BR112015030105B1 - Construção de gene quimérico, vetor recombinante, usos dos mesmos, bem como método para a produção de uma planta monocotiledônea com maior rendimento em comparação com uma planta monocotiledônea do tipo selvagem correspondente - Google Patents

Abstract

MEIOS E MÉTODOS PARA O DESEMPENHO DE PRODUTIVIDADE NAS PLANTAS. A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, mais particularmente ao campo da agricultura, ainda mais particularmente ao campo da melhora da produtividade das plantas. A presente invenção fornece genes quiméricos e construções que podem ser utilizados para aumentar o rendimento nas plantas e culturas.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, mais particularmente ao campo da agricultura, ainda mais particularmente ao campo da melhora da produtividade das plantas. A presente invenção fornece genes quiméricos e construções que podem ser utilizados para aumentar o rendimento nas plantas e lavouras.

Introdução da invenção

[002] Desde o início da agricultura e horticultura, havia uma necessidade em melhorar características vegetais no cultivo de culturas. Estratégias de reprodução de propriedades agrícolas adotivas para resistir ao estresse biótico e abiótico, para melhorar a eficiência de uso de nutrientes e para alterar outros parâmetros específicos da cultura intrínseca, isto é, aumentar a produtividade através da aplicação de avanços técnicos. Nas próximas décadas, um desafio crucial para a humanidade será alcançar demandas futuras de alimentos sem arruinar gradativamente mais adiante a integridade dos sistemas ambientais da Terra. Os sistemas agrícolas já são a maior força de degradação ambiental global, mas o crescimento da população e o aumento do consumo de dietas intensivas em calorias e de carne são esperados de rudemente dobrar a demanda alimentar humana em 2050. Em resposta a essas pressões, existe um crescente foco na "intensificação sustentável" como um meio de aumentar os rendimentos sobre as paisagens de baixo desempenho, enquanto diminui simultaneamente os impactos ambientais dos sistemas agrícolas. Meios convencionais para a cultura e melhoras na horticultura na época atual utilizam técnicas de reprodução seletiva para identificar as plantas com características desejáveis. Os avanços na biologia molecular permitiram modificar o idioplasma das plantas de uma forma específica. Por exemplo, a modificação de um único gene resultou em vários casos de um aumento significativo no rendimento ou nas características relacionadas com o rendimento.

[003] As monooxigenases do citocromo P450 são uma superfamília das enzimas heme-dependentes que estão envolvidas na biossíntese e desintoxicação de uma ampla variedade de moléculas. Várias reações mediadas pelo citocromo P450 dão origem a produtos necessários para o controlo da expansão das células nas plantas. O gene CYP78A5 é uma monooxigenase do citocromo P450 (Zondlo SC and Irish VF (1999) The Plant Journal 19(3), 259-268), que é fortemente expressa nas regiões periféricas dos meristemas apicais vegetativos e reprodutivos do broto. A superexpressão de CYP78A5 afeta vários tipos de células, provocando a torção e enroscamento do caule e defeitos no desenvolvimento floral. Além disso, a superexpressão constitutiva de CYP78A5 leva a folhas menores nas plantas transformadas. Na presente invenção, surpreendentemente, mostramos que uma construção de genes quiméricos em que o CYP78A5 do milho é controlado por um promotor da GA2 oxidase do milho, leva a um aumento superior a 30 % no tamanho da folha no milho. Esta nova característica pode ser utilizada para aumentar o rendimento nas plantas, em particular nas culturas tais como, por exemplo, cereais.

Figuras

[004] Figura 1: A sequência do promotor de GA2 oxidase derivado dos sítios GRMZM2G031724, attB1 e attB2 está sublinhada (SEQ ID NO 1).

[005] Figura 2: A sequência do gene KLUH (GRMZM2G167986), ligado aos sítios attB1 e attB2 está sublinhada (SEQ ID NO: 2).

[006] Figura 3: Estrutura do vetor de pBb42GW7

[007] Figura 4: Estrutura do clone de expressão contendo o promotor de GA2 oxidase e o gene KLUH.

[008] Figura 5: A sequência do gene quimérico resultante "promotor da GA2 oxidase (GRMZM2G031724) operativamente ligado ao gene KLUH (GRMZM2G167986)" que foi incorporada no vetor de expressão da planta (SEQ ID NO: 3).

[009] Figura 6: Taxa de alongamento foliar em 140_04. R representa plantas transgênicas (resistentes), S representa plantas não transgênicas (sensíveis).

[0010] Figura 7: Taxa de alongamento foliar em 140_05. R representa plantas transgênicas (resistentes), S representa plantas não transgênicas (sensíveis).

[0011] Figura 8: Resultados comparativos da expressão de KLUH da folha 4 de 140_01. R representa plantas transgênicas, S representa plantas não transgênicas.

[0012] Figura 9: Resultados comparativos da expressão de KLUH da folha 4 de 139_01. R representa plantas transgênicas, S representa plantas não transgênicas.

[0013] Figura 10: Temporização do tamanho da zona de temporização em GA2ox::KLUH. O gráfico de barras mostra como o tamanho da zona de divisão se alterou durante o crescimento da folha 4. O gráfico linear mostrou a taxa de alongamento foliar da folha 4 ao mesmo tempo. S indica tipo silvestre (barras à esquerda); R indicou plantas resistentes de GA2ox::KLUH transgênico (barras à direita). Os asteriscos indicam p < 0,01.

[0014] Figura 11: fenótipos do GA2OX::KLUH x UBIL::GA20Ox cruzado e suas respectivas origem. A. mudas de 30 dias após a semeadura. As setas indicam a folha 4; B. plantas totalmente cultivadas em 115 dias; C. taxa de crescimento ou LER (eixo Y: mm/h e eixo X dias de crescimento da folha 4).

[0015] Figura 12: crescimento de plantas de milho transgênicas que abrigam o gene quimérico GA2ox::KLUH sob estresse de estiagem suave. W indica plantas sob condições bem providas de água; D indica plantas sob estresse de estiagem suave. R e S referem-se às plantas resistentes e sensíveis.

Descrição detalhada da invenção

[0016] A folha do milho em desenvolvimento fornece um excelente sistema modelo para estudar a função da divisão celular e da expansão de células no controle do tamanho do órgão, visto que estes dois processos ocorrem espacialmente separados dentro da zona de crescimento. Em uma muda de milho, a quarta folha está crescendo em uma taxa máxima logo após o surgimento da bainha de folhas mais velhas circundantes. A sua zona de crescimento está localizada na base da folha, o que significa que a folha deve ser dissecada a partir da bainha, a fim de aceder a zona de crescimento. Desta forma, a zona de crescimento da quarta folha pode ser facilmente experimentada com uma resolução espacial elevada, devido ao tamanho relativamente grande da folha do milho em crescimento.

[0017] Na presente invenção, mostramos que numerosos transcritos mostram uma expressão diferencial dentro das diferentes amostras que compõem uma zona, indicando as distinções dentro da zona de crescimento. Similarmente, os hormônios de regulação do crescimento auxinas e citocininas são superiores na parte basal da zona de divisão em comparação com a parte mais distal (Nelissen et al., 2012, Curr. Biol). O estudo de transcriptoma de alta resolução que foi feito nos permitiu identificar os genes com perfis de expressão muito distintos em toda a zona de crescimento. Na presente invenção, construímos um gene quimérico que compreende o promotor de um gene da GA2 oxidase da planta operativamente acoplado à sequência de nucleotídeo do gene KLUH. Na nossa modalidade exemplificada, mostramos que este gene quimérico - quando expresso em uma planta - leva a um aumento de 30 % no tamanho da folha. Sem limitar a invenção a um mecanismo particular de uma forma de pensar que este gene quimérico exerce a sua ação benéfica, quando se expressa em uma planta, é que a expressão do gene KLUH ou um homólogo funcional de pelo menos 55 % de identidade de aminoácido éprolongada durante a zona de crescimento (isto é, a expressão do gene KLUH é mantida ativa por um período mais longo do que a expressão do gene KLUH sob controle de seu próprio promotor, em células em divisão). Ainda de acordo com a nossa hipótese não limitativa, acredita- se que a expressão estendida (ou prolongada) de KLUH dentro da zona de crescimento (em comparação com a expressão do gene KLUH sob controle do seu próprio promotor) resulta na estimulação de divisões adicionais e consequentemente em maior produtividade da cultura.

[0018] Consequentemente, em uma primeira modalidade, a invenção fornece uma construção de genes quiméricos compreendendo os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: a) a região do promotor de um gene da GA2 oxidase da planta, b) uma região de DNA que codifica uma proteína CYP78A5 da planta ou um ortólogo funcional com uma identidade de aminoácido de pelo menos 55 % e c) uma região da extremidade 3' compreendendo sinais de terminação da transcrição e de poliadenilação que funcionam nas células de uma planta.

[0019] Em uma modalidade particular, a região do promotor de um gene da GA2 oxidase da planta é ativa nas células em divisão. Em mais outra modalidade particular, a região do promotor de um gene da GA2 oxidase da planta é ativa na zona de crescimento de um órgão da planta, tal como, por exemplo, a folha. Em mais outra modalidade particular, o promotor do gene da GA2 oxidase da planta é ativo na zona de crescimento da folha. Em mais outra modalidade particular, o promotor da GA2 oxidase da planta está ativa em um tecido vegetal que está ativamente em divisão. Em outra modalidade particular, o promotor do promotor da GA2 oxidase da planta é ativo na espiga (de, por exemplo, Zea mays). Em mais modalidade particular, o promotor da GA2 oxidase da planta é ativo no meristema apical do broto (SAM). Em mais outra modalidade particular, o promotor da GA2 oxidase da planta é ativa no embrião da planta.

[0020] Entende-se que o promotor do gene da GA2 oxidase da planta (por exemplo, órgão específico (tal como na folha, espiga, embrião ou SAM)) é um fragmento a montante do códon de partida do gene que consiste de cerca de 1000 a 2500 pb, de preferência de 1000 a 2000 pb, mais preferivelmente de 1000 a 1500 pb. A GA2 oxidase é conhecida na técnica como a giberelina 2-oxidase. Um exemplo representativo não limitativo de um promotor da GA2 oxidase é representado na Figura 1. Outros exemplos de promotores da GA2 oxidase são descritos no Exemplo 7 da invenção.

[0021] O gene KLUH da planta também é designado na técnica como o CYP78A5. O CYP78A5 é uma oxidase do citocromo P450. Um membro representativo não limitativo do CYP78A5 de milho é representado na Figura 2. Outros exemplos de genes ortólogos CYP78A5 são descritos no exemplo 8 da invenção.

[0022] Na presente invenção as palavras "KLUH" ou "CYP78A5" são utilizadas de modo trocável. O termo "KLUH-semelhante" ou "CYP78A5-semelhante" é utilizado para definir um ortólogo funcional de KLUH (ou CYP78A5). De acordo com a técnica (Nelson DR (2006), Methods Mol Biol, 320:1-10) os ortólogos de KLUH (ou CYP78A5) com uma identidade de aminoácido de pelo menos 55 % pertencem ao mesmo grupo funcional do citocromo P450 oxidase, e, consequentemente, possuem a mesma função nas plantas. Assim, em uma modalidade particular, uma região de DNA que codifica uma proteína CYP78A5 vegetal ou um ortólogo funcional com uma identidade de aminoácido de pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pode ser utilizada na presente invenção para a construção do gene quimérico.

[0023] Fica entendido que um gene quimérico particular pode ser utilizado como uma característica nas diferentes espécies de plantas e que um promotor de GA2 oxidase específico da planta é ativo em mais do que uma espécie de planta.

[0024] Na presente invenção, o "promotor da GA2 oxidase da planta" compreende os elementos reguladores que medeiam a expressão do segmento da sequência de codificação de KLUH, ou um ortólogo funcional de pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % de identidade nas células vegetais. Para a expressão nas plantas, a molécula de ácido nucléico deve ser ligada operativamente a um promotor da GA2 oxidase da planta adequado que expressa o gene KLUH ou um ortólogo funcional com pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % no ponto de tempo correto e com o padrão de expressão espacial requerido na zona de crescimento (ou na zona de divisão celular).

[0025] Para a identificação de promotores da GA2 oxidase da planta funcionalmente equivalentes (por exemplo, em outros gêneros de planta ou outras espécies de planta), a força do promotor e/ou o padrão de candidato de um promotor da GA2 oxidase candidato pode ser analisado, por exemplo, através da ligação operacional do promotor à um gene repórter e teste do nível e padrão de expressão do gene repórter na planta. Os genes repórteres bem conhecidos adequados incluem, por exemplo, beta-glicuronidase; beta-galactosidase ou qualquer proteína fluorescente. A atividade do promotor é avaliada através da medição da atividade enzimática da beta-glicuronidase ou da beta-galactosidase. Alternativamente, a força do promotor também pode ser testada através da quantificação dos níveis de mRNA ou através da comparação dos níveis de mRNA do ácido nucléico com os níveis de mRNA dos genes de manutenção tais como 18S rRNA, utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como Northern blotting com a análise densitométrica de auto-radiogramas, PCR em tempo real ou RT-PCR quantitativa (Heid et al., 1996 Genome Methods 6:986-994).

[0026] O termo "ligado operativamente" como aqui utilizado refere-se a uma ligação funcional entre a sequência de promotor (aqui o promotor da GA2 oxidase) e o gene de interesse (aqui o gene KLUH ou um homólogo funcional deste, como aqui definido acima), de tal modo que a sequência de promotor da GA2 oxidase é capaz de iniciar a transcrição do gene KLUH (ou um homólogo funcional deste) de interesse.

[0027] Um "gene quimérico" ou "construção quimérica" é uma sequência de ácido nucléico recombinante em que um promotor ou sequência de ácido nucléico reguladora está operativamente ligado, ou associados, com uma sequência de ácido nucléico que codifica um mRNA, de tal forma que a sequência de ácido nucléico reguladora é capaz de regular a transcrição ou a expressão da sequência de codificação de ácido nucléico associada. A sequência de ácido nucléico reguladora do gene quimérico não é normalmente ligada operativamente à sequência de ácido nucléico associada como encontrado na natureza.

[0028] O termo "terminador" abrange uma sequência de controle que é uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade de transcrição que sinaliza 3' que processa a poliadenilação do transcrito primário e um término da transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes vegetais, ou a partir do T-DNA. O terminador para ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou, alternativamente, de outro gene vegetal, ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

[0029] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um vetor recombinante compreendendo uma construção de gene quimérico que compreende os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: a) a região do promotor de um promotor da GA2 oxidase da planta, b) uma região de DNA que codifica uma proteína vegetal CYP78A5 ou um ortólogo funcional com uma identidade de aminoácidos de pelo menos 55 % e c) uma região da extremidade 3' compreendendo sinais de término da transcrição e de poliadenilação que funcionam nas células de uma planta.

[0030] Em mais outra modalidade a invenção fornece uma planta, célula vegetal ou semente de planta compreendendo uma construção de gene quimérico que compreende os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: a) a região do promotor de um gene da GA2 oxidase da planta, b) uma região de DNA que codifica uma proteína vegetal CYP78A5 ou um ortólogo funcional com uma identidade de aminoácido de pelo menos 55 % e c) uma região de extremidade 3' compreendendo os sinais de término da transcrição e poliadenilação que funcionam nas células de uma planta ou um vetor recombinante compreendendo uma construção de gene quimérico que compreende os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: a) a região promotora de um gene da GA2 oxidase da planta, b) uma região de DNA que codifica uma proteína vegetal CYP78A5 ou um ortólogo funcional com uma identidade de aminoácido de pelo menos 55 % e c) uma região da extremidade 3' que compreende os sinais do término da transcrição e poliadenilação que funcionam nas células de uma planta.

[0031] Em mais outra modalidade, a invenção fornece o uso de um gene quimérico ou um vetor recombinante de acordo com a invenção para aumentar o rendimento das plantas.

[0032] Em mais outra modalidade, a invenção fornece o uso de um gene quimérico ou um vetor recombinante de acordo com a invenção para aumentar o vigor das mudas das plantas.

[0033] Em mais outra modalidade, a invenção fornece o uso de um gene quimérico ou um vetor recombinante de acordo com a invenção para aumentar a tolerância à estiagem das plantas. Em uma modalidade específica, o gene quimérico ou o vetor recombinante que compreende o gene quimérico da invenção é utilizado para aumentar a tolerância à estiagem do milho.

[0034] Em uma modalidade específica os genes quiméricos ou o vetor recombinante compreendendo os genes quiméricos são utilizados nas culturas.

[0035] Em outra modalidade específica as culturas são cereais.

[0036] Em mais outra modalidade específica as culturas são gramíneas.

[0037] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma planta com maior rendimento em comparação com uma planta do tipo selvagem correspondente, por meio da qual o método compreende a introdução ou a transformação de um gene quimérico ou um vetor recombinante de acordo com a invenção.

[0038] Em mais outra modalidade particular, o gene quimérico da invenção é combinado com outros genes quiméricos que favoravelmente aumentam o rendimento das plantas. Um exemplo particular é a combinação do promotor de GA2ox-gene KLU quimérico e do promotor de UBIL do gene quimérico-gene da GA20oxidase na mesma planta de milho. Um exemplo específico desta combinação favorável é descrito no Exemplo 5.

[0039] O termo "rendimento" como aqui utilizado geralmente refere- se a um produto mensurável de uma planta, particularmente uma cultura. Rendimento e aumento do rendimento (em comparação com uma planta de partida não transformada ou do tipo selvagem) pode ser medido de várias maneiras, e entende-se que uma pessoa versada na técnica será capaz de aplicar o sentido correto tendo em vista as modalidades particulares, a cultura particular envolvida e o propósito ou aplicação específico envolvido. Os termos "rendimento melhorado" ou "aumento do rendimento" podem ser utilizados de modo trocável. Como aqui utilizado, o termo "rendimento melhorado" ou o termo "aumento do rendimento", significa qualquer melhora no rendimento de qualquer produto vegetal medido, tal como grãos, frutos, folhas, raízes, espiga ou fibra. De acordo com a invenção, as mudanças em diferentes características fenotípicas podem melhorar o rendimento. Por exemplo, e sem limitação, os parâmetros tais como o desenvolvimento do órgão floral, a iniciação da raiz, a biomassa radicular, o número de sementes, o peso das sementes, o índice de colheita, a formação de folhas, fototropismo, a dominância apical e o desenvolvimento dos frutos, são medidas adequadas de rendimento melhorado. O aumento do rendimento inclui rendimentos mais elevados de frutas, rendimentos mais elevados de sementes, maior produção de matéria fresca e/ou maior produção de matéria seca. Qualquer aumento no rendimento é uma melhora de rendimento de acordo com a invenção. Por exemplo, a melhora do rendimento pode compreender um aumento de 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90% ou maior em qualquer parâmetro medido. Por exemplo, um aumento no rendimento bu/acre da soja ou milho derivada de uma cultura compreendendo plantas que são transgênicas para os genes quiméricos da invenção, em comparação com o rendimento bu/acre da soja não transformada ou do milho cultivado sob as mesmas condições, é um rendimento melhorado de acordo com a invenção. O rendimento aumentado ou melhorado pode ser alcançado na ausência ou presença de condições de estresse. Por exemplo, "rendimento" intensificado ou aumentado refere-se a um ou mais parâmetros de rendimento selecionados do grupo que consiste de produção de biomassa, produção de biomassa seca, produção de biomassa seca aérea, produção de biomassa seca subterrânea, produção de matéria fresca de biomassa, produção de matéria fresca de biomassa aérea, produção de matéria fresca de biomassa subterrânea; rendimento intensificado de partes que podem ser colhidas, matéria seca ou fresca ou ambas, aérea ou subterrânea ou ambas; rendimento acentuado de fruticultura, matéria seca ou fresca ou ambas, aérea ou subterrânea ou ambas; e rendimento acentuado de sementes, matéria seca ou fresca ou ambas, aérea ou subterrânea ou ambas. "A produção da cultura" é aqui definida como o número de alqueires de produto agrícola relevante (tais como grãos, forragem ou semente) colhido por acre. A produção da cultura é afetada por estresses abióticos, tais como a seca, calor, salinidade, e estresse provocado pelo frio e pelo tamanho (biomassa) da planta. O rendimento de uma planta pode depender da planta específica/cultura de interesse, assim como a sua aplicação planejada (tal como a produção de alimentos, produção de ração, produção de alimentos processados, produção de biocombustível, biogás ou álcool, ou coisa parecida) de interesse em cada caso particular. Assim, em uma modalidade, o rendimento pode ser calculado como o índice de colheita (expresso como uma relação do peso das respectivas partes que podem ser colhidas dividido pela biomassa total), partes que podem ser colhidas em peso por área (acre, metro quadrado, ou coisa parecida); e outros mais. O índice de colheita é a relação da biomassa produzida para a biomassa cumulativa total na colheita. O índice de colheita é relativamente estável sob muitas condições ambientais, e assim uma correlação forte entre o tamanho da planta e produção de grãos é possível. As medições do tamanho da planta em desenvolvimento inicial, sob as condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para medir as vantagens do rendimento potencial conferidas pela presença de um transgene. Consequentemente, o rendimento de uma planta pode ser aumentado através da melhora de um ou mais dos fenótipos ou características relacionadas com o rendimento. Tais fenótipos ou característica relacionados com o rendimento de uma planta, cuja melhora resulta em aumento do rendimento compreendem, sem limitação, o aumento da capacidade de rendimento intrínseca de uma planta, eficiência melhorada do uso de nutrientes e/ou aumento da tolerância ao estresse. Por exemplo, rendimento refere-se à produção de biomassa, por exemplo, à produção de matéria seca de biomassa e/ou à produção de matéria fresca de biomassa. A produção de biomassa refere-se às partes aéreas ou subterrâneas de uma planta, dependendo das circunstâncias específicas (condições de teste, culturas específicas de interesse, aplicação de interesse, e outros mais). Em uma modalidade, a produção de biomassa refere-se às partes aéreas e subterrâneas. A produção de biomassa pode ser calculada como matéria fresca, matéria seca ou uma base com umidade ajustada. A produção de biomassa pode ser calculada em uma base por planta ou em relação a uma área específica (por exemplo, produção de biomassa por acre/metro quadrado/ou coisa parecida). "Produção" também pode referir-se à produção de sementes, a qual pode ser medida por um ou mais dos seguintes parâmetros: o número de sementes ou número de sementes carregadas (por planta ou por área (acre/metro quadrado/ou coisa parecida)); taxa de carregamento de sementes (relação entre o número de sementes carregadas e o número total de sementes); número de flores por planta; biomassa da semente ou peso total das sementes (por planta ou por área (acre/metro quadrado/ou coisa parecida); peso de mil grãos (TKW; extrapolado a partir do número de sementes carregadas contados e seu peso total; um aumento no TKW pode ser provocado por um aumento do tamanho da semente, um aumento do peso da semente, um tamanho aumentado do embrião, e/ou um aumento do endosperma). Outros parâmetros que permitem medir o rendimento de sementes também são conhecidos na técnica. O rendimento de semente pode ser determinado em uma base de matéria seca ou matéria fresca, ou tipicamente em uma base ajustada de umidade, por exemplo, em 15,5 por cento de umidade. Por exemplo, o termo "aumento de rendimento" significa que uma planta apresenta uma maior taxa de crescimento, por exemplo, na ausência ou na presença de estresse ambiental abiótico, em comparação com a planta do tipo selvagem correspondente. Um aumento da taxa de crescimento pode ser refletido, inter alia, ou confere um aumento da produção de biomassa da planta total, ou uma maior produção de biomassa das partes aéreas de uma planta, ou por um aumento da produção da biomassa das partes subterrâneas de uma planta, ou por um aumento da produção da biomassa das partes de uma planta, como caules, folhas, flores, frutos e/ou sementes. Um crescimento prolongado compreende a sobrevivência e/ou o crescimento contínuo da planta, no momento quando o organismo do tipo selvagem não transformado apresenta sintomas visuais de deficiência e/ou morte. Quando a planta da invenção for uma planta de milho, o rendimento aumentado com relação às plantas de milho significa, por exemplo, o aumento da produtividade de sementes, em especial para as variedades de milho utilizadas para consumo humano ou animal. O aumento da produção de sementes de milho refere-se a um aumento do tamanho ou peso do grão, um aumento do grão por espiga, ou o aumento de espigas por planta. Alternativamente ou além disso, o rendimento da espiga pode ser aumentado, ou o comprimento ou tamanho da espiga é aumentado, ou a relação de grãos por espiga é melhorada.

[0040] Quando a planta da invenção for uma planta de soja, o aumento do rendimento para as plantas de soja significa um aumento no rendimento das sementes, em particular para as variedades de soja utilizadas para consumo humano ou animal. O aumento da produção de sementes de soja, por exemplo, refere-se a um aumento do tamanho ou peso dos grãos, um aumento de grãos por vagem, ou aumento das vagens por planta. Quando a planta da invenção for uma planta de colza (OSR), o rendimento aumento com relação às plantas de OSR significa aumento da produtividade de sementes, em particular com relação às variedades de OSR utilizadas para consumo humano ou animal. O aumento da produção de sementes de OSR refere-se a um aumento do tamanho ou peso das sementes, um aumento do número de sementes por síliqua, ou aumento de síliquas por planta. Quando a planta da invenção for uma planta de algodão, o aumento do rendimento para as plantas de algodão significa maior produtividade das fibras. O aumento da produtividade das fibras de algodão refere-se em uma modalidade a um comprimento aumentado das fibras. Quando a planta for uma planta que pertence aos gramados, um aumento das folhas pode significar um aumento da biomassa foliar. Dito aumento do rendimento pode ser tipicamente alcançado através do aumento ou melhora de uma ou mais características relacionadas com o rendimento da planta. Tais características relacionadas com o rendimento de uma planta compreendem, sem limitação, o aumento da capacidade de rendimento intrínseca de uma planta, a melhora da eficiência de uso de nutrientes e/ou o aumento da tolerância ao estresse, em particular o aumento da tolerância ao estresse abiótico. A capacidade de rendimento intrínseca de uma planta pode ser, por exemplo, manifestada através da melhora do rendimento específico (intrínseco) de sementes (por exemplo, em termos de aumento do tamanho de semente/grão, aumento do número de espigas, aumento do número de sementes por espiga, melhora da carga de sementes, melhora da composição de sementes, melhorias dos embriões e/ou endospermas, ou coisa parecida); modificação e melhora dos mecanismos inerentes de crescimento e desenvolvimento de uma planta (tais como altura das plantas, taxa de crescimento da planta, número de vagens, posição da vagem sobre a planta, número de entrenós, incidência de vagem despedaçada, eficiência de nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de carbono, melhora do vigor da muda/vigor inicial, eficiência acentuada de germinação (sob condições estressadas ou não estressadas), melhora na arquitetura da planta, modificações do ciclo celular, modificações da fotossíntese, várias modificações da via de sinalização, modificação da regulação da transcrição, modificação da regulação translacional, modificação das atividades enzimáticas, e outras mais); e/ou coisa parecida.

[0041] "Marcador selecionável", "gene marcador selecionável" ou "gene repórter" inclui qualquer gene que confere um fenótipo sobre uma célula na qual é expresso para facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com uma construção de ácido nucléico da invenção. Estes genes marcadores permitem a identificação de uma transferência bem-sucedida das moléculas de ácido nucléico através de uma série de princípios diferentes. Marcadores adequados podem ser selecionados de marcadores que conferem resistência a antibióticos ou herbicidas, os quais introduzem uma nova característica metabólica ou permitem a seleção visual. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência aos antibióticos (tais como nptII que fosforila a neomicina e a canamicina, ou hpt que fosforila a higromicina, ou genes que conferem resistência a, por exemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina), aos herbicidas (por exemplo, exceto que fornecem resistência a Basta®; aroA ou gox que fornece resistência contra o glifosato, ou os genes que conferem resistência a, por exemplo, imidazolinonas, fosfinotricina ou sulfonilureias), ou genes que fornecem uma característica metabólica (tal como manA que permite o uso de manose pelas plantas como a única fonte de carbono ou xilose isomerase para a utilização de xilose, ou marcadores antinutritivos tais como a resistência a 2-desoxiglicose). A expressão de genes marcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo, β- glicuronidase, GUS ou β-galactosidase com os seus substratos coloridos, por exemplo, X-Gal), luminescência (tal como o sistema luciferina/luceferase) ou fluorescência (Proteína Fluorescente Verde, GFP, e seus derivados). Essa lista representa apenas um pequeno número de possíveis marcadores. O profissional qualificado está familiarizado com tais marcadores. Diferentes marcadores são preferidos, dependendo do organismo e do método de seleção.

[0042] Sabe-se que após a integração estável ou transiente de ácidos nucléicos nas células vegetais, apenas uma minoria das células absorve DNA estranho e, se desejável, integra no seu genoma, dependendo do vetor de expressão utilizado e da técnica de transfecção utilizada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador de selecionável (tal como aqueles descritos acima) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Estes marcadores podem ser utilizados, por exemplo, em mutantes nos quais estes genes não são funcionais, por exemplo, eliminação por métodos convencionais. Além disso, as moléculas de ácido nucléico que codificam um marcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor que compreende a sequência que codifica os polipeptídeos da invenção ou utilizadas nos métodos da invenção, ou então em um vetor separado. As células que foram estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas, por exemplo, através da seleção (por exemplo, as células que integraram o marcador selecionável sobrevivem enquanto que as outras células morrem).

[0043] Visto que os genes marcadores, particularmente os genes de resistência a antibióticos e herbicidas, não são mais necessários ou são indesejáveis na célula hospedeira transgênica, visto que os ácidos nucléicos foram introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para a introdução dos ácidos nucléicos vantajosamente emprega técnicas que permitem a remoção ou a excisão destes genes marcadores. Se um tal método for aquele que é conhecido como co- transformação. O método de co-transformação emprega dois vetores em simultâneo para a transformação, um vetor que carrega o ácido nucléico de acordo com a invenção e um segundo que carrega o gene marcador. Uma grande proporção dos transformantes recebe ou, no caso de plantas, compreende (até 40 % ou mais dos transformantes), ambos os vetores. Em caso de transformação com Agrobacterium, os transformantes geralmente recebem apenas uma parte do vetor, isto é, a sequência flanqueada por T-DNA, que geralmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem ser subsequentemente removidos da planta transformada através da execução de cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados em um transposon são utilizados para a transformação em conjunto com o ácido nucléico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com uma fonte de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucléico que confere a expressão de transposase, transiente ou estável. Em alguns casos (aprox. 10 %), o transposon salta para fora do genoma da célula hospedeira assim que a transformação tenha ocorrido com sucesso e é perdida. Em um outro número de casos, o transposon salta para uma localização diferente. Nestes casos o gene marcador deve ser eliminado através da execução de cruzamentos. Em microbiologia, técnicas foram desenvolvidas que tornam possíveis, ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método vantajoso conta com aquele que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O sistema melhor conhecido deste tipo é aquele que é conhecido como o sistema Cre/lox. Cre 1 é uma recombinase que remove as sequências situadas entre as sequências loxP. Se o gene marcador for integrado entre as sequências loxP, ele é removido visto que a transformação ocorreu com sucesso, através da expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são os sistemas as HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). A integração específica do sítio no genoma da planta das sequências de ácido nucléico de acordo com a invenção é possível.

[0044] Para os propósitos da invenção, "transgênico", "transgene" ou "recombinante" significa, por exemplo, em relação a uma sequência de ácido nucléico, um cassete de expressão, uma construção de gene ou um vetor que compreende a sequência de ácido nucléico ou um organismo transformado com as sequências de ácido nucléico, cassetes ou vetores de expressão de acordo com a invenção.

[0045] Uma planta transgênica para os propósitos da invenção é assim compreendida como significando, conforme acima, que os ácidos nucléicos utilizados no método do invento não estão presentes no, ou são provenientes do genoma de dita planta, ou estão presentes no genoma de dita planta, mas não no seu local natural no genoma de dita planta, sendo possível para os ácidos nucléicos serem expressos de forma heteróloga ou homóloga. No entanto, como mencionado, transgênico também significa que, embora os ácidos nucléicos de acordo com a invenção ou utilizados no método da invenção estejam na sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi alterada em relação à sequência natural, e/ou que as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. Transgênico é de preferência compreendido como significando a expressão dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção em um lócus não natural no genoma, isto é, a expressão homóloga ou heteróloga dos ácidos nucléicos ocorre. As plantas transgênicas preferidas são aqui mencionadas.

[0046] Para o propósito da presente invenção relacionada com genes ortólogos do gene KLUH como aqui descrito anteriormente, podem ser isolados a partir das bases de dados de sequências disponíveis (publicamente). A "identidade de sequência" de duas sequências de nucleotídeos ou aminoácido relacionadas, expressa como uma porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas sequências idealmente alinhadas que possuem resíduos idênticos (x100) dividido pelo número de posições comparadas. Uma lacuna, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos. O alinhamento das duas sequências é executado pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48: 443-453) O alinhamento de sequências assistido por computador acima, pode ser convenientemente executado utilizando o programa de software padrão, tal como GAP que faz parte do Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA) utilizando a matriz de pontuação padrão com uma penalidade de criação de descontinuidade de 50 e uma penalidade de extensão de abertura de 3. As sequências são indicadas como "essencialmente semelhantes" quando tal sequência possui uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 75 %, particularmente pelo menos cerca de 80 %, mais particularmente pelo menos cerca de 85 %, muito particularmente ao redor de 90 %, especialmente ao redor de 95 %, mais especialmente ao redor de 100 %, muito especialmente são idênticas.

[0047] Alternativamente, a pessoa versada na técnica pode isolar os genes ortólogos KLUH da planta através de métodos de hibridação genética. Tais métodos são bem conhecidos pelo biólogo molecular versado (planta).

[0048] O termo "expressão" ou "expressão do gene" significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica. O termo "expressão" ou "expressão do gene" significa, em particular, a transcrição de um gene ou genes ou construção genética no RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem translação subsequente deste último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.

[0049] O termo "introdução" ou "transformação" como aqui referido abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a transferência. O tecido vegetal capaz da subsequente propagação clonal, quer por organogênese quer por embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta inteira regenerada a partir dele. O tecido particular escolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis, e mais adequados, para as espécies particulares sendo transformadas. Os alvos teciduais exemplares incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilo, megagametófitos, tecido caloso, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema apical, brotos axilares e meristemas radiculares), e tecido do meristema induzido (por exemplo, meristema cotilédone e meristema hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser transitória ou estavelmente introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode então ser utilizada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida das pessoas versadas na técnica.

[0050] A transferência dos genes estranhos no genoma de uma planta é chamada de transformação. A transformação de espécies vegetais é agora uma técnica bastante rotineira. Vantajosamente, qualquer um dos vários métodos de transformação pode ser utilizado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais podem ser utilizados para a transformação transitória ou estável. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a captação livre de DNA, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeamento com canhão de partículas, transformação utilizando vírus ou pólen e microprojecão. Os métodos podem ser selecionados do método de cálcio/polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102.); microinjeção em material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeamento de partícula revestida com DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), infecção com vírus (não integrativos) e outros mais. As plantas transgênicas, incluindo as plantas de cultura transgênicas, são preferivelmente produzidas por meio da transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para esta finalidade, é possível, por exemplo, deixar as agrobactérias atuarem sobre as sementes da planta ou inocular o meristema da planta com agrobactérias. Provou-se particularmente vantajoso de acordo com a invenção deixar uma suspensão de agrobactérias transformadas atuar na planta intacta ou pelo menos sobre os primórdios da flor. A planta é subsequentemente cultivada até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de arroz incluem os métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente Europeia EP1198985, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência como se fossem completamente apresentadas. No caso de transformação de milho, o método preferido é como descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência como se fossem completamente apresentadas. Ditos métodos são descritos ainda a título de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucléicos ou a construção a ser expressa são de preferência clonados em um vetor, o qual é adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBIN19 (Bevan et al (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). As agrobactérias transformadas por um tal vetor podem então ser utilizadas de uma maneira conhecida para a transformação de plantas, tal como as plantas utilizadas como um modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana está dentro do escopo da presente invenção não considerada como uma planta de cultivo), ou plantas de cultivo tais como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, através da imersão das folhas esmagadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacteriana e depois o seu cultivo em meios adequados. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida, inter alia, da F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

[0051] Além da transformação de células somáticas, que depois têm de ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células dos meristemas da planta e em particular aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento natural da planta, dando origem a plantas transgênicas. Assim, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e sementes são obtidas das plantas em desenvolvimento das quais uma certa proporção é transformada e, por conseguinte, transgênica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1 -9; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, por meio do qual as sementes transformadas podem igualmente ser obtidas em um ponto posterior no tempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especialmente eficaz é o método de infiltração a vácuo com suas modificações tais como o método de "imersão floral". No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, as plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1 194-1 199], enquanto que no caso do método de "imersão floral" o tecido floral em desenvolvimento é incubado brevemente com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativo [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Uma certa proporção de sementes transgênicas são coletadas em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas das sementes não transgênicas através do crescimento sob as condições seletivas acima descritas. Além disso, a transformação estável de plastídios é vantajoso porque os plastídios são herdados maternalmente é a maioria das culturas reduz ou elimina o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto é geralmente alcançada através de um processo que tem sido apresentado esquematicamente em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Resumidamente as sequências a serem transformadas são clonadas juntamente com um gene marcador selecionável entre as sequências de flanqueamento homólogas no genoma do cloroplasto. Estas sequências de flanqueamento homólogas direcionam a integração específica do sítio na plastoma. A transformação plastidial foi descrita por muitas espécies de plantas diferentes e uma visão geral é dada em Bock (2001 ) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 or Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Outros progressos biotecnológicos foram recentemente relatados na forma de transformantes de plastídio livres de marcadores, que podem ser produzidos por um gene marcador co-integrado transiente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

[0052] As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas por meio de todos os métodos com os quais o especialista versado está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações acima mencionadas por S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Hofgen and Willmitzer.

[0053] Geralmente após a transformação, as células vegetais ou agrupamentos de células são selecionadas quanto a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes de expressão de plantas co-transferidos com o gene de interesse, após o que o material transformado é regenerado em uma planta completa. Para selecionar as plantas transformadas, a matéria vegetal obtida na transformação é, por via de regra, submetida às condições seletivas de modo que as plantas transformadas possam ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira acima descrita podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada através da pulverização. Uma outra possibilidade consiste no cultivo de sementes, se apropriado após a esterilização, em placas de ágar utilizando um agente de seleção adequado, de modo que apenas as sementes transformadas possam se desenvolver nas plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são submetidas a triagem quanto à presença de um marcador selecionável tal como aqueles descritos acima.

[0054] Após a transferência e regeneração do DNA, as plantas putativamente transformadas também podem ser avaliadas, por exemplo, utilizando a análise de Southern, com relação à presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados utilizando a análise de Northern Blot e/ou a análise de Western Blot, ambas as técnicas sendo bem conhecidas das pessoas tendo habilidade prática na técnica.

[0055] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tais como por propagação clonal ou técnicas clássicas de reprodução. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autopolinizada e os transformantes de segunda geração homozigotos (ou T2) selecionados e as plantas T2 ainda podem então ser propagadas através de técnicas clássicas de reprodução. Os organismos transformados gerados podem tomar uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e de células não transformadas; os transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, nas plantas, um rizoma transformado enxertado a um rebento não transformado).

[0056] Os termos "aumentar", "melhorar" ou "intensificar" são intercambiáveis e irão significar no sentido da aplicação pelo menos 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % ou 10 %, de preferência pelo menos 15 % ou 20 %, mais preferivelmente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais de rendimento e/ou crescimento em comparação com o controle das plantas como aqui definido.

[0057] O termo "planta" como aqui utilizado abrange plantas inteiras, antepassados e a descendência das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidos e órgãos, em que cada um dos anteriormente mencionados compreende o gene/ácido nucléico de interesse. O termo "planta" também abrange as células vegetais, culturas em suspensão, tecidos de calos, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos pólen e micrósporos, mais uma vez em que cada um dos anteriormente mencionados compreende o gene/ácido nucléico de interesse.

[0058] As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas particulares incluindo forragem ou leguminosas forrageiras, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos selecionados da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hibrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo silvestre]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outras.

[0059] A escolha de plantas de controle adequadas é uma parte rotineira de uma configuração experimental e pode incluir as plantas do tipo selvagem correspondentes ou as plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle é tipicamente da mesma espécie de planta ou ainda da mesma variedade como a planta a ser avaliada. A planta de controle também pode ser um nulizigoto da planta a ser avaliada. Os nulizigotos são indivíduos que não acertam o transgene através da segregação. Uma "planta de controle" como aqui utilizada refere-se não apenas às plantas inteiras, mas também as partes da planta, incluindo as sementes e as partes da semente.

[0060] O termo "cassete de expressão" refere-se a qualquer sistema de expressão recombinante para o propósito de expressar uma sequência de ácido nucléico da invenção, in vitro ou in vivo, constitutiva ou indutivelmente, em qualquer célula, incluindo, além das células vegetais, as células procariotas, de levedura, fúngicas, de inseto ou de mamífero. O termo inclui os sistemas de expressão lineares e circulares. O termo inclui todos os vetores. Os cassetes podem permanecer epissomais ou integrados no genoma da célula hospedeira. Os cassetes de expressão podem ter a capacidade de auto-replicação ou não (isto é, acionam apenas a expressão transiente em uma célula). O termo inclui os cassetes de expressão recombinantes que contêm apenas os elementos mínimos necessários para a transcrição do ácido nucléico recombinante.

[0061] Os seguintes Exemplos não limitativos descrevem os métodos e meios de acordo com a invenção. A não ser que de outra maneira mencionada nos Exemplos, todas as técnicas são realizadas de acordo com protocolos padrão na técnica. Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar as modalidades da invenção. Aqueles de habilidade na técnica deverão, à luz da presente descrição, observar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda assim obter um resultado igual ou similar sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos enquanto que os mesmos resultados ou similares sejam alcançados. Todos esses substitutos semelhantes e modificações evidentes para aqueles versados na técnica são considerados de estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definidos pelas reivindicações anexas.

Exemplos 1. Construção de um gene quimérico: promotor da GA2 oxidase operativamente ligado a uma sequência de codificação de KLUH

[0062] O promotor da GA2 oxidase do milho derivado do Gene GRMZM2G031724 de Zea mays foi isolado (2046 bp) e fundido com os sítios attB4 e attB1r, e combinado com o vetor de entrada pDONR P4- P1r através da reação de BP (ver a Figura 1).

[0063] Um gene KLUH milho representativo (GRMZM2G167986) também foi isolado. O gene possui um íntron, leva a dois padrões de transcrição no milho. Isolamos a sequência do genoma (1834 pb), incluindo o íntron e a sequência de codificação (CDS). A sequência de KLUH foi fundida com os sítios attB1 e attB2, e combinada com o vetor de entrada pDONR 221 através da reação de BP (ver a Figura 2).

[0064] O vetor de expressão pBb42GW7 é um vetor intermediário MultiSite Gateway designado para monocotiledônea ((Karimi et al., 2013); ver a Figura 3). O promotor da GA2 oxidase operativamente ligado ao gene KLUH foi inserido no vetor de expressão pBb42GW7 por meio da reação de LR entre attR4 e attR2. O gene bar conduzido pelo promotor 35S foi utilizado para selecionar as plantas transgênicas durante o processo de transformação (ver a Figura 4). A sequência do gene quimérico do promotor da GA2 oxidase operativamente ligado ao gene KLUH no vetor de expressão pBb42GW7 é mostrada na Figura 5.

[0065] A transformação do milho foi executada de acordo com (Coussens et al., 2012).

[0066] No total, 10 linhagens T0 independentes foram obtidas após a transformação. Cerca de 35 sementes T1 do retrocruzamento T0 com o tipo silvestre B104 foram semeadas em solo para análise de segregação e fenotipagem. O ensaio de amônio (De Block et al., 1995) foi utilizado para detectar as plantas transgênicas, a pintura da folha foi utilizada para confirmar certas plantas com relação ao escalonamento.

[0067] Quatro linhagens independentes 139_01, 140_01, 140_04, 140_05, que possuem uma inserção de T-DNA e apresentaram um fenótipo, foram selecionadas para outra análise (ver a Tabela 1). Tabela 1: Teste do qui-quadrado e resultados de fenotipagem das plantas T1. * Indica as linhas de lócus isoladas. As plantas de NA não podem ser genotipadas devido à germinação tardia ou crescimento retardado.

2. Análise fenotípica e molecular dos transformantes de milho que compreendem o gene quimérico

[0068] O comprimento da folha das plantas foi medido a partir da parte superior do solo até a ponta da folha. O comprimento da folha e a área foliar da folha 2 foram medidos quando elas estavam totalmente crescidas (dois dias depois a folha 4 aparece). O comprimento da folha 4 foi medido diariamente a partir do aparecimento da folha 4 até que foi totalmente desenvolvida (cerca de 10 dias). A partir dos dados registrados da folha 4, a LER é calculada como a diferença no comprimento da folha em dois momentos sucessivos dividida pelo intervalo de tempo entre eles (em mm/h). A área da folha 4 foi medida quando a folha estava totalmente crescida. A lâmina de folha foi digitalizada e a área foliar foi calculada utilizando Image J. A análise cinemática foi executada como descrito em (Nelissen et al., 2013).

[0069] Entretanto, parte das medidas da folha foi realizada em quatro linhagens selecionadas. Comprimento final da folha e área foliar da folha 2 foram calculados em 140_01 e 139_01 (Tabela 2). Taxa de alongamento foliar e mais os parâmetros detalhados da folha 4 foram calculados em 140_04 140_05 e (Fig 6, Tabela 3, Fig 7, Tabela 4).

2.1 Os parâmetros da folha 2 para as linhagens 140 01 e 139 01 apresentam o comprimento e área da folha

[0070] Para a linhagem 140_01 e 139_01 apenas as medições na folha 2 totalmente desenvolvida foram realizadas até agora. No entanto, elas mostram que a área final da folha e o comprimento são significativamente aumentados nas duas linhagens independentes. Os parâmetros da folha 4 estão sendo atualmente medidos nessas duas linhagens.Tabela 2: Parâmetros foliares da folha 2 de duas linhagens T1 140 01 e 139 01. R representa as plantas transgênicas (resistentes), S representa as plantas não transgênicas (sensíveis).

2.2 Os parâmetros da folha 4 para as linhagens 140 04 e 140 05 mostram aumento da LER, comprimento da folha e tamanho da zona de divisão

[0071] Para as linhagens 140_04 e 140_05, o comprimento da folha 4 foi monitorado enquanto estava crescendo, o que mostra que a taxa de alongamento da folha (LER) foi mais elevada durante o estado estacionário nas plantas transgênicas versus de controle e que a duração do crescimento foi aumentada na linhagem transgênica (Figura 6 e 7).

[0072] Além disso, quando as medições foram executadas em 2 plantas por linhagem, ficou claro que a área foi aumentada em 34 a 45 % (Tabela 3 e 4). Para o comprimento da folha e o tamanho da zona de divisão, foram analisadas mais plantas, permitindo uma análise estatística: o comprimento final foliar da folha 4 foi significativamente aumentado em ambas as linhagens transgênicas (variando de 15,3 a 24,2 %). Para a linhagem 140_04 uma medição preliminar do tamanho da zona de divisão foi determinada, o que mostra que o aumento no comprimento da folha nesta linhagem foi pelo menos em parte devido a um aumento do tamanho da zona de divisão (15,7 %) e assim o número das células em divisão (Tabela 3).Tabela 3: Parâmetros foliares da folha 4 de 140 04. R representa as plantas transgênicas (resistentes), S representa as plantas não transgênicas (sensíveis).

Tabela 4: Parâmetros foliares da folha 4 de 140 05. R representa as plantas transgênicas (resistentes), S representa as plantas não transgênicas (sensíveis).

2.3 A análise QPCR mostra maior expressão de KLUH na zona de crescimento da folha de milho

[0073] A folha 4 foi colhida dois dias após elas apareceram para analisar o nível superexpressão de KLUH sob o promotor da GA2 oxidase. A folha 4 foi cortada em 10 pedaços da base da folha em direção à ponta da folha na escala de 0,5 cm. A partir da análise de qPCR, duas linhagens apresentaram maior fenótipo de folha 2, 140_01 e 139_01, tiveram maior nível de expressão de KLUH em comparação com nenhuma planta transgênica (Fig 8, Fig 9).

2.4 Conclusão

[0074] Dos 10 eventos de transformação, 4 linhagens foram escolhidas em que o T-DNA foi inserido em um único lócus do genoma. Todas as quatro linhagens apresentam melhora do crescimento da folha, resultando em folhas maiores com área de lâmina aumentada. Este aumento da área de lâmina da folha permite capturar mais luz solar, o que pode resultar de ocorrer mais fotossíntese livre. A análise celular de uma linha mostrou que o aumento do comprimento da folha é, pelo menos em parte, devido a um aumento no tamanho da zona de divisão, assim mais células em divisão. Embora não se pretenda limitar a invenção a um mecanismo particular, uma hipótese é que, visto que o KLUH foi mostrado de estimular a divisão celular nas plantas e assim, prolongando a expressão de KLUH dentro da zona de crescimento, resulta na estimulação de divisões adicionais (em um órgão particular da planta).

[0075] As quatro linhagens são agora cultivadas próximas umas das outras e as medições detalhadas das quatro folhas serão executadas. Na mesma experiência experimentamos comparar os níveis de "superexpressão" de KLUH na zona de crescimento. As plantas também são cultivadas até a maturidade para avaliar a altura final da planta, época de florescimento, intervalo de florescimento (ASI), produção de sementes, biomassa e comprimento dos entrenós.

3. Plantas de milho geneticamente transformadas com o gene quimérico GA2ox::KLUH possuem uma zona de divisão estável durante pelo menos um dia extra

[0076] A análise cinemática detalhada ao longo do tempo foi aplicada na folha 4. A partir de várias plantas independentes transformadas, a folha 4 foi colhida todos os dias desde que surgiu a partir da folha 3 até que foi totalmente crescida. O tamanho da zona de divisão foi determinado por coloração com DAPI. Uma interação significativa entre o tamanho da zona de divisão e o tempo de crescimento da folha foi mostrada através da ANOVA, que mostra que o tamanho da zona de divisão em GA2ox::KLUH permaneceu um dia mais longo no tamanho máximo do que o tipo silvestre (ver dia 5 na figura 10).

4. Plantas de milho transgênicas que abrigam o gene quimérico GA2ox::KLUH possuem intervalo de florescimento mais curto do que o tipo silvestre

[0077] O intervalo de florescimento (ASI) mais curto de 3 dias em média foi observado nas plantas de milho transgênicas que abrigam o gene quimérico GA2ox::KLUH em comparação com plantas de milho do tipo selvagem. O ASI é o tempo entre a emissão de pólen e o aparecimento da seda. O ASI mais curto permite que o pólen mais viável entre na seda para facilitar a eficiência de polinização e também está documentado na técnica que pode ajudar as plantas a manter o rendimento sob estresse em estiagem.

5. Plantas transgênicas híbridas de milho que abrigam um gene quimérico GA2ox::KLUH e um gene quimérico UBIL::GA20ox possuem um maior rendimento de biomassa do que as suas origens

[0078] Anteriormente mostrou-se que nas plantas de milho transgênicas que abrigam o gene quimérico UBIL::GA20ox, os níveis elevados de GA afetam principalmente os níveis máximos da taxa de crescimento (LER), mas não o tempo de crescimento (ver Nelissen et al., 2012). Na presente invenção, mostramos agora que as plantas de milho que abrigam o gene quimérico GA20X::KLUH minimamente afetam a taxa de crescimento máxima, mas que a presença desse gene quimérico mantém a taxa de crescimento máxima durante um dia adicional, isto é, mantendo o tamanho da zona de divisão máxima por um período mais longo. A fim de examinar se os dois genes quiméricos sinergicamente influenciam uns aos outros e, se a combinação de ambos os genes quiméricos ainda aumenta o comprimento da folha, fizemos um cruzamento entre as duas linhagens transgênicas.

[0079] A LER de folha 4 do cruzamento resultante de GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox apresentou taxa de crescimento igualmente elevada como UBIL::GA20ox; e no dia 7 do crescimento da folha 4, o cruzamento apresentou a mesma taxa de crescimento como GA2ox::KLUH, quando a taxa de crescimento de UBIL::GA20ox já havia diminuído para um nível mais baixo. Esta combinação de gene quimérico no híbrido leva ao aumento aditivo do comprimento final da folha e da área foliar. Além disso, também medimos o comprimento final da folha e a área foliar da folha 2, que é semelhante àquela que vimos da folha 4. Nenhuma heterose significativa foi observada no fenótipo de folhas maduras de GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox, embora a combinação mostrou maior altura e peso da planta (ver a figura 11 B; tabela 5). Em conclusão, mostramos que a combinação de gene quimérico (GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox) tomou o melhor fenótipo de cada planta de origem, isto é, a altura de UBIL::GA2ox e a maior área foliar de GA2ox::KLUH.Tabela 5. Parâmetros da planta do cruzamento de GA20X::KLUH x UBIL::GA20ox e suas respectivas origens

[0080] Os asteriscos indicam as diferenças significativas para comparar GA2ox::KLUH x UBIL::GA20ox com p < 0,05.

6. Crescimento das plantas transgênicas de milho que abrigam o gene quimérico GA2ox::KLUH sob condições de estresse

[0081] Quando as plantas transgênicas de milho que abrigam o gene quimérico GA2ox::KLUH foram submetidas ao estresse de estiagem suave, não observamos nenhuma diferença significativa no comprimento final da folha (P_valor = 0,95), mas uma maior redução de LER (P_valor = 0,035) e um período de crescimento mais longo (P_valor = 0) foram observados nas plantas resistentes sob seca amena (ver a Fig. 12). 7. Exemplos não limitativos de promotores adequados da GA2 oxidase (derivados de Zea mays) que podem ser utilizados para construir os genes quiméricos da invenção • SEQ ID NO: 4: promoter ZmGA2ox1 (GRMZM2G127757; 2489bp), este promotor é ativo na folha em desenvolvimento • SEQ ID NO: 5: promotor ZmGA2ox2.1 (GRMZM2G078798_T01; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04; 2505 bp); Os três padrões de transcrição GRMZM2G078798_T01; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04 começam na mesma posição. Assim o mesmo promotor pode ser utilizado. Este promoter é ativo nas folhas em desenvolvimento. • SEQ ID NO: 6: promotor ZmGA2ox2.1 (GRMZM2G078798_T03; 2404bp); GRMZM2G078798_T03 começa mais tarde no genoma do que as três transcrições anteriores (Três padrões de transcrição GRMZM2G078798 T01 ; GRMZM2G078798_T02; GRMZM2G078798_T04). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento. • SEQ ID NO: 7: promoter ZmGA2ox2.2 (GRMZM2G176963_T01 ; 2500bp). Este promotor é ativo no sabugo de milho. • SEQ ID NO: 8: promotor ZmGA2ox3.1 (GRMZM2G022679_T01 ; 2494bp). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento. • SEQ ID NO: 9: promotor ZmGA2ox3.2 (GRMZM2G031724; 2046bp). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento e foi utilizado no exemplo 1. • SEQ ID NO: 10: promotor ZmGA2ox4 (GRMZM2G427618_T01 ; 2120bp). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento. • SEQ ID NO: 11: promotor ZmGA2ox6.2 (GRMZM2G153359_T01 ; 2467bp). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento. • SEQ ID. NO. 12: promotor ZmGA2ox7.1 (GRMZM2G051619_T01 ; 2456bp). Este promotor é ativo nas folhas em desenvolvimento e no embrião. • SEQ ID. NO 13: promotor ZmGA2ox7.2 (GRMZM2G152354_T01 ; 2500bp). Este promotor é ativo no sabugo. • SEQ ID. NO 14: promotor ZmGA2ox7.3 (GRMZM2G031432_T01 ; 2472bp). Este promoter é ativo nas folhas e na SAM. 8. Exemplos não limitativos de genes KLUH ortólogos que podem ser utilizados para construir os genes quiméricos da invenção • SEQ ID NO 15: >CYP78A5 (AtKLUH) AT1 G13710 • SEQ ID NO 16: >CYP78A1 (ZmKLUH) GRMZM2G167986 • SEQ ID NO 17: >ZmKLUH-LIKE - GRMZM2G054603 • SEQ ID NO 18: >CYP78A1 1 (OsPLAI) Os10g0403000 • SEQ ID NO 19: >CYP78A7 - AT5G09970 • SEQ ID NO 20: >CYP78A27 (PpKLUHI) PP00504G00010.1 • SEQ ID NO 21: >CYP78A28 (PpKLUH2) PP00134G00010.1 Referências Anastasiou, E., Kenz, S., Gerstung, M., MacLean, D., Timmer, J., Fleck, C, and Lenhard, M. (2007). Control of Plant Organ Size by KLUH/CYP78A5-Dependent Intercellular Signaling. Developmental Cell 13, 843-856. Coussens, G., Aesaert, S., Verelst, W., Demeulenaere, M., De Buck, S., Njuguna, E., Inze, D., and Van Lijsebettens, M. (2012). Brachypodium distachyon promoters as efficient building blocks for transgenic research in maize. Journal of Experimental Botany 63, 42634273. De Block, M., Sonville, A., and Debrouwer, D. (1995). The selection mechanism of phosphinothricin is influenced by the metabolic status of the tissue. Planta 197, 619-626. Karimi, M., Inzé, D., Van Lijsebettens, M., and Hilson, P. (2013). Gateway vectors for transformation of cereals. Trends in Plant Science 18, 1-4. Kazama, T., Ichihashi, Y., Murata, S., and Tsukaya, H. (2010). The Mechanism of Cell Cycle Arrest Front Progression Explained by a KLUH/CYP78A5-dependent Mobile Growth Factor in Developing Leaves of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology 51, 1046-1054. Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., and Beemster, G.S. (2013). Kinematic Analysis of Cell Division in Leaves of Mono- and Dicotyledonous Species: A Basis for Understanding Growth and Developing Refined Molecular Sampling Strategies. In Plant Organogenesis, I. De Smet, ed (Humana Press), pp. 247-264. Nelissen, H., Rymen, B., Jikumaru, Y., Demuynck, K., Van Lijsebettens, M., Kamiya, Y., Inzé, D., and Beemster, Gerrit T.S. (2012). A Local Maximum in Gibberellin Levels Regulates Maize Leaf Growth by Spatial Control of Cell Division. Current Biology 22, 1183-1187.

Claims (7)

1. Construção de gene quimérico, caracterizada pelo fato de que compreende os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: a) a região promotora de um gene da GA2 oxidase da planta que está ativo na zona de crescimento da folha da planta monocotiledônea e na qual a sequência é selecionada de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 ou 14, b) uma região de DNA selecionada de SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 que codifica uma proteína CYP78A5 vegetal e c) uma região da extremidade 3' compreendendo sinais de término da transcrição e poliadenilação que funcionam nas células de uma planta monocotiledônea.

2. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 1.

3. Uso de um gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou um vetor recombinante como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para aumentar o rendimento em 15% de uma planta monocotiledônea quando comparada a uma planta monocotiledônea do tipo selvagem correspondente.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as plantas são culturas.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as culturas são cereais.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as culturas são gramíneas.

7. Método para a produção de uma planta monocotiledônea com 15% maior rendimento em comparação com uma planta monocotiledônea do tipo selvagem correspondente, caracterizado pelo fato de que compreende a transformação de uma planta monocotiledônea com um gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou um vetor recombinante como definido na reivindicação 2 e seleção de uma planta monocotiledônea com uma expressão estável do dito gene quimérico.

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