TW202130813A

TW202130813A - 一種在生物體內產生新突變的方法及應用

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Publication number: TW202130813A
Application number: TW109138717A
Authority: TW
Inventors: 姜臨建; 莫蘇東; 王繼堯; 李玉才; 戚偉; 李華榮; 陳波
Original assignee: 大陸商青島清原化合物有限公司
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2021-08-16
Also published as: CN112251419B; JP2023500357A; KR20220093324A; BR112022008916A2; EP3889266A4; AU2020378387A1; CA3159682A1; EP3889266A1; US20230287389A1; CN112251419A; TWI840629B; MX2022001245A; IL289541A; WO2021088601A1; ZA202203920B; CL2021003593A1

Abstract

本發明屬基因工程技術領域，具體而言涉及一種在無人工DNA模板的前提下，在生物體內創制定點突變的方法及應用。該方法包括以下步驟：在生物體基因組的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生。本發明根據順次編輯產生的新的修復事件形成的序列，設計新靶點，可以在基因組的特定位置連續多次形成突變，極大的豐富DNA斷裂後修復事件的類型，實現單次基因編輯無法得到的新的鹼基替換、刪除及插入突變。

Description

一種在生物體內產生新突變的方法及應用

優先權資訊

本申請要求2019年11月7日提交的中國發明專利申請201911081617.X、2020年8月15日提交的中國發明專利申請202010821877.2和2020年9月16日提交的中國發明專利申請202010974151.2的權益，上述申請藉由引用完全併入本文。

本發明屬基因工程技術領域，具體而言涉及一種在無人工DNA模板的前提下，在生物體內創制定點突變的方法及應用。

利用基因工程技術改造生物體基因組已在工農業生產中得到廣泛應用，例如在製藥、化工領域常用的轉基因微生物和農業領域的抗蟲抗除草劑轉基因作物等。隨著位點特異性核酸酶的出現，藉由將靶向斷裂引入到受體生物基因組並引起自發修復，已經能夠實現基因組的定點編輯，對基因組進行更精確的改造。

基因編輯工具主要包括三大類型序列特異性核酸酶(SSN)：鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和成簇的規律間隔的短回文重複序列(CRISPR)–Cas系統(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas system)。序列特異性核酸酶是可編程的核酸酶，能夠在基因組中的特定位點產生DNA雙鏈斷裂（DSBs）。DNA雙鏈斷裂激活內源性DNA修復途徑修復細胞DNA損傷，修復過程中容易導致目標位點DNA序列的變化，從而實現在預期位點引入突變，這項技術使生物學家能夠精確靶向目標基因並且加以編輯。其中ZFN和TALEN都需要針對靶點序列設計特異識別的蛋白模塊，通量低，操作複雜。而CRISPR/Cas系統中Cas蛋白是通用的，針對靶點設計特異的CRISPR-RNA (crRNA)即可單獨或與反式激活RNA（tracrRNA）配合形成引導RNA（guide RNA，gRNA），或設計單一引導RNA（single guide RNA，sgRNA）即可，crRNA與tracrRNA共同或者sgRNA單獨和Cas蛋白組裝形成核糖核蛋白複合體(ribonucleoprotein, RNP)，在基因組中以原間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)為基礎識別靶點序列，實現定點編輯，因其操作簡便、適用範圍廣、通量高成為目前主流的基因編輯工具。

序列特異性核酸酶能夠在基因組的特定位置產生DNA雙鏈斷裂，這些DNA雙鏈斷裂會被修復成多種不同的修復類型，其中以鹼基的插入或缺失為主。如CRISPR/Cas9編輯事件中最為普遍的兩種類型是在斷口處插入一個鹼基或在斷口處刪除一個鹼基（Shen et al. 2018. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature. DOI: 10.1038/s41586-018-0686-x）。編碼區鹼基的插入、缺失會造成移碼突變，導致基因功能的喪失，因此，上述基因編輯工具最主要的用途仍然是用於基因敲除。

一直以來單獨使用序列特異性核酸酶被認為無法實現鹼基替換類型的突變。為此，先前技術提出了3種解決方案：1）加入外源DNA片段作為修復模板引發同源重組修復途徑；2）將脫氨酶與Cas9融合開發先後出了C到T，A到G的單鹼基編輯工具；3）將逆轉錄酶與Cas9融合，以pegRNA引導合成置換小範圍的DNA鏈。但是這三種方案的編輯效率都顯著低於基因敲除的效率，同時引入的外源DNA片段和逆轉錄酶也容易引起生物安全性的顧慮，單鹼基編輯的脫靶效應也制約了其在細胞治療中的應用潛力。尤其對於長週期的植物育種項目而言，如何提高目標位點的鹼基替換效率同時降低監管部門對於生物安全性的顧慮是基因編輯技術應用中需要解決的問題。

綜上所述，僅用序列特異性核酸酶的靶向敲除實現定點的鹼基替換，不引入外源DNA片段，特別是藉由非轉基因的瞬時編輯體系高效率的完成定點的鹼基替換編輯在細胞治療和生物育種領域都有著急迫的技術需求。

本發明提供了一種僅藉由在基因組上產生雙鏈斷裂的形式，並且在不提供人工DNA模板的情況下，在生物體內創制定點突變的方法及其應用。本發明採用的技術方案如下：

一種在生物體內產生新突變的方法，包括以下步驟：在生物體基因組的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生。

在一具體實施方式中，所述的“DNA斷裂”是藉由將具有靶向特性的核酸酶遞送到生物體細胞內與基因組DNA特定位置接觸實現的。

在一具體實施方式中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”為ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統。

在一具體實施方式中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由ZFN或TALEN編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的ZFN或TALEN蛋白，對該位點再次進行切割。

在另一具體實施方式中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。例如，第二次是針對由Cas9編輯的第一次斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該處再次進行切斷。同理，可以根據再次修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該處進行第三次切斷。如圖1所示，以此類推。

在一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”是將不同的靶向核酸酶按先後順序遞送到不同代的受體細胞中產生的，以完成在先編輯的突變細胞作為受體接受在後編輯的靶向核酸酶的遞送，進行二次編輯產生定點突變。這種方式較佳用於ZFN、TALEN編輯系統。

在另一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”是將不同靶向的靶向核酸酶遞送到同一個受體細胞中產生的。這種方式較佳用於CRISPR/Cas編輯系統。

在一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”由同一種CRISPR/Cas核酸酶與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。

在另一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas核酸酶與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。例如來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9識別的PAM序列是“NGG”或“NAG”(Jinek等，“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”，Science 2012，337：816-821)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9識別的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”，腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)Cas9識別PAM序列NNNNGATT，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9識別PAM序列NNAGAAW。在這種方式下，DNA分子上可編輯的視窗範圍更大。

在一具體實施方式中，該靶向核酸酶為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。

在一具體實施方式中，該靶向核酸酶以DNA形式存在。

在另一具體實施方式中，該靶向核酸酶以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。較佳蛋白形式。

在一具體實施方式中，將靶向核酸酶遞送到細胞內的方法包括，1）PEG介導的細胞轉染的方法；2）脂質體介導的細胞轉染的方法；3）電擊轉化的方法；4）顯微注射；5）基因槍轟擊；6）農桿菌介導的轉化方法等。

該方法以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎設計新靶點，可以在基因組的特定位置連續多次形成突變，指數級的豐富DNA斷裂後修復事件的類型，實現單次基因編輯無法得到的新的鹼基替換、刪除及插入突變類型，適合用作創造新突變的工具，本方法可以簡述為循環打靶或連續打靶的方法。

在一具體實施方式中，根據對生物體基因組特定位置在先斷裂修復後預測可能產生的特定新序列設計新靶點，進行順次編輯，可以提前設計該位置最終可能產生的突變，實現預期編輯。

在另一具體實施方式中，根據對生物體基因組特定位置在先斷裂修復後預測可能產生的新序列設計新靶點，進行順次編輯，除預期的編輯事件外，該位置最終還可能產生多種不同突變，可作為創造多種不同突變的工具。

在另一方面，本發明還提供了一種在生物體內產生新突變的方法，包括以下步驟：在生物體基因組或染色體水準上，藉由在基因的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂，實現精準鹼基替換、刪除或插入。

在一具體實施方式中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對前一次斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該處再次進行切斷。

在一具體實施方式中，所述的“DNA斷裂”是藉由具有靶向特性的核酸酶來實現。

本發明還提供一種採用前述方法獲得的新突變。

本發明另外提供一種具有該新突變的蛋白或其生物活性片段。

本發明另外提供一種核酸，其包含編碼該蛋白或其生物活性片段的核酸序列或者其互補序列。

本發明另外還提供一種核酸，其包含： (a)編碼靶向RNA的核苷酸序列，其中，該RNA至少包含兩個，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。

在一具體實施方式中，該核酸還包括(b)編碼Cas多肽的核苷酸序列。

在一具體實施方式中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。

在一具體實施方式中，該Cas多肽和該靶向RNA為在體外細胞或離體細胞內。

本發明另外提供一種重組表達載體，其包含前述的核酸，以及與之可操作地連接的啟動子。

本發明另外提供一種表達盒，其中包含前述的核酸。

本發明另外提供一種宿主細胞，其中包含有所述的表達盒。

本發明另外還提供採用該宿主細胞再生成的生物。

本發明還提供一種裂解靶DNA的方法，其包括使該靶DNA與複合物接觸，該複合物包含： (a)Cas多肽；以及 (b)至少兩個靶向RNA，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。

在一具體實施方式中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。

在一具體實施方式中，該靶DNA存在於細菌細胞、真核細胞、植物細胞或動物細胞中。

在一具體實施方式中，該靶DNA為染色體DNA。

在一具體實施方式中，該接觸包括將以下引入細胞：(a)該Cas多肽或編碼該Cas多肽的多核苷酸，和(b)該靶向RNA或編碼該靶向RNA的DNA多核苷酸。

本發明還提供一種組合物，其包含： (a)Cas多肽，或編碼該Cas多肽的多核苷酸；以及 (b)至少兩個靶向RNA，或編碼該靶向RNA的DNA多核苷酸，其中，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。

在一具體實施方式中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。

本發明還提供所述的組合物在用於製備治療疾病的藥劑中的用途。

能夠用本發明的組合物進行治療的疾病包括，但不限於，遺傳性酪氨酸血症1型、苯丙酮尿症、早衰症、鐮狀細胞病等單基因突變引起的疾病，藉由向細胞內遞送Cas蛋白和針對致病突變位點預期可修復為正常功能蛋白的crRNA或sgRNA組合物，誘導細胞自發修復產生治療效果。

本發明還提供一種試劑盒，其包含： (a)Cas多肽，或包含編碼該Cas多肽的核苷酸序列的核酸；以及 (b)至少兩個靶向RNA，或包含編碼該靶向RNA的核苷酸序列的核酸，其中，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷；其中(a)和(b)是在相同或單獨的容器中。

在一具體實施方式中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。

在一具體實施方式中，(b)中的靶向RNA是在相同或單獨的容器中。

本發明還提供一種不依賴外源轉基因標記篩選編輯事件的方法，包括以下步驟： 1) 在受體細胞第一目標基因的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2) 第一目標基因特定位置經順次切割並修復後產生的某些編輯事件，能夠賦予突變體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生表型可選擇的性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物； 3) 可選的，在第一目標基因之外，同時使用針對至少一個第二目標基因的靶向核酸酶對其它靶點進行編輯，藉由篩選第一目標基因突變產生的可選擇性狀同步對第二目標基因的編輯事件進行富集篩選，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二目標基因編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”是編碼至少一種表型可選擇性狀的基因位點，其中該至少一種表型可選擇性狀是抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因的特定位置”是指該位置處經順次切割並修復後產生的某些突變類型能夠賦予該受體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生至少一種表型可選擇的抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。

在一具體實施方式中，該“某些突變類型”包括單鹼基替換、多個鹼基的替換或不特定數目的鹼基插入或缺失。

在一具體實施方式中，該“某種篩選壓力”可以是環境壓力，如高溫、低溫、低氧等，也可以是添加的化合物壓力，例如鹽離子濃度、抗生素、細胞毒素、除草劑等。

在一具體實施方式中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。

在一具體實施方式中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。

在另一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas核酸酶與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。在這種方式下，DNA分子上可編輯的視窗範圍更大。

在一具體實施方式中，該“第二目標基因”是指編碼與第一目標基因不同的其它基因。

在一具體實施方式中，該“針對至少一個第二目標基因的靶向核酸酶”與在第一目標基因特定位置上產生DNA斷裂使用的CRISPR/Cas核酸酶相同。

在另一具體實施方式中，該“針對至少一個第二目標基因的靶向核酸酶”與在第一目標基因特定位置上產生DNA斷裂使用的CRISPR/Cas核酸酶不同。在這種方式下，第二目標基因上可選擇的編輯位點更多。

在一具體實施方式中，該靶向核酸酶以DNA形式存在。

本發明進一步提供了一種對生物體基因組進行非轉基因瞬時編輯的方法，包括以下步驟： 1）針對受體細胞第一目標基因的特定位置設計並合成至少兩條crRNA片段組合或至少兩條sgRNA片段組合，該crRNA組合與tracrRNA結合或單獨使用sgRNA組合能夠引導對應的Cas蛋白在受體細胞第一目標基因的特定位置上依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2）將適量CRISPR/Cas蛋白或其相應的mRNA與上述預先設計合成的能夠引導第一目標基因定點編輯產生內源篩選標記的crRNA片段組合和tracrRNA片段或單獨sgRNA片段組合混合，可選的，進一步加入至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段，在體外孵育形成RNP複合體； 3）將上述RNP複合體遞送到受體細胞中，與基因組DNA特定位置接觸實現基因編輯； 4）根據RNP複合體對第一目標基因的定點編輯產生的表型可選擇的性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物，以及可選的，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二、第三或更多目標基因的編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物。

在一具體實施方式中，所述的CRISPR/Cas蛋白為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。

在一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”由同一種CRISPR/Cas蛋白與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。

在另一具體實施方式中，該“兩個以上的DNA斷裂”由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas蛋白與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。在這種方式下，DNA分子上可編輯的視窗範圍更大。

在一具體實施方式中，該“第二、第三或更多目標基因”是指編碼與第一目標基因不同的其它基因。

在一具體實施方式中，該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA共用同一種Cas蛋白。

在另一具體實施方式中，該該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA使用識別不同PAM序列的Cas蛋白。在這種方式下，第二目標基因上可選擇的編輯位點更多。

在一具體實施方式中，將該RNP複合體遞送到細胞內的方法包括，1）PEG介導的細胞轉染的方法；2）脂質體介導的細胞轉染的方法；3）電擊轉化的方法；4）顯微注射；5）基因槍轟擊等。

本發明還提供一種對植物基因組進行非轉基因瞬時編輯的方法，包括以下步驟： 1）針對受體植物細胞或組織第一目標基因的特定位置設計並合成至少兩條crRNA片段組合或至少兩條sgRNA片段組合，該crRNA組合與tracrRNA結合或單獨使用sgRNA組合能夠引導對應的Cas蛋白在受體細胞第一目標基因的特定位置上依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2）將適量CRISPR/Cas蛋白或其相應的mRNA與上述預先設計合成的能夠引導第一目標基因定點編輯產生內源篩選標記的crRNA片段組合和tracrRNA片段或單獨sgRNA片段組合混合，可選的，進一步加入至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段，在體外孵育形成RNP複合體； 3）將上述RNP複合體遞送到受體植物細胞或組織中，與基因組DNA特定位置接觸實現基因編輯； 4）根據RNP複合體對第一目標基因的定點編輯產生的表型可選擇的性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的植物，以及可選的，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二、第三或更多目標基因的編輯事件的細胞、組織、器官或完整的植物。

在一具體實施方式中，該“受體植物細胞或組織”為任何能作為瞬時表達受體並能經過組織培養再生為完整植株的細胞或組織。具體而言，該細胞具體為原生質體細胞或懸浮細胞等；該組織具體為愈傷組織、幼胚、成熟胚、葉片、莖尖、幼穗或下胚軸等。

在一具體實施方式中，將該RNP複合體遞送到植物細胞內的方法包括，1）PEG介導的原生質體轉化的方法； 2）顯微注射；3）基因槍轟擊；4）碳化矽纖維介導法；5)真空滲入法或其他任何瞬時導入方法。較佳基因槍轟擊。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”是編碼選自除草劑抗性/耐受性的至少一種表型可選擇性狀的至少一個內源基因，其中除草劑抗性/耐受性選自包括對EPSPS抑制劑(包括草甘膦)的抗性/耐受性；對谷氨醯胺合成抑制劑(包括草銨膦)的抗性/耐受性；對ALS或AHAS抑制劑(包括咪唑啉或磺醯脲)的抗性/耐受性；對ACCase抑制劑(包括芳氧基苯氧基丙酸(FOP))的抗性/耐受性；對類胡蘿蔔素生物合成抑制劑的抗性/耐受性，包括八氫番茄紅素去飽和酶（PDS）步驟的類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)抑制劑或其他類胡蘿蔔素生物合成靶抑制劑；對纖維素抑制劑的抗性/耐受性；對脂質合成抑制劑的抗性/耐受性；對長鏈脂肪酸抑制劑的抗性/耐受性；對微管組裝抑制劑的抗性/耐受性；對光系統I電子分流劑的抗性/耐受性；對光系統II抑制劑(包括氨基甲酸酯、三嗪類和三嗪酮類)的抗性/耐受性；對PPO抑制劑的抗性/耐受性和對合成生長素(包括麥草畏、2,4-D(即2,4-二氯苯氧乙酸))的抗性/耐受性。其中，該第一目標基因可選自PsbA、ALS、EPSPS、ACCase、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、TIR1、AFB5，這些除草劑標靶基因的特定位置經順次切割並修復後產生的某些突變類型能夠賦予該受體植物細胞對相應除草劑的抗性/耐受性。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”為ALS，該“基因的特定位置”是指擬南芥AtALS蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：1所示）位點A122、P197、R198、D204、A205、D376、R377、W574、S653、G654，以及以AtALS氨基酸序列為參照標準的其它植物的ALS蛋白相對應的上述氨基酸位點。該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼AtALS蛋白氨基酸序列位點A122、P197、R198、D204、A205、D376、R377、W574、S653、G654或其任意組合的序列的靶序列，以及以AtALS氨基酸序列為參照標準的其它植物的ALS蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。較佳ALS W574位點。該篩選壓力較佳啶磺草胺或煙嘧磺隆處理。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”為ACCase，該“基因的特定位置”是指大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides) AmACCase蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：3所示，基因序列如SEQ ID NO：4所示）位點I1781、E1874、N1878、W1999、W2027、I2041、D2078、C2088、G2096，以及以AmACCase氨基酸序列為參照標準的其它單子葉植物的ACCase蛋白相對應的上述氨基酸位點。該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼AmACCase基因氨基酸序列位點I1781、E1874、N1878、W1999、W2027、I2041、D2078、C2088、G2096或其任意組合的序列的靶序列，以及以AmACCase氨基酸序列為參照標準的其它單子葉植物的ACCase蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。較佳ACCase W2027位點。該篩選壓力較佳精喹禾靈處理。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”為HPPD，該“基因的特定位置”是指水稻OsHPPD蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：5所示，基因組序列如SEQ ID NO：6所示）位點H141、L276、P277、N338、G342、R346、D370、P386、K418、G419，以及以OsHPPD氨基酸序列為參照標準的其它植物的HPPD蛋白相對應的上述氨基酸位點。該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsHPPD基因氨基酸序列位點H141、L276、P277、N338、G342、R346、D370、P386、K418、G419或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsHPPD氨基酸序列為參照標準的其它植物的HPPD蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。該篩選壓力較佳雙唑草酮處理。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”為PPO，該“基因的特定位置”是指水稻OsPPO1蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：7所示，基因組序列如SEQ ID NO：8所示）位點S128、V217、S223、V364、K373、L423、Y425、W470，以及以OsPPO1氨基酸序列為參照標準的其它植物的PPO蛋白相對應的上述氨基酸位點。該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsPPO1基因氨基酸序列位點S128、V217、S223、V364、K373、L423、Y425、W470或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsPPO1氨基酸序列為參照標準的其它植物的PPO蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。該篩選壓力較佳苯嘧磺草胺處理。

在一具體實施方式中，該“第一目標基因”為TIR1，該“基因的特定位置”是指水稻OsTIR1蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：9所示，基因組序列如SEQ ID NO：10所示）位點F93、F357、C413、S448，以及以OsTIR1氨基酸序列為參照標準的其它植物的TIR1蛋白相對應的上述氨基酸位點。該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsTIR1基因氨基酸序列位點F93、F357、C413、S448或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsTIR1氨基酸序列為參照標準的其它植物的TIR1蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。該篩選壓力較佳2,4-D處理。

本發明還提供了採用前述方法的非轉基因瞬時編輯系統。

本發明另外提供了前述非轉基因瞬時編輯系統作為篩選標記的用途。

本發明另外提供了前述非轉基因瞬時編輯系統在疾病治療中的用途。

本發明另外提供了前述非轉基因瞬時編輯系統在生物育種中的用途。

本發明另外提供了一種採用前述方法獲得的遺傳修飾植物，其基因組中包含第一目標基因的編輯事件，該遺傳修飾植物是非轉基因方式獲得的。

本發明另外提供了一種採用前述方法獲得的遺傳修飾植物，其基因組中包含第一目標基因的編輯事件，還包括至少一個第二目標基因的編輯事件，該遺傳修飾植物是非轉基因方式獲得的。

本發明另外提供了一種採用前述方法獲得的遺傳修飾植物，其基因組中包含至少一個第二靶點基因的編輯事件，該遺傳修飾植物是非轉基因方式獲得的，其中第一目標基因的編輯事件已經過遺傳分離去除。

本發明還提供了採用前述方法獲得的遺傳修飾植物的基因組，該基因組包含：1）第一目標基因的編輯事件；2）第一目標基因的編輯事件和至少一個第二目標基因的編輯事件；或3）至少一個第二靶點基因的編輯事件，其中第一目標基因的編輯事件已經過遺傳分離去除；其中該遺傳修飾植物是非轉基因方式獲得的。

本發明另一方面提供了一種採用前述方法獲得的植物基因新突變。

本發明還提供一種在植物內產生的新突變，其包括以下類型中的一個或兩個以上的組合：對應於擬南芥ALS376位置處的天冬氨酸被任何其他氨基酸取代、ALS574位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代、ALS653位置處的絲氨酸被任何其他氨基酸取代、或ALS654位置處的絲氨酸被任何其他氨基酸取代；或者，對應於大穗看麥娘ACCase2027位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代。

在一具體實施方式中，對應於擬南芥ALS376位置處的天冬氨酸被谷氨酸取代（D376E）、ALS574位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代（W574L或W574M）、ALS653位置處的絲氨酸被天冬醯胺或精氨酸取代（S653N或S653R）、或ALS654位置處的甘氨酸被天冬氨酸取代（G654D），其中，氨基酸的位置以擬南芥中相應氨基酸的序列位置為參照；或者，對應於大穗看麥娘ACCase2027位置處的色氨酸被亮氨酸或半胱氨酸取代（W2027L或W2027C），其中，氨基酸的位置以大穗看麥娘Alopecurus myosuroides中相應氨基酸的序列位置為參照。

在另一具體實施方式中，該突變類型為S653R/G654D，其中，氨基酸的位置以擬南芥中相應氨基酸的序列位置為參照。

在一具體實施方式中，水稻ALS350位置處的天冬氨酸被任何其他氨基酸取代、水稻ALS548位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代、或馬鈴薯ALS2 561位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代；或者，水稻ACCase2 2038位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代。

在另一具體實施方式中，水稻ALS350位置處的天冬氨酸被谷氨酸取代（D350E）、水稻ALS548位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代（W548L或W548M）、或馬鈴薯ALS2 561位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代（W561L或W561M）；或者，水稻ACCase2 2038位置處的色氨酸被亮氨酸或半胱氨酸取代（W2038L或W2038C）。其中，水稻ALS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，馬鈴薯StALS2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，水稻ACCase2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。

本發明另外提供了一種具有該新突變的蛋白或其生物活性片段。

本發明還提供了一種核酸，其包含編碼該蛋白或其生物活性片段的核酸序列或者其互補序列。

本發明另外提供了一種重組表達載體，其包含所述的核酸，以及與之可操作地連接的啟動子。

本發明另外還提供了一種表達盒，其中包含所述的核酸。

本發明另外還提供了一種植物細胞，其中包含有所述的表達盒。

本發明進一步還提供了採用該植物細胞再生成的植物。

本發明另一方面提供了一種生產對於除草劑的抗性或耐受性提高的植物的方法，其中包括所述的植物細胞再生成植物。

本發明另一方面又提供了一種控制植物栽培場所的雜草的方法，其中該植物包括上述的植物或者藉由上述方法製備的植物，該方法包括對該栽培場所施用控制雜草有效量的一種或多種除草劑。

本發明另一方面還提供了該新突變、所述的蛋白或其生物活性片段、所述的核酸、所述的重組表達載體或所述的表達盒在提高植物細胞、植物組織、植物部分或植物的除草劑抗性或耐受性上的應用。本發明具有如下優異技術效果：

根據順次編輯產生的新的修復事件形成的序列，設計新靶點，可以在基因組的特定位置連續多次形成突變，極大的豐富DNA斷裂後修復事件的類型，實現單次基因編輯無法得到的新的鹼基替換、刪除及插入突變。即本發明採用的以在先基因編輯修復序列為在後基因編輯靶點的循環打靶方案，可以賦予CRISPR/Cas藉由簡單敲除實現單鹼基編輯和定點精準刪除和插入的新功能。

本發明能夠實現無外源標記的基因編輯事件篩選，進一步的實現非轉基因的基因編輯並能有效篩選編輯事件，能夠極大減輕該方法在細胞治療和生物育種中應用的生物安全性關切。

尤其是本發明提供的植物非轉基因瞬時編輯方法，只涉及Cas蛋白和人工合成的小片段gRNA或sgRNA，全程無外源DNA參與，藉由連續打靶編輯第一目標基因產生內源抗性篩選標記，能夠有效篩選編輯事件，實質並不涉及轉基因操作，與化學誘變或輻射誘導育種等同，也不需要連續多代的分離檢測外源轉基因成分，能夠縮短育種週期，保證生物安全性，節約監管和審批成本，在植物精準育種中有巨大的應用前景。

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

本文所用術語“基因組”是指存在於生物體的每個細胞或病毒或細胞器中的遺傳物質(基因和非編碼序列)的全部互補物，和/或從一個親本作為一個單位(單倍體)遺傳的完整染色體組。

術語“基因編輯”是指針對活體有機體的任何遺傳資訊或基因組的靶向特異性修飾的策略和技術。因此，術語包括基因編碼區的編輯，但也包括除基因組的基因編碼區之外的區域的編輯。它還包括編輯或改造核(如果存在)以及細胞的其他遺傳資訊。

術語“CRISPR/Cas核酸酶”可以是基於CRISPR的核酸酶或編碼其的核酸序列，包括但不限於：1）Cas9，包括SpCas9，ScCas9，SaCas9，xCas9，VRER-Cas9，EQR-Cas9，SpG-Cas9，SpRY-Cas9，SpCas9-NG，NG-Cas9，NGA-Cas9（VQR）等，2）Cas12，包括LbCpf1，FnCpf1，AsCpf1，MAD7等，或前述基於CRISPR的核酸酶的任何變體或衍生物，較佳其中該至少一個基於CRISPR的核酸酶與相應的野生型序列相比包含突變，使得所獲得的基於CRISPR的核酸酶識別不同的PAM序列。如本文所用，“基於CRISPR的核酸酶”是已經在天然存在的CRISPR系統中鑒定的任何核酸酶，其隨後從其天然背景中分離，並且其較佳已被修飾或組合成感興趣的重組建構體，適合作為靶向基因組工程的工具。只要最初的基於野生型CRISPR的核酸酶提供DNA識別，即結合特性，任何基於CRISPR的核酸酶都可以使用並任選重新編程或另外突變以適合本發明的各種實施方案。

術語“CRISPR”指代依賴於成簇規律間隔短回文重複序列途徑的序列特異性遺傳操縱技術，其不同於RNA干擾在轉錄水準下調節基因表達。

“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互換使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割結構域和/或Cas9的gRNA結合結構域的蛋白)的RNA指導的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的規律間隔的短回文重複序列及其相關系統)基因組編輯系統的組分，能在引導RNA的指導下靶向並切割DNA靶序列形成DNA雙鏈斷裂(DSB)。

“Cas蛋白”或“Cas多肽”是指由Cas(CRISPR-相關的)基因編碼的多肽。Cas蛋白包括Cas內切核酸酶。Cas蛋白可以是細菌或古細菌蛋白。例如，本文中的I-III型CRISPR Cas蛋白通常起源於原核生物；I型和III型Cas蛋白可以源自於細菌或古細菌物種，而II型Cas蛋白(即Cas9)可以源自於細菌種類。Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas5、Cas7、Cas8、Cas10、Cas12a、Cas12b或這些的組合或複合物。

“Cas9變體”或“Cas9內切核酸酶變體”是指親本Cas9內切核酸酶的變體，其中當與crRNA和tracRNA或與sgRNA相締合時，Cas9內切核酸酶變體保留以下能力：識別、結合DNA靶序列的全部或部分並任選地解旋DNA靶序列的全部或部分、使DNA靶序列的全部或部分產生切口、或切割DNA靶序列的全部或部分。Cas9內切核酸酶變體包括本文該Cas9內切核酸酶變體，其中該Cas9內切核酸酶變體不同於親本Cas9內切核酸酶，其方式為：該Cas9內切核酸酶變體(當與gRNA複合以形成能夠修飾靶位點的、多核苷酸指導的內切核酸酶複合物時)與親本Cas9內切核酸酶(與相同的gRNA複合以形成能夠修飾相同靶位點的、多核苷酸指導的內切核酸酶複合物)相比時具有至少一種改善的特性，例如，但不限於，增加的轉化效率、增加的DNA編輯效率、減少的脫靶切割、或其任意組合。

本文所述的Cas9內切核酸酶變體包括當與crRNA和tracrRNA或與sgRNA相締合時可結合雙鏈DNA靶位點並使雙鏈DNA靶位點產生切口的變體，而親本Cas內切核酸酶當與crRNA和tracrRNA或與sgRNA相締合時可在靶位點處結合並使雙鏈斷裂(切割)。

“引導RNA”和“gRNA”在本文中可互換使用，指代用於靶向特定基因從而採用CRISPR技術進行校正的引導RNA序列，通常由部分互補形成複合物的crRNA和tracrRNA分子構成，其中crRNA包含與靶序列具有足夠互補性以便與該靶序列雜交並且指導CRISPR複合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)與該靶序列序列特異性結合的序列。然而，本領域已知可以設計單一引導RNA(sgRNA)，其同時包含crRNA和tracrRNA的特徵。

術語“單一引導RNA”和“sgRNA”在本文中可互換使用，並涉及兩個RNA分子的合成融合，其中包含可變靶向結構域(與tracrRNA雜交的tracr配對序列連接)的crRNA(CRISPRRNA)與tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)融合。sgRNA可以包含可與II型Cas核酸內切酶形成複合物的II型CRISPR/Cas系統的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中該引導RNA/Cas核酸內切酶複合物可以將Cas核酸內切酶引導至DNA靶位點，使得Cas核酸內切酶能夠識別、任選地結合DNA靶位點、並任選地使DNA靶位點產生切口或切割(引入單鏈或雙鏈斷裂)DNA靶位點。

在某些實施方式中，引導RNA(一個或多個)和Cas9可以作為核糖核蛋白(RNP)複合物遞送至細胞。RNP由與gRNA複合的純化的Cas9蛋白組成，並且在本領域中眾所周知RNP可以被有效地遞送到多種類型的細胞中，包括但不限於幹細胞和免疫細胞(Addgene，Cambridge，MA、Mirus Bio LLC，Madison，WI)。

本文中的原間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM) 是指與由gRNA/Cas內切核酸酶系統識別的(靶向的)靶序列(前間隔子)鄰近的短核苷酸序列。如果靶DNA序列不鄰近合適的PAM序列，則Cas內切核酸酶可能無法成功識別該靶DNA序列。本文中的PAM的序列和長度可以取決於所使用的Cas蛋白或Cas蛋白複合物而不同。該PAM序列可以是任何長度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸長度。

如本文所使用的，術語“生物”或“生物體”，包括動物、植物、真菌、細菌等。

如本文所使用的，術語“宿主細胞”，包括植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等。

在本發明中，“動物”包括但不限於脊椎動物，如人類、非人哺乳動物、鳥類、魚類、爬行類、兩棲類等，以及無脊椎動物，如昆蟲等。

在本發明中，“植物”應理解為能夠進行光合作用的任何分化的多細胞生物，特別是單子葉或雙子葉植物，例如：（1）糧食作物：稻屬(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa)、闊葉稻(Oryza latifolia)、水稻(Oryza sativa)、光稃稻（Oryza glaberrima)；小麥屬(Triticum spp.)，例如普通小麥(Triticum aestivum)、硬粒小麥(T.Turgidumssp.durum); 大麥屬(Hordeum spp.)，例如大麥(Hordeum vulgare)、亞利桑那大麥（Hordeum arizonicum）；黑麥 (Secale cereale)；燕麥屬(Avena spp.)，例如燕麥(Avena sativa)、野燕麥(Avena fatua)、比贊燕麥(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、雜種燕麥(Avena hybrida)；稗屬(Echinochloa spp.)，例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、高粱(兩色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黑小麥、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、穀子、糜子、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、黍子、蕎麥屬(Fagopyrum spp.)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、沼生菰(Zizania palustris)、埃塞俄比亞畫眉草(Eragrostis tef)、稷(Panicum miliaceum)、龍爪稷(Eleusine coracana)；（2）豆類作物：大豆屬(Glycine spp.)，例如大豆(Glycine max)、黃豆(Soja hispida)、Soja max)、野豌豆屬(Vicia spp.)、豇豆屬(Vigna spp.)、豌豆屬(Pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆屬(Lupinus spp.)、蠶豆屬(Vicia)、酸豆(Tamarindus indica)、兵豆(Lens culinaris)、山黧豆屬(Lathyrus spp.)、扁豆屬(Lablab)、蠶豆、綠豆、紅豆、鷹嘴豆；（3）油料作物：花生(Arachis hypogaea)、落花生屬(Arachis spp)、胡麻屬(Sesamum spp.)、向日葵屬(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、油棕屬(Elaeis)(例如油棕 (Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、大豆(soybean)、油菜（Brassicanapus）、芸苔、芝麻、芥菜（Brassicajuncea）、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄欖、蓖麻、歐洲油菜 ( Brassica napus L. )、卡諾拉油菜（canola）；（4）纖維作物：劍麻(Agave sisalana)、棉屬 (棉花、海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum) )、紅麻、劍麻、蕉麻、亞麻(Linum usitatissimum)、黃麻、苧麻、大麻(Cannabis sativa)、火麻；（5）水果類作物：棗屬(Ziziphus spp.)、香瓜屬(Cucumis spp.)、雞蛋果(Passiflora edulis)、葡萄屬(Vitis spp.)、越桔屬(Vaccinium spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、李屬 (Prunus spp.)、番石榴屬(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、蘋果屬(Malus spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔屬(Citrus spp.)、無花果(Ficus carica)、金桔屬 (Fortunella spp.)、草莓屬(Fragaria spp.)、山楂屬(Crataegus spp.)、柿樹屬(Diospyros spp.)、紅仔果(Eugenia unifora)、枇杷(Eriobotrya japonica)、龍眼(Dimocarpus longan)、番木瓜(Carica papaya)、椰子屬(Cocos spp.)、陽桃 (Averrhoa carambola)、猻猴桃屬(Actinidia spp.)、扁桃(Prunus amygdalus)、芭蕉屬(Musa spp.)（香蕉）、鱷梨屬(Persea spp.)（鱷梨(Persea americana)）、番石榴(Psidium guajava)、曼密蘋果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、橄欖(油橄欖(Oleaeuropaea))、番木瓜(Caricapapaya) 、椰子(Cocos nucifera)、凹緣金虎尾(Malpighia emarginata)、人心果(Manilkara zapota)、菠蘿(Ananas comosus)、番荔枝屬(Annona spp.)、柑桔樹(柑桔屬物種(Citrus spp.))、波羅蜜屬(Artocarpus spp.)、荔枝(Litchi chinensis)、茶藨子屬(Ribes spp.)、懸鉤子屬(Rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、楊梅、檸檬、金橘、榴蓮、橙、草莓(straw berry)、藍莓、哈密瓜、甜瓜、椰棗、胡桃樹、櫻桃樹；（6）根莖類作物：木薯屬(Manihot spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、芋 (Colocasia esculenta)、榨菜、洋蔥、荸薺、油莎草、山藥；（7）蔬菜類作物：菠菜屬(Spinacia spp.)、菜豆屬(Phaseolus spp.)、萵苣(Lactuca sativa)、苦瓜屬(Momordica spp)、歐芹 (Petroselinum crispum)、辣椒屬(Capsicum spp.)、茄屬(Solanum spp.) (例如馬鈴薯(Solanum tuberosum)、紅茄(Solanum integrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、蕃茄屬(Lycopersicon spp.) (例如西紅柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄 (Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆屬(Macrotyloma spp.)、無頭甘藍(kale)、棱角絲瓜(Luffa acutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵 (okra)、洋蔥(onion)、馬鈴薯(potato)、洋薊(artichoke)、蘆筍(asparagus)、西蘭花(broccoli)、球芽甘藍(Brussels sprouts)、捲心菜(cabbage)、胡蘿蔔(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘藍(collard greens)、西葫蘆 (squash)、冬瓜(Benincasa hispida)、石刁柏(Asparagus officinalis)、旱芹(Apium graveolens)、莧屬(Amaranthus spp.)、蔥屬(Allium spp.)、秋葵屬(Abelmoschus spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、南瓜屬(Cucurbita spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、埃塞俄比亞芥（B.carinata）、蘿蔔(Rapbanus sativus)、芸苔屬(Brassica)物種(例如例如歐洲油菜(Brassica napus)、蕪菁亞種(Brassica rapa ssp.)、卡諾拉油菜(canola)、油籽油菜 (oilseed rape)、蕪菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘藍、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘藍、茄科植物（茄子）、甜椒、黃瓜、絲瓜、白菜、油菜、甘藍、葫蘆、韭菜、蓮、藕、生菜；（8）花卉作物：小金蓮花(Tropaeolum minus)、金蓮花 (Tropaeolum majus)、美人蕉(Canna indica)、仙人掌屬(Opuntia spp.)、萬壽菊屬(Tagetes spp.)、蘭花、文殊蘭、君子蘭、朱頂紅、玫瑰、月季、茉莉花、鬱金香、櫻花、牽牛花、金盞花、荷花、雛菊、康乃馨、矮牽牛花、鬱金香、百合、梅花、水仙、迎春、報春、瑞香、山茶、白玉蘭、紫玉蘭、瓊花、君子蘭、海棠、牡丹、芍藥、丁香、杜鵑、西洋杜鵑、含笑、紫荊、棣棠、錦帶花、連翹、雲南黃馨、金雀花、仙客來、蝴蝶蘭、石斛、風信子、鳶尾、馬蹄蓮、金盞菊、百枝蓮、四季海棠、吊鐘海棠、竹節海棠、天竺葵、綠蘿；（9）藥用作物：紅花(Carthamus tinctorius)、薄荷屬(Mentha spp.)、波葉大黃(Rheum rhabarbarum)、番紅花(Crocus sativus)、枸杞、玉竹、黃精、知母、麥冬、貝母、鬱金、砂仁、何首烏、大黃、甘草、黃芪、人參、三七、五加、當歸、川芎、北柴胡、曼佗羅、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黃芩、夏枯草、除蟲菊、銀杏、金雞納樹、天然橡膠樹、苜蓿、胡椒、板藍根、白術；（10）原料作物：橡膠、蓖麻(Ricinus communis)、油桐、桑、忽布、樺、榿木、漆樹；（11）牧草作物：冰草屬(Agropyron spp.)、車軸草屬(Trifolium spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、狼尾草屬(Pennisetum sp.)、虉草(Phalaris arundinacea)、柳枝稷(Panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草 (Indiangrass)、大須芒草(Big bluestem grass)、梯牧草(Phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科（高山嵩草、腳苔草(Carex pediformis）、低苔草）、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫雲英、檉麻、田菁、紅萍、水葫蘆、紫穗槐、羽扇豆、三葉草、沙打旺、水浮蓮、水花生、黑麥草；（12）糖料作物：甘蔗(甘蔗屬物種(Saccharum spp.))、甜菜(Beta vulgaris)；（13）飲料作物：大葉茶(Camellia sinensis)、茶(Camellia Sinensis)、茶樹(tea)、咖啡(咖啡屬物種(Coffea spp.))、可可樹 (Theobroma cacao)、蛇麻花（啤酒花）；（14）草坪植物：固沙草(Ammophila arenaria)、早熟禾屬(Poa spp.)（草地早熟禾(Poa pratensis)(藍草)）、剪股穎屬物種(Agrostis spp.)(剪股穎、匍匐剪股穎（Agrostis palustris）)、黑麥草屬物種(Lolium spp.)(黑麥草)、羊茅屬物種(Festuca spp.) (羊茅)、結縷草屬物種(Zoysia spp.)(結縷草（Zoysiajaponica）)、狗牙根屬物種(Cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、側鈍葉草(Stenotaphrum secunda tum)(聖奧古斯丁草)、雀稗屬物種(Paspalum spp.)(巴哈草)、假儉草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草屬物種(Axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草屬變種物種 (Bouteloua var.spp.)(格蘭馬草) 、馬唐（Digitariasanguinalis）、香附子（Cyperusrotundus）、短葉水蜈蚣（Kyllingabrevifolia）、阿穆爾莎草（Cyperusamuricus）、加拿大飛蓬（Erigeroncanadensis）、天胡荽（Hydrocotylesibthorpioides）、雞眼草（Kummerowiastriata）、地錦（Euphorbiahumifusa）、耕地堇菜（Violaarvensis）、白穎苔草、異穗苔草、草皮草（turf）；（15）樹木作物：松屬(Pinus spp.)、柳屬(Salix sp.)、槭樹屬(Acer spp.)、木槿屬(Hibiscus spp.)、桉屬(Eucalyptus sp.)、銀杏(Ginkgo biloba)、箣竹屬(Bambusa sp.)、楊屬(Populus spp.)、牧豆樹屬(Prosopis spp.)、櫟屬(Quercus spp.)、刺葵屬(Phoenix spp.)、山毛櫸屬 (Fagus spp.)、吉貝(Ceiba pentandra)、樟屬(Cinnamomum spp.)、黃麻屬(Corchorus sp.)、南方蘆葦(Phragmites australis)、酸漿屬(Physalis spp.)、山螞蝗屬(Desmodium spp.)、楊、常春藤、白楊、珊瑚樹、銀杏、櫟類、臭椿、木荷、冬青、懸鈴木、女貞、大葉黃揚、落葉松、黑荊樹、馬尾松、思茅松，雲南松、南亞松、油松、紅松、黑胡桃、檸檬、懸鈴木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荊、羊蹄甲、雨樹、合歡、龍牙花、刺桐、廣玉蘭、蘇鐵、紫薇、針葉樹、喬木、灌木；（16）堅果作物：巴西栗 (Bertholletia excelsea)、栗屬(Castanea spp.)、榛屬(Corylus spp.)、山核桃屬 (Carya spp.)、核桃屬(Juglans spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲堅果(全緣葉澳洲堅果(Macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、開心果、巴旦木以及產生堅果的植物；（17）其他：擬南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、Cadaba farinosa、藻類(algae)、Carex elata、觀賞植物、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、菜薊屬(Cynara spp.)、野胡蘿蔔(Daucus carota)、薯蕷屬(Dioscorea spp.)、蔗茅屬(Erianthus sp.)、葦狀羊茅(Festuca arundinacea)、萱草 (Hemerocallis fulva)、百脈根屬(Lotus spp.)、Luzula sylvatica、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨屬(Melilotus spp.)、黑桑(Morus nigra)、煙草屬(Nicotiana spp.)、木犀欖屬(Olea spp.)、鳥足豆屬(Ornithopus spp.)、歐防風(Pastinaca sativa)、接骨木屬(Sambucus spp.)、白芥屬(Sinapis sp.)、蒲桃屬 (Syzygium spp.)、鴨茅狀摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、香堇(Viola odorata)等。

在一具體實施方式中，該植物選自水稻、玉米、小麥、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麥、穀子、甘蔗、番茄、煙草、木薯、馬鈴薯、甘薯、白菜、甘藍、黃瓜、月季、綠蘿、西瓜、甜瓜、草莓、藍莓、葡萄、蘋果、柑橘、桃、梨、香蕉等。

如本文所使用的，術語“植物”包括整個植物和任何後代、植物的細胞、組織、或部分。術語“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限於：種子(包括成熟種子、沒有種皮的未成熟胚、和不成熟的種子)；植物插條(plant cutting)；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果實、芽、葉、根、莖，和相關外植體)。植物組織或植物器官可以是種子、愈傷組織、或者任何其他被組織成結構或功能單元的植物細胞群體。植物細胞或組織培養物能夠再生出具有該細胞或組織所來源的植物的生理學和形態學特徵的植物，並能夠再生出與該植物具有基本上相同基因型的植物。與此相反，一些植物細胞不能夠再產生植物。植物細胞或組織培養物中的可再生細胞可以是胚、原生質體、分生細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、絲、花、果仁、穗、穗軸、殼、或莖。

植物部分包括可收穫的部分和可用於繁殖後代植物的部分。可用於繁殖的植物部分包括，例如但不限於：種子；果實；插條；苗；塊莖；和砧木。植物的可收穫部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限於：花；花粉；苗；塊莖；葉；莖；果實；種子；和根。

植物細胞是植物的結構和生理單元。如本文所使用的，植物細胞包括原生質體和具有部分細胞壁的原生質體。植物細胞可以是處於分離的單個細胞或細胞聚集體的形式(例如，鬆散愈傷組織和培養的細胞)，並且可以是更高級組織單元(例如，植物組織、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物細胞可以是原生質體、產生配子的細胞，或者能夠再生成完整植物的細胞或細胞的集合。因此，在本文的實施方案中，包含多個植物細胞並能夠再生成為整株植物的種子被認為是一種“植物部分”。

如本文所使用的，術語“原生質體”是指細胞壁被完全或部分地除去、其脂雙層膜裸露的植物細胞。典型地，原生質體是沒有細胞壁的分離植物細胞，其具有再生成細胞培養物或整株植物的潛力。

植物“後代”包括植物的任何後續世代。

術語“細菌”意旨所有的原核生物，包括原核生物界（Kingdom Procaryotae）中的所有生物。術語“細菌”包括認為是細菌的所有微生物，包括支原體屬(Mycoplasma)、衣原體屬(Chlamydia)、放線菌屬(Actinomyces)、鏈黴菌屬(Streptomyce)和立克次氏體屬(Rickettsia)。所有形式的細菌均包括在該定義內，包括球菌、桿菌、螺旋菌、原生質球、原生質體等。在該術語中還包括為革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的原核生物。“革蘭氏陰性”和“革蘭氏陽性”意指使用本領域眾所周知的革蘭氏染色法的染色模式(例如參見Finegold和Martin，Diagnostic Microbiology，6th Ed.，CV MosbySt.Louis，pp.13-15[1982])。“革蘭氏陽性菌”為保留用於革蘭氏染色的原染料的細菌，導致染色的細胞在顯微鏡下表現出深藍色至紫色。“革蘭氏陰性菌”不保留用於革蘭氏染色的原染料，但被覆染劑染色。因此，革蘭氏陰性菌在革蘭氏染色反應後呈紅色。

本文所用的術語“真菌”用以指真核生物，諸如黴菌和酵母，包括雙態性真菌。

“除草劑耐受性”和“除草劑抗性”兩個術語可以互換使用，均指的是對除草劑的耐受性和對除草劑的抗性。“除草劑耐受性提高”和“除草劑抗性提高”是指對該除草劑的耐受性或抗性與含有野生型基因的植物相比提高。

術語“野生型”指的是可以在自然界中被發現存在的核酸分子或蛋白質。

在本發明中，術語“場所”包括栽培本發明植物的場地例如土壤，也包括例如植物種子、植物苗以及長成的植物。術語“控制雜草有效量”指的是除草劑的量足以影響目標雜草的生長或發育，例如阻止或抑制目標雜草的生長或發育，或者殺滅該雜草。有利地，該控制雜草有效量不會顯著影響本發明植物種子、植物苗或植物的生長和/或發育。本領域技術人員可以藉由常規實驗確定這樣的控制雜草有效量。

如本文所使用的“靶DNA”為包含“靶位點”或“靶序列”的DNA多核苷酸。

“裂解”意指DNA分子的共價骨架的斷裂。可藉由各種各樣的方法來開始裂解，該方法包括但不限於磷酸二酯鍵的酶水解或化學水解。單鏈裂解和雙鏈裂解均是可能的，並且雙鏈裂解可由於兩個相異單鏈裂解事件而發生。DNA裂解可導致平端或交錯端產生。在某些實施方案中，包含靶向DNA的RNA和定點修飾多肽的複合物用於靶向的雙鏈DNA裂解。

術語“基因”包括表達功能性分子(諸如但不限於，特定蛋白質)的核酸片段，包括在編碼序列之前(5’非編碼序列)和之後(3’非編碼序列)的調節序列。

“編碼”具體RNA的DNA序列為轉錄成RNA的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可編碼翻譯成蛋白質的RNA(mRNA)，或DNA多核苷酸可編碼不翻譯成蛋白質的RNA(例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；又稱為“非編碼”RNA或“ncRNA”)。

“多肽”、“肽”和“蛋白”在本發明中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用於其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及適用於天然存在的氨基酸聚合物。術語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”還可包括修飾形式，包括但不限於糖基化、脂質連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥化和ADP-核糖基化。

“生物活性片段”是指從蛋白質的N和/或C末端缺失一或多個氨基酸殘基而仍保留其功能活性的片段。

對於說明書中所用的有關氨基酸取代的術語，第一個字母代表特定序列某一位置上天然存在的氨基酸，後面的數字代表該對應序列中的位置，第二個字母代表取代該天然氨基酸的不同氨基酸。譬如W574L表示第574位的色氨酸被亮氨酸取代。對於雙重或多重突變，各突變之間以“/”隔開。

術語“多核苷酸”和“核酸”可以互換使用，包括 DNA、RNA 或者其雜交體，可以是雙鏈或單鏈的。

術語“核苷酸序列”和“核酸序列”均是指DNA或RNA中鹼基的排列順序。

如本發明所用，“表達盒”、“表達載體”和“表達建構體”是指適於感興趣的核苷酸序列在植物中表達的載體如重組載體。“表達”指功能產物的產生。例如，核苷酸序列的表達可指核苷酸序列的轉錄(如轉錄生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質。

本發明的“表達建構體”可以是線性的核酸片段、環狀質粒、病毒載體，或者，在一些實施方式中，可以是能夠翻譯的RNA(如mRNA)。

本發明的“表達建構體”可包含不同來源的調控序列和感興趣的核苷酸序列，或相同來源但以不同於通常天然存在的方式排列的調控序列和感興趣的核苷酸序列。

術語“重組表達載體”或“DNA建構體”在本文中可互換使用，是指包含載體和至少一個插入物的DNA分子。通常出於表達和/或繁殖插入物的目的或出於建構其它重組核苷酸序列而產生重組表達載體。插入物可以可操作的或可以不可操作地連接至啟動子序列並且可以可操作的或可以不可操作地連接至DNA調節序列。

“調控序列”和“調控元件”可互換使用，指位於編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，並且影響相關編碼序列的轉錄、RNA 加工或穩定性或者翻譯的核苷酸序列。植物表達調控元件指的是能夠在植物中控制感興趣的核苷酸序列轉錄、RNA加工或穩定性或者翻譯的核苷酸序列。

調控序列可包括但不限於啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列。

“啟動子”指能夠控制另一核酸片段轉錄的核酸片段。在本發明的一些實施方案中，啟動子是能夠控制植物細胞中基因轉錄的啟動子，無論其是否來源於植物細胞。啟動子可以是組成型啟動子或組織特異性啟動子或發育調控啟動子或誘導型啟動子。

“組成型啟動子”指一般將引起基因在多數細胞類型中在多數情況下表達的啟動子。“組織特異性啟動子”和“組織較佳啟動子”可互換使用，並且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達，而且也可在一種特定細胞或細胞型中表達的啟動子。“發育調控啟動子”指其活性由發育事件決定的啟動子。“誘導型啟動子”響應內源性或外源性刺激(環境、激素、化學訊號等)而選擇性表達可操縱連接的DNA序列。

如本文中所用，術語“可操作地連接”指調控元件(例如但不限於，啟動子序列、轉錄終止序列等)與核酸序列(例如，編碼序列或開放讀碼框)連接，使得核苷酸序列的轉錄被該轉錄調控元件控制和調節。用於將調控元件區域可操作地連接於核酸分子的技術為本領域已知的。

將核酸分子(例如質粒、線性核酸片段、RNA等)或蛋白質“導入”植物是指用該核酸或蛋白質轉化植物細胞，使得該核酸或蛋白質在植物細胞中能夠發揮功能。本發明所用的“轉化”包括穩定轉化和瞬時轉化。

“穩定轉化”指將外源核苷酸序列導入植物基因組中，導致外源基因穩定遺傳。一旦穩定轉化，外源核酸序列穩定地整合進該植物和其任何連續世代的基因組中。

“瞬時轉化”指將核酸分子或蛋白質導入植物細胞中，執行功能而沒有外源基因穩定遺傳。瞬時轉化中，外源核酸序列不整合進植物基因組中。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語具有與藉由本發明所屬領域中的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然還可在本發明的實踐或測試中使用類似於或等同於本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但現在描述較佳的方法和材料。

本說明書中引用的所有出版物和專利以引用的方式併入本文如同每個單獨的出版物或專利均確切地和單獨地指出以引用的方式併入一樣，並且以引用的方式併入本文以揭露和描述與出版物所引用的相關的方法和/或材料。任何出版物的引用為其揭露在申請日之前並且不應該解釋為承認本發明沒有資格先於現有發明的這種出版物。此外，所提供的出版日期可與實際出版日期不同，這可能需要獨立證實。

除非具體說明或暗示，如本文中所用，術語“一”、“一個/一種”和“該”表示“至少一個”。本文提到或引用的所有專利、專利申請和出版物整體引入本文作為參考，其引用程度如同單獨地個別引用一樣。

以下結合實例，對本發明作進一步說明。下面的說明是採用舉例的方式，但是本發明的保護範圍不應局限於此。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常用分子生物學、組織培養技術和農學手冊所記載的方法。例如，具體步驟可參見：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition)》（Sambrook，J.，Russell, David W.， 2001，Cold Spring Harbor），《Plant Propagation by Tissue Culture》(Edwin F. George, Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk, 2008, Springer)。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1 針對擬南芥ALS基因W574及S653位點循環打靶設計可預期的鹼基替換 A．實驗材料

1.擬南芥材料擬南芥Col-0野生型為雙子葉植物模式品種，原始種子由中國農業大學植物保護學院雜草學教研室提供，本實驗室按照本領域標準方法擴繁保存。

2.載體 pCBC-dT1T2（Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1):327具體資訊見https://www.addgene.org/50590/）、pHEE401E（具體資訊見Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ Genome Biol. 2015 Jul 21;16:144. doi: 10.1186/s13059-015-0715-0. https://www.addgene.org/71287/）、pHEE401E-NG （將Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129報道中的突變引入到pHEE401E中，建構成識別NG PAM的載體pHEE401E-NG）載體質粒可自Addgene網站商購獲得或由本實驗室按照常規分子生物學方法建構，並由本實驗室保存。

3.主要儀器設備移液槍、水浴鍋、PCR儀（Bio-rad T100）、電泳儀（威克斯WIX-EP600）、凝膠成像儀、電熱鼓風乾燥機、離心機（Eppendorf 5424R）、高通量組織破碎儀、搖床、電子天平、pH計等。

4.主要試劑高保真DNA聚合酶（購自Tsingke生物）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質粒提取試劑盒（購自思科捷）、BsaI與T4 DNA連接酶（購自NEB）、Trans5α感受態細胞與EHA105感受態細胞（購自北京全式金），GV3101農桿菌感受態（購自上海昂羽生物），Tris、EDTA、卡那黴素、頭孢抗生素、潮黴素、瓊脂糖、酵母粉、胰蛋白腖、NaCl（購自生工生物）、MS粉末、蔗糖、Silwet-77、潮黴素（購自索萊寶公司），核酸染料（Dured）、無水乙醇（購自國藥）等。

5.主要溶液配置 1）種子消毒液：4mL 10%SDS，20mL NaClO，加水定容至200mL。 2）SDS提取緩衝液：40mL 1M Tris ▪HCl（pH 8.0），50mL 0.1M EDTA，10mL 5M NaCl，10mL 10%SDS，加水定容至200mL。 3）侵染液：蔗糖1.5g，Silwet-77 9μL，加入30mL 超純水。 4）LB固體培養基：酵母粉5g，胰蛋白腖10g，NaCl 10g，瓊脂15g，加水定容至1L，121℃滅菌15分鐘後倒平板備用。 5）50×TAE母液：Tris 242g，Na₂ EDTA ▪2H₂ O 37.2g，加入800mL超純水，充分攪拌溶解，加入57.1mL醋酸，充分攪拌，最後用去離子水定容至1L，室溫保存。 6）MS固體培養基：稱取4.42g MS粉末，10g蔗糖，加入800mL 超純水，調pH至5.8，加水定容至1L，加入10g植物凝膠，121℃滅菌15分鐘後倒平板備用。 B．實驗方法

1. CRISPR/Cas9雙靶點載體設計與建構 1.1靶點設計擬南芥ALS基因序列如SEQ ID NO: 2所示，以擬南芥ALS574位點附近AGA為PAM設計19個鹼基的靶點序列gRNA1: 5’-GCATGGTTATGCAATGGGA-3’，預測經過編輯後在PAM前3-4位之間會刪除一個鹼基G，然後以刪除後的序列設計第二個靶點序列gRNA2: 5’-GGCATGGTTATGCAATGGA-3’，預測經過第二次編輯會插入一個鹼基T，從而實現TGG-TTG的轉換，如圖2所示。同樣的，以擬南芥ALS653位點附近TGG為PAM設計19個鹼基的靶點序列gRNA3: 5’- TGCCGATGATCCCGAGTGG-3’，預測經過編輯後在PAM前3-4位之間會刪除一個鹼基G，然後以刪除後的序列設計第二個靶點序列gRNA4: 5’- TTGCCGATGATCCCGATGG-3’，預測經過第二次編輯會插入一個鹼基A，從而實現AGT-AAT的轉換，如圖2所示。 1.2載體建構按照Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1):327中該方法進行。具體而言，以dT1T2質粒為模板分別擴增ALS574與653位點雙靶點片段，建構sgRNA表達盒。BsaI酶切pHEE401E、pHEE401E-NG載體骨架，切膠回收，目的片段經酶切後直接用於連接反應。採用T4 DNA連接酶連接載體骨架與目的片段，轉化連接產物至Trans5α感受態細胞，挑取不同的單植株測序，測序正確後利用思科捷高純度質粒小量提取試劑盒抽提質粒，得到重組質粒，分別命名為pQY743、pQY745。

2. 靶點檢測引物的設計靶點檢測引物以ALS574、ALS653靶點為中心，上游檢測引物距ALS574靶點約100bp左右，下游檢測引物距ALS653靶點約280bp。引物序列574/653checking-F：5’ AT- TGACGGAGATGGAAGCTT3’， 574/653checking-R：5’CCAAACTGAGCCAGTCACAA3'。

3. 擬南芥遺傳轉化體系的建立 3.1農桿菌轉化將建構好的重組質粒轉化農桿菌GV3101感受態細胞，得到重組農桿菌。 3.2農桿菌侵染液的製備 1）挑取活化的農桿菌接種於30ml YEP液體培養基(含25mg/L Rif和50mg/L Kan)中，28℃ 200 轉/分鐘振盪培養過夜至OD600值為1.0-1.5左右。 2）6000 轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，棄上清。 3）用侵染液（無須調節pH）重新懸浮菌體至OD600=0.8左右備用。 3.3擬南芥轉化 1）植株轉化之前注意植株是否生長良好，花序茂盛，無脅迫反應，第一次轉化株高20釐米即可進行。若土壤乾燥可適當澆一些水。轉化前一天用剪刀將已長出的角果剪去。 2）將待轉化植株花序浸泡於上述溶液中30秒-1分鐘，期間輕輕攪動，浸潤後的植株上應該有一層液體膜。 3）轉化完成後植株放於黑暗環境中暗培養24小時，然後取出放於正常光照環境下生長。 4）一週以後即可按同樣的方法進行第二次轉化。 3.4種子收穫待種子成熟後即可進行收穫，收穫後置於37℃烘箱一週左右烘乾種子。

4. 轉基因植株的篩選種子經過消毒液處理5分鐘，用去離子水洗5遍後均勻鋪於MS篩選培養基（含30μg/mL 潮黴素、100μg/mL 頭孢黴素）上，將培養基放於光照培養箱培養（溫度22℃，16小時光照，8小時黑暗，光照強度100-150μmol/m² /s，濕度75%），一週後選取陽性幼苗移栽至土壤。

5. T1突變植株的檢測 5.1基因組DNA提取 1）剪取擬南芥葉片約於2mL離心管中，加入鋼珠，利用高通量組織破碎儀進行葉片研磨。 2）待研磨充分後，加入400μL SDS提取緩衝液，上下顛倒混勻，置於65℃水浴鍋中孵育15分鐘，期間每隔5分鐘顛倒混勻一次。 3）13000轉/分鐘離心5分鐘。 4）吸取300μL上清液轉移至一新的1.5mL離心管中，向離心管中加入等體積經過-20℃預冷的異丙醇，將離心管置於-20℃ 1小時或者過夜。 5）13000轉/分鐘離心10分鐘，去掉上清液。 6）向離心管中加入500μL 70%乙醇洗滌沉澱，離心後倒掉洗滌液（注意不要倒掉沉澱），置於室溫晾乾後，加入30μL超純水溶解DNA，置於-20℃保存DNA。 5.2 PCR擴增以提取的T1植株基因組為模板，用檢測引物進行靶點片段擴增，吸取5μL擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，並經凝膠成像儀成像，剩餘產物交由測序公司直接進行測序。

6. T2突變植株的檢測單株收穫T1株系的種子後，選取兩個載體不同株系的種子鋪於甲咪唑煙酸篩選培養基（MS培養基+0.24μg/mL甲咪唑煙酸）上進行篩選，一週後移栽陽性幼苗至土壤並進行分子檢測，方法同步驟5。所用引物及序列：

引物名稱	序列（5’-3’）
ALS574-F	ATATATGGTCTCGATTGGCATGGTTATGCAATGGGAGTTTTAGAGCTAGAAATA
ALS574-R	ATTATTGGTCTCGAAACTCCATTGCATAACCATGCCCAATCTCTTAGTCGACTC
ALS653-F	ATATATGGTCTCGATTGTGCCGATGATCCCGAGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATA
ALS653-R	ATTATTGGTCTCGAAACCCATCGGGATCATCGGCAACAATCTCTTAGTCGACTC
ALS574/653checking-F	ATTGACGGAGATGGAAGCTT
ALS574/653checking-R	CCAAACTGAGCCAGTCACAA

C．試驗結果

1. T1植株基因型檢測 T1種子經過MS潮黴素抗性培養基篩選，pQY743載體共得到32株陽性苗，pQY745載體共得到18株陽性苗。每個載體選擇10株幼苗提取葉片基因組DNA檢測靶點，發現ALS574位點T1代均未發生編輯，而ALS653位點均有符合設計預期的編輯事件發生。檢測結果如表1所示：表1 T1植株突變類型

ALS位點	載體編號	T1植株編號	編輯類型
574	pQY743	1-10	WT
653	pQY745	3,4-8,10	嵌合體
1,2,9	雜合體

2. T2代種子篩選結果單株收穫T2代種子後，鋪於甲咪唑煙酸抗性培養基篩選，可以看到野生型Col-0在抗性培養基上不能生長，突變株系陽性植株在抗性培養基上能夠正常生長，如圖3所示。每個載體選擇10株幼苗取葉片提取基因組DNA進行分子檢測，發現pQY743載體有6株發生了符合預期的純合突變，由TGG變為TTG，如圖4所示。另有1株為雜合突變，3株為嵌合突變。檢測結果如表2所示。表2 T2植株突變類型

ALS位點	載體編號	T2植株編號	編輯類型
574	pQY743	2,3,5,6,7,9	純合體
4	雜合體
1,8,10	嵌合體

以上結果表明，使用本發明順次連續打靶的技術方案，可以實現對目標位點設計預期突變並實現，能夠藉由設計有先後順序的sgRNA的組合僅需Cas9蛋白即可實現鹼基替換突變。實施例2 針對擬南芥ALS基因W574及S653位點循環打靶實現多種突變類型

載體設計，建構，擬南芥轉化篩選操作步驟參照實施例1，對AtALS W574位點，設計載體與實施例1相同，載體示意圖見圖5，藉由在特定位置先-G再+T，預期實現W574L突變。載體轉化擬南芥在T1代未檢測到編輯事件，對轉基因擬南芥T2代使用0.24 mg/L甲咪唑煙酸篩選，得到大量抗除草劑植株，如圖6左側所示，對這些抗性植株進行分子檢測，PCR產物測序結果顯示，W574位點不僅出現了預期的W574L突變，也出現了另外一種抗性突變W574M，見圖6右側。

對AtALS S653位點，設計載體與實施例1相同，載體示意圖見圖7，藉由在特定位置先-G再+A，預期實現S653N突變。載體轉化擬南芥在T1代檢測到S653N的預期編輯事件，對轉基因擬南芥T2代繼續使用0.24 mg/L甲咪唑煙酸篩選，得到大量抗除草劑植株，如圖8左側所示，對這些抗性植株進行分子檢測，PCR產物測序結果顯示，S653位點不僅出現了預期的S653N突變，也出現了另外兩種抗性突變S653R、S653R/G654D，見圖8右側。

以上結果表明，使用本發明順次連續打靶的技術方案，藉由設計有先後順序的sgRNA的組合僅需配套Cas9蛋白，除實現對目標位點設計的預期突變外，還能夠產生多種功能突變類型，適合作為一種創制新功能突變的工具。實施例3 針對擬南芥ALS基因W574位點附近利用不同的PAM進行循環打靶產生 W574M抗性突變

載體設計，建構，擬南芥轉化篩選操作步驟參照實施例1，與實施例1不同之處在於，對AtALS W574位點附近序列5’CTTGGCATGGTTATGCAATGg g 3’首先以更靠近W574位點的GG為PAM，設計sgRNA1：5’CTTGGCATGGTTATGCAATG3’帶下劃線為W574位點，斜體為NG PAM，預測切割修復將+A後形成新序列 5’CTTGGCATGGTTATGCAAATGG GAag 3’，以AG為新的PAM位點設計sgRNA2：5’CTTGGCATGGTTATGCAAATGGGA3’，經過細胞自發修復形成-G的基因型，導致W574M，即本方案中兩次切割使用了不同的PAM位點，載體示意圖見圖9。使用該載體轉化擬南芥，對T1代轉基因株系進行基因型檢測，從中檢測到W574M的預期編輯事件，植株表現對甲咪唑煙酸處理的抗性。

結果表明，使用本發明的技術方案，利用不同的PAM進行循環打靶編輯，能夠在更寬的序列範圍內進行編輯，實現氨基酸替換。實施例4 針對水稻ALS基因D350和W548位點設計可預期的鹼基替換

將Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129報道中的突變引入到pHUE411（A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327. 10.1186/s12870-014-0327-y具體資訊見https://www.addgene.org/71287/）中，建構成識別NG PAM的載體pHUE411-NG。

水稻ALS基因序列如SEQ ID NO: 12所示，以5’GGCGTGCGGTTTGATGAT CG3’（帶下劃線為對應擬南芥ALS-D376的OsALS-D350位點）和預測在先編輯後生成的新序列5’GGCGTGCGGTTTGATGACG3’為靶點，按照Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014該方法，建構雙靶點載體，預期實現GAT-GAA的轉換，產生OsALS D350E突變。以5’GGTATGGTTGTGCAATGG GA3’（帶下劃線為對應擬南芥ALS-W574的OsALS-W548位點）和預測在先編輯後生成的新序列5’ GGTATGGTTGTGCAATGGA 3’為靶點，建構雙靶點載體，預期實現TGG-TTG的轉換，產生OsALS W548L突變。

然後將這兩個載體轉入水稻，獲得轉基因植株，鑒定獲得了預期替換的D350E和W548L的植株。田間抗除草劑生測實驗結果表明，D350E和W548L突變體獲得了對ALS抑制劑類除草劑的抗性。實施例5 針對水稻ACCase2基因W2038位點設計可預期的鹼基替換及篩選多種突變類型

水稻ACCase2基因序列如SEQ ID NO: 14所示，OsACCase2 W2038位點對應大穗看麥娘ACCase W2027位點，以靠近該位點的AGG為PAM設計sgRNA1: 5’TTCATCCTCGCTAAC- TGGAG3’，預測切割修復將-G後形成新序列，繼續以AGG為PAM設計sgRNA2：5’CTTC- ATCCTCGCTAACTGAG3’，再次切割修復後形成+T的基因型，導致W2038L突變，將sgRNA1和sgRNA2建構到pHUE411載體上形成編輯載體，載體示意圖見圖10。

編輯載體轉化水稻品種淮稻5號愈傷組織，經50 μg/L潮黴素和50 μg/L精喹禾靈共篩選3週後，出現了大量抗性愈傷，如圖11左側所示，取抗性愈傷進行基因型鑒定，發現不僅出現了預期的W2038L突變，也出現了W2038C突變，如圖11右側所示。

以上對水稻基因循環打靶的結果說明本發明的技術方案在單雙子葉植物中均適用。實施例6 SpCas9和NGA-Cas9蛋白的表達純化

1. 試驗儀器試劑表3 試驗儀器

試劑	配製及使用方法
Q5 DNA 聚合酶	購買自NEB
I5 DNA 聚合酶及I5反應液	購買自Tsingke生物
dNTP	上海生工
Ni-NTA樹脂	上海生工
Tris/NaCl/咪唑	上海生工
DTT	上海生工
β-巰基乙醇	Sigma
SDS-PAGE預製膠	南京金斯瑞
Superdex200柱	GE Healthcare

表4 試驗儀器

儀器	型號
PCR儀	Bio-rad T100
恆溫搖床	歐諾HNY-200B
細胞破碎儀	寧波新芝JY92-IIN
電泳儀	威克斯WIX-EP600
蛋白純化儀	GE AKTA pure
高速大容量冷凍離心機	湘智ZX21K
高速離心機	Eppendorf 5424R
白光膠片觀察儀	北京六一WD-9406
核酸凝膠成像儀	北京賽智ChampGel™ 5000
微量分光光度計	DS-II

2.試驗方法 2.1 pET15b-Cas9表達載體建構 SpCas9和NGA-Cas9 蛋白經植物密碼子最佳化後的DNA序列分別見SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，序列交金斯瑞合成作為模板DNA。將NG-Cas9和NGA-Cas9序列分別擴增後，融合（infusion）法將兩個片段連接到pET15b表達載體上，轉化DH5a，驗證後測序。表5 PCR驗證擴增體系及引物

反應體系50 ul
2× I5反應液	25 ul
模板DNA	1 ul
正反向引物	各2 ul
超純水	補足至50 ul
引物序列：	5’-3’
pET15b-NG Cas9 -F	gtgccgcgcggcagccatatggattacaaggaccacgacg
pET15b-NG Cas9-R	tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttcgcctgc
pET15b-NGA Cas9 -F	tgccgcgcggcagccatatgatggattacaaggaccacgacg
pET15b-NG Cas9 -R	tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttggcctgtccc

2.2 蛋白表達純化將建構好的表達載體轉入大腸桿菌Rosetta (DE3)中，經IPTG誘導表達，收菌裂解後利用Ni-NTA柱進行純化，具體方法如下： a)將重組表達載體轉化到Rosetta (DE3)菌株中，挑取單植株到10 ml LB培養基中，CmR+Amp（pET15b）或者CmR+Kana（pET28a）抗性37℃，200 rpm培養過夜，轉入含有1 L LB培養基的2 L搖瓶中，37℃，200 rpm，培養到OD600達到0.6-0.8時，降溫到18℃，0.5 mM IPTG誘導表達過夜，4000g離心收菌。 b)將收集好的菌體利用Ni-buffer A：50 mM HEPES pH7.4, 500 mM NaCl, 20 mM 咪唑, 5 mM β-巰基乙醇重懸，加入終濃度為1 mM PMSF和250 ul Cocktail inhibitor，混勻。 c)重懸後的菌體經超聲破碎儀破碎後，40000g，4℃離心30分鐘，取上清過Ni-NTA柱。 d)Ni-NTA柱純化，將裂解液上清與resin結合20分鐘後，用含有50 mM 咪唑的buffer A洗雜，最後用含400 mM 咪唑的洗脫緩衝液洗脫。 e)SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白純化效果。 f)透析換buffer至50 mM HEPES pH7.5, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 3% 甘油。 h)最終樣品經SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白純化效果，超濾濃縮後，凍存於-80℃備用。 2.3 Cas9融合蛋白表達純化結果 SpCas9和NGA-Cas9蛋白純化結果如圖12所示，箭頭所指為Cas9蛋白條帶，達到較高的純度。實施例7 SpCas9和NGA Cas9蛋白分別對OsACCase2 W2038和OsALS W548靶向位點的體外酶切活性檢測

1. 將OsALS和OsACCase2基因DNA序列輸入CRISPOR在線工具中（http://crispor.tefor.net/）針對OsALS對應擬南芥ALS蛋白第574位氨基酸位點的W548（OsALS第548位氨基酸，水稻ALS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示）和OsACCase2對應大穗看麥娘第2027位氨基酸位點的W2038（OsACCase2第2038位氨基酸，水稻ACCase2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示）分別設計sgRNA如下，委託金斯瑞公司合成：＞sgRNA1-548-G: 5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’ ＞ sgRNA1-2038-G: 5’GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’

2. 利用特異檢測引物OsALS265AA-F：5’ggtcttgcgtctggttggc3’和OsALS-end-R：5’ccatgccaagcacatcaaacaag 3’擴增含有OsALS W548靶位點的片段，PCR產物長度為1200 bp。利用特異檢測引物OsACC1750AA-F：5’gcgaagaagactatgctcgtattgg3’和OsACC2196AA-R：5’cttaatcacacctttcgcagcc3’，擴增含有OsACCase W2038靶位點的片段，PCR產物長度為1500 bp PCR體系如下表：

成分	體積
2 × I5 反應液	25 µL
正向引物（10 µM ）	2 µL
反向引物（10 µM ）	2 µL
基因組DNA模板	2 µL
超純水	補到50 µL

3. 建立PCR反應，反應條件為：

步驟	溫度	時間
預變性	98 °C	30 s
30-35 擴增循環	98 °C	15 s
58 °C	15 s
72 °C	30 s
最後延伸	72 °C	3 min

4. 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物並送測序進一步驗證，驗證無誤後切膠回收DNA片段，加入30ul RNase-free超純水進行溶解，並測試濃度。

5. 使用以下檢測體系檢測Cas9蛋白活性，體系添加完成後，37℃條件下孵育1h。

成分	體積
Cas9蛋白	0.5µL (1ug)
sgRNA	0.5µL (1ug)
10×Cas9反應緩衝液	2 µL
回收DNA片段	XµL (100ng)
RNase-free超純水	補到20 µL

6. 反應完畢後，65℃處理10 分鐘，加入4 ul 6×DNA上樣緩衝液，使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠檢測條帶大小。

結果如圖13所示，可見純化的Cas9蛋白僅在加入sgRNA的條件下能夠在設計的靶向位點處切割DNA雙鏈。實施例8 利用兩種不同靶向的RNP複合體轉化水稻原生質體實現OsALS548位點的W548L突變

1. 水稻原生質體製備以及PEG介導的轉化在已經發表的方法（Bart et al., 2006）基礎上進行了部分修改，具體的製備步驟如下：（1）首先準備原生質體用的水稻幼苗，品種為日本晴（Nipponbare）。水稻種子首先去殼，去殼種子用75%乙醇漂洗1 分鐘，用5%（v/v）的次氯酸鈉處理20分鐘，然後用無菌水洗滌5次以上，放在超淨台中吹乾後放在盛有1/2 MS的培養基的組培瓶中，每瓶放20粒種子。26°C，12 小時光照培養10天左右取出製備原生質體。（2）選取幼苗葉鞘部分，用鋒利的吉利剃鬚刀片切成約1 毫米的碎片，放在0.6 M甘露醇和MES培養液（配方：0.6 M 甘露醇，0.4 M MES，pH 5.7）中備用。將全部材料切好後轉入20 mL酶解液（配方：1.5%纖維素酶R10/RS (YaKult Honsha)，0.5% Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM MES, pH5.7，10mM CaCl₂ ，0.1% BSA，5 mM β-巰基乙醇）中，用錫箔紙包好置於28℃搖床中，50 rpm避光酶解約4小時，最後2分鐘將轉速提高至100 rpm；（2）酶解結束後，加入等體積的W5溶液（配方：154mM NaCl，125mM CaCl₂ ，5mM KCl，15mM MES），水平搖動10秒，釋放原生質體。酶解後的細胞經300目的篩子過濾後，150 g離心5分鐘收集原生質體；（3）用W5溶液漂洗細胞兩次，150 g離心5分鐘收集原生質體；（4）用適量的MMG溶液（配方：3.05g/L MgCl₂ ，1g/L MES，91.2g/L甘露醇）重懸原生質體，原生質體濃度約為2×10⁶ 個細胞/mL。

2. RNP複合體製備：根據OsALS548靶位點序列GGGTATGGTTGTGCAATGG GAgga ，帶下劃線為對應擬南芥ALS W574的OsALS W548位點，斜體小寫為Cas9蛋白識別的PAM位點，選擇純化的NGA-Cas9蛋白製備RNP複合體。以GGA為PAM設計＞CrRNA1-548-G: 5’-GGGUAUGGUUGUGCAAUGG GAguuuuagagcuaugcu-3’，預測經過編輯後在PAM前3-4位之間會刪除一個鹼基G，然後以刪除後的序列設計第二個＞CrRNA2-548+T: 5’-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3’，預測經過第二次編輯會插入一個鹼基T，從而實現TGG-TTG的轉換。將＞CrRNA1-548-G，＞CrRNA1-548+T交金斯瑞生物科技公司合成，同時還合成了sgRNA：＞sgRNA1-548-G: 5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’ ＞sgRNA2-548+T: 5’UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’。將合成的crRNA與GenCRISPR tracrRNA（金斯瑞 SC1933）等摩爾混合，加入crRNA&tracrRNA退火buffer（金斯瑞SC1957-B）按操作說明退火製備gRNA。tracrRNA序列為5'-agcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu-3'。按下表製備RNP反應體系，添加完成後，25℃孵育10分鐘。

成分	體積
NGA Cas9蛋白	10µL (20 µg)
gRNA或sgRNA	10µL (20 µg)
10x×Cas9 反應緩衝液	10 µL
RNase-free超純水	70 µL

3. 原生質體轉化（1）取上述200 μl MMG重懸的原生質體加入孵育完成後的RNP複合體（Cas9蛋白 20μg，sgRNA 20μg ），輕彈混勻。（2）加入等體積的40%（w/v）的PEG溶液（配方：40%（w/v）PEG，0.5M 甘露醇，100mM CaCl₂ ），輕彈混勻，28°C避光靜置15分鐘；（3）誘導轉化結束後緩慢加1.5 mL的W5溶液，輕彈混勻細胞，150 g離心3分鐘收集細胞，重複此步驟一次；（4）加入1.5 mL W5溶液重懸細胞，置於28°C培養箱中避光培養12-16小時，若用於提取原生質體基因組DNA，需培養48-60小時。

4. 基因組靶點編輯事件檢測（1）提取原生質體DNA，使用CTAB法並進行部分修改，具體方法如下：原生質體離心後棄上清，加入500 μL DNA提取液，振盪混勻，置於65°C水浴鍋中孵育1小時；水浴後的樣品冷卻後加入等體積的氯仿，顛倒混勻後10,000 rpm離心10分鐘；取400 μl上清轉移到一個新的1.5 mL離心管中，加入1 mL 70%（v/v）的乙醇放入-20°C沉澱20分鐘；用12,000 rpm離心15分鐘沉澱DNA，待沉澱晾乾後加入50 μl超純水溶解，保存於-20°C備用。（2）使用基因特異引物，擴增含有W548靶位點的片段，針對靶點設計了檢測引物：OsALS500AA-F：5’GGCTAACCCAGGTGTCACAG3’， OsALS-3’UTR-R：5’CCATGCCAAG- CACATCAAACAAG3’ PCR反應體系如下表：

成分	體積
2 × I5反應液	25 µL
正向引物（10 µM ）	2 µL
反向引物（10 µM ）	2 µL
基因組DNA模板	2 µL
超純水	補到50 µL

（3）建立PCR反應，一般反應條件是：

步驟	溫度	時間
預變性	98 °C	30 s
30-35擴增循環	98 °C	15 s
58 °C	15 s
72 °C	30 s
最後延伸	72 °C	3 min

（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR片段測序。

5. 檢測結果：使用合成的crRNA和tracrRNA退火製備的gRNA或直接使用合成的sgRNA與純化的NGA-Cas9蛋白均能形成有活性的RNP複合體，對OsALS548靶向位點測序能夠檢測到TGG到TTG的突變，證明RNP複合體配合前後順序的crRNA或sgRNA能夠在細胞內實現對目標位點的定向突變。如圖14所示，原生質體OsALS548靶點測序峰圖中箭頭所指處除原始的G鹼基訊號峰外，還有突變得到的T鹼基訊號峰，導致了OsALS548位點處W548L突變。實施例9：利用兩種不同靶向的RNP複合體轟擊水稻愈傷實現OsACCase2 W2038位點的W2038L突變

1. RNP複合體製備：根據OsACCase2 W2038靶位點序列GTTCATCCTCGCTAACTGG AGagg ，帶下劃線為對應大穗看麥娘ACCase W2027的OsACCase2 W2038位點，斜體小寫為Cas9蛋白識別的PAM位點，選擇純化的SpCas9蛋白製備RNP複合體。以GGA為PAM設計＞CrRNA1-2038-G: 5’-GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuaugcu-3’，預測經過編輯後在PAM前3-4位之間會刪除一個鹼基G，然後以刪除後的序列設計第二個＞CrRNA2-2038+T: 5’-UGUUCAUCCUCGCUAACUGAGguuuuagagcuaugcu-3’，預測經過第二次編輯會插入一個鹼基T，從而實現TGG-TTG的轉換。將＞CrRNA1-2038-G，＞CrRNA2-2038+T交金斯瑞生物科技公司合成，同時還合成了sgRNA：＞sgRNA1-2038-G: 5’GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3’ ＞sgRNA2-2038+T: 5’UGUUCAUCCUCGCUAACUGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3’。將合成的crRNA與GenCRISPR tracrRNA（金斯瑞SC1933）等摩爾混合，加入crRNA&tracrRNA退火buffer（金斯瑞SC1957-B）按操作說明退火製備gRNA。按實施例8同樣的反應體系孵育製備RNP複合體，以基因槍轉化10次轟擊用量為例：Cas9蛋白20µg，gRNA或sgRNA 20 µg，10µl 10×Cas9反應緩衝液，使用 RNase-free超純水補足，共100 µl，25℃孵化10分鐘，輕混勻。

2. 水稻愈傷誘導挑選成熟飽滿的水稻種子，脫殼，按以下步驟消毒處理：（1）剝取水稻種子，水稻品種為淮稻5號，來自種子市場採購。（2）無菌水清洗種子，直至洗後的水變清澈，不限次數。（3）70%酒精消毒1分鐘，之後10%次氯酸鈉置於水平搖床搖晃培養25分鐘。（4）次氯酸鈉消毒後無菌水清洗5次。接種於愈傷誘導培養基（配方：MS粉末（4.42g/L）+2,4-D（2mg/L）+ 蔗糖（30g/L）+ 植物凝膠（4g/L）），28℃黑暗培養誘導愈傷。

3. 基因槍RNP轟擊：（1）高滲培養將胚性良好的愈傷組織轉移至高滲培養基（配方：MS粉末（4.42g/L）+2,4-D（2mg/L）+ 蔗糖（30g/L）+ D-甘露醇（0.4M）+ 植物凝膠（4g/L）），超淨台無菌操作，25℃，暗培養4-6小時。（2）製備金粉懸浮液：用1.5 mL的進口EP管，稱取30 mg金粉（直徑0.6μm）；加入1mL 70%的乙醇，充分渦旋，冰上靜置10 分鐘。離心1 分鐘，棄上清；加入1mL無菌水，充分渦旋，離心1分鐘，棄上清，重複操作3次。加入500 μL滅菌甘油（50%），充分渦旋，製成濃度為60 μg/μl 的金粉懸浮液，-20℃保存。（3）取50µl金粉懸浮液（60µg/ml），加入製備好的RNP複合體100μL，溫和混勻。（4）取15µl RNP金粉混合液於PDS-1000臺式基因槍（Bio-Rad）可裂膜中心，吹乾後，按照儀器操作說明進行轟擊。轟擊參數：真空度為26-28，距離為6釐米，氣壓為1100psi或1350psi。（5）轟擊完成後愈傷在高滲培養基上25℃黑暗過夜培養16小時。

4. 篩選、分化和生根：（1）轟擊後的愈傷過夜培養後，轉入誘導培養基，28℃恢復培養一週。（2）恢復1週後，愈傷轉入篩選培養基（配方：4.1g/L N6粉末+ 0.3 g/L水解酪蛋白+ 2.8 g/L脯氨酸+ 2 mg/L 2,4-D + 3 %蔗糖+ 50 ug/L 精喹禾靈+ 500 mg/L Cef（頭孢黴素）+0.1 g/L肌醇+ 0.35 %植物凝膠，pH 5.8）篩選3-4週，對OsACCase 2 W2038的預期編輯，使用精喹禾靈50 ug/L進行篩選，如圖15所示。（3）篩選出的生長狀態良好的抗性愈傷轉入分化培養基（配方：MS粉末（4.42g/L）+KT（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+ 植物凝膠（4.5g/L）+50 ug/L精喹禾靈，pH 5.8），28℃光照培養誘導分化2-4週。（4）將分化出的幼苗移至生根培養基（配方：1/2MS粉末（2.3g/L）+ 蔗糖（30g/L）+ 植物凝膠（4.5g/L））進行生根培養，生根完成的幼苗進行煉苗處理後，移至裝有土壤的花盆中置溫室進行培養。

5. 抗性愈傷和T0組培苗的靶點編輯事件檢測：在篩選階段共得到11個抗性愈傷，使用CTAB法提取DNA，針對靶點設計檢測引物為OsACC2038test-F：5’CTGTAGGCATTTGAAACTGCAGTG3’，OsACC2038test-R：5’GCAATCCTGGAGTTCCT-CTGACC3’，擴增包含OsACCase2 W2038位點的PCR片段，回收測序。測序檢測其中10個在OsACCase2 W2038位點存在TGG到TTG的突變，其中3個樣品為純合突變。對抗性愈傷分化得到的T0代組培苗提取DNA檢測編輯靶點序列，同樣在OsACCase2 W2038位點存在TGG到TTG的純合突變，如圖16所示。

6. T1代苗對ACCase抑制劑類除草劑的抗性測試檢測發生W2038L突變的T0株系擴繁後，對T1代突變幼苗使用田間濃度精喹禾靈和高效氟吡甲禾靈測試除草劑抗性，可見OsACCase2 W2038L突變株系對這2種ACCase抑制劑類除草劑均產生明顯抗性，如圖17至圖18所示。綜上，使用合成的crRNA和tracrRNA退火製備的gRNA或直接使用合成的sgRNA與純化的SpCas9蛋白均能形成有活性的RNP複合體，能夠在組培階段使用精喹禾靈對基因槍轟擊的愈傷進行篩選，對T0代組培苗的OsACCase2 W2038靶向位點測序能夠檢測到TGG到TTG的純合突變，該突變能夠遺傳到T1代並表現出ACCase抑制劑類除草劑的抗性，進一步證明RNP複合體配合前後順序的crRNA或sgRNA連續打靶能夠在細胞內實現對目標位點的定向突變，並能引導產生細胞內源的篩選標記用於組培篩選，創制抗除草劑的作物。實施例10：利用不同靶向的RNP複合體編輯水稻愈傷OsACCase2 W2038位點同時編輯OsBADH2基因

RNP複合體製備方法參照實施例8，基因槍轟擊和組培步驟同實施例9，除針對OsACCase2 W2038位點的crRNA或sgRNA外，同時加入針對OsBADH2基因的crRNA或sgRNA，與SpCas9蛋白孵育形成針對第二標靶基因OsBADH2的靶向RNP複合體，進行基因槍轟擊，恢復培養，篩選，分化，生根，得到T0代組培苗，擴繁T1代。

水稻OsBADH2基因組序列如SEQ ID NO: 17所示，根據CRISPOR在線工具（http://crispor.tefor.net/）選擇靶位點序列CCAAGTACCTCCGCGCAATCGcgg ，斜體小寫為Cas9蛋白識別的PAM位點，選擇純化的SpCas9蛋白製備RNP複合體。以CGG為PAM設計＞CrRNA1-OsBADH2: 5’-CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuaugcu-3’，預測藉由精喹禾靈篩選得到的抗性愈傷中能夠同時檢測到OsACCase2 W2038L的抗性突變和OsBADH2的敲除突變事件。

將＞CrRNA1-OsBADH2交金斯瑞生物科技公司合成，同時還合成了sgRNA：＞OsBADH2-sgRNA:5’CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’。

按實施例9中的轉化步驟篩選抗性愈傷，如圖19所示，挑選抗性愈傷分化出苗，對愈傷和T0代組培苗OsACCase2和OsBADH2靶點處序列進行測序，OsBADH2靶點檢測引物為： OsBADH2-check F：5’CATCGGTACCCTCCTCTTC3’ OsBADH2-check R：5’ATCGATCGATTTGGGGCTCA3’ 結果共篩選得到13個抗性愈傷，其中11個檢測到OsACCase2 W2038L突變事件，在這11個愈傷樣品中檢測OsBADH2靶點序列，其中8個同時含有OsBADH2靶點處的編輯事件。在分化得到的T0代組培苗中，能夠檢測到存在OsACCase2 W2038L的突變和OsBADH2 +A的純合突變，如圖20至圖21所示。

綜上所述，使用順序打靶的crRNA或sgRNA靶向RNP複合體對OsACCase2 W2038進行定向編輯，同時加入靶向第二標靶基因OsBADH2的靶向RNP複合體，對水稻愈傷進行基因槍轟擊後，能夠在組培階段使用精喹禾靈對愈傷進行篩選，抗性愈傷中61%同時發生了OsACCase2 W2038突變和OsBADH2的靶向敲除，在T0代組培苗中可見檢測到OsBADH2發生純合突變的株系，說明順序打靶結合RNP轉化針對抗性基因的定點編輯可以產生內源的篩選標記，加入對應的篩選壓力可以同時篩選第二標靶基因的編輯事件，實現非轉基因手段的基因組定點編輯。實施例11：利用不同靶向的RNP複合體編輯水稻愈傷OsALS548位點同時編輯OsSWEET14基因

針對OsALS548位點的靶向RNP複合體製備方法參照實施例8，crRNA和sgRNA序列同實施例8，分別為：＞CrRNA1-548-G: 5’-GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuaugcu-3’，＞CrRNA2-548+T: 5’-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3’，＞sgRNA1-548-G: 5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’ ，＞sgRNA2-548+T: 5’UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’。

參照實施例8，將gRNA或sgRNA與NGA-Cas9孵育製備靶向OsALS548位點的RNP複合體。

除針對OsALS548位點的靶向RNP複合體外，同時加入針對OsSWEET14基因的crRNA或sgRNA，與SpCas9蛋白孵育形成針對第二標靶基因OsSWEET14的靶向RNP複合體，進行基因槍轟擊，恢復培養，篩選，分化，生根，得到T0代組培苗，擴繁T1代。篩選壓力選用5mg/L啶磺草胺。

水稻OsSWEET14基因組序列如SEQ ID NO: 18所示，根據CRISPOR在線工具（http://crispor.tefor.net/）選擇靶位點序列GAGCTTAGCACCTGGTTGGAGggg ，斜體小寫為SpCas9蛋白識別的PAM位點，選擇純化的SpCas9蛋白製備RNP複合體。以GGG為PAM設計：＞CrRNA1-OsSWEET14: 5’-GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuaugcu-3’，預測藉由啶磺草胺篩選得到的抗性愈傷中能夠同時檢測到OsALS W548L的抗性突變和OsSWEET14的敲除突變事件。

將＞CrRNA1-Os SWEET14交金斯瑞生物科技公司合成，同時還合成了sgRNA：＞Os SWEET14-sgRNA: 5’GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’。

按實施例9所述基因槍轟擊和組培步驟篩選抗性愈傷，如圖22所示，挑選抗性愈傷分化出苗，其中篩選培養基配方為：4.1g/L N6粉末+ 0.3 g/L 水解酪蛋白+ 2.8 g/L 脯氨酸+ 2 mg/L 2,4-D + 3 %蔗糖+ 5 mg/L 啶黃草胺+ 500 mg/L Cef（頭孢黴素）+0.1 g/L肌醇+ 0.35 %植物凝膠，pH 5.8。

對愈傷和T0代組培苗OsALS548位點和OsSWEET14靶點處序列進行測序，OsSWEET14靶點檢測引物為： OsSWEET14-check F：5’ ATGGGTGCTGATGATTATCTTGTAT3’ OsSWEET14-check R：5’ TGAAGAGACATGCCAGCCATTG3’ 結果共篩選得到9個抗性愈傷，其中8個檢測到OsALS W548L突變事件，在這8個愈傷樣品中檢測OsSWEET14靶點序列，其中5個同時含有OsSWEET14靶點處的編輯事件。在分化得到的T0代組培苗中，能夠檢測到同時存在OsALS W548L的突變和OsSWEET14 -C的純合突變，如圖23至圖24所示。

檢測發生OsALS W548L突變的T0株系擴繁後，對T1代突變幼苗株系使用田間濃度的啶磺草胺、甲基咪草煙、煙嘧磺隆和氟唑磺隆測試除草劑抗性，可見OsALS W548L突變株系對這4種ALS抑制劑類除草劑均產生明顯抗性，如圖25至圖28所示。

綜上所述，使用合成的crRNA和tracrRNA退火製備的gRNA或直接使用合成的sgRNA與純化的NGA Cas9蛋白均能形成有活性的RNP複合體，配合順序打靶的crRNA或sgRNA能夠在細胞內實現對目標位點的定向突變，能夠在組培階段使用啶磺草胺對基因槍轟擊的愈傷進行篩選，對T0代組培苗的OsALS548靶向位點測序能夠檢測到TGG到TTG的突變，該突變能夠遺傳到T1代並表現出對ALS抑制劑類除草劑的抗性。

同時加入靶向第二標靶基因OsSWEET14的靶向RNP複合體，使用識別NGG PAM的SpCas9蛋白，對水稻愈傷進行基因槍轟擊後，在組培階段使用啶磺草胺對愈傷進行篩選，抗性愈傷中55%同時發生了OsALS W548L突變和OsSWEET14的靶向敲除，在T0代組培苗中可檢測到OsSWEET14發生純合突變的株系，進一步說明順序打靶結合RNP轉化針對抗性基因的定點編輯可以產生內源的篩選標記，並且可以同時使用識別不同PAM位點的Cas9蛋白，加入對應的篩選壓力同時篩選第二標靶基因的編輯事件，實現非轉基因手段的基因組定點編輯。實施例12：利用兩種不同靶向的RNP複合體轟擊馬鈴薯外植體實現StALS561位點的W561L突變

馬鈴薯StALS2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，馬鈴薯StALS2基因序列如SEQ ID NO: 20所示。RNP複合體製備和基因槍轟擊方法參照實施例8-9，針對馬鈴薯StALS2對應擬南芥ALS574位點的StALS2W561位點設計針對原始序列和編輯後序列的sgRNA如下：＞StALS561- G: 5’GGGAAUGGUGGUUCAGUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’ ＞StALS561 +T: 5’UGGGAAUGGUGGUUCAGUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’，按實施例8所述方法製備RNP複合體。

受體馬鈴薯品種為大西洋或費瑞烏它，分別使用了葉片、莖段和腋芽作為外植體，基因槍轟擊和篩選分化方法如下：（1）葉片：將整葉剪下，平鋪在高滲M6培養基（配方：4.42g/L MS粉末+1 ml/L B5 vitamins（Phytotechlab，G219）+ 30g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+2mg/L 2,4-D +0.8mg/L 玉米素核苷 +0.2M 甘露醇+250mg/L Cef）中，每一槍大約5-6片葉。預培養24小時後，進行金粉轟擊。轟擊後繼續高滲M6培養基暗培養2天，轉移至M6培養基（4.42g/L MS粉末+1 ml/L B5 vitamins（Phytotechlab，G219）+ 30g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+2mg/L 2,4-D +0.8mg/L玉米素核苷+250mg/L Cef）中，繼續培養1週，1週後轉移至帶有篩選壓力的M6培養基，篩選壓力為20μg/L 氯磺隆（配方：4.42g/L MS粉末+1 ml/L B5 vitamins（Phytotechlab，G219）+ 30g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+2mg/L 2,4-D +0.8mg/L玉米素核苷 +250mg/L Cef+20μg/L 氯磺隆）中進行篩選抗性愈傷，4週後轉移至含有篩選壓力的誘導芽培養基R4（配方：4.42g/L MS粉末+1 ml/L B5 vitamins（Phytotechlab，G219）+ 30g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+2mg/L GA3 +0.8mg/L玉米素核苷 +250mg/L Cef+20μg/L 氯磺隆），直至出苗。（2）莖段：取馬鈴薯莖段（不含腋芽），將莖段縱切，切口朝上，放置於CIMI培養基（4.42g/L MS粉末+20g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+0.5mg/L玉米素核苷+2mg/L 2,4-D +250mg/L Cef+20μg/L 氯磺隆）上，隨後進行基因槍轟擊，轟擊後暗培養1天，將莖段轉移至新鮮的CIMI培養基上，繼續培養1週，隨後將莖段轉移至含有篩選壓力的SIMI培養基（配方：4.42g/L MS粉末+20g/L 蔗糖+8g/L瓊脂+1mg/L玉米素核苷+0.1mg/L GA3+250mg/L Cef+20μg/L 氯磺隆）上進行抗性芽的篩選，直至出苗。（3）腋芽：取馬鈴薯莖段上的腋芽，進行縱切後轉移至CIMI培養基上，切口朝上，放置於CIMI培養基上，隨後進行基因槍轟擊，轟擊後暗培養1天，將莖段轉移至新鮮的CIMI培養基上，繼續培養1週，隨後將莖段轉移至含有篩選壓力的SIMI培養基上進行抗性芽的篩選，直至出苗。對StALS2 W561位點的檢測引物為： StALS561-Check F：5’GTGGATTAGGAGCAATGGGATTT3’ StALS561-Check R：5’ TTATTTTAGATAATACAATGCCTCG3’ 經檢測，經抗性篩選的T0代馬鈴薯組培苗StALS2 W561位點發生了W561L的編輯事件，說明本發明提供的非轉基因瞬時基因編輯方法適用於類似馬鈴薯這類難以藉由自交或雜交分離去除外源轉基因元件的作物。實施例13：循環打靶方案成功地在人類293T細胞中進行了鹼基替換

選擇人胚腎細胞293T中HBB（hemoglobin subunit beta）基因（其DNA序列如SEQ ID NO: 21所示，其CDS序列如SEQ ID NO: 22所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示），第一個外顯子的區域設計sgRNA的連續打靶的靶位點，其中第一靶點catggtgcaCctgactcctgAGG ，識別此靶點的sgRNA命名為sgHBB，預測此位點sgRNA切口處有可能產生減少一個C鹼基。第二靶點為ccatggtgcatctgactctgAGG ，識別第一靶點打靶後產生的減少一個C鹼基的序列，此靶點的sgRNA命名為sgHBB-c。並設計在293T細胞中無靶位點的sgRNA命名為sgNOTAR，作為實驗中轉染補齊質粒。

根據以上設計，分別合成互補單鏈DNA片段。經過退火後連接入BbsI酶酶切的px458（addgene：48138）質粒中。並轉化大腸桿菌DH5a感受態。獲得的大腸桿菌單植株經過測序驗證正確後，用無內毒素質粒提取試劑盒（天根生物）提取純化質粒。

用0.05%胰蛋白酶（Gibico）消化分離生長旺盛的293T細胞。用DMEM培養基（10%胎牛血清；青黴素+鏈黴素雙抗）稀釋後接種至24孔培養板。置於二氧化碳培養箱中培養過夜。次日，按照連續打靶：sgHBB和sgHBB-c質粒各0.5ug；單靶點打靶：sgHBB和sgNOTAR質粒各0.5ug；無靶點對照：pEGFP-c1質粒1ug分別混合。用lipofectamine3000（Invitrogen）進行轉化。每組設3個重複。

轉化後48小時，用熒光顯微鏡拍照記錄轉化效率。並用核酸提取試劑盒（Omega）分別提取各孔細胞總DNA。

設計Hi-tom測序引物如下： Hi-HBB-F：ggagtgagtacggtgtgcGCTTACATTTGCTTCTGACACAACT； Hi-HBB-R：gagttggatgctggatggTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG。並用此引物對各個DNA樣本進行PCR。PCR產物用Hi-tom方法高通量測序（Sci China Life Sci. 2019 Jan;62(1):1-7. doi: 10.1007/s11427-018-9402-9）。

測序結果的統計資料顯示在表6和表7中，這些資料表明：HBB位點連續打靶方法產生了約1.67%的C到T的編輯結果（導致P6S突變），而單靶點打靶無法產生此類鹼基替換突變。表6 在293T細胞中HBB基因連續打靶實驗不同sgRNA組合產生的編輯類型，以Hi-Tom方式測序檢測到的不同基因型的讀數

基因型	HBB循環打靶重複1	HBB循環打靶重複2	HBB循環打靶重複3	HBB單靶點重複1	HBB單靶點重複2	HBB單靶點重複3	GFP轉化對照重複1	GFP轉化對照重複2

WT	6025	6037	6003	5776	5636	5614	7564	7430
1Deletion	555	593	613	1170	1134	1120	252	288
2Deletion	594	625	410	465	509	405
3Deletion	304	263	258		260	243
4Deletion		222
5Deletion			220		217
6Deletion
7Deletion	312	223	232	274	229	278
Insertion				273		308
C-＞T SNP	168		230
total	7958	7963	7966	7958	7985	7968	7816	7718

表7 合併統計在293T細胞中HBB基因連續打靶實驗不同sgRNA組合產生的編輯類型各自所占的比例

基因型	HBB循環打靶	HBB單靶點打靶	GFP轉化背景	HBB循環打靶比例	HBB單靶點打靶比例	GFP轉化背景比例

WT	18065	17026	14994	75.63%	71.21%	96.52%
1Deletion	1761	3424	540	7.37%	14.32%	3.48%
2Deletion	1629	1379	0	6.82%	5.77%	0.00%
3Deletion	825	503	0	3.45%	2.10%	0.00%
4Deletion	222	0	0	0.93%	0.00%	0.00%
5Deletion	220	217	0	0.92%	0.91%	0.00%
6Deletion	0	0	0	0.00%	0.00%	0.00%
7Deletion	767	781	0	3.21%	3.27%	0.00%
Insertion	0	581	0	0.00%	2.43%	0.00%
C-＞T SNP	398	0	0	1.67%	0.00%	0.00%
total	23887	23911	15534	100.00%	100.00%	100.00%

注：WT代表野生型；Deletion代表刪除的基因型；Insertion代表插入的基因型；C-＞T SNP代表在切口處產生C到T的鹼基替換的基因型；total代表總計。

此外，鐮刀細胞貧血症（sickle cell anemia）和β-地中海貧血（β-thalassemia）都是由於編碼成人血紅蛋白β亞基的HBB基因上出現突變而導致的遺傳性貧血症。這些疾病的患者可能終生需要接受輸血或者其它療法的治療。上述實驗的結果表明，藉由本發明提供的循環打靶的技術方案，可以對HBB基因的突變位點設計crRNA或sgRNA組合誘導在突變位點產生預期的修復，使細胞產生有活性的血紅蛋白，恢復功能，起到治療作用，即本發明提供的組合物具有治療疾病的用途。

同時經過多種測試，由於這種新方法完全是建立在Cas9已有功能的基礎之上，因此在其他Cas9能夠很好起作用的生物體中（植物、動物、真菌或細菌等），本發明的方法將完全適用，實現鹼基替換、刪除和插入特定的片段的新功能。

說明書中提及的所有出版物和專利申請均藉由引用併入本文，如同每篇出版物或專利申請被單獨、特別地藉由引用併入本文一樣。

儘管為清楚理解起見，前述發明已藉由舉例說明和實施例的方式較為詳細地進行了描述，但顯而易見的是，可以在所附申請專利範圍的範圍內實施某些改變和修改，這樣的改變和修改均在本發明的範圍之內。

無。

圖1為本發明該在生物體內產生新突變的方法原理圖，圖中僅僅以NGG為PAM的Cas9為例；同理也可以應用其它具有不同PAM（如NG等）的Cas9變體。圖2為擬南芥ALS基因W574位點與S653位點 gRNA設計示意圖。圖3顯示了轉化兩個不同循環打靶載體的擬南芥T2代抗除草劑株系。pQY743和pQY745為載體編號。抗性株系能夠正常生根，野生型Col-0和非抗性株系不能生根。圖4為抗甲咪唑煙酸擬南芥T2代株系ALS基因的測序峰圖，箭頭所指的T由G突變而來，導致了W574L突變。圖5為擬南芥ALS基因W574位點循環打靶方案設計。T-DNA序列表達sgRNA1、sgRNA2、Cas9和HygR四個基因。其中sgRNA1和Cas9形成複合物，切割基因組中ALS的W574密碼子，預期經過細胞自發修復形成-G的基因型，該新序列可以被sgRNA2和Cas9形成的複合物識別並切割，經過細胞自發修復形成+T的基因型，導致W574L。圖6顯示甲咪唑煙酸篩選的擬南芥抗性苗和ALS W574位點測序結果。圖7為擬南芥ALS基因S653位點循環打靶方案設計。T-DNA序列表達sgRNA1、sgRNA2、Cas9和HygR四個基因。其中sgRNA1和Cas9形成複合物，切割基因組中ALS的S653密碼子。經過細胞自發修復形成-G的基因型。該序列可以被sgRNA2和Cas9形成的複合物識別並切割。經過細胞自發修復形成+A的基因型，導致S653N。圖8顯示甲咪唑煙酸篩選的擬南芥抗性苗和ALS S653位點測序結果。左側為抗性苗篩選結果和抗性苗的比例，右側顯示了S653位點的測序峰圖和突變類型。圖9為擬南芥ALS基因W574位點循環打靶方案設計。T-DNA序列表達sgRNA1、sgRNA2、Cas9和HygR四個基因。其中sgRNA1和Cas9形成複合物，切割基因組中ALS的W574密碼子。經過細胞自發修復形成+A的基因型。該序列可以被sgRNA2和Cas9形成的複合物識別並切割。經過細胞自發修復形成-G的基因型，導致W574M。其中兩次切割利用了不同的PAM位點。圖10為水稻ACCase2基因W2038位點循環打靶方案設計，該位點對應大穗看麥娘W2027。T-DNA序列表達sgRNA1、sgRNA2、Cas9和HygR四個基因。其中sgRNA1和Cas9形成複合物，切割基因組中ACCase的W2038密碼子。經過細胞自發修復形成-G的基因型。該序列可以被sgRNA2和Cas9形成的複合物識別並切割。經過細胞自發修復形成+T的基因型，導致W2038L。圖11顯示潮黴素（50 ug/L）和精喹禾靈（50 ug/L）共篩選的抗性水稻愈傷和W2038位點測序結果。圖12為原核表達純化的SpCas9和NGA-Cas9蛋白聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。箭頭所指的條帶為Cas9蛋白條帶。圖13顯示用瓊脂糖凝膠電泳檢測純化的Cas9蛋白在體外對含有OsALS W548靶位點和OsACCase2 W2038靶位點DNA片段的切割活性，可以看到僅在同時加入Cas9蛋白和sgRNA片段的條件下，DNA片段能夠被切割為預期大小。圖14為RNP轉化水稻原生質體OsALS W548靶點測序峰圖，該位點對應擬南芥ALS W574位點。箭頭所指處除原始的G鹼基訊號峰外，還有突變得到的T鹼基訊號峰，導致了W548L突變。圖15為50ug/L精喹禾靈篩選RNP編輯OsACCase2 W2038位點的水稻抗性愈傷。箭頭所指為抗性愈傷。圖16為抗性愈傷分化出的水稻苗 OsACCase2 W2038靶點測序峰圖。箭頭所指處的T由G突變而來，導致了W2038L突變。圖17為T1代OsACCase2 W2038L編輯苗對高效氟吡甲禾靈的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左4為野生型淮稻5號和兩個RNP基因槍轉化T1代W2038L編輯株系QY367-7-12、QY367-7-18使用5克每畝活性成分的高效氟吡甲禾靈處理的結果。可見編輯株系產生了對高效氟吡甲禾靈的抗性。圖18為T1代OsACCase2 W2038L編輯苗對精喹禾靈的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左4為野生型淮稻5號和兩個RNP基因槍轉化T1代W2038L編輯株系QY367-5-10、QY367-5-21使用5克每畝活性成分的精喹禾靈處理的結果。可見編輯株系產生了對精喹禾靈的抗性。圖19為50ug/L精喹禾靈篩選RNP編輯同時編輯OsACCase2 W2038位點和OsBADH2基因的水稻抗性愈傷。箭頭所指為抗性愈傷。圖20為T0代雙位點編輯苗OsACCase2 W2038靶點測序峰圖。箭頭所指處的T由G突變而來，導致了W2038L突變。圖21為T0代雙位點編輯苗OsBADH2靶點測序峰圖。箭頭所指處發生了+A的純合突變。圖22為5mg/L啶磺草胺篩選RNP編輯同時編輯OsALS W548位點和OsSWEET14基因的水稻抗性愈傷。箭頭所指為抗性愈傷。圖23為T0代雙位點編輯苗OsALS W548靶點測序峰圖。箭頭所指處同時存在G鹼基和T鹼基的訊號峰，導致了W548L突變。圖24為T0代雙位點編輯苗OsSWEET14靶點測序峰圖。箭頭所指處顯示發生了-C的純合突變。圖25為T1代OsALS W548位點和OsSWEET14雙位點編輯苗對煙嘧磺隆的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左3為野生型淮稻5號和RNP基因槍轉化T1代W548L編輯株系QY360-7-11使用4克每畝活性成分的煙嘧磺隆處理的結果。可見編輯株系產生了對煙嘧磺隆的抗性。圖26為T1代OsALS W548位點和OsSWEET14雙位點編輯苗對氟唑磺隆的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左3為野生型淮稻5號和RNP基因槍轉化T1代W548L編輯株系QY360-7-9使用2克每畝活性成分的氟唑磺隆處理的結果。可見編輯株系產生了對氟唑磺隆的抗性。圖27為T1代OsALS W548位點和OsSWEET14雙位點編輯苗對甲基咪草煙的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左3為野生型淮稻5號和RNP基因槍轉化T1代W548L編輯株系QY360-7-11使用7克每畝活性成分的甲基咪草煙處理的結果。可見編輯株系產生了對甲基咪草煙的抗性。圖28為T1代OsALS W548位點和OsSWEET14雙位點編輯苗對啶磺草胺的抗性測試。圖中左1為野生型淮稻5號水處理對照，左2至左4為野生型淮稻5號和RNP基因槍轉化T1代W548L編輯株系QY360-7-2、QY360-7-11使用2克每畝活性成分的啶磺草胺處理的結果。可見編輯株系產生了對啶磺草胺的抗性。圖29為293T細胞中HBB基因連續打靶方案。其中，A代表293T細胞中HBB基因連續打靶靶點設計；B代表293T細胞中HBB基因連續打靶各編輯載體轉化48小時後的轉化效率；C代表293T細胞中HBB基因連續打靶和單位點打靶產生的基因編輯類型的比例；WT：野生型，indel：刪除或插入的基因型，C-＞T SNP：在切口處產生C到T的鹼基替換的基因型。

序列說明本發明所涉及的主要序列總結如下，並且在序列表中提供了相關的序列。

SEQ ID NO:	序列說明
1	擬南芥ALS蛋白氨基酸序列
2	擬南芥ALS基因DNA序列
3	大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides) AmACCase蛋白的氨基酸序列
4	大穗看麥娘AmACCase基因的DNA序列
5	水稻OsHPPD蛋白氨基酸序列
6	水稻OsHPPD蛋白基因組DNA序列
7	水稻OsPPO1蛋白氨基酸序列
8	水稻OsPPO1蛋白基因組DNA序列
9	水稻OsTIR1蛋白氨基酸序列
10	水稻OsTIR1蛋白基因組DNA序列
11	水稻ALS蛋白氨基酸序列
12	水稻ALS基因DNA序列
13	水稻ACCase2蛋白氨基酸序列
14	水稻ACCase2基因組DNA序列
15	SpCas9蛋白經植物密碼子最佳化後的DNA序列
16	NGA-Cas9蛋白經植物密碼子最佳化後的DNA序列
17	水稻OsBADH2基因組DNA序列
18	水稻OsSWEET14基因組DNA序列
19	馬鈴薯StALS2蛋白氨基酸序列
20	馬鈴薯StALS2基因DNA序列
21	人胚腎細胞293T中HBB（hemoglobin subunit beta）基因DNA序列
22	人胚腎細胞293T中HBB基因CDS序列
23	人胚腎細胞293T中HBB基因氨基酸序列

Claims

一種在生物體內產生新突變的方法，其包括以下步驟：在生物體基因組的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生。
如請求項1所述的方法，其中，所述的“DNA斷裂”是藉由將具有靶向特性的核酸酶遞送到生物體細胞內與基因組DNA特定位置接觸實現的。
如請求項2所述的方法，其中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”為ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統。
如請求項1至請求項3中任一項所述的方法，其中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由ZFN或TALEN編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的ZFN或TALEN蛋白，對該位點再次進行切割。
如請求項1至請求項3中任一項所述的方法，其中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。
如請求項1至請求項4中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是將不同的一靶向核酸酶按先後順序遞送到不同代的受體細胞中產生的，以完成在先編輯的突變細胞作為受體接受在後編輯的靶向核酸酶的遞送，進行二次編輯產生定點突變。
如請求項1至請求項3、請求項5中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是將不同靶向的一靶向核酸酶遞送到同一個受體細胞中產生的。
如請求項1至請求項3、請求項5、請求項7中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是由同一種CRISPR/Cas核酸酶與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項1至請求項3、請求項5、請求項7中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas核酸酶與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項7所述的方法，其中，該靶向核酸酶為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。
如請求項6或請求項7所述的方法，其中，該靶向核酸酶以DNA形式存在。
如請求項7至請求項9任一項所述的方法，其中，該靶向核酸酶以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。
如請求項6或請求項7所述的方法，其中，將靶向核酸酶遞送到細胞內的方法選自1）PEG介導的細胞轉染的方法；2）脂質體介導的細胞轉染的方法；3）電擊轉化的方法；4）顯微注射；5）基因槍轟擊；或6）農桿菌介導的轉化方法。
一種採用如請求項1至請求項13中任一項所述方法獲得的一新突變。
一種具有如請求項14所述新突變的蛋白或其生物活性片段。
一種核酸，其包含編碼如請求項15所述蛋白或其生物活性片段的核酸序列或者其互補序列。
一種核酸，其包含： (a)編碼靶向RNA的核苷酸序列，其中，該RNA至少包含兩個，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。
如請求項17所述的核酸，其中，還包括(b)編碼Cas多肽的核苷酸序列。
如請求項17或請求項18所述的核酸，其中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。
如請求項17至請求項19中任一項所述的核酸，其中，該Cas多肽和該靶向RNA為在體外細胞或離體細胞內。
一種重組表達載體，其包含如請求項16至請求項20中任一項所述的核酸，以及與之可操作地連接的啟動子。
一種表達盒，其中包含如請求項16至請求項20中任一項所述的核酸。
一種宿主細胞，其中包含有如請求項22所述的表達盒。
採用如請求項23所述宿主細胞再生成的生物。
一種裂解靶DNA的方法，其包括使該靶DNA與複合物接觸，該複合物包含： (a)Cas多肽；以及 (b)至少兩個靶向RNA，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。
如請求項25所述的方法，其中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。
如請求項25或請求項26所述的方法，其中，該靶DNA存在於細菌細胞、真核細胞、植物細胞或動物細胞中。
如請求項25至請求項27中任一項所述的方法，其中，該靶DNA為染色體DNA。
如請求項25至請求項28中任一項所述的方法，其中，該Cas多肽和該靶向RNA為在體外細胞或離體細胞內。
如請求項25至請求項29中任一項所述的方法，其中，該接觸包括將以下引入細胞：(a)該Cas多肽或編碼該Cas多肽的多核苷酸，和(b)該靶向RNA或編碼該靶向RNA的DNA多核苷酸。
一種組合物，其包含： (a)一Cas多肽，或編碼該Cas多肽的多核苷酸；以及 (b)至少兩個靶向RNA，或編碼該靶向RNA的DNA多核苷酸，其中，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷。
如請求項31所述的組合物，其中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。
如請求項31或請求項32所述的組合物，其中，該Cas多肽和該靶向RNA為在體外細胞或離體細胞內。
如請求項31至請求項33中任一項所述的組合物在用於製備治療疾病的藥劑中的用途。
一種試劑盒，其包含： (a)Cas多肽，或包含編碼該Cas多肽的核苷酸序列的核酸；以及 (b)至少兩個靶向RNA，或包含編碼該靶向RNA的核苷酸序列的核酸，其中，前一個RNA靶向DNA導致其斷裂，後一個靶向RNA針對前一次斷裂修復事件形成的序列再次進行切斷；其中(a)和(b)是在相同或單獨的容器中。
如請求項35所述的試劑盒，其中，該靶向RNA為sgRNA或gRNA。
如請求項35或請求項36所述的試劑盒，其中，(b)中的靶向RNA是在相同或單獨的容器中。
一種不依賴外源轉基因標記篩選編輯事件的方法，包括以下步驟： 1) 在受體細胞第一目標基因的特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2) 第一目標基因特定位置經順次切割並修復後產生的某些編輯事件，能夠賦予突變體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生表型可選擇的一性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物； 3) 可選的，在第一目標基因之外，同時使用針對至少一個第二目標基因的一靶向核酸酶對其它靶點進行編輯，藉由篩選第一目標基因突變產生的可選擇性狀同步對第二目標基因的編輯事件進行富集篩選，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二目標基因編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物。
如請求項38所述的方法，其中，該“第一目標基因”是編碼至少一種表型可選擇性狀的基因位點，其中該至少一種表型可選擇性狀是抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項38或請求項39所述的方法，其中，該“第一目標基因的特定位置”是指該位置處經順次切割並修復後產生的某些突變類型能夠賦予該受體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生至少一種表型可選擇的抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項40所述的方法，其中，該“某些突變類型”包括單鹼基替換、多個鹼基的替換或不特定數目的鹼基插入或缺失。
如請求項38至請求項41中任一項所述的方法，其中，該“某種篩選壓力”是一環境壓力或一添加的化合物壓力；該環境壓力較佳高溫、低溫或低氧；該添加的化合物壓力較佳鹽離子濃度、抗生素、細胞毒素或除草劑。
如請求項38至請求項42中任一項所述的方法，其中，所述的“DNA斷裂”是藉由將具有靶向特性的核酸酶遞送到生物體細胞內與基因組DNA特定位置接觸實現的。
如請求項43所述的方法，其中，所述的“具有靶向特性的核酸酶”為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。
如請求項38至請求項44中任一項所述的方法，其中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。
如請求項38至請求項45中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是由同一種CRISPR/Cas核酸酶與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項38至請求項45中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”是由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas核酸酶與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項38至請求項47中任一項所述的方法，其中，該“第二目標基因”是指編碼與第一目標基因不同的其它基因。
如請求項38至請求項48中任一項所述的方法，其中，該“針對至少一個第二目標基因的靶向核酸酶”與在第一目標基因特定位置上產生DNA斷裂使用的CRISPR/Cas核酸酶相同或不同。
如請求項38至請求項45、請求項48至請求項49中任一項所述的方法，其中，該靶向核酸酶以DNA形式存在。
如請求項38至請求項49中任一項所述的方法，其中，該靶向核酸酶以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。
如請求項43至請求項51中任一項所述的方法，其中，將靶向核酸酶遞送到細胞內的方法選自1）PEG介導的細胞轉染的方法；2）脂質體介導的細胞轉染的方法；3）電擊轉化的方法；4）顯微注射；5）基因槍轟擊；或6）農桿菌介導的轉化方法。
一種對生物體基因組進行非轉基因瞬時編輯的方法，包括以下步驟： 1）針對受體細胞第一目標基因的特定位置設計並合成至少兩條crRNA片段組合或至少兩條sgRNA片段組合，該crRNA組合與tracrRNA結合或單獨使用sgRNA組合能夠引導對應的Cas蛋白在受體細胞第一目標基因的特定位置上依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2）將適量CRISPR/Cas蛋白或其相應的mRNA與上述預先設計合成的能夠引導第一目標基因定點編輯產生內源篩選標記的crRNA片段組合和tracrRNA片段或單獨sgRNA片段組合混合，可選的，進一步加入至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段，在體外孵育形成RNP複合體； 3）將上述RNP複合體遞送到受體細胞中，與基因組DNA特定位置接觸實現基因編輯； 4）根據RNP複合體對第一目標基因的定點編輯產生的表型可選擇的性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物，以及可選的，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二、第三或更多目標基因的編輯事件的細胞、組織、器官或完整的生物。
如請求項53所述的方法，其中，該“第一目標基因”是編碼至少一種表型可選擇性狀的基因位點，其中該至少一種表型可選擇性狀是抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項53或請求項54所述的方法，其中，該“第一目標基因的特定位置”是指該位置處經順次切割並修復後產生的某些突變類型能夠賦予該受體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生至少一種表型可選擇的抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項55所述的方法，其中，該“某些突變類型”包括單鹼基替換、多個鹼基的替換或不特定數目的鹼基插入或缺失。
如請求項55或請求項56所述的方法，其中，該“某種篩選壓力”是環境壓力或添加的化合物壓力；該環境壓力較佳高溫、低溫或低氧；該添加的化合物壓力較佳鹽離子濃度、抗生素、細胞毒素或除草劑。
如請求項53至請求項57中任一項所述的方法，其中，所述的CRISPR/Cas蛋白為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。
如請求項53至請求項58中任一項所述的方法，其中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。
如請求項53至請求項59中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”由同一種CRISPR/Cas蛋白與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項53至請求項59中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas蛋白與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項53至請求項61中任一項所述的方法，其中，該“第二、第三或更多目標基因”是指編碼與第一目標基因不同的其它基因。
如請求項53至請求項62中任一項所述的方法，其中，該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA共用同一種Cas蛋白。
如請求項53至請求項62中任一項所述的方法，其中，該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA使用識別不同PAM序列的Cas蛋白。
如請求項53至請求項64中任一項所述的方法，其中，將該RNP複合體遞送到細胞內的方法選自1）PEG介導的細胞轉染的方法；2）脂質體介導的細胞轉染的方法；3）電擊轉化的方法；4）顯微注射；或5）基因槍轟擊。
一種對植物基因組進行非轉基因瞬時編輯的方法，包括以下步驟： 1）針對受體植物細胞或組織第一目標基因的特定位置設計並合成至少兩條crRNA片段組合或至少兩條sgRNA片段組合，該crRNA組合與tracrRNA結合或單獨使用sgRNA組合能夠引導對應的Cas蛋白在受體細胞第一目標基因的特定位置上依次產生兩個以上的DNA斷裂並分別自發修復，其中在後的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復後產生的新序列為基礎產生； 2）將適量CRISPR/Cas蛋白或其相應的mRNA與上述預先設計合成的能夠引導第一目標基因定點編輯產生內源篩選標記的crRNA片段組合和tracrRNA片段或單獨sgRNA片段組合混合，可選的，進一步加入至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段，在體外孵育形成RNP複合體； 3）將上述RNP複合體遞送到受體植物細胞或組織中，與基因組DNA特定位置接觸實現基因編輯； 4）根據RNP複合體對第一目標基因的定點編輯產生的表型可選擇的性狀，施加相對應的篩選壓力對該性狀進行選擇，分離出含有該類編輯事件的細胞、組織、器官或完整的植物，以及可選的，分離出同時含有第一目標基因與至少一個第二、第三或更多目標基因的編輯事件的細胞、組織、器官或完整的植物。
如請求項66所述的方法，其中，該“第一目標基因”是編碼至少一種表型可選擇性狀的基因位點，其中該至少一種表型可選擇性狀是抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項66或請求項67所述的方法，其中，該“第一目標基因的特定位置”是指該位置處經順次切割並修復後產生的某些突變類型能夠賦予該受體細胞對某種篩選壓力的抗性，產生至少一種表型可選擇的抗性/耐受性性狀或生長優勢性狀。
如請求項68所述的方法，其中，該“某些突變類型”包括單鹼基替換、多個鹼基的替換或不特定數目的鹼基插入或缺失。
如請求項68或請求項69所述的方法，其中，該“某種篩選壓力”是環境壓力或添加的化合物壓力；該環境壓力較佳高溫、低溫或低氧；該添加的化合物壓力較佳鹽離子濃度、抗生素、細胞毒素或除草劑。
如請求項66至請求項70中任一項所述的方法，其中，該“受體植物細胞或組織”為任何能作為瞬時表達受體並能經過組織培養再生為完整植株的細胞或組織；該細胞較佳為原生質體細胞或懸浮細胞；該組織較佳為愈傷組織、幼胚、成熟胚、葉片、莖尖、幼穗或下胚軸。
如請求項66至請求項71中任一項所述的方法，其中，所述的CRISPR/Cas蛋白為所有能實現基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。
如請求項66至請求項72中任一項所述的方法，其中，所述的“特定位置上按先後順序依次產生兩個以上的DNA斷裂”是指針對由CRISPR/Cas系統編輯產生的在先的DNA斷裂修復事件形成的新序列設計新的靶向RNA，對該位點再次進行切割。
如請求項66至請求項73中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”由同一種CRISPR/Cas蛋白與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項66至請求項73中任一項所述的方法，其中，該“兩個以上的DNA斷裂”由兩種以上識別不同PAM序列的CRISPR/Cas蛋白與對應的gRNA或sgRNA分別組成RNP複合體按先後順序切割對應的靶點序列產生。
如請求項66至請求項75中任一項所述的方法，其中，該“第二、第三或更多目標基因”是指編碼與第一目標基因不同的其它基因。
如請求項66至請求項76中任一項所述的方法，其中，該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA共用同一種Cas蛋白。
如請求項66至請求項76中任一項所述的方法，其中，該“至少一個靶向第二、第三或更多目標基因的人工合成的crRNA和tracrRNA片段或人工合成的sgRNA片段”與靶向第一目標基因的crRNA或sgRNA使用識別不同PAM序列的Cas蛋白。
如請求項66至請求項78中任一項所述的方法，其中，將該RNP複合體遞送到植物細胞內的方法選自1）PEG介導的原生質體轉化的方法；2）顯微注射；3）基因槍轟擊；4）碳化矽纖維介導法；或5)真空滲入法或其他任何瞬時導入方法。
如請求項66至請求項79中任一項所述的方法，其中，該“第一目標基因”是編碼選自除草劑抗性/耐受性的至少一種表型可選擇性狀的至少一個內源基因，其中除草劑抗性/耐受性選自包括對EPSPS抑制劑的抗性/耐受性、對穀氨醯胺合成抑制劑的抗性/耐受性、對ALS或AHAS抑制劑的抗性/耐受性、對ACCase抑制劑的抗性/耐受性、對類胡蘿蔔素生物合成抑制劑的抗性/耐受性、對纖維素抑制劑的抗性/耐受性、對脂質合成抑制劑的抗性/耐受性、對長鏈脂肪酸抑制劑的抗性/耐受性、對微管組裝抑制劑的抗性/耐受性、對光系統I電子分流劑的抗性/耐受性、對光系統II抑制劑的抗性/耐受性或對PPO抑制劑的抗性/耐受性和對合成生長素的抗性/耐受性；較佳地，該“第一目標基因”選自PsbA、ALS、EPSPS、ACCase、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、TIR1或AFB5。
如請求項80所述的方法，其中，該“第一目標基因”為ALS，該“基因的特定位置”是指擬南芥AtALS蛋白氨基酸序列位點A122、P197、R198、D204、A205、D376、R377、W574、S653或G654，以及以AtALS氨基酸序列為參照標準的其它植物的ALS蛋白相對應的上述氨基酸位點；或該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼AtALS蛋白氨基酸序列位點A122、P197、R198、D204、A205、D376、R377、W574、S653、G654或其任意組合的序列的靶序列，以及以AtALS氨基酸序列為參照標準的其它植物的ALS蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。
如請求項80所述的方法，其中，該“第一目標基因”為ACCase，該“基因的特定位置”是指大穗看麥娘AmACCase蛋白氨基酸序列位點I1781、E1874、N1878、W1999、W2027、I2041、D2078、C2088或G2096，以及以AmACCase氨基酸序列為參照標準的其它單子葉植物的ACCase蛋白相對應的上述氨基酸位點；或該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼AmACCase基因氨基酸序列位點I1781、E1874、N1878、W1999、W2027、I2041、D2078、C2088、G2096或其任意組合的序列的靶序列，以及以AmACCase氨基酸序列為參照標準的其它單子葉植物的ACCase蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。
如請求項80所述的方法，其中，該“第一目標基因”為HPPD，該“基因的特定位置”是指水稻OsHPPD蛋白氨基酸序列位點H141、L276、P277、N338、G342、R346、D370、P386、K418或G419，以及以OsHPPD氨基酸序列為參照標準的其它植物的HPPD蛋白相對應的上述氨基酸位點；或該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsHPPD基因氨基酸序列位點H141、L276、P277、N338、G342、R346、D370、P386、K418、G419或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsHPPD氨基酸序列為參照標準的其它植物的HPPD蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。
如請求項80所述的方法，其中，該“第一目標基因”為PPO，該“基因的特定位置”是指水稻OsPPO1蛋白氨基酸序列位點S128、V217、S223、V364、K373、L423、Y425或W470，以及以OsPPO1氨基酸序列為參照標準的其它植物的PPO蛋白相對應的上述氨基酸位點；或該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsPPO1基因氨基酸序列位點S128、V217、S223、V364、K373、L423、Y425、W470或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsPPO1氨基酸序列為參照標準的其它植物的PPO蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。
如請求項80所述的方法，其中，該“第一目標基因”為TIR1，該“基因的特定位置”是指水稻OsTIR1蛋白氨基酸序列位點F93、F357、C413或S448，以及以OsTIR1氨基酸序列為參照標準的其它植物的TIR1蛋白相對應的上述氨基酸位點；或該crRNA或sgRNA靶向包含選自編碼OsTIR1基因氨基酸序列位點F93、F357、C413、S448或其任意組合的序列的靶序列，以及以OsTIR1氨基酸序列為參照標準的其它植物的TIR1蛋白相對應的上述氨基酸位點及其任意組合的序列的靶序列。
一種採用如請求項53至請求項85中任一項所述方法的非轉基因瞬時編輯系統。
如請求項86該非轉基因瞬時編輯系統在作為篩選標記或疾病治療或生物育種中的用途。
一種採用如請求項66至請求項85中任一項所述方法獲得的遺傳修飾植物，其基因組中包含： 1）第一目標基因的編輯事件； 2）第一目標基因的編輯事件和至少一個第二目標基因的編輯事件；或 3）至少一個第二靶點基因的編輯事件，其中第一目標基因的編輯事件已經過遺傳分離去除；其中，該遺傳修飾植物是非轉基因方式獲得的。
一種採用如請求項66至請求項85中任一項所述方法獲得的植物基因新突變。
一種在植物內產生的新突變，其包括以下類型中的一個或兩個以上的組合：對應於擬南芥ALS376位置處的天冬氨酸被任何其他氨基酸取代、ALS574位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代、ALS653位置處的絲氨酸被任何其他氨基酸取代、或ALS654位置處的絲氨酸被任何其他氨基酸取代；或者，對應於大穗看麥娘ACCase2027位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代。
如請求項90所述的突變，其中，對應於擬南芥ALS376位置處的天冬氨酸被谷氨酸取代、ALS574位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代、ALS653位置處的絲氨酸被天冬醯胺或精氨酸取代、或ALS654位置處的甘氨酸被天冬氨酸取代；或者，對應於大穗看麥娘ACCase2027位置處的色氨酸被亮氨酸或半胱氨酸取代。
如請求項90所述的突變，其中，水稻ALS350位置處的天冬氨酸被任何其他氨基酸取代、水稻ALS548位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代、或馬鈴薯ALS2 561位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代；或者，水稻ACCase2 2038位置處的色氨酸被任何其他氨基酸取代。
如請求項90至請求項92中任一項所述的突變，其中，水稻ALS350位置處的天冬氨酸被谷氨酸取代、水稻ALS548位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代、或馬鈴薯ALS2 561位置處的色氨酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代；或者，水稻ACCase2 2038位置處的色氨酸被亮氨酸或半胱氨酸取代。
一種具有如請求項89至請求項93中任一項所述新突變的蛋白或其生物活性片段。
一種核酸，其包含編碼如請求項94所述的蛋白或其生物活性片段的核酸序列或者其互補序列。
一種重組表達載體，其包含如請求項95所述的核酸，以及與之可操作地連接的啟動子。
一種表達盒，其中包含如請求項95所述的核酸。
一種植物細胞，其中包含有如請求項97所述的表達盒。
一種採用如請求項98所述植物細胞再生成的植物。
一種生產對於除草劑的抗性或耐受性提高的植物的方法，其中包括用請求項96所述的重組表達載體或請求項97所述的表達盒轉化或轉染植物細胞，並將經轉化或轉染的植物細胞再生成植物。
一種控制植物栽培場所的雜草的方法，其中該植物包括請求項88或請求項99所述的植物或者藉由請求項100所述方法製備的植物，該方法包括對該栽培場所施用控制雜草有效量的一種或多種除草劑。
如請求項89至請求項93中任一項所述新突變、請求項94所述的蛋白或其生物活性片段、請求項95所述的核酸、請求項96所述的重組表達載體或請求項97所述的表達盒在提高植物細胞、植物組織、植物部分或植物的除草劑抗性或耐受性上的應用。