CN103958685A - 具有增强的产量相关性状的植物和产生该植物的方法 - Google Patents

Abstract

提供了通过调节编码PRR样(伪应答调节子)多肽的核酸在植物中的表达增强植物中产量相关性状的方法。也提供了用于实施本发明的具有相对于对照植物增强的产量相关性状的、具有受调节的编码PRR样多肽的核酸，迄今未知的PRR样编码核酸的表达的植物，和包含其的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和产生该植物的方法

背景技术

本发明一般地涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码PRR样(伪应答调节子样)多肽的核酸在植物中的表达而增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码PRR样多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了用于本发明方法中的构建体。

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是特别重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。

对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。

又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等,Planta218,1-14,2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。

作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。

伪应答调节子(PRR)共享保守结构域，接收子样结构域(RLD)，以及另一个结构域CONSTANS/CONSTANS样/TOC1(CCT)结构域。RLD与应答调节子的接受子结构域的组氨酸至天冬氨酸(His-Asp)的磷酸中继(phosphorelay)相似，一种在从细菌到动物以外的真核细胞的生物中的多功能信号转导系统。

在双子叶植物拟南芥的模型中，这样的组分基因的代表性组是伪应答调节子(PRR)基因家族，所述基因家族包含五个成员基因，TOC1(也称为PRR1)/PRR3/PRR5/PRR7/PRR9，它们在拟南芥节律性网络的联锁循环中的多个节点处充当调控角色。

取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。

现在已经发现，可以通过调节植物中编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达而改善植物中多种产量相关性状。

发明详述

本发明示出调节植物中编码PRR样多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

根据第一个实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码PRR样多肽的核酸的表达并任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供了用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括调节所述植物中如本文定义的编码PRR样多肽的核酸的表达并任选地选择具有增强的产量相关性状的植物的步骤。

用于调节，优选地增加，编码PRR样多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码PRR样多肽的核酸。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何参考指的是如本文定义的PRR样多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何参考指的是能够编码此类PRR样多肽的核酸。待引入到植物中(并因此在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将要描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也命名为“PRR样核酸”或“PRR样基因”。

如本文定义的“PRR样多肽”是指包含对应于PFAM登录号PF00072的InterPro登录号IPR001789信号转导应答调节子，接收子结构域，和/或对应于PFAM登录号PF06203的Interpro登录号IPR010402CCT结构域的任意多肽。

根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物提高植物中如本文提供的产量相关性状的方法，所述方法包括调节在植物中如本文定义的编码PRR样多肽的核酸的表达。

使用MEME算法(Bailey和Elkan，Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)得到基序1至3。在MEME基序内的每一个位置上，显示了残基以高于0.2的频率存在于查询序列组中。方括号内的残基代表了备选。

在一个实施方案中，如本文所用的PRR样多肽包含基序1、2或3中的至少一个。

基序1：(SEQ ID NO:43):

MS[ST]NDSMSMVFKCLSKGAVDFLVKP[LI]RKNELKNLWQH[VI]WRRCHSSSGS[GE]S

基序2：(SEQ ID NO:44):

L[LV][VD][EP][NP]D[DS][SCT][TC][RA][QH]V[VI][SH][AP]L[LS][RE][KI]C[CS][YN][EK][VW][IL]P[AT][EA]N[GK][SLR][HN]A[WK][RKQ]Y[LK]E[ND][LK][QD][NE][NS][IM][DG][LR][VY]LT[EI]

基序3：(SEQ ID NO:45):

HDDEENDD[DG]DDDDFSVGLNARDGSDNGSGTQSSWTKRAVEIDSPQP[MI]SPD

在另外一个实施例中，PRR样多肽以递增优选顺序包含如上所定义的至少2个或全部3个基序。

额外或备选地，PRR样蛋白质与SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性，条件是同源性蛋白质包含上文概述的保守基序中的任何一个或多个。使用全局比对算法，如程序GAP(GCGWisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地使用默认参数并且优选地使用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。在一个实施方案中，通过对比多肽序列与SEQID NO:2序列的全长确定序列同一性水平。

在另外一个实施方案中，通过对比SEQ ID NO:2中的一个或多个保守结构域或基序与其他PRR样多肽中的相对应的保守结构域或基序确定序列同一性水平。当仅考虑保守结构域或基序时，与整体序列同一性相比，所述序列同一性通常会更高。优选地，PRR样多肽中的基序与SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45表示的基序(基序1至3)中任何一个或多个以递增优选顺序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。换言之，在另一个实施方案中，提供了用于增强植物中的产量相关性状的方法，其中所述PRR样多肽包含与SEQ ID NO:2中的从氨基酸161开始多至氨基酸211的保守结构域和/或从氨基酸84开始多至氨基酸133的保守结构域和/或从氨基酸237开始多至氨基酸286的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域(或基序)。

在本文“定义”部分中定义了术语“结构域”、“标签”和“基序”。

当根据实施例7和9中所概括的本发明的方法在稻中表达编码PRR样多肽的核酸时，产生了具有增加的产量相关性状，特别是地上生物量、根生物量和种子产量的植物，所述种子产量包括种子总重量、种子数量、每圆锥花序的充实率和花数。当本发明的此类核酸序列在活体植物细胞中被转录和转译时，编码PRR样多肽的核酸序列的另一功能是赋予PRR样蛋白质的合成信息，所述信息增加如本文所描述的产量或产量相关性状。

通过用编码SEQ ID NO:2的多肽序列的SEQ ID NO:1表示的核酸序列转化植物阐述了本发明。然而，本发明的实施不限于这些序列；使用如本文定义的任何PRR样编码核酸或PRR样多肽可以有利地实施本发明的方法。如本文所用的术语“PRR样”或“PRR样多肽”也意图包括如下文定义的SEQ ID NO:2的同源物。

在本文实施例章节的表A中给出编码PRR样多肽的核酸的实例。此类核酸可用于实施本发明的方法。在实施例章节的表A中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2表示的PRR样多肽的直向同源物和旁系同源物的序列实例，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过进行如定义部分中所述的称作交互性blast检索容易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，第二次BLAST(反向BLAST)将针对甘蔗序列。

本发明还提供迄今未知的PRR样编码核酸和PRR样多肽，所述核酸和多肽用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状。

因此，根据本发明的其他实施方案，提供了选自以下的分离的核酸分子：

(i)由SEQ ID NO:39表示的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:39表示的核酸的互补核酸；

(iii)编码PRR样多肽的核酸，所述PRR样多肽与SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外或备选地所述PRR样多肽包含与SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45中给出的基序中的任何一个或多个以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的一个或多个基序，并且还优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。

(iv)核酸分子，其在高度严格杂交条件下与(i)至(iii)的核酸分子杂交，并优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状。

根据本发明的其他实施方案，还提供了选自以下的分离的多肽：

(i)SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外或备选地包含与SEQ ID43至SEQ ID NO:45中给出的基序中的任何一个或多个以递增优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的一个或多个基序，并且还优选地赋予相对于对照植物的增强的产量相关性状；

(iii)上文(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

也可以将核酸变体用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括编码在实施例章节的表A中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中还有用的是这样的核酸，其编码在实施例章节的表A中所给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与它们所来源的未经修饰的蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子使用或其中去除了miRNA靶位点的变体。

在实施本发明的方法中有用的其他核酸变体包括编码PRR样多肽的核酸的部分，与编码PRR样多肽的核酸杂交的核酸，编码PRR样多肽的核酸的剪接变体，编码PRR样多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码PRR样多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。

编码PRR样多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不只依赖于全长核酸序列的用途。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入并且表达在实施例章节表A中给出的任一个核酸序列的部分，或编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

核酸的部分可以例如通过对所述核酸进行一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，以，例如产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

在本发明方法中有用的部分编码了如本文定义的PRR样多肽或至少其部分，并且与实施例章节的表A中所给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例章节的表A中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例章节表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分具有至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300个连续核苷酸的长度，所述连续核苷酸是在实施例章节的表A中给出的任一核酸序列，或是编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO:1的核酸的部分。优选地，该部分编码了氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列包含基序1至3(SEQ ID NO:43至45)中的中的任一项，和/或与SEQ ID NO:2至少具有15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选地在严格条件下，与如本文所定义的编码PRR样多肽的核酸，或与如本文所定义的部分杂交的核酸。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入并且表达核酸，所述核酸能够与编码实施例章节的表A中给出的任一蛋白质的核酸的互补核酸杂交，或与编码在实施例章节的表A中给出的任一蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的互补核酸杂交。

在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的PRR样多肽，所述多肽与实施例章节的表A中给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物学活性。优选地，杂交序列能够与编码实施例章节的表A中给出的任一蛋白质的核酸的互补核酸杂交，或与这些序列中任一个的部分(如本文定义的部分)杂交，或该杂交序列能够与编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补核酸杂交。最优选地，该杂交序列能够与编码如SEQ ID NO:2表示的多肽的核酸的互补核酸或与其部分杂交。在一个实施方案中，杂交调节为中等严格，优选地高度严格，如本文所定义的。

优选地，该杂交序列编码了具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含基序1至3(SEQ ID NO:43至45)中的任一项，和/或所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少具有15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在另外一个实施方案中，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入并且表达编码实施例章节的表A中给出的任一蛋白质的核酸的剪接变体，或编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是由SEQ ID NO:1表示的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列包含基序1至3(SEQ ID NO:43至45)中的任一项，和/或与SEQ ID NO:2至少具有15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在另一实施例中，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入并且表达编码实施例章节的表A中给出的任一蛋白质的核酸的等位变体，或包括在植物中引入并且表达编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。

用于本发明方法中的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO:2的PRR样多肽以及在实施例章节的表A中描述的任一氨基酸序列具有基本上相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中涵盖这些天然的等位基因的用途。优选地，等位变体是SEQ ID NO:1的等位变体，或是编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由等位变体编码的氨基酸序列包含基序1至基序3(SEQ ID NO:43至45)中的任一项，和/或与SEQ ID NO:2至少具有15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在另一个实施方案中，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入并且表达编码实施例章节的表A中给出的任一个蛋白质的核酸的变体，或包括在植物中引入并且表达编码在实施例章节的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，所述变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含基序1至基序3(SEQ ID NO:43至45)中的任一项，和/或与SEQ ID NO:2至少具有15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

此外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。与SEQ ID NO:2的序列相差一个或几个氨基酸(如本文定义的替换、插入和/或缺失)的PRR样多肽可同等用于提高本方法的植物和本发明的构建体和植物中的产量。

编码PRR样多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。可以通过有意的人类操作，从其在组合物和/或遗传环境中的天然形式修饰核酸。优选地，PRR样多肽编码核酸来自植物，更优选地来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Poaceae)，最优选地，该核酸来自甘蔗(Saccharum officinarum)。

在另一个实施例中，本发明延伸到包含在本发明的方法中的有用的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸由于重组方法存在于染色体DNA中，但不在其天然遗传环境中。在另一实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的地上生物量、增加的根生物量和/或者增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本发明因此提供了用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状，更特别是产量，特别是地上生物量、根生物量和植物种子产量的方法，所述方法包括调节植物中如本文所定义的编码PRR样多肽的核酸的表达。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物的生长速率的方法，所述方法包括调节如本文定义的编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物的增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物中的产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施给予在干旱条件下生长的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物的增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在干旱条件下生长的植物中的产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下，特别是缺氮条件下生长的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物的增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在养分缺乏条件下生长的植物中的产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施给予在盐胁迫条件下生长的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物的增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加在盐胁迫条件下生长的植物中的产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达。

本发明也提供遗传构建体和载体以促进编码PRR样多肽的核酸在植物中的引入和/或表达。所述遗传构建体可以被插入载体中，所述载体可以商购，适于转化至植物或宿主细胞中并且适于在经转化的细胞中表达目的基因。本发明也提供如本文中定义的遗传构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)如上文所定义的编码PRR样多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码PRR样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。

本发明的遗传构建体可能包含于宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。植物或宿主细胞用诸如载体或包含任何上述核酸的表达盒的构建体转化。因此本发明还提供了用如上所描述的构建体转化的植物或宿主细胞。特别地，本发明提供了用如上文所述的构建体转化的植物，所述植物具有如本文所述的增加的产量相关性状。

在一个实施方案中，当已经被引入所述植物时，本发明的遗传构建体赋予植物增加的产量或产量相关性状，所述植物表达包含在遗传构建体中的编码PRR样的核酸。在另一个实施方案中，本发明的遗传构建体赋予其中已经引入了构建体的包含植物细胞的植物增加的产量或产量相关性状，所述植物细胞表达包含在遗传构建体中的编码PRR样的核酸。

技术人员非常了解为了成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞必须存在于遗传构建体上的遗传元件。目的序列与一种或多种控制序列(至少与启动子)有效连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的启动子，均可以用来驱动核酸序列表达，但优选地，启动子是植物来源的。在方法中特别有用的是组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

组成型启动子优选地为中等强度的遍在组成型启动子。更优选地，其为植物来源的启动子，例如植物染色体起点的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(即功能等同启动子)，更优选，启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选地，组成型启动子由与SEQ ID NO:46基本上相似的核酸序列表示，最优选地，组成型启动子如SEQ ID NO:46所表示。对于组成型启动子的其他实例，见本文的“定义”部分。

应该清楚的是，本发明的适用性不限于SEQ ID NO：1所表示的PRR样多肽编码核酸，当PRR样的多肽编码核酸表达是由组成型启动子驱动时，本发明适用范围也不限于稻GOS2启动子。

任选地，可以在被引入到植物中的构建体中使用一个或多个终止子序列。本领域技术人员将知道可以适用于实施本发明的终止子序列。优选地，构建体包含表达盒，所述表达盒包含与编码PRR样多肽的核酸有效连接的、与SEQ ID NO:46基本上相似的GOS2启动子。更优选地，构建体还包含连接到PRR样编码序列3’末端的玉米醇溶蛋白终止子(t-zein)。此外，在被引入到植物中的构建体中可以存在编码可可选择的标记物物的一个或多个序列。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中详实记录了用于增加核酸或者基因的表达，或基因产物的方法并且在定义章节中提供了实例。

如上文所提及，用于调节编码PRR样多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入并且表达编码PRR样多肽的核酸；然而使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标记、TILLING、同源重组，也可以实现实施该方法的效果，即增强产量相关性状。在定义章节中提供了这些技术的描述。

本发明也提供了用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括在植物中引入并表达本文所定义的编码PRR样多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的生物量和种子产量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入并且表达PRR样多肽编码核酸或包含PRR样多肽编码核酸的遗传构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

(i)的核酸可以是如本文所定义的能够编码PRR样多肽的任意核酸。

在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞可以包括或不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的特定实施方案中，通过根据本发明的方法转化的植物细胞可再生为经转化的植物。在本发明的另一个实施方案中，通过根据本发明的方法转化的植物细胞不可再生为经转化的植物，即，使用本领域中已知的细胞培养技术不能够再生为植物的细胞。尽管植物细胞通常具有全能性的特征，某些植物细胞不能被用于从所述细胞再生或繁殖完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞就是这样的细胞。在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式维持自己的植物细胞。

可以将核酸直接引入到植物细胞中或引入到植物自身中(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分中)。根据本发明的优选特征，优选地通过转化将核酸引入到植物或植物细胞中。术语“转化”在本文的“定义”章节中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。

本发明涵盖可通过根据本发明的方法获得的植物或其部分，包括种子。植物或植物部分或植物细胞包含如上文所定义的编码PRR样多肽的核酸转基因，优选地在诸如表达盒的遗传构建体中。本发明进一步扩展至涵盖已经通过任一前述方法产生的原代转化的或转染的细胞、组织、器官或整个植物的子代，唯一要求是该子代显示出与在根据本发明的方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

在另一个实施例中，本发明扩展至包含本发明的表达盒、本发明的遗传构建体，或如上所描述的编码PRR样和/或PRR样多肽的核酸的种子。

本发明也包括宿主细胞，所述宿主细胞含有如上文所定义的编码PRR样多肽的分离的核酸。在一个实施方案中，根据本发明宿主细胞是植物细胞、酵母、真菌和细菌。原则上，根据本发明方法中所用的核酸、构建体、表达盒或载体的宿主植物有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。在特定的实施方案中，本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。

本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其是如本文定义的任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于超家族植物界，特别是单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、三叶草、大豆、甜菜(beet)、甜菜(sugarbeet)、向日葵、卡诺拉、苜蓿、油菜籽、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一实施方案，植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、单粒小麦、画眉草(teff)、蜀黍和燕麦。在特定的实施方案中，用于本发明方法的植物选自由玉米、小麦、稻、大豆、棉花、包括卡诺拉的油菜、甘蔗、甜菜和苜蓿组成的组。本发明方法有利地比已知的方法更有效，因为相对于用于可比较方法中的对照植物，本发明的植物具有增加的产量和/或对环境胁迫的耐受。

本发明也扩展至植物的可收获部分诸如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码PRR样多肽的重组核酸。此外，本发明还涉及源自或产生自，优选直接源自或产生自此类植物的可收获部分的产品，如干燥沉淀物、粉或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括制造产品的方法，方法包括a)种植本发明的植物b)从或通过本发明植物或其植物部分，包括种子生产所述的产品。在另一个实施方案中，方法包括步骤a)种植本发明的植物b)从植物中移除如本文所述的可收获的部分，和c)从或用根据本发的植物的可收获部分生产所述的产品。

在一个实施方案中，通过本发明方法生产的产品是植物产品，诸如但不限于食品、饲料、食品补充剂、饲料补充剂、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，用于生产的方法被用于制备农业产品，诸如但不限于，植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪、油、聚合物、维他命等。

在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽包含于农业产品中。在特定实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可用作产品标记物，例如其中农业产品是通过本发明方法生产的。此类标记物可用于鉴定通过优势工艺生产的产品，所述优势工艺由于工艺中采用了提高的质量的植物材料和可收获植物部分，导致大大提高的工艺效率和提高的产品的质量。此类标记物可被许多本领域熟知的方法检测，诸如但不限于基于PCR的核酸检测法，或基于抗体的蛋白质检测法。

本发明也涵盖如本文所述的编码PRR样多肽的核酸和这些PRR样多肽在增强植物中的任意前述产量相关性状中的用途。例如，如本文所述的编码PRR样多肽的核酸，或PRR样多肽本身可用于育种计划中，所述育种计划中鉴定可以与PRR样多肽编码基因遗传地连接的DNA标记物。核酸/基因，或者PRR样多肽本身，可以用来限定分子标记物。然后，此DNA或蛋白质标记物可以用于育种计划中以选择具有在本发明方法中如本文所定义的增强的产量相关性状的植物。此外，PRR样多肽编码核酸/基因的等位变体可用于标记物辅助的育种计划中。编码PRR样多肽的核酸也可以用作用于基因的遗传和物理作图的探针，所述核酸是所述基因的部分并且用作与这些基因连锁的性状的标记物。此类信息可用于植物育种中以开发具有所希望表型的品系。

此外，本发明还涉及以下具体实施方式：

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节编码PRR样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述PRR样多肽包含对应于PFAM登录号PF00072的Interpro登录号IPR001789信号转导应答子，接受子结构域，和/或对应于PFAM登录号PF06203的Interpro登录号IPR010402CCT结构域。

2.根据实施方案1的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入并表达编码所述PRR样多肽的所述核酸实现。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，并且优选地包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。

4.根据实施方案1至3中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

5.根据实施方案1至3中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。

6.根据实施方案1至5中任一项的方法，其中所述PRR样多肽包含下列基序中的一种或多种：

(i)由SEQ ID NO:43表示的基序1；

(ii)由SEQ ID NO:44表示的基序2；

(iii)由SEQ ID NO:45表示的基序3

7.根据实施方案1至6中任一项的方法，其中编码PRR样多肽的所述核酸是植物来源，优选来自双子叶植物，还优选地来自禾本科，更优选地来自甘蔗属，最优选地来自甘蔗。

8.根据实施方案1至7中任一项的方法，其中所述编码PRR样多肽的核酸编码表A中列出的任一多肽或是此类核酸的一部分，或能够与此类核酸杂交的核酸。

9.根据实施方案1至8中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。

10.根据实施方案1至9中任一项的方法，其中所述核酸编码由SEQID NO:2表示的多肽。

11.根据实施方案1至10中任一项的方法，其中所述核酸与植物源的组成型启动子，优选与植物源的中等强度的组成型启动子，更优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

12.可通过根据实施方案1至11中任一项的方法获得的植物、或其部分、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如实施方案1和6至10中任一项中定义的编码PRR样多肽的重组核酸。

13.构建体，其包含：

(i)如实施方案1和6至10任一项中定义的编码PRR样的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

14.根据实施方案13的构建体，其中所述控制序列中的一种是植物源的组成型启动子，优选是植物源的中等强度的组成型启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。

15.根据实施方案13或14的构建体在制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

16.用根据实施方案13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

17.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中引入并表达如实施方案1和6至10中任一项中定义的编码PRR样多肽的核酸；并且

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

18.相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物来自于如实施方案1和6至10任一项中定义的编码PRR样多肽的核酸的受调节的表达。

19.根据实施方案12、16或18的转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、甜菜(sugarbeet)或苜蓿；或单子叶植物，如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。

20.根据实施方案19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为根生物量和/或种子。

21.产品，其源自根据实施方案19的植物和/或源自根据实施方案20的植物的可收获部分。

22.如实施方案1和6至10中任一项中定义的编码PRR样多肽的核酸用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状，优选地用于相对于对照植物增加产量，并更优选用于增加种子产量和/或用于增加植物中生物量的用途。

23.制造产品的方法，包括种植根据实施方案12、16、19或20的植物及从或通过所述植物、植物部分包括种子生产所述产品的步骤。

24.从根据实施方案19的植物和/或从根据实施方案20的植物的可收获部分生产的产品。

25.包含于植物细胞中的根据实施方案13或14的构建体。

26.包含根据实施方案13至14的构建体的重组染色体DNA。

27.根据实施方案1至11中任一项的方法，其中所述多肽由核酸分子编码，所述核酸分子包含选自于下列组成的组的核酸分子：

(i)由SEQ ID NO:1表示的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1表示的核酸的互补核酸；

(iii)如SEQ ID NO:1表示的编码多肽的核酸，并且还优选地赋予相对于对照植物的增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1的核酸酸序列以递增优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物的增强的产量相关性状；

(v)核酸分子，其在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子的互补核酸杂交且优选地赋予相对于对照植物的增强的产量相关性状。

(vi)核酸，其编码与SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的所述多肽，并且优选地赋予相对于对照植物的增强的产量相关性状；或

(vii)包含上述(i)至(vi)特征的任意组合的核酸。

定义

将在本说明书中自始至终使用以下定义。本申请的章节题目和标题仅为方便和参考目的，且不应当以任何方式影响本申请的意思或解释。本申请范围内使用的技术术语和表达法将被赋予的含义一般也适用于植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种相关领域中。下列所有术语的定义适用于本申请的全部内容。与属性或值相联的术语“基本上”，“大约”，“约”等，也特定地分别准确地定义属性和准确地定义值。在本文中给定数值或范围的术语“大约”特定地指在给定的数值或范围的20％内、10％内，或5％内的数值或范围。

肽/蛋白质

术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的任意长度的聚合形式的氨基酸。除非本文另有提及。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。

直向同源物和旁系同源物是同源物的两种不同的形式，并且包含用来描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物是起源于先祖基因复制的相同物种内的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也源自共同的祖先基因。

“缺失”指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。

“插入”指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比N端融合或C端融合更小，约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。

“替换”指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束并且可以为1到10个氨基酸。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。

表1：保守性氨基酸替换的实例

残基保守性替换	残基	保守性替换
			Ala Ser	Leu	Ile；Val
Arg Lys	Lys	Arg；Gln
			Asn Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
			Gln Asn	Ser	Thr；Gly
Cys Ser	Thr	Ser；Val
			Glu Asp	Trp	Tyr
Gly Pro	Tyr	Trp；Phe
			His Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile Leu，Val

氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法(见Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989和每年更新版本))。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)的融合物。

结构域、基序/共有序列/标签(signature)

术语“结构域”指沿着进化上相关的蛋白质的序列比对上的特别位置处的保守的氨基酸组。尽管在其他位置处的氨基酸在同源物之间可以不同，在特别位置处高度保守的氨基酸提示很可能在蛋白质的结构、稳定性或功能中必要的氨基酸。由在蛋白质同源物家族的比对的序列中其高保守度所鉴定的，它们可以用作鉴定物用来确定任何目标多肽是否属于先前鉴定的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864；Letunic等人，(2002)NucleicAcids Res30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology).Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编著，第53-61页,AAAI Press,Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002))。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:The proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis,Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等人,(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法容易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定相似性和同一性的总体百分数(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matricesusing protein or DNA sequences)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。

交互式BLAST

通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例章节的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选的结果或非筛选的结果的全长序列随后针对来自衍生查询序列的生物中的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后的反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。

高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。

Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于至多0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：

1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog₁₀[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]–500x[L^c]^-1–0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子

T_m＝79.8℃+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交分子：

对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln)

对于20–35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)

a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01–0.4M范围内是精确的。

b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。

c L＝双链体的长度(以碱基对计)。

d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的实例包括在55℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。

剪接变体

如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性区段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6:25)。

等位变体

“等位基因”或“等位变体”是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。

内源基因

本文中对“内源”基因的任何称谓不仅指如植物中以其天然形式(即不存在任何人类干预情况下)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后被(再)引入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达的明显降低和/或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

能在宿主细胞内复制且用于将目标DNA序列引入宿主细胞或宿主生物体的人工DNA(诸如但不限于质粒或病毒)。本文所述的宿主细胞可以是选自任何细菌细胞的细胞，例如大肠杆菌或土壤杆菌属物种细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞。本领域技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含目标序列的宿主细胞必须存在于遗传构建体上的遗传元件。目标序列与如本文所述的一种或多种控制序列(至少一个启动子)有效连接。额外的调控元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义章节中描述，内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包括用于特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是遗传构建体需要作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测如本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记物基因(或报道基因)是有利的。因此，所述遗传构建体可以任选地包含可选择的标记物基因。在本文的“定义”章节中更详细地描述可选择的标记物。一旦不再需要所述标记物基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记物移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。

调控元件/控制序列/启动子

术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从经典的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调控序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调控元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典的原核基因的转录调控序列，在此情况下它可以包括–35盒序列和/或–10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3'调节区如终止子或远离ORF的其它3'调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”意指以下的启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其在全部情况以低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平表达。

有效连接

如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子基本上在生物的所有组织或细胞内有活性。

发育调节性启动子

发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子在应答化学品(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

下表2b中列出根特异性启动子的实例。

表2b：根特异性启动子的实例

“种子特异性启动子”主要在种子组织中有转录活性，但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。下表2c至2f中显示种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2,113-125,2004)中给出，所述文献的公开内容通过引用方式如完整给出那样并入本文。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子的实例

表2e：表2e：胚特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8117-8122,1996
KNOX	Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol., 339:39:257-71, 1999
		PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
		PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

表2f：糊粉特异性启动子的实例

如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。

下表2g中显示可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。下表2h中显示可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其它植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。

可选择的标记物(基因)/报道基因

“可选择的标记物”、“可选择的标记物基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记物基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记物可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记物。可选择的标记物基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或使潮霉素磷酸化的hpt，或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记物如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记物基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记物。技术人员熟悉此类标记物。取决于生物和选择方法，优选不同的标记物。

已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码可选择的标记物(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记物可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码可选择的标记物的核酸分子可以引入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的可选择的标记物的细胞存活而其它细胞死亡)。

因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记物基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记物基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记物基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌属(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼为T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记物基因随后可以通过进行杂交而从经转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记物基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记物基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记物基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记物基因被去除。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如，核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、遗传构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中

a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或

b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

a)和b)

不处于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法修饰，修饰有可能采用例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。

为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中所使用的核酸不存在于所述植物的基因组中或不源于其中，或存在所述植物的基因组中，但是不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调控序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

应该指出，在本发明的上下文下，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别视为同义于“重组核酸”或“重组多肽”，并且指不位于其天然遗传环境和/或已经通过重组方法修饰过的核酸或多肽。

调节

相对于表达或基因表达，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比，表达水平因所述的基因表达而改变，该表达水平可以增加或减少。原初的、未调节的表达可以是任何类型的结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA表达，伴随后续翻译。为了本发明的目的，原初的、未调节的表达也可以是不存在任何表达。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，其导致增加的植物产量和/或增加的植物生长。表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或遗传构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

增加的表达/过表达

如本文中所用的术语“增加的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。为了本发明的目的，原初的、野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。

在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或替换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。

若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其它真核基因。

内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5'末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。

减少的表达

本文中对“减少的表达”或“降低或基本消除”表达的任何称谓意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％、或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。

为了降低或基本消除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中引入并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。

在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含控制序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其它一般细节，见例如Grierson等(1998)WO98/53083；Waterhouse等(1999)WO99/53050)。

本发明方法的实施不依赖在植物中引入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。

一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向引入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中引入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝引入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。

RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。"反义"核酸序列包含与编码蛋白质的"有义"核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区"指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区"指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5'和3'非翻译区)。

反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和'加帽'及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修饰是本领域众所周知的。

这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中引入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而引入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。

根据又一个方面，反义核酸序列是a-异头核酸序列。a-异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。

基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其它人描述的策略而实现。

当在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。

另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。

其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。

备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。

人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。

通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等人,Dev.Cell8,517–527,2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等人,Plant Cell18,1121-1133,2006)。

为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待引入的核酸序列起源于与该核酸序列将要引入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待引入的核酸之间存在实质性的同源性就足够了。

上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会容易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。

转化

如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而不同。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。备选地，不能再生为植物的植物细胞可以选作宿主细胞，即，所产生的经转化的植物细胞不具备再生为(整个)植物的能力。

外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735–743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer,在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。

除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet208：1-9；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同可选择的标记物基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization ofplastid transformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记物质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记物基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。

可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出遗传修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。备选地，遗传修饰的植物细胞不可再生为整个植物。

通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选可选择的标记物(如上文所述的可选择的标记物)的存在。

在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。

可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如，在植物中，嫁接至未转化接穗的转化砧木)。

T-DNA激活标签化

T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所引入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

TILLING

术语“TILLING”是“靶向诱导的基因组局部损伤(Targeting InducedLocal Lesions In Genomes)”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)于Methods inArabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编辑，World Scientific Publishing Co，第16–82页；Feldmann等，(1994)于Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)进行了描述，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等人,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。

产量相关性状

“产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可包含以下特征非限制性名单中的一项或多项：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期萌发势、绿度指数、生长速率、农艺学性状，例如水下耐受性(其导致稻的产量)、水使用效率(WUE)和氮使用效率(NUE)等。

本文提及的相对于对照植物的增强的产量相关性状指的是早期萌发势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加中的一种或多种，所述的部分可以包括(i)地上部分和优选地上可收获的部分和/或(ii)地下部分和优选可收获的地下部分。特别地，此类可收获的部分是种子。

产量

术语“产量”通常指的是经济价值的可测量结果，通常与特定的作物、与面积并且与时间段有关。基于个体植物部分的数目、大小和/或重量，个体植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是作物一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米而确定。

术语植物的“产量”和“植物产量”在本文中可互换地使用，并指的是营养生物量如根和/或苗生物量，指的是繁殖器官，和/或指的是繁殖体，如该植物的种子。

玉米中的花是单性的；雄花序(雄花穗)来自顶生茎，而雌花序(穗)产生自腋芽顶点。雌花序在中心轴(穗轴)表面上产生成对的小穗。每一雌性小穗包裹两朵可育的小花，一旦受精后，其中一朵通常将成熟为玉米核。因此玉米中产量的增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/直径的增加、种子充实率(其为充实的小花(即，含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100)增加，及其他。

稻植物中的花序称为圆锥花序。圆锥花序具有小穗，所述小穗是圆锥花序的基本单元，并且由花梗和小花组成。小花生在花梗上并且包括由两片保护性颖片：较大的颖片(外稃)和较短的颖片(内稃)所覆盖的花。因此，以稻为实例，产量增加可以表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数、种子充实率(其为充实的小花(即，含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100)增加，千粒重增加等。

早期开花时间

如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一圆锥花序出现之间的日数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。

早期萌发势

“早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。

增加的生长速率

增加的生长速率可以专指植物的一个或多个部分(包括种子)，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸多因素如萌发速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期阶段间，增加的生长速率可以反映增强的生长势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物比原本可能地更晚播种和/或更早收获(在开花时间更早情况下，可以获得相似的效果)。如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规的生长时期内)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的情况下，从相同砧木收获额外的次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产的增加(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比野生型对应物更广泛的地理区域内栽培，因为栽培某作物的地域限制往往由栽种时间(早季)或收获时间(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线推算多项参数来确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所耗费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所耗费的时间)，以及其他参数。

胁迫抗性

与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫引起的受损生长往往是对农业而言不受欢迎的特征。非生物胁迫可以因干旱或水过量、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。

“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归因于干旱)、盐胁迫或冷冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物性胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冷冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。如Wang等人(Planta(2003)218:1-14)中所报道，非生物性胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号转导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以递增的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。

特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在一个实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下实施。

在一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。

在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，而可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等的任意一种或多种。

在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冷冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

增加/改善/增强

术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。

种子产量

增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：

a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；

b)每株植物增加的花数；

c)增加的种子数；

d)增加的种子充实率(其表示为充实小花数除以小花总数之间的比率)；

e)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产量除以地上的植物部分生物量的比率；和

f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以由增加的种子尺寸和/或种子重量导致，并且也可以由胚尺寸和/或胚乳尺寸增加导致。

可认为术语“充实小花”和“充实种子”是同义词。

种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。

绿度指数

如本文中所用的“绿度指数”从植物的数字图像计算。对于属于该图像上植物目标的每个像素，计算绿色值对红色值的比率(在用于编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素的百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。

生物量

如本文所用的术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述植物的部分可以包括以下任意一种或多种：

-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地下部分，如但不限于根生物量等；

-地下可收获部分，例如但不限于根生物量、块茎、球茎等；

-部分在地下的可收获部分，如但不限于甜菜和植物的其它下胚轴区、根状茎、匍匐枝或匍匐根茎。

-营养性生物量，如根生物量、苗生物量，等；

-生殖器官；

-繁殖体如种子。

标记物辅助育种

此类育种计划有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理来引入等位变异；或者，所述计划可以始于一组并非故意造成的所谓“自然”来源性等位变体。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。而后是步骤：选择所讨论序列的并且导致产量增加的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一株植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。

用作(基因作图中)的探针

编码目的蛋白的核酸用于对基因进行遗传和物理作图的用途仅需至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记物。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，ALaboratory Manual)可以用编码目的蛋白的核酸探测。所得的条带模式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)，进行遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸可以用来探测含有一组个体的限制性内切核酸酶处理的基因组DNA的Southern印迹物，其中所述的一组个体代表确定的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离被注意到并且用来计算编码目的蛋白的核酸在先前使用这个群体所获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变型对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。

所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等人，在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，所述核酸探针可以用于直接荧光原位杂交(FISH)作图中(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管现有的FISH作图法支持大克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5:13-20)的使用，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

多种基于核酸扩增的用于遗传作图及物理作图的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用来设计并且产生在扩增反应或在引物延伸反应中所使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，可能需要鉴定在对应于本发明核酸序列的区域内作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，对作图法而言，这通常不是必需的。

植物

如本文中所用的术语“植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。

特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapassp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadabafarinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

对照植物

合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物种类或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是通过分离而丢失转基因的个体。此外，对照植物在与本发明植物的生长条件等同的生长条件下(即在本发明植物的附近，并与本发明植物同时)生长。如本文中所用的“对照植物”不仅指整个植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

附图简述

本发明现在将参考以下图进行描述，其中：

图1表示具有保守基序1至3的SEQ ID NO:2的结构域结构。

图2表示多种PRR样多肽的多重比对。当使用保守氨基酸时，该比对可以用于限定其他基序或标签序列。

图2中显示的比对的多肽序列对应的SEQ ID NO为：

SEQ ID NO:4为矢车菊_TA1222_215693

SEQ ID NO:6为莴苣_TC22097

SEQ ID NO:8为苦苣_TA960_114280

SEQ ID NO:10为甘蔗_TC81972

SEQ ID NO:2为甘蔗_PRR样

SEQ ID NO:12为两色蜀黍_Sb01g038820.1

SEQ ID NO:14为玉蜀黍_GRMZM2G095727_T03

SEQ ID NO:16为玉蜀黍_GRMZM2G095727_T02

SEQ ID NO:18为玉蜀黍_GRMZM2G095727_T04

SEQ ID NO:20为玉蜀黍_GRMZM2G095727_T05

SEQ ID NO:22为玉蜀黍_GRMZM2G095727_T01

SEQ ID NO:24为甘蔗_TC80591

SEQ ID NO:26为柳枝稷_TC27226

SEQ ID NO:28为甘蔗_TC111093

SEQ ID NO:30为甘蔗_TC84822

SEQ ID NO:32为柳枝稷_TC42896

SEQ ID NO:34为柳枝稷_TC22980

SEQ ID NO:36为普通小麦_TC284871

SEQ ID NO:38为大麦_TC165635

SEQ ID NO:40为普通小麦_c59844892@6464

SEQ ID NO:42为二穗短柄草_DV469398

图3显示了实施例3的MATGAT的表。

图4表示用于增加稻中PRR样编码核酸在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的表达的双元载体。

实施例

本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是说明性的。以下实施例不意图限制本发明的范围。除非另有说明，本发明采用传统的植物生物学、分子生物学、生物信息学和作物育种技术和方法。

DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual,第3版Cold Spring HarborLaboratory Press,CSH,New York)或Ausubel等(1994),Current Protocolsin Molecular Biology,Current Protocols第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications)(英国)出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子研究工作的标准材料和方法。

实施例1：鉴定与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO:1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A提供与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的一系列核酸序列。

表A：PRR样核酸和多肽的实例：

序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。例如，真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法用目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物，例如为某些原核生物创建了特别的核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专有数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例2：PRR样多肽序列的比对

多肽序列的比对使用累进比对的ClustalW2.0.11算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res25:4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic AcidsRes31:3497-3500)，用标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开放罚分：10，空位延伸罚分：0.2)进行。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。PRR样多肽在图2中比对。

实施例3：多肽序列之间的总体同一性百分数的计算

使用MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT:使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences)，Campanella JJ,Bitincka L,Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)，确定在可用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法进行一系列配对比对，然后将结果置于距离矩阵中。

在图3中显示了在多肽序列的全长范围上的总体相似性和同一性百分比的MatGAT分析结果。序列相似性在分界线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。分析中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。和SEQ ID NO：2相比，可用于实施本发明方法的PRR样多肽序列间的序列同一性(％)可以低至7,8％，但通常高于67％。

像全长序列一样，可以生成基于特定结构域的子序列的MATGAT表。基于PRR样多肽的多重比对，如实施例2中的一个多重比对，本领域技术人员可以选择保守序列并作为MATGAT分析的输入提交。

实施例4：鉴定在可用于实施本发明方法的多肽序列中所包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是用于基于文本及基于序列的搜索的常用标记数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及关于充分表征的蛋白质的不同程度的生物学信息以取得蛋白质标记(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐马尔科夫模型的大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。

在表B中呈现了如SEQ ID NO:2表示的多肽序列的InterPro扫描(InterPro数据库4.8版)的结果。

表B：如SEQ ID NO:2表示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。

在一个实施方案中，PRR样多肽包含与SEQ ID NO:2中从氨基酸84至163或SEQ ID NO:2中从氨基酸711至754的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域或基序。

实施例5：PRR样多肽序列的拓扑结构预测

TargetP1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。基于任何N端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的经预测的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必须相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性类别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性类别(RC)是从1至5的范围，其中1指示最强有力的预测。也可以对预测含有N端前序列的序列预测潜在的切割位点。在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护TargetP。

在分析序列前必须选择许多参数，如生物类群(非植物或植物)、截断集合(无、预定义的截断集合或用户指定的截断集合)和切割位点预测的计算(是或否)。

表C显示如SEQ ID NO:2表示的多肽序列的TargetP1.1分析的结果。已经选择“植物”生物类，没有限定截断，并且要求转运肽的预测的长度。如SEQ ID NO:2表示的多肽序列的亚细胞定位可能是细胞质或细胞核，没有预测转运肽。

表C：如SEQ ID NO:2表示的多肽序列的TargetP1.1分析结果。

长度(AA)	766
		叶绿体转运肽	0.061
线粒体转运肽	0.157
		分泌通路信号肽	0.104
其它亚细胞定位	0.908
		预测位置	/
可靠性等级	2
		预测转运肽长度	/

许多其他算法可以用来进行此类分析，它们包括：

·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；

·在加拿大阿伯特塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白质组分析专家PA-GOSUB2.5；

·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。

·PSORT(URL:psort.org)

·PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)

实施例6：编码PRR样的核酸序列的克隆

使用客户定制的甘蔗幼苗cDNA文库作为模板通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，使用市售纠错(proofreading)Taq DNA聚合酶在标准条件下进行PCR。所用的引物是prm15559(SEQ ID NO:47；有义):

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggtagcgcttggcc-3’和prm15560(SEQ ID NO:48；反向，互补):

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacgaagatgccatgttgtatt-3’，所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。然后，进行Gateway方法的第一步骤，BP反应，在此期间，将所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语的“进入克隆(entry clone)”，pPRR样。从Invitrogen购买作为技术部分的质粒pDONR201。

然后，在LR反应中包含SEQ ID NO:1的进入克隆与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有作为功能性元件的：植物可选择的标记物、可筛选的标记物表达盒和用于与已经被克隆到该进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO:46)位于该Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，根据本领域熟知的方法将所得的表达载体pGOS2::PRR(图4)转化至农杆菌属菌株LBA4044中。

实施例7：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育一分钟，随后在次氯酸钠溶液中30分钟至60分钟，优选30分钟(取决于污染的等级)，随后用无菌蒸馏水洗涤3至6次，优选4次实施消毒。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在光线中温育6天后，用如本文下面描述的农杆菌转化来自小盾片的愈伤组织。

含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将愈伤组织在该混悬液内浸泡1至15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。将农杆菌洗除后，在选择剂存在下，将愈伤组织在光线中于28℃至32℃于含有2,4-D的培养基上培育10至14天(籼稻生长时间为3周)。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-6周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。

根据本领域技术人员公知的技术，水稻栽培种籼稻的转化也可以用上面给出的相似方式进行。

对于一个构建体，产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现出选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。

实施例8：其他作物的转化

玉米转化

玉米(玉蜀黍)的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech14(6)：745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型有效用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记物)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记物)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油菜籽/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep17:183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5–10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol119:839–847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture4:111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol119:839–847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天。外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US5,159,135中所述的方法转化棉花。棉花种子在3％次氯酸钠溶液中作20分钟表面消毒并在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/m苯菌灵的SH培养基用于萌发。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌混悬液(每毫升大约10⁸个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记物转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人,Exp.Cell Res.50:151-158(1968))、0.1mg/l2,4-D、0.1mg/l6-糠基氨基嘌呤和750μg/mlMgCL₂以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周继代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管内，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠基氨基嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的花钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

甜菜转化

将甜菜种子在70％乙醇中消毒一分钟，之后在20％的次氯酸盐漂白剂，例如常规漂白剂(可通过商业途径从Clorox，1221百老汇(Broadway)，奥克兰，CA94612，美国得到)中晃动20分钟。用无菌水冲洗种子并风干，之后将其接种到萌发培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige,T.,和Skoog,.,1962.Physiol.Plant,vol.15,473-497)，所述培养基包括维生素B5(Gamborg等人；Exp.Cell Res.,vol.50,151-8.)并补充有10g/l蔗糖和0.8％琼脂))。根据Hussey和Hepher(Hussey,G.,和Hepher,A.,1978.Annals of Botany,42,477-9)，对于苗培养物的引发，下胚轴组织是必须使用的并在基于MS的培养基(补充了30g/l蔗糖和0.25mg/l苄基氨基嘌呤以及0.75％琼脂，pH5.8)上在23-25℃下以16小时的光周期维持。将携带双元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验，所述双元质粒包含可选择的标记物基因，例如nptII。在转化前一天，包括抗生素的液体LB培养物在摇床中(28℃，150RPM)生长，直到600nm处光密度(O.D.)达到～1。将过夜生长的细菌培养物离心并重悬浮在包括乙酰丁香酮，pH值5.5的接种培养基中(OD～1)。将苗基部的组织切成片(大约1.0cm x1.0cm x2.0mm)。将组织浸入液体的细菌接种培养基中30秒。通过滤纸印迹去除多余的液体。共培养发生在基于MS的培养基(包括30g/l蔗糖)中，持续24至72小时，之后是在基于MS的培养基(包括30g/l蔗糖与1mg/l的BAP以诱导苗的发育，以及用于消除农杆菌的头孢噻肟)中的非选择性的时期。在3-10天后，将外植体转移到包含例如卡那霉素或G418(50-100mg/l的基因型依赖性)的相似的选择性培养基中。每2-3周将组织转移到新鲜培养基中以维持选择压力。苗的快速引发(3-4天后)表明是现存的分生组织的再生，而不是新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮继代培养后，将小苗转移到含有5mg/l NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基中。采取额外的步骤，以降低产生经转化的嵌合(部分转基因)的植物的可能性。将来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于甜菜的其他转化方法是本领域中已知的，例如Linsey&Gallois(Linsey,K.,和Gallois,P.,1990.Journal of Experimental Botany；第41卷,No.226；529-36)的那些方法或在公布为WO9623891A的国际申请中的方法。

甘蔗转化

从六月龄的田间生长的甘蔗植株分离纺锤体(Arencibia等人,1998.Transgenic Research，卷7，213-22；Enriquez-Obregon等人，1998.Planta，卷206，20-27)。通过浸入20％次氯酸盐漂白剂例如常规漂白剂(可通过商业途径从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA94612,USA得到)中20分钟对材料进行消毒。将约0.5cm的横切片以顶部朝上的方向置于培养基上。将植物材料在包括B5维生素(Gamborg等；Nutrientrequirements of suspension cultures of soy-bean root cells.Exp.Cell Res.,卷50,151-8.)并补充有20g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg/l2,4-D的基于MS(Murashige,T.,和Skoog,.,1962.A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant,卷15,473-497)的培养基上在23℃黑暗中培养4周。4周后将培养物转移至相同的新鲜培养基上。将携带含有可选择的标记物基因例如hpt的双元质粒的根癌农杆菌菌株用于转化实验。转化前一天，含抗生素的液体LB培养物在摇床(28℃,150rpm)中生长直到600nm处光密度(O.D.)达到～0.6。将过夜生长的细菌培养物离心并在包括乙酰丁香酮pH值为5.5的基于MS的接种培养基中重悬浮(O.D.～0.4)。根据致密结构且为黄色的形态特征分离甘蔗胚发生的愈伤组织块(2-4mm)，并在通风橱中干燥20分钟，之后浸入液体细菌接种培养基中10-20分钟。通过滤纸印迹除去多余的液体。在黑暗中滤纸上共培养3-5天，将所述滤纸置于包括B5维生素和1mg/l2,4-D的基于MS的培养基上。共培养后，用无菌水洗涤愈伤组织，之后是在含500mg/l头孢噻肟(用于消灭剩余的农杆菌属细胞)的相似培养基上的非选择培养期。3-10天后，将外植体转移至含B5维生素、1mg/l2,4-D和25mg/l潮霉素(基因型依赖性的)的基于MS的选择培养基上再培养3周。所有处理在23℃黑暗条件下进行。抗性愈伤组织在16小时光周期下在缺少2,4-D但是包括1mg/l BA和25mg/l潮霉素的培养基上进一步培养，导致苗结构的发育。分离出苗并在选择性生根培养基(含20g/l蔗糖、20mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟的基于MS的培养基)上培养。将来自再生苗的组织样品用于进行DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法为本领域所知，例如来自公布为WO2010/151634A的国际申请和经授权的欧洲专利EP1831378中的方法。

实施例9：表型评价方法

9.1评价建立

产生了35个至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以种植并收获T1种子。保留了T1子代以3:1对所述转基因的存在/不存在分离的6个事件。对于这些事件中的每一个，通过监测可视标记表达选择大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排种植转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。以规律的间隔期对在非胁迫条件下生长的植物浇水，以确保水和养分不是限制性的并且确保满足植物完成生长和发育的需要，除非它们用于胁迫筛选。

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

可根据如用于T1代的相同评价方法，例如利用较少的事件和/或每个事件较多的个体在T2代中进一步评价T1事件。

干旱筛选

在盆栽土壤中在正常条件下种植T1或T2植物直至它们达到抽穗期。然后将它们转移至“干燥”段，其中不予灌溉。将土壤湿度探针插入随机选择的盆内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC低于某些阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。然后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

在除营养液之外的正常条件下在盆栽土壤中种植T1或T2植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常减少了7至8倍之间的氮(N)含量的特定营养液浇灌所述盆。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

T1或T2植物种植在椰子纤维和烘烤粘土颗粒(Argex)(3:1比例)组成的基质上。在将小植物移植到温室中后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如对正常条件下的生长所详述的记录生长和产量参数。

9.2统计分析：F-检验

将两因子ANOVA(方差分析)用作总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部测量参数进行F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体效应(又称作总体基因效应)。对于F检验，将真实总体基因效应的显著性的阈值设在5％概率水平。显著性F检验值指出基因效应，这意味不是仅基因的存在或位置才引起表型上的差异。

9.3测量的参数

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。如WO2010/031780中描述的在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。这些测量用于确定不同参数。

生物量相关的参数测量

植物地上部分面积，或叶生物量，通过计数来自地上的植物部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正换算成以平方mm表述的物理表面值。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。

根生物量的增加表述为总根生物量增加，度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量；或表述为根/苗指数增加，度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例。换言之，该根/苗指数定义为根和苗活跃生长期中根生长速度与苗生长速度的比例。根生物量可使用如WO2006/029987中描述的方法进行测定。

与发育时间相关的参数

早期萌发势是萌发后3周的植物地上部分面积。通过计数来自地上植物部分中与背景区别的像素总数确定早期萌发势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正换算成以平方mm表述的物理表面值。

AreaEmer指示快速的早期发育，当与对照植物相比时该值降低。其为植物产生30％的最终生物量需要的时间和植物产生90％其最终生物量需要的时间之间的比例，以％表述。

植物的“开花时间”或“开花时间”可使用如WO2007/093444中描述的方法进行测定。

种子相关的参数测量值

将成熟的主要圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子一般被干燥的外罩(外壳)所覆盖。使用鼓风装置，将充实粒(本文中也命名为充实小花)与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。

通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定种子总数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测得种子总重量。

通过计数从植物收获的籽粒(无论充实与否)的数目确定每株植物的种子(或小花)总数。

从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。

本发明中的收获指数(HI)定义为种子总重量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。

如本发明中定义的每一圆锥花序花的数是种子总数与成熟主要圆锥花序数之间的比例。

如本发明中定义的“种子充实率”是充实种子数，即含有种子的小花，对种子总数，即：小花总数的比例，表示为％。换言之，种子充实率是填充了种子的小花的百分数。

实施例10：转基因植物的表型评价结果

在T1代中的且在非胁迫条件下表达编码SEQ ID NO:2的PRR样多肽的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现于下文表D中。当在非胁迫条件下生长时，观察到地上生物量(AreaMax)、根生物量(RootMax)和种子产量，包括总种子重量(totalwgseeds)、种子数量(nrfilledseeds)、充实率(fillrate)和每一圆锥花序的花数量(flowerperpan)至少5％的增加(表D)。

表D：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示确认的(T1代)总体增加百分数，对于每个参数，p值是<0.05。

参数	总体增加
		AreaMax	10.9
RootMax	9.7
		总种子重量	26.7
种子数量	22.9
		充实率	17.3
每一圆锥花序的花数量	17.1

Claims (21)

1.生产相对于对照植物具有提高的生物量和/或种子产量的转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤：

-在植物细胞中或植物中引入并且表达编码PRR样多肽的核酸，其中所述核酸与组成型植物启动子有效连接，并且其中所述PRR样多肽包含由下述之一所表示的多肽：SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的其同源物，并且

-在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述增加的种子产量包含下述至少一个参数，所述参数选自包含增加的种子总重量、增加的种子数量、增加的充实率和增加的每一圆锥花序的花数量的组。

3.根据权利要求1或2的方法，其中当与对照植物比较所述参数中的至少一个时，所述种子产量增加包含在所述植物中增加至少5％。

4.根据权利要求1的方法，其中所述生物量增加包含下述至少一个参数，所述参数选自包含增加的地上生物量和增加的根生物量的组。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述增加的生物量和/或种子产量是在非胁迫条件下获得的。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述核酸与GOS2启动子有效连接。

7.根据权利要求6的方法，其中所述GOS2启动子是来自稻的GOS2启动子。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。

9.根据权利要求8的方法，其中所述植物是谷类。

10.构建体，其包含：

(i)如权利要求1所定义的编码PRR样多肽的核酸，

(ii)能驱动(i)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

11.权利要求10的构建体，其中所述一种或多种控制序列中的一种是GOS2启动子。

12.相对于对照植物具有如权利要求2或3中定义的增强的种子产量的转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物产生于在所述植物中引入并且表达如权利要求1所定义的编码PRR样多肽的核酸。

13.根据权利要求12的转基因植物，或源自于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、甜菜或苜蓿；或单子叶植物，如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。

14.根据权利要求13的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为根生物量和/或种子。

15.源自于根据权利要求13的植物和/或源自于根据权利要求14的植物的可收获部分的产品。

16.如权利要求1、6或7中任一项中定义的编码PRR样多肽的核酸用于在植物中相对于对照植物增加生物量和/或种子产量的用途。

17.生产产品的方法，所述方法包括种植根据权利要求12或13的植物并从或通过所述植物，或其部分，包括种子，生产所述产品的步骤。

18.从根据权利要求13的植物和/或从根据权利要求14的植物的可收获部分生产的产品。

19.根据权利要求10或11的包含在植物细胞中的构建体。

20.包含根据权利要求10或11的构建体的重组染色体DNA。

21.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述多肽由核酸分子编码，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核酸分子：

(i)由SEQ ID NO:1表示的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1表示的核酸的互补核酸；

(iii)如SEQ ID NO:1表示的编码多肽的核酸，并且还优选地赋予相对于对照植物的增加的生物量和/或种子产量；

(iv)核酸，其与SEQ ID NO:1的核酸酸序列以递增优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地赋予相对于对照植物的增加的生物量和/或种子产量；

(v)核酸分子，其在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子的互补核酸杂交且优选地赋予相对于对照植物的增加的生物量和/或种子产量。

(vi)核酸，其编码与SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列以递增优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的所述多肽，并且优选地赋予相对于对照植物的增加的生物量和/或种子产量；或

(vii)包含上述(i)至(vi)特征的任意组合的核酸。