과 tracrRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단편 단독의 조합과 적절한 양의 CRISPR/Cas 단백질 또는 이에 상응하는 mRNA가 혼합되어 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집을 유도해 내인성 선별 마커를 생성할 수 있고, 선택적으로 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 인공적으로 합성된 최소한 1개의 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편이 추가로 첨가되고, 시험관 내에서 배양되어 RNP 복합체를 형성하는 단계;
3) 상기 RNP 복합체가 수용 세포 내로 전달되고 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉하여 유전자를 편집하는 단계;
4) RNP 복합체에 의한 제1 표적유전자의 부위-특이적 편집에 의해 생성된 표현형으로 선별가능한 형질에 따라, 상응하는 선별압력이 적용되어 형질의 선별이 이루어지고, 편집 이벤트를 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되며, 선택적으로, 제1 표적 유전자 및 최소한 1개의 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자의 편집 이벤트를 동시에 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 유전자 좌이며, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자의 특정 부위"는 순차적인 절단 및 복구 후에 특정 유형의 돌연변이가 발생되는 부위를 지칭하며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 유형의 돌연변이"는 단일 염기의 치환, 다수의 염기의 치환, 또는 불특정 수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 선별압력" 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력일 수 있고; 예를 들어, 환경적 압력은 고온, 저온 또는 저산소증 등이고; 첨가된 화합물에 의한 압력은 염 이온 농도, 항생제, 세포독소 또는 제초제 등에 의한 압력일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CRISPR/Cas 단백질은 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성" 특징은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여, 새로운 표적RNA가 설계되어 해당 부위를 다시 절단하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, "2개 이상의 DNA 절단"은 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 각각의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다. 이러한 방식으로 DNA 분자의 편집 가능한 창(window)이 더 커진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자"는 제1 표적유전자와 코딩이 다른 유전자를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 sgRNA 단편"과 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA는 동일한 Cas 단백질을 공유한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 " 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 sgRNA 단편 "과 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA는 상이한 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질을 사용한다. 이러한 방식으로 제2 표적유전자에 더 많은 선별가능한 편집 부위가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, RNP 복합체를 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중 선택되지만 이에 국한되지는 않는다: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 5) 유전자 총 충격; 등.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 식물 지놈의 비-형질전환적 일시적 편집 방법을 추가로 제공한다:
1) 수용 식물 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에 대해 최소한 2개 이상의 crRNA 단편의 조합 또는 최소한 2개 이상의 sgRNA 단편의 조합이 설계 및 합성되고, 이 때 crRNA와 tracrRNA의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합은 상응하는 Cas 단백질이 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 이를 각각 자발적으로 복구하도록 유도할 수 있으며, 여기서 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기반한다;
2) 사전에 위와 같이 설계 및 합성된 부위 특이적 편집을 유도할 수 있는 crRNA 단편과 tracrRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단편 단독의 조합과 적절한 양의 CRISPR/Cas 단백질 또는 이에 상응하는 mRNA가 혼합되어 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집을 유도해 내인성 선별 마커를 생성할 수 있고, 선택적으로, 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 인공적으로 합성된 최소한 1개의 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편이 추가로 첨가되고, 시험관 내(in vitro)에서 배양되어 RNP 복합체를 형성한다;
3) 상기 RNP 복합체는 수용 식물 세포 또는 조직으로 전달되고 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉하여 유전자 편집을 수행한다;
4) RNP 복합체에 의한 제1 표적유전자의 부위-특이적 편집에 의해 생성된 표현형으로 선별가능한 형질에 따라, 형질을 선택하기 위한 상응하는 선별압력이 적용되고, 편집 이벤트를 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 식물체가 분리되고, 선택적으로, 제1 표적 유전자 및 최소한 1개의 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자의 편집 이벤트를 동시에 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 식물체가 분리된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 코딩하는 유전자 좌이며, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자의 특정 부위"는 해당 부위에서의 순차적 절단 및 복구 후에 특정 유형의 돌연변이가 발생될 수 있는 부위를 지칭하며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점이 있는 형질을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 유형의 돌연변이"는 단일 염기의 치환, 다수의 염기의 치환, 또는 불특정 수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 선별압력"은 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력일 수 있고; 예를 들어, 환경적 압력은 바람직하게는 고온, 저온 또는 저산소증 등이고; 첨가된 화합물에 의한 압력은 염 이온 농도, 항생제, 세포독소, 제초제 등에 의한 압력일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "수용 식물 세포 또는 조직"은 일시적 발현을 위한 수용체로서 작용할 수 있고 조직 배양을 통해 완전한 식물로 재생될 수 있는 임의의 세포 또는 조직이다. 구체적으로, 세포는 원형질체 세포 또는 현탁 세포이고; 조직은 바람직하게는 캘러스, 미성숙 배, 성숙한 배, 잎, 싹 끝, 어린 스파이크, 배축 등이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CRISPR/Cas 단백질은 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성" 특징은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여, 새로운 표적RNA가 설계되어 해당 부위를 다시 절단하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "2개 이상의 DNA 절단"은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적 서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, "2개 이상의 DNA 절단"은 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 각각의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성된다. 이러한 방식으로 DNA 분자의 편집 가능한 창(window)이 더 커진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자"는 제1 표적유전자와 코딩이 다른 유전자를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 sgRNA 단편"과 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA는 동일한 Cas 단백질을 공유한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 " 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 sgRNA 단편 "과 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA는 상이한 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질을 사용한다. 이러한 방식으로 제2 표적유전자에 더 많은 선별 가능한 편집 부위가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, RNP 복합체를 식물 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중에서 선택되나, 이에 국한되지는 않는다: 1) PEG-매개 원형질체 형질전환 방법; 2) 미세주입법; 3) 유전자 총 충격; 4) 탄화규소섬유-매개 방법; 5) 진공 침투 방법, 또는 기타 일시적인 도입 방법. 유전자 총 충격 방법이 선호된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 제초제 저항성/내성으로부터 선별되는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 최소한 1개의 내인성 유전자이고, 상기 제초제 저항성/내성은 EPSPS 억제제(글리포세이트(glyphosate) 포함)에 대한 저항성/내성; 글루타민 합성 억제제(글루포시네이트(glufosinate) 포함)에 대한 저항성/내성; ALS 또는 AHAS 억제제(이미다졸린 또는 설포닐우레아 포함)에 대한 저항성/내성; ACCase 억제제(아릴옥시페녹시프로피온산(aryloxyphenoxypropionic acid, FOP) 포함)에 대한 저항성/내성; 피토엔 데새투라제(phytoene desaturase, PDS) 단계의 카로티노이드 생합성 억제제, 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD) 억제제 또는 기타 카로티노이드 생합성 표적 억제제를 포함하는 카로티노이드 생합성 억제제에 대한 저항성/내성; 셀룰로오스 억제제에 대한 저항성/내성; 지질 합성 억제제에 대한 저항성/내성; 장쇄 지방산 억제제에 대한 저항성/내성; 미세소관 조립 억제제에 대한 저항성/내성; 광계 I 전자 션트제에 대한 저항성/내성; 광계 II 억제제(카바메이트, 트리아진 및 트리아존 포함)에 대한 저항성/내성; PPO 억제제에 대한 저항성/내성; 및 합성 성장 호르몬(디캄바, 2,4-D(즉, 2,4-디클로로페녹시아세트산) 포함)에 대한 저항성/내성으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 제1 표적 유전자는 PsbA, ALS, EPSPS, ACCase, PPO, HPPD, PDS, GS, DOXPS, TIR1, AFB5에서 선택되고, 상기 제초제 표적유전자의 특정 부위에서 순차적 절단 및 복구 후에 발생된 몇몇 유형의 돌연변이는 수용 식물 세포에 해당 제초제에 대한 저항성/내성을 부여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 ALS이고, "유전자의 특정 부위"는 Arabidopsis AtALS 단백질 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1에 나타냄)에서 A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653 또는 G654 부위 및 AtALS 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 ALS 단백질의 아미노산 부위를 지칭한다. crRNA 또는 sgRNA는 A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653, G654 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AtALS 단백질 아미노산 서열 부위를 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열과 AtALS 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 ALS 아미노산 부위 및 이들의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적한다. ALS W574 부위가 선호된다. 선별압력은 바람직하게는 피록술람(pyroxsulam) 또는 니코설퓨론(nicosulfuron) 처리이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적 유전자"는 ACCase이고, "유전자의 특정 부위"는 Alopecurus myosuroides AmACCase 단백질 아미노산서열(예를 들어, 서열번호 3에 나타냄, 유전자 서열은 서열번호 4에 나타냄)에서 I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088 또는 G2096 부위 및 AmACCase 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 단자엽 식물의 ACCase 단백질의 아미노산 부위를 지칭한다. crRNA 또는 sgRNA는 I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088, G2096 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 AmACCase 아미노산 서열 부위를 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열과 AmACCase 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 단자엽 식물의 ACCase 아미노산 부위 및 이들의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적한다. ACCase W2027 부위가 선호된다. 선별압력은 바람직하게는 퀴잘로포프-p-에틸(quizalofop-p-ethyl) 처리이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 HPPD이고, "유전자의 특정 부위"는 Oryza sativa OsHPPD 단백질 아미노산 서열(서열번호 5로 나타냄, 지놈 서열은 서열번호 6으로 나타냄)에서 H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418 또는 G419 부위 및 OsHPPD 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 HPPD 단백질의 아미노산 부위를 지칭한다. crRNA 또는 sgRNA는 H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418, G419 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 OsHPPD 아미노산 서열 부위를 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열과 OsHPPD 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 HPPD 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적한다. 선별압력은 바람직하게는 비스카르펜트라존(biscarfentrazone) 처리이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 PPO이고, "유전자의 특정 부위"는 Oryza sativa OsPPO1 단백질 아미노산 서열(서열번호 7로 나타냄, 지놈 서열은 서열번호 8에 나타냄)에서 S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425 또는 W470 부위 및 OsPPO1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 PPO 단백질의 아미노산 부위를 지칭한다. crRNA 또는 sgRNA는 S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425, W470 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 OsPPO1 아미노산 서열 부위를 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열과 OsPPO1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 PPO 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적한다. 선별압력은 바람직하게는 사플루페나실(saflufenacil) 처리이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 "제1 표적유전자"는 TIR1이고, "유전자의 특정 부위"는 Oryza sativa OsTIR1 단백질 아미노산 서열(서열번호 9로 나타냄, 지놈 서열은 서열번호 10에 나타냄)의 F93, F357, C413 또는 S448 부위 및 OsTIR1 아미노산 서열을 참조표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 TIR1 단백질의 아미노산 부위를 지칭한다. crRNA 또는 sgRNA는 F93, F357, C413, S448 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 OsTIR1 아미노산 서열 부위를 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열과 OsTIR1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 언급된 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 TIR1 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적한다. 선별압력은 바람직하게는 2,4-D 처리이다.
본 발명은 전술한 방법을 사용하는 비-형질전환적 일시적 편집 시스템을 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 비-형질전환적 일시적 편집 시스템의 선별 마커로서의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 비-형질전환적 일시적 편집 시스템의 질병의 치료 용도를 추가 제공한다.
본 발명은 전술한 비-형질전환적 일시적 편집 시스템의 생물학적 육종에서의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 전술한 방법으로 얻어진 유전자 변형 식물(GMO)을 추가적으로 제공하고, 지놈은 제1 표적유전자의 편집을 포함하며, 유전자 변형 식물은 비-형질전환적 방식으로 얻어진다.
본 발명은 전술한 방법으로 얻어진 유전자 변형 식물을 추가적으로 제공하고, 지놈은 제1 표적유전자의 편집 이벤트를 포함하며, 추가적으로 최소한 1개의 제2 표적유전자 편집 이벤트를 포함하고, 유전자 변형 식물은 비-형질전환적 방식으로 얻어진다.
본 발명은 전술한 방법으로 얻어진 유전자 변형 식물을 추가적으로 제공하고, 지놈은 최소한 1개의 제2 표적유전자 편집 이벤트를 포함하고, 유전자 변형식물은 비-형질전환적적 방식으로 얻어지며, 제1 표적유전자 편집 이벤트는 유전적 분리에 의해 제거된다.
본 발명은 전술한 방법으로 얻어진 유전자 변형 식물의 지놈을 제공하고, 지놈은 다음을 포함한다: 1) 제1 표적유전자의 편집; 2) 제1 표적유전자의 편집 및 최소한 1개의 제2 표적유전자의 편집; 또는 3) 최소한1개의 제2 표적유전자 편집(여기서, 제1 표적유전자의 편집 이벤트는 유전적 분리에 의해 제거됨); 여기서 유전자 변형 식물은 비-형질전환적 방식으로 얻어진다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 방법으로 얻어진 새로운 식물 유전자 돌연변이를 제공한다.
본 발명은 또한 다음 유형 중 하나 또는 둘 이상의 조합을 포함하는 식물에서 발생된 새로운 돌연변이를 제공한다:
Arabidopsis ALS376에 상응하는 부위의 아스파르트산을 다른 아미노산으로 치환, Arabidopsis ALS574에 상응하는 부위의 트립토판을 다른 아미노산으로 치환, Arabidopsis ALS653에 상응하는 부위의 세린을 임의의 다른 아미노산으로 치환, 또는 Arabidopsis ALS654에 상응하는 부위의 세린을 임의의 다른 아미노산으로 치환; 또는 Alopecurus myosuroides ACCase2027에 상응하는 부위의 트립토판을 다른 아미노산으로 치환.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Arabidopsis ALS376에 상응하는 부위의 아스파르트산은 글루탐산(D376E)으로 치환되고, Arabidopsis ALS574에 상응하는 부위의 트립토판은 류신 또는 메티오닌(W574L 또는 W574M)으로 치환되고, Arabidopsis ALS653에 상응하는 부위가 아스파라긴 또는 아르기닌으로 치환되고(S653N 또는 S653R), 또는 Arabidopsis ALS654에 상응하는 부위의 글리신이 아스파르트산으로 치환(G654D)되며, 상기 아미노산 부위는 Arabidopsis thalianan의 해당 아미노산 부위를 기준으로 언급되었다; 또는 Alopecurus myosuroides ACCase2027에 상응하는 부위의 트립토판이 류신 또는 시스테인(W2027L 또는 W2027C)으로 치환되며, 상기 아미노산 부위는 Alopecurus myosuroides의 해당 아미노산 부위를 기준으로 언급되었다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 돌연변이 유형은 S653R/G654D이고, 상기 아미노산 부위는 Arabidopsis thalianan의 해당 아미노산 부위를 기준으로 언급되었다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Oryza sativa ALS의 350 부위의 아스파르트산은 임의의 다른 아미노산으로 치환되고, Oryza sativa ALS의 548 부위의 트립토판은 임의의 다른 아미노산으로 치환되고, 또는 Solanum tuberosum L. ALS2의 561 부위의 트립토판은 임의의 다른 아미노산으로 치환되고; 또는 Oryza sativa ACCase2의 2038부위의 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, Oryza sativa ALS의 350 부위의 아스파르트산은 글루탐산(D350E)에 의해 치환되고, Oryza sativa ALS의 548 부위의 트립토판은 류신 또는 메티오닌(W548L 또는 W548M)에 의해 치환되고, 또는 Solanum tuberosum L. ALS2의 561 부위의 트립토판은 류신 또는 메티오닌으로 치환되고(W561L 또는 W561M); 또는, Oryza sativa ACCase2의 2038 부위의 트립토판이 류신 또는 시스테인(W2038L 또는 W2038C)으로 치환되며, 상기 Oryza sativa ALS 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 11에 나타내었으며, Solanum tuberosum L.의 StALS2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 19에 나타내었으며, Oryza sativa ACCase2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 13에 나타내었다.
본 발명은 전술한 새로운 돌연변이를 갖는 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 핵산 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명은 핵산을 포함하는 발현 카세트를 추가로 제공한다.
본 발명은 발현 카세트를 포함하는 식물 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 식물 세포를 이용하여 재생된 식물을 추가로 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 식물 세포를 식물로 재생시키는 것을 포함하는, 제초제에 대한 저항성 또는 내성이 개선된 식물의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 식물 재배 장소에서 잡초를 방제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 식물은 전술한 식물 또는 전술한 방법에 의해 생산된 식물을 포함하고, 상기 방법은 재배 장소에 1개 이상의 제초제를 잡초를 제거하는데 유효한 양으로 처리하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 새로운 돌연변이, 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 핵산, 재조합 발현 벡터 또는 발현 카세트의 식물 세포, 식물 조직, 식물의 일부 또는 식물체의 제초제에 대한 저항성 또는 내성 개선 용도를 제공한다.
본 발명은 다음의 우수한 기술적 효과를 갖는다:
순차 편집에 의해 생성된 새로운 복구 이벤트에서 형성된 서열을 기반으로 지놈의 특정 부위에서 여러 번 연속적으로 돌연변이를 발생시킬 수 있는 새로운 표적을 설계할 수 있으므로, 이에 따라 DNA 절단 후 복구 유형을 기하급수적으로 풍부하게 하고, 단일 유전자 편집으로 얻을 수 없는 염기 치환, 결실 및 삽입 돌연변이 유형을 실현한다. 즉, 본 발명에서 채택한 이전의 유전자 편집 복구에서 형성된 서열을 나중의 유전자 편집 대상으로 사용하는 프로그래밍된 순차적 절단/편집 방식은 간단한 녹아웃을 통해 CRISPR/Cas에 단일 염기 편집 및 정확한 부위의 염기 삽입, 결실이라는 새로운 기능을 부여할 수 있다.
본 발명은 외인성 마커 없이 유전자 편집 이벤트의 선별을 실현할 수 있고, 추가로 비-형질전환적 유전자 편집을 실현하고 편집 이벤트를 효과적으로 선별할 수 있으며, 세포 치료 및 생물학적 육종 방법에서 생물학적 안전성 문제를 크게 감소시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서 제공하는 식물 비-형질전환적 일시적인 편집 방법은 전 과정에서 외인성 DNA의 개입 없이 Cas 단백질과 인공적으로 합성된 gRNA 또는 sgRNA의 작은 단편만을 포함하고, 순차적 절단/편집으로 제1 표적유전자를 편집하여 내인성 저항성 선별 마커를 생산하여, 편집 이벤트를 효과적으로 선별할 수 있으며, 실제로 유전적 변형 작업이 수반되지 않으므로 이 방법은 화학적 돌연변이 유발 또는 방사선-유도 육종과 동등하고, 또한 외인성 형질전환 성분의 연속적인 다세대 분리 및 검출이 필요하지 않으므로 육종 주기를 단축하고 생물학적 안전성을 보장하며 감독 및 승인 비용을 절약하고 식물의 정밀 육종에서 크게 응용될 수 있는 전망을 제공한다.
본 발명에 있어서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 문서에서 사용되는 단백질 및 핵산 화학, 분자생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학, 면역학 관련 용어 및 실험 절차는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 절차이다. 동시에, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여 관련 용어에 대한 정의 및 설명을 이하 제시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지놈"은 유기체의 각 세포 또는 바이러스 또는 소기관에 존재하는 유전 물질(유전자 및 비암호화 서열)의 모든 보완물 및/또는 부모로부터 하나의 단위로 유전되는 완전한 지놈(반수체)을 지칭한다.
용어 "유전자 편집"은 살아있는 유기체의 모든 유전 정보 또는 지놈의 표적화된 특이적 변형 전략 및 기술을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 지놈의 유전자 코딩 영역뿐만 아니라 유전자 코딩 영역 이외의 영역의 편집도 포함한다. 여기에는 핵(존재하는 경우) 및 세포의 기타 유전 정보를 편집하거나 수정하는 것도 포함된다.
용어 "CRISPR/Cas 뉴클레아제"는 CRISPR 기반 뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산 서열일 수 있으며, 여기에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: 1) SpCas9, ScCas9, SaCas9, xCas9, VRER-Cas9, EQR-Cas9, SpG-Cas9, SpRY-Cas9, SpCas9-NG, NG-Cas9, NGA-Cas9(VQR) 등을 포함하는 Cas9; 2) LbCpf1, FnCpf1, AsCpf1, MAD7 등을 포함하는 Cas12, 또는 전술한 CRISPR 기반 뉴클레아제의 임의의 변이체 또는 유도체; 바람직하게는, 최소한 1개의 CRISPR-기반 뉴클레아제는 상응하는 야생형 서열과 비교해 돌연변이를 포함하며, 획득한 CRISPR-기반 뉴클레아제는 상이한 PAM 서열을 인식한다. 본 명세서에 사용된 "CRISPR 기반 뉴클레아제"는 자연적으로 발생하는 CRISPR 시스템에서 확인된 임의의 뉴클레아제이며, 이는 자연적 배경으로부터 후속적으로 분리되며, 바람직하게는 목적하는 재조합 컨스트럭트(construct)로 변형되거나 조합되며, 표적화된 지놈 공학을 위한 도구로 적합하다. 본래의 야생형 CRISPR-기반 뉴클레아제가 DNA 인식, 즉 결합 특성을 제공하는 한, 본 발명의 다양한 구현예에 적합하도록 임의의 CRISPR-기반 뉴클레아제가 사용되거나 선택적으로 재프로그래밍되거나 돌연변이될 수 있다.
용어 "CRISPR"는 전사 수준에서 유전자 발현을 조절하는 RNA 간섭과 상이한, 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복에 의존하는 서열 특이적 유전자 조작 기술을 지칭한다.
용어 "Cas9 뉴클레아제" 및 "Cas9"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, Cas9 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, Cas9의 활성 DNA 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 함유하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9는 CRISPR/Cas(클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 및 관련 시스템) 지놈 편집 시스템의 구성 요소이다. 가이드 RNA의 유도에 따라 DNA 표적서열을 표적하고 절단하여 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있다.
용어 "Cas 단백질" 또는 "Cas 폴리펩타이드"는 Cas(CRISPR-연관) 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭한다. Cas 단백질에는 Cas 엔도뉴클레아제가 포함된다. Cas 단백질은 박테리아 또는 고세균 단백질일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 유형 I 내지 III CRISPR Cas 단백질은 일반적으로 원핵생물에서 유래하고; 유형 I 및 유형 III Cas 단백질은 박테리아 또는 고세균 종으로부터 유래될 수 있고, 유형 II Cas 단백질(즉, Cas9)은 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다. "Cas 단백질"은 Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas3, Cas3-HD, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, Cas12a, Cas12b, 또는 이들의 조합 또는 복합체를 포함한다.
"Cas9 변이체" 또는 "Cas9 엔도뉴클레아제 변이체"는 모체 Cas9 엔도뉴클레아제의 변이체를 말하며, 여기서 Cas9 엔도뉴클레아제 변이체는 crRNA 및 tracRNA 또는 sgRNA와 연관될 때 DNA 표적서열의 전부 또는 일부를 인식, 결합하는 능력, 선택적으로 DNA 표적서열의 전체 또는 일부를 풀고, 틈을 만들거나(nicking) 절단하는 능력을 보유한다. Cas9 엔도뉴클레아제 변이체는 본 명세서에 기재된 Cas9 엔도뉴클레아제 변이체를 포함하며, 상기 Cas9 엔도뉴클레아제 변이체는 다음 방식으로 모체 Cas9 엔도뉴클레아제와 상이하다: Cas9 엔도뉴클레아제 변이체(gRNA와 융합되어 표적부위를 수정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드-다이렉트 엔도뉴클레아제 복합체를 형성)는 모체 Cas9 엔도뉴클레아제(동일한 gRNA와 융합되어 동일한 표적 부위를 수정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드-유도 엔도뉴클레아제 복합체를 형성)와 비교하여 다음과 같은, 그러나 그에 국한되지 않는 최소한 1개의 개선된 특성을 갖는다; 증가된 형질전환 효율, 증가된 DNA 편집 효율, 감소된 표적외(off-target) 절단 또는 이들의 임의의 조합과 같은 최소한 1개의 개선된 특성을 갖는다.
본 명세서에 기재된 Cas9 엔도뉴클레아제 변이체는 crRNA 및 tracrRNA 또는 sgRNA와 관련될 때 이중 가닥 DNA 표적부위에 결합하여 틈을 낼 수 있는 변이체를 포함하는 반면, 모체 Cas 엔도뉴클레아제는 crRNA 및 tracrRNA 또는 sgRNA와 관련될 때 표적부위에 결합하여 이중 가닥 절단(파손)을 생성할 수 있다.
용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, CRISPR 기술을 사용한 교정을 위해 특정 유전자를 표적하는데 사용되는 가이드 RNA 서열을 지칭하며, 일반적으로 부분적으로 상보적인 crRNA 및 tracrRNA 분자로 구성되어 복합체를 형성하고, 상기 crRNA는 표적서열에 대해 충분한 상보성을 가진 서열을 포함해서 표적서열과 혼성화하고 CRISPR 복합체(Cas9+crRNA+tracrRNA)가 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 지시할 수 있다. 그러나, crRNA 및 tracrRNA의 특성을 모두 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 설계될 수 있다는 것은 당업계에 알려져있다.
용어 "단일 가이드 RNA" 및 "sgRNA"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 가변 표적화 도메인(tracrRNA와 혼성화 되어 tracr페어링 서열에 연결된다)의 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(트랜스 활성화 CRISPR RNA)의 융합을 포함하는 2개의 RNA 분자의 합성 융합을 지칭한다. sgRNA는 유형 II Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 유형 II CRISPR/Cas 시스템의 crRNA 또는 crRNA 단편 및 tracrRNA 또는 tracrRNA 단편을 포함할 수 있으며, 여기서 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 Cas 엔도뉴클레아제를 DNA 표적부위로 유도하여, Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적부위를 인식하고, 선택적으로 결합하고, 선택적으로 DNA 표적부위에 틈을 만들거나 DNA 표적부위를 절단(단일 가닥 또는 이중 가닥 절단을 도입)하게 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 가이드 RNA(들) 및 Cas9는 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체로서 세포에 전달될 수 있다. RNP는 gRNA가 복합된 정제된 Cas9 단백질로 구성되어 있으며, RNP가 줄기세포 및 면역세포를 비롯한 다양한 세포에 효과적으로 전달될 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다(Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI).
본 명세서에서 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM)는 gRNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 의해 인식되는 (표적화된) 표적서열(프리스페이서)에 인접한 짧은 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 표적DNA서열이 적절한 PAM 서열에 인접하지 않으면 Cas 엔도뉴클레아제가 표적DNA서열을 성공적으로 인식하지 못할 수 있다. 본 명세서에서 PAM의 서열 및 길이는 사용 중인 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체에 따라 상이할 수 있다. PAM 서열은 임의의 길이일 수 있지만 일반적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드 길이다.
본 명세서에서, 용어 "유기체" 또는 "생체"는 동물, 식물, 진균, 박테리아 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "숙주 세포"는 식물 세포, 동물 세포, 진균 세포, 박테리아 세포 등을 포함한다.
본 발명에서, "동물"은 인간, 비인간 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 양서류 등과 같은 척추동물 뿐만 아니라 곤충과 같은 무척추동물을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, "식물" 광합성을 수행할 수 있는 임의의 분화된 다세포 유기체, 특히 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어, (1) 식용 작물: Oryza sativa, Oryza latifolia, Oryza sativa, Oryza glaberrima같은 Oryza spp.; Triticum aestivum, T. Turgidumssp. durum 같은 Triticum spp.; Hordeum vulgare, Hordeum arizonicum 같은 Hordeum spp.; Secale cereale; Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantine, Avena fatua var.sativa, Avena hybrida 같은 Avena spp.; Pennisetum glaucum, Sorghum, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Triticale, Zea mays or Maize, Millet, Rice, Foxtail millet, Proso millet, Sorghum bicolor, Panicum, Fagopyrum spp., Panicum miliaceum, Setaria italica, Zizania palustris, Eragrostis tef, Panicum miliaceum, Eleusine coracana 같은 Echinochloa spp.; (2) 콩과 식물: Glycine max 같은 Glycine spp., Soja hispida, Soja max, Vicia spp., Vigna spp., Pisum spp., field bean, Lupinus spp., Vicia, Tamarindus indica, Lens culinaris, Lathyrus spp., Lablab, broad bean, mung bean, red bean, chickpea; (3) 기름작물: Arachis hypogaea, Arachis spp, Sesamum spp., Helianthus spp. like Helianthus annuus, Elaeis like Eiaeis guineensis, Elaeis oleifera, soybean, Brassicanapus, Brassica oleracea, Sesamum orientale, Brassica juncea, Oilseed rape, Camellia oleifera, oil palm, olive, castor-oil plant, Brassica napus L., canola; (4) 섬유 작물: Agave sisalana, Gossypium spp. like Gossypium, Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Hibiscus cannabinus, Agave sisalana, Musa textilis Nee, Linum usitatissimum, Corchorus capsularis L, Boehmeria nivea (L.), Cannabis sativa, Cannabis sativa; (5) 과일 작물: Ziziphus spp., Cucumis spp., Passiflora edulis, Vitis spp., Vaccinium spp., Pyrus communis, Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Malus spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Crataegus spp., Diospyros spp., Eugenia unifora, Eriobotrya japonica, Dimocarpus longan, Carica papaya, Cocos spp., Averrhoa carambola, Actinidia spp., Prunus amygdalus, Musa spp. (musa acuminate), Persea spp. (Persea Americana), Psidium guajava, Mammea Americana, Mangifera indica, Canarium album (Oleaeuropaea), Caricapapaya, Cocos nucifera, Malpighia emarginata, Manilkara zapota, Ananas comosus, Annona spp., Citrus reticulate (Citrus spp.), Artocarpus spp., Litchi chinensis, Ribes spp., Rubus spp., pear, peach, apricot, plum, red bayberry, lemon, kumquat, durian, orange, strawberry, blueberry, hami melon, muskmelon, date palm, walnut tree, cherry tree; (6) 뿌리줄기 작물: Manihot spp., Ipomoea batatas, Colocasia esculenta, tuber mustard, Allium cepa (onion), eleocharis tuberose (water chestnut), Cyperus rotundus, Rhizoma dioscoreae; (7) 채소 작물: Spinacia spp., Phaseolus spp., Lactuca sativa, Momordica spp, Petroselinum crispum, Capsicum spp., Solanum spp. (Solanum tuberosum, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum 같은), Lycopersicon spp. (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme 같은), Macrotyloma spp., Kale, Luffa acutangula, lentil, okra, onion, potato, artichoke, asparagus, broccoli, Brussels sprouts, cabbage, carrot, cauliflower, celery, collard greens, squash, Benincasa hispida, Asparagus officinalis, Apium graveolens, Amaranthus spp., Allium spp., Abelmoschus spp., Cichorium endivia, Cucurbita spp., Coriandrum sativum, B.carinata, Rapbanus sativus, Brassica spp. (such as Brassica napus, Brassica rapa ssp., canola, oilseed rape, turnip rape, turnip rape, leaf mustard, cabbage, black mustard, canola (rapeseed), Brussels sprout, Solanaceae (eggplant), Capsicum annuum (sweet pepper), cucumber, luffa, Chinese cabbage, rape, cabbage, calabash, Chinese chives, lotus, lotus root, lettuce; (8) 꽃 작물: Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Canna indica, Opuntia spp., Tagetes spp., Cymbidium (orchid), Crinum asiaticum L., Clivia, Hippeastrum rutilum, Rosa rugosa, Rosa Chinensis, Jasminum sambac, Tulipa gesneriana L., Cerasus sp., Pharbitis nil (L.) Choisy, Calendula officinalis L., Nelumbo sp., Bellis perennis L., Dianthus caryophyllus, Petunia hybrida, Tulipa gesneriana L., Lilium brownie, Prunus mume, Narcissus tazetta L., Jasminum nudiflorum Lindl., Primula malacoides, Daphne odora, Camellia japonica, Michelia alba, Magnolia liliiflora, Viburnum macrocephalum, Clivia miniata, Malus spectabilis, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Syzygium aromaticum, Rhododendron simsii, Rhododendron hybridum, Michelia figo (Lour.) Spreng., Cercis chinensis, Kerria japonica, Weigela florida, Fructus forsythiae, Jasminum mesnyi, Parochetus communis, Cyclamen persicum Mill., Phalaenophsis hybrid, Dendrobium nobile, Hyacinthus orientalis, Iris tectorum Maxim, Zantedeschia aethiopica, Calendula officinalis, Hippeastrum rutilum, Begonia semperflorenshybr, Fuchsia hybrida, Begonia maculataRaddi, Geranium, Epipremnum aureum; (9) 약용작물: Carthamus tinctorius, Mentha spp., Rheum rhabarbarum, Crocus sativus, Lycium chinense, Polygonatum odoratum, Polygonatum Kingianum, Anemarrhena asphodeloides Bunge, Radix ophiopogonis, Fritillaria cirrhosa, Curcuma aromatica, Amomum villosum Lour., Polygonum multiflorum, Rheum officinale, Glycyrrhiza uralensis Fisch, Astragalus membranaceus, Panax ginseng, Panax notoginseng, Acanthopanax gracilistylus, Angelica sinensis, Ligusticum wallichii, Bupleurum sinenses DC., Datura stramonium Linn., Datura metel L., Mentha haplocalyx, Leonurus sibiricus L., Agastache rugosus, Scutellaria baicalensis, Prunella vulgaris L., Pyrethrum carneum, Ginkgo biloba L., Cinchona ledgeriana, Hevea brasiliensis (wild), Medicago sativa Linn, Piper Nigrum L., Radix Isatidis, Atractylodes macrocephala Koidz; (10) 원료 작물: Hevea brasiliensis, Ricinus communis, Vernicia fordii, Morus alba L., Hops Humulus lupulus, Betula, Alnus cremastogyne Burk., Rhus verniciflua stokes; (11) 목초지 작물: Agropyron spp., Trifolium spp., Miscanthus sinensis, Pennisetum sp., Phalaris arundinacea, Panicum virgatum, prairiegrasses, Indiangrass, Big bluestem grass, Phleum pratense, turf, cyperaceae (Kobresia pygmaea, Carex pediformis, Carex humilis), Medicago sativa Linn, Phleum pratense L., Medicago sativa, Melilotus suavcolen, Astragalus sinicus, Crotalaria juncea, Sesbania cannabina, Azolla imbircata, Eichhornia crassipes, Amorpha fruticosa, Lupinus micranthus, Trifolium, Astragalus adsurgens pall, Pistia stratiotes linn, Alternanthera philoxeroides, Lolium; (12) 설탕 작물: Saccharum spp., Beta vulgaris; (13) 음료 작물: Camellia sinensis, Camellia Sinensis, tea, Coffee (Coffea spp.), Theobroma cacao, Humulus lupulus Linn.; (14) 잔디 식물: Ammophila arenaria, Poa spp.(Poa pratensis (bluegrass)), Agrostis spp. (Agrostis matsumurae, Agrostis palustris), Lolium spp. (Lolium), Festuca spp. (Festuca ovina L.), Zoysia spp. (Zoysiajaponica), Cynodon spp. (Cynodon dactylon/bermudagrass)，Stenotaphrum secunda tum (Stenotaphrum secundatum), Paspalum spp., Eremochloa ophiuroides (centipedegrass), Axonopus spp. (carpetweed), Bouteloua dactyloides (buffalograss), Bouteloua var. spp. (Bouteloua gracilis), Digitaria sanguinalis, Cyperusrotundus, Kyllingabrevifolia, Cyperusamuricus, Erigeron canadensis, Hydrocotylesibthorpioides, Kummerowiastriata, Euphorbia humifusa, Viola arvensis, Carex rigescens, Carex heterostachya, turf; (15) 나무 작물: Pinus spp., Salix spp., Acer spp., Hibiscus spp., Eucalyptus spp., Ginkgo biloba, Bambusa sp., Populus spp., Prosopis spp., Quercus spp., Phoenix spp., Fagus 종, Ceiba pentandra; (16) 견과 작물: Bertholletia excelsea, Castanea spp., Corylus spp., Carya spp., Juglans spp., Pistacia vera, Anacardium occidentale, Macadamia (Macadamia integrifolia), Carya illinoensis Koch, Macadamia, Pistachio, Badam, other plants that produce nuts; (17) 기타: arabidopsis thaliana, Bra chiaria eruciformis, Cenchrus echinatus, Setaria faberi, eleusine indica, Cadaba farinose, algae, Carex elata, ornamental plants, Carissa macrocarpa, Cynara spp., Daucus carota, Dioscorea spp., Erianthus sp., Festuca arundinacea, Hemerocallis fulva, Lotus spp., Luzula sylvatica, Medicago sativa, Melilotus spp., Morus nigra, Nicotiana spp., Olea spp., Ornithopus spp., Pastinaca sativa, Sambucus spp., Sinapis sp., Syzygium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Viola odorata 등.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 식물은 벼, 옥수수, 밀, 대두, 해바라기, 수수, 평지, 자주개자리, 목화, 보리, 기장, 사탕수수, 토마토, 담배, 카사바, 감자, 고구마, 배추, 양배추, 오이, 장미, Scindapsus aureus, 수박, 멜론, 딸기, 블루베리, 포도, 사과, 감귤류, 복숭아, 배, 바나나 등에서 선택된다.
본 명세서에서, 용어 "식물"은 식물 전체 및 임의의 자손, 세포, 조직 또는 식물의 부분을 포함한다. 용어 "식물 부분"은 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는 식물의 임의의 부분을 포함한다: 종자(성숙 종자, 종피가 없는 미성숙 배 및 미성숙 종자 포함); 식물 절단; 식물 세포; 식물 세포 배양; 식물 기관(예: 꽃가루, 배아, 꽃, 과일, 새싹, 잎, 뿌리, 줄기 및 관련 외식편). 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 캘러스 조직 또는 구조적 또는 기능적 단위로 구성된 기타 식물 세포 집단일 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양물은 세포 또는 조직이 유래된 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생시킬 수 있고, 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 대조적으로, 일부 식물 세포는 식물을 재생할 수 없다. 식물 세포 또는 조직 배양에서 재생 가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 꽃가루, 잎, 꽃밥, 뿌리, 뿌리 끝, 실크, 꽃, 커널, 스파이크, 속대, 껍질 또는 줄기일 수 있다.
식물 부분은 수확 가능한 부분 및 자손 식물을 번식시키는 데 사용할 수 있는 부분을 포함한다. 번식을 위해 사용될 수 있는 식물 부분은 예를 들면 다음과 같으나 이에 국한되지는 않는다: 종자; 과일; 절단; 묘목; 괴경; 및 대목. 식물의 수확 가능한 부분은 예를 들면 다음과 같으나 이에 국한되지는 않는다: 꽃; 화분; 묘목; 괴경; 이파리; 줄기; 과일; 종자; 및 뿌리.
식물 세포는 식물의 구조적, 생리학적 단위이다. 본 명세서에서, 식물 세포는 원형질체 및 부분적인 세포벽을 갖는 원형질체를 포함한다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 세포 집합체(예: 느슨한 캘러스 및 배양 세포)의 형태일 수 있고, 고차 조직 단위(예: 식물 조직, 식물 기관 및 식물체)의 일부일 수 있다. 따라서 식물 세포는 원형질체, 배우자 생산 세포, 또는 전체 식물을 재생할 수 있는 세포 또는 세포의 집합체일 수 있다. 따라서, 본 명세서의 구현예에서, 다수의 식물 세포를 함유하고 전체 식물로 재생될 수 있는 종자는 "식물 부분"으로 간주된다.
본 명세서에서, "원형질체(protoplast)"라는 용어는 세포벽이 완전히 또는 부분적으로 제거되고 지질 이중층 막이 노출된 식물 세포를 의미한다. 일반적으로 원형질체는 세포벽이 없는 분리된 식물 세포로, 세포 배양 또는 전체 식물로 재생할 가능성이 있다.
식물 "자손"은 식물의 모든 후속 세대를 포함한다.
용어 "박테리아"는 원핵생물계의 모든 유기체를 포함한 모든 원핵생물을 의미한다. 용어 "박테리아"는 Mycoplasma, Chlamydia, Actinomyces, Streptomyce 및 Rickettsia를 포함하여 박테리아로 간주되는 모든 미생물을 포함한다. 구균(cocci), 간균(bacilli), 스피릴라(spirilla), 스페로플라스트(spheroplast), 원형질체(protoplast) 등을 포함한 모든 형태의 박테리아가 이 정의에 포함된다. 이 용어에는 그람 음성 또는 그람 양성인 원핵생물도 포함된다. "그람 음성" 및 "그람 양성"은 당업계에 잘 알려진 그람 염색 방법을 사용한 염색 패턴을 의미한다(예를 들어, Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., CV Mosby St. Louis, pp. 13 -15[1982]). "그람 양성 박테리아"는 그람 염색에 사용된 원래 염료를 유지할 수 있는 박테리아로, 염색된 세포가 현미경으로 짙은 파란색에서 보라색으로 나타난다. "그람 음성 박테리아"는 그람 염색에 사용된 원래 염료를 유지하지 않지만 반대 염색으로 염색할 수 있다. 따라서 그람 음성균은 그람 염색 반응 후에 붉게 나타난다.
본 명세서에서, 용어 "진균"은 이형성 진균을 포함하는 곰팡이 및 효모와 같은 진핵 유기체를 지칭한다.
용어 "제초제 내성" 및 "제초제 저항성"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 둘 다 제초제 내성 및 제초제 저항성을 나타낸다. "제초제 내성 개선" 및 "제초제 저항성 개선"은 야생형 유전자를 함유하는 식물에 비해 제초제에 대한 내성 또는 저항성이 개선됨을 의미한다.
용어 "야생형"은 자연에서 발견될 수 있는 핵산 분자 또는 단백질을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "재배지"는 토양과 같이 본 발명의 식물이 재배되는 장소를 포함하며, 또한 예를 들어 식물 종자, 식물 묘목 및 재배 식물을 포함한다. 용어 "잡초 방제 유효량"은 표적 잡초의 성장 또는 발달에 영향을 미치기에 충분한 제초제의 양, 예를 들어 표적 잡초의 성장 또는 발달을 예방 또는 억제하거나 잡초를 죽이기에 충분한 양을 말한다. 유리하게는, 잡초 방제 유효량은 본 발명의 식물 종자, 식물 묘목 또는 식물의 성장 및/또는 발달에 유의한 영향을 미치지 않는다. 당업자는 일상적인 실험을 통해 이러한 잡초 방제 유효량을 결정할 수 있다.
본 명세서의 용어 "표적DNA"는 "표적부위" 또는 "표적서열"을 포함하는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "용해"는 DNA 분자의 공유 골격의 절단을 의미한다. 용해는 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 및 이중 가닥 용해가 모두 가능하며, 이중 가닥 용해는 두 가지 개별 단일 가닥 용해 이벤트로 인해 생성될 수 있다. DNA 용해로 인해 끝이 뭉툭하거나 엇갈릴 수 있다(blunt or staggered ends). 본 발명의 일 구현예에 따르면, DNA-표적화 RNA 및 부위-특이적 변형 폴리펩타이드를 포함하는 복합체가 표적화된 이중 가닥 DNA 용해를 위해 사용된다.
용어 "유전자"는 코딩 서열 전(5' 비-코딩 서열)후(3' 비-코딩 서열)의 조절 서열을 포함하는 기능적 분자 (예를 들어, 특정 단백질 그러나 이에 국한되지 않음)를 발현하는 핵산 단편을 포함한다.
특정 RNA를 "암호화"하는 DNA 서열은 RNA로 전사될 수 있는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역될 수 있는 RNA(mRNA), 또는 단백질로 번역될 수 없는 RNA(예: tRNA, rRNA 또는 DNA-표적화 RNA; "비코딩" RNA 또는 " ncRNA"로 알려짐)를 인코딩할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적 화학적 유사체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 또한 글리코실화, 지질 결합, 황산화, 글루탐산 잔기의 γ-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하나 이에 국한되지 않는 변형 형태를 포함할 수 있다.
용어 "생물학적 활성 단편"은 단백질의 N 및/또는 C-말단에서 결실된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 단편을 말하지만 여전히 그의 기능적 활성을 유지한다.
본 명세서에 사용된 아미노산 치환과 관련된 용어 중 첫 번째 문자는 특정 서열의 특정 부위에서 자연적으로 발생하는 아미노산을 나타내고, 다음 숫자는 해당 서열 내의 부위를, 두번째 문자는 자연 발생 아미노산을 대체하기 위한 다른 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, W574L은 574 부위의 트립토판이 류신으로 대체되었음을 의미한다. 이중 또는 다중 돌연변이의 경우 각 돌연변이는 "/"로 구분된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용되며 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 DNA, RNA 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
용어 "뉴클레오타이드 서열" 및 "핵산 서열"이라는 용어는 둘 다 DNA 또는 RNA의 염기 서열을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 용어 "발현 카세트", "발현 벡터" 및 "발현 컨스트럭트(expression construct)"는 식물에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 재조합 벡터와 같은 벡터를 지칭한다. 용어 "발현"은 기능적 산물의 생산을 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열의 발현은 뉴클레오타이드 서열의 전사(예: mRNA 또는 기능적 RNA를 생성하기 위한 전사) 및/또는 RNA의 전구체 또는 성숙한 단백질로의 번역을 지칭할 수 있다.
본 발명의 "발현 컨스트럭트(expression construct)"는 선형 핵산 단편, 원형 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 일부 구현예에서 번역될 수 있는 RNA(예: mRNA)일 수 있다.
본 발명의 "발현 컨스트럭트"는 상이한 공급원으로부터의 관심 조절 서열 및 관심 뉴클레오타이드 서열, 또는 동일한 공급원으로부터의 관심 조절 서열 및 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있지만 자연에서 일반적으로 발생하는 것과 다른 방식으로 배열될 수 있다.
용어 "재조합 발현 벡터" 또는 "DNA 컨스트럭트"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며 벡터 및 최소한 1개의 삽입을 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. 재조합 발현 벡터는 일반적으로 삽입물의 발현 및/또는 증식을 위해 또는 다른 재조합 뉴클레오타이드 서열의 구축을 위해 생산된다. 삽입물은 작동가능하게 또는 작동불가능하게 프로모터 서열 및 DNA 조절 서열에 연결될 수 있다.
용어 "조절 서열" 및 "조절 요소"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 코딩 서열의 상류(5' 비코딩 서열), 중간 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며 관련 코딩 서열의 전사, RNA 처리, 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 식물 발현 조절 요소는 식물에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 번역을 제어할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 및 폴리A 인식 서열을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
용어 "프로모터"는 다른 핵산 단편의 전사를 조절할 수 있는 핵산 단편을 의미한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 프로모터는 식물 세포로부터 유래되었는지 여부에 관계없이 식물 세포의 유전자 전사를 제어할 수 있는 프로모터이다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터 또는 발달적으로 조절되는 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
용어 "구성적 프로모터"는 대부분의 경우 대부분의 세포 유형에서 일반적으로 유전자 발현을 유발하는 프로모터를 지칭한다. "조직 특이적 프로모터" 및 "조직 선호 프로모터"는 상호교환적으로 사용되며, 주로 조직 또는 기관에서 발현되지만 반드시 그러한 것은 아니며 특정 세포 또는 세포 유형에서도 발현되는 프로모터를 의미한다. "발생적으로 조절되는 프로모터"는 그의 활성이 발생적 사건에 의해 결정되는 프로모터를 지칭한다. "유도성 프로모터"는 내인성 또는 외인성 자극(환경, 호르몬, 화학적 신호 등)에 반응하여 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 선택적으로 발현한다.
본 명세서의 용어 "작동가능하게 연결된"은 뉴클레오타이드 서열의 전사가 전사 조절 요소에 의해 제어, 조절되도록 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등, 그러나 이에 국한되지 않음)를 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임)에 연결하는 것을 의미한다. 조절 요소 영역을 핵산 분자에 작동가능하게 연결하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
핵산 분자(예: 플라스미드, 선형 핵산 단편, RNA 등) 또는 단백질을 식물에 "도입"한다는 것은 핵산 또는 단백질로 식물 세포를 형질전환시켜 핵산 또는 단백질이 식물 세포에서 기능할 수 있게 하는 것이다. 본 발명에서, 용어 "형질전환"은 안정 형질전환 및 일시적 형질전환을 포함한다.
용어 "안정 형질전환(stable transformation)"은 외인성 뉴클레오타이드 서열을 식물 지놈에 도입함으로써 외인성 유전자의 안정적인 유전을 초래하는 것을 지칭한다. 일단 안정적으로 형질전환되면, 외인성 핵산 서열은 식물 또는 이의 연속적인 세대의 지놈에 안정적으로 통합된다.
용어 "일시적 형질전환(transient transformation)"은 기능을 수행하기 위해 핵산 분자 또는 단백질을 식물 세포에 도입하지만 외래 유전자의 안정적인 유전을 초래하지 않는 것을 의미한다. 일시적 형질전환에서 외인성 핵산 서열은 식물의 지놈에 통합되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다.
이 설명에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참고문헌에 포함되도록 정확하고 개별적으로 표시된 것처럼 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위해 참고문헌으로 포함된다. 출원일 이전에 출판된 간행물의 인용은 본 발명이 기존 발명의 출판물보다 선행할 자격이 없다는 뜻으로 해석되어서는 안 된다. 또한 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로 별도의 검증이 필요할 수 있다.
구체적으로 언급되거나 암시되지 않는 한, 여기에서 사용된 용어 "a", "a/an" 및 "the"는 "최소한 1개"를 의미한다. 여기에 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 개별적으로 인용된 것과 동일한 수준으로 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
[서열목록 설명]
본 발명과 관련된 주요 서열을 요약하면 다음과 같으며, 관련 서열은 서열 목록에 제시되어 있다.
Figure pct00001
도 1은 본 발명에 따른 유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법의 개략도를 나타낸다. 도면에서는 NGG를 PAM으로 사용하는 Cas9만 예시하였다; 같은 방식으로 상이한 PAM(예: NG)을 사용하는 Cas9 종류도 사용할 수 있다.
도 2는 Arabidopsis thaliana의 ALS 유전자 부위 W574 및 S653에서 gRNA 설계의 개략도를 나타낸다.
도 3은 두 개의 상이한 프로그래밍된 순차적 절단/편집 벡터로 형질전환된 Arabidopsis thaliana T2 세대 제초제 저항성을 가진 집단을 나타낸다. pQY743 및 pQY745는 벡터 숫자이다. 저항성 집단은 정상적으로 발근이 가능하였으나, 야생형 Col-0 및 비 저항성 집단은 그렇지 못하였다.
도 4는 이마자픽(imazapic)에 저항성을 지닌 Arabidopsis thaliana의 T2 세대 집단의 ALS 유전자의 시퀀싱 피크를 나타낸 도면으로서, 화살표로 표시된 T가 G로부터 돌연변이되어 W574L 돌연변이가 발생하였다.
도 5는 Arabidopsis thaliana의 ALS 유전자의 W574 부위에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집 방식의 설계를 나타낸다. T-DNA 서열은 4개의 유전자, sgRNA1, sgRNA2, Cas9 및 HygR을 발현하였다. 이 중 sgRNA1 및 Cas9은 지놈에서 ALS의 W574 코돈을 절단하는 복합체를 형성하고, 자발적인 복구를 통해 -G 유전자형을 발생시킬 것으로 예상되었다. 이 새로운 서열은 sgRNA2와 Cas9에 의해 형성된 복합체에 의해 인식되고 절단될 수 있었고, 세포의 자발적인 복구를 통해 +T 유전자형을 발생시켜 W574L 돌연변이가 발생하였다.
도 6은 이마자픽으로 선별한 Arabidopsis thaliana 저항성 묘목과 ALS W574 부위의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Arabidopsis thaliana ALS 유전자의 S653 부위에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집 방식의 설계를 나타낸다. T-DNA 서열은 4개의 유전자, sgRNA1, sgRNA2, Cas9 및 HygR을 발현했다. 이 중 sgRNA1 및 Cas9는 지놈에서 ALS의 S653 코돈을 절단하는 복합체를 형성했다. 세포 자연 복구 후 -G 유전자형이 발생되었다. 이 서열은 sgRNA2 및 Cas9에 의해 형성된 복합체에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 세포의 자발적 복구 후 +A 유전자형이 발생되어 돌연변이 S653N이 발생되었다.
도 8은 이마자픽으로 선별한 Arabidopsis thaliana 저항성 묘목과 ALS S653 부위의 시퀀싱 결과를 나타낸다. 왼쪽 패널은 저항성 묘목의 선별 결과와 저항성 묘목 비율을 나타내고, 오른쪽 패널은 S653 부위의 염기서열 피크와 돌연변이 유형을 도식화한 것이다.
도 9는 Arabidopsis thaliana ALS 유전자의 W574 부위에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집 방식의 설계를 나타낸다. T-DNA 서열은 4개의 유전자, sgRNA1, sgRNA2, Cas9 및 HygR을 발현하였다. 이 중 sgRNA1 및 Cas9는 지놈에서 ALS의 W574 코돈을 절단하는 복합체를 형성했다. 세포의 자발적 복구 후 +A 유전자형이 발생되었다. 이 서열은 sgRNA2 및 Cas9에 의해 형성된 복합체에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 세포의 자발적 복구 후 -G 유전자형이 발생되어 돌연변이 W574M이 발생되었다. 두 절단은 서로 다른 PAM 부위를 사용했다.
도 10은 Oryza sativa ACCase2 유전자의 W2038 부위에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집 방식의 설계를 나타낸다. 이 부위는 Alopecurus myosuroides의 ACCase2 유전자의 W2027 부위에 상응한다. T-DNA 서열은 4개의 유전자, sgRNA1, sgRNA2, Cas9 및 HygR을 발현하였다. 그 중 sgRNA1 및 Cas9는 지놈에서 ACCase의 W2038 코돈을 절단하는 복합체를 형성했다. -G 유전자형이 세포의 자발적 복구 후에 발생되었다. 이 서열은 sgRNA2 및 Cas9에 의해 형성된 복합체에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 세포의 자발적 복구 후 +T 유전자형이 발생되어 돌연변이 W2038L이 발생되었다.
도 11은 하이그로마이신(50ug/L) 및 퀴잘로포프-p(50ug/L)로 공동으로 선별한 Oryza sativa의 저항성 캘러스와 W2038 부위의 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 12은 원핵생물 발현에 의해 생산 및 정제된 SpCas9 및 NGA-Cas9 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 도식이다. 화살표로 표시된 밴드는 Cas9 단백질 밴드이다.
도 13은 정제된 Cas9 단백질의 OsALS W548 표적부위와 OsACCase2 W2038 표적부위를 포함하는 DNA 절편에 대한 in vitro 절단 활성을 나타낸 것으로, 아가로스 겔 전기영동을 통해 검출했으며, Cas9 단백질 및 sgRNA 절편을 동시에 첨가해야 DNA 단편을 예상한 크기로 절단할 수 있음을 알 수 있다.
도 14는 RNP 형질전환된 Oryza sativa 원형질체의 OsALS W548 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타내며, 이 부위는 Arabidopsis thaliana ALS W574 부위에 상응한다. 화살표로 표시된 위치에 원래의 G 염기 신호 피크 외에 돌연변이에 의해 얻은 T 염기 신호 피크가 있었고, 이는 W548L 돌연변이로 이어졌다.
도 15는 OsACCase2 W2038 부위에서 RNP에 의해 편집되고 50ug/L 퀴잘로포프-p로 선별된 Oryza sativa의 저항성 캘러스를 나타낸다. 화살표는 저항성 캘러스를 나타낸다.
도 16은 저항성 캘러스로부터 분화된 Oryza sativa 묘목의 OsACCase2 W2038 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타낸다. 화살표로 표시된 T는 G에서 돌연변이되어 W2038L 돌연변이가 발생했다.
도 17은 T1 세대 OsACCase2 W2038L 편집된 묘목의 할록시포프-p에 대한 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호(벼 품종)의 수처리 대조군이며, 2 내지 4번 묘목은 야생형 화이다오 5호 및 2개의 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W2038L 편집된 집단 QY367-7-12 및 QY367-7-18이며, 모두 5g/mu 활성 성분(mu, 면적 단위, 1mu = 1/15헥타르)의 할록시포프-p 처리되었고, 편집된 집단은 할록시포프-p 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 18은 T1 세대 OsACCase2 W2038L 편집된 묘목의 퀴잘로포프-p에 대한 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호 수처리 대조군이며, 2 내지 4번 묘목은 야생형 Huaidao 5호 및 2개의 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W2038L 편집된 집단 QY367-5-10 및 QY367-5-21이며, 모두 5g/mu 활성 성분의 퀴잘로포프-p로 처리되었다. 편집된 집단은 퀴잘로포프-p 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 19는 OsACCase2 W2038 부위와 OsBADH2 유전자에서 동시에 RNP에 의해 편집되고 50ug/L퀴잘로포프-p로 선별된 Oryza sativa의 저항성 캘러스를 나타낸다. 화살표는 저항성 캘러스를 나타낸다.
도 20은 T0 세대 이중 부위 편집 묘목의 OsACCase2 W2038 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타낸다. 화살표로 표시된 T는 G에서 돌연변이되어 W2038L 돌연변이가 발생했다.
도 21은 T0 세대 이중 부위 편집 묘목의 OsBADH2 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타낸다. 화살표로 표시된 부위에서 +A 동형 접합 돌연변이가 발생했다.
도 22는 OsALS W548 부위와 OsSWEET14 유전자에서 동시에 RNP에 의해 편집되고 5mg/L 피록술람으로 선별된 Oryza sativa의 저항성 캘러스를 나타낸다. 화살표는 저항성 캘러스를 나타낸다.
도 23은 T0 세대 이중 부위 편집 묘목의 OsALS W548 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타낸다. 화살표로 표시된 위치에 G 염기와 T 염기 신호 피크가 모두 존재하여 W548L 돌연변이가 발생했다.
도 24는 T0 세대 이중 부위 편집 묘목의 OsSWEET14 표적부위의 시퀀싱 피크의 도식을 나타낸다. 화살표로 표시된 부위에서 -C 동형 접합 돌연변이가 발생했다.
도 25는 니코설퓨론에 대한 T1 세대 OsALS W548 부위 및 OsSWEET14 이중 부위 편집 묘목의 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호의 수처리 대조군을 나타내고, 2 내지 3번 묘목은 야생형 Huaidao 5호와 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W548L 편집 집단 QY360-7-11이며, 둘 다 4g/mu 활성 성분의 니코설퓨론으로 처리되었다. 편집된 집단은 니코설퓨론 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 26은 플루카바존-소듐에 대한 T1 세대 OsALS W548 부위 및 OsSWEET14 이중 부위 편집 묘목의 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호의 수처리 대조군을 나타내고, 2 내지 3번 묘목은 야생형 Huaidao 5호와 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W548L 편집 집단 QY360-7-9이며, 둘 다 2g/mu 활성 성분의 플루카바존-소듐으로 처리되었다. 편집된 집단은 플루카바존-소듐 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 27은 이마자픽에 대한 T1 세대 OsALS W548 부위 및 OsSWEET14 이중 부위 편집 묘목의 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호의 수처리 대조군을 나타내고 2 내지 3번 묘목은 야생형 Huaidao 5호와 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W548L 편집 집단 QY360-7-11이며, 둘 다 7g/mu 활성 성분의 이마자픽으로 처리되었다. 편집된 집단은 이마자픽 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 28은 피록술람에 대한 T1 세대 OsALS W548 부위 및 OsSWEET14 이중 부위 편집 묘목의 저항성 테스트를 나타낸다. 왼쪽으로부터 1번 묘목은 야생형 Huaidao 5호 수처리 대조군을 나타내고, 2 내지 4번 묘목은 야생형 Huaidao 5호와 RNP 유전자 총-형질전환 T1 세대 W548L 편집 집단 QY360-7-2 및 QY360-7-11이며, 모두 2g/mu 활성 성분의 피록술람으로 처리되었다. 편집된 집단은 피록숨람 저항성이 개발되었음이 분명하다.
도 29는 293T 세포에서 HBB 유전자의 프로그래밍된 순차적 절단/편집 개략도를 나타낸다. A. 293T 세포에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집을 위한 HBB 유전자 부위의 설계를 나타낸다; B. 편집 벡터 별 형질전환 48시간 후 293T 세포 HBB 유전자의 프로그래밍된 순차적 절단/편집의 전환 효율; C. 293T 세포 HBB 유전자의 프로그래밍된 순차적 절단/편집 및 HBB 유전자의 단일 부위 절단/편집에서 발생된 유전자 편집 유형의 비율; WT: 야생형, indel: 결실 또는 삽입을 위한 유전자형, C->T SNP: 절단 시 C에서 T 염기로 치환된 유전자형.
이하, 실시예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 아래의 실시례는 예시를 통해 발명을 설명하나, 본 발명의 보호범위가 이들 실시예에 한정되어서는 안 된다. 다음 실시예의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 사용되는 분자 생물학, 조직 배양 기술 및 농업 경제학 매뉴얼에 설명된 방법이다. 예를 들어, 특정 단계는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition)"(Sambrook, J., Russell, David W., 2001, Cold Spring Harbor), "Plant Propagation by Tissue Culture"(Edwin)에서 찾을 수 있다. 다음 실시예에 사용된 재료, 시약, 기구 등은 달리 명시되지 않는 한 상업적 출처에서 얻을 수 있다.
실시예1: Arabidopsis thaliana 의 ALS 유전자의 W574 및 S653 부위에 대한 프로그래밍된 순차적 절단/편집에 의해 도입된 예측 가능한 염기 치환 설계
A. 실험재료
1. Arabidopsis thaliana 재료
야생형 Arabidopsis thaliana Col-0은 쌍떡잎식물의 표본품종으로, 원래 종자는 중국농업대학(China Agricultural University) 식물보호대학 잡초과에서 제공받았고, 번식 및 보존은 본 연구실에서 이 분야의 표준방법에 따라 수행되었다.
2. 벡터
벡터 플라스미드 pCBC-dT1T2 (Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29 ;14(1):327, 자세한 내용은 https://www.addgene.org/50590 참조), pHEE401E(Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ Genome Biol. 2015.7.21, 16:144. doi: 10.1186/s13059-015-0715-0. https://www.addgene.org/71287 참조), pHEE401E-NG(NG PAM을 인식할 수 있는 벡터pHEE401E-NG를 구성하기 위해 Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded Targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129 에서 보고된 돌연변이가 pHEE401E에 도입되었다)를 Addgene 웹사이트에서 구입하였고, 기존의 분자 생물학 방법에 따라 당사 연구실에서 구축되고, 당사 연구실에서 보관하였다.
3. 주요 장비
피펫 건, 수조, PCR 기기(Bio-rad T100), 전기영동 기기(WIX-EP600), 겔 이미저(gel imager), 전기송풍건조기(electric blast dryer), 원심분리기(Eppendorf 5424R), 고처리량 조직 용해기, 쉐이커, 전자 저울, pH 측정기, 등.
4. 주요 시약
고정확도 DNA 폴리머레이즈 (Tsingke Bio에서 구입), 아가로스 겔 리커버리 키트 및 플라스미드 추출 키트 (Sparkjade에서 구입), BsaI 및 T4 DNA ligase (NEB에서 구입), Trans5α 컴피턴트 세포(competent cells) 및 EHA105 컴피턴트 세포 (TransGen Biotech에서 구입, Beijing, China), GV3101 Agrobacterium 컴피턴트 세포 (Shanghai AngyuBio에서 구입), Tris, EDTA, 카나마이신, 세팔로스포린, 하이그로마이신, 아가로스, 효모 분말, 트립톤, NaCl(Sangon Biotech에서 구입), MS 분말, 자당, Silwet-77, 하이그로마이신(Solarbio에서 구매), 핵산염료(Dured), 앱솔루트에탄올(sinopharm에서 구매), 등.
5. 주 용액의 준비
1) 종자살균제: 10% SDS 4mL, NaClO 20mL, 물을 넣어 200mL를 만든다.
2) SDS 추출 완충액: 1M Tris·HCl(pH 8.0) 40mL, 0.1M EDTA 50mL, 5M NaCl 10mL, 10% SDS 10mL에 물을 넣어 200mL를 만든다.
3) 감염액: 초순수 30mL에 자당 1.5g, Silwet-77 9μL를 가한다.
4) LB 고체 배지: 효모분말 5g, 트립톤 10g, NaCl 10g, 한천 15g에 물을 넣어 1L를 만들고, 121℃에서 15분간 멸균한 후 접시에 부어 사용한다.
5) 50Х TAE 스톡: 초순수 800mL에 Tris 242g, Na2EDTA·2H2O 37.2g를 첨가해 잘 저어 녹이고, 아세트산 57.1mL를 첨가하고, 잘 교반하고, 최종적으로 탈이온수로 1L까지 희석하고, 실온에서 보관한다.
6) MS 고체 배지: 초순수 800mL에 MS 분말 4.42g 및 자당 10g을 측량해 첨가하여 pH 5.8로 조정한 후, 물을 첨가하여 1L가 되도록 하고 피타겔(phytagel) 10g을 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균하고, 추후 사용을 위해 접시에 부었다.
B. 실험방법
1. CRISPR/Cas9 이중 표적 벡터의 설계 및 제작
1.1 표적 설계
Arabidopsis thaliana ALS 유전자 서열은 서열번호 2로 나타내었다. 19개 염기의 표적서열 gRNA1(5'-GCATGGTTATGCAATGGGA-3')은 Arabidopsis thaliana ALS574 부위 부근의 AGA를 PAM으로 사용하여 설계되었으며, 편집 후에 PAM의 처음 3-4 부위 사이의 하나의 G염기가 결실되는 것이 예상되며, 제2 표적서열 gRNA2(5'-GGCATGGTTATGCAATGGA-3')가 염기의 결실로부터 형성된 서열을 기반으로 설계되었으며, 하나의 T 염기가 두번째 편집을 통해 삽입되어 도 2와 같이 TGG-TTG의 변환을 실현할 것으로 예상된다.
유사하게, 19개 염기의 표적서열 gRNA3(5'-TGCCGATGATCCCGAGTGG-3')은 Arabidopsis thaliana ALS653 부위 근처의 TGG를 PAM으로 사용하여 설계되었으며, 편집 후에 PAM의 처음 3-4 부위 사이의 하나의 G 염기가 결실되는 것이 예상되며, 제2 표적서열gRNA4(5'-TTGCCGATGATCCCGATGG-3')가 염기의 결실로부터 형성된 서열을 기반으로 설계되었으며, 두번째 편집 후에 하나의 A 염기가 삽입되어 도 2와 같이 AGT-AAT의 변환을 실현할 것으로 예상된다.
1.2 벡터 제작
Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1): 327에 설명된 방법이 수행되었다. 구체적으로, dT1T2 플라스미드를 주형으로 사용하여 각각 ALS574 및 653 부위 이중표적 단편을 증폭하여 sgRNA 발현 카세트를 제작하였다. pHEE401E 및 pHEE401E-NG의 벡터 백본(backbones)을 BsaI로 분해하고, 밴드를 겔에서 절단하여 회수하고, 표적단편을 분해한 후 라이게이션 반응에 직접 사용하였다. T4 DNA 리가아제를 사용하여 벡터 백본과 표적단편을 연결하고, 연결 산물을 Trans5α 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환하고, 시퀀싱을 위해 상이한 모노클론을 선택했다. 시퀀싱을 통해 확인한 후 Sparkjade High Purity Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 플라스미드를 추출하여 각각 pQY743 및 pQY745로 명명된 재조합 플라스미드를 얻었다.
2. 표적 검출용 프라이머 설계
표적 검출용 프라이머는 ALS574 및 ALS653 표적부위를 중심으로 하였고, 업스트림 검출용 프라이머는 ALS574 표적부위로부터 약 100bp, 다운스트림 검출용 프라이머는 ALS653 표적부위로부터 약 280 bp였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 574/653checking-F: 5'ATTGACGGAGATGGAAGCTT3', 및 574/653checking-R: 5'CCAAACTGAGCCAGTCACAA3'.
3. Arabidopsis thaliana 유전자 변형 시스템 구축
3.1 Agrobacterium 형질전환
제작된 재조합 플라스미드를 Agrobacterium GV3101 컴피턴트 세포(competent cells)로 형질전환시켜 재조합 Agrobacterium 세포를 얻었다.
3.2 Agrobacterium 감염액의 제조
1) 활성화된 Agrobacterium을 채취하여 YEP 액체 배지(25mg/L Rif 및 50mg/L Kan 함유) 30ml에 접종하고 OD600 값이 약 1.0-1.5가 될 때까지 200rpm 및 28℃에서 밤새 진탕 배양하였다.
2) 6000rpm에서 10분간 원심분리한 후 Agrobacterium을 채취하고 상층액은 버렸다.
3) 추후 사용을 위해 Agrobacterium을 OD600=0.8로 감염액(pH를 조정할 필요가 없음)에 재현탁했다.
3.3 Arabidopsis thaliana의 형질전환
1) 식물 형질전환 전 식물이 잘 자라는지, 꽃차례가 무성한지, 스트레스 반응이 없는지에 주목하였다. 제1 형질전환은 식물 높이가 약 20cm일 때 수행되었다. 흙이 말랐을 때 물을 적절히 주었다. 성장한 실리크(siliques)는 형질전환 전날 가위로 잘랐다.
2) 형질전환 될 식물의 꽃차례를 상기 용액에 담가 30초 내지 1분 동안 부드럽게 저어주었고, 침투된 식물에 액체막 층이 있어야 한다.
3) 형질전환이 완료된 식물체를 암실에서 24시간 배양한 후 꺼내어 생장을 위한 정상적인 광환경에 두어 배양시켰다.
4) 1주일 후 동일한 방법으로 제2 형질전환이 수행될 수 있었다.
3.4 종자 수확
씨앗이 성숙한 후, 수확되었다. 수확 후, 종자를 37°C의 오븐에서 약 1주일 동안 건조시켰다.
4. 형질전환 식물체의 선별
종자를 소독제로 5분간 처리한 후 탈이온수로 5회 세척하고 MS 선별 배지(30μg/mL 하이그로마이신, 100μg/mL 세팔로스포린 함유)에 도포하여 인큐베이터(온도 22℃, 점등 16시간, 소등 8시간, 조도 100-150μmol/m2/s, 습도 75%)에 배지를 두고, 1주일 후 양성 묘목을 선별하여 토양에 이식하였다.
5. T1 돌변변이 식물체의 검출
5.1 지놈 DNA의 추출
1) Arabidopsis thaliana 잎을 잘라 2mL 원심분리관에 넣은 뒤 강구(steel ball)를 넣어 고처리량 조직 용해기(high-throughput tissue lyser)로 분쇄하였다.
2) 분쇄가 완료된 후 SDS 추출 완충액 400μL를 첨가하여 뒤집어 혼합하고 65℃수조에서 15분간 배양하였고 5분마다 뒤집어 혼합하였다.
3) 13,000rpm에서 5분간 원심분리를 수행하였다.
4) 300μL의 상등액을 피펫팅하여 새로운 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고, -20°C로 미리 냉각된 동량의 이소프로판올을 원심분리관에 첨가하고, 원심분리기 튜브를 -20°C에 1시간 또는 하룻밤 두었다.
5) 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버렸다.
6) 원심분리관에 70% 에탄올 500μL를 넣어 펠릿을 세척하고 원심분리 후 세척액을 버리고(펠릿을 버리지 않도록 주의) 상온에서 건조한 후 DNA용해를 위해 초순수 30μL를 첨가했으며, DNA는 -20°C에서 보관되었다.
5.2 PCR 증폭
추출된 T1 식물 지놈을 주형으로 사용하고, 검출 프라이머를 사용하여 표적단편을 증폭하고, 5μL의 증폭된 생성물을 피펫팅하여 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검출하고, 겔 이미저로 이미지화하였다. 나머지 생산물은 시퀀싱 업체에 의뢰해 직접 시퀀싱을 진행했다.
6. T2돌연변이 식물의 검출
단일 식물에서 T1 집단의 종자를 수확한 후, 두 벡터의 상이한 집단의 종자를 선별하여 이마자픽(imazapic) 선별배지(MS 배지 + 0.24μg/mL imazapic)에 도포하여 선별하고 양성묘를 이식하였다. 1주일 후 토양에 이식하고 분자 검출을 하였으며, 방법은 5단계와 동일하였다.
사용된 프라이머 및 이의 서열:
Figure pct00002
C. 실험결과
1. T1 식물체의 유전자형 검출
T1 종자는 MS 하이그로마이신 배지에 의해 선별되었고, pQY743 벡터에 대해 총 32개의 양성 묘목을 얻었고, pQY745 벡터에 대해 총 18개의 양성 묘목을 얻었다. 각 벡터에 대해 10개의 묘목을 선별하고 이의 잎 지놈 DNA를 추출하여 표적부위를 검출하였다. ALS574 부위에서는 T1세대에서 편집 이벤트가 발생하지 않았으며, ALS653 부위에서는 설계 기대치를 충족시키는 편집 이벤트가 있는 것으로 확인됐다. 검출 결과는 표 1에 나타내었다.
T1 식물체의 돌연변이 유형
ALS 부위 벡터 번호 T1 식물 번호 편집 유형
574 pQY743 1-10 WT
653 pQY745 3,4-8,10 Chimera
1,2,9 Heterozygote
2. T2 세대 종자의 선별 결과
단일 식물의T2 세대 종자를 수확한 후 이마자픽 저항성 배지에 도포하여 선별을 수행한 결과, 야생형 Col-0은 저항성 배지에서 성장하지 못하는 반면, 도 3과 같이 돌연변이체 양성 식물은 정상적으로 성장함을 알 수 있었다.
각 벡터에 대해, 10개의 묘목을 선별하고 분자 검출을 위해 잎에서 지놈 DNA를 추출하였다. pQY743 벡터의 경우, 예상한대로 도 4와 같이 TGG에서 TTG로 변이된 돌연변이를 가진 6개의 집단이 있음을 확인했다. 또한, 이형 돌연변이가 있는 집단이 1개 있었고, 키메라 돌연변이가 있는 3개의 집단이 있었다. 검출 결과는 표 2에 나타내었다.
T2 식물체의 돌연변이 유형
ALS 부위 벡터 번호 T2 식물 번호 편집 유형
574 pQY743 2,3,5,6,7,9 Homozygote
4 Heterozygote
1,8,10 Chimera
상기 결과는 본 발명의 프로그래밍된 순차적 절단/편집 기술을 사용함으로써 표적부위에서 예상되는 돌연변이의 설계 및 실현이 가능하며, 순차적인 sgRNA와 Cas9단백질만의 조합만으로 염기 치환 돌연변이가 실현될 수 있음을 보여준다.
실시예 2: Arabidopsis thaliana ALS 유전자의 W574 및 S653 부위에서 프로그래밍된 순차적 절단/편집을 통해 다중 돌연변이 유형의 달성
벡터 설계, 제작, Arabidopsis thaliana 형질전환 및 선별을 위한 조작 단계는 실시예 1을 참조하여 수행하였다. AtALS W574 부위에서, 벡터의 설계는 실시예 1과 동일하였다. 벡터의 개략도는 도 5에 나타나 있으며, W574L 돌연변이는 특정 부위에서 먼저 -G, 그 다음 +T에 의해 실현될 것으로 예상되었다. 벡터 형질전환된 Arabidopsis thaliana의 T1 세대에서는 편집 이벤트가 검출되지 않았다. 0.24 mg/L 이마자픽으로 형질전환된 Arabidopsis thaliana의 T2 세대를 선별하였고, 도 6의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이 다수의 제초제 저항성 식물이 획득되었고, 이들 저항성 식물의 분자 검출을 수행하였으며, PCR 생산물 시퀀싱 결과, 도 6의 우측 패널에 나타낸 바와 같이 W574 부위에 예상되는 W574L 돌연변이뿐만 아니라 또 다른 저항성 돌연변이 W574M도 나타났다.
AtALS S653 부위에서, 벡터의 설계는 실시예 1과 동일하였다. 벡터의 도면은 도 7에 나타내었고, S653N 돌연변이는 특정 부위에서 먼저 -G, 그 다음 +A에 의해 실현될 것으로 예상되었다. 벡터 형질전환된 Arabidopsis thaliana의 T1 세대에서 예상된 S653N 돌연변이의 편집 이벤트가 검출되었다. 0.24 mg/L 이마자픽으로 형질전환된 Arabidopsis thaliana의 T2 세대를 연속적으로 선별하였고, 도 8의 좌측 패널과 같이 다수의 제초제 저항성 식물이 획득되었고, 이들 저항성 식물의 분자 검출을 수행하였으며, PCR 생산물 시퀀싱 결과, 도 8의 우측 패널에 나타낸 바와 같이 S653 부위에서 예상되는 S653N 돌연변이뿐만 아니라 두 개의 다른 저항성 돌연변이 S653R과 S653R/G654D도 나타났다.
상기 결과는 본 발명의 프로그래밍된 순차적 절단/편집의 기술을 사용하여 표적부위에 대해 설계된 예상 돌연변이 외에, 순차적인 sgRNA와 상응하는 Cas9단백질만의 조합만을 설계함으로써 다수의 기능적인 돌연변이 유형들을 발생시킬 수 있으며, 이는 새로운 기능적인 돌연변이를 만드는 데 적합한 도구라는 것을 보여준다.
실시예 3: Arabidopsis thaliana ALS 유전자의 W574 부위 근처에서 프로그래밍된 순차적인 절단/편집을 위해 상이한 PAMs를 사용한 W574M 저항성 돌연변이의 발생
벡터 설계, 제작 및 Arabidopsis thaliana 형질전환 및 선별은 실시예 1을 참조하여 수행되었으나, AtALS W574 부위 근처의 서열 5'CTTGGCATGGTTATGCAATG gg 3'에 대해 W574 부위에 가까운 GG가 sgRNA1: 5'CTTGGCATGGTTATGCAATG3'을 설계하기 위한 PAM으로 먼저 사용되었다, 여기서 W574 부위는 밑줄이 그어져 있고 NG PAM은 이탤릭체로 표시되었다. 절단 및 복구 후 +A에 의해 새로운 서열 5'CTTGGCATGGTTATGCAAATGGGAag3'이 형성될 것으로 예측되었다. AG는 sgRNA2: 5'CTTGGCATGGTTATGCAAATGGGA3'를 설계하기 위한 새로운 PAM 부위로 사용되었고, 세포의 자발적인 복구 후에 -G 유전자형이 발생되어 W574M이 발생되었다. 즉, 이 계획에서 두 절단에 대해 서로 다른 PAM 부위가 사용되었다. 벡터 도면은 도 9에 나타내었다. 벡터는 Arabidopsis thaliana를 형질전환하는 데 사용되었으며, T1 세대 형질전환 집단은 유전자형 검출을 거쳐, W574M의 예상되는 편집 이벤트가 검출되었고, 식물체는 이마자픽(imazapic) 처리에 저항성을 보였다.
실험결과는 본 발명의 기술 및 상이한 PAM을 사용한 프로그래밍된 순차적 절단/편집을 사용함으로써 더 넓은 서열 범위에서 편집이 수행되어 아미노산 치환을 얻을 수 있음을 보여준다.
실시예 4: Oryza sativa ALS 유전자의 D350 및 W548에 대한 예측 가능한 염기 치환 설계
NG PAM을 인식할 수 있는 벡터pHEE401E-NG를 구성하기 위해 Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded Targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129 에서 보고된 돌연변이가 pHEE401E에 도입되었다((A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327. 10.1186/s12870-014-0327-y, 자세한 내용은 https://www.addgene.org/71287/ 참조).
Oryza sativa의 ALS 유전자 서열은 서열번호 12번에 나타내었다. Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014에 설명된 방법에 따라, 5'GGCGTGCGGTTTGATGATCG3' (밑줄은 Arabidopsis thaliana ALS-D376에 상응하는 OsALS-D350 부위) 및 편집에서 형성될 것으로 예상되는 새로운 서열 5'GGCGTGCGGTTTGATGACG3'을 표적으로 사용해 이중표적 벡터를 제작하였으며, OsALS D350E 돌연변이를 일으키는 TGG-TTG 변환을 얻을 것으로 예상되었다.
5'GGTATGGTTGTGCAATGGGA3' (밑줄은 Arabidopsis thaliana ALS-W574에 상응하는 OsALS-W548 부위) 및 편집에서 형성될 것으로 예상되는 5'GGTATGGTTGTGCAATGGA 3'을 표적으로 사용해 이중표적 벡터를 제작하였으며, OsALS W548L 돌연변이를 일으키는 TGG-TTG 변환을 얻을 것으로 예상되었다.
그런 다음 형질전환 식물체를 얻기 위해 두 벡터를 Oryza sativa로 옮겨, 확인 결과 예상했던 전환인 D350E 및 W548L이 있는 식물체를 얻었다. 현장에서 제초제 저항성 바이오테스트 결과 D350E 및 W548L 돌연변이체가 ALS 억제제 제초제에 대한 저항성을 획득한 것으로 나타났다.
실시예 5: Oryza sativa ACCase2 유전자의 W2038 부위에 대한 예측 가능한 염기 치환 설계 및 다중 돌연변이 유형의 선별
Oryza sativa ACCase2 유전자 서열은 서열번호 14번에 나타내었으며, 여기서 OsACCase2 W2038 부위는 Alopecurus myosuroides의 ACCase W2027 부위에 상응된다. sgRNA1: 5'TTCATCCTCGCTAAC-TGAG3'를 설계하기 위해 이 부위에 가까운 AGG가 PAM으로 사용되었고, 절단 및 복구 이후 -G에 의해 새로운 서열이 형성될 것으로 예측되었다. sgRNA2: 5'CTTC-ATCCTCGCTAACTGAG3'를 설계하기 위해 AGG를 PAM으로 계속 사용하였으며, 절단 및 복구를 다시 거쳐 +T 유전자형이 발생되었으며, W2038L 돌연변이가 발생되었다. pHUE411 벡터에 sgRNA1 및 sgRNA2를 구성하여 편집벡터를 제작하였으며, 벡터 도해는 도 10에 나타내었다.
편집 벡터를 사용하여 Huaidao 5호(벼 품종)의 캘러스를 형질전환시켰고, 50㎍/L 하이그로마이신과 50㎍/L퀴잘로포프-p로 함께 선별을 한 3주 후, 많은 수의 저항성을 가진 캘러스를 얻었으며, 도 11의 좌측 패널에 나타내었다. 유전자형 식별을 위해 저항성 캘러스를 채취하였고, 도 11의 우측 패널과 같이 예상되는 W2038L 돌연변이뿐만 아니라 W2038C 돌연변이도 발생함을 확인하였다.
상기 Oryza sativa 유전자의 프로그래밍된 순차적 절단/편집 결과는 본 발명의 기술이 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에 적용가능함을 보여주었다.
실시예 6: SpCas9 및 NGA-Cas9 단백질의 발현 및 정제
1. 실험 기구 및 시약
실험 시약
시약 준비 및 사용
Q5 DNA 폴리머레이즈 NEB에서 구매
I5 DNA 폴리머레이즈 및 I5 반응용액 Tsingke Bio에서 구매
dNTPs Shanghai Sangon
Ni-NTA 레진 Shanghai Sangon
Tris/NaCl/imidazole Shanghai Sangong
DTT Shanghai Sangong
β-mercaptoethanol Sigma
SDS-PAGE 프리캐스트 겔 Nanjing GenScript
Superdex200 컬럼 GE Healthcare
실험 기구
실험기구 모델
PCR 기구 Bio-rad T100
항온 진탕 장치 Ounuo HNY-200B
세포 파쇄기(Cell disrupter) Ningbo Xinzhi JY92-IIN
전기영동장치 WIX-EP600
단백질 정제기 GE AKTA pure
고속 대용량 냉동원심분리기 Xiangzhi ZX21K
고속 원심분리기 Eppendorf 5424R
백색광 필름 뷰어(White light film viewer) Beijing Liuyi WD-9406
핵산 겔 이미저(Nucleic acid gel imager) Beijing Sage ChampGelTM 5000
미세 분광 광도계(Micro spectrophotometer) DS-II
2. 실험 방법
2.1 pET15b-Cas9 발현 벡터의 제작
식물 코돈의 최적화 후 얻은 SpCas9 및 NGA-Cas9 단백질의 DNA 서열은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타내었으며, 각각의 서열은 GenScript를 통해 주형 DNA로 합성되었다
NG-Cas9및 NGA-Cas9 서열을 따로 증폭시킨 후, 두 개의 단편을 pET15b 발현벡터에 주입법(infusion)으로 연결하고, DH5a로 형질전환하여, 검증을 거친 후 서열분석을 하였다.
PCR 검증 증폭 시스템 및 프라이머
반응계, 50 ul
2Х I5 반응 용액 25 ul
주형 DNA 1 ul
포워드 및 리버스 프라이머 각각 2 ul
초순수 50 ul까지 첨가
프라이머 서열: 5'-3'
pET15b-NG Cas9 -F Gtgccgcgcggcagccatatggattacaaggaccacgacg
pET15b-NG Cas9-R Tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttcgcctgc
pET15b-NGA Cas9 -F Tgccgcgcggcagccatatgatggattacaaggaccacgacg
pET15b-NG Cas9 -R Tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttggcctgtccc
2.2 단백질의 발현 및 정제
제조된 발현 벡터를 Escherichia coli Rosetta(DE3)에 형질전환시키고, IPTG로 발현을 유도하고, Ni-NTA 컬럼을 이용하여 박테리아를 채취, 용해 및 정제하였다. 구체적인 방법은 다음과 같았다:
a) 재조합 발현 벡터를 Rosetta(DE3) 집단으로 형질전환하고, 10 ml의 LB 배지에서 CmR+Amp(pET15b) 또는 CmR+Kana(pET28a) 저항성을 가진 단일 콜로니를 선별하여, 37℃에서 200 rpm으로 밤새 배양하고, 1L의 LB 배지를 포함하는 2L 진탕 플라스크로 옮기고, OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37°C 및 200rpm에서 배양하고, 18°C로 냉각하고, 0.5mM IPTG로 밤새 발현을 유도하고, 박테리아는 4000g에서 원심분리에 의해 채취되었다.
b) 채취한 박테리아를 Ni-완충액 A에서 재현탁시켰다: 50mM HEPES, pH7.4, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 5mM β-메르캅토에탄올에 PMSF, 최종 농도 1mM 및 250 ul 혼합 억제제 250ul를 추가, 그리고 잘 섞어주었다.
c) 재현탁된 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 4°C에서 40000g으로 30분간 원심분리하고 상층액을 모아 Ni-NTA 컬럼에 통과시켰다.
d) Ni-NTA 컬럼을 통한 정제: 용해물 상층액을 레진과 20분간 결합시키고, 50mM 이미다졸이 포함된 완충액 A로 용출하여 불순물을 제거하고, 최종적으로 400mM 이미다졸을 포함하는 용출 완충액으로 용출하였다.
e) SDS-PAGE 겔 전기영동 시스템을 사용하여 단백질의 정제 효과를 검출하였다.
f) 완충액을 50mM HEPES pH 7.5, 150mM KCl, 1mM DTT, 3% 글리세롤로 변경하여 투석을 수행했다.
h) 최종 시료를 SDS-PAGE 겔 전기영동하여 단백질의 정제 효과를 검출하였다. 한외여과에 의한 농축 후, 단백질은 추후 사용을 위해 -80°C에서 동결되었다.
2.3 Cas9 융합 단백질의 발현 및 정제 결과
SpCas9 및 NGA-Cas9 단백질의 정제 결과를 도 12에 나타내었다. 화살표는 Cas9 단백질 밴드를 나타내며, 이는 더 높은 순도로 정제되었음을 나타낸다.
실시예 7: OsACCase2 W2038 및 OsALS W548 표적부위에 각각 검출된 SpCas9 및 NGA Cas9 단백질의 In vitro 효소 절단 활성
1. OsALS 및 OsACCase2 유전자의 DNA 서열은 CRISPOR 온라인 툴(http://crispor.tefor.net/)에 입력되었으며, 다음의 sgRNA는 Arabidopsis thaliana ALS 단백질의 574번 아미노산 부위와 상응되는 OsALS의 W548 (OsALS의 548번째 아미노산, Oryza sativa ALS 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 11에 나타내었다) 및 Alopecurus myosuroides의 아미노산 부위 2027에 상응하는 OsACCase2의 W2038 (OsACCase2의 2038번째 아미노산, Oryza sativa ACCase2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 13에 나타내었다) 를 위해 설계되었으며, 이러한 sgRNA는 GenScript에 의해 합성되었다 .
>sgRNA1-548-G:
5'GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'
> sgRNA1-2038-G:
5'GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'
2. 특정 검출 프라이머 OsALS265AA-F: 5'ggtcttgcgtctggttggc3' 및 OsALS-end-R: 5'ccatgccaagcacatcaaacaag3'는 OsALS W548 표적부위를 포함하는 단편을 증폭하는 데 사용되었으며 PCR 산물의 길이는 1200 bp였다.
특정 검출 프라이머 OsACC1750AA-F: 5'gcgaagaagactatgctcgtattgg3' 및 OsACC2196AA-R: 5'cttaatcacacctttcgcagcc3'은 OsACCase W2038 표적부위를 포함하는 단편을 증폭하는데 사용되었으며 PCR 산물은 1500bp 길이였다.
PCR 시스템은 아래에 나타내었다:
Figure pct00003
3. PCR 반응이 확립되었고, 반응 조건은 아래에 나타내었다:
Figure pct00004
4. PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 검출되었고 추가 검증을 위해 시퀀싱을 거쳤다. 정확하게 검증된 후 젤을 절단하여 DNA 단편을 회수했다. 회수된 DNA 단편을 RNase가 없는 초순수 30ul를 첨가하여 용해시키고 농도를 측정하였다.
5. Cas9 단백질 활성을 검출하기 위해 아래와 같은 검출 시스템을 사용하였으며, 시스템이 준비된 후 37°C에서 1시간 동안 배양하였다.
Figure pct00005
6. 반응이 완료된 후, 시스템을 65℃에서 10분 동안 처리하고, 4 ul의 6x DNA 로딩 완충액을 첨가하고, 밴드 크기를 검출하기 위해 2% 아가로스 겔 상에서 작동시켰다.
그 결과를 도 13에 나타내었고, 정제된 Cas9 단백질은 sgRNA의 존재 하에서만 설계된 표적부위에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 2개의 다른 표적 RNP 복합체로 Oryza sativa 원형질체를 형질전환하여 OsALS548 부위에서 W548L 돌연변이 발생
1. Oryza sativa 원형질체의 준비 및 PEG-매개 형질전환은 발간된 방법(Bart et al., 2006)을 부분적으로 변형한 것을 기반으로 수행되었으며, 구체적인 준비 단계는 다음과 같다:
(1) 원형질체를 위해 Oryza sativa 묘목을 먼저 준비하였다. 쌀의 품종은 Nipponbare였다. 먼저 벼 종자를 껍질을 벗기고, 껍질을 벗긴 종자를 75% 에탄올로 1분간 헹구고, 5%(v/v) 차아염소산나트륨으로 20분간 처리한 후, 멸균수로 5회 이상 세척하고, 매우 청결한 테이블에 놓고 블로우-드라이를 한 다음, 1/2 MS 배지가 들어 있는 조직 배양 플라스크에 각 20개의 종자를 넣었다. 원형질체는 종자를 약 10일 동안 26°C 및 12시간의 광환경에서 배양하여 준비했다.
(2) 묘목의 잎 덮개를 선별하고, 날카로운 질레트 면도날로 약 1mm 조각으로 자르고, 추후 사용을 위해 0.6M 만니톨 및 MES 배양 배지(제형: 0.6M 만니톨, 0.4M MES, pH 5.7)에 넣었다. 모든 물질을 절단한 후, 효소용액 20mL(제제: 1.5% 셀룰라아제 R10/RS(YaKult Honsha), 0.5% Mecerozyme R10(YaKult Honsha), 0.5M 만니톨, 20mM KCl, 25mM MES, pH .7, 10mM CaCl2, 0.1% BSA, 5mM β-mercaptoethanol)로 옮겨졌고, 알루미늄 호일로 싸서 28℃에서 진탕기에 넣었다. 암실에서 약 4시간 동안 50rpm으로 효소분해를 수행하고, 마지막 2분 동안 속도를 100rpm으로 증가시켰다.
(3) 효소분해 후, 동일한 부피의 W5 용액(제형: 154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 15mM MES)을 첨가하고, 10초 동안 수평으로 흔들어 원형질체를 방출시켰다. 효소 분해 처리한 세포를 300-mesh 체를 통해 여과하고 150g에서 5분 동안 원심분리하여 원형질체를 채취하였다;
(4) 세포를 W5 용액으로 두 번 헹구고 150g에서 5분 동안 원심분리하여 원형질체를 채취하였다.
(5) 원형질체를 적절한 양의 MMG 용액(제형: 3.05g/L MgCl2, 1g/L MES, 91.2g/L 만니톨)으로 재현탁시켰고, 원형질체 농도는 약 2 x 106 cells/mL이었다.
2. RNP 복합체의 준비:
OsALS548 표적 부위 서열 GGGTATGGTTGTGCAATGGGAgga (OsALS W548 부위는 밑줄, Arabidopsis thaliana ALS W574에 상응하며 Cas9 단백질에 의해 인식되는 PAM 부위는 이탤릭체 소문자로 표시)에 따라, 정제된 NGA-Cas9 단백질을 선별하여 RNP를 제조하였다. >CrRNA1-548-G: 5'-GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuaugcu-3'를 설계하기 위해 GGA가 PAM으로 사용되었으며, 편집 후 PAM의 처음 3-4개 위치 사이에서 하나의 G 염기가 결실될 것으로 예측되었으며, 위 염기의 결실로 얻은 서열이 두번째 >CrRNA2-548+T: 5'-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3'를 설계하기 위해 사용되었으며, TGG-TTG 변환을 얻기 위해 두번째 편집 후에 하나의 T 염기가 삽입될 것으로 예측되었다.
>CrRNA1-548-G 및 >CrRNA1-548+T는 GenScript Biotechnology Company에서 합성되었으며 sgRNA도 합성되었다:
>sgRNA1-548-G:
5'GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'
>sgRNA2-548+T:
5'UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'.
합성된 crRNA와 GenCRISPR tracrRNA(GenScript SC1933)를 등몰로 혼합하고, crRNA&tracrRNA 어닐링 완충액(GenScript SC1957-B)을 첨가하고 어닐링하여 지침에 따라 gRNA를 제조하였다. tracrRNA 서열은 5'-agcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu-3'이었다.
RNP 반응 시스템은 아래에 따라 준비되었으며, 반응 시스템이 준비된 후 25℃에서 10분간 배양하였다.
Figure pct00006
3. 원형질체 형질전환
(1) 위에서 제조한 MMG 재현탁된 원형질체 200㎕를 취하여 배양으로 생성된 RNP 복합체(Cas9 단백질 20㎍, sgRNA 20㎍)를 첨가하고, 부드럽게 휘저어 잘 혼합하였다.
(2) 동일한 부피의 40%(w/v) PEG 용액(제형: 40%(w/v) PEG, 0.5M 만니톨, 100mM CaCl2)을 첨가하고 부드럽게 흔들어 잘 섞이도록 하고 15분간 28°C암실에 두었다;
(3) 유도 및 형질전환 후, W5 용액 1.5mL를 천천히 첨가하고, 세포가 잘 혼합되도록 부드럽게 흔들어준 뒤, 150g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 이 단계는 한 번 반복되었다;
(4) 1.5mL의 W5 용액을 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 28℃배양기에 넣고 12-16시간 동안 암실에서 배양하였다. 원형질체 지놈 DNA를 추출하는 경우 세포를 48~60시간 동안 배양해야한다.
4. 지놈 표적 편집 이벤트의 검출
(1) 부분적으로 변형된 CTAB 방법을 사용하여 원형질체 DNA를 추출하였으며, 방법은 구체적으로 다음과 같다: 원형질체를 원심분리하고 상층액을 버리고, 500 μL의 DNA 추출 용액을 첨가하고, 진탕 및 잘 혼합하고, 65°C 수조에서 1시간 동안 배양하였다; 샘플을 수조에서 배양한 후 냉각하고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하고, 잘 혼합되도록 여러 번 뒤집어 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리했다. 400μl의 상층액을 취하여 새로운 1.5mL 원심분리관에 옮기고 70%(v/v) 에탄올 1mL를 첨가하고 -20°C에서 20분 동안 침전되도록 두었다; 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 침전시키고, 침전물을 공기 중에서 건조시킨 다음 초순수 50 ㎕를 첨가하여 용해시키고, 추후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
(2) 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 W548 표적부위를 포함하는 단편을 증폭시키고, 표적부위에 대해 다음 검출 프라이머를 설계하였다:
OsALS500AA-F: 5'GGCTAACCCAGGTGTCACAG3',
OsALS-3'UTR-R: 5'CCATGCCAAGCACATCAAACAAG3'
PCR 반응 시스템은 아래에 나타내었다:
Figure pct00007
(3) PCR 반응이 확립되었고, 일반적인 반응 조건은 아래에 나타내었다:
Figure pct00008
(4) 검출은 아가로스 겔 전기영동으로 수행하였고, PCR 단편을 회수하고 시퀀싱하였다.
5. 실험결과:
어닐링에 의한 합성 crRNA 및 tracrRNA로 제조된 gRNA를 사용하거나 합성 sgRNA를 직접 사용함으로써, 활성 RNP 복합체가 정제된 NGA-Cas9 단백질로 형성될 수 있었다. OsALS548 표적부위를 시퀀싱함으로써, TGG에서 TTG로의 돌연변이를 검출할 수 있었고, 이는 crRNA 또는 sgRNA의 순차적인 조합으로 형성된 RNP복합체의 프로그래밍된 순차적인 절단/편집으로 세포 내 표적부위의 부위 특이적 돌연변이가 발생될 수 있음을 입증한다. 도14에 도시된 바와 같이, 원형질체 OsALS548 표적 시퀀싱 피크의 화살표 지점에는 원래의 G 염기 신호 피크 외에 돌연변이로부터 생성된 T 염기 신호 피크도 있었고, 이는 OsALS548 부위에서 W548L 돌연변이를 초래하였다.
실시예 9: Oryza sativa 캘러스에 2개의 상이한 RNP 복합체를 충돌시켜 OsACCase2 W2038 부위에서 W2038L 돌연변이 발생
1. RNP 복합체의 준비:
OsACCase2 W2038 표적부위서열 GTTCATCCTCGCTAACTGGAGagg에 따라, 이 때 Alopecurus myosuroides ACCase W2027에 상응하는 OsACCase2 W2038 부위에 밑줄로 표시하였으며 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 부위를 이탤릭체 소문자로 나타내었고, 정제된 SpCas9 단백질을 선별하여 RNP 복합체를 준비했다. >CrRNA1-2038-G: 5'-GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuaugcu-3'을 설계하기 위해 GGA가 PAM으로 사용되었으며, 편집 후 PAM의 처음 3-4개 위치 사이에서 하나의 G 염기가 결실될 것으로 예측되었으며, 염기의 결실로 인해 형성된 서열을 사용하여 두번째 >CrRNA2-2038+T: 5'-UGUUCAUCCUCCGCUAACUGAGguuuuagagcuaugcu-3'을 설계했으며, 두번째 편집 후에 하나의 T 염기가 삽입될 것으로 예측되어, TGG-TTG의 전환이 획득되었다.
>CrRNA1-2038-G 및 >CrRNA2-2038+T GenScript Biotechnology Company에서 합성되었으며, sgRNA도 합성되었다:
>sgRNA1-2038-G:
5'GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3'
>sgRNA2-2038+T:
5'UGUUCAUCCUCGCUAACUGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3'.
합성된 crRNA와 GenCRISPR tracrRNA(GenScript SC1933)를 등몰로 혼합하고, crRNA&tracrRNA 어닐링 완충액(GenScript SC1957-B)를 첨가하고 어닐링하여 지침에 따라 gRNA를 준비하였다.
RNP 복합체는 실시예 8과 동일한 반응 시스템에서 배양하여 제조되었다. 형질전환을 위한 10개의 유전자 총 충격량을 예로 들면: 20㎍의 Cas9 단백질, 20㎍의 gRNA 또는 sgRNA, 10㎕의 10x Cas9 반응 완충액, RNase 가 없는 초순수로 만든 완충액 총 100μl를 25°C에서 10분 동안 배양하고 부드럽게 혼합했다.
2. Oryza sativa 캘러스 유도
성숙하고 통통한 Oryza sativa 종자를 선별하고, 껍질을 벗기고, 다음 단계에 따라 살균하였다:
(1) 벼(Oryza sativa) 종자를 껍질을 벗기고, 벼 품종은 종자 시장에서 구입한 Huaidao 5호 였다.
(2) 세척된 물이 투명해질 때까지 종자를 멸균수로 무제한 세척하였다.
(3) 70% 알코올로 1분간 살균한 후, 종자를 10% 차아염소산나트륨에 넣고 수평진탕기에서 25분간 진탕 배양하였다.
(4) 차아염소산나트륨 살균 후 종자를 멸균수로 5회 세척하였다. 종자를 캘러스 유도 배지(제형: MS 분말(4.42g/L) + 2,4-D(2mg/L) + 자당(30g/L) + 피타겔(4g/L))에 파종하고, 캘러스를 유도하기 위해 28°C 암실에서 배양했다.
3. 유전자 총 RNP 충격:
(1) 고장성 재배
배발생성이 좋은 캘러스를 고장성 배지로 옮겼다(제형: MS 분말(4.42g/L) + 2,4-D(2mg/L) + 자당(30g/L) + D-만니톨(0.4M)) + 피타겔 (4g/L)), 매우 청결한 벤치에서 무균 작업을 하였으며, 25℃ 암실에서 4-6시간 동안 배양하였다.
(2) 금 분말 현탁액의 제조: 수입된 1.5 mL EP 튜브를 사용하여 금 분말(직경 0.6 μm) 30 mg을 측량하였다; 70% 에탄올 1mL를 가하고 잘 볼텍싱한 후 얼음 위에 10분간 두었다. 1분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버렸다; 멸균수 1mL를 넣고 충분히 볼텍싱한 후 1분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 위의 과정을 3회 반복하였다. 멸균된 글리세롤(50%) 500μL를 첨가하고 철저히 볼텍싱하여 농도 60μg/μl의 금 분말 현탁액을 제조하고 -20°C에서 보관하였다.
(3) 50μl의 금 분말 현탁액(60μg/ml)을 취하여 제조된 RNP 복합체 100μL를 첨가하고 부드럽게 혼합하였다.
(4) 15 μl의 RNP/금 분말 혼합물을 취하여 PDS-1000 벤치탑 유전자 총(Bio-Rad)의 절단 가능한 막 중앙에 놓고, 건조시킨 다음, 기기의 지시에 따라 충격을 가했다.
폭격 매개변수: 진공도는 26-28, 거리는 6cm, 기압은 1100 psi 또는 1350 psi였다.
(5) 충격이 완료된 후 캘러스를 25°C의 고장성 배지에서 암실에서 밤새(16시간 동안) 배양하였다.
4. 선별, 분화 및 발근(rooting):
(1) 충격된 캘러스를 밤새 배양한 후, 유도 배지로 옮기고, 회복을 위해 28℃에서 1주일 동안 배양하였다.
(2) 1주일의 회복 후, 캘러스를 선별 배지(제제: 4.1g/L N6 분말 + 0.3g/L 가수분해 카제인 + 2.8g/L 프롤린 + 2mg/L 2,4-D + 3% 자당 + 50ug/L 퀴잘로포프-p(quizalofop-p) + 500mg/L 세팔로스포린(Cef) + 0.1g/L 이노시톨 + 0.35% 피타겔, pH5.8)로 옮겨 3-4주 동안 선별과정을 수행했다; 도 15와 같이 이후의 OsACCase2 W2038의 편집을 위해 50ug/L퀴잘로포프-p가 선별에 사용되었다.
(3) 선별된 성장 상태가 좋은 저항성 캘러스를 분화 배지(제제: MS 분말(4.42g/L) + KT(1mg/L) + 자당(30g/L) + 피타겔(4.5g/L))로 옮겼다. + 50 ug/L 퀴잘로포프-p, pH 5.8), 28℃의 빛이 있는 상태에서 배양하여 2-4주간 분화를 유도했다.
(4) 분화된 묘목을 발근을 위해 발근 배지(제형: 1/2 MS 분말(2.3g/L) + 자당(30g/L) + 피타겔(4.5g/L))로 옮기고, 발근이 완료된 후 묘목을 템퍼링하여, 흙을 채운 화분에 옮겨 온실에 넣어 재배하였다.
5. 저항성 캘러스 및 T0 조직 배양 묘목에서 표적 편집 이벤트의 검출:
총 11개의 저항성 캘러스가 선별되었으며, 이들의 DNA는 CTAB 방법으로 추출되었다. 표적부위에 대한 검출 프라이머는 다음과 같이 설계되었다: OsACC2038test-F: 5'CTGTAGGCATTTGAAACTGCAGTG3', OsACC2038test-R: 5'GCAATCCTGGAGTTCCT-CTGACC3', 및 OsACCase2 W2038 부위를 포함하는 PCR 단편을 증폭, 회수 및 서열화하였다. 시퀀싱 검출에서 그 중 10개가 OsACCase2 W2038 부위에서 TGG에서 TTG로의 돌연변이를 갖는 것으로 나타났으며, 여기서 3개의 샘플은 동형 돌연변이체였다.
저항성 캘러스 분화에 의해 얻어진 T0 세대 조직 배양 묘목의 경우, 편집 표적 부위 서열을 검출하기 위해 그 DNA를 추출하였고, 도 16에 도시된 바와 같이 OsACCase2 W2038 부위에서 TGG에서 TTG로의 동형 돌연변이도 존재하였다.
6. ACCase 억제제 제초제에 대한 T1 세대 묘목의 저항성 테스트
W2038L 돌연변이를 포함하는 T0 집단을 번식시킨 후, T1 세대 돌연변이 묘목을 현장 농도의 퀴잘로포프-p 및 할록시포프-p로 제초제 저항성 테스트를 하였다. OsACCase2 W2038L 돌연변이 집단은 도 17-18에 도시된 바와 같이 이들 2가지 ACCase 억제제 제초제에 대해 상당한 저항성이 있음을 알 수 있었다.
요약하면, 합성 crRNA 및 tracrRNA로 어닐링하여 제조한 gRNA를 사용하거나 합성 sgRNA를 직접 사용하여, 활성 RNP 복합체가 정제된 SpCas9단백질로 형성될 수 있었다; 유전자 총 충격을 받은 캘러스는 조직 배양 단계에서 퀴잘로포프-p를 사용하여 선별될 수 있었고; TGG에서 TTG로의 동형 접합 돌연변이는 T0 세대 조직 배양 묘목의 OsACCase2 W2038 표적부위를 시퀀싱하여 검출할 수 있었다. 돌연변이는 T1 세대로 유전될 수 있고 ACCase 억제제 제초제에 대한 저항성을 나타냈으며, 이는 crRNA 또는 sgRNA의 순차적인 조합으로 형성된 RNP복합체의 프로그래밍된 순차적인 절단/편집으로 세포 내 표적부위에 부위 특이적 돌연변이가 발생될 수 있다는 것, 및 조직 배양 선별을 위한 세포-내인성 선별 마커의 생산을 유도하여 제초제 저항성 작물을 생산할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 10: 상이한 표적화 RNP 복합체는 Oryza sativa 캘러스의 OsACCase2 W2038 부위 및 OsBADH2 유전자를 동시에 편집한다
실시예 8에 따른 방법으로 RNP 복합체를 제조하였으며, 유전자 총 충격 및 조직 배양 절차는 실시예 9와 동일하였다. OsACCase2 W2038 부위를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA 외에 OsBADH2 유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA를 동시에 첨가하고, SpCas9 단백질과 함께 배양하여 제2 표적유전자 OsBADH2에 대한 표적 RNP 복합체를 형성했다. 유전자 총 충격을 진행하고, 회복 배양, 스크리닝, 분화 및 발근 후에 T0 세대 조직 배양 묘목을 얻고, 번식에 의해 T1 세대를 얻었다.
Oryza sativa OsBADH2 지놈 서열은 서열번호 17에 나타내었다. CRISPOR 온라인 툴(http://crispor.tefor.net/ )에 따라, 표적부위 서열 CCAAGTACCTCCGCGCAATCGcgg를 선별하였고, 여기서 Cas9 단백질에 의해 인식되는 PAM 부위는 이탤릭체 소문자로 표시하였으며, 정제된 SpCas9 단백질을 선별하여 RNP 복합체를 제조하였다. >CrRNA1-OsBADH2:5'-CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuaugcu-3'을 설계하기 위해 CGG를 PAM으로 사용했으며, 퀴잘로포프-p 선별에 의해 얻은 저항성 캘러스에서 OsACCase2 W2038L의 저항성 돌연변이와 OsBADH2의 녹아웃 돌연변이 이벤트를 동시에 검출할 수 있을 것으로 예측되었다.
>CrRNA1-OsBADH2는 GenScript Biotechnology Company에서 합성되었으며 sgRNA도 합성되었다:
>OsBADH2-sgRNA:5'CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'.
도 19와 같이 실시예 9의 형질전환 단계에 따라 저항성 캘러스를 선별하고, 저항성 캘러스를 선별하여 분화 및 묘목을 발생시키고, 캘러스 및 T0 세대의 조직 배양 묘목의 OsACCase2 및 OsBADH2 표적부위의 서열을 시퀀싱했다. OsBADH2 표적 검출 프라이머는 다음과 같다:
OsBADH2-check F: 5'CATCGGTACCCTCCTCTTC3'
OsBADH2-check R: 5'ATCGATCGATTTGGGGCTCA3'
그 결과 총 13개의 저항성 캘러스가 선별되었고, 그 중 11개에서 OsACCase2 W2038L 돌연변이가 검출되었고, 이들 11개 캘러스 샘플에 대한 OsBADH2 표적서열의 검출에서 그 중 8개의 샘플은 OsBADH2편집을 동시에 포함하는 것으로 나타났다. 분화를 통해 얻은 T0 세대 조직배양 묘목에서는, 도 20-21과 같이 OsACCase2 W2038L 돌연변이와 OsBADH2+A 동형 돌연변이의 존재를 확인하였다.
요약하면, 쌀 캘러스가 OsACCase2 W2038의 부위-특이적 편집을 수행하기 위해 순차적인 crRNA-표적화 또는 sgRNA-표적화 RNP 복합체로 유전자 총 충격과 제2 표적유전자 OsBADH2를 표적하는 표적화 RNP 복합체를 동시에 추가한 후, 퀴잘로포프-p를 사용한 조직 배양 단계에서 캘러스의 선별이 가능했다; 저항성 캘러스의 61%에서 OsACCase2 W2038 돌연변이와 표적화된 OsBADH2 녹아웃이 동시에 발생하였고, OsBADH2의 동형 돌연변이를 포함하는 집단은 T0 세대 조직 배양 묘목에서 검출되었다. 이들은 저항성 유전자의 부위 특이적 편집을 위한 RNP 형질전환과 순차적 절단/편집의 조합이 내인성 선별 마커를 생성할 수 있고, 상응하는 선별압력의 추가가 제2 표적유전자의 편집 이벤트를 동시에 선별할 수 있으며, 이에 따라 비 형질전환적 수단에 의한 지놈의 부위 특이적 편집이 가능함을 암시한다.
실시예 11: 상이한 표적화된 RNP 복합체가 Oryza sativa 캘러스의 OsALS548 부위 및 OsSWEET14 유전자를 동시에 편집한다.
OsALS548 부위에 대한 표적화 RNP 복합체가 실시예8의 방법과 동일한 방법으로 준비되었으며, 여기서 crRNA 및 sgRNA 서열이 각각 실시예 8에서와 각각 같다:
>CrRNA1-548-G: 5'-GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuaugcu-3',
>CrRNA2-548+T: 5'-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3',
>sgRNA1-548-G:
5'GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3',
>sgRNA2-548+T:
5'UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'.
실시예 8을 참조하여, gRNA 또는 sgRNA를 NGA-Cas9와 함께 배양하여 OsALS548 부위를 표적하는 RNP 복합체를 제조하였다.
OsALS548 부위에 표적화된 RNP 복합체에, 추가로 OsSWEET14 유전자에 대한 crRNA 또는 sgRNA를 동시에 첨가하고, SpCas9 단백질과의 배양에 의해 제2 표적유전자 OsSWEET14에 대한 표적화 RNP 복합체를 형성하였다. T0세대 조직배양 묘목은 유전자 총 충격, 회수 배양, 선별, 분화, 발근을 통해 획득하였고, T1세대는 번식을 통해 획득하였다. 선별압력은 5 mg/L 피록술람이었다.
Oryza sativa OsSWEET14 지놈 서열은 서열번호18에 나타내었다. CRISPOR 온라인 툴(http://crispor.tefor.net/ )에 따라 표적 부위 서열 GAGCTTAGCACCTGGTTGGAGggg가 선별되었으며, 여기서 SpCas9 단백질에 의해 인식되는 PAM 부위는 이탤릭체 소문자로 표시하였으며, 정제된 SpCas9 단백질을 선별하여 RNP 복합체를 제조하였다. GGG는 다음을 설계하기 위한 PAM으로 사용되었다:
>CrRNA1-OsSWEET14:
5'-GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuaugcu-3', 그리고 OsALS W548L의 저항성 돌연변이와 OsSWEET14의 녹아웃 돌연변이가 피록술람의 선별에 의해 얻어진 저항성 캘러스에서 동시에 검출될 수 있을 것으로 예측되었다.
>CrRNA1-Os SWEET14는 GenScript Biotechnology Company에서 합성되었으며 sgRNA도 합성되었다:
>Os SWEET14-sgRNA:
5'GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'.
저항성 캘러스는 도 22에 도시된 바와 같이 실시예 9에 기재된 바와 같이 유전자 총 충격 및 조직 배양 절차에 따라 선별되었고, 저항성 캘러스는 분화 및 묘목 발생을 위해 선별되었으며, 여기서 선별 배지 제형은: 4.1/L N6 분말 + 0.3 g/L 가수분해된 카제인 + 2.8 g/L 프롤린 + 2 mg/L 2,4-D + 3% 자당 + 5 mg/L 피록술람(pyroxsulam) + 500 mg/L 세팔로스포린(Cef) + 0.1 g/L 이노시톨 + 0.35% 피타겔, pH 5.8. 이었다.
캘러스 및 T0 세대 조직 배양 묘목의 OsALS548 부위 및 OsSWEET14 표적부위의 서열을 시퀀싱하였다. OsSWEET14 표적부위 검출 프라이머는 다음과 같다:
OsSWEET14-check F: 5' ATGGGTGCTGATGATTATCTTGTAT3'
OsSWEET14-check R: 5' TGAAGAGACATGCCAGCCATTG3'
그 결과 총 9개의 저항성 캘러스가 선별되었고, 그 중 8개에서 OsALS W548L 돌연변이 이벤트가 검출되었으며, 그중 5개의 캘러스 샘플은 OsSWEET14 표적 서열의 편집 역시 포함했다. 분화에 의해 얻어진 T0 세대 조직 배양 묘목에서, 도 23-24에 도시된 바와 같이, OsALS W548L 돌연변이 및 OsSWEET14-C 동형 접합 돌연변이 두가지 모두가 검출될 수 있었다.
OsALS W548L 돌연변이 발생이 검출된 T0 집단의 번식 후, T1 세대 돌연변이 묘목 집단을 현장 농도에서 피록술람, 이마자픽, 니코설퓨론 및 플루카바존-소듐으로 제초제 저항성 시험을 하였다. OsALS W548L 돌연변이 집단은 도 25-28에 나타낸 바와 같이 이들 4가지 ALS 억제제 제초제 모두에 대해 상당한 저항성을 나타냄을 알 수 있었다.
요약하면, 합성 crRNA 및 tracrRNA를 어닐링하여 제조한 gRNA를 사용하거나 합성 sgRNA를 직접 사용함으로써, 활성 RNP 복합체가 정제된 NGA Cas9 단백질로 형성될 수 있으며, 순차적인 표적 crRNA 또는 sgRNA의 조합으로 형성된 RNP 복합체의 순차적 절단/복구에 의해 부위-특이적 돌연변이가 발생될 수 있으며, 유전자 총 충격을 받은 캘러스의 선별은 조직 배양 단계에서 피록술람으로 수행될 수 있으며, TGG에서 TTG로의 돌연변이는 T0 세대 조직 배양 묘목의 OsALS548 표적부위를 시퀀싱하여 검출되었고, 이 돌연변이는 T1 세대로 유전될 수 있고 ALS 억제제 제초제에 대한 저항성을 나타냈다.
쌀 캘러스에 제2 표적유전자인 OsSWEET14를 표적하는 표적화 RNP 복합체를 동시에 첨가하여 유전자 총 충격을 가하고, NGG PAM을 인식하는 SpCas9 단백질을 이용하여, 조직 배양 단계에서 피록술람으로 캘러스를 선별하였다. OsALS W548L 돌연변이와 OsSWEET14의 표적 녹아웃은 저항성 캘러스의 55%에서 동시에 발생했으며, OsSWEET14의 동형 접합 돌연변이의 발생이 T0 세대 조직 배양 묘목에서 검출될 수 있었고, 이는 추가로 PNP 형질전환으로 발생된 저항성 유전자의 부위 특이적 편집과 순차적 절단/편집의 조합으로 내인성 선별 마커가 생성될 수 있음을 나타내며, 상이한 PAM 부위를 인식하는 Cas9 단백질을 동시에 사용하고 상응하는 선별압력을 가하여 제2 표적유전자의 편집을 동시에 선별할 수 있었고, 이에 의해 비 형질전화적 수단에 의한 지놈의 부위-특이적 편집을 달성할 수 있었다.
실시예 12: 감자( Solanum tuberosum L .)의 외식편에 2개의 다른 표적 RNP 복합체를 충격시켜 StALS561 부위에서 W561L 돌연변이 발생
Solanum tuberosum L. StALS2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호19로, Solanum tuberosum L. StALS2 유전자의 서열은 서열번호20으로 나타내었다. RNP 복합체의 제조 방법 및 유전자 총 충격 방법은 실시예 8-9를 참조했으며, Arabidopsis thaliana ALS574 부위에 상응하는 Solanum tuberosum L. StALS2의 StALS2 W561 부위에 대해 설계된 원래 서열 및 편집된 서열에 대한 sgRNA는 다음과 같았다:
>StALS561- G:
5'GGGAAUGGUGGUUCAGUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3'
>StALS561 +T:
5'UGGGAAUGGUGGUUCAGUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3',
그리고 실시예 8에 기재된 방법에 따라 RNP 복합체를 제조하였다.
감자 품종은 Atlantic 또는 Favorita였으며, 각각의 잎, 줄기 및 곁눈을 각각 외식편으로 사용하였다. 유전자 총 충격 및 선별 및 분화 방법은 다음과 같다:
(1) 잎: 전체 잎을 절단하고 고장성 M6 배지(제제: 4.42g/L MS 분말 + 1 ml/L B5 비타민(Phytotechlab, G219) + 30g/L 자당 + 8g/L 한천 + 2mg/L 2,4-D + 0.8mg/L 제아틴 리보사이드 + 0.2M 만니톨 + 250mg/L Cef)에 평평하게 도포하고, 각 충격에 약 5-6개의 잎이 사용되었다. 24시간 동안 사전 배양 후, 금 분말로 충격을 수행하였다. 충격 후, 암실의 고장성 M6 배지에서 2일 동안 연속 배양한 후 M6 배지(4.42g/L MS 분말 + 1 ml/L B5 비타민(Phytotechlab, G219) + 30g/L 자당 + 8g/L 한천 + 2mg/L 2,4-D + 0.8mg/L 제아틴 리보사이드 + 250mg/L Cef)로 옮겼다. 1주의 연속 배양 후, M6 배지로 옮겨 선별압력을 가했으며, 저항성 캘러스 선별을 20μg/L 클로설퓨론 (제형: 4.42g/L MS 분말 + 1 ml/L B5 비타민(Phytotechlab, G219) + 30g/L 자당 + 8g/L 한천 + 2mg/L 2,4-D + 0.8 mg/L 제아틴 리보사이드 + 250mg/L Cef + 20μg/L 클로설퓨론) 선별압력을 통해 수행하였다. 4주 후, 묘목이 발생할 때까지 선별압력을 가진 눈 유도 배지 R4 (제형: 4.42g/L MS 분말 + 1ml/L B5 비타민(Phytotechlab, G219) + 30g/L 자당 + 8g/L 한천 + 2mg/L GA3 + 0.8mg/L 제아틴 리보사이드 + 250mg/L Cef + 20μg/L 클로설퓨론)으로 옮겨졌다.
(2) 줄기: 감자 줄기(곁눈이 없는)를 채취하여 절개부가 위를 향하도록 세로로 자르고 CIMI 배지(4.42g/L MS 분말 + 20g/L 자당 + 8g/L 한천 + 0.5 mg/L 제아틴 뉴클레오사이드 + 2mg/L 2,4-D + 250mg/L Cef + 20μg/L 클로설퓨론)에 두었으며, 이어서 유전자 총 충격을 가하고, 충격 후 1일 동안 암실에서 배양하고, 줄기를 신선한 CIMI 배지로 옮겨 1주일 동안 연속 배양한 후, 줄기를 선별압력을 포함하는 SIMI 배지로 옮겨(제형: 4.42g/L MS 분말 + 20g/L 자당 + 8g/L 한천 + 1mg/L 제아틴 리보사이드 + 0.1mg/L GA3 + 250mg/L Cef + 20μg/L 클로설퓨론), 묘목이 발생할 때까지 저항성 눈에 대한 선별을 수행했다.
(3) 곁눈: 감자 줄기에서 곁눈을 채취하여 절개부가 위를 향하도록 세로로 자르고 CIMI 배지에 두었으며, 이어서 유전자 총 충격을 가하고, 충격 후 1 일 동안 암실에서 배양하고, 신선한 CIMI 배지로 옮겨 1주일 동안 연속 배양한 후, 선별압력이 포함된 SIMI 배지로 옮겨 묘목 발생까지 저항성 눈 선별을 수행하였다.
StALS2 W561 부위의 검출 프라이머는 다음과 같다:
StALS561-Check F: 5'GTGGATTAGGAGCAATGGGATTT3'
StALS561-Check R: 5' TTATTTTAGATAATACAATGCCTCG3'
검출 후, W561L의 편집은 저항성-선별된 T0 세대 감자 조직 배양 묘목의 StALS2 W561 부위에서 발생하였으며, 이는 본 발명에서 제공하는 비 형질전환적 일시적 유전자 편집 방법이 감자와 같은 작물에 적합함을 입증한다. 외인성 형질전환 요소는 자가 또는 혼성화에 의해 거의 분리 및 제거될 수 없다.
실시예 13: 인간 293T 세포에서 염기 치환을 위해 프로그래밍된 순차적 절단/편집 계획의 성공적인 활용
인간 배아 신장 세포 293T의 HBB(헤모글로빈 서브유닛 베타) 유전자(이의 DNA 서열은 서열번호 21에, CDS 서열은 서열번호 22에, 아미노산 서열은 서열번호 23에 나타내었다)가 선별되었고, 첫 번째 엑손 영역에 sgRNA의 순차적인 절단/편집을 위한 표적부위가 설계되었으며, 제1표적은 catggtgcaCctgactcctgAGG였다.
이 표적을 인식한 sgRNA를 sgHBB로 명명하였고, 이 부위의 sgRNA 절단에서 하나의 C 염기의 결실이 발생할 수 있음을 예측하였다. 제2 표적은 ccatggtgcatctgactctgAGG 로 제1표적의 절단/편집 과정에서 형성된 하나의 C 염기가 결실된 서열을 인식하였으며, 이 표적의 sgRNA를 sgHBB-c로 명명하였다. 293T 세포에 표적부위가 없는 sgRNA를 설계하고 sgNOTAR로 명명했으며, 이는 실험에서 형질주입을 위한 보완 플라스미드로 사용되었다.
위의 설계에 따라 상보적인 단일 가닥 DNA 단편이 각각 합성되었다. 어닐링 후 BbsI 효소로 분해된 px458(addgene: 48138) 플라스미드에 연결하고 E. coli DH5a 컴피턴트로 형질전환했다. 생성된 E. coli 단일 콜로니를 시퀀싱으로 검증한 후, 엔도톡신이 없는 플라스미드 추출 키트(Tiangen Bio)로 플라스미드를 추출 및 정제하였다.
활발하게 성장하는 293T 세포를 0.05% 트립신(Gibico)으로 소화 및 분리하고 DMEM 배지(10% 소태아혈청; 페니실린 + 스트렙토마이신 이중 내성)로 희석하여 24웰 배양 접시에 접종하고 이산화탄소 배양기에 밤새 넣었다. 다음날, 순차적 절단/편집에 따라 sgHBB 및 sgHBB-c 플라스미드 각각 0.5ug; 단일 표적 절단/편집: sgHBB 및 sgNOTAR 플라스미드 각각 0.5ug; 표적 없는 대조군: pEGFP-c1 플라스미드 1μg. 형질전환은 리포펙타민3000(Invitrogen)으로 수행되었다. 각 그룹에 대해 3번의 반복실험이 있었다.
48시간 형질전환 후 형광현미경으로 사진을 촬영하여 형질전환 효율을 기록하였고, 각 웰의 전체 DNA를 핵산 추출 키트(Omega)로 추출하였다.
설계된 Hi-tom 시퀀싱 프라이머는 다음과 같다:
Hi-HBB-F: gaggtgagtacggtgtgcGCTTACATTTGCTTCTGACACAACT;
Hi-HBB-R: gagttggatgctggatggTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG.
이 프라이머를 사용하여 각 DNA 샘플에 대한 PCR을 수행했다. PCR 산물의 고처리량 시퀀싱은 Hi-tom 방법(Sci China Life Sci. 2019 Jan;62(1):1-7. doi: 10.1007/s11427-018-9402-9)을 사용하여 수행되었다.
시퀀싱 결과의 통계 데이터는 표 6과 표 7에 나타내었다. 이 데이터는 HBB 부위에서 순차적인 절단/편집 방법이 약 1.67%의 비율로 C에서 T로의 편집 (P6S 돌연변이 발생)을 발생시킴을 나타내며, 반면에 단일 표적 절단/편집 방법은 이러한 염기 치환을 발생시킬 수 없다.
293T 세포 HBB 유전자의 순차적 절단/편집 실험에서 서로 상이한 sgRNA 조합에 의해 발생된 편집 유형 및 Hi-Tom 시퀀싱으로 검출된 상이한 유전자형의 판독
유전자형 HBB
프로그래밍된 순차적인 절단/편집 반복 1		 HBB
프로그래밍된 순차적인 절단/편집 반복 2		 HBB
프로그래밍된 순차적인 절단/편집 반복 3		 HBB
단일 타겟 절단/편집 반복 1		 HBB
단일 타겟 절단/편집 반복 2		 HBB
단일 타겟 절단/편집 반복 3		 GFP 형질전환 반복 1 GFP 형질 전환 반복 2
WT 6025 6037 6003 5776 5636 5614 7564 7430
1결실 555 593 613 1170 1134 1120 252 288
2결실 594 625 410 465 509 405
3결실 304 263 258 260 243
4결실 222
5결실 220 217
6결실
7결실 312 223 232 274 229 278
삽입 273 308
C->T SNP 168 230
계 7958 7963 7966 7958 7985 7968 7816 7718
293T 세포 HBB 유전자의 순차적 절단/편집 실험에서 서로 상이한 sgRNA 조합에 의해 발생된 편집 유형의 비율에 대한 통합된 통계
유전자형 HBB
프로그래밍된 순차적인 절단/편집		 HBB
단일 타겟 절단/편집		 GFP 형질 전 환 백그라운드 HBB
프로그래밍된 순차적인 절단/편집 비율		 HBB
단일 타겟 절단/편집 비율		 GFP 형질 전 환 백그라운드 비율
WT 18065 17026 14994 75.63% 71.21% 96.52%
1결실 1761 3424 540 7.37% 14.32% 3.48%
2결실 1629 1379 0 6.82% 5.77% 0.00%
3결실 825 503 0 3.45% 2.10% 0.00%
4결실 222 0 0 0.93% 0.00% 0.00%
5결실 220 217 0 0.92% 0.91% 0.00%
6결실 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
7결실 767 781 0 3.21% 3.27% 0.00%
삽입 0 581 0 0.00% 2.43% 0.00%
C->T SNP 398 0 0 1.67% 0.00% 0.00%
계 23887 23911 15534 100.00% 100.00% 100.00%
참고: WT는 야생형을 나타낸다; 결실은 결실 유전자형을 나타내며; 삽입은 삽입 유전자형을 나타낸다; C->T SNP는 절단에서 C에서 T로 염기 치환이 있는 유전자형을 나타낸다; 합계는 총계를 나타낸다.
또한 겸상 적혈구 빈혈과 베타 지중해 빈혈은 모두 성인의 헤모글로빈 β 소단위를 암호화하는 HBB 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 빈혈이다. 이러한 질병을 가진 환자는 평생 동안 수혈 또는 기타 요법이 필요할 수 있다. 상기 실험의 결과는 본 발명의 프로그램된 순차적 절단/편집 기술을 통한 crRNA 또는 sgRNA의 조합이 HBB 유전자의 돌연변이 부위에 대해 설계되어 돌연변이에서 예상되는 복구를 유도할 수 있음을 입증하였으며, 세포가 활성 헤모글로빈을 생성하고 기능을 회복하여 치료 효과를 얻을 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제공되는 조성물은 질병의 치료 용도를 가진다.
다양한 테스트를 동시에 거친 이 새로운 방법은 완전히 Cas9의 기존 기능을 기반으로 하기 때문에, 본 발명의 방법은 Cas9가 잘 작동할 수 있는 다른 유기체(식물, 동물, 균류 또는 박테리아 등)에서 특정 단편의 염기 치환, 결실 및 삽입이라는 새로운 기능을 달성하는 데 완벽하게 적용될 수 있다.
설명에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 마치 각 간행물 또는 특허 출원이 개별적, 구체적인 참고문헌으로 여기에 포함되는 것처럼 참고문헌으로 포함된다.
이상에서 본 발명은 명확한 이해를 위하여 실시예 및 구현예를 통하여 더욱 상세하게 설명하였지만, 특허청구범위의 범위 내에서 소정의 변경 및 수정을 가할 수 있음은 자명하며, 이러한 변경 및 수정은 모두 본 발명의 특허청구범위에 포함되는 것임은 자명하다.
<110> QINGDAO KINGAGROOT CHEMICAL COMPOUND CO., LTD. <120> Method For Generating New Mutations In Organisms, And Application Thereof <130> PI210046CN <150> CN 201911081617.X <151> 2019-11-07 <150> CN 202010821877.2 <151> 2020-08-15 <150> CN 202010974151.2 <151> 2020-09-16 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 670 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis thaliana ALS protein amino acid sequence (amino acid sequence) <400> 1 Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe 1 5 10 15 Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser 20 25 30 Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala 50 55 60 Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys 65 70 75 80 Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe Ile Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gln Pro 85 90 95 Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val 100 105 110 Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln 115 120 125 Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu 130 135 140 Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys 145 150 155 160 Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 165 170 175 Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile 180 185 190 Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu 195 200 205 Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu 210 215 220 Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Ile Ile Glu Glu Ala Phe Phe 225 230 235 240 Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys 245 250 255 Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg 260 265 270 Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His 275 280 285 Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu 290 295 300 Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe 305 310 315 320 Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly 325 330 335 Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu 355 360 365 Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala 370 375 380 Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys 405 410 415 Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu 420 425 430 Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys 435 440 445 Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro 450 455 460 Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile 465 470 475 480 Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr 485 490 495 Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala 500 505 510 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro 515 520 525 Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn 530 535 540 Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val 545 550 555 560 Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp 565 570 575 Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala 580 585 590 Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys 595 600 605 Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala 610 615 620 Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile 625 630 635 640 Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr 645 650 655 Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr 660 665 670 <210> 2 <211> 2013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis thaliana ALS gene DNA sequence (DNA sequence) <400> 2 atggcggcgg caacaacaac aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60 tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120 aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180 tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240 cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300 gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360 ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420 cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480 ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540 gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600 attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660 cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720 ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780 cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840 cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900 aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960 gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020 gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga ctgtgtatgc aaattacgct 1080 gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtaaggt ttgatgatcg tgtcacgggt 1140 aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctcggctgag 1200 attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgttaagct ggctttgcaa 1260 gggatgaata aggttcttga gaaccgagcg gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320 aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380 gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440 ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaaa 1500 ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gatttggact tcctgctgcg 1560 attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgcg atagttgtgg atattgacgg agatggaagc 1620 tttataatga atgtgcaaga gctagccact attcgtgtag agaatcttcc agtgaaggta 1680 cttttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaaa 1740 gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800 atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat 1860 ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920 tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980 ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013 <210> 3 <211> 2320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alopecurus myosuroides ACCase protein amino acid sequence (amino acid sequence) <400> 3 Met Gly Ser Thr His Leu Pro Ile Val Gly Phe Asn Ala Ser Thr Thr 1 5 10 15 Pro Ser Leu Ser Thr Leu Arg Gln Ile Asn Ser Ala Ala Ala Ala Phe 20 25 30 Gln Ser Ser Ser Pro Ser Arg Ser Ser Lys Lys Lys Ser Arg Arg Val 35 40 45 Lys Ser Ile Arg Asp Asp Gly Asp Gly Ser Val Pro Asp Pro Ala Gly 50 55 60 His Gly Gln Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro 65 70 75 80 Lys Glu Gly Ala Ser Ala Pro Asp Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu 85 90 95 Asp His Lys Ala Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Leu Asn Glu Ser His 100 105 110 Asn Gly Arg His Ala Ser Leu Ser Lys Val Tyr Glu Phe Cys Thr Glu 115 120 125 Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly 130 135 140 Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp 145 150 155 160 Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro 165 170 175 Glu Asp Met Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe 180 185 190 Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln 195 200 205 Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr Gly Val Ser Ala Val Trp Pro 210 215 220 Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro Glu Leu Pro Asp Ala Leu Thr 225 230 235 240 Ala Lys Gly Ile Val Phe Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ser Met Asn Ala 245 250 255 Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val 260 265 270 Pro Thr Leu Ala Trp Ser Gly Ser His Val Glu Ile Pro Leu Glu Leu 275 280 285 Cys Leu Asp Ser Ile Pro Glu Glu Met Tyr Arg Lys Ala Cys Val Thr 290 295 300 Thr Ala Asp Glu Ala Val Ala Ser Cys Gln Met Ile Gly Tyr Pro Ala 305 310 315 320 Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val 325 330 335 Asn Asn Asp Asp Glu Val Lys Ala Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu 340 345 350 Val Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met Arg Leu Ala Ser Gln Ser Arg 355 360 365 His Leu Glu Val Gln Leu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Asn Val Ala Ala 370 375 380 Leu His Ser Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Ile 385 390 395 400 Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu 405 410 415 Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys Ala Val Gly Tyr Val Gly Ala 420 425 430 Ala Thr Val Glu Tyr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Gly Glu Tyr Tyr Phe 435 440 445 Leu Glu Leu Asn Pro Arg Leu Gln Val Glu His Pro Val Thr Glu Ser 450 455 460 Ile Ala Glu Val Asn Leu Pro Ala Ala Gln Val Ala Val Gly Met Gly 465 470 475 480 Ile Pro Leu Trp Gln Ile Pro Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asp 485 490 495 Asn Gly Gly Gly Tyr Asp Ile Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Ala Thr 500 505 510 Pro Phe Asn Phe Asp Glu Val Asp Ser Gln Trp Pro Lys Gly His Cys 515 520 525 Val Ala Val Arg Ile Thr Ser Glu Asn Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro 530 535 540 Thr Gly Gly Lys Val Lys Glu Ile Ser Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val 545 550 555 560 Trp Gly Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile His Glu Phe Ala 565 570 575 Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala Tyr Gly Glu Thr Arg Ser Ala 580 585 590 Ala Ile Thr Ser Met Ser Leu Ala Leu Lys Glu Ile Gln Ile Arg Gly 595 600 605 Glu Ile His Thr Asn Val Asp Tyr Thr Val Asp Leu Leu Asn Ala Pro 610 615 620 Asp Phe Arg Glu Asn Thr Ile His Thr Gly Trp Leu Asp Thr Arg Ile 625 630 635 640 Ala Met Arg Val Gln Ala Glu Arg Pro Pro Trp Tyr Ile Ser Val Val 645 650 655 Gly Gly Ala Leu Tyr Lys Thr Ile Thr Thr Asn Ala Glu Thr Val Ser 660 665 670 Glu Tyr Val Ser Tyr Leu Ile Lys Gly Gln Ile Pro Pro Lys His Ile 675 680 685 Ser Leu Val His Ser Thr Ile Ser Leu Asn Ile Glu Glu Ser Lys Tyr 690 695 700 Thr Ile Glu Ile Val Arg Ser Gly Gln Gly Ser Tyr Arg Leu Arg Leu 705 710 715 720 Asn Gly Ser Leu Ile Glu Ala Asn Val Gln Thr Leu Cys Asp Gly Gly 725 730 735 Leu Leu Met Gln Leu Asp Gly Asn Ser His Val Ile Tyr Ala Glu Glu 740 745 750 Glu Ala Gly Gly Thr Arg Leu Leu Ile Asp Gly Lys Thr Cys Leu Leu 755 760 765 Gln Asn Asp His Asp Pro Ser Arg Leu Leu Ala Glu Thr Pro Cys Lys 770 775 780 Leu Leu Arg Phe Leu Ile Ala Asp Gly Ala His Val Asp Ala Asp Val 785 790 795 800 Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys Met Cys Met Pro Leu Leu Ser 805 810 815 Pro Ala Ala Gly Val Ile Asn Val Leu Leu Ser Glu Gly Gln Ala Met 820 825 830 Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala 835 840 845 Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Gly Ser Phe Pro Glu Met Ser Leu 850 855 860 Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His Lys Arg Cys Ala Ala Ser Leu 865 870 875 880 Asn Ala Ala Arg Met Val Leu Ala Gly Tyr Asp His Ala Ala Asn Lys 885 890 895 Val Val Gln Asp Leu Val Trp Cys Leu Asp Thr Pro Ala Leu Pro Phe 900 905 910 Leu Gln Trp Glu Glu Leu Met Ser Val Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg 915 920 925 Arg Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Asn Glu Tyr Lys Leu Asn 930 935 940 Val Asp His Val Lys Ile Lys Asp Phe Pro Thr Glu Met Leu Arg Glu 945 950 955 960 Thr Ile Glu Glu Asn Leu Ala Cys Val Ser Glu Lys Glu Met Val Thr 965 970 975 Ile Glu Arg Leu Val Asp Pro Leu Met Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu 980 985 990 Gly Gly Arg Glu Ser His Ala His Phe Ile Val Lys Ser Leu Phe Glu 995 1000 1005 Glu Tyr Leu Ser Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp 1010 1015 1020 Val Ile Glu Arg Leu Arg Leu Gln Tyr Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val 1025 1030 1035 1040 Val Asp Ile Val Leu Ser His Gln Gly Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu 1045 1050 1055 Ile Leu Ala Leu Met Glu Lys Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala Tyr 1060 1065 1070 Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Arg Tyr Tyr 1075 1080 1085 Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr Lys Leu Ser 1090 1095 1100 Glu Leu Arg Thr Ser Ile Ala Arg Asn Leu Ser Ala Leu Asp Met Phe 1105 1110 1115 1120 Thr Glu Glu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Ile 1125 1130 1135 Asn Glu Ser Met Gly Asp Leu Val Thr Ala Pro Leu Pro Val Glu Asp 1140 1145 1150 Ala Leu Val Ser Leu Phe Asp Cys Thr Asp Gln Thr Leu Gln Gln Arg 1155 1160 1165 Val Ile Gln Thr Tyr Ile Ser Arg Leu Tyr Gln Pro 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120 tccaagaaga aaagccgacg tgttaagtca ataagggatg atggcgatgg aagcgtgcca 180 gaccctgcag gccatggcca gtctattcgc caaggtctcg ctggcatcat cgacctccca 240 aaggagggcg catcagctcc agatgtggac atttcacatg ggtctgaaga ccacaaggcc 300 tcctaccaaa tgaatgggat actgaatgaa tcacataacg ggaggcacgc ctctctgtct 360 aaagtttatg aattttgcac ggaattgggt ggaaaaacac caattcacag tgtattagtc 420 gccaacaatg gaatggcagc agctaagttc atgcggagtg tccggacatg ggctaatgat 480 acatttgggt cagagaaggc gattcagttg atagctatgg caactccgga agacatgaga 540 ataaatgcag agcacattag aattgctgat cagtttgttg aagtacctgg tggaacaaac 600 aataacaact atgcaaatgt ccaactcata gtggagatag cagagagaac tggtgtctcc 660 gccgtttggc ctggttgggg ccatgcatct gagaatcctg aacttccaga tgcactaact 720 gcaaaaggaa ttgtttttct tgggccacca gcatcatcaa tgaacgcact aggcgacaag 780 gttggttcag ctctcattgc tcaagcagca ggggttccca ctcttgcttg gagtggatca 840 catgtggaaa ttccattaga actttgtttg gactcgatac ctgaggagat gtataggaaa 900 gcctgtgtta caaccgctga tgaagcagtt gcaagttgtc agatgattgg ttaccctgcc 960 atgatcaagg 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gcaaagggac agtttttttt tctgtttact 840 tgtgtatgat ctggatttac ttttggtgtt tcctaagttg aagaccaaga agtcttcttg 900 tgacagtatt ttagatgctt ataacgtgtt aatgtcaaag gaatgattcc catgaaaatt 960 ctgctgtgat ttgtacattt tattaggagt taagtaacag agtgaattga gtgatgctca 1020 cgtcttcttt aaatcttagc tatgatttgt tcctaggaag ctttgacttg tatttgagtg 1080 cctggtttgc gaagatgtga ttctcttgca cggatctgtg tgattgacag aagaaatatt 1140 tctacctgtt taagcaatga tggatccatc tctttgtttc tttttgtgct ttttacccaa 1200 aagaatggga tatttcaagt ttacaaacaa ctggtgatgc gcctttataa ttttgggctt 1260 ttttaaaaga atgtattctt cccatcatga gttactagat ctgagttgaa ctgttttcct 1320 ttatattttc ctgatattta agtgaatttg ttgagttcct atcctgattt gaacttccag 1380 attctaaaga accaggtctt ttaagcatgt ttttgtcatg tagattccca gtttatcccc 1440 tccccctcct tttgtgctca agaatctact accttttatc ttgcttttgg tgagggaaag 1500 tgatttttgc tccaatattt gtgatgtcct catgtaatgg acagttaaaa caaacagatt 1560 tgttcttgcg agtatcttct ggactccccc cagaaaagaa ttaggaatgt gtgggattcc 1620 tatcattggg gaatttatat cctaaaccag atagaaggat ctaatagtgg gagtttcgat 1680 cctgattcat ccattagtag tagtttaata tgccaaagca gtatcatttg catcattttg 1740 aggaactcga aacagttgaa ctgtgaagtt taactactgt acacttcaaa caggcagatt 1800 agaataggtt gtgagataac taaatttggt tcggtgatcg tataaggcca tattcttgga 1860 tattaggacg aaatgagcct gagcaccaca tgtgtacttg ctgatggttg agaacttagc 1920 atagatacta gtttttatgc tagactagag ggctactggt acattcactt gtttgataaa 1980 tccagatgta tttaagtttt gattcaaaat attttgactc tagattggag actacatttt 2040 agagcattca aaatttacaa tggaagcagg attttagcaa aactattttc atacatttac 2100 tctgttattg agccagaatc attttttagt tcttgctact tttttgttaa cactgttatg 2160 catgtaaact cagcgttaca tttatttcaa ttacaaggat ctacacttgt agctctgggt 2220 gcagatggta gttaacattg atgaatctta gctatatcga aatactatct tctaagtaca 2280 aacttttctt gtgtgattct tatccttgtt gttactgttg ctacttatat ccattgattg 2340 agcatgcttt gaattacctt aagaatttct ctctccagtc aaatttattt gactttgaga 2400 gaactgtgtt tatttctccc aacgtcaaat gttttgaatt ttgaatggac agagtatgta 2460 gtagtgggca gcacattggt gccctagctg caaataaaac cttttttttt tgttaaaaca 2520 atgattatga ggatgtcggt ttacactgtc cactcagaaa tttgacttga ttatggatag 2580 ggtacacctt gttgttttag atggttcctt cttaacaaga tgctagattt tgatgatttg 2640 attctttaca aggagtagtc taaaatactg gaagtgtcaa cttaaaaagt tcaaacttgc 2700 cctagccata cgtgatacat tagacaactg atgtgctgtg ttatctgcaa ctgacaatta 2760 ttgttgttgc tatctccttt ttttgcttta gagtaggcag gtattttgtg tcaactaaaa 2820 gtgtgtttca cgtgttgcct ttcttaatac cttttgaata atagggtata agaaaatttt 2880 catgaatggt ttgctttcca attgttgatg ttgctttcct tcaccttatt ttttaaacca 2940 ccatgattaa tctatttatc taggtaatat tgctcatgct gattcatgat acgtggtaaa 3000 aaaataggtc ttttcaactt tcagaggctg ctggactcca tttatttagt tgattttgat 3060 ccctacaccg attttatcca ttggtttata ttcactgcta acatatgata ctcgctatca 3120 tttacttcac tgttgatcat caatgtttta attttgacca ttattaactt ttatatgatt 3180 aatttagtat taatgaaagt tgtgcggttg tatttatggc atgacacaca tttctaacat 3240 ggcatacttt taagcataca taactttttt tgtaaaaagg acaagcgatc aaaggtaaaa 3300 aggtgaatag catacagtga gaagtatttg agaccaaagg gagtataatc attatctact 3360 aaacaaatac aataccattc attataagct gagttcgcat agtgtaattg aaagtgggga 3420 atgctagtat agctcacaca tgaaatcaag tccctgtgaa atgatagtaa accctacgtg 3480 ttcattgttt tagtcttatg atatgttcca gttatgtttg ccatggttgt tgaatgcagt 3540 agtcaaagtt tgcttctgtt tgtttgagtg gattctcatt taccttgcct tttccaccat 3600 atactcatat gggctttgtt tcacaagtga taacattggt taatggctat atgctatcct 3660 tacagtttca ttcttctttt aagatatgag tcaccatgca catttcttca acttctgatt 3720 ttgtctaata ttgcagacac ctaagagaac ttgacctgca agagaacgag attgaggatt 3780 gttctattca ttggctcagc ctcttcccgg aatcgttcac ttctctagta actctaaact 3840 tttcatgctt agagggggag gtcaatatca ctgtacttga acggttagtg accagatgtc 3900 acaacctgaa gactcttaag ctcaacaatg ctatccccct tgacaagctt gctagcctcc 3960 ttcataaggc tcctcagcta gttgaactcg gaactggcaa attctctgct gattaccatt 4020 ccgatctgtt tgcaaagctg gaggcggcgt ttggaggttg taaaagcttg agaaggcttt 4080 ctggggcttg ggatgctgtt ccagattatc tgccagcatt ctattgtgta tgtgaaggcc 4140 tcacatcact taatctgagt tatgctactg 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aatttttcag gtgatggacc tcattgagga 5040 tcatggttta gctgttgtgg catcatcttg caataaactt caagagttgc gggtcttccc 5100 ttctgaccct tttggtgcag gattcttgac tgaaagaggt cttgttgatg tctctgcaag 5160 ttgtccaatg ttggagtcag tgctctactt ctgcagacgg atgacaaatg aggcacttat 5220 taccattgca aagaaccgtc ccaacttcac ttgcttccgc ctatgcatcc ttgagccaca 5280 cactccagac tacatcacac gggagcctct tgatgcaggt ttcagcgcca ttgtggagtc 5340 atgcaggggc cttaggcgtc tctctatctc aggccttctc acagatcttg tgtttaaatc 5400 cattggggca catgctgatc gtcttgagat gctttcaatc gccttcgctg ggaacagcga 5460 cttgggcctg cattacatcc tctcaggctg caagagcctg aagaaactgg agatcaggga 5520 ctgcccattt ggtgataagc cattgctggc gaacgcagca aagctggaga caatgcgatc 5580 cctttggatg tcgtcgtgct tgttgaccct gggcgcatgc cgacagcttg cacgcaagat 5640 gccccgcctt agtgtggaga tcatgaacga tcctggaagg tcatgcccct tggattcgct 5700 tccggatgaa acacctgttg agaaactgta cgtctaccgg acgatcgcag gtccaaggtc 5760 cgacacacca gcctgcgtcc agattgtgta g 5791 <210> 11 <211> 644 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oryza sativa L. 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ACCase2 protein amino acid sequence (amino acid sequence) <400> 13 Met Thr Ser Thr His Val Ala Thr Leu Gly Val Gly Ala Gln Ala Pro 1 5 10 15 Pro Arg His Gln Lys Lys Ser Ala Gly Thr Ala Phe Val Ser Ser Gly 20 25 30 Ser Ser Arg Pro Ser Tyr Arg Lys Asn Gly Gln Arg Thr Arg Ser Leu 35 40 45 Arg Glu Glu Ser Asn Gly Gly Val Ser Asp Ser Lys Lys Leu Asn His 50 55 60 Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala 65 70 75 80 Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu Asp Pro Arg Gly Pro 85 90 95 Thr Val Pro Gly Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Ile Asn Glu Thr His 100 105 110 Asn Gly Arg His Ala Ser Val Ser Lys Val Val Glu Phe Cys Thr Ala 115 120 125 Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly 130 135 140 Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp 145 150 155 160 Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro 165 170 175 Glu Asp Leu Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe 180 185 190 Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn 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tactaaaacc atctgaattg gcttccgtgt 2520 aagtttaaca tgttaacttg ttaatgtcat acccatgcta gttgcaatga catttgattt 2580 taaaatgttg tggcatgtcc atgctgcaag caatgtaatt tgaaatctct ctctatcatt 2640 aattaccagg acttgtttgg agcttgctga tgtgtgtaaa gaggttggtc ttccttcagg 2700 tgtgctaaac atagtgactg gattaggttc tgaagccggt gctcctttgt catcacaccc 2760 tggtgtagac aaggtacagc tattcctcct gtaatcatgt ataccccatc aatggaaatg 2820 atattcctct caatacatgg tttatgtttt ctgttaggtt gcatttactg ggagttatga 2880 aactggtaaa aagattatgg cttcagctgc tcctatggtt aaggtttgtt tccaaatttc 2940 tgtggatatt ttttgttctc tttctactaa ctctctatta tcaattctca atgttgtcct 3000 tttcttttaa ctcctttact ttttagaatt gtgatcaaga cactttgagc atcattctag 3060 tagccagttc tatcctgttt cttacctttt tatggttcgt cttttcttga cagcctgttt 3120 cactggaact tggtggaaaa agtcctatag tggtgtttga tgatgttgat gttgaaaaag 3180 gtacatgcca cttgctatga ttaactaatt ctgaagtgcg ggactttgta aagcacttaa 3240 ctgagctgga tgctagaccc ccaaaagccc tttttggtgt cttgggcttg ttgcagaaat 3300 actggtccca gacgagcagg atgcaagaaa attaactact tttgccactg attagtattt 3360 cttagaagtt acacctcaag gattagcaat actttcttaa aatgtgctat tgattaaaaa 3420 gatgtcctgt attattttga gcagatcttg tactggttga tcggcttgca tgaaaatatt 3480 gttgaggatt ataatgccat gccaactgag taaagaaaag agttgtaaaa tatgttatgc 3540 aacatgaata tatatgtgat ttcatttttc ctttttcttt tcgtggcaag gaaggcagtt 3600 aggaaggact gatgtgaaaa gcacaagtac tattcttagt tctggaaaac tgtgttcttt 3660 attttcctaa ctacaattca ccttgattag tcagtaactt gatattggca attctagctg 3720 attatgaatt ctgtttatat ttcactaatt ttgaatcttt aattacattt tatggttgaa 3780 atttaacgtt ttgtctggtt atggactctg tttgtattca ctcaatttgg atcttccatt 3840 agatttcatt gttggtcctt cttcttgtac agctgttgag tggactctct ttggttgctt 3900 ttggaccaat ggccagattt gcagtgcaac atcgcgtctt attcttcatg taagcattga 3960 atatatccgt caatcataat ctattgttgt acttgatttt ttttctgatc aactcctgag 4020 ttcagattat tatatgatgc cattactatt gcacagagcg aataaaattg tatttatgca 4080 cagcatgtat tttgagtaat atatgcattg cctattattt aatatataga ttgtagcact 4140 taattttgtg tccatgtctc tatgatgttt attactttat tattgccggc atgaagcaac 4200 tttgaactct atgttgatct tgaactaaaa ttgaaattaa ttggcttatt gctattaatg 4260 atatagcttt cagcttcttg ctcctgacca tgaaagtttt gcagaaaaaa atcgctaaag 4320 aatttcaaga aaggatggtt gcatgggcca aaaatattaa ggtgtcagat ccacttgaag 4380 agggttgcag gcttgggccc gttgttagtg aaggacaggt accacatgta aactttttct 4440 aaattcaaaa aagaaatgcc actgatcaat ggtaggtcct tccaagcctt attgctggat 4500 tgttgcactg ttttgtcaat tttgtgtaat atagttctga atgaattagt cggtgtatgc 4560 tcttgctagt tgctagtatg tggtacaggg tcttcctact ttgagcaaat tcgtgttaaa 4620 atgcattgat gaaaaggcca cctttccgta ggtttatctt gtcataattt aaaccccaat 4680 aaaattttaa ttttttgttt tgaccccatg gcactttaat gaaatcactt agccatgagc 4740 ttttgtatat attttcaaag caccagaatg tttagatggt ttgttggaaa tcttacacat 4800 cctattgcct tgtgtcagta tgagaagatt aagcaatttg tatctaccgc caaaagccaa 4860 ggtgctacca ttctgactgg tggggttaga cccaaggtaa taatctacta cacggttgta 4920 tatataggta cccacatatc attatgaagt agaaataatc ttgtatgttt ttgtcagcat 4980 ctggagaaag gtttctatat tgaacccaca atcattactg atgtcgatac atcaatgcaa 5040 atttggaggg aagaagtttt tggtccagtg ctctgtgtga aagaatttag cactgaagaa 5100 gaagccattg aattggccaa cgatactcag tgagtttttt ttttaataca gttcattgtc 5160 ctgttcaatc ttgcagcata tgtatatact ctgtggcata tgaacttatt ctgctactac 5220 tacttttgat agttatggtc tggctggtgc tgtgctttcc ggtgaccgcg agcgatgcca 5280 gagattaact gaggtatatc caagtgaagg gggttggcat tgtttgattc atatgacatg 5340 gttgcatcaa gctgatattc aagaatctca tttattactt gcattctatg catctccagt 5400 tcttccctgg actccggtca atgttaatat agtttgtttg ctagtagtat gctactccaa 5460 ttaagttgct cttcacttcc acatcatctg atccatgact ttatatttga cccctttttt 5520 ttgcaaaaga aagggaaata cttaacgaaa atttcctact gcaggagatc gatgccggaa 5580 ttatctgggt gaactgctcg caaccctgct tctgccaagc tccatggggc gggaacaagc 5640 gcagcggctt tggacgcgag ctcggagaag ggtgggtagc acacaacaat ctcactttaa 5700 aacaccattt cgatcgtctg atgatctcga cctgacatca tgcctttggt attttcattc 5760 acttttcagg ggcattgaca actacctaag cgtcaagcaa gtgacggagt acgcctccga 5820 tgagccgtgg ggatggtaca aatccccttc caagctgtaa 5860 <210> 18 <211> 2192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oryza sativa L.OsSWEET14 genome DNA sequence (DNA sequence) <400> 18 atggctggca tgtctcttca gcatccctgg gccttcgcct ttggtctcct aggtgtgttg 60 cctttgatct gatccaagga attctcttga gaattaatct tgcatggtta tttacttttg 120 ttgttattat tctctacatt tttaatcatg tacttttcca tgttccactt ttgttgccaa 180 agctactata tttttcctac caattcatcc aaaactacta tattatagca aggcagctag 240 tggatcgact ttgcactttt ggatgcaatt gtgagtggtt tacattagag gggccatgca 300 tagccaaata aattgtttgg caaaatatga tttcccttgt agttagcaca atattgtgat 360 ctttcattcc tttactcttt ttgttccacc accctcatta ttgcaaagcc ccctctttta 420 gaaccaaact aaagataaga aacatttgat tcatcattag aggagattag atatacatac 480 atactacaca tgcattgctg tgataagcct agccaggcac agaaagagcc aagacaaaag 540 gagctcaaaa gaaaaggggc tccaatatct tgcccggcct gatcagtgta acatgacgtc 600 acccacacaa ttattaaaag gatagatgca tatgtgttcg ttacgtatct ccttgtgtca 660 cgttgctgtg catggttcac tcgcttaatt ataacgtccg tcgcatttta tgcatgcact 720 tcgtttttag ttaatcaaat taaacaagat cctaacatat gatttctatt ttattctctt 780 tgcaggcaac atcatctcct tcatgaccta cctggcccca ctgtaagtcc cacacatccg 840 gatattttct tttctttagc gaaattttac attgctccag aaagtacctt ttacactaaa 900 atttcttata caccaccata aaattaatgt ggtactattg gtaccttatc aaaaatgata 960 aaattacctt tttcttcaga taaaaacact ccccgtctct gtataactaa gatgtagaca 1020 accaatacac atgtctagag ctaatcctat caattaacat tgctagtaaa tacaaggaaa 1080 aatataaaga attaaccaat tgcttggatg tcttgcaggc cgacgttcta caggatctac 1140 aagagcaagt cgacgcaggg gttccagtcg gtaccctacg tggtggcgct gttcagcgcg 1200 atgctgtgga tctactacgc gctgctcaag tccgacgagt gcctcctcat caccatcaac 1260 tccgctggct gcgtcatcga gaccatctac atcgccgtct acctcgtcta cgcccccaag 1320 aaggccaaga tgttcaccgc caagctcctc ctcctcgtca acgtcggcgt cttcggcctc 1380 atcctcctcc tcaccctcct cctctccgcc ggcgaccgcc gcatcgtggt tcttggttgg 1440 gtctgcgttg gcttctccgt cagcgtcttc gtcgcccccc ttagcatcat cgtaagaaac 1500 cctagaattg cctgtaaaca ataataactt tcggtctctg caccaactaa ggatgcacat 1560 atttacgcac cgcttttgct atctctgcag aggctggtgg tgcgcaccaa gagcgtggag 1620 ttcatgccgt tctcgctctc cttctccctc accatcagcg ccgtcgtctg gttcctctac 1680 ggcctcctca tcaaggacaa atatgtcgct gtgagtagct ccgattcgac ccgttcttct 1740 tcctaaattt tccgctgctc gatttaattt ctatttctaa ttgtggaaga ttgtttaatt 1800 atagtgatta tggctagctg ataaccgatt ttaatttctg atggtgatcc aaaatggaac 1860 agcttcccaa cgtgctgggc ttctccttcg gcgtcatcca gatggggctg tacgccatgt 1920 acaggaactc gacgcccaag gccgtgctga ccaaggaggt cgaggcggcg acggccaccg 1980 gcgacgacga ccactccgcc gccggcgtca aggagcacgt cgtcaacatc gccaagctct 2040 ctgccgccgt cgacgtcgtc aagacccgcg aggtgcaccc cgtcgacgtc gagtccccgc 2100 cggcagaggc gccgcctgag gaggacgaca aggccgccgc cgccaccgcc gccgccgtcg 2160 ccggcgccgg cgagaagaag gtagctgcat ga 2192 <210> 19 <211> 657 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Solanum tuberosum L. StALS2 protein amino acid sequence (amino acid sequence) <400> 19 Met Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Cys Phe Ser Lys Asn Leu Pro Pro 1 5 10 15 Ser Ser Ser Lys Ser Ser Ile Leu Leu Pro Lys Ser Thr Phe Thr Phe 20 25 30 His Asn His Pro Lys Asn Thr Ser Pro Leu His Leu Thr His Thr Gln 35 40 45 His His Ser Arg Phe Thr Val Ser Asn Val Ile Leu Ser Thr Thr Thr 50 55 60 His Asn Asp Val Ser Glu Pro Glu Ile Phe Val Ser Arg Phe Ala Pro 65 70 75 80 Asp Glu Pro Arg Lys Gly Cys Asp Val Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg 85 90 95 Glu Gly Val Lys Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu 100 105 110 Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Asn Ile Ile Arg Asn Val Leu Pro 115 120 125 Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala 130 135 140 Thr Gly Phe Pro Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr 145 150 155 160 Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile Pro Ile 165 170 175 Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala 180 185 190 Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His 195 200 205 Asn Tyr Leu Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val Val Arg Glu 210 215 220 Ala Phe Phe Leu Ala Lys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp 225 230 235 240 Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Ile Pro Asn Trp Asp Gln 245 250 255 Pro Met Arg Leu Pro Gly Tyr Ile Ser Arg Leu Pro Lys Leu Pro Asn 260 265 270 Glu Met Leu Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys 275 280 285 Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Thr Gln Ser Ser Glu Glu Leu 290 295 300 Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met 305 310 315 320 Gly Leu Gly Thr Phe Pro Cys Gly Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu 325 330 335 Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Ser Ser Asp 340 345 350 Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys 355 360 365 Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp 370 375 380 Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ser Ile Leu Glu Gly Lys 405 410 415 Glu Gly Lys Leu Lys Leu Asp Phe Ser Ala Trp Arg Gln Glu Leu Thr 420 425 430 Glu Gln Lys Val Lys Tyr Pro Leu Asn Tyr Lys Thr Phe Gly Glu Ala 435 440 445 Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly 450 455 460 Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala 465 470 475 480 Gln Tyr Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly 485 490 495 Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val 500 505 510 Gly Arg Pro Gly Glu Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Lys Val Glu Asn Leu Pro 530 535 540 Val Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln 545 550 555 560 Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly 565 570 575 Asn Pro Ala Asn Glu Glu Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Lys Phe Ala 580 585 590 Glu Ala Cys Gly Val Pro Ala Ala Arg Val Ser His Arg Asp Asp Leu 595 600 605 Arg Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu 610 615 620 Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser 625 630 635 640 Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Arg Ser 645 650 655 Tyr <210> 20 <211> 1974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solanum tuberosum L. StALS2 gene DNA sequence (DNA sequence) <400> 20 atggcggctg catctccatc tccttgtttt tccaaaaacc tacctccatc ttcatcaaaa 60 tcttccatcc ttcttcccaa atctaccttt actttccaca atcaccccaa aaatacctca 120 ccccttcacc ttacccacac ccaacatcat agccgtttca ctgtctcaaa tgtcatccta 180 tcaaccacga cccataacga cgtttctgaa cccgaaatct tcgtttcacg tttcgcccct 240 gacgaaccca gaaagggttg tgatgttctt gtggaggcac ttgaaaggga aggggttaag 300 gatgtatttg catacccagg aggtgcttcc atggagattc atcaggcttt gacacgttcc 360 aatattattc gtaatgtgct gccacgtcat gaacagggtg gtgtgtttgc tgcagagggt 420 tacgcacggg ccactgggtt ccctggtgtt tgcattgcta catctggtcc gggagctacg 480 aatcttgtta gcggtcttgc ggatgctttg ttggatagta ttccgattgt tgctattacg 540 ggtcaagtgc cgaggaggat gattggtact gatgcgtttc aggaaactcc tattgttgag 600 gtaacgagat ccattacgaa gcataattat cttgttatgg atgtagagga tattcctagg 660 gttgttcgtg aagcgttttt tctagcgaaa tcgggacggc ctggaccggt tctgattgat 720 gttcctaagg atattcagca acaattggtg atacctaatt gggatcagcc aatgaggttg 780 cctggttaca tctctaggtt gcctaaattg cctaatgaga tgcttttgga acaaattgtt 840 aggctgattt cggagtcgaa gaagcctgtt ttgtatgtgg gtggtgggtg tacacaatcg 900 agtgaggagc tgagacgatt tgtggagctt acgggtattc ctgtggcgag tactttgatg 960 ggtcttggaa cttttccatg tggggatgag ctttctcttc aaatgttggg tatgcatggg 1020 actgtgtatg ctaattatgc ggtggatagt agtgatttgt tgcttgcatt tggggtgagg 1080 tttgatgatc gagttactgg taaattggaa gcttttgcta gccgagcgaa aattgtccac 1140 attgatattg attcggctga gattggaaag aacaagcaac ctcatgtttc catttgtgca 1200 gatatcaagt tggcattaca gggtttgaat tccatattgg agggtaaaga aggtaagctg 1260 aagttggact tttctgcttg gaggcaggag ttaacggagc agaaggtgaa gtacccattg 1320 aattataaga cttttggtga agccatccct ccacaatatg ctattcaggt tcttgatgag 1380 ttaactaacg gaaatgccat tattagtact ggtgtggggc aacaccaaat gtgggctgcc 1440 caatactata agtacaaaaa gccacgccaa tggttgacat ctggtggatt aggagcaatg 1500 ggatttggtt tgcctgctgc tataggtgcg gctgttggaa gaccgggtga gattgtggtt 1560 gacattgatg gtgacgggag ttttatcatg aatgtgcagg agttagcaac aattaaggtg 1620 gagaatctcc cagttaagat tatgttactg aataatcaac acttgggaat ggtggttcag 1680 tgggaggatc gattctataa ggctaacaga gcacacactt acttgggtaa tcctgctaat 1740 gaggaagaaa tcttccctaa tatgctgaaa tttgcagagg cttgtggcgt acctgctgca 1800 agagtgtcac acagggatga tcttagagct gccattcaaa agatgttaga cactcctggg 1860 ccatacttgt tggatgtgat tgtacctcat caggagcacg ttctacctat gattcccagt 1920 ggtggcgctt tcaaagatgt gattacggag ggtgatggga gacgttccta ttga 1974 <210> 21 <211> 1424 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB gene DNA sequence (comprising intron)(DNA sequence) <400> 21 atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt 120 aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg 180 cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc 240 ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg 300 caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc 360 tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct 420 gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc 480 ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacagtttag 540 aatgggaaac agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt ttagtttctt 600 ttatttgctg ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct ttttttttct 660 tctccgcaat ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca aaaggaaata 720 tctctgagat acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct agtacattac 780 tatttggaat atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt attttctttt 840 atttttaatt gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa tgttttaata 900 tgtgtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt 960 cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt 1020 tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg 1080 ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct gcatataaat 1140 tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg 1200 cttttatttt atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc 1260 taatcatgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg 1320 tgctggccca tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag 1380 tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaa 1424 <210> 22 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB gene CDS sequence (DNA sequence) <400> 22 atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 120 aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 180 gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 240 aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 300 cctgagaact tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 360 aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat 420 gccctggccc acaagtatca ctaa 444 <210> 23 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB gene amino acid sequence (amino acid sequence) <400> 23 Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120 125 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145

Claims (102)

  1. 다음 단계를 포함하는 유기체에서 새로운 돌연변이를 발생시키는 방법: 순차적으로 유기체 지놈 내의 특정 부위에 2개 이상의 DNA 절단을 생성하고 각각 자발적으로 복구하는 단계로서, 후기 DNA 절단(later DNA break)은 이전 DNA 절단(previous DNA break)의 복구로부터 형성된 새로운 서열에 기초해 생성되는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 절단은 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제를 유기체의 세포 내로 전달하여 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉함으로써 생성되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순차적으로 유기체 지놈 내의 특정 부위에 2개 이상의 DNA 절단을 생성하는 단계는 ZFN 또는 TALEN의 편집에 의해 생성된 DNA 절단 복구 이벤트에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여 새로운 ZFN 또는 TALEN 단백질이 해당 부위를 다시 절단하도록 설계되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순차적으로 유기체 지놈 내의 특정 부위에 2개 이상의 DNA 절단을 생성하는 단계는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 DNA 절단 복구 이벤트에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여, 새로운 표적RNA가 해당 부위를 다시 절단하도록 설계되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 상이한 표적화된 뉴클레아제를 상이한 세대의 수용 세포에 순차적으로 전달함으로써 생성되고, 여기서 이전의 지놈 편집이 완료된 돌연변이 세포는 나중의 지놈 편집에서 표적화된 뉴클레아제의 전달을 받기 위한 수용체로 사용되어 두번째 지놈 편집을 수행해 부위 특이적 돌연변이를 발생시키는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 상이한 표적에 대한 상이한 표적화된 뉴클레아제를 동일한 수용 세포 내로 전달함으로써 생성되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA절단은, 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 형성된 RNP 복합체가, 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단하여 생성되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA절단은, 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가, 상응하는 표적 서열을 순차적으로 절단하여 생성되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제는 지놈의 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제인, 돌연변이를 발생시키는 방법.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제는 DNA 형태인 돌연변이를 발생시키는 방법.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제는 DNA 대신 mRNA 또는 단백질의 형태인 돌연변이를 발생시키는 방법.
  13. 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제를 세포내로 전달하는 방법은 다음 중에서 선택되는 것인, 돌연변이를 발생시키는 방법: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 5) 유전자 총 충격 방법; 또는6) Agrobacterium-매개 형질전환 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이를 발생시키는 방법에 의해 얻어진 새로운 돌연변이.
  15. 제14항의 새로운 돌연변이를 갖는 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편.
  16. 제15항의 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그 상보적 서열을 포함하는 핵산.
  17. 다음을 포함하는 핵산:
    (a) 표적RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열,
    상기 표적RNA는 최소한 2개의 표적RNA를 포함하며, 제1 표적RNA는 DNA를 표적하여 DNA 절단을 생성하고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구 이벤트로부터 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성함.
  18. 제17항에 있어서, 추가적으로 (b) Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA인 핵산.
  20. 제17항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포에 존재하는 것인 핵산.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산과, 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  22. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  23. 제22항에 따른 발현 카세트를 포함하는 숙주세포.
  24. 제23항에 따른 숙주세포로부터 재생된 유기체.
  25. 표적DNA를 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적DNA를 용해시키는 방법으로서, 상기 복합체는 다음을 포함하는 것인 방법:
    (a) Cas 폴리펩타이드; 및
    (b) 제1 표적RNA가 DNA를 표적하여 DNA 절단을 생성시키고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구로부터 형성된 서열을 표적하여 절단을 다시 생성하는 것인 최소한 2개의 표적RNA.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA인, 표적DNA를 용해시키는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 표적DNA는 세균 세포, 진핵 세포, 식물 세포 또는 동물 세포에 존재하는 것인 표적DNA를 용해시키는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적DNA는 염색체 DNA인, 표적DNA를 용해시키는 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포에 존재하는 것인 표적DNA를 용해시키는 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 다음과 같은 것을 세포 내부로 도입하는 것을 포함하는 표적DNA를 용해시키는 방법:
    (a) Cas 폴리펩타이드, 또는 Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 표적RNA, 또는 표적RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드.
  31. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) Cas 폴리펩타이드, 또는 Cas폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 최소한 2개의 표적RNAs 또는 표적RNAs를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드,
    여기에서 제1표적 RNA는 DNA를 표적하여 DNA 절단을 생성하고, 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구 이벤트로부터 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성시킴.
  32. 제31항에 있어서, 상기 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA인 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 폴리펩타이드 및 표적RNA는 in vitro 세포 또는 ex vivo 세포에 존재하는 것인 조성물.
  34. 제31항 내지 제33항에 따른 조성물의 질병 치료용 약제의 제조 용도.

  35. 다음을 포함하는 키트:
    (a) Cas 폴리펩타이드 또는 Cas 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및
    (b) 최소한 2개의 표적RNAs 또는 표적RNAs를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로서, 제1표적 RNA는 DNA를 표적하여 DNA 절단을 생성하고 이후의 표적RNA는 이전의 절단 복구로부터 형성된 서열을 표적하여 다시 절단을 생성시키는 것인 표적RNA 또는 핵산;
    상기 (a) 및 (b)는 동일하거나 별도의 컨테이너에 있다.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적RNA는 sgRNA 또는 gRNA인 키트.
  37. 제35항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적RNAs는 동일하거나 별도의 컨테이너에 담긴 키트.
  38. 다음 단계를 포함하는 외인성 형질전환 마커(exogenous transgenic marker)와 독립적인 편집 이벤트를 선별하는 방법:
    1) 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위의 서열상에서 2개 이상의 DNA 절단이 순차적으로 생성되고 자발적으로 각각 복구되는 단계, 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 서열에 기초해 생성됨;
    2) 제1 표적유전자의 특정 부위가 순차적으로 절단되고 복구된 후 특정 편집 이벤트가 발생되며, 이는 표현형으로 선별가능한 형질을 생성하기 위한 특정 선별압력에 대한 저항력을 돌연변이 세포에 부여하고, 상응하는 선별압력이 적용되어 형질이 선별되며, 지놈 편집 이벤트를 포함한 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계;
    3) 선택적으로, 제1 표적유전자에 더하여 동시에 다른 표적부위를 편집하기 위해 최소한 1개의 제2 표적유전자에 표적화된 뉴클레아제가 사용되며, 제2 표적유전자의 편집 이벤트는 제1 표적유전자의 돌연변이에 의해 생성된 선별가능한 형질의 선별을 통해 강화됨과 동시에 선별되며, 제1 표적유전자의 편집 이벤트 및 최소한 하나의 제2 표적유전자의 편집 이벤트를 동시에 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 유전자 좌(gene locus)이며, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 또는 성장에 이점을 갖는 형질인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적유전자의 특정 부위는 순차적인 DNA 절단과 복구후에 특정 유형의 돌연변이가 발생되는 부위를 말하며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 또는 성장에 이점을 갖는 형질을 생산할 수 있는 것인 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 특정 유형의 돌연변이는 단일 염기의 치환, 다수의 염기의 치환, 또는 불특정한 수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 선별압력은 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력이며, 상기 환경적 압력은 바람직하게는 고온, 저온 또는 저산소증이고; 상기 첨가된 화합물에 의한 압력은 바람직하게는 염 이온 농도, 항생제, 세포독소 또는 제초제로 인한 압력인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 절단은 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉하도록 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제를 유기체의 세포내로 전달함으로써 생성되는 것인 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표적화 특성을 갖는 뉴클레아제는 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제인 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 부위의 서열상에서 2개 이상의 DNA 절단이 순차적으로 생성된다는 특성은 CRISPR/Cas 시스템에 의한 이전의 DNA 절단 복구 이벤트에 의해 형성된 새로운 서열에 기초해, 새로운 표적RNA가 해당 부위를 다시 절단하도록 설계되는 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  46. 제38항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 상이한 gRNA 또는 sgRNA에 의해 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단함에 따라 생성된 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  47. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA에 의해 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단함에 따라 생성된 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적유전자는 제1 표적유전자와 코딩이 상이한 또 다른 유전자인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 최소한 1개의 제2 표적유전자에 표적화된 뉴클레아제는 제1 표적유전자의 특정 부위에 DNA 절단을 생성시키는데 사용되는 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 동일하거나 상이한 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  50. 제38항 내지 제45항 및 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제는 DNA 형태인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  51. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제는 DNA 대신 mRNA 또는 단백질의 형태인, 편집 이벤트를 선별하는 방법.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화된 뉴클레아제를 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중 선택되는 것인, 편집 이벤트를 선별하는 방법: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 5) 유전자 총 충격 방법; 또는6) Agrobacterium -매개 형질전환 방법.
  53. 다음과 같은 단계를 포함하는 비 형질전환적 일시적인 유기체 지놈의 편집 방법:
    1) 최소한 2개의 crRNA 단편의 조합 또는 최소한 2개의 sgRNA 단편의 조합이 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에 맞게 설계 및 합성되며, 이 때 tracrRNA와 조합된 crRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합은 상응하는 Cas 단백질이 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 각각 자발적으로 복구하도록 유도하며, 이 때 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초한 것인 단계;
    2) 적절한 양의 CRISPR/Cas 단백질 또는 그와 상응하는 mRNA가 앞서 설계 및 합성된 tracrRNA와 조합된 crRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합과 혼합되어 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집을 유도해 내인성 선별 마커를 생성할 수 있으며, 선택적으로, 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편이 추가적으로 첨가되며, in vitro 상에서 배양이 수행되어 RNP 복합체를 형성하는 단계;
    3) 상기 RNP 복합체가 수용 세포 내로 전달되고 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉해 유전자를 편집하는 단계;
    4) RNP 복합체의 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집으로 생성된 표현형으로 선별가능한 형질에 따라, 상응하는 선별압력이 적용되어 형질의 선별이 이루어지고, 편집 이벤트를 포함한 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되며, 선택적으로 제1 표적유전자 및 최소한 1개의 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자의 편집 이벤트를 포함한 세포, 조직, 기관 또는 완전한 유기체가 분리되는 단계.
  54. 제53항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 유전자 좌이고, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점을 갖는 형질인, 지놈의 편집 방법.
  55. 제53항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적유전자의 특정 부위는 순차적인 DNA 절단과 복구 이후에 특정 유형의 돌연변이가 발생되는 부위이며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점을 갖는 형질을 생산할 수 있는 것인, 지놈의 편집 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 특정 유형의 돌연변이는 단일 염기의 치환, 복수의 염기의 치환, 또는 불특정 개수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인, 지놈의 편집 방법.
  57. 제55항 또는 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 선별압력은 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력이며; 상기 환경적 압력은 바람직하게는 고온, 저온 또는 저산소증이고; 상기 첨가된 화합물에 의한 압력은 바람직하게는 염 이온 농도, 항생제, 세포독소 또는 제초제로 인한 압력인 지놈의 편집 방법.
  58. 제53항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 단백질은 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제인 지놈의 편집 방법.
  59. 제53항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성시키는 특성은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 이전의 DNA 절단 복구 이벤트에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여, 해당 부위를 다시 절단하기 위해 새로운 표적RNA가 설계되는 것인 지놈의 편집 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각 상이한 gRNA 또는 sgRNA로 형성된 RNP 복합체가 순차적으로 상응하는 표적서열을 절단할 때 생성되는 것인 지놈의 편집 방법.
  61. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 각각의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA로부터 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적 서열을 절단할 때 생성되는 것인 지놈의 편집 방법.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자는 제1 표적유전자와 코딩이 상이한 다른 유전자인 지놈의 편집 방법.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편은 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA와 동일한 Cas 단백질을 공유하는 것인 지놈의 편집 방법.
  64. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편은 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA와 상이한 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질을 사용하는 것인 지놈의 편집 방법.
  65. 제53항 내지 64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNP 복합체를 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중 선택되는 것인 지놈의 편집 방법: 1) PEG-매개 세포 형질주입 방법; 2) 리포솜-매개 세포 형질주입 방법; 3) 전기천공 형질전환 방법; 4) 미세주입법; 또는 5) 유전자 총 충격 방법.
  66. 다음과 같은 단계를 포함하는 비 형질전환적 일시적인 식물체 지놈의 편집 방법:
    1) 최소한 2개의 crRNA 단편의 조합 또는 최소한 2개의 sgRNA 단편의 조합이 수용 식물 세포 또는 조직의 제1 표적유전자의 특정 부위에 맞게 설계 및 합성되며, 이 때 tracrRNA와 조합된 crRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합은 상응하는 Cas 단백질이 수용 세포의 제1 표적유전자의 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성하고 각각 자발적으로 복구하도록 유도하며, 이 때 나중의 DNA 절단은 이전의 DNA 절단 복구에 의해 형성된 새로운 서열에 기초한 것인 단계.
    2) 적절한 양의 CRISPR/Cas 단백질 또는 그와 상응하는 mRNA가 앞서 설계 및 합성된 tracrRNA와 조합된 crRNA 단편의 조합 또는 sgRNA 단독의 조합과 혼합되어 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집을 유도해 내인성 선별 마커를 생성할 수 있으며, 선택적으로, 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편이 추가적으로 첨가되며, RNP 복합체를 형성하기 위해 in vitro상에서 배양이 수행되는 단계;
    3) 상기 RNP 복합체가 수용 식물 세포 또는 조직 내로 전달되고 지놈 DNA의 특정 부위와 접촉해 유전자를 편집하는 단계;
    4) RNP 복합체의 제1 표적유전자의 부위 특이적 편집으로 생성된 표현형으로 선별가능한 형질에 따라, 상응하는 선별압력이 적용되어 형질의 선별이 이루어지고, 편집 이벤트를 포함한 세포, 조직, 기관 또는 완전한 식물체가 분리되며, 선택적으로 제1 표적유전자 및 최소한 1개의 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자의 편집 이벤트를 가진 세포, 조직, 기관 또는 완전한 식물체가 분리되는 단계.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 유전자 좌이고, 상기 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질은 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점을 갖는 형질인 지놈의 편집 방법.
  68. 제66항 또는 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적유전자의 특정 부위는 순차적인 DNA 절단과 복구 이후에 특정 유형의 돌연변이가 발생되는 부위이며, 이는 수용 세포에 특정 선별압력에 대한 저항성을 부여하여 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 저항성/내성 형질 또는 성장에 이점을 갖는 형질을 생산할 수 있는 것인 지놈의 편집 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 특정 유형의 돌연변이는 단일 염기의 치환, 복수의 염기의 치환, 또는 불특정 개수의 염기의 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 지놈의 편집 방법.
  70. 제68항 또는 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 선별압력은 환경적 압력 또는 첨가된 화합물에 의한 압력이며; 상기 환경적 압력은 바람직하게는 고온, 저온 또는 저산소증이고; 상기 첨가된 화합물에 의한 압력은 바람직하게는 염 이온 농도, 항생제, 세포독소 또는 제초제로 인한 압력인 지놈의 편집 방법.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용 식물 세포 또는 조직은 일시적 발현을 위한 수용체로 작용할 수 있고 조직배양을 통해 완전한 식물체로 재생될 수 있는 임의의 세포 또는 조직이며; 상기 세포는 바람직하게는 원형질체 세포 또는 현탁 세포이며; 상기 조직은 바람직하게는 캘러스, 미성숙 배, 성숙한 배, 잎, 새싹 끝, 어린 스파이크 또는 배축인 지놈의 편집 방법.
  72. 제66항 내지 71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 단백질은 지놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 뉴클레아제인 지놈의 편집 방법.
  73. 제66항 내지 72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 부위에서 2개 이상의 DNA 절단을 순차적으로 생성시키는 특성은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 이전의 DNA 절단 복구 이벤트에 의해 형성된 새로운 서열에 기초하여, 해당 부위를 다시 절단하기 위해 새로운 표적RNA가 설계되는 것인 지놈의 편집 방법.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 동일한 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 상이한 gRNAs 또는 sgRNAs로부터 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성되는 것인 지놈의 편집 방법.
  75. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 DNA 절단은 상이한 PAM 서열을 인식하는 2개 이상의 각각의 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 각각의 gRNA 또는 sgRNA로 각각 형성된 RNP 복합체가 상응하는 표적서열을 순차적으로 절단할 때 생성되는 것인 지놈의 편집 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3 또는 그 이상의 표적유전자는 제1 표적유전자와 코딩이 상이한 다른 유전자인 지놈의 편집 방법.
  77. 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편은 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA와 동일한 Cas 단백질을 공유하는 것인 지놈의 편집 방법.
  78. 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2, 제3, 또는 그 이상의 표적유전자를 표적하는 최소한 1개의 인공적으로 합성된 crRNA 및 tracrRNA 단편 또는 인공적으로 합성된 sgRNA 단편은 제1 표적유전자를 표적하는 crRNA 또는 sgRNA와 상이한 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질을 사용하는 것인 지놈의 편집 방법.
  79. 제66항 내지 78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNP 복합체를 식물 세포 내로 전달하는 방법은 다음 중에서 선택되는 것인 지놈의 편집 방법: 1) PEG-매개 원형질체 형질전환 방법; 2) 미세주입법; 3) 유전자 총 충격 방법; 4) 탄화규소섬유-매개 방법; 또는 5) 진공 침투 방법, 또는 임의의 다른 일시적 도입 방법.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 제초제 저항성/내성으로 선별되는 최소한 1개의 표현형으로 선별가능한 형질을 인코딩하는 최소한 1개의 내인성 유전자이며, 상기 제초제 저항성/내성은 EPSPS 억제제에 대한 저항성/내성, 글루타민 합성 억제제에 대한 저항성/내성, ALS 또는 AHAS 억제제에 대한 저항성/내성, ACCase 억제제에 대한 저항성/내성, 카로티노이드 생합성 억제제에 대한 저항성/내성, 셀룰로오스 억제제에 대한 저항성/내성, 지질 합성 억제제에 대한 저항성/내성, 장쇄 지방산 억제제에 대한 저항성/내성, 미세소관 조립 억제제에 대한 저항성/내성, 광계1 전자 션트제에 대한 저항성/내성, 광계2 억제제에 대한 저항성/내성, 또는 PPO 억제제에 대한 저항성/내성, 및 합성 성장호르몬에 대한 저항성/내성 중에서 선택되는 것이며; 바람직하게는, 제1 표적유전자는 PsbA, ALS, EPSPS, ACCase, PPO, HPPD, PDS, GS, DOXPS, TIR1 또는 AFB5로부터 선택되는 것인 지놈의 편집 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 ALS이고, 상기 유전자의 특정 부위는 Arabidopsis AtALS 단백질 아미노산 서열내의 A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653 또는 G654 부위, 및 AtALS 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 ALS 단백질내의 아미노산 부위를 지칭; 또는
    crRNA 또는 sgRNA는 A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653, G654 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 AtALS 단백질 아미노산 서열 부위를 포함하는 표적서열, 및 AtALS 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 ALS 단백질내의 아미노산 부위 및 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적하는 것인 지놈의 편집 방법.
  82. 제80항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 ACCase이며, 상기 유전자의 특정 부위는 Alopecurus myosuroides AmACCase 단백질 아미노산 서열내의 I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088 또는 G2096 부위, 및 AmACCase 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 단자엽 식물의 ACCase 단백질 내의 아미노산 부위를 지칭하며; 또는
    crRNA 또는 sgRNA는 I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088, G2096 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 AmACCase 아미노산 서열 부위를 포함하는 표적서열, 및 AmACCase 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 단자엽 식물의 ACC 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적하는 것인 지놈의 편집 방법.
  83. 제80항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 HPPD이며, 상기 유전자의 특정 부위는 Oryza sativa OsHPPD 단백질 아미노산 서열내의 H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418 또는 G419 부위, 및 OsHPPD 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 HPPD 단백질 내의 아미노산 부위를 지칭하며; 또는
    crRNA 또는 sgRNA는 H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418, G419 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 OsHPPD 아미노산 서열 부위를 포함하는 표적서열, 및 OsHPPD 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 HPPD 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적하는 것인 지놈의 편집 방법.
  84. 제80항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 PPO이며, 상기 유전자의 특정 부위는 Oryza sativa OsPPO1 단백질 아미노산 서열내의 S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425 또는 W470 부위, 및 OsPPO1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 PPO 단백질 내의 아미노산 부위를 지칭하며; 또는
    crRNA 또는 sgRNA는 S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425, W470 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 OsPPO1 아미노산 서열 부위를 포함하는 표적서열, 및 OsPPO1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 PPO 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적하는 것인 지놈의 편집 방법.
  85. 제80항에 있어서, 상기 제1 표적유전자는 TIR1이며, 상기 유전자의 특정 부위는 Oryza sativa OsTIR1 단백질 아미노산 서열내의 F93, F357, C413 또는 S448부위, 및 OsTIR1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 TIR1 단백질 내의 아미노산 부위를 지칭하며; 또는
    crRNA 또는 sgRNA는 F93, F357, C413, S448 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 OsTIR1 아미노산 서열 부위를 포함하는 표적서열, 및 OsTIR1 아미노산 서열을 참조 표준으로 사용한, 상기 아미노산 부위에 상응하는 다른 식물의 TIR1 단백질의 아미노산 부위 및 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 서열을 포함하는 표적서열을 표적하는 것인 지놈의 편집 방법.
  86. 제53항 내지 제85항 중 어느 한 항의 지놈의 편집방법을 사용하는 비-형질전환적 일시적인 편집 시스템.
  87. 제86항의 비-형질전환적 일시적인 편집 시스템의 선별 마커 또는 질병치료 또는 생물학적 육종에서의 용도.
  88. 제66항 내지 제85항 중 어느 한 항에 따른 지놈의 편집 방법에 의해 얻어진 유전자 변형 식물, 상기 식물의 지놈은 다음을 포함함:
    1) 제1 표적유전자의 편집 이벤트;
    2) 제1 표적유전자의 편집 이벤트 및 최소한 1개의 제2 표적유전자의 편집 이벤트; 또는
    3) 유전적 분리에 의해 제1 표적유전자의 편집 이벤트가 제거된 최소한 1개의 제2 표적유전자 편집 이벤트;
    상기 유전자 변형 식물은 비-형질전환적 방법으로 얻어짐.
  89. 제66항 내지 제85항 중 어느 한 항에 따른 지놈 편집 방법에 의해 얻어진 새로운 식물 유전자 돌연변이.
  90. 다음 유형 중 하나 또는 둘 이상의 조합을 포함하는 식물에서 발생된 새로운 돌연변이:
    Arabidopsis ALS376에 상응하는 부위의 아스파르트산이 임의의 다른 아미노산으로 치환, Arabidopsis ALS574에 상응하는 부위의 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환, Arabidopsis ALS653에 상응하는 부위의 세린이 임의의 다른 아미노산으로 치환, 또는 Arabidopsis ALS654에 상응하는 부위의 세린이 임의의 다른 아미노산으로 치환; 또는 Alopecurus myosuroides ACCase2027에 상응하는 부위의 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환.
  91. 제90항에 있어서, 상기 Arabidopsis ALS376에 상응하는 부위의 아스파르트산이 글루탐산으로 치환, Arabidopsis ALS574에 상응하는 부위의 트립토판이 류신 또는 메티오닌으로 치환, Arabidopsis ALS653에 상응하는 부위의 세린이 아스파라긴 또는 아르기닌으로 치환, 또는 Arabidopsis ALS654에 상응하는 부위의 글라이신이 아스파르트산으로 치환; 또는, Alopecurus myosuroides ACCase2027에 상응하는 부위의 트립토판이 류신 또는 시스테인으로 치환된 식물에서 발생된 새로운 돌연변이.
  92. 제90항에 있어서, Oryza sativa ALS의 350 부위에 있는 아스파르트산이 임의의 다른 아미노산으로 치환, Oryza sativa ALS의 548 부위에 있는 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환, 또는 Solanum tuberosum L. ALS2의 561 부위에 있는 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환; 또는, Oryza sativa ACCase2의 2038 부위에 있는 트립토판이 임의의 다른 아미노산으로 치환된 식물에서 발생된 새로운 돌연변이.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Oryza sativa ALS의 350 부위에 있는 아스파르트산이 글루탐산으로 치환, Oryza sativa ALS의 548 부위에 있는 트립토판이 류신 또는 메티오닌으로 치환, 또는 Solanum tuberosum L. ALS2의 561 부위에 있는 트립토판이 류신 또는 메티오닌으로 치환; 또는, Oryza sativa ACCase2의 2038 부위에 있는 트립토판이 류신 또는 시스테인으로 치환된 식물에서 발생된 새로운 돌연변이.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 새로운 돌연변이를 포함하는 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편.
  95. 제94항에 따른 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그 상보적 서열을 포함하는 핵산.
  96. 제95항에 따른 핵산 및 그와 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  97. 제95항에 따른 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  98. 제97항에 따른 발현 카세트를 포함하는 식물 세포.
  99. 제98항에 따른 식물 세포를 사용하여 재생된 식물체.
  100. 제96항에 따른 재조합 발현 벡터 또는 제97항에 따른 발현 카세트로 식물 세포를 형질전환 또는 형질주입시키는 단계, 및 형질전환 또는 형질감염된 식물 세포를 식물체로 재생시키는 것을 포함하는 제초제 저항성 또는 내성이 향상된 식물을 제조하는 방법.
  101. 제88항 또는 제99항에 따른 식물 또는 제100항에 따른 방법에 의해 생산된 식물을 포함하는 식물 재배 장소에서 잡초를 방제하는 방법으로서, 상기 방법은 1개 이상의 제초제를 잡초를 제거하기 위한 효과적인 양으로 적용하는 것을 포함하는 것인 잡초를 방제하는 방법.
  102. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 새로운 돌연변이, 제94항에 따른 단백질 또는 그 생물학적 활성 단편, 제95항에 따른 핵산, 제96항에 따른 재조합 발현 벡터, 또는 제97항에 따른 발현 카세트의, 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분, 식물체의 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 향상시키는 용도.

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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115161316A (zh) * 2021-04-02 2022-10-11 上海科技大学 一种引导编辑工具、融合rna及其用途
CN113846075A (zh) * 2021-11-29 2021-12-28 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用
CN114145231B (zh) * 2021-12-16 2022-09-13 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法
CN117987447A (zh) * 2022-11-02 2024-05-07 广州大学 一种真核细胞持续进化的控制方法及其应用
CN115644067B (zh) * 2022-12-09 2023-03-14 云南省农业科学院药用植物研究所 一种生产滇黄精双单倍体的方法
CN116286869B (zh) * 2023-03-23 2024-04-05 石河子大学 一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用
CN116410989B (zh) * 2023-05-12 2024-06-14 云南农业大学 一种病毒诱导的三七pds基因沉默体系及应用
CN117918260B (zh) * 2024-03-21 2024-05-24 西南林业大学 一种云南松组培苗的繁殖方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101668419B (zh) * 2007-04-04 2016-03-23 巴斯福植物科学有限公司 Ahas突变体
US20120005773A1 (en) * 2008-10-01 2012-01-05 Aasen Eric D Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2015024957A1 (en) * 2013-08-21 2015-02-26 Bayer Cropscience Nv Als inhibitor herbicide tolerant mutant plants
US20160298129A1 (en) * 2013-12-02 2016-10-13 Bayer Cropscience Nv Als inhibitor herbicide tolerant mutant plants
BR112018011133A2 (pt) * 2015-11-30 2018-11-21 Univ Duke alvos terapêuticos para a correção do gene humano de distrofina por edição de gene e métodos de uso
US20170314033A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-02 Ohio State Innovation Foundation Herbicide-resistant taraxacum kok-saghyz and taraxacum brevicorniculatum
AU2018212986A1 (en) * 2017-01-28 2019-08-08 Inari Agriculture Technology, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
CN108795972B (zh) * 2017-05-05 2023-07-14 苏州齐禾生科生物科技有限公司 不使用转基因标记序列分离细胞的方法
JP2020518253A (ja) * 2017-05-05 2020-06-25 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ トランスジェニックマーカー配列を使用せず細胞を単離する方法
BR112019023377A2 (pt) * 2017-05-11 2020-06-16 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Criação de um gene resistente a herbicida e uso do mesmo
CN110157727A (zh) * 2017-12-21 2019-08-23 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物碱基编辑方法
CA3087715A1 (en) * 2018-02-08 2019-08-15 Zymergen Inc. Genome editing using crispr in corynebacterium
WO2019196717A1 (zh) * 2018-04-13 2019-10-17 青岛清原化合物有限公司 一种随机突变的基因编辑系统及其应用
US20190330643A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 The Catholic University Of America Engineering of bacteriophages by genome editing using the crispr-cas9 system
CN109536527A (zh) * 2018-11-27 2019-03-29 中国科学院动物研究所 一种基因点突变修复的新方法

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