JP2024516693A - 生物内で新規遺伝子を生成する方法およびその利用 - Google Patents

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ワン、チヤオ
モー、ストン
チェン、ボー
フー、チアン
ティン、トーホイ
リー、ホアロン
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Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co Ltd
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Abstract

人工ＤＮＡテンプレートの非存在下で生物内で新規遺伝子を作製する方法およびその用途が提供される。この方法は、生物のゲノム中の２つ以上の異なる特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成する工程であって、前記特異的部位が、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離できるゲノム部位であり、前記ＤＮＡ切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復により互いに連結される前記工程、元のゲノム配列とは異なる遺伝要素またはタンパク質ドメインの新規組み合わせを生成し、それにより前記新規遺伝子を作製する工程を含。前記新規遺伝子は、生物の成長、発達、抵抗性、収量およびその他の形質を変化させる可能性がある。

Description

本発明は、遺伝子工学およびバイオインフォマティクスの技術分野に関し、特に、人工ＤＮＡテンプレートの非存在下で生物内で新規遺伝子を作製する方法およびその利用に関する。
一般的に、生物における完全な遺伝子発現カセットは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コード領域（ＣＤＳ）または非コードＲＮＡ領域（Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ターミネータ、およびその他多くの要素含む。非コードＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを含むＲＮＡレベルでの生物学的機能を行うことができる。ＣＤＳ領域にはエクソンおよびイントロンが含まれる。転写されたＲＮＡがタンパク質に翻訳された後、通常、異なるセグメントのアミノ酸が異なるドメインを形成する。特定のドメインは、タンパク質の細胞内局在および機能を決定する（核局在シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、酵素触媒中心等）。非コードＲＮＡの場合、セグメントが異なれば機能も異なる。遺伝子の１つまたは複数の要素が変化すると、新しい機能を有し得る新規遺伝子が形成される。例えば、蟠桃のＰｐＯＦＰ１遺伝子の上流で１．７Ｍｂの染色体断片の反転事象が発生すると新規プロモーターが生成される場合があり、これにより果実発達のＳ２段階にある平らな形状の桃果実におけるＰｐＯＦＰ１の発現が、丸い形状の桃の果実に比べて大幅に増加し、それにより蟠桃では桃の果実の垂直方向の発達が阻害され、平らな形状の表現型が得られる（Zhou et al. 2018. A 1.7-Mb chromosomal inversion downstream of a PpOFP1 gene is responsible for flat fruit shape in peach. Plant Biotechnol. J. DOI: 10.1111/pbi.13455）。
生物学的ゲノム内で新規遺伝子が自然に生成されるには、長い進化のプロセスが必要である。研究成果によると、新規遺伝子を生成する分子機構としては、エクソン再配列、遺伝子重複、レトロトランスポジション、可動要素（トランスポゾン、レトロトランスポゾン）の統合、遺伝子水平伝達、遺伝子融合分割、ｄｅ ｎｏｖｏ生成、および多くの他の機構等が挙げられ、新規遺伝子は、派生および機能進化を通じた自然選択の作用下で種内に保持され得る。ショウジョウバエ、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、および霊長類において同定された比較的若い新規遺伝子は、計算によると数十万年から数百万年の歴史を有している（Long et al. 2012. The origin and evolution of new genes. Methods Mol Biol. DOI: 10.1007/978-1-61779-585-5_7）。したがって、植物を例にとると、遺伝子工学および生物学的育種の分野では、植物に新規遺伝子を導入したい場合、（たとえ新規遺伝子のすべての遺伝要素がその種自体の異なる遺伝子に由来しているとしても）、それは遺伝子組み換え技術によってのみ達成され得る。すなわち、異なる遺伝子の要素がｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられて新規遺伝子が形成され、次いでトランスジェニック技術によって植物に導入される。これは、新規遺伝子の構築をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う必要があり、その結果、トランスジェニック作物が得られることを特徴としている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等に代表される遺伝子編集ツールは、生物のゲノム上の特異的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的かつ正確に生成することができ、細胞自身の非相同末端修復または相同組換え機構により二本鎖切断（ＤＳＢ）が修復され、それにより部位特異的変異が生成される。遺伝子編集技術の現在の応用は、主に単一遺伝子の内部要素の編集、主にＣＤＳエクソン領域の編集に焦点を当てている。エクソンを編集すると、通常、遺伝子にフレームシフト変異が生じ、遺伝子の機能が失われる。このため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等の遺伝子編集ツールは、遺伝子ノックアウト（すなわち、遺伝子破壊）ツールとしても知られている。ＣＤＳ領域に加えて、プロモーター、５’ＵＴＲおよびその他の領域もノックアウトして、遺伝子の発現レベルに影響を与え得る。これらの方法はすべて、新規遺伝子を生成することなく既存の遺伝子を突然変異させるため、生産上の一部のニーズを満たすことが困難である。例えば、ほとんどの遺伝子について、既存の遺伝子編集技術では遺伝子発現の上方制御を達成することが困難であり、タンパク質の細胞内局在を変更したり、タンパク質の機能ドメインを変更したりすることも困難である。文献には、既存の遺伝子の上流にプロモーターまたはエンハンサー配列を挿入して、遺伝子の発現パターンを変化させて新規の形質を生み出すという報告もあるが（Lu et al. 2020. Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice. Nat Biotechnol. DOI: 10.1038/s41587-020-0581-5）、この方法には外来ＤＮＡテンプレートの提供が必要なため、遺伝子組み換え作物と同様の厳しい規制手順が適用され、適用が制限されている。
従来技術における上記問題を解決するために、本発明は、人工ＤＮＡテンプレートの非存在下で、生物のゲノム内の特異的部位の組み合わせにおいて２つ以上のＤＮＡ二本鎖切断を同時に生じさせることにより、生物において新規遺伝子を作製する方法、およびその使用を提供する。
一つの態様において、本発明は、生物において新規遺伝子を作製する方法であって、下記の工程：
前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成する工程であって、前記特異的部位が、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離できるゲノム部位であり、前記ＤＮＡ切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復により互いに連結される前記工程、元のゲノム配列と異なる遺伝要素またはタンパク質ドメインの新規組み合わせを生成し、それにより前記新規遺伝子を作製する工程
を含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、生物において安定に継承される新規遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで作製する方法であって、下記の工程：
（１）前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特異的部位で二本鎖ＤＮＡ切断を同時に生成する工程であって、前記特異的部位が、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離することができ、前記ＤＮＡ切断が次いで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復により互いに連結される前記工程、元のゲノム配列に由来する異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規組み合わせまたはアセンブリを生成し、それにより前記新規遺伝子を生成する工程；
特定の実施形態において、（２）前記新規組み合わせまたはアセンブリを特異的に検出できるプライマー対を設計する工程であって、次いで、前記新規遺伝子を含む細胞または組織がＰＣＲ検査によってスクリーニングされ得、前記遺伝要素の新規組み合わせの特徴的な配列がシーケンシングにより決定され得る前記工程；および
（３）前記スクリーニングされた細胞または組織を培養してＴ０世代生物を得、Ｔ０世代およびその育種されたＴ１を含む連続的な２世代または少なくとも連続的な３世代の生物に対してＰＣＲ試験およびシーケンシングを行って、前記遺伝要素の新規組み合わせの特徴的な配列を含む前記生物を選択する工程、すなわち安定に継承される新規遺伝子を生物において製造する工程
を含み；
任意に、（４）前記新規遺伝子の機能に関連する生物学的形質または表現型を試験して、前記生物に有益な形質をもたらすことができる遺伝子型を決定し、安定に継承される新規機能的遺伝子を得る工程を含む方法を提供する。
特定の実施形態において、前記工程（１）において、前記ＤＮＡ切断が前記生物のゲノム中の２つの異なる特異的部位で同時に生成され、一方の部位が、遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間のゲノム遺伝子座であり、他方の部位が、異なる発現パターンを有する別の遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間にあり、それにより一方の遺伝子のプロモーターと、異なる発現パターンを有する他方の遺伝子のコード領域との新規組み合わせが生じ；好ましくは、強力なプロモーターと目的の遺伝子との組み合わせが最終的に生成される。
別の特定の実施形態において、前記工程（１）において、前記ＤＮＡ切断が前記生物のゲノム中の３つの異なる特異的部位で同時に生成され、該３つの特異的部位が、高度に発現される遺伝子のプロモーター領域を切断することができる２つのゲノム部位の組み合わせ、および異なる発現パターンを有する目的の遺伝子のコード領域とプロモーター領域との間の第３のゲノム部位を含むか；または、高度に発現される遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間のゲノム部位、および異なる発現パターンを有する目的の遺伝子のコード領域断片を切断できる別の２つのゲノム部位の組み合わせを含み；次いで、上記部位における遺伝子編集により、目的の遺伝子のコード領域の上流に挿入される強力なプロモーター断片、または目的の遺伝子のコード領域断片が高度に発現される別の遺伝子のプロモーターの下流に挿入される転座編集イベントが発生し、最終的に、一つの遺伝子のプロモーターと、異なる発現パターンを有する別の目的の遺伝子のコード領域との組み合わせが生成される。
特定の実施形態において、「２つ以上の異なる特異的部位」は、同一の染色体上に位置してもよく、異なる染色体上に位置してもよい。それらが同一の染色体上に位置する場合、２つの特異的部位で同時に発生するＤＮＡ切断によって生じる染色体断片は、修復後に欠失、反転、または複製が二重になる可能性がある。それらが異なる染色体上に位置する場合、２つの特異的部位で生じたＤＮＡ切断は修復後に互いに連結され、染色体アームの交差イベントが発生する可能性がある。これらのイベントは、特別に設計されたプライマーを用いたＰＣＲシーケンスによって同定およびスクリーニングできる。
特定の実施形態において、「２つ以上の異なる特異的部位」は、少なくとも２つの異なる遺伝子上の特異的部位であってもよく、同一の遺伝子上の少なくとも２つの異なる特異的部位であってもよい。
特定の実施形態では、「少なくとも２つの異なる遺伝子」の転写方向は、同一であっても異なっていてもよい（互いに反対方向または向かい合う方向）。
「遺伝要素」には、遺伝子のプロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コード領域（ＣＤＳ）または非コードＲＮＡ領域（非コードＲＮＡ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）およびターミネーターが含まれる。
特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせは、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子のうちの一方のプロモーターと、他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域との組み合わせを指す。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせは、異なる発現パターンを有する２つの遺伝子のうちの一方のプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域と、他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域との組み合わせを指す。
特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、遺伝子発現の異なるレベルを指す。
別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、異なる組織特異的な遺伝子発現を指す。
別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、遺伝子発現の異なる発生段階特異性を指す。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせは、同一の遺伝子内の隣接する遺伝要素の組み合わせである。
「タンパク質ドメイン」とは、タンパク質の特定の機能ドメインに対応するＤＮＡ断片を指し；限定されないが、核局在化シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、リン酸化部位、メチル化部位、膜貫通ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、受容体活性化ドメイン、酵素触媒中心等が挙げられる。
特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組み合わせは、異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在シグナル領域と、他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域との組み合わせを指す。
特定の実施形態において、「異なる細胞内位置」としては、限定されないが、核局在、細胞質局在、細胞膜局在、葉緑体局在、ミトコンドリア局在、または小胞体膜局在が挙げられる。
別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組み合わせは、異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメインの組み合わせを指す。
特定の実施形態において、「異なる生物学的機能」としては、限定されないが、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドへの結合、小分子シグナルへの結合、イオンへの結合、または特異的酵素反応が挙げられる。
別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組み合わせは、同一の遺伝子内の隣接するタンパク質ドメインの組み合わせを指す。
別の特定の実施形態において、遺伝要素とタンパク質ドメインとの組み合わせは、タンパク質ドメインと、同一の遺伝子内の隣接するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーターの組み合わせを指す。
具体的には、異なる遺伝子のプロモーターの交換は、染色体断片の反転によって達成され得；同一の染色体上に位置する２つの遺伝子が異なる方向を有する場合、２つの遺伝子それぞれのプロモーターとＣＤＳとの間の特異的部位でＤＮＡ切断が発生する可能性があり、切断間の領域が反転すると、これら２つの遺伝子のプロモーターが交換され、反転した染色体セグメントの両端に２つの新規遺伝子が生成される。２つの遺伝子の異なる方向は、それらの５’末端が内部にある、すなわち両方の遺伝子が反対の方向を向いているか、またはそれらの５’末端が外部にある、すなわち両方の遺伝子が互いに向かい合っている可能性がある。遺伝子が反対方向にある場合、図２のスキーム１に示すように、遺伝子のプロモーターは反転し；遺伝子が互いに向かい合っている場合、図４のスキーム１に示すように、遺伝子のＣＤＳ領域は反転される。反転された領域は、間に他の遺伝子が存在しない場合、長さは１０ｋｂ未満という短いものにすることができ；または、反転領域は非常に長く、最大３００ｋｂ～３Ｍｂに達し、数百の遺伝子を含み得る。
染色体断片を倍加して新規遺伝子を生成することもでき；同一の染色体上にある２つの遺伝子が同じ方向にある場合、２つの遺伝子それぞれのプロモーターとＣＤＳとの間の特異的部位でＤＮＡ切断が発生する可能性があり、図１スキーム１および図３に示すように、切断間の領域は複製により倍化され得、下流遺伝子のプロモーターを上流遺伝子のＣＤＳ領域に融合することにより、倍化したセグメントの接合部に新規遺伝子が生成される。倍化領域の長さは５００ｂｐ～５Ｍｂの範囲であり、間に他の遺伝子が存在しない非常に短い場合もあれば、数百の遺伝子を含む非常に長い場合もある。この方法では、元の２つの遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域との間の領域に点突然変異が誘発されるが、このような小規模な点突然変異は一般に遺伝子発現の特性にほとんど影響を与えないが、プロモーターの置換によって生成された新規遺伝子は新しい表現特性を有する。あるいは、同一の遺伝子のタンパク質ドメインの両側の特定の位置でＤＮＡ切断を生成し、複製によって切断間の領域を２倍にし、それによって特定の機能ドメインが倍化した新規遺伝子を生成することもできる。
本発明はまた、本方法により得ることができる新規遺伝子を提供する。
元の遺伝子と比較して、新規遺伝子は異なるプロモーターを有しているため、組織、強度、発達段階の点で発現特性が異なるか、新規のアミノ酸配列を有し得る。
「新規アミノ酸配列」は、２つ以上の遺伝子の全体もしくは部分的なコード領域の融合、または同一の遺伝子の部分的なタンパク質コード領域の倍加のいずれかであり得る。
本発明はさらに、生物における抵抗性／耐性形質または成長有利形質の付与または改善における遺伝子の使用を提供する。
特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は植物強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素はＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯ、ＡＬＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＧＳ、ＰＤＳ、ＤＨＰＳ、ＤＸＰＳ、ＨＳＴ、ＳＰＳ、同一の植物のセルロース合成、ＶＬＣＦＡＳ、脂肪酸チオエステラーゼ、セリンスレオニンプロテインホスファターゼまたはリコペンシクラーゼ遺伝子コード領域である。
特定の実施形態において、本発明は、本方法によって得ることができる新規遺伝子も提供し、該新規遺伝子の発現レベルは、植物の内因性の野生型ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯ、ＡＬＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＧＳ、ＰＤＳ、ＤＨＰＳ、ＤＸＰＳ、ＨＳＴ、ＳＰＳ、セルロース合成、ＶＬＣＦＡＳ、脂肪酸チオエステラーゼ、セリンスレオニンプロテインホスファターゼまたはリコペンシクラーゼ遺伝子と比較して上方制御されている。
特定の実施形態において、本発明はまた、植物細胞、植物組織、植物部分または植物における対応するＨＰＰＤの阻害、ＥＰＳＰＳの阻害、ＰＰＯの阻害、ＡＬＳの阻害、ＡＣＣａｓｅの阻害、ＧＳの阻害、ＰＤＳの阻害、ＤＨＰＳの阻害、ＤＸＰＳの阻害、ＨＳＴの阻害、ＳＰＳの阻害、セルロース合成の阻害、ＶＬＣＦＡＳの阻害、脂肪酸チオエステラーゼの阻害、セリンスレオニンプロテインホスファターゼの阻害、またはリコペンシクラーゼ除草剤の阻害に対する抵抗性または耐性の改善における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は生物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素は同一の生物内のＰ４５０ファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明は、本方法によって得ることができる新規遺伝子も提供し、新規遺伝子発現のレベルは、生物の対応する内因性の野生型Ｐ４５０遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、生物学的解毒能力、ストレス耐性または二次代謝能力の増強における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、前記Ｐ４５０遺伝子は、イネＯｓＣＹＰ８１Ａ遺伝子またはトウモロコシＺｍＣＹＰ８１Ａ９遺伝子である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、イネ内因性ＯｓＣＹＰ８１Ａ６遺伝子またはトウモロコシ内因性ＺｍＣＹＰ８１Ａ９遺伝子と比較してそれぞれ上方制御される。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、除草剤に対するイネまたはトウモロコシの抵抗性または耐性の改善における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素はトウモロコシの強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素はトウモロコシ遺伝子ＺＭＭ２８（Ｚｍ００００１ｄ０２２０８８）、ＺｍＫＮＲ６またはＺｍＢＡＭ１ｄのコード領域。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、植物の内因性の野生型ＺＭＭ２８遺伝子、ＺｍＫＮＲ６遺伝子またはＺｍＢＡＭ１ｄ遺伝子と比較してそれぞれ上方制御される。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、トウモロコシ収量の改善における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素はイネの強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素はイネ遺伝子ＣＯＬＤ１またはＯｓＣＰＫ２４のコード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、イネの内因性の野生型ＣＯＬＤ１遺伝子またはＯｓＣＰＫ２４と比較してそれぞれ上方制御される。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、イネの耐寒性の向上における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は強力な内因性プロモーター、または生物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素は同一の生物内のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、生物の対応する内因性の野生型ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、生物学的解毒能力またはストレス耐性の増強における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態では、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は植物の強力な内因性プロモーターであるか、または植物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素は同一の植物内のＮＡＣ転写因子ファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である。
別の特定の実施形態において、前記ＮＡＣ転写因子ファミリー遺伝子は、ＯｓＮＡＣ０４５、ＯｓＮＡＣ６７、ＺｍＳＮＡＣ１、ＯｓＮＡＣ００６、ＯｓＮＡＣ４２、ＯｓＳＮＡＣ１またはＯｓＳＮＡＣ２である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、対応する植物の内因性の野生型ＮＡＣ転写因子ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、植物のストレス耐性または植物収量の向上における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は植物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素は同一の植物内のＭＹＢ、ＭＡＤＳ、ＤＲＥＢおよびｂＺＩＰ転写因子ファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、対応する植物の内因性の野生型ＭＹＢ転写因子遺伝子、ＭＡＤＳ転写因子ファミリー遺伝子、ＤＲＥＢ転写因子ファミリー遺伝子コード領域またはｂＺＩＰ転写因子ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、植物のストレス耐性の増強または植物の成長および発達の調節における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は表Ａに列挙される過剰発現または組織特異的発現イネ遺伝子のいずれか１つのプロモーターであり、他方はイネの遺伝子に対応する選択されたプロモーターとは異なる別の遺伝子のタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子の発現パターンは、イネの内因性の遺伝子の選択されたタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域と比較して変化している。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、イネの成長および発達の調節における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は表Ｂ～Ｋに列挙される生物学的機能遺伝子のいずれか１つから選択されるタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域であり、他方は選択された遺伝子に対応する生物学的ゲノムの選択された機能遺伝子とは異なる別の遺伝子のプロモーター領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子が提供し、新規遺伝子の発現パターンは、選択された機能遺伝子と比較して変化している。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、生物の成長および発達の調節における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は生物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方は同一の生物内のＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）ファミリーである。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、生物の対応する内因性のＧＳＴ（グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ）ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、生物学的解毒能力またはストレス耐性の増強における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、前記ＧＳＴファミリー遺伝子は、コムギＧＳＴ Ｃｌａ４７（ＡＹ０６４４８０．１）遺伝子、コムギＧＳＴ １９Ｅ５０（ＡＹ０６４４８１．１）遺伝子、コムギＧＳＴ ２８Ｅ４５（ＡＹ４７９７６４．１）遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ６遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ３１遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＩＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＧＳＴ５遺伝子またはトウモロコシＧＳＴ７遺伝子である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、内因性のコムギＧＳＴ Ｃｌａ４７（ＡＹ０６４４８０．１）遺伝子、コムギＧＳＴ１９Ｅ５０（ＡＹ０６４４８１．１）遺伝子、コムギＧＳＴ２８Ｅ４５（ＡＹ４７９７６４．１）遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ６遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ３１遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＩＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＧＳＴ５遺伝子またはトウモロコシＧＳＴ７遺伝子と比較してそれぞれ上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、除草剤に対するコムギまたはトウモロコシの抵抗性または耐性の改善における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素はイネの強力な内因性プロモーターであるか、または生物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素はイネの遺伝子タンパク質ＧＩＦ１（Ｏｓ０４ｇ０４１３５００）、ＮＯＧ１（Ｏｓ０１ｇ０７５２２０）、ＬＡＩＲ（Ｏｓ０２ｇ０１５４１００）、ＯＳＡ１（Ｏｓ０３ｇ０６８９３００）、ＯｓＮＲＴ１．１Ａ（Ｏｓ０８ｇ０１５５４００）、ＯｓＮＲＴ２．３Ｂ（Ｏｓ０１ｇ０７０４１００）、ＯｓＲａｃ１（Ｏｓ０１ｇ０２２９４００）、ＯｓＮＲＴ２．１（Ｏｓ０２ｇ０１１２１００）、ＯｓＧＩＦ１（Ｏｓ０３ｇ０７３３６００）、ＯｓＮＡＣ９（Ｏｓ０３ｇ０８１５１００）、ＣＰＢ１／Ｄ１１／ＧＮＳ４（Ｏｓ０４ｇ０４６９８００）、ｍｉＲ１４３２（Ｏｓ０４ｇ０４３６１００）、ＯｓＮＬＰ４（Ｏｓ０９ｇ０５４９４５０）、ＲＡＧ２（Ｏｓ０７ｇ０２１４３００）、ＬＲＫ１（Ｏｓ０２ｇ０１５４２００）、ＯｓＮＨＸ１（Ｏｓ０７ｔ０６６６９００）、ＧＷ６（Ｏｓ０６ｇ０６２３７００）、ＷＧ７（Ｏｓ０７ｇ０６６９８００）、Ｄ１１／ＯｓＢＺＲ１（Ｏｓ０４ｇ０４６９８００、Ｏｓ０７ｇ０５８０５００）、ＯｓＡＡＰ６（Ｏｓ０７ｇ０１３４０００）、ＯｓＬＳＫ１（Ｏｓ０１ｇ０６６９１００）、ＩＰＡ１（Ｏｓ０８ｇ０５０９６００）、ＳＭＧ１１（Ｏｓ０１ｇ０１９７１００）、ＣＹＰ７２Ａ３１（Ｏｓ０１ｇ０６０２２００）、ＳＮＡＣ１（Ｏｓ０３ｇ０８１５１００）、ＺＢＥＤ（Ｏｓ０１ｇ０５４７２００）、ＯｓＳｔａ２（Ｏｓ０２ｇ０６５５２００）、ＯｓＡＳＲ５（Ｏｓ１１ｇ０１６７８００）、ＯｓＣＰＫ４（Ｏｓ０２ｇ０３４１０）、ＯｓＤｊＡ９（Ｏｓ０６ｇ０１１６８００）、ＥＵＩ（Ｏｓ０５ｇ０４８２４００）、ＪＭＪ７０５（Ｏｓ０１ｇ６７９７０）、ＷＲＫＹ４５（Ｏｓ０５ｔ０３２２９００）、ＯｓＲＳＲ１（Ｏｓ０５ｇ０１２１６００）、ＯｓＲＬＣＫ５（Ｏｓ０１ｇ０１１４１００）、ＡＰＩＰ４（Ｏｓ０１ｇ０１２４２００）、ＯｓＰＡＬ６（Ｏｓ０４ｔ０５１８４００）、ＯｓＰＡＬ８（Ｏｓ１１ｇ０７０８９００）、ＴＰＳ４６（Ｏｓ０８ｔ０１６８０００）、ＯｓＥＲＦ３（Ｏｓ０１ｇ５８４２０）およびＯｓＹＳＬ１５（Ｏｓ０２ｇ０６５０３００）のいずれか１つのコード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得られる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子発現のレベルは、対応する内因性遺伝子と比較して上方制御されている。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、イネ育種における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なる遺伝要素の組み合わせにおいて、一方の要素は魚の内因性の強力プロモーターであり、他方は選択された魚のＧＨ１（成長ホルモン１）の遺伝子コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、この方法によって得ることができる魚の内因性の高発現ＧＨ１遺伝子を提供する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、魚の育種における魚の内因性の高発現ＧＨ１遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組み合わせにおいて、一方の要素はコムギの内因性のタンパク質の葉緑体局在化シグナルドメインであり、他方の要素は細胞質局在化ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩｃ）のコムギ成熟タンパク質コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子は、コーディング細胞質と関連してホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子の位置を特定し、その成熟タンパク質は葉緑体に位置する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、コムギ収量の向上における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、異なるタンパク質ドメインの組み合わせにおいて、一方の要素はイネのタンパク質葉緑体局在化シグナルドメイン（ＣＴＰ）であり、他方の要素はＯｓＧＬＯ３、ＯｓＯＸＯ３またはＯｓＣＡＴＣの成熟タンパク質コード領域である。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、本方法によって得ることができる新規遺伝子を提供し、新規遺伝子の成熟タンパク質は、ＯｓＧＬＯ３、ＯｓＯＸＯ３またはＯｓＣＡＴＣとは異なる葉緑体に位置する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、イネの光合成効率の向上における新規遺伝子の使用を提供する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、葉緑体局在化タンパク質ＯｓＣＡＣＴを提供し、該タンパク質をコードするヌクレオチドは：
（１）配列番号２８に示される核酸配列またはその一部もしくは相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、葉緑体局在化タンパク質ＯｓＧＬＯ３を提供し、該タンパク質をコードするヌクレオチドは：
（１）配列番号２９に示される核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する。
別の特定の実施形態において、本発明はまた、イネの光合成効率の向上におけるタンパク質の使用を提供する。
本発明はさらに、
（ａ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方の遺伝子のプロモーター、および他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域；
（ｂ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方の遺伝子の５’非翻訳領域のプロモーターと、他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域との間の領域；
（ｃ）異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在化シグナル領域、および他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域；
（ｄ）異なる機能を有する２つの遺伝子に由来する、異なる生物学的機能を有するタンパク質ドメインの遺伝子コード領域
を含む組成物を提供し、
該組成物は非天然に存在し、生体染色体上に直接結合しており、安定的に遺伝される。
特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、遺伝子発現の異なるレベルを指す。
別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、異なる組織特異的な遺伝子発現を指す。
別の特定の実施形態において、「異なる発現パターン」とは、遺伝子発現の異なる発生段階特異性を指す。
特定の実施形態では、「異なる細胞内位置」としては、限定されないが、核の位置、細胞質の位置、細胞膜の位置、葉緑体の位置、ミトコンドリアの位置、または小胞体膜の位置が挙げられる。
特定の実施形態において、「異なる生物学的機能」とは、限定されないが、特定のＤＮＡまたはＲＮＡの保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドへの結合、小分子シグナルへの結合、イオンへの結合、または特定の酵素反応が挙げられる。
特定の実施形態では、組成物はｉｎ ｖｉｖｏで融合される。
本発明はまた、外来性ＤＮＡドナー断片と独立して、生物における標的内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを調節するための編集方法であって、下記の工程：
プロモーターと、標的内因性遺伝子および所望の発現パターンを有する任意の内因性誘導性発現遺伝子または組織特異的発現遺伝子のコード領域との間の選択された部位で別々に同時にＤＮＡ切断を生成する工程；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によりＤＮＡ切断を互いに連結し、それによって前記標的内因性遺伝子のコード領域と前記任意の誘導性または組織特異的発現プロモーターのｉｎ ｖｉｖｏ融合を生成して、予想される発現パターンを有する新規遺伝子を形成する工程
を含む編集方法を提供する。
特定の実施形態において、標的内因性遺伝子、および所望の発現パターンを有する任意の内因性誘導性または組織特異的発現遺伝子は、同一の染色体上または異なる染色体上に位置する。
特定の実施形態において、標的内因性遺伝子は酵母ＥＲＧ９遺伝子であり、内因性誘導性発現遺伝子はＨＸＴ１遺伝子であり、誘導性発現プロモーターはグルコース濃度に応答するＨＸＴ１である。
本発明はまた、前記編集方法により得ることができる酵母内因性誘導性ＥＲＧ９遺伝子を提供する。
本発明はまた、合成生物学における、酵母内因性誘導性ＥＲＧ９遺伝子の使用を提供する。
特に、本発明はまた、外来性ＤＮＡドナー断片と独立して、生物における標的内因性遺伝子の発現レベルを増大させる編集方法を提供し、下記の工程：プロモーターと、標的内因性遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのＣＤＳとの間の特異的部位にＤＮＡ切断を同時に生成する工程；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によりＤＮＡ切断を互いに連結し、標的内因性遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターのｉｎ ｖｉｖｏ融合を形成し、それにより新規高発現内因性遺伝子を生成する工程を含む編集方法を提供する。この方法は、内因性遺伝子をノックアップする編集方法と名付けられる。
特定の実施形態において、標的内因性遺伝子および任意の高発現内因性遺伝子は、同一の染色体上に位置する。
別の特定の実施形態において、標的内因性遺伝子および任意の高発現内因性遺伝子は、異なる染色体上に位置する。
別の態様において、本発明は、植物における内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法を提供し、前記ＨＰＰＤ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、新規の高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子を形成することを含む。すなわち、プロモーターと、ＨＰＰＤ遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのＣＤＳとの間の特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成し、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結して、ＨＰＰＤ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとのｉｎ ｖｉｖｏでの融合を形成して、新規の高発現ＨＰＰＤ遺伝子を生成する。イネにおいて、強力なプロモーターはユビキチン２遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により得られる高発現植物内因性ＨＰＰＤ遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子であって：
（１）配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２７に示される核酸配列またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子を提供する。
別の態様において、本発明は、植物における内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法を提供し、前記ＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターとｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、新規の高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を形成することを含む。すなわち、プロモーターと、ＥＰＳＰＳ遺伝子および任意の高発現内因性遺伝子のそれぞれのＣＤＳとの間の特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成し、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結して、ＥＰＳＰＳ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとのｉｎ ｖｉｖｏでの融合を形成して、それによって新規の高発現ＥＰＳＰＳ遺伝子を生成する。イネにおいて、強力なプロモーターはＴＫＴ遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により得られる高発現植物内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子であって：
（１）配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４に示される核酸配列またはそれらの部分配列もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を提供する。
別の態様において、本発明は、植物における内因性ＰＰＯ（ＰＰＯＸ）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法を提供し、前記ＰＰＯ遺伝子のコード領域と強力な植物内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、新規の高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子を形成することを含む。すなわち、プロモーターと、ＰＰＯ遺伝子および任意の高発現内因性遺伝子のそれぞれのＣＤＳとの間の特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成し、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結して、ＰＰＯ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとのｉｎ ｖｉｖｏでの融合を形成して、新規の高発現ＰＰＯ遺伝子を生成する。イネにおいて、強力なプロモーターはＣＰ１２遺伝子のプロモーターであることが好ましい。シロイヌナズナにおいて、強力なプロモーターはユビキチン１０遺伝子のプロモーターであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により得られる高発現植物内因性ＰＰＯ遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現イネ内因性ＰＰＯ１遺伝子であって：
（１）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５もしくは配列番号２６またはそれらの部分配列もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＰＰＯ１遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現イネ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
（１）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６もしくは配列番号４７またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）に規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＰＰＯ２遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現トウモロコシ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
（１）配列番号４８もしくは配列番号４９に示される核酸配列またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）に規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現トウモロコシ内因性ＰＰＯ２遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現コムギ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
（１）配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６またはそれらの一部もしくはそれらの相補的配列；
（２）（１）に規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現コムギ内因性ＰＰＯ２遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現アブラナの内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
（１）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０もしくは配列番号６１に示される核酸配列またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）に規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、前記高発現アブラナの内因性ＰＰＯ２遺伝子を提供する。
本発明はまた、植物細胞、植物組織、植物部分または植物における対応する阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性の改善における遺伝子の使用を提供する。
本発明はまた、前記遺伝子を含む植物細胞から再生される植物またはそれに由来する後代を提供する。
本発明はまた、前記遺伝子を含む植物細胞を植物またはそれに由来する後代において再生することを含む、除草剤に対する抵抗性または耐性が増大した植物の製造方法を提供する。
特定の実施形態において、除草剤に対する抵抗性または耐性が増大した植物は、本発明の植物宿主細胞から再生される植物と野生型植物とを交配して、遺伝子分離を通じて外因性トランスジェニック因子を除去することにより得られる非トランスジェニック系統である。
本発明はまた、イネ新規遺伝子、高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子、高発現イネ内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子、高発現イネ内因性ＰＰＯ１遺伝子、および高発現イネ内因性ＰＰＯ２遺伝子の１種または２種以上の組み合わせを含む、除草剤抵抗性イネを提供する。
特定の実施形態において、除草剤抵抗性イネは非トランスジェニックである。
本発明はまた、トウモロコシ新規遺伝子、コムギまたはトウモロコシ新規遺伝子、トウモロコシ高発現ＰＰＯ２遺伝子、コムギ高発現ＰＰＯ２遺伝子、およびアブラナ高発現ＰＰＯ２遺伝子の１種または２種以上の組み合わせを含む、除草剤耐性のトウモロコシ、コムギまたはアブラナを提供する。
特定の実施形態において、トウモロコシ、コムギまたはナタネは非トランスジェニックである。
本発明はまた、植物の栽培場所における雑草を防除する方法であって、前記植物が、その方法により調製された植物、イネ、トウモロコシ、コムギもしくはナタネからなる群より選択される、を提供する。この方法は、雑草を効果的に防除するための量の１つまたは複数の対応する阻害性除草剤を栽培場所に適用することを含む。
本発明はまた、植物における内因性ＷＡＫ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＷＡＫ遺伝子のコード領域と植物の強力な内因性プロモーターとｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、新規の高発現植物内因性ＷＡＫ遺伝子を形成することを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ＷＡＫ遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＷＡＫ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規の高発現ＷＡＫ遺伝子を形成する工程を含むことを特徴とする。
本発明はまた、上記の編集方法により得ることができる高発現植物内因性ＷＡＫ遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現イネＷＡＫ遺伝子であって：
（１）配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８に示される核酸配列またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、高発現イネＷＡＫ遺伝子を提供する。
本発明はまた、植物における内因性ＣＮＧＣ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＣＮＧＣ遺伝子のコード領域と植物の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、新規の高発現植物内因性ＣＮＧＣ遺伝子を形成することを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ＣＮＧＣ遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＣＮＧＣ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規高発現ＣＮＧＣ遺伝子を形成する工程を含むことを特徴とする。
本発明はまた、上記の編集方法により得ることができる高発現植物内因性ＣＮＧＣ遺伝子を提供する。
本発明はまた高発現イネＣＮＧＣ遺伝子であって：
（１）配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１もしくは配列番号７２に示される核酸配列またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
（２）（１）に規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
（３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
からなる群から選択される配列を有する、高発現イネＣＮＧＣ遺伝子を提供する。
本発明はまた、イネにおけるイネいもち病に対する抵抗性の付与または改善における遺伝子の使用を提供する。
本発明はまた、イネ高発現ＷＡＫ遺伝子および高発現イネＣＮＧＣ遺伝子の１種または２種以上の組み合わせを含む、イネいもち病抵抗性イネを提供する。
好ましくは、イネは非トランスジェニックである。
本発明はまた、魚類における内因性ＧＨ１遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＧＨ１遺伝子のコード領域と魚類の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子を形成することを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ＧＨ１遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＧＨ１遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規の高発現ＧＨ１遺伝子を形成する工程を含むことを特徴とし；前記強力なプロモーターは、対応する魚類ＣｏｌＩＡ１ａ（Ｉ型コラーゲンα１ａ）遺伝子プロモーター、ＲＰＳ１５Ａ（リボソームタンパク質Ｓ１５ａ）遺伝子プロモーター、アクチンプロモーター、またはＤＤＸ５［ＤＥＡＤ（Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ）ボックスヘリカーゼ５］遺伝子プロモーターであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により得ることができる高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子の魚類育種における使用を提供する。
本発明はまた、ブタにおける内因性ＩＧＦ２（インスリン様成長因子２）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＩＧＦ２遺伝子のコード領域とブタの強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合して新規の高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子を形成することを含むことを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ＩＧＦ２遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＩＧＦ２遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して、新規の高発現ＩＧＦ２遺伝子を形成する工程を含み；前記強力なプロモーターは、ブタＴＮＮＩ２遺伝子プロモーターおよびＴＮＮＴ３遺伝子プロモーターの１つであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により得られる高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子のブタ育種における使用を提供する。
本発明はまた、ニワトリ胚線維芽細胞における内因性ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＩＧＦ１遺伝子のコード領域と、ニワトリの強力な内因性タンパク質とをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現ニワトリ内因性ＩＧＦ１遺伝子を形成することを含むことを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、前記ＩＧＦ１遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＩＧＦ１遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規の高発現ＩＧＦ１遺伝子を形成する工程を含み；前記強力なプロモーターは、ニワトリＭＹＢＰＣ１（ミオシン結合プロテインＣ）遺伝子プロモーターであることが好ましい。
本発明はまた、上記の編集方法により取得可能な高発現ニワトリ内因性ＩＧＦ１遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現ニワトリ内因性ＩＧＦ１遺伝子のニワトリ育種における使用を提供する。
本発明はまた、動物細胞における内因性ＥＰＯ（エリスロポエチン）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＥＰＯ遺伝子のコード領域と動物の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合して新規の高発現内因性ＥＰＯ遺伝子を形成することを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ＥＰＯ遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ＥＰＯ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規の高発現ＥＰＯ遺伝子を形成する工程を含む。
本発明はまた、上記の編集方法により得ることができる高発現動物内因性ＥＰＯ遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現動物内因性ＥＰＯ遺伝子の動物育種における使用を提供する。
本発明はまた、動物細胞における内因性ｐ５３遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ｐ５３遺伝子のコード領域と動物の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合して新規の高発現内因性ｐ５３遺伝子を形成することを特徴とする編集方法を提供する。すなわち、プロモーターと、前記ｐ５３遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路によりＤＮＡ切断を互いに連結する工程、前記ｐ５３遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規の高発現ｐ５３遺伝子を形成する工程を含む。
本発明はまた、上記の編集方法により得ることができる高発現動物内因性ｐ５３遺伝子を提供する。
本発明はまた、高発現動物内因性ｐ５３遺伝子の動物育種または癌予防における使用を提供する。
特定の実施形態において、「ＤＮＡ切断」は、ターゲティング特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞内に送達してゲノムＤＮＡの特異的部位と接触させることによって生成される。このタイプのＤＮＡ切断と、従来の技術（放射線や化学的突然変異誘発等）によって生じるＤＮＡ切断との間には、本質的な違いはない。
特定の実施形態において、「ターゲティング特性を有するヌクレアーゼ」は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから選択される。
これらのうち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、異なる配列を標的とする２つ以上の主要なＲＮＡを介して、ゲノム内の異なる部位で２つ以上のＤＮＡ二本鎖切断を生成することができる。ＺＦＮタンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質を２つ以上の特異的部位配列で個別に設計することにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮシステムは２つ以上の部位でＤＮＡ二本鎖切断を同時に生成することができる。２つの切断が同一の染色体上にある場合、欠失、逆位および倍加等の修復結果が発生する可能性があり；２つの切断が２つの異なる染色体上にある場合、染色体アームの交差が発生する可能性がある。２つのＤＮＡ切断における染色体セグメントの欠失、逆位、倍加および交換により、異なる遺伝要素またはタンパク質ドメインが組み換えられ、それによって新規の機能的な遺伝子が生成される。
特定の実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムまたはＣａｓ１２ヌクレアーゼシステムである。
特定の実施形態において、「ターゲティング特性を有するヌクレアーゼ」は、ＤＮＡの形態で存在する。
別の特定の実施形態において、「ターゲティング特性を有するヌクレアーゼ」は、ＤＮＡの形態ではなく、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態で存在する。
特定の実施形態において、ターゲティング特性を有するヌクレアーゼを細胞内に送達するための方法は：１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション；３）電気ショック形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃法；６）アグロバクテリウム媒介形質転換法；７）ウイルスベクター媒介形質転換法；または８）ナノ磁気ビーズ媒介形質転換法からなる群から選択される。
本発明はまた、上記伝子を含むＤＮＡを提供する。
本発明はまた、上記遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片を提供する。
本発明はまた、上記遺伝子およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明はまた、上記遺伝子を含む発現カセットを提供する。
本発明はまた、発現カセットを含む宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、宿主細胞から再生される生物を提供する。
本発明者らの研究研究では、二重標的または多重標的遺伝子編集を同時に受けている細胞において、異なる標的におけるＤＮＡ二本鎖切断の末端の一定の割合が自発的に互いに連結され、その結果、同じ染色体上の標的間の断片の欠失、逆転、重複倍加および／または異なる染色体上の標的間の染色体断片の交換のイベントが発生することが見出されている。この現象は植物および動物に共通して存在することが文献で報告されている（Puchta et al. 2020. Changing local recombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosome engineering. Nat Commun. DOI: 10.1038/s41467-020- 18277-z；Li et al. 2015. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. DOI: 10.1093/jmcb/mjv016）。
本発明者らは、驚くべきことに、対象遺伝子の特定の要素の近傍の遺伝子編集標的の組み合わせにおいてＤＮＡ二本鎖切断を誘導し、自発的修復連結を引き起こすことにより、外来ＤＮＡテンプレートを提供する必要なく、異なる遺伝要素の指向性結合をゲノムレベルで達成できることを見出し、そこから新規の機能遺伝子を製造することが可能である。この戦略は新規遺伝子の生成を大幅に加速し、動植物の育種や遺伝子機能の研究において大きな可能性を秘めている。
発明の詳細な説明
本発明において、特に特定されない限り、本明細書でいられる科学技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で用いられるタンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語および実験手順はすべて、対応する分野で広く用いられている用語および日常的な手順である。例えば、本発明で用いられる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業者によく知られており、下記の文献に詳述されている：Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989。本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義および説明を以下に提供する。
本明細書で用いられる「ゲノム」という用語は、生物の各細胞またはウイルスまたは細胞小器官に存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）のすべての相補体、および／または単位（半数体）として親から受け継いだ完全なゲノムを指す。
表Ａは、イネにおいて遍在的に発現する遺伝子および組織特異的に発現する遺伝子の一部を示す。一般に、生産用途では、遍在的に発現する遺伝子または組織特異的遺伝子の開始コドンの上流３ｋｂ以内のＤＮＡ配列が、プロモーター領域および５’非コード領域として用いられ、遍在的に発現する遺伝子のプロモーター領域は、強力なプロモーターの代表として、組織特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域は、組織特異的プロモーターの代表として用いられる。イネに類似する他の種において遍在的に発現する遺伝子および組織特異的遺伝子は、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、ＪＧＩ（https://jgi.doe) .gov/）等の公開されたデータベースに見出すことができる。
Figure 2024516693000001
Figure 2024516693000002
Figure 2024516693000003
Figure 2024516693000004
Figure 2024516693000005
Figure 2024516693000006
表Ｂは、植物代謝産物に関連することが報告されているいくつかの機能遺伝子のリストである。これらの遺伝子の発現の上方制御、または果実、葉およびその他の器官における特異的な発現により、そのような植物の経済的価値を高める可能性がある。
Figure 2024516693000007
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表Ｃは、アブラナにおける重要な機能遺伝子のリストである。これらの遺伝子とアブラナの内因性プロモーターとの組み合わせは、本発明の方法を適用することにより非トランスジェニック高発現内因性新規遺伝子または組織特異的発現遺伝子を生成するために用いられ、育種のためのより多くの応用シナリオをもたらすことができる。イネ、トウモロコシ、コムギ、ダイズおよびその他の種において機能が報告されている遺伝子も多数存在している。作物の競争上の優位性を実現するために上方制御する必要がある機能的遺伝子または非コーディングＲＮＡについては、それらと既知の強力な発現プロモーターとの組み合わせを用いて、必要に応じて本発明の方法を用いることにより、新しい発現パターンを有するカスタマイズされた新規遺伝子を作成することができる。
Figure 2024516693000017
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Figure 2024516693000023
表Ｄは、いくつかの園芸作物における重要な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができる。
Figure 2024516693000024
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表Ｅは、ダイズの代表的な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができ、大豆育種プログラムに利用することができる。
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表Ｆは、トウモロコシの代表的な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができ、トウモロコシ育種プログラムに利用することができる。
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表Ｇは、オオムギの代表的な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができ、オオムギ育種プログラムに利用することができる。
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表Ｈは、イネの代表的な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができ、イネ育種プログラムに利用することができる。
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表Ｉは、コムギの代表的な機能遺伝子のリストである。本発明の方法は、そのような遺伝子を編集し、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規の組み合わせを設計することによって新規遺伝子を作製するために用いることができ、コムギ育種プログラムに利用することができる。
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表Ｊは、トマトのいくつかの代表的な機能遺伝子のリストである。
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表Ｋは、ジャガイモおよびサツマイモのいくつかの代表的な機能遺伝子のリストである。
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本発明において「新規遺伝子の発現レベルが上方制御される」とは、対応する生物の内因性野生型遺伝子と比較して、新規遺伝子の発現レベルが増大することを意味し、好ましくは発現レベルが少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍増大することを意味する。
「遺伝子編集」という用語は、生物の遺伝情報またはゲノムを標的とした特定の改変を行うための戦略および技術を指す。したがって、この用語には、遺伝子コード領域の編集が含まれるが、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も包含される。この用語には、核（存在する場合）および細胞の他の遺伝情報の編集または変更も包含される。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ、またはそれをコードする核酸配列であり得、限定されないが：１）ＳｐＣａｓ９、ＳｃＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ｘＣａｓ９、ＶＲＥＲ－Ｃａｓ９、ＥＱＲ－Ｃａｓ９、ＳｐＧ－Ｃａｓ９、ＳｐＲＹ－Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＮＧ－Ｃａｓ９、ＮＧＡ－Ｃａｓ９（ＶＱＲ）等のＣａｓ９；２）ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＭＡＤ７等を含むＣａｓ１２、または上述したＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意の変異体もしくは誘導体；好ましくは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、対応する野生型配列と比較して変異を含み、その結果、得られるＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは異なるＰＡＭ配列を認識する。本明細書で用いられる場合、「ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ」は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムにおいて同定され、続いてその天然のバックグラウンドから単離され、好ましくは修飾され、または標的ゲノム工学のためのツールとして適切な目的の組換えコンストラクトに組み合わされる。元の野生型ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼがＤＮＡ認識、すなわち結合特性をもたらす限り、任意のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼを用いることができ、本発明の様々な実施形態に適するように任意に再プログラムするか、さもなければ突然変異させることができる。
「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文配列に依存する配列特異的な遺伝子操作技術を指し、転写レベルで遺伝子発現を調節するＲＮＡ干渉とは異なるものである。
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書では互換的に用いられ、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復および関連システム）ゲノム編集システムの構成要素である。ガイドＲＮＡの誘導の下でＤＮＡ標的配列を標的にして切断し、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する。
「Ｃａｓタンパク質」または「Ｃａｓポリペプチド」とは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質にはＣａｓエンドヌクレアーゼが含まれる。Ｃａｓタンパク質は細菌または古細菌のタンパク質であり得る。例えば、本明細書において、Ｉ～ＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、一般に原核生物に由来し；Ｉ型およびＩＩＩ型のＣａｓタンパク質は細菌または古細菌種に由来し得、ＩＩ型のＣａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓ９）は細菌種に由来し得る。「Ｃａｓタンパク質」としては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはそれらの組み合わせもしくは複合体が挙げられる。
「Ｃａｓ９変異体」または「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体」とは、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの変異体を指し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと結合した場合に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、ＤＮＡ標的配列の全部または一部を認識し、結合する能力を保持し、任意にＤＮＡ標的配列の全部または一部を巻き戻し、ＤＮＡ標的配列の全部または一部にニックを入れるか、またはＤＮＡ標的配列の全部または一部を切断する能力を保持する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体が含まれ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、下記の点で親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとは異なる：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（ｇＲＮＡと複合体を形成した場合、標的部位を改変することができるポリヌクレオチド指向性エンドヌクレアーゼ複合体を形成する）は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（同じＲＮＡと複合体を形成して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチド誘導性エンドヌクレアーゼ複合体を形成する）と比較して、限定されないが、形質転換効率の増大、ＤＮＡ編集効率の増大、オフターゲット切断の減少等の少なくとも１つの特性改善、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
本明細書に記載されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと結合する場合に二本鎖ＤＮＡ標的部位に結合してニッキングすることができる変異体が含まれるのに対して、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと結合する場合に標的部位に結合して二本鎖切断（切断）をもたらすことができる。
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書では互換的に用いられ、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いた補正のために特定の遺伝子を標的とするために用いられるガイドＲＮＡ配列を指し、通常、複合体を形成するために部分的に相補的なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子からなり、ｃｒＲＮＡには、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）が標的配列に特異的に結合するように指示するために、標的配列と十分な相補性を有する配列が含まれる。しかしながら、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の特性を有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計できることが当技術分野で知られている。
「シングルガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、可変標的ドメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたｔｒａｃｒペアリング配列に連結された）のｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）との融合体を含む、２つのＲＮＡ分子の合成融合体を指す。ｓｇＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み得、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的に導き、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、任意にＤＮＡ標的部位に結合し、任意にＤＮＡ標的部位にニックを入れるか、またはＤＮＡ標的部位を切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）できるようする。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として細胞に送達され得る。ＲＮＰは、ｇＲＮＡと複合体を形成した精製Ｃａｓ９タンパク質で構成されており、ＲＮＰが、限定されないが、幹細胞および免疫細胞を含む多くの種類の細胞に効果的に送達され得ることは当技術分野でよく知られている（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、ウィスコンシン州マディソン）。
本明細書において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって認識される（標的化された）標的配列（プレスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。標的ＤＮＡ配列が適切なＰＡＭ配列に隣接していない場合、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡ配列を十分に認識できない可能性がある。本明細書において、ＰＡＭの配列および長さは、用いるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列の長さは任意であるが、通常は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドである。
シトクロムＰ４５０酵素システム（ＣＹＰ）は、ＣＯに結合することができるタンパク質として発見された。１９５８年に、クリンゲンベルクは、ラット肝臓ミクロソームにおいてこの色素タンパク質を発見した。シトクロムＰ４５０は、還元状態のＣＯと結合した場合の４５０ｎｍ波長の最大吸収値にちなんで名付けられた。オキシドレダクターゼの最大のスーパーファミリーとして、Ｐ４５０は、限定されないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む大部分の生物に広く分布している。シトクロムＰ４５０酵素としては、下記の文献または下記のウェブサイトで概説されている酵素が挙げられる：Van Bogaert et al, 2011, FEBS J. 278(2): 206-221またはUrlacher and Girhard, 2011, Trends in Biotechnology 30(1): 26-36、http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.htmlおよびhttp://p450.riceblast.snu.ac.kr/index.php?a=view。その命名は、英語の略語ＣＹＰ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０）に基づいており、数字＋文字＋数字がそれぞれファミリー、サブファミリーおよび個々の酵素を表している。
いくつかの実施形態について、上述したシトクロムＰ４５０としては、限定されないが、下記のリストのものが挙げられる。
いくつかの実施形態について、イネシトクロムＰ４５０としては、限定されないが、下記のリストのものが挙げられる。
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本明細書で用いられる場合、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーは、多種多様な薬理学的薬剤、潜在的に有毒な薬物、および生体異物、ならびに陰イオンの輸送を制御する膜トランスポータータンパク質のファミリーである。ＡＢＣトランスポーターは、特異的な活性のために細胞のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に結合して用いられる相同な膜タンパク質である。そして、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータータンパク質は、膜を通過する広範囲の基質のエネルギー依存性輸送に関与する原核生物および真核生物の膜タンパク質の大きなファミリーを構成している（Higgins, C. F. et al., Ann. Rev. Cell Biol., 8:67-113 (1992)）。真核生物では、ＡＢＣ輸送タンパク質は、典型的には２つの保存されたＡＴＰ結合ドメインおよび２つの膜貫通ドメインを含む４つのドメインからなる（Hyde et al., Nature, 346:362-5 (1990)）。
本明細書で用いられる場合、ＮＡＣ転写因子は植物に特有の転写因子であり、陸上植物に多数存在し、広く分布している。それらは最大の転写因子ファミリーの１つを構成し、複数の成長発達およびストレス反応プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここで、ＮＡＣは、ＮＡＣドメインを含むとして最初に記載された３つの遺伝子、すなわちＮＡＭ（頂端分裂組織なし）、ＡＴＡＦ１、２およびＣＵＣ２（カップ状子葉）の名前に由来する頭字語である。
本明細書で用いられる場合、Ｍｙｂ遺伝子は、転写因子をコードすることが見出され（Biedenkapp H., et al., 1988, Nature, 335: 835-837）、多くの関連遺伝子を含むファミリーを表し、酵母、線虫、昆虫および植物等、ならびに脊椎動物を含む多様な生物種において広範囲に存在する（岩渕雅樹・篠崎一雄、「植物ゲノム機能のダイナミズム－転写因子による発現制御」）、シュプリンガー・ジャパン、２００１）。植物転写因子ＭＹＢ（ｖ－ｍｙｂ鳥骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ）は、植物の成長および発達、生理学的代謝、細胞の形態およびパターン形成、ならびにその他の生理学的プロセスの制御に関連する、近年発見された転写因子の一種である。ＭＹＢ転写因子は植物において遍在性であり、植物における最大の転写ファミリーの１種でもあり、植物の代謝および制御において重要な役割を果たす。ほとんどのＭＹＢタンパク質は、Ｎ末端のアミノ酸残基で構成されるＭｙｂドメインを含む。この高度に保存されたドメインの構造的特徴に従って、ＭＹＢ転写因子は４つのカテゴリー：１Ｒ－ＭＹＢ／ＭＹＢ関連；Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ；３Ｒ－ＭＹＢ；４Ｒ－ＭＹＢ（Ｒ１／Ｒ２を４回繰り返す）に分類される。ＭＹＢ転写因子は様々な生物学的機能を有し、植物の根、茎、葉および花の成長および発達に広く関与している。同時に、ＭＹＢ遺伝子ファミリーは、干ばつ、塩分および冷害等の非生物的ストレスプロセスにも反応する。さらに、ＭＹＢ転写因子は特定の換金作物の品質にも密接に関連している。
本明細書で用いられる場合、ＭＡＤＳ転写因子のファミリーは、花および種子の発達を含む植物の多様な発達プロセスにおいて重要な役割を果たす（Minster, et al., 2002; Parenicova, et al., 2003）。ＭＡＤＳタンパク質は、ドメインタンパク質に属するＭＡＤＳ（Ｍ）、Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ（Ｉ）、Ｋｅｒａｔｉｎ ２ ｌｉｋｅ（Ｋ）、Ｃ２ ｔｅｒｍｉｎａｌ（Ｃ）等のドメインから構成されている。
本明細書で用いられる場合、ＤＲＥＢ（脱水反応性因子結合タンパク質）型転写因子は、ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ（ＡＰＥＴＡＬＡ２／エチレン反応性因子結合タンパク質）転写因子ファミリーのサブファミリーである。保存されたＡＰ２ドメインを有し、ストレス抵抗性遺伝子のプロモーター領域におけるＤＲＥシス作用因子と特異的に結合して、低温、干ばつ、生理食塩水アルカリ等の条件下で一連の下流ストレス反応遺伝子の発現を調節することができる。これは、ストレス適応における重要な制御因子である。
本明細書で用いられる場合、転写因子のｂＺＩＰ（基本領域／ロイシンジッパー）ファミリーは、天然で特定のＤＮＡ部位を標的とするために用いられる最も単純なモチーフ：配列特異性および高親和性でＤＮＡ主溝を認識する一対の短いα－ヘリックスを含む（Struhl, K., Ann. Rev. Biochem., 1989, 58,1051；Landschulz, W. H., et al., Science, 1988, 240, 1759-1764）。
本明細書で用いられる、植物ｂＺＩＰ転写因子は、真核生物に広く分布し、比較的保存されているタンパク質のクラスである。その塩基性領域は高度に保存されており、約２０個のアミノ酸残基が含まれている。ｂＺＩＰの構造の違いにより、ｂＺＩＰは１０のサブファミリーに分類することができる。異なるサブグループの転写因子は、主に植物の種子貯蔵遺伝子の発現、植物の成長および発達の制御、光シグナル伝達、病気の予防、ストレス反応およびＡＢＡ感受性、ならびにその他のシグナル反応を含む異なる機能を実行する。
本明細書で用いられる場合、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ファミリーは、動物、植物および微生物において遍在的に発現する酵素の大きなファミリーである。これは、複数の遺伝子によりコードされ、複数の機能を有する酵素のスーパーファミリーである。これらは、グルタチオンを介して有害な異種物質または酸化生成物と結合して、そのような物質の代謝、局所的な分離または除去を促進し、広範囲の細胞毒性物質に対する細胞防御に関与する（Gate and Tew, Expert Opin. Ther. Targets 5: 477, 2001を参照されたい）。４００を超える異なるＧＳＴ配列が同定されており、それらの遺伝的特徴および基質特異性に基づいて、４つの異なるクラスα、μ、πおよびθに分類することができる（Mannervik et al., Biochem. J. 282:305, 1992を参照されたい）。同一の遺伝子座でコードされる各対立遺伝子変異体は文字によって区別される。植物タンパク質の相同性および遺伝子構造の特徴に従って、ＧＳＴファミリーは８つのサブファミリー：Ｆ（φ）、Ｕ（τ）、Ｔ（θ）、Ｚ（ζ）、Ｌ（λ）、ＤＨＡＲ、ＥＦ１ＢγおよびＴＣＨＱＤに分類される。ＦおよびＵファミリーは植物に固有のものである。これらは、他のサブファミリーと比較して、メンバー数が最も多く、コンテンツが最も豊富である。可溶性ＧＳＴは主に細胞質に分布し、一部は葉緑体および微小体に、少量は核およびアポプラストに分布する。植物ＧＳＴは最初にトウモロコシ（ゼア・メイズ Ｌ．）で発見され、その後、アラビドプシス・タリアナ、ダイズ（グリシン・マックス）、イネ（オリザ・サティバ Ｌ．）およびタバコ（ニコチナ・タバカム Ｌ．）等の植物で発見された。
本明細書で用いられる「生物」という用語には、動物、植物、菌類、細菌等が包含される。
本明細書で用いられる「宿主細胞」という用語には、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等が包含される。
本発明において、「動物」という用語には、動物界のあらゆるメンバー、例えば、無脊椎動物および脊椎動物が包含される。無脊椎動物としては、限定されないが、原生動物（アメーバ等）、蠕虫、軟体動物（エスカルゴ、カタツムリ、淡水貝、カキおよびデビルフィッシュ等）、節足動物（昆虫、クモおよびカニ等）等が挙げられ；脊椎動物としては、魚類（ゼブラフィッシュ、サケ、フナ、コイまたはティラピア、および人工飼育可能な他の食用経済魚等）、両生類（カエル、ヒキガエルおよびイモリ等）、爬虫類（ヘビ、トカゲ、イグアナ、カメおよびワニ等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、七面鳥、ダチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、ワシ、トビ、ハゲワシ、ハリアー、ミサゴ、フクロウ、カラス、ホロホロ鳥、ハト、エミューおよびヒクイドリ等）、哺乳動物（ヒト、ヒト以外の霊長類（キツネザル、メガネザル、サル、類人猿およびオランウータン等）、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ウサギ、カンガルー、シカ、ホッキョクグマ、イヌ科動物（イヌ、オオカミ、キツネおよびジャッカル等）、ネコ科動物（ライオン、トラ、チーター、オオヤマネコおよびネコ等）、齧歯動物（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット等））等が挙げられる。「ヒト以外」の用語は、ヒトを含まない。
「動物」という用語には、あらゆる発達段階（新生児、胎児、胎児の段階を含む）の個々の動物も包含される。
「真菌」という用語は、腐生胞子および寄生胞子により生成される真核生物のあらゆるメンバーを指す。一般に、それらは糸状生物であり、以前は、限定されないが、担子菌類、不完全菌類、子嚢菌類、乳菌類、接合菌類等を含むクロロフィル欠損植物として分類されていた。しかしながら、真菌の分類は常に進化しており、その結果、菌類界の具体的な定義は将来調整される可能性がある。マクロな真菌は、食用真菌、薬用真菌、有毒真菌、用途不明の真菌の４つのカテゴリーに分類することができる。ほとんどの食用真菌および薬用真菌は担子菌類に属し、例えば、Tremella fuciformis、Phlogiotis helvelloides、Tremella aurantialba、Auricularia auricular、Auricularia polytricha、Auricularia delicate、Auricularia messenterica、Auricularia rugosissima、Calocera cornea、Fistulina hepatica、Poria cocos、Grifola frondosa、Grifola umbellate、Ganoderma applanatum、Coriolus versicolor、Ganoderma capense、Ganoderma lucifum、Ganoderma cochlear、Ganoderma lobatum、Ganoderma tsugae、Ganderma sinense、Polyporus rhinoceros、Omphalia lapidescens、Phellinus baumii、Cryptoporus volvatus、Pycnoporus cinnabarinus、Fuscoporus obliqus、Sparassis crispa、Hericium erinaceus、Thelephora vialis、Ramaria flava、Ramaria botrytoides、Ramaria stricta、Ramaria botrytis、Clavicorona pyxidata、Clavulina cinerea、Cantharellus cibarius、Hydnum repandum、Lycoperdon perlatum、Lycoperdon Polymorphum、Lycoperdon pusllum、Lycoperdon aurantium、Lycoperdon flavidum、Lycoperdon poleroderma、Lycoperdon verrucosum、Boletus albidus、Boletus aereus、Boletus rubellus、Suillus grevillea、Suillus granulatus、Suillus luteus、Fistulina hepatica、Russula integra、Russula alutacea、Russula zoeteus、Russula Viresceu、Pleurotus citrinopileatus、Pleurotus ostreatus、Pleurotus sapidus、Pleurotus ferulae、Pleurotus abalonus、Pleurotus cornucopiae、Pleurotus cystidiosus、Pleurotus djamor、Pleurotus salmoneostramineus、Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel. var. eryngii、Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel.var.ferulae Lanzi、Pleurotus nebrodensis、Pleurotus ostreatus、Pleurotus florida、Pleurotus pulmonarius、Pleurotus tuber-regium、Hohenbuchelia serotine、Agaricus bisporus、Agaricus arvensis、Agaricus blazei、Tricholoma matsutake、Tricholoma gambosum、Tricholoma conglobatum、Tricholoma album、Tricholoma mongolicum、Armillaria mellea、Armillariella ventricosa、Armillariella mucida、Armillariella tabescens、Collybia radicata、Collybia radicata (Relh.ex Fr.) Quel. var. furfuracea PK.、Marasmius androsaceus、Termitomyces albuminosus、Tricholoma giganteum、Hypsizigus marmoreus、Lepista sordida、Lyophyllum ulmarium、Lyophyllum shimeji、Flammulina velutipes、Cortinarius armillatus、Amanita caesarea、Amanita caesarea (Scop. ex Fr.) Pers. ex Schw. var. alba Gill、Amanita strobiliformis、Amanita vaginata、Volvariella volvacea、Pholiota adiposa、Pholiot squarrosa、Pholiot mutabilis、Pholiota nameko、Stropharia rugoso-annulata、Coprinus sterquilinus、Coprinus fuscesceus、Coprinus atramentarius、Coprinus comatus、Coprinus ovatus、Dictyophora indusiata、Dictyophora duplicate、Dictyophora echino-volvata、Schizphylhls commne、Agrocybe cylindracea、Lentinus edodesであり；いくつかはAscomycotina、例えば、Morchella esculenta、Cordyceps sinensis、Cordyceps militaris、Claviceps purpurea、Cordyceps sobolifera、Engleromyces geotzii、Podostroma yunnansis、Shiraia bambusiicola、Hypocrella bambusea、Xylaria nigripes、Tuber spp.である。
本発明において、「植物」とは、光合成を行うことができる任意の分化した多細胞生物、特に単子葉植物または双子葉植物、例えば、（１）食用作物：Oryza spp.、例えばOryza sativa、Oryza latifolia、Oryza sativa、Oryza glaberrima；Triticum spp.、例えばTriticum aestivum、T. Turgidumssp. durum；Hordeum spp.、例えばHordeum vulgare、Hordeum arizonicum；Secale cereale；Avena spp.、例えばAvena sativa、Avena fatua、Avena byzantine、Avena fatua var.sativa、Avena hybrida；Echinochloa spp.、例えばPennisetum glaucum、Sorghum、Sorghum bicolor、Sorghum vulgare、Triticale、Zea maysまたはトウモロコシ、キビ、イネ、Foxtail millet、Proso millet、Sorghum bicolor、Panicum、Fagopyrum spp.、Panicum miliaceum、Setaria italica、Zizania palustris、Eragrostis tef、Panicum miliaceum、Eleusine coracana；（２）マメ科作物: Glycine spp.、例えばGlycine max、Soja hispida、Soja max、Vicia spp.、Vigna spp.、Pisum spp.、ソラマメ（field bean）、Lupinus spp.、ソラマメ属、Tamarindus indica、Lens culinaris、Lathyrus spp.、フジマメ、ソラマメ（broad bean）、ヤエナリ、アカインゲンマメ、ヒヨコマメ；（３）油糧作物：Arachis hypogaea、Arachis spp、Sesamum spp.、Helianthus spp.、例えばHelianthus annuus、アブラヤシ属、例えばEiaeis guineensis、Elaeis oleifera、ダイズ、Brassicanapus、Brassica oleracea、Sesamum orientale、Brassica juncea、アブラナ、Camellia oleifera、アブラヤシ、オリーブ、トウゴマ、Brassica napus L.、キャノーラ；（４）繊維作物：Agave sisalana、Gossypium spp.、例えばワタ属、Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum、Hibiscus cannabinus、Agave sisalana、Musa textilis Nee、Linum usitatissimum、Corchorus capsularis L、Boehmeria nivea (L.)、Cannabis sativa、Cannabis sativa；（５）果実作物：Ziziphus spp.、Cucumis spp.、Passiflora edulis、Vitis spp.、Vaccinium spp.、Pyrus communis、Prunus spp.、Psidium spp.、Punica granatum、Malus spp.、Citrullus lanatus、Citrus spp.、Ficus carica、Fortunella spp.、Fragaria spp.、Crataegus spp.、Diospyros spp.、Eugenia unifora、Eriobotrya japonica、Dimocarpus longan、Carica papaya、Cocos spp.、Averrhoa carambola、Actinidia spp.、Prunus amygdalus、Musa spp. (musa acuminate)、Persea spp. (Persea Americana)、Psidium guajava、Mammea Americana、Mangifera indica、Canarium album (Oleaeuropaea)、パパイア、Cocos nucifera、Malpighia emarginata、Manilkara zapota、Ananas comosus、Annona spp.、Citrus reticulate (Citrus spp.)、Artocarpus spp.、Litchi chinensis、Ribes spp.、Rubus spp.、セイヨウナシ、モモ、アプリコット、プラム、レッドベイベリー、レモン、キンカン、ドリアン、オレンジ、イチゴ、ブルーベリー、ハミメロン（hami melon）、マスクメロン、ナツメヤシ、クルミ、サクランボ；（６）根茎作物；Manihot spp.、Ipomoea batatas、Colocasia esculenta、ザーサイ（tuber mustard）、Allium cepa (タマネギ)、eleocharis tuberose (シログワイ)、Cyperus rotundus、Rhizoma dioscoreae；（７）野菜作物：Spinacia spp.、Phaseolus spp.、Lactuca sativa、Momordica spp、Petroselinum crispum、Capsicum spp.、Solanum spp. (Solanum tuberosum、Solanum integrifolium、Solanum lycopersicum等)、Lycopersicon spp. (Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme等)、Macrotyloma spp.、ケール、Luffa acutangula、レンティル、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、Brussels sprouts、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン、カボチャ、Benincasa hispida、Asparagus officinalis、Apium graveolens、Amaranthus spp.、Allium spp.、Abelmoschus spp.、Cichorium endivia、Cucurbita spp.、Coriandrum sativum、B.carinata、Rapbanus sativus、Brassica spp. (Brassica napus、Brassica rapa ssp.、キャノーラ、アブラナ、カブ、セイヨウアブラナ、カラシナ、キャベツ、黒ガラシ、キャノーラ(ナタネ)、芽キャベツ、Solanaceae (ナス)、Capsicum annuum (パプリカ)、キュウリ、ヘチマ、ハクサイ、セイヨウアブラナ、キャベツ、ヒョウタン、ニラ、ハス、レンコン、レタス；（８）花卉作物：Tropaeolum minus、Tropaeolum majus、Canna indica、Opuntia spp.、Tagetes spp.、シンビジウム（ラン）、Crinum asiaticum L.、クンシラン、Hippeastrum rutilum、Rosa rugosa、Rosa Chinensis、Jasminum sambac、Tulipa gesneriana L.、Cerasus sp.、Pharbitis nil (L.) Choisy、Calendula officinalis L.、Nelumbo sp.、Bellis perennis L.、Dianthus caryophyllus、Petunia hybrida、Tulipa gesneriana L.、Lilium brownie、Prunus mume、Narcissus tazetta L.、Jasminum nudiflorum Lindl.、Primula malacoides、Daphne odora、Camellia japonica、Michelia alba、Magnolia liliiflora、Viburnum macrocephalum、Clivia miniata、Malus spectabilis、Paeonia suffruticosa、Paeonia lactiflora、Syzygium aromaticum、Rhododendron simsii、Rhododendron hybridum、Michelia figo (Lour.) Spreng.、Cercis chinensis、Kerria japonica、Weigela florida、Fructus forsythiae、Jasminum mesnyi、Parochetus communis、Cyclamen persicum Mill.、Phalaenophsis hybrid、Dendrobium nobile、Hyacinthus orientalis、Iris tectorum Maxim、Zantedeschia aethiopica、Calendula officinalis、Hippeastrum rutilum、Begonia semperflorenshybr、Fuchsia hybrida、Begonia maculataRaddi、ゼラニウム、Epipremnum aureum；（９）薬用作物：Carthamus tinctorius、Mentha spp.、Rheum rhabarbarum、Crocus sativus、Lycium chinense、Polygonatum odoratum、Polygonatum Kingianum、Anemarrhena asphodeloides Bunge、Radix ophiopogonis、Fritillaria cirrhosa、Curcuma aromatica、Amomum villosum Lour.、Polygonum multiflorum、Rheum officinale、Glycyrrhiza uralensis Fisch、Astragalus membranaceus、Panax ginseng、Panax notoginseng、Acanthopanax gracilistylus、Angelica sinensis、Ligusticum wallichii、Bupleurum sinenses DC.、Datura stramonium Linn.、Datura metel L.、Mentha haplocalyx、Leonurus sibiricus L.、Agastache rugosus、Scutellaria baicalensis、Prunella vulgaris L.、Pyrethrum carneum、Ginkgo biloba L.、Cinchona ledgeriana、Hevea brasiliensis（野生）、Medicago sativa Linn、Piper Nigrum L.、Radix Isatidis、Atractylodes macrocephala Koidz；（１０）原料作物：Hevea brasiliensis、Ricinus communis、Vernicia fordii、Morus alba L.、Hops Humulus lupulus、Betula、Alnus cremastogyne Burk.、Rhus verniciflua stokes；（１１）牧草作物：Agropyron spp.、Trifolium spp.、Miscanthus sinensis、Pennisetum sp.、Phalaris arundinacea、Panicum virgatum、prairiegrasses、インディアングラス、ビッグブルーステムグラス、Phleum pratense、シバ、カヤツリグサ科（Kobresia pygmaea、Carex pediformis、Carex humilis）、Medicago sativa Linn、Phleum pratense L.、Medicago sativa、Melilotus suavcolen、Astragalus sinicus、Crotalaria juncea、Sesbania cannabina、Azolla imbircata、Eichhornia crassipes、Amorpha fruticosa、Lupinus micranthus、シャジクソウ、Astragalus adsurgens pall、Pistia stratiotes linn、Alternanthera philoxeroides、Lolium；（１２）糖料作物：Saccharum spp.、Beta vulgaris；（１３）飲料作物：Camellia sinensis、Camellia Sinensis、チャ、コーヒー(Coffea spp.)、Theobroma cacao、Humulus lupulus Linn.；（１４）芝生作物：Ammophila arenaria、Poa spp.(Poa pratensis (ブルーグラス))、Agrostis spp. (Agrostis matsumurae、Agrostis palustris)、Lolium spp. (ドクムギ属)、Festuca spp. (Festuca ovina L.)、Zoysia spp. (Zoysiajaponica)、Cynodon spp. (Cynodon dactylon／バミューダグラス)、Stenotaphrum secunda tum (Stenotaphrum secundatum)、Paspalum spp.、Eremochloa ophiuroides (センチピードグラス)、Axonopus spp. (カーペットウィード)、Bouteloua dactyloides (バッファローグラス)、Bouteloua var. spp. (Bouteloua gracilis)、Digitaria sanguinalis、Cyperusrotundus、Kyllingabrevifolia、Cyperusamuricus、Erigeron canadensis、Hydrocotylesibthorpioides、Kummerowiastriata、Euphorbia humifusa、Viola arvensis、Carex rigescens、Carex heterostachya、シバ；（１５）樹木作物：Pinus spp.、Salix spp.、Acer spp.、Hibiscus spp.、Eucalyptus spp.、Ginkgo biloba、Bambusa sp.、Populus spp.、Prosopis spp.、Quercus spp.、Phoenix spp.、Fagus spp.、Ceiba pentandra、Cinnamomum spp.、Corchorus spp.、Phragmites australis、Physalis spp.、Desmodium spp.、ハコヤナギ、Hedera helix、Populus tomentosa Carr、Viburnum odoratissinum、Ginkgo biloba L.、Quercus、Ailanthus altissima、Schima superba、Ilex pur-purea、Platanus acerifolia、ligustrum lucidum、Buxus megistophylla Levl.、Dahurian larch、Acacia mearnsii、Pinus massoniana、Pinus khasys、Pinus yunnanensis、Pinus finlaysoniana、Pinus tabuliformis、Pinus koraiensis、Juglans nigra、Citrus limon、Platanus acerifolia、Syzygium jambos、Davidia involucrate、Bombax malabarica L.、Ceiba pentandra (L.)、Bauhinia blakeana、Albizia saman、Albizzia julibrissin、Erythrina corallodendron、Erythrina indica、Magnolia gradiflora、Cycas revolute、Lagerstroemia indica、coniferous、macrophanerophytes、低木；（１６）ナッツ作物：Bertholletia excelsea、Castanea spp.、Corylus spp.、Carya spp.、Juglans spp.、Pistacia vera、Anacardium occidentale、Macadamia (Macadamia integrifolia)、Carya illinoensis Koch、Macadamia、Pistachio、Badam、other plants that produce nuts；（１７）その他：arabidopsis thaliana、Bra chiaria eruciformis、Cenchrus echinatus、Setaria faberi、eleusine indica、Cadaba farinose、algae、Carex elata、ornamental plants、Carissa macrocarpa、Cynara spp.、Daucus carota、Dioscorea spp.、Erianthus sp.、Festuca arundinacea、Hemerocallis fulva、Lotus spp.、Luzula sylvatica、Medicago sativa、Melilotus spp.、Morus nigra、Nicotiana spp.、Olea spp.、Ornithopus spp.、Pastinaca sativa、Sambucus spp.、Sinapis sp.、Syzygium spp.、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、Viola odorata等であると理解される。
特定の実施形態において、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、アブラナ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、ハクサイ、キャベツ、キュウリ、チャイニーズローズ、シンダプサス・アウレウス（Scindapsus aureus）、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、柑橘類、モモ、ナシ、バナナ等から選択される。
本明細書で用いられる「植物」という用語には、植物全体および任意の後代、細胞、組織または植物部分が含まれる。「植物部分」という用語は、植物の任意の部分を含み、限定されないが、例えば：種子（成熟種子、種皮のない未熟胚、および未熟種子を含む）；植物の切り穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎および関連する外植片）を含む。植物組織または植物器官は、構造的または機能的単位に組織化された種子、カルス組織、またはその他の植物細胞集団であり得る。いくつかの植物細胞または組織培養物は、その細胞または組織が由来する植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、また植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる。対照的に、植物細胞の中には植物を再生できないものもある。植物細胞または組織培養における再生可能な細胞は、胚、原形質体、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸、花、穀粒、穂、穂軸、殻または茎であり得る。
植物部分には、収穫可能な部分、および後代の植物を繁殖させるために用いられる部分が包含される。繁殖に用いられる植物部分としては、限定されないが、例えば、種子、果実、挿し木、苗木、塊茎および台木が挙げられる。植物の収穫可能な部分としては、限定されないが、例えば、花、花粉、苗、塊茎、葉、茎、果実、種子および根を含む植物の有用な部分のいずれもが挙げられる。
植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位である。本明細書において用いられる場合、植物細胞には、プロトプラストおよび部分的な細胞壁を有するプロトプラストが包含される。植物細胞は、単離された単一細胞または細胞集合体（例えば、緩いカルスおよび培養細胞）の形態であってもよく、高次の組織単位（例えば、植物組織、植物器官、および無傷の植物）の一部であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子生成細胞、または植物全体を再生できる細胞もしくは細胞の集合体であり得る。したがって、本明細書の実施形態においては、複数の植物細胞を含み、植物全体に再生することができる種子を「植物部分」とみなす。
本明細書において用いられる「プロトプラスト」という用語は、細胞壁が完全または部分的に除去され、脂質二重層膜が露出した植物細胞を指す。通常、プロトプラストは細胞壁のない単離された植物細胞であり、細胞培養物または植物全体を再生し得る。
植物の「後代」には、その後代の植物が包含される。
「抑制性除草剤耐性」および「抑制性除草剤耐性」という用語は互換的に用いることができ、いずれも抑制性除草剤に対する耐性および抵抗性を指す。「抑制型除草剤に対する耐性の向上」および「抑制型除草剤に対する抵抗性の向上」とは、野生型遺伝子を含む植物と比較して、抑制型除草剤に対する耐性または抵抗性が向上することを意味する。
一般に、本発明の文脈において用いることができる本明細書に記載の除草性化合物が幾何異性体、例えばＥ／Ｚ異性体を形成することができる場合、本発明の組成物において、純粋な異性体およびその混合物の両方を用いることが可能である。本明細書に記載の除草性化合物が１つ以上のキラリティー中心を有し、その結果、鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在する場合、純粋な鏡像異性体およびジアステレオマーおよびそれらの混合物の両方を本発明による組成物中で用いることが可能である。本明細書に記載の除草性化合物がイオン化可能な官能基を有する場合、それらは農業上許容可能な塩の形態で用いることもできる。一般に、それらのカチオンの塩およびそのカチオンおよびアニオンがそれぞれ活性化合物の活性に悪影響を及ぼさない酸の酸付加塩が適当である。好ましいカチオンは、アルカリ金属、好ましくはリチウム、ナトリウムおよびカリウムのイオン、アルカリ土類金属のイオン、好ましくはカルシウムおよびマグネシウムのイオン、および遷移金属のイオン、好ましくはマンガン、銅、亜鉛および鉄のイオンであり、さらにアンモニウムおよび１～４個の水素原子がＣ１－Ｃ４－アルキル、ヒドロキシ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル、Ｃ１－Ｃ４－アルコキシ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル、ヒドロキシ－Ｃ１－Ｃ４－アルコキシ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されたアンモニウムであり、好ましくはアンモニウム、メチルアンモニウム、イソプロピルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、ジイソプロピルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ヘプチルアンモニウム、ドデシルアンモニウム、テトラデシルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、２－ヒドロキシエチルアンモニウム（オラミン塩）、２－（２－ヒドロキシエト－１－オキシ）エト－１－イルアンモニウム（ジグリコールアミン塩）、ジ（２－ヒドロキシエト－１－イル）アンモニウム（ジオラミン塩）、トリス（２－ヒドロキシエチル）アンモニウム（トロラミン塩）、トリス（２－ヒドロキシプロピル）アンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウム、ベンジルトリエチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルエタノールアンモニウム（コリン塩）、さらにホスホニウムイオン、スルホニウムイオン、好ましくはトリメチルスルホニウム等のトリ（Ｃ１－Ｃ４－アルキル）スルホニウム、およびスルホキソニウムイオン、好ましくはトリ（Ｃ１－Ｃ４－アルキル）スルホキソニウム、そして最後に、Ｎ，Ｎ－ビス－（３－アミノプロピル）メチルアミンおよびジエチレントリアミン等の多塩基性アミンの塩である。有用な酸付加塩のアニオンは主に塩化物、臭化物、フッ化物、ヨウ化物、硫酸水素塩、メチル硫酸塩、硫酸塩、リン酸二水素、リン酸水素、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、ヘキサフルオロケイ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、安息香酸塩、およびＣ１－Ｃ４－アルカン酸のアニオン、好ましくはギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩である。
カルボキシル基を有する本明細書に記載の除草性化合物は、酸の形態で、上述の農業上適切な塩の形態、あるいは農業上許容可能な誘導体の形態、例えばモノ－およびジ－Ｃ１－Ｃ６－アルキルアミドまたはアリールアミド等のアミド、エステ、例えばアリルエステル、プロパルギルエステル、Ｃ１－Ｃ１０－アルキルエステル、アルコキシアルキルエステル、テフリル（（テトラ－ヒドロフラン－２－イル）メチル））エステル、またチオエステル、例えばＣ１－Ｃ１０－アルキルチオエステルの形態で用いることができる。好ましいモノ－およびジ－Ｃ１－Ｃ６－アルキルアミドは、メチルアミドおよびジメチルアミドである。好ましいアリールアミドは、例えば、アニリドおよび２－クロロアニリドである。好ましいアルキルエステルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、メキシル（１－メチルヘキシル）、メプチル（１－メチルヘプチル）、ヘプチル、オクチルまたはイソオクチル（２－エチルヘキシル）エステルである。好ましいＣ１－Ｃ４－アルコキシ－Ｃ１～Ｃ４－アルキルエステルは、直鎖または分岐鎖のＣ１－Ｃ４－アルコキシエチルエステル、例えば、２－メトキシエチル、２－エトキシエチル、２－ブトキシエチル（ブトチル）、２－ブトキシプロピルまたは３－ブトキシプロピルエステルである。直鎖または分岐鎖状のＣ１－Ｃ６－アルキルチオエステルの例は、エチルチオエステルである。
（１）ＨＰＰＤ（ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）の阻害：それ自体が除草活性を有する物質、または他の除草剤および／またはその効果を変化させる可能性のある添加剤と組み合わせて用いられる物質であって、当該物質はＨＰＰＤを阻害することによって作用し得る。ＨＰＰＤを阻害することによって除草活性を生み出すことができる物質は当技術分野でよく知られており、以下の種類が挙げられるが、これらに限定されない。
１）トリケトン、例えば、スルコトリオン（ＣＡＳ番号：９９１０５－７７－８）、メソトリオン（ＣＡＳ番号：１０４２０６－８２－８）、ビシクロピロン（ＣＡＳ番号：３５２０１０－６８－５）、テンボトリオン（ＣＡＳ番号：３３５１０４－８４－２）、テフリルトリオン（ＣＡＳ番号：４７３２７８－７６－１）、ベンゾビシクロン（ＣＡＳ番号：１５６９６３－６６－５）；
２）ジケトニトリル、例えば、２－シアノ－３－シクロプロピル－１－（２－メチルスルホニル－４－トリフルオロメチルフェニル）プロパン－１，３－ジオン（ＣＡＳ番号：１４３７０１－７５－１）、２－シアノ－３－シクロプロピル－１－（２－メチルスルホニル－３，４－ジクロロフェニル）プロパン－１，３－ジオン（ＣＡＳ番号：２１２８２９－５５－５）、２－シアノ－１－［４－（メチルスルホニル）－２－トリフルオロメチルフェニル］－３－（１－メチルシクロプロピル）プロパン－１，３－ジオン（ＣＡＳ番号：１４３６５９－５２－３）；
３）イソオキサゾール、例えば、イソキサフルトール（ＣＡＳ番号：１４１１１２－２９－０）、イソキサクロルトール（ＣＡＳ番号：１４１１１２－０６－３）、クロマゾン（ＣＡＳ番号：８１７７７－８９－１）；
４）ピラゾール、例えば、トプラメゾン（ＣＡＳ番号：２１０６３１－６８－８）；ピラスルホトール（ＣＡＳ番号：３６５４００－１１－９）、ピラゾキシフェン（ＣＡＳ番号：７１５６１－１１－０）；ピラゾレート（ＣＡＳ番号：５８０１１－６８－０）、ベンゾフェナプ（ＣＡＳ番号：８２６９２－４４－２）、ビピラゾン（ＣＡＳ番号：１６２２９０８－１８－２）、トルピラレート（ＣＡＳ番号：１１０１１３２－６７－５）、フェンピラゾン（ＣＡＳ番号：１９９２０１７－５５－６）、シピラフルオン（ＣＡＳ番号：１８５５９２９－４５－１）、トリピラスルホン（ＣＡＳ番号：１９１１６１３－９７－２）；
５）ベンゾフェノン；
６）その他：ランコトリオン（ＣＡＳ番号：１４８６６１７－２１－３）、フェンキノトリオン（ＣＡＳ番号：１３４２８９１－７０－６）、フフェンゴカオアン（fufengcao’an）（ＣＡＳ番号：２４２１２５２－３０－２）；
および特許ＣＮ１０５２６４０６９Ａに記載されているもの。
（２）ＥＰＳＰＳ（エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ）の阻害：例えば、スルホサート、グリホサート、グリホサート－イソプロピルアンモニウム、およびグリホサート－トリメシウム。
（３）ＰＰＯ（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）の阻害は、ピリミジンジオン、ジフェニルエーテル、フェニルピラゾール、Ｎ－フェニルフタルイミド、チアジアゾール、オキサジアゾール、トリアゾリノン、オキサゾリジンジオンおよび異なる化学構造を有する他の除草剤に分類することができる。
例示的な実施形態において、ピリミジンジオン系除草剤としては、限定されないが、ブタフェナシル（ＣＡＳ番号：１３４６０５－６４－４）、サフルフェナシル（ＣＡＳ番号：３７２１３７－３５－４）、ベンズフェンジゾン（ＣＡＳ番号：１５８７５５－９５－４）、チアフェナシル（ＣＡＳ番号：１２２０４１１－２９－９）、エチル［３－［２－クロロ－４－フルオロ－５－（１－メチル－６－トリフルオロメチル－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－３－イル）フェノキシ］－２－ピリジルオキシ］アセテート（エピリフェナシル、ＣＡＳ番号：３５３２９２－３１－６）、１－メチル－６－トリフルオロメチル－３－（２，２，７－トリフルオロ－３－オキソ－４－プロパ－２－イニル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［１，４］オキサジン－６－イル）－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（ＣＡＳ番号：１３０４１１３－０５－０）、３－［７－クロロ－５－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンズイミダゾール－４－イル］－１－メチル－６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（ＣＡＳ番号：２１２７５４－０２－４）、フルプロパシル（ＣＡＳ番号：１２０８９０－７０－２）、ＣＮ１０５７５３８５３Ａに開示されるイソオキサゾリンを含むウラシル（例えば、化合物
Figure 2024516693000136
 ）、ＷＯ２０１７／２０２７６８およびＷＯ２０１８／０１９８４２に開示されるウラシルピリジンが挙げられる。
ジフェニルエーテル系除草剤としては、限定されないが、フォメサフェン（ＣＡＳ番号：７２１７８－０２－０）、オキシフルオルフェン（ＣＡＳ番号：４２８７４－０３－３）、アクロニフェン（ＣＡＳ番号：７４０７０－４６－５）、エトキシフェンエチル（ＣＡＳ番号：１３１０８６－４２－５）、ラクトフェン（ＣＡＳ番号：７７５０１－６３－４）、クロメトキシフェン（ＣＡＳ番号：３２８６１－８５－１）、クロルニトロフェン（ＣＡＳ番号：１８３６－７７－７）、フルオログリコフェンエチル（ＣＡＳ番号：７７５０１－９０－７）、アシフルオルフェンまたはアシフルオルフェンナトリウム（ＣＡＳ番号：５０５９４－６６－６または６２４７６－５９－９）、ビフェノックス（ＣＡＳ番号：４２５７６－０２－３）、エトキシフェン（ＣＡＳ番号：１８８６３４－９０－４）、フルオロニトロフェン（ＣＡＳ番号：１３７３８－６３－１）、フリルオキシフェン（ＣＡＳ番号：８００２０－４１－３）、ニトロフルオルフェン（ＣＡＳ番号：４２８７４－０１－１）およびハロサフェン（ＣＡＳ番号：７７２２７－６９－１）が挙げられる。
フェニルピラゾール系除草剤としては、限定されないが、ピラフルフェンエチル（ＣＡＳ番号：１２９６３０－１９－９）およびフルアゾレート（ＣＡＳ番号：１７４５１４－０７－９）が挙げられる。
Ｎ－フェニルフタルイミド系除草剤としては、フルミオキサジン（ＣＡＳ番号：１０３３６１－０９－７）、シニドネチル（ＣＡＳ番号：１４２８９１－２０－１）、フルミプロピン（ＣＡＳ番号：８４４７８－５２－４）、およびフルミクロラックペンチル（ＣＡＳ番号：８７５４６－１８－７）が挙げられる。
チアジアゾール系除草剤としては、限定されないが、フルチアセットメチル（ＣＡＳ番号：１１７３３７－１９－６）、フルチアセット（ＣＡＳ番号：１４９２５３－６５－６）およびチジアジミン（ＣＡＳ番号：１２３２４９－４３－４）が挙げられる。
オキサジアゾール系除草剤としては、限定されないが、オキサジアルギル（ＣＡＳ番号：３９８０７－１５－３）およびオキサジアゾン（ＣＡＳ番号：１９６６６－３０－９）が挙げられる。
トリアゾリノン系除草剤としては、限定されないが、カルフェントラゾン（ＣＡＳ番号：１２８６２１－７２－７）、カルフェントラゾンエチル（ＣＡＳ番号：１２８６３９－０２－１）、スルフェントラゾン（ＣＡＳ番号：１２２８３６－３５－５）、アザフェニジン（ＣＡＳ番号：６８０４９－８３－２）およびベンカルバゾン（ＣＡＳ番号：１７３９８０－１７－１）が挙げられる。
オキサゾリジンジオン系除草剤としては、限定されないが、ペントキサゾン（ＣＡＳ番号：１１０９５６－７５－７）が挙げられる。
他の除草剤としては、限定されないが、ピラクロニル（ＣＡＳ番号：１５８３５３－１５－２）、フルフェンピルエチル（ＣＡＳ番号：１８８４８９－０７－８）、プロフルアゾール（ＣＡＳ番号：１９０３１４－４３－３）、トリフルジモキサジン（ＣＡＳ番号：１２５８８３６－７２－４）、Ｎ－エチル－３－２，６－ジクロロ－４－フルオロメチルフェノキシ）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミド（ＣＡＳ番号：４５２０９８－９２－９）、Ｎ－テトラヒドロフルフリル－３－（２，６－ジクロロ－４－トリフルオロメチルフェノキシ）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミド（ＣＡＳ番号：９１５３９６－４３－９）、Ｎ－エチル－３－（２－クロロ－６－フルオロ－４－トリフルオロメチルフェノキシ）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミド（ＣＡＳ番号：４５２０９９－０５－７）、Ｎ－テトラヒドロフルフリル－３－（２－クロロ－６－フルオロ－４－トリフルオロメチルフェノキシ）－５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミド（ＣＡＳ番号：４５２１００－０３－７）、３－［７－フルオロ－３－オキソ－４－（プロパ－２－イニル）－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［１，４］オキサジン－６－イル］－１，５－ジメチル－６－チオキソ－［１，３，５］トリアジナン－２，４－ジオン（ＣＡＳ番号：４５１４８４－５０－７）、２－（２，２，７－トリフルオロ－３－オキソ－４－プロパ－２－イニル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［１，４］オキサジン－６－イル）－４，５，６，７－テトラヒドロ－イソインドール－１，３－ジオン（ＣＡＳ番号：１３００１１８－９６－０）、メチル（Ｅ）－４－［２－クロロ－５－［４－クロロ－５－（ジフルオロメトキシ）－１Ｈ－］メチル－ピラゾール－３－イル］－４－フルオロ－フェノキシ］－３－メトキシ－ブタ－２－エノエート（ＣＡＳ番号：９４８８９３－００－３）、ＷＯ２０１６／１２０１１６に開示されるフェニルピリジン、ＥＰ０９１６３２４２．２に開示されるベンゾオキサジノン誘導体、および一般式Ｉで表される化合物（特許ＣＮ２０２０１１４６２７６９．７を参照されたい）
が挙げられる。
別の例示的な実施形態において、Ｑは、
を表し；
Ｙはハロゲン、ハロＣ１－Ｃ６アルキルまたはシアノを表し；
Ｚはハロゲンを表し；
ＭはＣＨまたはＮを表し；
Ｘは、－ＣＸ１Ｘ２－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）ｎ－、－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）－ＣＸ１Ｘ２－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）ｎ－または－（ＣＨ２）ｒ－を表し；ｎは０または１を表し；ｒは２以上の整数を表し；
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、ハロＣ１－Ｃ６アルキル、ハロＣ２－Ｃ６アルケニル、ハロＣ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６アルキルチオ、ヒドロキシＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキル、フェニルまたはベンジルを表し；
Ｘ３、Ｘ４はそれぞれ独立にＯまたはＳを表し；
Ｗはヒドロキシ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ２－Ｃ６アルケニルオキシ、Ｃ２－Ｃ６アルキニルオキシ、ハロＣ１－Ｃ６アルコキシ、ハロＣ２－Ｃ６アルケニルオキシ、ハロＣ２－Ｃ６アルキニルオキシ、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキルオキシ、フェニルオキシ、スルフヒドリル、Ｃ１－Ｃ６アルキルチオ、Ｃ２－Ｃ６アルケニルチオ、Ｃ２－Ｃ６アルキニルチオ、ハロＣ１－Ｃ６アルキルチオ、ハロＣ２－Ｃ６アルケニルチオ、ハロＣ２－Ｃ６アルキニルチオ、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキルチオ、フェニルチオ、アミノまたはＣ１－Ｃ６アルキルアミノを表す。
別の例示的な実施形態において、一般式Ｉで表される化合物は、化合物Ａから選択され；Ｑは
Figure 2024516693000139
 を表し；Ｙは塩素を表し；Ｚはフッ素を表し；ＭはＣＨを表し；Ｘは－Ｃ＊Ｘ１Ｘ２－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）ｎ－（Ｃ＊はキラル中心、Ｒ配置である）を表し、ｎは０を表し；Ｘ１は水素を表し；Ｘ２はメチルを表し；Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立してＯを表し；Ｗはメトキシを表す。
４）ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）の阻害としては、限定されないが、以下の除草剤またはその混合物が含まれる：
（１）スルホニル尿素類：アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、ベンスルフロンメチル、クロリムロン、クロリムロンエチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメルフロン、エタメルフロンメチル、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルセトスルフロン、フルピルスル等フロン、フルピルスルフロンメチルナトリウム、ホルラムスルフロン、ハロスルフロン、ハロスルフロンメチル、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、ヨードスルフロンメチルナトリウム、イオフェンスルフロン、イオフェンスルフロンナトリウム、メソスルフロン、メタゾスルフロン、メツルフロン、メスルフロンメチル、ニコスルフロン、オルソスルファムロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プリミスルフロンメチル、プロピリスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、ピラゾスルフロン－エチル、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホメツロン－メチル、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、チフェンスルフロン－メチル、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリベヌロン－メチル、トリフロキシスルフロン、トリフロキシスルフロン－ナトリウム、トリフルスルフロン、トリフルスルフロン－メチルおよびトリトスルフロン；
（２）イミダゾリノン類、例えば、イマザメタベンズ、イマザメタベンズメチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル；
（３）トリアゾロピリミジン除草剤およびスルホアニリド、例えば、クロランスラム、クロランスラムメチル、ジクロスラム、フルメツラム、フロラスラム、メトスラム、ペノクスラム、ピロクスラム、ピリミスルファンおよびトリアファモン；
（４）ピリミジニル安息香酸塩：ビスピリバック、ビスピリバックナトリウム、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバックメチル、ピリチオバック、ピリチオバックナトリウム、４－［［［２－［（４，６－ジメトキシ－２－ピリミジニル）オキシ］フェニル等］メチル］アミノ］－安息香酸－１－メチルエチルエステル（ＣＡＳ番号：４２０１３８－４１－６）、４－［［［２－［（４，６－ジメトキシ－２－ピリミジニル）オキシ］フェニル］メチル］アミノ］－安息香酸プロピルエステル（ＣＡＳ番号：４２０１３８－４０－５）、Ｎ－（４－ブロモフェニル）－２－［（４，６－ジメトキシ－２－ピリミジニル）オキシ］ベンゼンメタンアミン（ＣＡＳ番号：４２０１３８）－０１－８）；
（５）スルホニルアミノカルボニル－トリアゾリノン系除草剤、例えば、フルカルバゾン、フルカルバゾン－ナトリウム、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾン－ナトリウム、チエンカルバゾンおよびチエンカルバゾン－メチル；
５）ＡＣＣａｓｅ（アセチルＣＯＡカルボキシラーゼ）の阻害：フェンチアプロップ、アロキシジム、アロキシジム－ナトリウム、ブトロキシジム、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホップ－プロパルギル、シクロキシジム、シハロホップ、シハロホップ－ブチル、ジクロホップ、ジクロホップ－メチル、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ－エチル、フェノキサプロップ－Ｐ、フェノキサプロップ－Ｐ－エチル、フルアジホップ、フルアジホップ－ブチル、フルアジホップ－Ｐ、フルアジホップ－Ｐ－ブチル、ハロキシホップ、ハロキシホップ－メチル、ハロキシホップ－Ｐ、ハロキシホップ－Ｐ－メチル、メタミホップ、ピノキサデン、プロフォキシジム、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ－エチル、キザロホップ－テフリル、キザロホップ－Ｐ、キザロホップ－Ｐ－エチル、キザロホップ－Ｐ－テフリル、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、４－（４’－クロロ－４－シクロプロピル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３（６Ｈ）－オン（ＣＡＳ番号１３１２３３７－７２－６）；４－（２’，４’－ジクロロ－４－シクロプロピル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３（６Ｈ）－１（ＣＡＳ番号：１３１２３３７－４５－３）；４－（４’－クロロ－４－エチル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３（６Ｈ）－ワン（ＣＡＳ番号：１０３３７５７－９３－５）；４－（２’，４’－ジクロロ－４－エチル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３，５（４Ｈ，６Ｈ）－ジオン（ＣＡＳ番号：１３１２３４０－８４－３）；５－（アセチルオキシ）－４－（４’－クロロ－４－シクロプロピル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－３，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３－オン（ＣＡＳ番号：１３１２３３７－４８－６）；５－（アセチルオキシ）－４－（２’，４’－ジクロロ－４－シクロプロピル－［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－３，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３－オン；５－（アセチルオキシ）－４－（４’－クロロ－４－エチル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－３，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３－オン（ＣＡＳ番号：１３１２３４０－８２－１）；５－（アセチルオキシ）－４－（２’，４’－ジクロロ－４－エチル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－３，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－２Ｈ－ピラン－３－オン（ＣＡＳ番号：１０３３７６０－５５－２）；４－（４’－クロロ－４－シクロプロピル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－５－オキソ－２Ｈ－ピラン－３－イル炭酸メチルエステル（ＣＡＳ番号：１３１２３３７－５１－１）；４－（２’，４’－ジクロロ－４－シクロプロピル－［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－５－オキソ－２Ｈ－ピラン－３－イル炭酸メチルエステル；４－（４’－クロロ－４－エチル－２’－フルオロ［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－５－オキソ－２Ｈ－ピラン－３－イル炭酸メチルエステル（ＣＡＳ番号：１３１２３４０－８３－２）；４－（２’，４’－ジクロロ－４－エチル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）－５，６－ジヒドロ－２，２，６，６－テトラメチル－５－オキソ－２Ｈ－ピラン－３－イル炭酸メチルエステル（ＣＡＳ番号：１０３３７６０－５８－５）。
（６）ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）の阻害：例えば、ビアラホス／ビラナホス、ビラナホス－ナトリウム、グルホシネート－アンモニウム、グルホシネート、およびグルホシネート－Ｐ。
（７）ＰＤＳ（フィトエンデサチュラーゼ）の阻害：例えば、フルオロクロリドン、フルルタモン、ベフルブタミド、ノルフルラゾン、フルリドン、ジフルフェニカン、ピコリナフェンおよび４－（３－トリフルオロメチルフェノキシ）－２－（４－トリフルオロメチルフェニル）ピリミジン（ＣＡＳ番号：１８０６０８－３３－７）。
（８）ＤＨＰＳ（ジヒドロプテロエートシンターゼ）の阻害：例えば、アスラム。
（９）ＤＸＰＳ（デオキシ－Ｄ－キシロースリン酸シンターゼ）の阻害：例えば、ビクスロゾン、クロマゾン。
（１０）ＨＳＴ（ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ）の阻害：例えば、シクロピリモレート。
（１１）ＳＰＳ（ソラネシル二リン酸シンターゼ）の阻害：例えば、アクロニフェン。
（１２）セルロース合成の阻害：例：インダジフラム、トリアジフラム、クロルチアミド、ジクロベニル、イソキサベン、フルポキサム、１－シクロヘキシル－５－ペンタフルオロフェニルオキシ－１４－［１，２，４，６］チアトリアジン－３－イルアミン（ＣＡＳ番号：１７５８９９－０１－１）、およびＣＮ１０９６８８８０７Ａに開示されているアジン。
（１３）ＶＬＣＦＡＳ（超長鎖脂肪酸合成）の阻害としては、限定されないが、下記のタイプが挙げられる：
１）α－クロロアセトアミド：例えば、アセトクロル、アラクロール、ブタクロール、ジメタクロル、ジメテナミド、ジメテナミド－Ｐ、メタザクロル、メトラクロール、メトラクロール－Ｓ、ペトキサミド、プレチラクロール、プロパクロール、プロピソクロルおよびテニルクロル；
２）α－オキシアセトアミド：例えば、フルフェナセット、メフェナセット；
３）α－チオアセトアミド：例えばアニロホス、ピペロホス；
４）アゾリルカルボキサミド：例えば、カフェンストロール、フェントラザミドおよびイプフェンカルバゾン；
５）ベンゾフラン：例えば、ベンフレサートおよびエトフメサート；
６）イソオキサゾリン類：例えば、フェノキサスルホン、ピロキサスルホン；
７）オキシラン：例えば、インダノファンおよびトリジファン；
８）チオカルバメート：例えば、シクロエート、ジメピペレート、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、モリネート、オルベンカルブ、プロスルホカルブ、チオベンカルブ／ベンチオカルブ、トリアレート、ベルノレート、および式ＩＩ．１、ＩＩ．２、ＩＩ．３、ＩＩ．４、ＩＩ．５、ＩＩ．６、ＩＩ．７、ＩＩ．８およびＩＩ．９のイソオキサゾリン化合物、ならびに特許ＷＯ２００６／０２４８２０、ＷＯ２００６／０３７９４５、ＷＯ２００７／０７１９００、ＷＯ２００７／０９６５７６等に記載される他のイソオキサゾリン化合物
Figure 2024516693000140
 。
（１４）脂肪酸チオエステラーゼの阻害：例えば、シンメチリン、メチオゾリン。
（１５）セリン・スレオニン・プロテイン・ホスファターゼの阻害：例えば、エンドタール。
（１６）リコペンシクラーゼの阻害：例えば、アミロール。
「野生型」という用語は、自然界で見られる核酸分子またはタンパク質を指す。
本発明において「栽培場所」とは、土壌等の本発明の植物が栽培される場所を含み、また、例えば、植物の種子、植物苗、生育した植物も含む。「雑草防除有効量」という用語は、標的雑草の成長または発達に影響を与えるのに十分な、例えば、標的雑草の成長または発達を予防または阻害する、または雑草を枯らすのに十分な除草剤の量を指す。有利には、雑草防除有効量は、本発明の植物種子、植物苗または植物の成長および／または発達に有意な影響を及ぼさない。当業者は、日常的な実験を通じてそのような雑草防除有効量を決定することができる。
「遺伝子」という用語は、機能分子（例えば、限定されないが、特定のタンパク質）を発現する核酸断片を含み、コードは配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む。
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写できるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳できるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることもでき、タンパク質に翻訳できないＲＮＡをコードすることもできる（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはＤＮＡターゲティングＲＮＡ等；「非コーディング」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」として知られている）。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然アミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」という用語には、限定されないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化を含む、それらの修飾形態も含まれ得る。
「生物学的に活性な断片」という用語は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から欠失した１つまたは複数のアミノ酸残基を有するが、その機能活性をまだ保持している断片を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は互換的に用いられ、二本鎖または一本鎖であり得るＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドを含む。
「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は両方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列を指し。
当業者であれば、定向進化法や点突然変異法等の公知の方法を用いて、本発明の配列番号９～配列番号１７に示すＤＮＡ断片を容易に変異させることができる。本発明の上記配列のいずれかと少なくとも７５％の同一性を有し、同様の機能を発揮する人工的に改変されたヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列の誘導体とみなされ、本発明の配列と同等である。
「同一性」という用語は、天然の核酸配列との配列類似性を指す。配列同一性は観察またはコンピューターソフトウェアによって評価することができる。コンピューター配列アライメントソフトウェアを用いることにより、２つ以上の配列間の同一性をパーセンテージ（％）として表すことができ、これを用いて関連する配列間の同一性を評価することができる。「部分配列」は、所定の配列の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を意味する。
ストリンジェントな条件としては、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液中で５０℃でハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で洗浄することが挙げられる。あるいは、７％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液中で５０℃でハイブリダイズし、１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する。あるいは、７％ ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液中で５０℃でハイブリダイズし、０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する。あるいは、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液中で５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する。あるいは、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡの混合溶液中で５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で６５℃で洗浄する。あるいは、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの溶液中で６５℃でハイブリダイゼーションし、その後２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳおよび１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで各１回メンブレンを洗浄する。あるいは、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの溶液中で６８℃、各５分間、ハイブリダイゼーションとメンブレン洗浄を２回行い、その後、６８℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの溶液中でハイブリダイゼーションとメンブレン洗浄を２回、毎回１５分行う；あるいは、０．１×ＳＳＰＥ（または０．１×ＳＳＣ）、０．１％ ＳＤＳの溶液中で６５℃でハイブリダイゼーションおよびメンブレン洗浄を行う。
本発明において用いられる場合、「発現カセット」、「発現ベクター」および「発現コンストラクト」は、植物における目的のヌクレオチド配列の発現に適した組換えベクター等のベクターを指す。「発現」という用語は、機能性産物の生産を指します。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（ｍＲＮＡまたは機能性ＲＮＡを生成するための転写等）および／またはＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を指してもよい。
本発明の「発現コンストラクト」は、直鎖状核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクターであり得、またはいくつかの実施形態において、翻訳可能なＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）であり得る。
本発明の「発現コンストラクト」は、異なる供給源からの目的の調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ供給源からのものであるが自然界で通常生じるものとは異なる方法で配置された目的の調節配列およびヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明における「高発現遺伝子」とは、特定の組織において一般的な遺伝子よりも発現量が高い遺伝子をいう。
「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡコンストラクト」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、ベクターおよび少なくとも１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは、通常、インサートの発現および／または増殖、または他の組換えヌクレオチド配列の構築を目的として作製される。インサートは、プロモーター配列に作動可能または作動不能に連結されてもよく、またＤＮＡ調節配列に作動可能にまたは作動不能に連結されてもよい。
「調節配列」および「調節因子」という用語は互換的に用いることができ、コード配列の上流（５’非コード配列）、中間または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼす。植物発現調節因子とは、植物における目的のヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳を制御できるヌクレオチド配列を指す。
調節配列としては、限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリＡ認識配列が挙げられる。
「プロモーター」という用語は、別の核酸断片の転写を制御することができる核酸断片を指す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターは、植物細胞に由来するか否かに関わらず、植物細胞において遺伝子転写を制御することができるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生調節プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。
「強力なプロモーター」という用語は、当該技術分野においてよく知られており、広く用いられている用語である。多くの強力なプロモーターが当技術分野で知られているか、日常的な実験によって同定することができる。強力なプロモーターの活性は、野生型生物において過剰発現される核酸分子に作動可能に連結されたプロモーター、例えば内因性遺伝子のプロモーターよりも高い活性を有するプロモーターの活性よりも高い。好ましくは、強力なプロモーターの活性は、野生型生物において過剰発現される核酸分子に作動可能に連結されたプロモーター活性よりも約２％、５％、８％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも高い。当業者であれば、プロモーターの活性を測定し、異なるプロモーターの活性を比較する方法を知っている。
「構成的プロモーター」という用語は、一般に、ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」および「組織優先プロモーター」は互換的に用いられ、主に、しかし必ずしも排他的にではなく組織または器官で発現され、また特定の細胞または細胞型でも発現されるプロモーターを指す。「発生調節プロモーター」とは、その活性が発生事象によって決定されるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」は、内因性または外因性の刺激（環境、ホルモン、化学シグナル等）に応答して、作動可能に結合したＤＮＡ配列を選択的に発現する。
本明細書で用いられる場合、「作動可能に連結された」という用語は、ヌクレオチド配列の転写が転写調節因子によって制御および調節されるような、調節因子（例えば、限定されないが、プロモーター配列、転写終結配列等）と核酸配列（例えば、コード配列またはオープンリーディングフレーム）との連結を指す。調節因子領域を核酸分子に機能的に連結するための技術は当技術分野で知られている。
核酸分子（プラスミド、直鎖核酸断片、ＲＮＡ等）またはタンパク質を植物に「導入する」とは、核酸またはタンパク質で植物の細胞を形質転換して、核酸またはタンパク質が植物細胞内で機能できるようにすることを指す。本発明における「形質転換」には、安定形質転換および一過性形質転換が含まれる。
「安定形質転換」という用語は、植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の導入により、外因性遺伝子の安定した継承がもたらされることを指す。一旦安定に形質転換されると、外因性核酸配列は植物およびその任意の連続世代のゲノムに安定して組み込まれる。
「一過性形質転換」という用語は、機能を実行するために植物細胞に核酸分子またはタンパク質を導入しても、外来遺伝子の安定した継承がもたらされないことを指す。一過性形質転換では、外因性核酸配列は植物のゲノムに組み込まれない。
生物における内因性遺伝子の発現の変化には、強度と時空間特性という２つの側面が含まれる。強度の変化には、遺伝子の発現の増加（ノックアップ）、減少（ノックダウン）、および／または遮断（ノックアウト）が含まれる。時空間特異性には、誘導性だけでなく、時間的（成長および発達段階）の特異性および空間的（組織）の特異性も含まれる。さらに、これには、タンパク質の標的を変更すること、例えば、タンパク質の細胞質局在の特徴を葉緑体局在または核局在の特徴に変更することが含まれる。
他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。
この説明で引用されるすべての出版物および特許は、あたかも個々の出版物または特許が参照によって組み込まれることが正確かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、引用された出版物に関連する方法および／または材料を、開示および説明するために参照によって本明細書に組み込まれる。出願日より前に出版された出版物の引用は、本発明が既存の発明の出版に先立つ資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供された発行日は実際の発行日と異なる場合があり、独立した検証が必要になる場合がある。
特に明記または暗示されない限り、本明細書で用いられる場合、用語「ａ」、「ａ／ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書で言及または引用されるすべての特許、特許出願、および出版物は、個別に引用された場合と同じ程度の引用で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の有利な技術的効果を有する。
本発明は、以下の２つの異なる専門分野の情報を総合的に活用し、生物体内に新規遺伝子を直接作り出す方法を開発し、これまでの遺伝子編集ツール（遺伝子のノックアウト）の従来の使い方を一変させ、新規遺伝子の創出のための新たな利用法を実現するものであり、特に遺伝子編集技術を用いて内因性遺伝子をノックアップし、目的の遺伝子の発現を高める編集手法を実現するものである。１つ目は、遺伝子編集の分野における情報であり、すなわち、２つ以上の異なる標的部位とＣａｓ９とがゲノムまたは生物体を同時に標的とする場合、欠失、反転、倍加、または逆倍加等のさまざまな状況が発生する可能性がある。２つ目は、ゲノミクス分野の情報であり、すなわち、ゲノム内のさまざまな遺伝子の位置および距離、ならびにさまざまな要素（プロモーター、５’ＵＴＲ、コーディング領域（ＣＤＳ）、さまざまなドメイン領域、ターミネーター等）の情報である。これら２つの異なる分野の情報を組み合わせることにより、２つ以上の異なる遺伝子の特定の部位、または１つの遺伝子内の２つ以上の特定の部位（特定の部位はゲノミクスの分野で決定できます）で切断が誘導される、異なる遺伝子要素または機能ドメインの新たな組み合わせが、欠失、反転、倍加および逆倍加または染色体アーム交換等を通じて形成され得（具体的な状況は遺伝子編集の分野で提供される)、それにより、生物において特異的に新規の遺伝子が生成される。
本発明によって生成される新規遺伝子は、生物における自発的ＤＮＡ修復機構の作用下で、２つ以上の遺伝子の異なる要素の融合または組換えによって形成され、発現強度、時空間特異性、特殊な機能ドメイン、および外因性導入遺伝子または合成遺伝要素を含まない元の遺伝子を変化させる。新規遺伝子は、２つ以上の異なる遺伝要素が融合しているため、遺伝子変異の範囲が大幅に広がり、より豊富で多様な機能が生み出されるため、幅広い応用が期待されている。同時に、これらの新規遺伝子は遺伝子編集ベクターに連結されていないため、遺伝子分離によってベクター要素を除去することができ、その結果、動植物育種用の新規遺伝子を含む非トランスジェニック生物材料が得られる。あるいは、ｍＲＮＡまたはリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）の送達によって非統合型一時編集を実行し、新規遺伝子を含む非遺伝子組み換え生体材料を作成することもできる。このプロセスは非トランスジェニックであり、結果的に編集された素材にはトランスジーンは含まれない。理論的にも実際にも、これらの新規遺伝子は従来の育種技術（放射線や化学的突然変異誘発等）によっても得ることができる。違いは、従来の技術によるスクリーニングでは膨大な数のランダムな変異体を含むライブラリーの作成が必要なため、新しい機能遺伝子のスクリーニングには時間と費用がかかることである。本発明では、遺伝子編集技術と組み合わせたバイオインフォマティクス解析により、新規機能遺伝子を創製することができ、育種期間を大幅に短縮することができる。本発明の方法は、多くの国における遺伝子編集生物に関する現在の規制に従う必要はない。
さらに、本発明の新規遺伝子作製技術は、成長、発達、抵抗性、収量等を含む生物の多くの形質を変化させるために用いることができ、大きな応用価値を有する。作成された新規遺伝子は、元の遺伝子の発現強度および／または時空間特性を変化させる新しい調節要素（プロモーター等）を含む場合があり、または新しいアミノ酸配列を有し、新しい機能を有する。作物を例にとると、特定の遺伝子の発現を変えると、害虫や雑草等の有害生物や、干ばつ、浸水、塩分等の非生物的ストレスに対する作物の耐性が高まり、収量も増加し、品質も向上する。魚を例にとると、魚の成長ホルモンの発現特性を変えると、その成長や発達の速度が大きく変化する。
図１は、イネにおける新規ＨＰＰＤ遺伝子の作製の模式図を示す。 図２は、イネにおける新規ＥＰＳＰＳ遺伝子の作製の模式図を図２に示す。 図３は、シロイヌナズナにおける新規ＰＰＯＸ遺伝子の作製の模式図を示す。 図４は、イネにおける新規ＰＰＯＸ遺伝子の作製の模式図を図４に示す。 図５は、イネのプロトプラストを用いて試験したＨＰＰＤ重複スキームの配列決定結果を示す。 図６は、イネのアグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２０９１のマップを示す。 図７は、ｐＱＹ２０９１形質転換ハイグロマイシン耐性イネカルスにおける新規遺伝子断片を検出するためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域の融合によって作成された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。数字は、さまざまなカルスサンプルの数である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。 図８は、ｐＱＹ２０９１形質転換イネＴ０苗における新規遺伝子断片を検出するためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーター、およびＨＰＰＤのコード領域の融合によって作成された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。番号は、さまざまなＴ０苗のシリアル番号である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。 図９は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加株ＱＹ２０９１Ｔ０世代のビピラゾン耐性試験結果を示す図である。同一の植木鉢の左側が野生型のＪｉｎｊｉｎｇ８１８であり、右側がＨＰＰＤ倍加株である。 図１０は、ＨＰＰＤ遺伝子倍加株ＱＹ２０９１Ｔ０世代におけるＨＰＰＤ遺伝子およびＵＢＩ２遺伝子の相対発現量を示す図である。８１８ＣＫ１および８１８ＣＫ３は、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８の２つの対照植物を表す。１３Ｍおよび２０Ｍは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表す。１３Ｌおよび２０Ｌは、除草剤耐性試験に用いられたＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の二次分げつ葉サンプルを表す。 図１１は、ＱＹ２０９１Ｔ１世代の可能な遺伝子型および分子検出プライマーの結合部位の概略図である。 図１２は、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０について、ＨＰＰＤ倍加を検出する配列決定結果と、予測された倍増配列との比較を示す。 図１３は、ＱＹ２０９１ＨＰＰＤ倍増株のＴ１世代の実生段階における除草剤耐性試験の結果を示す図である。 図１４は、イネＰＰＯ１遺伝子染色体断片逆位の起こり得る編集事象の種類と分子検出用プライマーの結合部位を示す模式図である。 図１５は、ＥＰＳＰＳ反転検出のシーケンス結果を示す。 図１６は、アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２２３４のマップを示す図である。 図１７は、ｐＱＹ２２３４で形質転換されたハイグロマイシン耐性イネカルスの新規遺伝子断片を検出するためのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、ＣＰ１２遺伝子のプロモーター、およびＰＰＯ１のコード領域の融合によって作成された新規遺伝子のＰＣＲバンドを示す。番号は、さまざまなカルスサンプルのシリアル番号である。ＭはＤＮＡマーカーを表し、バンドサイズは順に１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、５０００ｂｐ、７５００ｂｐである。 図１８は、ＱＹ２２３４Ｔ０世代のＰＰＯ１遺伝子反転株の化合物Ａに対する耐性試験の結果を示す図である。同じ処理量の下で、左側の植木鉢は野生型のＪｉｎｊｉｎｇ Ｎｏ．５対照であり、右側はＰＰＯ１反転株である。 図１９は、ＱＹ２２３４Ｔ０世代ＰＰＯ１反転株におけるＰＰＯ１遺伝子とＣＰ１２遺伝子の相対発現量を示す図である。Ｈ５ＣＫ１とＨ５ＣＫ２は２つの野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５対照植物を表す。２５２Ｍ、３０４Ｍ、および３２９Ｍは、ＱＹ２２３４－２５２、ＱＹ２２３４－３０４、およびＱＹ２２３４－３２９Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表す。２５２Ｌ、３０４Ｌ、および３２９Ｌは、二次分げつ葉サンプルを表す。 図２０は、ＰＰＯ１逆転の配列決定結果、およびＪｉｎｊｉｎｇ Ｎｏ．５バックグラウンドにおける予測された逆転配列との比較を示す。 図２１は、ＰＰＯ１反転の配列決定結果と、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンドにおける予測された反転配列との比較を示す。 図２２は、実生段階におけるＱＹ２２３４ＰＰＯ１逆転株のＴ１世代の除草剤耐性試験の結果を示す。 複製によりゼブラフィッシュ胚に新しいＧＨ１遺伝子カセットが作成された。ＧＨ１遺伝子はゼブラフィッシュの成長ホルモン遺伝子である。Ｃｏｌ１Ａ１ａは、コラーゲンＩ型アルファ１ａ遺伝子である。Ｃｏｌ１Ａ１ａ－ＧＨ１融合体は、重複の結果として得られた新規遺伝子カセットである。対照群（ＣＫ）のＰＣＲ増幅に用いられたＤＮＡテンプレートは、マイクロインジェクションを行わずに若いゼブラフィッシュから抽出された。治療群（ＲＮＰ治療）におけるＰＣＲ増幅に用いたＤＮＡテンプレートは、マイクロインジェクション後に若いゼブラフィッシュから抽出したＤＮＡサンプルである。 ＱＹ２２３４イネのＴ１世代における圃場におけるＰＰＯ１逆転イベント系統の除草剤耐性を試験した。ＷＴは野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８である。５＃および４２＃は、それぞれＱＹ２２３４／８１８－５およびＱＹ２２３４／８１８－４２のＰＰＯ１反転イベントラインからのサンプルを表す。試験した除草剤は、ＰＰＯ阻害剤化合物Ａである。 図２５は、ＱＹ２２３４系統のＴ１イネ植物におけるＰＰＯ１タンパク質のウェスタンブロット検出を示す。５＃、４２＃、１１４＃、および２５７＃は、それぞれＱＹ２２３４／８１８－５、ＱＹ２２３４／８１８－４２、ＱＹ２２３４／８１８－１４４、およびＱＹ２２３４／８１８－２５７の反転イベントラインからのサンプルを表す。 図２６は、ＱＹ２０９１イネのＴ１世代における圃場条件下でのＨＰＰＤ阻害剤除草剤耐性の圃場アッセイを示す。１２＃と２１＃はそれぞれＱＹ２０９１－１２とＱＹ２０９１－２１の重複イベント行を表す。試験された除草剤は、ＨＨＰＤ阻害剤ビピラゾンである。 図２７は、イネにおけるＰＰＯ１遺伝子を有する重複ＤＮＡ断片の概略図を示し、配列決定ピーク比較を用いてイネのプロトプラスト細胞において４つの重複イベントが検出された。ｐＱＹ２６４８、ｐＱＹ２６５０、ｐＱＹ２６５１、ｐＱＹ２６５３は試験されたベクター番号である。Ｒ２、Ｆ２を配列決定プライマーとして用いた。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図２８は、イネにおけるＨＰＰＤ遺伝子発現を上方制御する１番染色体および２番染色体間の断片転座の模式図を示す。標的断片の転座後、ＣＰ１２遺伝子プロモーターがＨＰＰＤＣＤＳ発現を駆動する。同時に、ＨＰＰＤ遺伝子プロモーターがＣＰ１２ＣＤＳ発現を駆動する。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 ｐＱＹ２２５７で形質転換したイネのプロトプラスト細胞において、ＣＰ１２のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域の融合が検出された。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 ＨＰＰＤのプロモーターとＣＰ１２のコード領域の融合が、ｐＱＹ２２５９で形質転換されたイネプロトプラスト細胞において検出された。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図３１は、ＣＲＩＳＰＲ／ＬｂＣｐｆ１によって媒介される、イネの２つの標的切断間のセグメントの重複の結果としてのＨＰＰＤ遺伝子発現のノックアップの模式図を示す。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図３２は、イネのプロトプラストの２つの標的切断間のセグメントの欠失によるＯｓＣＡＴＣ遺伝子と葉緑体シグナルペプチドドメイン（ＬＯＣ４３３１５１４ＣＴＰ）の融合の概略図を示す。その結果、ＯｓＣＡＴＣタンパク質は葉緑体シグナルペプチドドメインを有し、したがって発現後の葉緑体への移動が可能になる。そして、イネのプロトプラスト細胞で陽性事象が検出され、それが配列決定によって証明された。ＣＴＰは葉緑体シグナルペプチドドメインの略である。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図３３は、標的切断間の染色体断片反転を介して葉緑体シグナルペプチドドメイン（ＬＯＣ４３３７０５６ＣＴＰ）を連結するＯｓＧＬＯ３遺伝子の概略図であり、その結果、ＯｓＧＬＯ３タンパク質は葉緑体シグナルペプチドドメインを有し、したがって発現後に葉緑体に移動することができる一方、ＬＯＣ４３３７０５６遺伝子はＣＴＰ；および陽性イベントイネプロトプラストの検出結果を低下させる。ＣＴＰは葉緑体シグナルペプチドドメインの略である。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図３４は、イネの２つの標的切断間のＤＮＡ断片の複製によるＰＰＯ２遺伝子のノックアップを示す模式図を示す。ＳＡＭＤＣの強力なプロモーターがＰＰＯ２の発現を駆動する新規遺伝子が生成される。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 配列データのアラインメントによって示されるように、ｐＱＹ１３８６で形質転換されたイネカルスにおいて陽性重複事象が検出された。２８＃、６２＃は２つの重複陽性カルスである。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 配列データのアラインメントによって示されるように、ｐＱＹ１３８７で形質転換されたイネカルスにおいて陽性重複事象が検出された。６４＃、８２＃、１１０＃、１４５＃は重複陽性カルスである。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 ｐＱＹ１３８７形質転換カルスから出現したＴ０イネ植物（ＱＹ１３８７／８１８－２）で陽性重複イベントが検出された。２つのターゲットおよび重複関節の修復結果は、サンガー配列データと一致した。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図３８は、ＱＹ１３８７／８１８Ｔ０イネにおけるＰＰＯ２の相対発現量の検出結果を示す。予想通り、ＰＰＯ２発現は大幅に増加し、一方、ＳＡＭＤＣ発現は大幅に減少した。 図３９は、イネＱＹ１３８７Ｔ０植物の除草剤耐性アッセイを示す。２＃は１３８７／８１８－２系統を表し、４＃は１３８７／８１８－４系統を表し、ＷＴはＪｉｎｊｉｎｇ８１８の野生型である。試験した除草剤はＰＰＯ阻害剤化合物Ａである。 図４０は、イネの２つの標的切断部分間のＤＮＡ断片反転による新しいＰＰＯ２遺伝子の作製の概略図である。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 配列データのアラインメントによって示されるように、ポジティブ反転事象がＱＹ２６１１形質転換イネカルスで検出された。１０＃はＱＹ２６１１／８１８－１０カルスを表し、１３＃はＱＹ２６１１／８１８－１３カルスを表す。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 配列データのアライメントによって示されるように、ポジティブ反転事象がＱＹ２６１２形質転換イネカルスで検出された。５＃はＱＹ２６１２／８１８－５カルスを表し、３４＃はＱＹ２６１２／８１８－３４カルスを表します。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図４３は、２つの標的切断間のセグメントの複製による、トウモロコシプロトプラスト細胞における新規ＰＰＯ２遺伝子カセットの生成成功の概略図であり、サンガー配列データのアライメントによって実証される。ｐＱＹ１３４０およびｐＱＹ１３４１はテストベクターである。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図４４は、２つの標的切断間のセグメントの反転による、ｐＱＹ２６２６ベクターでトランスフェクトされたコムギプロトプラスト細胞における新規ＰＰＯ２－２Ａ遺伝子カセットの成功裏の生成の概略図であり、サンガー配列データのアライメントによって実証される。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図４５は、ｐＱＹ２６３１ベクターでトランスフェクトされたコムギプロトプラスト細胞において、２つの標的カット間のセグメントの複製を介して新しいＰＰＯ２－２Ｂ遺伝子カセットの生成に成功したことを示す概略図であり、サンガー配列データのアライメントによって実証される。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図４６は、ｐＱＹ２６３５ベクターでトランスフェクトされたコムギプロトプラスト細胞において、２つの標的切断間のセグメントの複製を介して新しいＰＰＯ２－２Ｄ遺伝子カセットの生成に成功したことを示す概略図であり、サンガー配列データのアライメントによって実証される。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図４７は、染色体断片逆位米系統ＱＹ１０８５／８１８－２３の配列決定結果を示す。 図４８は、染色体断片重複イネＱＹ１０８９／８１８－３２１系統の配列決定結果を示す。 図４９は、２つの標的切断間のセグメントの反転を介して、ＴＮＮＩ２遺伝子プロモーターによって駆動される新しいＩＧＦ２（インスリン様成長因子２）遺伝子カセットの生成の成功の概略図であり、ブタ初代線維芽細胞におけるブタＴＮＮＩ２プロモーターおよびＩＧＦ２遺伝子のポジティブ融合イベントの検出を実証する。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図５０は、２つの標的切断間のセグメントの反転を介して、ＩＧＦ２遺伝子プロモーターによって駆動される新しいＴＮＮＩ３（筋トロポニンＴ）遺伝子カセットの生成の成功の概略図であり、ブタ初代線維芽細胞におけるブタＩＧＦ２プロモーターおよびＴＮＮＴ３の融合イベントの検出を実証する。この図はＤＮＡセグメントの長さに比例していない。 図５１は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列決定結果を示す。実験の結果、ゼブラフィッシュの胚ではｇｈ１遺伝子とｃｏｌ１ａ１ａ遺伝子の間の断片が２倍になっていることが分かった。 図５２は、シーケンス結果を示す。実験の結果、ｄｄｘ５遺伝子のコード領域とコード領域とプロモーター、およびｇｈ１遺伝子のコード領域とプロモーターが染色体断片の反転により交換されることが分かった。 図５３は、反転ゼブラフィッシュと野生型ゼブラフィッシュとの比較図を示す。この結果から、発現が上方制御されたゼブラフィッシュの成長が明らかに加速されることが分かった。 図５４は、イネにおけるＰＰＯ２遺伝子をノックアップするためのＵｂｉ２プロモーターの転座の模式図である。 図５５は、ＱＹ３７８－１６転座イネの苗期Ｔ１世代の除草剤耐性試験結果を示す図である。
本発明を実施するための具体的なモデル
本発明を、以下の実施例と併せてさらに説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の保護範囲はこれに限定されるべきではない。
実施例１：植物－イネプロトプラスト試験における染色体断片の倍加誘導により内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現をノックアップする編集方法
ＨＰＰＤは植物のクロロフィル合成経路における重要な酵素であり、ＨＰＰＤの活性の阻害は最終的にアルビノ白化症と植物の死につながると考えられている。メソトリオンやトプラメゾン等の多くの除草剤は、ＨＰＰＤを標的タンパク質とする阻害剤であるため、植物の内因性ＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルを増大させると、これらの除草剤に対する植物の耐性が向上する可能性がある。イネＨＰＰＤ遺伝子（配列番号６に示す、１～１０６７ｂｐがプロモーター、残りが発現領域）はイネ２番染色体上に位置する。バイオインフォマティクス解析により、イネユビキチン２（以下、ＵＢＩ２という）遺伝子（配列番号５に示す、１～２１０７ｂｐがプロモーター、残りが発現領域）が、ＨＰＰＤ遺伝子の約３３８ｋｂ下流に位置し、ＵＢＩ２遺伝子とＨＰＰＤ遺伝子とが染色体上で同じ方向にあることが見出された。国際イネゲノム解読プロジェクト（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）が提供するイネ遺伝子発現プロファイルデータによると、イネ葉におけるＵＢＩ２遺伝子の発現強度は３～１０倍高かったＨＰＰＤ遺伝子のプロモーターよりも強く、ＵＢＩ２遺伝子プロモーターは強力な構成的に発現されるプロモーターであった。
図１に示すように、スキーム１は、ＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の部位で二本鎖切断が同時に生成され、２つの切断間の領域が２倍になる事象がスクリーニング後に得られたことを示す。そして、ＵＢＩ２のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域を融合させることにより、新規遺伝子を形成することができた。また、図１に示すスキーム２によれば、ＵＢＩ２のプロモーターとＨＰＰＤのコード領域が融合した新規遺伝子も２回連続の反転により形成することができた。まず、図１に示すスキームをイネのプロトプラストシステムで次のように試験した。
１．まず、イネＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）に入力し、利用可能な編集ターゲットサイトを検索した。オンラインスコアリングの後、ＨＰＰＤおよびＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域との間の以下の標的部位を試験用に選択した。
Figure 2024516693000141
ガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２は、ＨＰＰＤ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間に位置し、ＨＰＰＤタンパク質の開始コドンに近く、ガイドＲＮＡ３およびガイドＲＮＡ４は、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間に位置し、ＵＢＩ２タンパク質の開始コドンに近い。
ｐＨＵＥ４１１ベクター（https://www.addgene.org/62203/）をバックボーンとして用い、上記のターゲット部位に対して以下のプライマーを設計して、「Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. A CRISPR/Cas9 Toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29; 14(1): 327」に記載されているようにベクター構築を実行した。
Figure 2024516693000142
以下の二重標的の組み合わせのための遺伝子編集ベクターは、上記の文献で提供される方法に従って構築された。具体的には、ｐＣＢＣ－ＭＴ１Ｔ２プラスミド（ｈhttps://www.addgene.org/50593/）をテンプレートとして、ｓｇＲＮＡ１＋３、ｓｇＲＮＡ１＋４、ｓｇＲＮＡ２＋３、ｓｇＲＮＡ２＋４の二重標的断片をそれぞれ増幅し、ｓｇＲＮＡ発現カセットを構築した。ｐＨＵＥ４１１のベクター骨格をＢｓａＩで消化してゲルから回収し、標的断片を消化してライゲーション反応に直接用いた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてベクター骨格と標的断片をライゲーションし、ライゲーション産物をＴｒａｎｓ５αコンピテントセルに形質転換した。さまざまなモノクローンを選択し、配列を決定した。Ｓｐａｒｋｊａｄｅ高純度プラスミドミニ抽出キットを用いて、正しい配列を有するクローンからプラスミドを抽出し、以下のようにそれぞれｐＱＹ００２０６５、ｐＱＹ００２０６６、ｐＱＹ００２０６７、およびｐＱＹ００２０６８と名付けられた組換えプラスミドを得た。
ｐＱＹ００２０６５ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ１＋３ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ３の組み合わせ
ｐＱＹ００２０６６ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ１＋４ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ４の組み合わせ
ｐＱＹ００２０６７ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ２＋３ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ３の組み合わせ
ｐＱＹ００２０６８ｐＨＵＥ４１１－ＨＰＰＤ－ｓｇＲＮＡ２＋４ＯｓＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ４の組み合わせ
２．上記ｐＱＹ００２０６５－００２０６８ベクター用の高純度、高濃度のプラスミドを次のように調製した。
プラスミドは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７６４０）を用いて説明書に従って抽出した。具体的な手順は次のとおりである。
（１）大腸菌５ｍｌを加え、３７℃、２００ｒｐｍで１２～１６時間振盪する。
（２）上記菌液を５００ｍｌ遠沈管に入れ、５０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てる。
（３）３ｍｌの細胞再懸濁液（ＣＲＳ）を加えて細胞ペレットを再懸濁し、ボルテックスして完全に混合する。
（４）３ｍｌの細胞溶解液（ＣＬＳ）を添加し、５分以内でゆっくりと混合する。
（５）中和液３ｍｌを加え、色が透明になるまで転倒混和する。
（６）１４，０００ｇで１５分間遠心分離し、沈殿が緻密に形成されなかった場合はさらに１５分間遠心分離する。
（７）白い沈殿物が遠心管に吸い込まれないように、上清を新しい５０ｍｌ遠心管に移す。
（８）１０ｍｌのＤＮＡ精製樹脂（精製樹脂、使用前に激しく振盪）を添加し、よく混合する。
（９）樹脂／ＤＮＡ混合物をフィルターカラムに流し込み、真空ポンプ負圧法（０．０５ＭＰａ）で処理する。
（１０）フィルターカラムに１５ｍｌのＣｏｌｕｍｎＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＷＳ）を加え、真空引きする。
（１１）ＣＷＳを１５ｍｌ加え、真空引きを１回繰り返す。溶液全体がフィルターカラムを通過した後、真空引きを３０秒間延長した。
（１２）フィルターカラムを切断し、１．５ｍｌ遠心管に移し、１２，０００ｇで２分間遠心分離し、残留液体を除去し、フィルターカラムを新しい１．５ｍｌ遠心管に移す。
（１３）７０℃に予熱した滅菌水２００μＬを加え、２分間静置する。
（１４）１２，０００ｇで２分間遠心分離してプラスミドＤＮＡを溶出する。濃度は一般に約１μｇ／μＬであった。
３．イネのプロトプラストを調製し、ＰＥＧを介した形質転換を行った。
まず、品種「日本晴」のプロトプラスト用イネ苗を準備した。種子は、Weeds Department of the School of Plant Protection, China Agricultural Universityから提供され、社内で増殖させた。最初にイネ種子の皮を取り除き、その皮を剥いた種子を７５％エタノールで１分間洗浄し、５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで２０分間処理し、次いで滅菌水で５回以上洗浄した。超清潔なテーブルでブロー乾燥した後、それらを１／２ＭＳ培地（各ボトルあたり２０個のシード）を含む組織培養ボトルに入れた。プロトプラストは、２６℃、１２時間の光下で約１０日間インキュベートすることによって調製された。
イネのプロトプラストの調製およびＰＥＧを介した形質転換の方法は、「Lin et al., 2018 Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single-cell mutation detection to mutant plant regeneration. Plant Biotechnology Journal https://doi.org /10.1111/pbi.12870」に従って行った。手順は下記のとおりである。
（１）苗の葉鞘を選別し、Ｇｅｅｌｙ社の鋭利なカミソリで約１ｍｍに切り、後で用いるために０．６Ｍマンニトール＋ＭＥＳ培地（配合：０．６Ｍマンニトール、０．４Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．７）に入れる。全ての材料を切断し、２０ｍｌの酵素加水分解溶液（配合：１．５％セルラーゼＲ１０／ＲＳ（ヤクルト本社）、０．５％メセロザイムＲ１０（ヤクルト本社）、０．５Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、５ｍＭ β－メルカプトエタノール）に移し、錫箔に包み、２８℃のシェーカーに置き、暗所で５０ｒｐｍで約 ４時間酵素的に加水分解し、室温で速度を最後の２分間１００ｒｐｍに上げた。
（２）酵素溶解後、等量のＷ５溶液（配合：１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭＥＳ）を添加し、１０秒間水平に振盪してプロトプラストを遊離させた。酵素溶解後の細胞を３００メッシュの篩で濾過し、１５０ｇで５分間遠心分離してプロトプラストを収集した。
（３）細胞をＷ５溶液で２回洗浄し、１５０ｇで５分間の遠心分離によりプロトプラストを収集した。
（４）プロトプラストを適量のＭＭＧ溶液（配合：３．０５ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｇ／Ｌ ＭＥＳ、９１．２ｇ／Ｌマンニトール）で再懸濁し、プロトプラストの濃度を約２×１０６細胞／ｍＬとした。
プロトプラストの形質転換は次のように行った。
（１）２００μＬの前述のＭＭＧ再懸濁プロトプラストに、エンドトキシンを含まない高品質のプラスミドＤＮＡ（１０～２０μｇ）を加え、軽く叩いてよく混合した。
（２）等量の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液（配合：４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ、０．５Ｍマンニトール、１００ｍＭ ＣａＣｌ２）を添加し、軽く叩いてよく混合し、２８℃の暗所で１５分間放置した。
（３）形質転換の誘導後、１．５ｍｌのＷ５溶液をゆっくり添加し、軽く叩いて細胞をよく混合した。細胞を１５０ｇで３分間遠心分離することによって回収した。このステップを１回繰り返した。
（４）１．５ｍｌのＷ５溶液を添加して細胞を再懸濁し、２８℃のインキュベーターに入れ、暗所で１２～１６時間培養した。プロトプラストのゲノムＤＮＡを抽出するには、培養を４８～６０時間行う必要があった。
４．ゲノムターゲティングと新規遺伝子の検出：
（１）まず、ＣＴＡＢ法を一部改変してプロトプラストＤＮＡを抽出した。具体的な方法は、プロトプラストを遠心分離し、上清を廃棄した。ＤＮＡ抽出液（配合：ＣＴＡＢ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８１．８２ｇ／Ｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ β－メルカプトエタノール）５００μＬを添加し、よく振盪して混合し、６５℃の水浴に１時間浸した。インキュベートしたサンプルが冷却したら、５００μＬのクロロホルムを加えて上下を逆にして混合し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清４００μＬを新しい１．５ｍｌ遠心管に移し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを添加し、混合物を沈殿させるために－２０℃で２０分間保持した。混合物を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。沈殿を風乾した後、５０μＬの超純水を加え、後で用いるために－２０℃で保管した。
（２）以下の表の検出プライマーを用いて、両側に標的部位を含む断片、またはＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤコード領域の融合から生じる予測断片を増幅した。ＰＣＲ産物の長さは３００～１０００ｂｐであり、プライマー８－Ｆ＋プライマー６－Ｒの組み合わせを用いて、染色体断片の倍加後の中央結合部の融合断片を検出し、産物の長さは６３０ｂｐになると予想された。
Figure 2024516693000143
ＰＣＲ反応系は下記の通りである。
Figure 2024516693000144
（３）ＰＣＲ反応は以下の一般的な反応条件で行った。
Figure 2024516693000145
（４）ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動により検出した。結果は、ＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤコード領域の予測融合断片の６３０ｂｐポジティブバンドが、ｐＱＹ００２０６６およびｐＱＹ００２０６８形質転換サンプルで検出できることを示すものであった。
５．ＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤ コード領域の融合断片の陽性サンプルを検証のために配列決定し、ＯｓＨＰＰＤｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ－ｐｒｉｍｅｒ８－ＦおよびＯｓＨＰＰＤｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ－ｐｒｉｍｅｒ６－Ｒプライマーを使用して両端から配列を決定した。図５に示すように、ＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子の発現領域を直接連結することができ、イネのＵＢＩ２遺伝子のプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子の発現領域の融合編集イベントを行うことができた。ｐＱＹ００２０６６およびｐＱＹ００２０６８プラスミドで形質転換したイネのプロトプラストゲノムＤＮＡ中に検出され、染色体断片を倍加して新しいＨＰＰＤ遺伝子を形成するスキームが実現可能であることを示し、強力なプロモーターによって発現が駆動される新しいＨＰＰＤ遺伝子を作成することができ、これはＨＰＰＤ倍加イベントとして定義された。ＨＰＰＤ倍加事象を試験するためのｐＱＹ００２０６６ベクター形質転換プロトプラストの配列決定結果を配列番号９に示；ＨＰＰＤ倍加事象を試験するためのｐＱＹ００２０６８ベクター形質転換プロトプラストの配列決定結果を配列番号１０に示す。
実施例２：染色体倍加による内因性ＨＰＰＤ遺伝子ノックアップ発現による除草剤耐性イネの作出
１．ノックアップ編集ベクターの構築：実施例１のプロトプラスト試験の結果に基づいて、二重標的組み合わせＯｓＨＰＰＤガイドＲＮＡ１：５’ＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣ３’およびＯｓＨＰＰＤガイドＲＮＡ４：５’ＧＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＴ３’を高度編集効率を選択した。アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２０９１を実施例１に従って構築した。ｐＨＵＥ４１１をベクター骨格として用いて、イネコドン最適化を行った。ベクターのマップを図６に示す。
２．イネカルスのアグロバクテリウム形質転換：
１）アグロバクテリウム形質転換：イネノックアップ編集ベクターｐＱＹ２０９１プラスミド１μｇをアグロバクテリウムＥＨＡ１０５ヒートショックコンピテントセル（ＡｎｇｙｕＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｇ６０４０）１０μｌに添加し、氷上に５分間置き、液体窒素に１時間浸漬した。５分間急速冷凍し、その後取り出して３７℃で５分間加熱し、最後に氷上に５分間置いた。ＹＥＢ液体培地（配合：酵母エキス１ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、ビーフエキス５ｇ／Ｌ、ショ糖５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ）を５００μｌ添加した。混合物をシェーカーに入れ、２８℃、２００ｒｐｍで２～３時間インキュベートした。３５００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離により細菌を回収し、回収した細菌をＹＥＢ（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ＋リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）プレート上に広げ、２８℃のインキュベーター内で２日間インキュベートした。シングルコロニーを採取して液体培地に置き、細菌を－８０℃で保存した。
２）アグロバクテリウムの培養：ＹＥＢプレート上の形質転換アグロバクテリウムのシングルコロニーを採取し、２０ｍｌのＹＥＢ液体培地（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ＋リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）に添加し、２８℃で撹拌培養した。ＯＤ６００が０．５になるまで細菌細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収し、２０～４０ｍｌのＡＡＭ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、ロット番号ＬＡ８５８０）液体培地を加えて細菌細胞を再懸濁し、ＯＤ６００を０．２～０．３に到達させ。、次いでアセトシリンゴン（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、商品番号Ａ８１１０）を、カルスに感染させるための最終濃度２００μＭに達するまで添加した。
３）イネカルスの誘導：形質転換レシピエントイネの品種はＨｕａｉｄａｏ５とＪｉｎｊｉｎｇ８１８であり、江蘇省淮安の種子市場から購入し、自家増殖させた。８００～２０００個のきれいな米種子を籾殻を取り、洗浄後の水が透明になるまで滅菌水で洗浄した。次いで、種子を７０％アルコールで３０秒間消毒し、次に５％次亜塩素酸ナトリウム３０ｍｌを加え、混合物を水平振盪機に置き、５０ｒｐｍで２０分間振盪し、その後滅菌水で５回洗浄した。種子を滅菌吸収紙上に置き、風乾して種子表面の水分を除去し、誘導培地に接種し、２８℃で培養してカルスを得た。
誘導培地の配合：４．１ｇ／Ｌ Ｎ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ 加水分解カゼイン＋２．８７８ｇ／Ｌ プロリン＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋０．１ｇ／Ｌ イノシトール＋０．５ｇグルタミン＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８。
アグロバクテリウムによるイネカルスの感染：１０日間継代培養した直径３ｍｍのＨｕａｉｄａｏ５またはＪｉｎｊｉｎｇ８１８のカルスを選択し、５０ｍｌの遠沈管に回収した。ＯＤ６００が０．２～０．３に調整されたアグロバクテリウムＡＡＭの再懸濁液をカルスの入った遠沈管に注ぎ、２８℃のシェーカーに２００ｒｐｍの速度で入れて２０分間感染させた。感染が完了したら菌液を捨て、カルスを滅菌ろ紙上に置き、約２０分間風乾した後、共培養培地の入ったプレートに置き、共培養を行った。１００μＭのアセトシリンゴンを含むＡＡＭ液体培地に浸した滅菌濾紙で覆った。３日間の共培養後、アグロバクテリウムを洗浄（最初に滅菌水で５回洗浄、次に５００ｍｇ／Ｌセファロスポリン抗生物質で２０分間洗浄）により除去し、５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン選択培地で選択培養した。
共培養培地の配合：４．１ｇ／Ｌ Ｎ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ 加水分解カゼイン＋０．５ｇ／Ｌ プロリン＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋２００μＭ ＡＳ＋１０ｇ／Ｌ グルコース＋３％スクロース＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．５。
３．ハイグロマイシン耐性カルスの分子同定と実生への分化：
従来のイネ形質転換の選択プロセスとは異なり、染色体断片の倍加後に生成される融合断片の特異的プライマーを用いて、本発明ではカルスの選択および培養段階でハイグロマイシン耐性カルスを分子的に同定することができ、正の倍加イベントを決定することができ、異なる遺伝要素の融合により新規遺伝子を含むカルスを分化培養用に選択し、出芽を誘導した。具体的な手順は次のとおりである。
１）共培養したカルスを、第１ラウンドの選択（２週間）のために選択培地に移した。選択培地の配合は次のとおりである：４．１ｇ／Ｌ Ｎ６粉末＋０．３ｇ／Ｌ 加水分解カゼイン＋２．８７８ｇ／Ｌ プロリン＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋０．５ｇグルタミン＋３０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシン（ＨＹＧ）＋５００ｍｇ／Ｌ セファロスポリン（ｃｅｆ）＋０．１ｇ／Ｌ イノシトール＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８。
２）第１ラウンドの選択が完了した後、新たに成長したカルスを第２ラウンドの選択（２週間）のために新しい選択培地に移した。この段階で、新しく成長した直径３ｍｍ以上のカルスをピンセットで挟んで少量のサンプルを採取し、実施例１に記載のＣＴＡＢ法を用いてＤＮＡを抽出し、分子同定の１回目を行った。この実施例では、ＯｓＨＰＰＤ複製プライマー８－Ｆ（８Ｆ）とＯｓＨＰＰＤのプライマーペアｐＱＹ２０９１ベクターで形質転換されたカルスのＰＣＲ同定を行うために、重複プライマー６－Ｒ（６Ｒ）を選択した。反応系および反応条件は実施例１と同様であった。試験した合計３５０個のカルスのうち、陽性サンプルはなかった。Ｈｕａｉｄａｏ５のカルスでは２８個の陽性サンプルが検出され、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８のカルスでは２８個の陽性サンプルが検出された。一部のカルスのＰＣＲ検出結果を図７に示す。
３）ＰＣＲによって陽性と同定されたカルスを、第３ラウンドの選択および拡大培養のために新しい選択培地に移した。カルスの直径が５ｍｍを超えた後、拡大培養中のカルスに対して８Ｆ＋６Ｒプライマーペアを使用した２回目の分子同定を行い、良好な生育状態にある黄白色のカルスを陽性と同定した。２回目は分化培地に移して分化を行い、３～４週間後に約１ｃｍの苗を得ることができた。分化した苗を発根栽培用の発根培地に移した。発根栽培の苗は固まった後、土の入った植木鉢に移し、温室に入れて栽培した。分化培地の配合は次のとおりである：４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋０．５ｇ／Ｌ 加水分解カゼイン＋０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋３％スクロース＋３％ソルビトール＋３０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシン＋０．１ｇ／Ｌ リノシトール＋０．４５％フィタゲル、ｐＨ５．８。発根培地の配合は、２．３ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋３％スクロース＋０．４５％フィタゲルである。
４．ＨＰＰＤ倍増苗（Ｔ０世代）の分子検出：
２回目の分子同定後、２９個の倍加イベント陽性カルスを共分化させてＴ０世代の実生４０３本を得た。８Ｆ＋６Ｒプライマーペアを４０３個の実生の３回目の分子同定に用いた。そのうち５６本は、ポジティブなバンドがああった。陽性の苗木を栽培のために温室に移した。一部のＴ０苗のＰＣＲ検出結果を図８に示す。
５．ＨＰＰＤ倍増苗（Ｔ０世代）のＨＰＰＤ阻害性除草剤耐性試験：
倍加イベント陽性と同定されたＴ０世代の形質転換実生苗を温室内の大きなプラスチックバケツに移植して増殖を拡大し、Ｔ１世代の種子を得た。苗が分げつを開始した後、活発に成長している株から分げつを採取し、同じ成長期間に野生型対照品種の分げつと同じポットに植えた。草丈が２０ｃｍ程度になったところで除草剤耐性試験を行った。用いた除草剤は当社が製造したビピラゾン（ＣＡＳ番号１６２２９０８－１８－２）であり、その圃場投与量は通常１μあたり有効成分４グラム（４ｇａｉ／μ）であった。この実験では、ウォークインスプレータワーを用いて、ビピラゾンを２ｇ ａ．ｉ．／ｍｕ、４ｇ ａ．ｉ．／ｍｕ、８ｇ ａ．ｉ．／ｍｕ、および３２ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの用量勾配で適用した。
耐性試験の結果を図９に示す。散布から５～７日後、野生型対照イネ苗はアルビノを示し始めたが、ＨＰＰＤ倍加イベントの株はすべて正常な緑色のままであった。散布から４週間後、野生型イネの苗木は枯れそうになったが、倍加イベントの株はすべて引き続き緑色を保ち、正常に生育した。試験結果は、ＨＰＰＤ遺伝子を倍加した株がビピラゾンに対する耐性を大幅に改善したことを示した。
６．ＨＰＰＤ倍増実生（Ｔ０世代）におけるＨＰＰＤ遺伝子の相対的発現の定量的検出：
ＨＰＰＤ遺伝子倍増株のビピラゾンに対する耐性の向上は、ＵＢＩ２の強力なプロモーターとＨＰＰＤの発現を増加させるＨＰＰＤ遺伝子ＣＤＳの融合によるものと推測され、Ｔ０世代株ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０は除草剤耐性試験に使用する一次分げつと二次分げつからサンプルを採取し、それぞれ野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８を対照としてＨＰＰＤ遺伝子とＵＢＩ２遺伝子の発現レベルを検出した。具体的な手順は次のとおりである。
１）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出（Ｔｒｉｚｏｌ法）：
０．１～０．３ｇの新鮮な葉を採取し、液体窒素中で粉末に粉砕した。溶解のために組織５０～１００ｍｇごとに１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬を添加した。上記組織のトリゾール溶解物を１．５ｍｌ遠心管に移し、室温（１５～３０℃）で５分間静置した。クロロホルムをトリゾール１ｍｌ当たり０．２ｍｌの量で添加した。遠心分離管に蓋をし、手で１５秒間激しく振り、室温（１５～３０℃）で２～３分間放置し、その後１２０００ｇ（４℃）で１５分間遠心分離した。上部の水相を除去し、新しい遠心管に移し、トリゾール１ｍｌあたりイソプロパノール０．５ｍｌを加え、混合物を室温（１５～３０℃）で１０分間保持し、次いで４０℃で１２０００ｇ（２～８℃）で１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットにＴｒｉｚｏｌ１ｍｌあたり１ｍｌの７５％エタノールを加えて洗浄した。混合物をボルテックスし、７５００ｇ（２～８℃）で５分間遠心分離した。上清を廃棄し；沈殿したＲＮＡを室温で３０分間自然乾燥させ；ＲＮＡ沈殿物を５０μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶解し、電気泳動分析および濃度測定後、－８０℃で冷蔵庫に保管した。
２）ＲＮＡ電気泳動分析：
濃度１％のアガロースゲルを調製し、ＲＮＡ１μｌを採取し、２×ローディングバッファー１μｌと混合した。混合物をゲル上にロードした。電圧は１８０Ｖに設定し、電気泳動時間は１２分とした。電気泳動終了後、アガロースゲルを取り出し、ＵＶゲルイメージングシステムで断片の位置と輝度を観察した。
３）ＲＮＡ純度の検出：
ＲＮＡ濃度はマイクロプロテイン核酸分析装置で測定した。純度の高いＲＮＡのＯＤ２６０／ＯＤ２８０値は１．８～２．１であった。１．８より低い値は深刻なタンパク質汚染を示し、２．１より高い値は深刻なＲＮＡ分解を示す。
４）リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ
抽出したトータルＲＮＡを専用の逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写した。主な手順は、まず抽出された全ＲＮＡの濃度を測定し、１～４μｇのＲＮＡの一部を逆転写酵素合成によるｃＤＮＡの合成に使用することで構成されます。得られたｃＤＮＡを－２０℃で保存した。
（i）以下の表に示すように、ＲＮＡテンプレートの溶液を氷上で調製し、ＰＣＲ装置で変性およびアニーリング反応を行った。このプロセスは、ＲＮＡテンプレートの変性とプライマーとテンプレートの特異的なアニーリングを促進し、それによって逆転写の効率が向上した。
Figure 2024516693000146
（ii）ｃＤＮＡを合成するために、表２に示す逆転写反応系を準備した。
Figure 2024516693000147
（iii）イネのＵＢＱ５遺伝子を内部参照遺伝子として選択し、合成したｃＤＮＡをテンプレートとして蛍光定量ＰＣＲを行った。表３に記載のプライマーを用いて、表４に従って反応溶液を調製した。
Figure 2024516693000148
Figure 2024516693000149
（iv）反応を、表５のリアルタイム定量ＰＣＲ反応ステップに従って行った。反応は４０サイクル行われた。
Figure 2024516693000150
５）データ処理と実験結果
表６に示すように、ＵＢＱ５を内部標準として使用し、標的遺伝子のＣｔ値からＵＢＱ５のＣｔ値を差し引いてΔＣｔを算出し、２－ΔＣｔを算出し、これを標的遺伝子の相対発現量とした。８１８ＣＫ１と８１８ＣＫ３は２つの野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８対照植物であった。１３Ｍおよび２０Ｍは、ＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表す。１３Ｌおよび２０Ｌは、除草剤耐性試験に使用されるＱＹ２０９１－１３およびＱＹ２０９１－２０Ｔ０植物の二次分げつ葉サンプルを表す。
Figure 2024516693000151
結果を図１０に示す。イネＵＢＱ５を内部参照遺伝子として使用して、ＯｓＨＰＰＤ遺伝子とＵＢＩ２遺伝子の相対発現レベルを計算した。結果は、ＨＰＰＤ倍増株のＨＰＰＤ発現レベルが野生型のＨＰＰＤ発現レベルよりも有意に高いことを示し、これは、融合されたＵＢＩ２強力なプロモーターがＨＰＰＤの発現レベルを増加させ、それによって遺伝子がノックアップされた高発現のＨＰＰＤ遺伝子を作成したことを示す。ＵＢＩ２の発現レベルのわずかな低下は、プロモーター領域の編集に起因する小規模な変異によるものである可能性があり、実際にＵＢＩ２標的部位で塩基の挿入、欠失、または小さな断片の欠失が検出された。野生型と比較して、ＵＢＩ２およびＨＰＰＤの発現レベルは一貫している傾向が顕著であり、理論上の期待を満たしていた。そのうち、２０ＭサンプルのＨＰＰＤ発現レベルは野生型ＣＫ３グループのＨＰＰＤ発現レベルよりも約６倍高かった。
アグロバクテリウム形質転換および組織培養中の複数回の分子同定、および新しいタンパク質のＵＢＩ２強力なプロモーターによって選択できることを証明した。形質転換実生で生成されたＨＰＰＤ遺伝子融合により、ＨＰＰＤ遺伝子の発現レベルが増大し、植物は畑用量の最大８倍のＨＰＰＤ阻害除草剤ビピラゾンに対する耐性を獲得し、したがって内因性ＨＰＰＤ遺伝子がノックアップされた除草剤耐性イネが生成された。これを例にとると、実施例１および実施例２の染色体断片倍加技術的解決策を使用して、所望のプロモーターを内因性遺伝子に導入し、その遺伝子発現パターンを変化させて新規遺伝子を作成し、新しい品種の植物を作成することもできる。所望の遺伝子発現パターンを有する細胞は、アグロバクテリウムを介した形質転換によって作製することができる。
実施例３：染色体断片倍加により内因性ＨＰＰＤ遺伝子をノックアップ発現させた除草剤耐性イネＴ１世代の分子検出と除草剤耐性試験
図１のスキーム１に示すように、野生型イネゲノムにおけるＨＰＰＤ遺伝子とＵＢＩ２遺伝子間の物理的距離は３３８ｋｂであった。両者間の染色体断片が２倍になると、染色体長は３３８ｋｂ増大した。複製により、高度に発現する新しいＨＰＰＤ遺伝子が、ＨＰＰＤ ＣＤＳ領域の発現を駆動するために複製された断片の結合部にあるＵＢＩ２プロモーターによって生成された。新規遺伝子が安定して受け継がれるかどうか、また倍加染色体断片が遺伝的安定性に及ぼす影響を調べるために、ＨＰＰＤ倍増株のＴ１世代について分子検出と除草剤耐性試験を実施した。
まず第一に、すべての陽性Ｔ０株が正常な種子を生産することができたため、倍加イベントはＴ０世代植物の繁殖力に重大な影響を及ぼさないことが観察された。さらに、ＱＹ２０９１－１３株とＱＹ２０９１－２０株について、Ｔ１世代苗の定植試験を行った。
１．サンプルの準備：
ＱＹ２０９１－１３では、合計３６本のＴ１苗木が植えられ、そのうち２７本が正常に成長し、９本がアルビノでした。ＤＮＡ抽出と検出のために３２個が選択された。番号１～２４は正常な苗であり、番号２５～３２はアルビノの苗であった。
ＱＹ２０９１－２０では、合計４４本のＴ１苗木が植えられ、そのうち３３本が正常に成長し、１１本がアルビノでした。ＤＮＡ抽出と検出のために４０個が選択された。番号１～３２は正常な苗であり、番号３３～４０はアルビノの苗であった。
Ｔ１世代の植物ではアルビノの実生が観察された。ＨＰＰＤは植物のクロロフィル合成経路における重要な酵素であり、二重標的編集から得られるＴ０世代植物は、編集された標的部位における倍加、欠失、染色体断片の逆位、または小さな断片突然変異等、多くの遺伝子型のキメラである可能性がある。アルビノ表現型は、ＨＰＰＤ遺伝子が破壊された植物、たとえばＨＰＰＤＣＤＳ領域が欠失した植物で生成される可能性がある。考えられる遺伝子型を決定するために、ＰＣＲ用に異なるプライマーペアが設計された。
２．ＰＣＲ分子の同定：
１）検出プライマーの配列：５’－３’配列
プライマー８Ｆ：ＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣ
プライマー６Ｒ：ＧＡＧＴＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＴ
テスト１４１－Ｆ：ＣＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧ
プライマー４Ｒ：ＧＧＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣ
プライマー３Ｆ：ＣＣＴＣＣＡＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＴＣ
プライマー７Ｒ：ＧＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧ
ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１：ＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡ
ｐｇ－３５Ｓ－Ｆ：ＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣ
２）上記プライマーの結合部位を図１１に示す。このうち、Ｐｒｉｍｅｒ８Ｆ＋Ｐｒｉｍｅｒ６Ｒは、染色体断片倍加後のＵＢＩ２プロモーターとＨＰＰＤ ＣＤＳの融合断片と、その長さを検出するために用い、生成物の長さはは６３０ｂｐであり；試験１４１－Ｆ＋プライマー４Ｒは染色体断片欠失イベントの検出に用いられ、産物の長さは２２２ｂｐであり；編集ベクターのＴ－ＤＮＡ断片の検出には、ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆを用い、産物の長さは６６０ｂｐであった。
３）ＰＣＲ反応系、反応手順、ゲル電気泳動検出は実施例１に準じて行った。
３．分子検出結果：
倍加および欠失イベントの検出結果を表７に示す。染色体断片倍加イベントおよび欠失イベントが、系統ごとに異なる比率でＴ１世代植物で観察されたことが分かる。ＱＹ２０９１－１３（２９／３２）の倍加事象はＱＹ２０９１－２０（２１／４０）よりも高かったが、これはおそらくＴ０世代植物のキメラ比が異なるためである。検査結果は、倍加によって生成された融合遺伝子が遺伝性であることを示す。
Figure 2024516693000152
ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆプライマーを用いて、上記のＴ１実生の編集ベクターのＴ－ＤＮＡ断片を検出した。ＱＹ２０９１－２０－１７およびＱＹ２０９１－１３－７のＰＣＲ産物の電気泳動の結果は、Ｔ－ＤＮＡ断片に対して陰性であり、ホモ接合性の倍加であることが示された。倍加ホモ接合性の非トランスジェニック株は、倍加イベントのＴ１世代から分離できることがわかった。
４．シーケンスによる編集イベントの検出：
倍加融合断片は、ＱＹ２０９１－２０の倍加ホモ接合陽性Ｔ１世代サンプル１、５、７、１１、１８および１９と、ＱＹ２０９１－１３の倍加ホモ接合陽性Ｔ１サンプル１、３、７、９、１０および１２とについて配列決定された。ＨＰＰＤ遺伝子の左側の標的部位とＵＢＩ２の右側の標的部位は、標的部位での編集イベントを検出するための配列決定のために同時に増幅された。その中で、プライマー３Ｆ＋プライマー７Ｒを用いて、左側のＨＰＰＤターゲット部位の編集イベントを検出した。野生型対照産物の長さは４８１ｂｐでした。プライマー８Ｆ＋プライマー４Ｒを用いて、野生型対照産物の長さが３２９ｂｐである正しいＵＢＩ２標的部位の編集イベントを検出した。
１）倍加イベントの遺伝子型：
ＱＹ２０９１－１３におけるＨＰＰＤ倍加の配列決定結果を配列番号１８に示し、ＱＹ２０９１－２０におけるＨＰＰＤ倍加の配列決定結果を配列番号１９に示す。図１２を参照されたい。倍加のリンカー配列は、ＱＹ２０９１－１３ではリンカーに１つのＴ塩基が挿入され、ＱＹ２０９１－２０ではリンカーから１９塩基が削除され、挿入と削除の両方がＵＢＩ２のプロモーター領域で発生し、ＨＰＰＤタンパク質のコード領域に影響はなかった。実施例２におけるＨＰＰＤ遺伝子の発現量の検出結果から、ＵＢＩ２プロモーターをＨＰＰＤのＣＤＳ領域に融合させたこれらの新規ＨＰＰＤ遺伝子の発現量が顕著に増加していることが分かる。
２）両側の元のＨＰＰＤおよびＵＢＩ２ターゲットサイトでイベントを編集した。
双方の対象サイトで編集イベントの種類が増えた。これらの２つの系統では、ＨＰＰＤプロモーター領域で３つの編集タイプ、つまり１塩基の挿入、１７塩基の欠失、および１６塩基の欠失が発生した。また、ＵＢＩ２プロモーター領域では２つの編集タイプ、つまり７塩基の挿入と３塩基の欠失が発生した。試験とサンプリングに使用されたＴ１植物はすべて緑色の実生で、正常に成長した。このことは、これらのプロモーター領域の小規模な突然変異が遺伝子機能に重大な影響を及ぼさず、後代から除草剤耐性イネ品種を選抜できることを示す。
５．Ｔ１世代の実生苗の除草剤耐性試験：
ＱＹ２０９１ＨＰＰＤ倍増株のＴ１世代の除草剤耐性を実生段階で試験した。Ｔ１世代の種子を表面消毒した後、１．２μＭビピラゾンを含む１／２ＭＳ培地で発芽させ、２８℃、明所１６時間／暗所８時間で栽培し、野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８を対照として使用した。
耐性の試験結果を図１３に示す。明所で１０日間栽培した後、野生型対照イネ苗は白化の表現型を示し、ほぼすべてアルビノであったが、ＨＰＰＤ倍加イベントＱＹ２０９１－７、１３、２０、２２は、萎黄病と緑色苗の表現型分離を示した。前述の分子検出結果によれば、Ｔ１世代では遺伝子型の分離が見られた。除草剤処理を行わない場合でもアルビノ苗木が出現したが、緑色苗木は１．２μＭビピラゾンの添加後も緑色を維持し、正常に成長した。試験結果は、ＨＰＰＤ遺伝子二重化系統のビピラゾンに対する高い耐性がＴ１世代に安定して継承される可能性があることを示した。
実施例４：染色体断片の逆転を誘導して内因性ＰＰＯ遺伝子の発現をノックアップする編集法～イネプロトプラスト試験
イネＰＰＯ１（ＰＰＯＸ１としても知られる）遺伝子（配列番号７に示されるように、１～１０６５ｂｐがプロモーターであり、残りがコード領域である）は染色体１上に位置し、カルビンサイクルタンパク質ＣＰ１２遺伝子（配列番号８に示すように、１～２０８８ｂｐがプロモーターであり、残りがコード領域である）は、ＰＰＯ１遺伝子の９１１ｋｂ下流に反対方向に位置していた。国際イネゲノム解読プロジェクト（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）が提供するイネの遺伝子発現プロファイルデータによると、イネの葉におけるＣＰ１２遺伝子の発現強度はイネの葉の５０倍であり、ＰＰＯ１遺伝子、ＣＰ１２遺伝子のプロモーターは葉で高発現する強力なプロモーターであった。
図４のスキーム１に示すように、それぞれのプロモーターと２つの遺伝子のＣＤＳ領域の間に二本鎖切断を同時に誘導し、スクリーニングすることにより、２つの切断間の領域を逆転させ、ＰＰＯ１遺伝子のプロモーターをＰＰＯ１遺伝子のプロモーターに置き換えることができた。ＣＰ１２遺伝子のプロモーターによりＰＰＯ１遺伝子の発現量が増大し、ＰＰＯ阻害性除草剤に対する耐性が得られ、除草剤耐性系統の選抜が可能となった。さらに、図４のスキーム２に示すように、ＣＰ１２遺伝子のプロモーターによって駆動されるＰＰＯ１の新規遺伝子も、最初の反転とその後の倍加によって作成することができた。
１．まず、イネのＰＰＯ１およびＣＰ１２のゲノムＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）に入力し、利用可能な編集ターゲットサイトを検索した。オンラインスコアリングの後、テストのために、ＰＰＯ１およびＣＰ１２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間で次の標的部位が選択された。
Figure 2024516693000153
ガイドＲＮＡ１とガイドＲＮＡ２は、プロモーターとＰＰＯ１遺伝子のＣＤＳ領域の間に位置し、ＰＰＯ１開始コドンに近く、ガイドＲＮＡ３とガイドＲＮＡ４は、プロモーターとＣＰ１２遺伝子のＣＤＳ領域の間に位置し、ＣＰ１２開始コドンに近い。
実施例１に記載されているように、バックボーンとしてｐＨＵＥ４１１を有する二重標的ベクターを構築するために、上記の標的部位に対してプライマーを設計した。
Figure 2024516693000154
具体的には、ｐＣＢＣ－ＭＴ１Ｔ２プラスミド（https://www.addgene.org/50593/）をテンプレートとして使用して、それぞれｓｇＲＮＡ１＋３、ｓｇＲＮＡ１＋４、ｓｇＲＮＡ２＋３、ｓｇＲＮＡ２＋４デュアルターゲット断片とコンストラクトｓｇＲＮＡ発現カセットを増幅した。ｐＨＵＥ４１１ベクターバックボーンをＢｓａＩで消化してゲルから回収し、消化後の標的断片をライゲーション反応に直接使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してベクター骨格と標的断片をライゲーションし、ライゲーション産物をＴｒａｎｓ５αコンピテントセルに形質転換し、さまざまなモノクローンを選択して配列決定した。Ｓｐａｒｋｊａｄｅ高純度プラスミドミニ抽出キットを使用して、正しい配列決定結果でプラスミドを抽出し、以下に示すように、それぞれｐＱＹ００２０９５、ｐＱＹ００２０９６、ｐＱＹ００２０９７、ｐＱＹ００２０９８と名付けられた組換えプラスミドを得た。
ｐＱＹ００２０９５ＯｓＰＰＯ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ３の組み合わせを含むｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ１＋３
ｐＱＹ００２０９６ＯｓＰＰＯ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ３の組み合わせを含むｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ２＋３
ｐＱＹ００２０９７ＯｓＰＰＯ－ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ４の組み合わせを含むｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ１＋４
ｐＱＹ００２０９８ＯｓＰＰＯ－ガイドＲＮＡ２、ガイドＲＮＡ４組み合わせを含むｐＨＵＥ４１１－ＰＰＯ－ｓｇＲＮＡ２＋４
２．上記ｐＱＹ００２０９５～００２０９８ベクターについて、実施例１の工程２と同様にして、高純度、高濃度のプラスミドを調製した。
３．実施例１のステップ３に記載されているように、イネのプロトプラストを調製し、上記のベクターを用いたＰＥＧ媒介形質転換に供した。
４．実施例１のステップ４に記載のＰＣＲ検出用の下表に示す検出プライマーを用いたゲノムターゲティングおよび新規遺伝子の検出。
Figure 2024516693000155
このうち、ＰＰＯ－Ｒ２とＣＰ－Ｒ２の組み合わせは、染色体断片反転後に右側に生成されたＣＰ１２プロモーター駆動のＰＰＯ１ＣＤＳ新しい遺伝子断片を増幅するために使用され、ＰＰＯ－Ｆ２とＣＰ－Ｆ２の組み合わせは、反転後に左側に生成された、ＰＰＯ１プロモーター駆動のＣＰ１２ＣＤＳの新しい遺伝子断片を増幅するために使用された。デュアルターゲット編集から生じる可能性のある遺伝子型と分子検出プライマーの結合部位を図１４に示す。
５．ＰＣＲおよび配列決定の結果は、ＣＰ１２プロモーターがＰＰＯ１の発現を駆動する予想された新規遺伝子がイネのプロトプラストの形質転換から作成されたことを示した。イネＣＰ１２遺伝子プロモーターがＰＰＯ１遺伝子発現領域に融合する編集事象は、形質転換イネプロトプラストのゲノムＤＮＡにおいて検出できた。これは、染色体断片の逆転によって新しいＰＰＯ遺伝子を形成するスキームが実現可能であり、強力なプロモーターによって駆動される新しいＰＰＯ遺伝子を作成できることを示しており、これはＰＰＯ１逆転現象として定義された。ｐＱＹ００２０９５ベクターで形質転換されたプロトプラストにおける染色体断片逆位の配列決定結果を配列番号１５に示す。ｐＱＹ００２０９５ベクターで形質転換されたプロトプラストにおける染色体断片欠失の配列決定結果を配列番号１６に示す。そして、ｐＱＹ００２０９８ベクターで形質転換されたプロトプラストにおける染色体断片逆位の配列決定結果を配列番号１７に示す。
実施例５」アグロバクテリウムを介した形質転換による染色体断片反転による内因性ＰＰＯ遺伝子のノックアップ発現による除草剤耐性イネの作出
１．ノックアップ編集ベクターの構築：プロトプラストテストの結果に基づいて、編集効率の高いＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ１：５’ＣＣＡＴＧＴＣＣＧＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧ３’とＯｓＰＰＯガイドＲＮＡ４：５’ＣＧＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧＴ－ＧＴＧＡＴＧＴ３’のデュアルターゲットの組み合わせを構築を選択して、アグロバクテリウム形質転換ベクターｐＱＹ２２３４を構築した。ｐＨＵＥ４１１をベクターバックボーンとして使用し、イネコドン最適化を実施した。ベクトルマップを図１６に示す。
２．アグロバクテリウム形質転換イネカルスと２回の分子同定：
ｐＱＹ２２３４プラスミドを使用して、実施例２のステップ２に記載の方法に従ってイネカルスを形質転換した。レシピエント品種は、ＨｕａｉｄａｏＮｏ．５およびＪｉｎｊｉｎｇ８１８であった。カルスの選択段階では、ハイグロマイシン耐性について２ラウンドの分子同定を行った。カルスと反転事象で陽性のカルスが区別された。カルスの分子検出では、ＰＰＯ－Ｒ２とＣＰ－Ｒ２の組み合わせによる染色体断片の反転後に右側に生成されたＣＰ１２プロモーター駆動のＰＰＯ１ ＣＤＳ新規遺伝子断片の増幅が反転イベントの陽性標準とみなされました。一方、反転後に左側に生成されたＣＰ１２の新規遺伝子は、カルスの分化および実生出現後に考慮されました。Ｈｕａｉｄａｏ５の合計７３４個のカルスを検査し、そのうち２４個のカルスが反転事象について陽性であり、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８からの２５９個のカルスを検査したところ、２９個のカルスが反転事象について陽性であった。図１７は、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８カルスＮｏ．１９２－２５９のＰＣＲ検出結果を示す。
３．合計５３個の反転イベント陽性カルスが２ラウンドの分子同定を受けて共分化され、９個の倍加イベント陽性カルスが同定され、これらは２ラウンドの分子同定を受けて共分化された。１，８７５株のＴ０苗木を生産し、そのうち７６８株はＨｕａｉｄａｏ５バックグラウンド由来であり、１１０７株はＪｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンド由来であった。これらの１８７５実生はさらに、ＰＰＯ－Ｒ２およびＣＰ－Ｒ２プライマーペアを使用した３回目の分子同定にかけられ、その中でＨｕａｉｄａｏ５バックグラウンドからの１８４株が反転陽性のバンドを示し、Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンドからの３５０株が反転陽性の陽性バンドを示す。陽性の苗木を栽培のために温室に移した。
４．ＰＰＯ１反転苗（Ｔ０世代）のＰＰＯ阻害性除草剤耐性試験：
反転事象陽性と同定されたＱＹ２２３４Ｔ０世代の形質転換実生苗を温室内の大きなプラスチックバケツに移植して、Ｔ１世代の種子を生育させた。多数の陽性実生があったため、いくつかのＴ０実生と生育期間と状態が類似した野生型対照系統を選択した。草丈が約２０ｃｍに達した時点で、直接除草剤耐性試験を行った。使用した除草剤は、同社製の高効率ＰＰＯ阻害型除草剤（「化合物Ａ」）である。この実験では、ウォークイン型スプレータワーにより除草剤を０．１８、０．４、０．６ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの３段階の濃度勾配で散布した。
耐性試験の結果を図１８に示す。野生型対照イネ苗は散布後３～５日で葉先から枯れ始め、葉に壊死斑点が現れ、徐々に株が枯れていったが、ほとんどの苗は枯れた。ＰＰＯ１逆転現象の系統は正常な生育を維持し、葉には明らかな薬害はなかった。さらに、いくつかの系統は植物毒性を示したが、これはおそらく編集事象の多遺伝子型モザイク現象とＴ０世代系統におけるＰＰＯ１の発現レベルが低いためと考えられる。散布から２週間後、野生型イネ苗は枯れたが、ほとんどの逆転現象株は緑色を保ち、正常に生育した。試験結果から、ＰＰＯ１反転系統が化合物Ａに対する植物の耐性を大幅に改善できることが示された。
５．ＰＰＯ１反転実生（Ｔ０世代）におけるＰＰＯ１遺伝子の相対発現レベルの定量的検出：
化合物Ａに対するＰＰＯ１遺伝子反転系の耐性の増加は、ＰＰＯ１の発現レベルを増加させる強力なＣＰ１２プロモーターとＰＰＯ１遺伝子のＣＤＳとの融合によるものであると推測された。したがって，Ｈｕａｉｄａｏ５バックグラウンドからのＴ０世代ＱＹ２２３４－２５２，ＱＹ２２３４－３０４およびＱＹ２２３４－３２９の系統を選択し，それらの一次分げつおよび二次分げつをサンプリングし，ＰＰＯ１およびＣＰ１２遺伝子の発現レベルの検出に供した。野生型Ｈｕａｉｄａｏ５を対照として使用した。具体的なプロトコルは、内部参照遺伝子としてイネのＵＢＱ５遺伝子を用いて、実施例２のステップ６に従った。蛍光定量プライマーは次のとおりである：５’－３’。
Figure 2024516693000156
ＵＢＱ５は内部リファレンスとして使用された。ΔＣｔは、標的遺伝子のＣｔ値からＵＢＱ５のＣｔ値を差し引くことによって計算した。次に、標的遺伝子の相対発現レベルを表す２－ΔＣｔを計算した。Ｈ５ＣＫ１およびＨ５ＣＫ２はＨｕａｉｄａｏ５の２つの野生型対照植物であり、２５２Ｍ、３０４Ｍおよび３２９ＭはＱＹ２２３４－２５２、ＱＹ２２３４－３０４およびＱＹ２２３４－３２９Ｔ０植物の一次分げつ葉サンプルを表し、２５２Ｌ、３０４Ｌ、３２９Ｌは二次分げつ葉サンプルを表す。結果を以下の表８に示す。
Figure 2024516693000157
異なる株におけるＰＰＯ１およびＣＰ１２の相対発現レベルを図１９に示す。結果が示すように、実施例２の倍加イベントとは異なり、これらの逆転イベント株の遺伝子発現レベルは大きく異なっていた。ＣＰ１２の発現レベルは、おそらく実生の成長速度が異なるため、２つのＨｕａｉｄａｏ５ＣＫグループ間で大きく異なりる。Ｈ５ＣＫ２対照群と比較して、実験群のＣＰ１２の発現レベルはすべて減少傾向を示したが、２５２Ｌおよび３２９ＭのＰＰＯ１の発現レベルは有意に増加し、３０４Ｌおよび３２９ＬのＰＰＯ１の発現レベルはわずかに増加した。２５２Ｍおよび３０４ＭのＰＰＯ１の発現レベルは減少した。主に遺伝子発現量を増加させる染色体断片の倍加とは異なり、染色体断片の反転は両側に新規遺伝子を生成するため、両側の標的でさまざまな編集事象が起こり、転写方向の変化も影響を及ぼす可能性がある。同時に遺伝子発現レベルも測定した。つまり、Ｔ０世代の植物は複雑なキメラであった。同じ植物の一次分げつと二次分げつの間には、遺伝子発現レベルに大きな違いがある可能性もある。定量的ＰＣＲの結果から、ＰＰＯ１反転イベントはＰＰＯ１遺伝子発現レベルを増加させる可能性が高いことがわかり、反転イベントのための除草剤耐性選択によってＰＰＯ１の発現レベルが高い除草剤耐性株を選択できることがわかったイベント。
上記の結果は、プロトプラストにおける効果的な染色体断片反転を検出するスキームに従って、アグロバクテリウム形質転換および組織培養中の複数回の分子同定を通じて、反転事象を伴うカルスおよび形質転換実生を選択できること、およびＣＰ１２強力なプロモーターと融合したＣＰ１２を証明した。形質転換実生苗で生成された新しいＰＰＯ１遺伝子は、実際にＰＰＯ１遺伝子の発現レベルを増加させることができ、これにより植物にＰＰＯ阻害性除草剤化合物Ａに対する耐性を与えることができ、それによって内因性ＰＰＯ遺伝子がノックアップされた除草剤耐性イネが作出されたことを示す。これを例にとると、実施例４および実施例５の染色体断片逆転プロトコールは、必要なプロモーターを導入および融合することによって遺伝子発現パターンを変化させる必要がある他の内因性遺伝子にも適用され、それによって新規遺伝子を作成することができ、所望の遺伝子発現パターンを有する品種は、アグロバクテリウムを介した植物の形質転換によって作出される可能性がある。
実施例６：染色体断片反転による内因性ＰＰＯ１遺伝子のノックアップ発現を有する除草剤耐性イネ系統のＴ１世代植物の分子検出及び除草剤耐性試験
野生型イネゲノムＰＰＯ１遺伝子とＣＰ１２遺伝子間の物理的距離は９１１ｋｂであった。図１４に示すように、ＣＰ１２プロモーター駆動ＰＰＯ１ＣＤＳ領域を有する高発現ＰＰＯ１遺伝子が、２つの遺伝子間の染色体断片の逆位後に右側に生成された。染色体断片の欠失も発生する可能性があります。新規遺伝子が安定に継承できるかどうか、また染色体断片反転が遺伝的安定性に及ぼす影響を試験するために、ＰＰＯ１反転株のＴ１世代について分子検出と除草剤耐性試験を実施した。
まず第一に、すべての陽性Ｔ０株が正常に種子を生産できたため、逆転現象はＴ０世代植物の稔性に重大な影響を及ぼさないことが観察された。Ｈｕａｉｄａｏ５バックグラウンドを有するＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１株のＴ１世代を検出のために選択しました。
１．サンプルの準備：
ＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１では、合計４８本のＴ１苗を植えた。すべての植物は正常に成長した。
２．ＰＣＲ分子の同定：
１）検出プライマー配列：５’－３’
ＰＰＯ－Ｒ２：ＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧ
ＣＰ－Ｒ２：ＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＧＡＴＡＡＧＡＡＡＣＧＡ
ＰＰＯ－Ｆ２：ＣＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡ
ＣＰ－Ｆ２：ＡＧＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＧ
ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１：ＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡ
ｐｇ－３５Ｓ－Ｆ：ＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣ
２）上記プライマーの結合部位を図１４に示す。ここで、ＰＰＯ－Ｒ２＋ＣＰ－Ｒ２を使用して、染色体断片の逆位後の右ＣＰ１２プロモーターとＰＰＯ１コード領域との融合断片を検出した。産物の長さは５０７ｂｐであった。ＰＰＯ－Ｆ２＋ＣＰ－Ｆ２は、染色体断片の逆位後の左側のＰＰＯ１プロモーターとＣＰ１２コード領域の融合断片を検出するために使用され、産物の長さは５６０ｂｐであった。ＰＰＯ－Ｆ２＋ＰＰＯ－Ｒ２は、反転前に左側のＰＰＯ標的部位を検出するために使用され、野生型コントロールの産物の長さは５８６ｂｐであった。ＣＰ－Ｆ２＋ＣＰ－Ｒ２は、反転前に正しいＣＰ１２標的部位を検出するために使用され、野生型コントロールの産物の長さは４８１ｂｐであった。ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆは編集ベクターのＴ－ＤＮＡ断片の検出に使用され、産物の長さは６６０ｂｐであった。
３）ＰＣＲ反応系と反応条件：
Figure 2024516693000158
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で１８０Ｖの電圧で１０分間電気泳動に供した。
３．分子検出結果：
検出結果を表９に示す。合計４８植物が検出され、そのうち１２植物（２／７／１１／１６／２６／３６／３７／４０／４１／４４／４６／４７）が逆位ホモ接合であり、２１植物（１／３／４／５／６／８／９／１５／１７／２０／２２／２３／２４／２７／３０／３１／３３／３４／３９／４２／４３）が逆位ヘテロ接合であり、１５の植物（１０／１２／１３／１４／１８／１９／２１／２５／２８／２９／３２／３５／３８／４５／４８）が非反転でホモ接合であった。ホモ接合性反転：ヘテロ接合性反転：ホモ接合性非反転の比は、１：１．７５：１．２５、約１：２：１であった。したがって、検出結果はメンデルの遺伝の法則を満たし、逆転によって生成された新しいＰＰＯ１遺伝子が遺伝性であることを示した。
Figure 2024516693000159
上記のＴ１実生では、Ｐｇ－Ｈｙｇ－Ｒ１＋ｐｇ－３５Ｓ－Ｆプライマーを使用して編集ベクターのＴ－ＤＮＡ断片を検出した。１６および４１の電気泳動の結果はＴ－ＤＮＡ断片に対して陰性であり、ホモ接合性の反転を示す。ホモ接合性反転の非トランスジェニック株は、反転事象のＴ１世代から分離できることがわかった。
４．編集イベントのシーケンス検出：
反転イベントの遺伝子型検出は、右側の新しいＰＰＯ遺伝子の編集イベントに焦点を当てた。ＰＰＯ１遺伝子の完全なタンパク質コードフレームによる変異イベントは保持された。温室および野外での表現型観察を通じて植物の正常な成長に影響を与えなかった左側のＣＰ１２サイト編集イベントは保持された。反転イベント陽性系統で検出された編集イベントの遺伝子型を以下に示す。シームレスは、反転後の予測融合断片配列と同一であることを示す。Ｈｕａｉｄａｏ５号バックグラウンドで成功したＱＹ２２３４逆転イベントの遺伝子型は次のとおりであった。
Figure 2024516693000160
シーケンシングピークマップと配列比較結果の一部を図２０に示す。
Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８バックグラウンドで成功したＱＹ２２３４逆位の遺伝子型は次のとおりである。
Figure 2024516693000161
シーケンシングピークマップと配列比較結果の一部を図２１に示す。
ＰＰＯ１コード領域に融合されたＣＰ１２プロモーターを有する上記の異なる新しいＰＰＯ１遺伝子のシーケンシング結果を、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６に示す。
５．Ｔ１世代苗の除草剤耐性試験：
除草剤耐性試験を、実生段階のＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１ＰＰＯ１反転系統のＴ１世代に対して行った。野生型Ｈｕａｉｄａｏ５を対照として使用し、逆転系統のＴ１世代種子と同時に播種した。苗が草丈１５ｃｍに達したとき、化合物Ａを０．３、０．６、０．９および１．２ｇａｉ／ｍｕの４つのレベルで噴霧することによって施用した。培養条件は２８℃、明所１６時間、暗所８時間であった。
耐性試験の結果を図２２に示す。施用５日後、野生型対照イネ苗は０．３ｇａｉ／ｍｕの用量で明らかな薬害を示した。葉の先端から枯れ始め、葉には壊死斑点が現れた。０．６ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの用量では、植物はすぐに枯れた。しかしながら、ＱＹ２２３４／Ｈ５－８５１Ｔ１実生は０．３ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの用量で正常な生育を維持でき、葉には明らかな薬害は観察されなかった。０．６および０．９ｇａｉ／ｍｕの用量では、一部のＴ１実生は葉の先端が乾燥していたが、ほとんどのＴ１実生は緑色を維持して成長を続けることができたが、対照は実質的に枯れた。１．２ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの用量では、対照植物はすべて枯れたが、Ｔ１苗の一部は緑色を保ち、成長を続けることができた。試験結果は、化合物Ａに対するＰＰＯ１遺伝子反転系統の耐性がそれらのＴ１世代に安定して受け継がれる可能性があることを示す。
実施例７：植物の内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現をノックアップする編集方法
ＥＰＳＰＳは、植物の芳香族アミノ酸合成経路における重要な酵素であり、殺生物性除草剤グリホサートの標的部位である。ＥＰＳＰＳ遺伝子の高い発現レベルは、植物にグリホサートに対する耐性を与える可能性がある。ＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号４に示す、１－１８９７ｂｐがプロモーター、残りが発現領域）はイネの６番染色体上に位置していた。上流の遺伝子は逆方向のトランスケトラーゼ（配列番号３に示すＴＫＴ、１～２０９１ｂｐがプロモーター、残りが発現領域）であった。葉におけるＴＫＴ遺伝子の発現強度はＥＰＳＰＳ遺伝子の２０～５０倍であった。図２に示すように、２つの遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間にそれぞれ二本鎖切断を同時に誘導することにより、２つの切断間の領域の反転（スキーム１）または反転倍加（スキーム２）を得ることができる。どちらの場合も、ＥＰＳＰＳ遺伝子のプロモーターがＴＫＴ遺伝子のプロモーターに置き換えられ、それによってＥＰＳＰＳ遺伝子の発現レベルが増加し、グリホサートに対する耐性が得られた。さらに、図２に示すスキーム３、４および５は、ＴＫＴ遺伝子プロモーターによって駆動される新しいＥＰＳＰＳ遺伝子を作成することもできた。ＴＫＴに隣接し、ＴＫＴに対して方向が逆であるＥＰＳＰＳの遺伝子構造は、単子葉植物において保存されていた（表１０）。双子葉植物では、両方の遺伝子は同じ方向に隣接していた。したがって、この方法は植物に普遍的であった。
Figure 2024516693000162
この目的を達成するために、ｐＨＵＥ４１１をバックボーンとして使用し、以下をターゲットとして使用した。
Figure 2024516693000163
いくつかの異なる二重標的ベクターが構築された。
ｐＱＹ００２０６１ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ１＋３
ｐＱＹ００２０６２ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ２＋３
ｐＱＹ００２０６３ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ１＋４
ｐＱＹ００２０６４ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ２＋４
ｐＱＹ００２０９３ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ２＋５
ｐＱＹ００２０９４ｐＨＵＥ４１１－ＥＰＳＰＳ－ｓｇＲＮＡ２＋６
（２）以下の表に示す該当する検出プライマーを用いて、両側に標的部位を含む断片、またはＴＫＴプロモーターとＥＰＳＰＳコード領域の融合によって生成される予測された断片を増幅し、その産物の長さは３００～１０００ｂｐであった。
Figure 2024516693000164
プロトプラスト形質転換後の検出結果は、予想通りの反転イベントが得られたことを示す。図１５に示すように、ｐＱＹ００２０６２ベクター形質転換プロトプラストの反転検出の配列決定結果を配列番号１１に示した。ｐＱＹ００２０６２ベクター形質転換プロトプラストの欠失検出の配列決定結果を配列番号１２に示した。ｐＱＹ００２０９３ベクター形質転換プロトプラストのインバージョン検出の配列決定結果を配列番号１３に示した。また、ｐＱＹ００２０９３ベクター形質転換プロトプラストの欠失検出の配列決定結果を配列番号１４に示した。
これらのベクターをアグロバクテリウムに導入してイネのカルスを形質転換した。新しいＥＰＳＰＳ遺伝子を含む植物が得られました。除草剤バイオアッセイの結果、植物がグリホサート除草剤に対して明らかな耐性を持っていることが示された。
実施例８：シロイヌナズナの内因性ＰＰＯ遺伝子の発現をノックアップする編集方法
それぞれ、ＰＰＯおよびユビキチン１０遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間の部位にある。２つの切断間の領域の倍加事象は、ユビキチン１０プロモーターとＰＰＯコード領域とを融合することによって生成された新しい遺伝子をスクリーニングすることによって得ることができた。さらに、図１に示すスキーム２に従って、ユビキチン１０プロモーターとＰＰＯコード領域が融合した新規遺伝子も作製することができた。
この目的を達成するために、ｐＨＥＥ４０１Ｅがバックボーン（https://www.addgene.org/71287/）として使用され、下記の部位が標的部位として使用された。
Figure 2024516693000165
デュアルターゲットベクターは、「Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ. Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation. Genome Biol. 2015 Jul 21; 16:144」に記載された方法に従って構築された。
Figure 2024516693000166
シロイヌナズナは次の方法に従って形質転換された。
（１）アグロバクテリウムの形質転換
アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞を組換えプラスミドで形質転換し、組換えアグロバクテリウムを得た。
（２）アグロバクテリウム感染液の調製
１）活性化アグロバクテリウムを３０ｍｌのＹＥＰ液体培地（２５ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆ、５０ｍｇ／Ｌ Ｋａｎを含む）に植菌し、２８℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６００値が約１．０～１．５になるまで一晩培養した。
２）６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収し、上清を捨てた。
３）後で使用するために、細菌を感染溶液中に再懸濁し（ｐＨを調整する必要はない）、ＯＤ６００＝０．８に達した。
（３）シロイヌナズナの形質転換
１）植物の形質転換の前に、植物は豊かな花序を有し、ストレス反応を起こさずによく成長する必要がある。最初の形質転換は、草丈が２０ｃｍに達する限り行うことができる。土が乾いたら適宜水やりを行った。形質転換の前日に、成長した長角果をハサミで切った。
２）形質転換される植物の花序を、穏やかに撹拌しながら上記溶液に３０秒～１分間浸漬した。浸透した植物の上には液体の膜の層があるはずであった。
３）形質転換後、植物を暗所で２４時間培養し、その後、生育のために通常の光環境に移した。
４）１週間後、同様に２回目の形質転換を行った。
（４）種子の収穫
種子は成熟したときに収穫された。収穫した種子を３７℃のオーブンで約１週間乾燥させた。
（５）形質転換植物の選抜
種子を消毒剤で５分間処理し、ｄｄＨ２Ｏで５回洗浄し、次いでＭＳ選択培地（３０μｇ／ｍｌ Ｈｙｇ、１００μｇ／ｍｌ Ｃｅｆを含む）上に均一に広げた。次いで、この培地を光インキュベーター（温度２２℃、明１６時間、暗８時間、光強度１００～１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、湿度７５％）に入れて培養した。陽性の苗木を選択し、１週間後に土壌に移植した。
（６）Ｔ１変異植物の検出
（６．１）ゲノムＤＮＡの抽出
１）約２００ｍｇのシロイヌナズナの葉を切り取り、２ｍｌの遠沈管に入れた。鋼球を加え、ハイスループット組織破砕機で葉を粉砕した。
２）十分に粉砕した後、４００μＬのＳＤＳ抽出バッファーを加え、上下を逆にして混合した。混合物を６５℃の水浴中で１５分間インキュベートし、その間５分ごとに上下を逆にして混合した。
３）混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４）上清３００μＬを除去し、新しい１．５ｍｌ遠心管に移し、－２０℃に予冷した等量のイソプロパノールを遠心管に加え、遠心管を－２０℃で１時間または一晩保持した。
５）１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。
６）５００μＬの７０％エタノールを遠沈管に加えて沈殿を洗浄し、遠心分離後洗浄液を廃棄した（沈殿を廃棄しないように注意）。沈殿を室温で乾燥させた後、３０μＬのｄｄＨ２Ｏを加えてＤＮＡを溶解し、－２０℃で保存した。
（６．２）ＰＣＲ増幅
Ｔ１植物の抽出ゲノムをテンプレートとして、検出プライマーを用いて標的断片を増幅した。増幅産物を５μＬ採取し、１％アガロースゲル電気泳動で検出し、ゲルイメージャーで画像化した。残りの産物は配列決定会社によって直接シーケンシングされました。
シーケンシングの結果は、ＡｔＰＰＯ１遺伝子の倍加がシロイヌナズナで成功裏に達成されたことを示し、除草剤耐性試験では、倍増した植物がＰＰＯ除草剤に対して耐性を持っていることを示した。
実施例９：ゼブラフィッシュにおける新たな発現特性を有するＧＨ１遺伝子の創製
魚の成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子は、魚の成長と発達の速度を制御した。現在、トランスジェニック技術によってタイセイヨウサケのＧＨ遺伝子を高度に発現させると、成長率が大幅に向上する可能性がある。この技術は経済的に非常に価値があったが、販売が承認されたのは数十年後のことであった。ＧＨ１遺伝子はゼブラフィッシュの成長ホルモン遺伝子であった。本発明では、ゼブラフィッシュの適切なプロモーター（連続発現、強度、および組織特異性の点で適切）を、欠失、逆位、倍加、逆位倍加、染色体転移等によって生体内でＧＨ１遺伝子のＣＤＳ領域と融合させ、成長の早い魚の品種を作製した。
実験手順は下記の通りである。
１．ゼブラフィッシュの飼育：
１）ゾウリムシの調製：ゾウリムシの母液をオンラインで購入した（https://item.taobao.com/item.htm?spm=a230r.1.14.49.79f774c6C6elpL&id=573612042855&ns=1&abbucket=18#detail）。２Ｌビーカーを洗浄、滅菌し、２００ｍＬのゾウリムシ母液で満たした。これに、２つの酵母片と２つの滅菌コムギ粒を加えた。体積が２Ｌに達するまで滅菌水を加えた。次いで、開口部を滅菌クラフト紙で覆い、密封した。静置培養は２５～２８℃で３～５日間行った。使用可能な濃度に達したとき、混合物を使用してゼブラフィッシュの幼魚に餌を与えた。ゾウリムシ溶液を採取するたびに、高密度フィルタースクリーンを使用して不純物を除去した。
２）ブラインシュリンプの孵化：ブラインシュリンプはフェアリーシュリンプやアルテミアとしても知られ、海洋プランクトンである。ブラインシュリンプの卵を購入し、４℃で保存した。インキュベーションのために、混合物を、１Ｌの脱イオン水：３２ｇのＮａＣｌ：３．５ｇのブラインシュリンプの卵の比率で調製した。酸素化は２８．５℃で２５～３０時間行った。孵化させたブラインシュリンプを回収した。孵化したブラインシュリンプは、少量の３．２％ＮａＣｌ溶液中に保管され、４℃で２～３日間保管できた。
３）ゼブラフィッシュの標準化された大規模繁殖は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈａｉｓｈｅｎｇが製造した独自のゼブラフィッシュ養殖システムによって行った。浄水器で処理した水道水を投与バレルに入れ、適量のＮａＣｌおよびＮａＨＣＯ３を添加して比導電率５００μｓ／ｃｍおよびｐＨ７．０を維持した。水循環システムにより、すべての飼育タンクが一定の水位と流量状態を維持した。廃棄物処理システムは、魚の糞便と残りの魚の餌を自動的にろ過した。魚の養殖水は紫外線照射により殺菌し、加熱（２８．５℃）した後に再利用した。廃水が排出された後、真水が自動的に補充された。魚小屋の照明は自動タイマーで制御され、「１４時間明期＋１０時間暗期サイクル」を維持した。空調システムにより室内温度は２８℃に保たれた。過度の高湿度を避けるために、排気ファンが定期的に室内の湿気を除去した。ゼブラフィッシュの胚は、２８．５℃の生化学インキュベーター内で静置培養され、受精後５日目にゾウリムシを与えることができた。給餌は１日３～４回行った。生のブラインシュリンプは約１３日後から徐々に補充され始めた。すべての稚魚の体が赤くなったら、ゼブラフィッシュがブラインシュリンプを完全に食べられるようになったということである。その後、ゼブラフィッシュの稚魚を飼育水槽に移した。適量の新鮮なブラインシュリンプを１日３回与えた。
ゼブラフィッシュの繁殖前日の午後に、ゼブラフィッシュのＡＢ種を雌２匹：雄２匹の割合で孵卵箱に移した。それらはバッフルによって分離されていた。翌朝、バッフルが取り外された。ゼブラフィッシュは通常、約１０分以内に産卵を始めた。産卵後３０分以内に胚を回収し、Ｅ３培地（質量比２９．３％ＮａＣｌ、３．７％ＣａＣｌ２、４％ＭｇＳＯ４、１．３％ＫＣｌ、ｐＨ７．２）ですすいで死卵を除去した。
４）注入皿の調製：１．５％アガロースを調製した。３０～４０ｍｌのアガロース融解物を各プラスチック培養皿に注いだ。気泡が入らないように、アガロースの表面を型でそっと覆った。ゲルが完全に固まって「Ｖ字型」の溝ができた後、型を取り外した。準備した培養皿に少量のＥ３培地を添加した。密封して４℃で保存した。
２．ＲＮＰサンプルの調製：
ゼブラフィッシュＧＨ１遺伝子開始コドン上流１００ｂｐＤＮＡ配列についてはｓｇＲＮＡ－ＧＨ１ターゲット：５’ａａｇａａｃｇａｇｔｔｔｇｔｃｔａｔｃｔ３’が設計され、ゼブラフィッシュのＣｏｌ１ａ１ａ遺伝子終結コドンについてはｓｇＲＮＡ－ｃｏｌ１ａ１ａターゲット：５’ａｔｇｔａｇａｃｔｃｔｔｔｇａｇｇｃｇａ３’が設計され、ゼブラフィッシュｄｄｘ５遺伝子開始コドンの上流についてはｓｇＲＮＡ－ｄｄｘ５ターゲット：５’ｇｃａｃｃａｔｃａｃｔｇｃｇｃｇｔａｃａ３’が設計されたＧｅｎｓｃｒｉｐｔにＥａｓｙ ＥｄｉｔｓｇＲＮＡの合成を委託した。合成ｓｇＲＮＡと精製Ｃａｓ９を１：３の比率で混合した。１０×Ｃａｓ９緩衝液（２００ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１．５Ｍ ＫＣｌ）を添加し、ＲＮａｓｅフリー超純水で１倍に希釈し、Ｃａｓ９タンパク質濃度が６００ｎｇ／μＬとなるようにした。ｓｇＲＮＡ濃度は２００ｎｇ／μＬであり；２５℃で１０分間インキュベートした後、注射中の観察を容易にするために、少量のフェノールレッドを添加して注射サンプルを染色した。フェノールレッドの量は通常、総量の１０％未満であった。実験では、ｓｇＲＮＡ－ＧＨ１とｓｇＲＮＡ－ｃｏｌ１ａ１ａおよびｓｇＲＮＡ－ｄｄ×５とをそれぞれ等しい割合で組み合わせたＲＮＰ複合体を調製し、その混合物を魚卵に注入した。
３．マイクロインジェクション：
実体顕微鏡下で、注射を容易にするために医療用の尖った歯のない鉗子を使用して、注射針の先端を斜めにわずかに破断した。フェノールレッドを含むサンプル４μＬをマイクロローディングチップで採取した。ピペットチップは、針の端から注射針の先端に達する先端まで針に挿入された。先端を静かに押してサンプルを針に注入し、同時に先端を静かに引き抜いて、注射針の先端が赤色のＲＮＰサンプルで満たされるようにした。次いで、サンプルの入った注射針をホルダーに挿入して固定した。定量キャピラリーは長さ３３ｍｍ、総容量１μＬであった。１５回の注入後にキャピラリー内の液柱の長さが１ｍｍ増加するように注入圧力を調整した。したがって、各サンプル注入量は１ｎＬであった。インジェクションディッシュはあらかじめ冷蔵庫から取り出し、室温になるまで放置しておいた。採取した一細胞期受精卵をディッシュの溝に並べた。液面が受精卵の真上になるように少量のＥ３培地を加えた。実体顕微鏡下で、注射針の先端が受精卵の膜にゆっくりと突き刺さり、動物の極に近い卵黄に到達した。ペダルを踏むことでＲＮＰサンプルを注入した。ＲＮＰサンプルにはフェノールレッドが少量含まれているため、注入中に薄赤色のサンプル液体がはっきりと観察できた。注入された胚は、Ｅ３培地の入った使い捨てプレートに入れ、２８．５℃の恒温器内で培養した。イオン濃度と酸素含有量を確保するために、培地は２４時間ごとに交換する必要があった。
４．ＤＮＡ抽出：
各セットの注射後、生後約２～３か月で生存したゼブラフィッシュの尾びれを細胞溶解物緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ、ｐＨ８．２）で処理した。各チューブに２００μＬのライセートを充填し、５０℃で一晩保持した。この間に２～３回激しく振とうした。チューブを室温で１２００ｒ／分で５分間遠心分離し、その後２００μＬの上清を採取した。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、激しく振盪した。チューブを室温で１２０００ｒ／分で１０分間遠心分離した。採取した上清を等量のクロロホルムと混合し、チューブを激しく振盪した。チューブを室温で１２０００ｒ／分で１０分間遠心分離した。上清を１／２０容量の３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび２．５倍容量の予冷した無水エタノールと混合した。混合物はよく混合されているため、逆さにしない。氷上に３０分間放置した。チューブを１２０００ｒ／分、４℃で１０分間遠心分離し、上清を速やかに捨てた。すすぎのために１ｍＬの７０％アルコールを加えた。チューブを１２０００ｒ／分、４℃で１０分間遠心分離した。速やかに上澄みを捨て、真空乾燥を行った。最後に３０μＬの脱イオン水を加えてＤＮＡを溶解した。溶液は将来の使用に備えて－２０℃に保存された。０．８％アガロース電気泳動検出後、対応するプライマーを使用してＰＣＲテストを実行し、ポジティブストリップの配列検証を行った。ここで、ｇｈ１－Ｒ：ｔｇｃｔａｃａａａｔａａａｇｔｇｃａｃｔａｃａｃａおよびｃｏｌ１ａ１ａ－Ｆ：ｇｇｇｔｃｔｇｇａｔｔｇｇａｇｔｃａｃａを、増幅されたｃｏｌ１ａ１ａ遺伝子とｇｈ１との間で二重処理し；ｇｈ１－Ｒ：ｔｇｃｔａｃａａａｔａａａｇｔｇｃａｃｔａｃａｃａとｄｄｘ５－Ｆ：ａｃｇｃｇｔｔａｃｇｔａｃｇｔｃａｇａａ、およびＧＨ１－Ｆ：ａａａｔｇａｃｃｇｇａａｔｃａｃａａｃａとｄｄｘ５－Ｒ：ａｃｇａｃｃａｔｃｃｔｔａｃｃｃｔｃｔｇとを、増幅されたｄｄｘ５遺伝子とｇｈ１との間で逆処理した。
実験結果は以下のとおりである。図２３に示すように、ＲＮＰ注射群のゼブラフィッシュ胚サンプルでは染色体重複の特徴的な断片が検出された。図５１に示すように、配列決定の結果は、予想された重複事象がゼブラフィッシュ胚のＧＨ１遺伝子標的とＣＯＬ１Ａ１Ａ遺伝子標的の間の染色体断片で起こったことを示した。図５２に示すように、配列決定の結果は、ｄｄｘ５遺伝子のコード領域およびプロモーター、およびｇｈ１遺伝子のコード領域およびプロモーターが、染色体断片の反転により交換されたことを示した。図５３に示すように、発現が上方制御されたゼブラフィッシュの成長は明らかに加速された。
実施例１０：除草剤耐性イネ系統Ｔ１世代ＱＹ２２３４の圃場除草剤耐性試験
Ｔ１世代の逆転系統ＱＹ２２３４／８１８－５およびＱＹ２２３４／８１８－４２ＰＰＯ１を、除草剤感受性対照として野生型米Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８品種を用いて圃場除草剤耐性試験を行った。これらは、海南省三亜市のＲｅｄ Ｆｌａｇ Ｔｅａｍ、Ｎａｎｂｉｎ Ｆａｒｍの水田に反転系統Ｔ１世代の種子と同期して植えられた。試験は２０２０年１１月３０日から２０２１年４月１５日の間に実施された。苗はイネ種子を２日間浸漬した後に栽培され、移植は苗の３週間後に行われた。３セットの複製を配置した。化合物Ａと呼ばれる除草剤を移植後３週間で散布し、その濃度を０．３、０．６、０．９ｇ ａ．ｉ．／μ（１μ＝１／１５ｈａ）に設定した。適用後１０日目にイネ苗の状態を調査した（ＤＰＡ）。
圃場除草剤耐性試験の結果を図２４に示す。０．３ｇ ａ．ｉ．／ｍｕの用量で１０ＤＰＡでは、すべての野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８イネが枯死した。ＱＹ２２３４／８１８－５およびＱＹ２２３４／８１８－４２は正常に成長していた。０．６ｇ ａ．ｉ．／μの用量では、ＱＹ２２３４／８１８－４２は正常に生育したが、ＱＹ２２３４／８１８－５の個体植物のほとんどは枯れたが、ＱＹ２２３４／８１８－５の個体植物には耐性があった。０．９ｇ ａ．ｉ．／μの用量では、ＱＹ２２３４／８１８－４２およびＱＹ２２３４／８１８－５のほとんどの個々の植物は枯れたが、少数の耐性植物は緑色で成長を続けた。試験結果は、ＰＰＯ１遺伝子反転系統が海南省の高光強度の圃場条件下で除草剤耐性を示すことを示した。集団の中から安定した耐性系統を選抜することができ、除草剤耐性イネ育種の基礎材料となる。
実施例１１：ＱＹ２２３４系統イネのＴ１世代ＰＰＯ１タンパク質発現量のウエスタンブロット試験
４つのＰＰＯ１反転イネ系統、すなわちＱＹ２２３４／８１８－５、ＱＹ２２３４／８１８－４２、ＱＹ２２３４／８１８－１４４およびＱＹ２２３４／８１８－２５７のＴ１世代実生葉を選択して、ＰＰＯ１タンパク質発現レベルを決定した。野生型のＪｉｎｊｉｎｇ８１８米品種を対照として、それらを反転系統Ｔ１世代の種子と同期して温室に植えた。実生が１５ｃｍの高さに成長したとき、分子同定のために実施例６を参照して葉のサンプルを採取した。逆転陽性の実生は、タンパク質発現に関するウェスタンブロット試験のために選択された。
ウェスタンブロット試験は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989)に従って実施した。ＰＰＯ１タンパク質抗体は、Ｑｉｎｇｄａｏ Ｊｉｎｍｏｔａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（青島、中国）によって調製されたイネＰＰＯ１ポリクローナル抗体であった。植物内因性参照アクチンタンパク質抗体はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（上海、中国）から購入した（商品番号Ｄ１９５３０１）。二次抗体はＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｇｏｎ、商品番号Ｄ１１００５８）であった。試験は、ウェスタンブロットキット（Ｂｏｓｔｅｒ、製品番号ＡＲ００４０）を使用して操作説明書に従って実施された。
より具体的には、２ｇの単一植物のイネのサンプルを採取し、液体窒素で粉砕して粉末にした。適量のタンパク質抽出緩衝液（材料：タンパク質抽出緩衝液＝１：１．５）；氷上で３０分間インキュベートした。４℃、２７１００ｇで１５分間遠心分離し、上清を５×ローディングバッファー（キットに付属）と混合した。混合物を１５分間煮沸し、１１０Ｖで３０分間電気泳動にかけた。
タンパク質抽出バッファーは次のように配合されました。
Figure 2024516693000167
電気泳動終了後、ゲルを除去し、目的タンパク質のサイズに応じて適切なサイズのゲルブロックを採取し、ほぼ同体積の濾紙とＰＶＤＦフィルムを採取した。ゲルブロックを清水で洗浄し、転写溶液に浸した。濾紙とＰＶＤＦフィルムも転写溶液に浸して湿らせた。湿った濾紙、ＰＶＤＦフィルム、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルブロック、濾紙を下から上に重ねて、できるだけ多くの気泡を追い出した。試験管を使って平らにすることもできるが、平らにする際に層間のずれを防ぐ必要がある。フィルムを２５Ｖおよび１．３Ａで１０～３０分間転写した。転写後、ＰＶＤＦフィルムをＰＢＳＴバッファーで洗浄した。洗浄が完了したら、ブロッキング緩衝液に移し、室温で１時間ブロッキングした。封じ込め後、ＰＶＤＦフィルムをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄してブロッキング液を除去し、一次抗体を約１．５倍の希釈率でインキュベートした。１：１０００－１：３０００；一次抗体のインキュベーション時間は室温で２時間、または４℃で１２時間であった。一次抗体のインキュベーションが完了したら、ＰＶＤＦフィルムをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、各サイクルを１０分間続けました。二次抗体を約１．５倍の希釈率でインキュベートした。１：１００００～１：２００００、室温で１時間。二次抗体のインキュベーションが完了したら、ＰＶＤＦフィルムをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、各サイクルを１０分間続けた。ＥＣＬ発光：ＥＣＬ溶液ＡとＢを等量でよく混合し（必要に応じて調製）、液体混合物をＰＶＤＦフィルム上に均一に滴下した。フィルムは画像化のために蛍光画像装置に置かれた。
ウェスタンブロット試験の結果を図２５に示する。結果から、ＰＰＯ１反転陽性系統の内部対照アクチンタンパク質の発現レベルは野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８と同じであったが、ＰＰＯ１タンパク質の発現レベルはは大幅に上方制御されていた。選択された４つのＱＹ２２３４系統は、ＣＰ１２プロモーターとＰＰＯ１タンパク質コード領域の間の逆結合領域で異なる遺伝子型を有していた。ＱＹ２２３４／８１８－５は、予測された逆位融合断片配列と同一であった。予測された配列と比較して、ＱＹ２２３４／８１８－４２にはＣＰ１２プロモーター領域の１６塩基が欠如していた。ＱＹ２２３４／８１８－１４４およびＱＹ２２３４／８１８－２５７のＣＰ１２プロモーター領域に１塩基を挿入した。試験結果は、すべての新規遺伝子型が高レベルでＰＰＯ１タンパク質を発現できることを示し、本発明によって提供される新規遺伝子を作成する方法がゲノム内にさまざまな機能的遺伝子型を生成して遺伝子プールを富化できることを明らかにした。
実施例１２：ＨＰＰＤ複製イネ系統ＱＹ２０９１のＴ１世代の圃場除草剤耐性試験
発芽試験を通じて、アルビノ苗を分離していないＴ１世代のＨＰＰＤ遺伝子重複系統ＱＹ２０９１－１２およびＱＹ２０９１－２１を、対照として野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８米品種を用いた圃場除草剤耐性試験用に選択した。これらは、海南省三亜市のＲｅｄ Ｆｌａｇ Ｔｅａｍ、Ｎａｎｂｉｎ Ｆａｒｍの水田に、ＱＹ２０９１系統のＴ１世代種子と同期して植えられた。試験は２０２０年１１月１日から２０２１年４月１０日まで実施された。苗はイネ種子を２日間浸漬した後に栽培され、ＱＹ２０９１種子は１／３００００の除草剤化合物ビピラゾン水溶液に浸漬された。アルビノの苗木は出芽後に除去された。移植は実生３週間後に行われ、３セットの繰り返しが設定された。除草剤化合物ビピラゾンは、移植後３週間に４、８、１６、および３２ｇ ａ．ｉ．／μの濃度で施用された。散布後２１日目に苗の状態を調査した。
圃場除草剤耐性試験の結果を図２６に示す。除草剤配合量４ｇ ａ．ｉ．／ｍｕおよび８ｇ ａ．ｉ．／ｍｕでは、散布後２１日ですべての野生型Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８イネが白化により枯死した。ビピラゾン、ＱＹ２０９１－１２とＱＹ２０９１－２１は通常通り成長していた。１６ｇ ａ．ｉ．／ｍｕでは、ＱＹ２０９１－１２系統は正常に生育していたが、ＱＹ２０９１－２１系統は抵抗性分離を示し始めた。ほとんどの個々の植物が抵抗性を示し、少数の個々の植物は新葉の黄化を示した。３２ｇ ａ．ｉ．／ｍｕでは、ＱＹ２０９１－１２およびＱＹ２０９１－２１が抵抗性分離を示し始め、少数の個々の植物が白化により枯れたが、一部の個々の植物では新葉の顕著な黄変が観察された。個々の植物の約１／２は正常に成長しており、非常に高い抵抗性を示した。除草剤化合物ビピラゾンの野外散布に推奨される用量は、４ｇ ａ．ｉ．／ｍｕであった。試験の結果、染色体セグメントの重複によって作成された高発現のＨＰＰＤ新遺伝子を含む編集系統は、海南省の高光度の圃場条件下で除草剤耐性を示し、推奨圃場用量の８倍の除草剤用量に耐えることができることが示された。安定した耐性系統のスクリーニングは、除草剤耐性イネ育種の基礎材料を提供した。
実施例１３：イネプロトプラストにおけるＮＬＳ－ｆｒｅｅＣａｓ９と別々に発現したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの新規遺伝子創出活性
染色体断片の重複事象が引き起こされるかどうかをテストするために、ＰＰＯ１遺伝子の上流と下流から標的が選択されました。さらに、Ｃａｓ９を除去した核局在化シグナルが複製事象を引き起こすかどうか、およびｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）をｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの別々の発現に置き換えることで、細胞標的部位編集を誘導して染色体断片重複事象を引き起こすことができるかどうかについて試験を実施した。
二重標的編集ベクターｐＱＹ２６４８を、選択された標的配列設計プライマー、すなわち、ＯｓＰＰＯ１－ｅｓｇＲＮＡ３：５’ｔａｇｇｔｃｔｃｃａａａｃＡＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｇｃｃｇｃｇ３’およびＯｓＰＰＯ１－ｅｓｇＲＮＡ２：５’ＴａｇｇｔｃｔｃｃｇｇｃｇＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＡＧＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣ３’について、実施例１に記載の方法により構築した。ｐＱＹ２６４８を基にＳｐＣａｓ９の両端のＮＬＳシグナルペプチドを除去し、ＮＬＳフリーイネＰＰＯ１デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ２６５０を構築した。ｓｇＲＮＡ発現カセットは、ｐＱＹ２６５０およびｐＱＹ２６４８に基づいて変更された。融合したＳｃａｆｆｏｌｄ配列が除去され、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列が別々に発現された。より具体的には、ＯｓＵ３プロモーターはＯｓＰＰＯ１－ｓｇＲＮＡ２：５’ＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＡＧＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＴ３’ｃｒＲＮＡ配列の発現を駆動した。ＴａＵ３プロモーターは、ＯｓＰＰＯ１－ｓｇＲＮＡ３：５’ＡＣＧＣＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣ３’配列の発現を駆動した。ＯｓＵ３プロモーターは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列５’ＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴ３’の発現カセットの発現を駆動した。ＮＬＳを含まないｃｒＲＮＡイネＰＰＯ１デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ２６５１とＮＬＳを含むｃｒＲＮＡイネＰＰＯ１デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ２６５３を構築した。このプロセス中に使用したプライマーは次のとおりである。
２６５０Ｆ－ＢｓｔＢＩ：５’ｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｇａａＡＴＧｇａｃａａｇａａｇｔａｃｔｃｇａｔｃｇｇｃ３’
２６５０Ｒ－ＳａｃＩ：５’ｔｇａａｃｇａｔｃｇｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃＣＴＡｇｔｃｇｃｃｃｃｃｇａｇｃｔｇａｇ３’
ＯｓＵ３－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆｏｒ２６５１Ｆ：５’ＧＣＡＧＧＴＣＴＣａａｇｃｔｔａａｇｇａａｔｃｔｔｔａａａｃａｔａｃｇａａｃａｇ３’
ＣｒＲＮＡ１－ＢｓａＩ－Ｒ１：５’ＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＣＡＴＡＴＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＡＡＣＴＧ３’
ＴａＵ３－ＢｓａＩ－Ｆ２：５’ＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣｃａｔｇａａｔｃｃａａａｃｃａｃａｃｇｇａｇ３’
ＣｒＲＮＡ２－ＢｓａＩ－Ｒ２：５’ＧＣＡＧＧＴＣＴＣＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴ３’
ＴｒａＣｒＲＮＡ－ＯｓＵ３－ＢｓａＩＦ３：５’ＧＣＡＧＧＴＣＴＣＧＣＴＡＧａａｇｇａａｔｃｔｔｔａａａｃａｔａｃｇａａｃ３’
ＴｒａＣｒＲＮＡ－ＫｐｎＩ－Ｒ３：５’ＧｇｔａｃｃＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＣＧＣＣａｃｇｇａｔｃａｔｃｔｇｃａｃａａｃ３’，
上記の４つのベクターについて、実施例１を参考にして、イネプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換用の高純度かつ高濃度のプラスミドを調製した。編集重複イベントの検出のためにプロトプラストＤＮＡが抽出された。接合領域で設計された複製ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、両側の標的切断部位に基づいて設計され、その後、ＰＣＲ増幅断片の配列が決定された。プライマー配列は次のとおりである。
ＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＦ１：ＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣ
ＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＦ２：ＧＧＣＧＡＣＴＴＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧ
ＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＲ１：ＧＣＴＡＴＴＧＣＧＧＴＧＣＧＴＡＴＣＣ
ＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＲ２：ＴＣＣＡＡＧＣＴＡＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＡ
試験結果を図２７に示す。染色体断片重複事象は、プライマーＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＦ２またはＯｓＰＰＯ１Ｄｕｐ－ｔｅｓｔＲ２と、ｐＱＹ２６４８、ｐＱＹ２６５０、ｐＱＹ２６５１、およびｐＱＹ２６５３形質転換イネプロトプラストサンプルから抽出したＤＮＡを使用したＰＣＲ産物の配列決定を通じて検出された。予想される断片結合領域の２つのＤＮＡ切断部位の間で、ＤＮＡの小さな断片が欠落していた。ｐＱＹ２６５０のプロトプラストテストの結果は、染色体がデュアルターゲット編集ベクターで編集された場合、ＮＬＳを持たないＣａｓ９がターゲットを効果的に切断して、ターゲット切断間の染色体断片の倍加イベントを生成および検出できることを実証した。ｐＱＹ２６５３プロトプラストテストの結果は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現された場合に、組み立てられたｇＲＮＡがターゲット編集を効果的に誘導し、ターゲット切断部位間の染色体断片の倍加イベントを生成および検出できることを示した。ｐＱＹ２６５１プロトプラストのテスト結果は、ＮＬＳフリーＣａｓ９が、別々に発現したｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ、および自発的に組み立てられたｇＲＮＡと連携して、切断間の染色体断片の倍加イベントを生成および検出するようにターゲット編集を効果的に誘導できることを示した。本発明の方法を用いた染色体断片の倍加／複製、逆転、または転座は、Ｃａｓ９タンパク質または融合シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）システムの核局在化シグナルとは無関係であった。
実施例１４：イネで新しいＨＰＰＤ遺伝子を作成するための異なる染色体断片の転座と再構築
実施例１および実施例４で述べたように、イネのＨＰＰＤ遺伝子は第２染色体に位置し、ＣＰ１２遺伝子は第１染色体に反対方向に位置する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介の染色体切断と、ＣＰ１２およびＰＰＯ１遺伝子タンパク質コード領域を含む断片の自然発生的な反転、その後の染色体断片の融合を通じて、ＣＰ１２プロモーターがＰＰＯ１発現を駆動する新規遺伝子が生成され、予想通りＰＰＯ１発現が大幅に増強され、イネの除草剤耐性が付与された。ＣＰ１２プロモーターの高い発現特性を利用して、２つの開始コドンＡＴＧの上流の２つの領域を切断するデュアルターゲット編集ベクターが設計および構築された。アグロバクテリウムを介した形質転換、その後の選択と植物再生の後、ＣＰ１２プロモーターがＨＰＰＤタンパク質発現を駆動する新しいＨＰＰＤ遺伝子が、ＰＣＲとアンプリコン配列決定によって同定された。
国際イネゲノム解読プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）が提供するイネ遺伝子発現プロファイルデータ（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）の解析によると、ＣＰ１２遺伝子の発現強度は数十からＣＰ１２遺伝子プロモーターはイネの葉身におけるＨＰＰＤ遺伝子の１００倍であり、葉身および苗において強力である。
実施例１および実施例２を参照すると、利用可能な編集ターゲットを見つけて評価するために、イネのＨＰＰＤおよびＣＰ１２遺伝子の関連するゲノムＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）に入力した。オンラインスコアリングの後、ＨＰＰＤおよびＣＰ１２遺伝子のプロモーターとタンパク質コード領域の間で、以下のターゲット（５’～３’）がテスト用に選択された。
Figure 2024516693000168
ＨＰＰＤガイドＲＮＡ１およびＨＰＰＤガイドＲＮＡ２は、ＨＰＰＤ遺伝子プロモーターとタンパク質コード領域の間に位置し、ＨＰＰＤタンパク質開始コドンＡＴＧの近くにある。一方、ＣＰ１２ガイドＲＮＡ１およびＣＰ１２ガイドＲＮＡ２は、ＣＰ１２遺伝子プロモーターとタンパク質コード領域の間に位置し、ＣＰ１２タンパク質開始コドンＡＴＧの近くにある。
図２８に示すように、上記の標的について、以下のプライマーを設計および合成し、二重標的エディターｐＱＹ２２５７、ｐＱＹ２２５８、ｐＱＹ２２５９、ｐＱＹ２２６０を、形質転換および選択後にＨＰＰＤタンパク質コード領域を駆動するＣＰ１２プロモーターを同定できる編集イベントを期待して構築した。
Figure 2024516693000169
ここで、各編集ベクターのガイドＲＮＡの組み合わせは次のとおりである。
ｐＱＹ２２５７には、ＨＰＰＤガイドＲＮＡ１とＣＰ１２ガイドＲＮＡ１の組み合わせが含まれている、
ｐＱＹ２２５８には、ＨＰＰＤ－ガイドＲＮＡ１の組み合わせとＣＰ１２－ガイドＲＮＡ２の組み合わせが含まれている、
ｐＱＹ２２５９には、ＨＰＰＤガイドＲＮＡ２の組み合わせとＣＰ１２ガイドＲＮＡ１の組み合わせが含まれている、
ｐＱＹ２２６０には、ＨＰＰＤガイドＲＮＡ２の組み合わせとＣＰ１２ガイドＲＮＡ２の組み合わせが含まれている。
イネプロトプラスト形質転換法の実施例１を参照して、高純度および高濃度のプラスミドＤＮＡを有する上記のｐＱＹ２２５７～２２６０ベクターを調製し、次いで、高品質イネプロトプラストも同様に調製した。イネプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換ゲノム編集が行われ、最終的にはＣＰ１２プロモーターがＨＰＰＤ遺伝子発現を駆動するゲノム編集と設計された新規遺伝子が検出されることが期待されていた。
次の検出プライマー、ＯｓＣＰ１２ｐｒｏ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ＦおよびＯｓＨＰＰＤｕｔｒ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－Ｒを使用して、ＣＰ１２プロモーターとＨＰＰＤコード領域の融合によって生成される予測断片を増幅した。ＰＣＲアンプリコンの長さは３０５ｂｐであると予想された。同様に、ＯｓＨＰＰＤｐｒｏ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ＦおよびＯｓＣＰ１２ｃｄｓ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－Ｒを使用して、ＨＰＰＤプロモーターとＣＰ１２コード領域の融合によって生成される断片を検出し、ＰＣＲ産物の長さは４４５ｂｐであると予想された。
Figure 2024516693000170
同定の結果、図２９に示すように、ｐＱＹ２２５７で形質転換したプロトプラストサンプルでは、ＨＰＰＤコード領域と融合したＣＰ１２プロモーターを有することが検出された。一方、図３０に示すように、ｐＱＹ２２５９で形質転換したプロトプラストサンプルでは、ＣＰ１２コード領域と融合したＨＰＰＤプロモーターを有することが検出された。。
上記の結果は、本発明に記載の方法を使用すると、２つの異なる染色体に由来する２つの染色体断片間の組換えを生じさせることができ、設計通りの新規遺伝子を作り出すことが期待されることを示している。
この特定の例では、ＨＰＰＤ遺伝子発現はＣＰ１２遺伝子の強力なプロモーターによって駆動されて増加し、一方、ＣＰ１２遺伝子発現はＨＰＰＤ遺伝子の弱いプロモーターによって駆動されて減少する。したがって、本発明によって生成される新規遺伝子の発現レベルは、強いプロモーターまたは弱いプロモーターの選択によって必要に応じて調節することができる。
実施例１５：ＬｂＣｐｆ１デュアルターゲット編集イネプロトプラスト試験による染色体断片重複による新規高発現ＨＰＰＤ遺伝子の創製
ＬｂＣｐｆ１はＣａｓ１２ａタイプのヌクレアーゼに属し、ＴＴＴＶＰＡＭ部位を認識するため、ＡＴ含有量の高いＤＮＡ配列の編集に適している。一方、Ｃａｓ９はＮＧＧＰＡＭ部位を認識し、ＧＣ含有量の高いＤＮＡ配列の編集に適している。したがって、それらの編集能力のＤＮＡ範囲は互いに補完的である。図３１に示すように、イネのプロトプラスト系において、ＬｂＣｐｆ１が染色体断片を切断し、複製を誘導する能力、すなわち、新しいＨＰＰＤ遺伝子を作成する能力を試験した。
実施例１を参照すると、ｐＨＵＥ４１１ベクター（https://www.addgene.org/62203/）をバックボーンとして使用し、制限酵素消化によってｓｇＲＮＡ発現カセットを除去した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（中国、南京）で合成されたＳＶ４０ＮＬＳ－ＬｂＣｐｆ１－ヌクレオプラスミンＮＬＳ遺伝子断片は、ｐＨＵＥ４１１のＣａｓ９ＣＤＳを置換した。ＨＰＰＤ遺伝子の３３８ｋｂ下流には、同じ発現方向を持つ高発現Ｕｂｉ２遺伝子がある。したがって、重複戦略を使用してＨＰＰＤの発現を増加させ、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤に対する耐性を与えた。この目的のために、ｃｒＲＮＡをイネＨＰＰＤ遺伝子の開始コドンの上流：５’ａｃｃｃｃｃｃａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃｔｃｃｃ３’に設計し、２番目のｃｒＲＮＡをイネＵＢＩ２遺伝子の開始コドンの上流：５’ｃｔａｔｃｔｇｔｇｔｇａａｇａｔｔａｔｔｇｃｃ３’に設計した。以下に示すように、両端にＨＨリボザイムおよびＨＤＶリボザイム認識部位を有する鵜タンデムｃｒＲＮＡ配列を合成した：ＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣ３’。シームレスクローニングの操作説明書に従って、ＨＢ－ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｈａｎｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（上海、中国）のキットによりベクター内のＬｂＣｐｆ１タンパク質発現カセットの末端に連結した。トウモロコシＵＢＩ１プロモーターを使用して、同じ発現カセット内のＬｂｃｐｆ１タンパク質とｃｒＲＮＡの両方を駆動した。このベクターをｐＱＹ２６５８と名付けた。
実施例１を参照すると、イネプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換のために、高純度および高濃度のプラスミドが調製された。形質転換の４８～７２時間後、重複編集イベントを検出するためにプロトプラストＤＮＡを抽出した。ターゲットの両側のプライマーは重複領域をカバーするように設計されており、ターゲット断片は４９４ｂｐであると予想されます。プライマーシーケンスは次のとおりである。
Ｕｂｉ２ｐｒｏプライマー５：ｇｔａｇｃｔｔｇｔｇｃｇｔｔｔｔｃｇａｔｔｔｇ
ＨＰＰＤｃｄｓプライマー１０：ｔｃｇａｃｇｔｇｇｔｇｇａａｃｇｃｇａｇ
ｐＱＹ２６５８形質転換イネプロトプラストから抽出した複製アダプター断片のＤＮＡのＰＣＲ増幅では、予想されたサイズのバンドが生成され、アンプリコンの配列決定結果は、予想された染色体断片の複製アダプターシーケンスと一致した。配列決定の結果を配列番号２７に示す。
ｐＱＹ２６５８で形質転換されたプロトプラストに関する試験結果は、ＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼが標的を効果的に切断し、標的切断部位間に検出可能な染色体断片の重複を生成できることを証明した。これは、本発明を使用して、染色体断片の複製、逆位、または転座を介して新規遺伝子を作成できることを示しており、これはＣａｓ１２ａのヌクレアーゼシステムでも実現できる。
実施例１６：染色体セグメントの欠失を介して葉緑体シグナルペプチドドメインに接続されたＯｓＣＡＴＣ遺伝子
イネの３つの遺伝子、すなわちグリコール酸オキシダーゼＯｓＧＬＯ３、シュウ酸オキシダーゼＯｓＯＸＯ３、およびカタラーゼＯｓＣＡＴＣは、ＧＯＣ分岐と呼ばれる光呼吸分岐を形成する。光呼吸によって生成されるグリコール酸は、導入遺伝子によってイネにＧＯＣ分岐を導入し葉緑体に配置することによって、葉緑体中で直接触媒されてシュウ酸となり、最終的に完全にＣＯ２に分解され、それによってＣ４植物と同様の光合成によるＣＯ２濃度機構を作り出すことができた。、イネの光合成効率と収量の向上に役立ちました（Shen et al. Engineering a New Chloroplastic Photorespiratory Bypass to Increase Photosynthetic Efficiency and Productivity in Rice. Molecular Plant, 2019, 12(2): 199-214）。
本発明によって提示された方法を使用することにより、異なる遺伝子のタンパク質ドメインを非トランスジェニック法によって組み換えて、葉緑体局在化を必要とする遺伝子に葉緑体シグナルドメインを付加することができた。プライマーＯｓＣＡＴＣ－ｓｇＲＮＡ１：５’ｇｔｃｃｔｇｇａａｃａｃｃｇｃｃｇｃｇｇ３’は、ＯｓＣＡＴＣ遺伝子の上流２８ＫｂのＬＯＣ４３３１５１４遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインの末端に設計された。ＯｓＣＡＴＣ－ｓｇＲＮＡ２：５’ａｔｃａｇｃｃａｔｇｇａｔｃｃｃｔａｃａ３’は、ＯｓＣＡＴＣ遺伝子の最初の５アミノ酸コード領域に設計された。ＬＯＣ４３３１５１４遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインは、ＯｓＣＡＴＣ遺伝子のコード領域と融合して、標的間断片の除去後に葉緑体に位置する新しいＣＡＴＣ遺伝子を生成すると予想された。デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ２６５４を実施例１に記載の方法で構築し、使用したプライマーはＯｓＣＡＴＣ－ｓｇＲＮＡ１－Ｆｏｒ２６５４Ｆ：ｔａｇｇｔｃｔｃｃｇｇｃｇｇｔｃｃｔｇｇａａｃａｃｃｇｃｃｇｃｇｇＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣ、およびＯｓＣＡＴＣ－ｓｇＲＮＡ２－Ｆｏｒ２６５４Ｒ：ｔａｇｇｔｃｔｃｃａａａｃｔｇｔａｇｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｇｃｃｇｃｇであった。イネプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換のために、高純度かつ高濃度のプラスミドが調製された。欠失編集イベントの検出のためにプロトプラストＤＮＡが抽出された。検出プライマーは、両側のターゲットの中央の２８Ｋｂ染色体セグメント欠失後にリンカーセグメントを延長するように設計された。配列決定が行われ、プライマー配列は以下に示された。
ＯｓＣＡＴＣ－ＴｅｓｔＦ：ｃｃａｃａａａａａｃｇａｇｔｇｇｃｔｃａｇ
ＯｓＣＡＴＣ－ＴｅｓｔＲ：ｇｔｇａｇｃｇａｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｃｃ
ＯｓＣＡＴＣ－ｓｅｑＦ：ｃｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｃａｃｔｇ
試験結果を図３２に示す。ｐＱＹ２６５４形質転換イネプロトプラストからのＤＮＡの抽出は、標的欠失後の予想される結合領域のＰＣＲ増幅およびその後の配列決定を通じて、染色体断片欠失事象を検出することができた。ＬＯＣ４３３１５１４遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインをＯｓＣＡＴＣ遺伝子のコード領域と融合させて新規遺伝子を作成した。配列決定結果は配列番号２８に示す。ｐＱＹ２６５４のプロトプラスト試験の結果は、本発明の方法を使用することによって、異なるタンパク質ドメイン間の染色体セグメントの欠失を通じて、新しいタンパク質ドメインから結合された新規遺伝子が作製され得ることを示している。
実施例１７：染色体セグメントの逆位を介して葉緑体シグナルペプチドドメインに接続されたＯｓＧＬＯ３遺伝子
実施例１６で述べたように、イネの光合成効率を改善するには、ＯｓＧ１０３遺伝子を葉緑体中で異所的に発現させる必要もあった。そこで、ＯｓＧＬＯ３遺伝子については、上流６９ＫｂのＬＯＣ４３３７０５６遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインの末端にＯｓＧＬＯ３－ｇＲＮＡ１：５’ｇｔｃｃｔｇｇａａｃａｃｃｇｃｃｇｃｇｇ３’を設計し、開始コドン領域にＯｓＧＬＯ３－ｓｇＲＮＡ２：５’ｔｇａｔｇａｃｔｔｇａｇｃａｇａｇａａａ３’を設計した。ＯｓＣＡＴＣ遺伝子の；ＬＯＣ４３３７０５６遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインは、ＯｓＧＬＯ３遺伝子のコード領域と融合して、標的間断片の反転後に葉緑体に位置する新しいＧＬＯ遺伝子を生成すると予想された。二重標的編集ベクターｐＱＹ２６５５を、プライマーＯｓＧＬＯ３－ｓｇＲＮＡ１－Ｆｏｒ２６５５Ｆ：ｔａｇｇｔｃｔｃｃｇｇｃｇｃｇａｔｇｃｔｔｇｇｔｇｇｃａａｇｔｇｃＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣおよびＯｓＧＬＯ３－ｓｇＲＮＡ２－Ｆｏｒ２６５５Ｒ：ｔａｇｇｔｃｔｃｃａａａｃｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｃａａｇｔｃａｔｃａｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｇｃｃｇｃｇを使用して、実施例１に記載のように構築した。イネプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換のために、高純度かつ高濃度のプラスミドが調製された。反転編集イベントの検出のためにプロトプラストＤＮＡが抽出された。検出プライマーは、両側のターゲットの中央の６９Ｋｂ染色体セグメントの反転後にリンカーセグメントを延長するように設計された。配列決定が行われ、プライマー配列を以下に示す。
ＯｓＧＬＯ３－ＴｅｓｔＦ１：ｃｃｔｃｃｔｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｃｔｃｃｇ
ＯｓＧＬＯ３－ＴｅｓｔＦ２：ｃｇｇｔｃｇｇｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｔｃａｇｇ
ＯｓＧＬＯ３－ＴｅｓｔＲ１：ｃａｔｃｃａｇｃａｇｔｇｔｇｃｔａｃｃａｇ
ＯｓＧＬＯ３－ＴｅｓｔＲ２：ｃｔｔｇａｇａａｇｇｃｃｔｃｃｃｔｇｔｔｃ
試験結果を図３３に示した。ｐＱＹ２６５５形質転換イネプロトプラストからのＤＮＡの抽出は、標的反転後の予想される結合領域のＰＣＲ増幅およびその後の配列決定を通じて、染色体断片反転事象を検出することができた。ＬＯＣ４３３７０５６遺伝子の葉緑体シグナルペプチドドメインをＯｓＣＡＴＣ遺伝子のコード領域と融合させて新規遺伝子を作成した。配列決定結果を配列番号２９に示す。ｐＱＹ２６５５のプロトプラスト試験の結果は、本発明の方法を使用することによって、異なるタンパク質ドメイン間の染色体セグメントの反転を通じて、新しいタンパク質ドメインから結合された新規遺伝子を作製できることを示した。
実施例１８：内因性ＰＰＯ２遺伝子発現のノックアップによる除草剤耐性イネの創製
イネＰＰＯ２遺伝子はイネ４番染色体上に位置しており；バイオインフォマティクス分析により、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（以下、「ＳＡＭＤＣ」という）遺伝子がＰＰＯ２遺伝子の下流約４３６ｋｂであり；ＰＰＯ２遺伝子とＳＡＭＤＣ遺伝子は染色体上で同じ転写方向を有していることが示された。国際イネゲノム解読プロジェクトのイネ遺伝子発現プロファイルデータ（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）を用いた解析によると、イネ葉におけるＳＡＭＤＣ遺伝子の発現強度は数十から数百であることが判明した。ＰＰＯ２遺伝子の数倍。ＳＡＭＤＣ遺伝子のプロモーターは強力で構成的な発現プロモーターであった。
イネＰＰＯ２遺伝子については、イネＰＰＯ２およびＳＡＭＤＣのゲノムＤＮＡ配列をそれぞれＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）に入力し、実施例１および２に記載の手順に従って利用可能な編集ターゲットを探した。オンラインスコアリングに基づいて、ＰＰＯ２およびＳＡＭＤＣ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のテストのために次のターゲットが選択された。
Figure 2024516693000171
ＰＰＯ２－ガイドＲＮＡ１およびＰＰＯ２－ガイドＲＮＡ２は、ＰＰＯ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のＰＰＯ２の開始コドンＡＴＧ（すなわち５’ＵＴＲ）に近かった。ＳＡＭＤＣ－ガイドＲＮＡ１およびＳＡＭＤＣ－ガイドＲＮＡ２も、ＳＡＭＤＣ遺伝子プロモーターとＣＤＳ領域（すなわち５’ＵＴＲ）の間のＳＡＭＤＣタンパク質開始コドンに近かった。
以下のプライマーは、上記のターゲット用に設計された。デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ１３８６およびｐＱＹ１３８７が構築され、２つのターゲット切断間の染色体断片重複の編集イベントが達成されることが期待された。図３４に示すように、ＳＡＭＤＣプロモーターによって駆動されるＰＰＯ２ＣＤＳによって発現される新規遺伝子は、重複断片リンカーで生成された。
Figure 2024516693000172
ｐＱＹ１３８６には、ＰＰＯ２ガイドＲＮＡ１とＳＡＭＤＣガイドＲＮＡ１の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ１３８７には、ＰＰＯ２ガイドＲＮＡ２とＳＡＭＤＣガイドＲＮＡ２の組み合わせが含まれている
ベクタープラスミドを抽出し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５株を電気形質転換した。実施例２に記載の方法により、受容体としてイネ品種Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換を行った。形質転換および選択中に数回のカルス同定を実施し、重複事象の陽性カルスを分化のために選択した。
以下の表の検出プライマーを使用して、両側に標的部位を含む断片、または予測されるＳＡＭＤＣプロモーターとＰＰＯ２コード領域の融合から生成された断片を増幅した。ＰＣＲ産物の長さは３００～１０００ｂｐであると予想された。プライマー５－Ｆ＋プライマー４－Ｒの組み合わせを使用して、染色体断片複製後の中間リンカーでの融合セグメントを検出した。予測された産物の長さは９１２ｂｐであった。
Figure 2024516693000173
最終的な識別結果によると、ＱＹ１３８６／８１８－２８＃およびＱＹ１３８６／８１８－６２＃カルスで重複編集イベントが検出された。重複断片リンカーにおける配列決定結果を配列番号３０および配列番号３１に示した。配列アラインメントの結果を図３５に示した。＃６２カルスリンカーの結果は期待どおりあった。シームレスな接続が観察されたが、その後分化した苗では重複編集イベントは検出されなかった。
ＱＹ１８３７のカルスでは５つの重複編集イベントが検出された。重複断片リンカーでのシーケンシング結果を配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に示す。いくつかの配列アラインメント結果を図３６に示す。
ＱＹ１８３７分化実生では重複事象が検出された。一部のＴ０実生のＰＣＲ増幅産物と染色体重複リンカー、ＰＰＯ２ターゲット、およびＳＡＭＤＣターゲットの配列決定の結果を以下に示す。
Figure 2024516693000174
１３８７／８１８－２と配列決定ピーク図を比較した結果を図３７に示す。ＳＡＭＤＣプロモーターによって駆動されるＰＰＯ２によって発現される新規ＰＰＯ２遺伝子がゲノム内で発達したことは明らかであった。ターゲットの両側で小さな断片が削除されたが、これはＣＤＳ領域のリーディングフレームの完全性に影響を与えなかった。
ＰＰＯ２遺伝子の相対発現の定量的ＰＣＲ検出を、Ｔ０世代分化実生１３８７／８１８－２、１３８７／８１８－４および１３８７／８１８－６に対して実行した。実験操作は実施例２と一致した。定量的ＰＣＲプライマー配列は次のように５’－３’であった。
Figure 2024516693000175
内部対照としてＵＢＱ５を使用した場合の結果を図３５に示す。野生型イネＪｉｎｊｉｎｇ８１８コントロールと比較して、二重編集実生のＰＰＯ２遺伝子発現は大幅に増加しますが、ＳＡＭＤＣ発現は相対的に減少した。
１３８７／８１８－２および１３８７／８１８－４のＴ０実生の除草剤耐性を、実施例６に記載したように予備的に測定した。同様の草丈を持つ野生型のＪｉｎｊｉｎｇ８１８苗木を対照とし、それらとＴ０苗木に化合物Ａを０．６ｇａｉ／ｍｕの化学濃度で同時に施用した。培養温度は、１６（明）＋８（暗）ベースで２８℃に維持した。図３６に示すように、散布から７日後に結果を記録するために写真を撮った。１３８７／８１８－２および１３８７／８１８－４のＴ０苗は上部が少し乾燥していたが、いくつかの薬剤スポットが葉の表面に現れていた。野生型のＪｉｎｊｉｎｇ８１８は枯死した。この結果は、ＳＡＭＤＣプロモーターによるＰＰＯ２タンパク質の高発現により、イネがＰＰＯ阻害剤除草剤に抵抗できることを示す。
実施例１９：アグロバクテリウム媒介形質転換後のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的染色体切断および逆位による内因性ＯｓＰＰＯ２遺伝子のノックアップ発現による除草剤耐性イネの作出
ＯｓＰＰＯ２遺伝子を操作するための実施例４を参照すると、ＯｓＰＰＯ２から逆方向の１７０ｋｂ下流にある高度に発現される遺伝子であるＯｓＺＦＦ（ＬＯＣ＿ＯＳ０４Ｇ４１５６０）を選択して、タンパク質開始コドンＡＴＧに近い領域を標的とする２つのｓｇＲＮＡと、デュアル－ターゲット編集ベクターｐＱＹ２６１１を構築した。同様に、逆転確率を高めるために、ＯｓＰＰＯ２からの下流４０ｋｂと、ＯｓＰＰＯ２の反対方向に高発現する遺伝子ＯｓＮＰＰ（ＬＯＣ＿ＯＳ０４Ｇ４１３４０）も選択して、タンパク質の開始コドンＡＴＧに近い領域を標的とする別の２つのｓｇＲＮＡと、別のデュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ２６１２を構築した。選択された３つのターゲットは次の表のように表示される。図４０に示すように、編集により二本鎖ＤＮＡ切断が生成され、その後ターゲット間の染色体断片が反転して、それぞれＰＰＯ２の高発現を伴う新規遺伝子が形成されることが予想された。
Figure 2024516693000176
ベクターの構築には次のプライマーを使用した。
Figure 2024516693000177
ｐＱＹ２６１１には、ＯｓＰＰＯ２ガイドＲＮＡ２と５６０ガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６１２には、ＯｓＰＰＯ２ガイドＲＮＡ２と３４０ガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６１１には、ＯｓＰＯ２ガイドＲＮＡ２と５６０ガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６１２には、ＯｓＰＯ２ガイドＲＮＡ２と３４０ガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ベクタープラスミドを抽出し、アグロバクテリウム・ツメファシエン株ＥＨＡ１０５に形質転換した。イネ品種Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８をアグロバクテリウム媒介形質転換の受容体として使用し、形質転換方法は実施例２を参照した。形質転換後の選択プロセス中に数回のカルスの同定が実行され、正の反転イベントを伴うカルスが分化のために選択された。
以下の表の検出プライマーを使用して、標的部位と、予測される５６０プロモーターとＰＰＯ２コード領域の間の融合断片の両方を含む断片を増幅した。ＰＣＲアンプリコンの長さは３００～１０００ｂｐと予想された。Ｐｒｉｍｅｒ２－Ｆ＋Ｐｒｉｍｅｒ１２－ＲおよびＰｒｉｍｅｒ３－Ｆ＋Ｐｒｉｍｅｒ１０－Ｒを使用して、染色体断片化および反転後のＯｓＺＦＦ接合部の融合断片を検出した。予想されるアンプリコンの長さは、それぞれ５１２ｂｐおよび５６１ｂｐであった。同様に、Ｐｒｉｍｅｒ２－Ｆ＋Ｐｒｉｍｅｒ６－ＲおよびＰｒｉｍｅｒ３－Ｆ＋Ｐｒｉｍｅｒ７－Ｒを使用して、染色体断片化および反転後のＯＳＮＰＰ接合部の融合断片を検出した。予想されるアンプリコンの長さは、それぞれ３８３ｂｐおよび６６６ｂｐであった。
Figure 2024516693000178
ｐＱＹ２６１１で形質転換されたカルスは、ＰＣＲおよびアンプリコン配列決定によって同定された。２９２個のサンプルが特定され、そのうち１９個が反転について陽性であった。同定された反転イベントの遺伝子型は次の表に示されている。
Figure 2024516693000179
ＯｓＰＰＯ２ＣＤＳ領域と融合したＯｓＺＦＦプロモーターの配列決定結果を配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３に示す。２６１１／８１８－１０および２６１１／８１８－１３クロマトグラムピークのアライメント比較結果を図４１に示す。イベント２６１１／８１８－３、２６１１／８１８－１０、２６１１／８１８－５４をさらに区別し、反転陽性Ｔ０植物を得た。
同様に、ｐＱＹ２６１２で形質転換されたカルスでは、逆転現象が確認された。合計５７７個のカルスサンプルが特定され、４５個のカルスサンプルが反転陽性であることが検出された。検出された反転イベントの遺伝子型は次の表に示す。
Figure 2024516693000180
ＯｓＮＰＰプロモーターと融合したＯＳＰＰＯ２ＣＤＳ領域の配列決定結果を配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７に示す。イベント２６１２／８１８－５および２６１１／８１８－３４の配列決定結果とクロマトグラムピークを図４２に示す。最終的にイベント２６１２／８１８－２９のみが正常に識別され、所望の反転を有するポジティブＴ０プラントが得られた。
実施例２０：トウモロコシプロトプラストを用いた新規ＰＰＯ２遺伝子の作出試験
実施例７に示すように、染色体上の遺伝子分布は、異なる植物間で同一直線上にあった。新しい発現様式でＥＰＳＰＳ、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＨＰＰＤ等の新規遺伝子をうまく作成する方法は、他の植物種の間でも汎用性があった。実施例１８によれば、トウモロコシにおけるＰＰＯ２遺伝子選択およびトウモロコシＳＡＭＤＣ遺伝子間の染色体断片の重複を通じて新規ＰＰＯ２遺伝子を作製し、トウモロコシプロトプラスト試験用のデュアルターゲット編集ベクターを構築した。
ＰＰＯ２およびＳＡＭＤＣ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のテストのために次のターゲットを選択した：ＺｍＰＰＯ２－ｓｇＲＮＡ１：５’ｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｇｔｔｇｔｃｇｔｇｇ３’は、ＰＰＯ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のＰＰＯ２タンパク質の開始コドンＡＴＧに近かった（つまり５’ＵＴＲ）。ＺｍＳＡＭＤＣ－ｓｇＲＮＡ２：５’ｇｔｃｇａｔｔａｔｃａｇｇａａｇｃａｇｃ３’およびＺｍＳＡＭＤＣ－ｓｇＲＮＡ３：５’ａｃａａｔｇｃｔｇｇａｇａｔｇｇａｇｇｇ３’は、ＳＡＭＤＣ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のＳＡＭＤＣタンパク質開始コドンＡＴＧ（すなわち５’ＵＴＲ）に近かった。
デュアルターゲット編集ベクターｐＱＹ１３４０およびｐＱＹ１３４１は、上記のターゲット用に設計された以下のプライマーを使用して構築された。
Figure 2024516693000181
ｐＱＹ１３４０は、ＺｍＰＰＯ２－ｓｇＲＮＡ１およびＳＡＭＤＣ－ｓｇＲＮＡ２標的の組み合わせを含有し、一方、ｐＱＹ１３４１は、ＺｍＰＰＯ２－ｓｇＲＮＡ１およびＳＡＭＤＣ－ｓｇＲＮＡ３標的の組み合わせを含有した。
イネのプロトプラストの調製および形質転換について実施例１に記載した手順に従って、上記のベクター用に高濃度プラスミドを調製し、トウモロコシのプロトプラスト形質転換に使用した。米と若干異なるのは、酵素加水分解物が細胞とより適切に接触するように、酵素分解前に１５ｐａの真空度を３０分間維持する必要があることである。使用したトウモロコシ品種はＢ７３であった。
以下の表の検出プライマーを使用して、両側に標的部位を含む断片、または予測されるＳＡＭＤＣプロモーターとＰＰＯ２コード領域の融合から生成された断片を増幅した。ＰＣＲ産物の長さは３００～１１００ｂｐであると予想された。ＺｍＳＡＭＤＣテスト－Ｆ１＋ＺｍＰＰＯ２テスト－Ｒ２の組み合わせを使用して、染色体断片複製後の中間リンカーでの融合セグメントを検出した。予想される製品の長さは約５９７ｂｐであり；シーケンシングにはインナープライマーＺｍＳＡＭＤＣｔｅｓｔ－Ｆ２を使用した。
Figure 2024516693000182
ＰＣＲ反応産物について１％アガロースゲル電気泳動試験を行った結果、すべてのｐＱＹ１３４０およびｐＱＹ１３４１形質転換トウモロコシプロトプラストにおいて、ＺｍＳＡＭＤＣプロモーターとＺｍＰＰＯ２コード領域が融合した予測陽性バンド（約５９７ｂｐ）が検出された。サンプル。陽性断片を配列決定し、ｐＱＹ１３４０ベクター形質転換プロトプラスト試験のＰＰＯ２重複事象配列決定結果を配列番号４８に示した。ｐＱＹ１３４１ベクター形質転換プロトプラストテストのＰＰＯ２重複事象配列決定結果を配列番号４９に示した。予測される染色体セグメント重複リンカーの配列との比較の結果を図４３に示し、ＳＡＭＤＣ遺伝子プロモーターとＰＰＯ２遺伝子発現領域を直接連結して、強力なプロモーター駆動発現を持つ新規ＰＰＯ２遺伝子を作成できた。したがって、新規遺伝子を作成するために本発明によって提供される方法がトウモロコシにも適用できることは明らかである。
実施例２１：コムギプロトプラスト試験における新規ＰＰＯ２遺伝子の作製
実施例１８によれば、コムギにおいて、ＰＰＯ２遺伝子とＳＡＭＤＣ遺伝子との間の染色体断片領域を二重標的編集のために選択し、ＳＡＭＤＣプロモーターによって駆動されるＰＰＯ２コード領域によって発現される新規遺伝子を作製した。コムギは六倍体であるため、ゲノムＡ、Ｂ、Ｄには３セットのＰＰＯ２遺伝子とＳＡＭＤＣ遺伝子があった。ＴａＰＰＯ２－２Ａ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ａ０２Ｇ３４７９００）遺伝子はコムギ２Ａ染色体に位置し、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ａ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ａ０２Ｇ３５５４００）遺伝子は約１１．７１Ｍｂ下流に位置し；ＴａＳＡＭＤＣ－２Ａ遺伝子とＴａＰＰＯ２－２Ａ遺伝子の転写は同じ染色体上で逆方向であるため、図４４に示すように、反転編集戦略を選択する必要があった。ＴａＰＰＯ２－２Ｂ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ｂ０２Ｇ３６６３００）はコムギ２Ｂ染色体に位置し、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ｂ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ｂ０２Ｇ３７２９００）は９．５Ｍｂ下流にあった。ＴａＳＡＭＤＣ－２ＢおよびＴａＰＰＯ２－２Ｂ遺伝子発現は染色体上で同じ方向にあるため、図４５に示すように重複編集戦略を使用する必要があった。ＴａＰＰＯ２－２Ｄ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ｄ０２Ｇ３４６２００）はコムギ２Ｄ染色体に位置し、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ｄ（ＴｒａｅｓＣＳ２Ｄ０２Ｇ３５２９００）は８．３Ｍｂ下流に位置していた。ＴａＳＡＭＤＣ－２ＤとＴａＰＰＯ２－２Ｄ遺伝子の転写は染色体上で同じ方向にあるため、図４６に示すように重複編集イベントを選択する必要があった。
コムギＡＢＤ遺伝子群ＰＰＯ２およびＳＡＭＤＣ遺伝子のＤＮＡ配列をそれぞれＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）に入力し、利用可能な編集ターゲットを探した。オンラインスコアリングに基づいて、ＰＰＯ２およびＳＡＭＤＣ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のテストのために次のターゲットが選択された。
Figure 2024516693000183
２ＡガイドＲＮＡ１および２ＡガイドＲＮＡ２は、ＰＰＯ２遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域の間のＰＰＯ２タンパク質の開始コドン（すなわち５’ＵＴＲ）に近かった。２ＡガイドＲＮＡ３および２ＡガイドＲＮＡ４は、ＳＡＭＤＣ遺伝子プロモーターとＣＤＳ領域（すなわち５’ＵＴＲ）の間のＳＡＭＤＣタンパク質開始コドンに近かった。２Ｂと２Ｄは上記と同じ原理に従った。
以下のプライマーは、「Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327」に示される方法を使用して、フレームワークとしてｐＨＵＥ４１１ベクター（https://www.addgene.org/62203/）を使用してベクターを構築するために、上記のターゲットに対して設計された。
Figure 2024516693000184
以下のデュアルターゲット結合遺伝子編集ベクターは、上記の文献に記載されている方法を使用して構築された。より具体的には、ｐＣＢＣ－ＭＴ１Ｔ２プラスミド（https://www.addgene.org/50593/）をテンプレートとして使用して、デュアルターゲット断片ｓｇＲＮＡ１＋３、ｓｇＲＮＡ１＋４、ｓｇＲＮＡ２＋３、およびｓｇＲＮＡ２＋４を増幅して構築した。ｓｇＲＮＡ発現カセット。ＢｓａＩはｐＨＵＥ４１１ベクターフレームワークを消化し、ゲルが回収された。ターゲット断片は、消化直後にライゲーション反応に使用された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してベクターフレームワークとターゲット断片を連結し、ライゲーション産物をＴｒａｎｓ５αコンピテントセルに形質転換した。異なるモノクローナル配列が選択された。シーケンシングによって配列が正しいことを確認した後、Ｓｉｇｉｔｅｃｈ少量高純度プラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出し、それぞれｐＱＹ２６２６、ｐＱＹ２６２７、ｐＱＹ２６２８、ｐＱＹ２６２９、ｐＱＹ２６３０、ｐＱＹ２６３１、ｐＱＹ２６３２、ｐＱＹ２６３３、ｐＱＹ２６３４、ｐＱＹ２６３５、ｐＱＹ２６３６およびｐＱＹ２６３７と名付けた組換えプラスミドは次のとおりである：
ｐＱＹ２６２６には、２ＡガイドＲＮＡ１と２ＡガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６２７には、２ＡガイドＲＮＡ１と２ＡガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６２８には、２ＡガイドＲＮＡ２と２ＡガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６２９には、２ＡガイドＲＮＡ２と２ＡガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３０には、２ＢガイドＲＮＡ１と２ＢガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３１には、２ＢガイドＲＮＡ１と２ＢガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３２には、２ＢガイドＲＮＡ２と２ＢガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３３には、２ＢガイドＲＮＡ２と２ＢガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３４には、２ＤガイドＲＮＡ１と２ＤガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３５には、２ＤガイドＲＮＡ１と２ＤガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３６には、２ＤガイドＲＮＡ２と２ＤガイドＲＮＡ３の組み合わせが含まれている
ｐＱＹ２６３７には、２ＤガイドＲＮＡ２と２ＤガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれている。
イネのプロトプラストの調製および形質転換について実施例１に記載した手順に従って、上記のベクター用に高濃度プラスミドを調製し、コムギのプロトプラスト形質転換に使用した。米とは少し異なるが、酵素加水分解物が細胞により適切に接触するように、酵素分解前に真空度１５ｐａを３０分間維持する必要がある。使用したコムギの品種はＫＮ１９９であった。種子はTeaching and Research Office on Weeds, School of Plant Protection, China Agricultural Universityからのもので、私たちの研究室で増殖された。コムギの種子を小さなポットに播種し、２６℃で約１０日～１５日暗所培養した。黄化した実生の茎と葉を使用してプロトプラストを調製した。
以下の表の検出プライマーを使用して、両側に標的部位を含む断片、または予測されるＳＡＭＤＣプロモーターとＰＰＯ２コード領域の融合から生成された断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物の長さは３００～１１００ｂｐであると予想された。ＺｍＳＡＭＤＣテスト－Ｆ１＋ＺｍＰＰＯ２テスト－Ｒ２の組み合わせを使用して、染色体断片複製後の中間リンカーでの融合セグメントを検出した。ＰＣＲ産物の長さは３００～１１００ｂｐであると予想された。プライマーペアの組み合わせＴａＳＡＭＤＣＡ－ｇ６００Ｆ＆ＴａＰＰＯ２Ａ＋ｇ４８０Ｒ、ＴａＳＡＭＤＣＢ－ｇ６１０Ｆ＆ＴａＰＰＯ２Ｂ＋ｇ４７０Ｒ、およびＴａＳＡＭＤＣＤ－ｇ５１０Ｆ＆ＴａＰＰＯ２Ｄ＋ｇ４９０Ｒをそれぞれ使用して、ＡＢＤゲノムにおける染色体断片の重複または逆位後の中間リンカーでの融合セグメントをテストした。製品の長さは約１ｋｂｍｍであることが予想された。
Figure 2024516693000185
ＰＣＲ反応産物に対して１％アガロースゲル電気泳動試験を行ったところ、予測されたＳＡＭＤＣプロモーターと約１．５μｍの陽性ストリップ／バンドが確認された。ＰＰＯ２コード領域融合セグメントの１ｋｂは、２ＡゲノムのｐＱＹ２６２６およびＰＱＹ２６２７形質転換サンプル、２ＢゲノムのｐＱＹ２６３０およびｐＱＹ２６３１形質転換サンプル、および２ＢゲノムのＱＹ２６３４、ｐＱＹ２６３５およびｐＱＹ２６３６形質転換サンプルで検出できる。
ＰＣＲ増幅された陽性断片を配列決定し、ｐＱＹ２６２６ベクター形質転換プロトプラストテストのＰＰＯ２反転イベント配列決定結果を配列番号５０に示した。ＰＱＹ２６２７ベクター形質転換プロトプラストテストのＰＰＯ２反転イベント配列決定結果を配列番号５１に示した。予測された染色体セグメントの反転リンカーにおける配列比較の結果は、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ａ遺伝子プロモーターおよびＴａＰＰＯ２－２Ａ遺伝子発現領域が可能であることを示した。直接結合して、強力なプロモーター駆動発現を持つ新規ＰＰＯ２遺伝子を作成することができる。
ｐＱＹ２６３０ベクター形質転換プロトプラスト試験のＰＰＯ２重複事象配列決定結果を配列番号５２に示した。ｐＱＹ２６３１ベクター形質転換プロトプラスト試験のＰＰＯ２重複事象配列決定結果を配列番号５３に示した。予測された染色体セグメントの重複リンカーにおける配列比較の結果は、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ｂ遺伝子プロモーターおよびＴａＰＰＯ２－２Ｂ遺伝子発現領域が可能であることを示した。直接結合して、強力なプロモーター駆動発現を持つ新規ＰＰＯ２遺伝子を作成することができます。ｐＱＹ２６３１の配列決定ピーク図の比較結果を図４５に示す。
ｐＱＹ２６３４ベクター形質転換プロトプラスト試験のＰＰＯ２重複事象配列決定結果を配列番号５４に示した。ｐＱＹ２６３５ベクター形質転換プロトプラストテストのＰＰＯ２重複イベントシーケンス結果を配列番号５５に示した。ＱＹ２６３６ベクター形質転換プロトプラストテストのＰＰＯ２重複イベントシーケンス結果を配列番号５６に示した。染色体上の予測配列との比較セグメント重複リンカーは、ＴａＳＡＭＤＣ－２Ｄ遺伝子プロモーターとＴａＰＰＯ２－２Ｄ遺伝子発現領域を直接結合して、強力なプロモーター駆動発現を持つ新規ＰＰＯ２遺伝子を作成できることを示した。ｐＱＹ２６３５の配列決定ピーク図の比較結果を図４６に示す。
これらのプロトプラスト試験の結果によると、ＴａＳＡＭＤＣプロモーターによって駆動されるＴａＰＰＯ２によって発現される新規ＰＰＯ２遺伝子は、コムギの染色体セグメント逆位または重複によっても作成できることがわかった。したがって、本発明で提示された新規遺伝子を作成する方法がコムギにも適用できることは明らかである。
実施例２２：アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換による内因性ＰＰＯ２遺伝子発現ノックアップによる除草剤耐性アブラナの作出
Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓは四倍体であり、染色体セットはＡＡＣＣでした。ＡゲノムとＣゲノム間の冗長性により、染色体セグメントの欠失または再配置を通じて、遺伝要素の異なる組み合わせを持つ新規遺伝子の作成が可能になる。ＰＰＯ阻害剤除草剤に耐性のあるアブラナの遺伝質を作り出すには、内因性ＰＰＯ遺伝子発現の上方制御が実現可能な技術的手段であった。ナタネＣ９染色体のゲノムデータを解析した結果、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１３遺伝子（以下、３０ＳＲ）が約３０番目の位置に存在することが判明した。ＢｎＣ９．ＰＰＯ２の２３ｋｂ上流。両方とも同じ染色体上の同じ転写方向であった。ナタネのさまざまな組織におけるアブラナ３０ＳＲおよびＢｎＣ９．ＰＰＯ２の発現レベルをＢｒａｓｓｉｃａＥＤＢデータベース（https://brassica.biodb.org/）で分析した。３０ＳＲおよびＢｎＣ９．ＰＰＯ２は主に葉で発現され、３０ＳＲの発現レベルはＢｎＣ９．ＰＰＯ２の発現レベルよりも有意に高かった。３０ＳＲプロモーターとＢｎＣ９．ＰＰＯ２ＣＤＳの間の染色体セグメントを欠失させることによって、３０ＳＲプロモーターによって駆動されるＢｎＣ９．ＰＰＯ２ＣＤＳによって発現される新規遺伝子を作成すると、ＰＰＯ２タンパク質の発現レベルが上昇すると予想されました。このようにして、アブラナは除草剤耐性を獲得した。
利用可能な標的は、アブラナデータベースＷｅｂサイト（http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/）で形質転換受容体アブラナ品種ＷｅｓｔａｒのＣ９染色体に関する情報を見つけることによって同定された。合計６つのターゲットが選択された。
Figure 2024516693000186
ガイドＲＮＡ１、ガイドＲＮＡ２およびガイドＲＮＡ３は、３０ＳＲ遺伝子のプロモーターとＣＤＳ領域（すなわち、５’ＵＴＲ領域）の間の３０ＳＲタンパク質の開始コドンＡＴＧに近かった。ガイドＲＮＡ４、ガイドＲＮＡ５およびガイドＲＮＡ６は、ＢｎＣ９．ＰＰＯ２遺伝子プロモーターとＣＤＳ領域（すなわち５’ＵＴＲ領域）の間のＢｎＣ９．ＰＰＯ２タンパク質開始コドンＡＴＧに近かった。
実施例１を参照すると、異なる標的の組み合わせ、すなわちｐＱＹ２５３３、ｐＱＹ２５３４、ｐＱＹ２５３５およびｐＱＹ２５３６の編集ベクターが、ｐＨＳＥ４０１ベクターをフレームワークとして構築された。
ｐＱＹ２５３３にはガイドＲＮＡ１とガイドＲＮＡ４の組み合わせが含まれていた
ｐＱＹ２５３４にはガイドＲＮＡ２とガイドＲＮＡ５の組み合わせが含まれていた
ｐＱＹ２５３５にはガイドＲＮＡ３とガイドＲＮＡ６の組み合わせが含まれていた
ｐＱＹ２５３６にはガイドＲＮＡ１とガイドＲＮＡ５の組み合わせが含まれていた
ベクタープラスミドを抽出し、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を電気形質転換した。以下の方法を使用して、アグロバクテリウムツメファシエンスを介した形質転換を、受容体としてアブラナ品種Ｗｅｓｔａｒを用いて実行した。
（i）播種：種子を７５％アルコールに１分間浸漬し、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で９分間消毒し、滅菌水で５回洗浄し、Ｍ０培地に播種し、２４℃、暗所で５～６日間培養した。
（ii）アグロバクテリウムの調製：３ｍＬの液体ＬＢ培地を滅菌チューブに移した。アグロバクテリウムを含む溶液を、２００ｒｐｍの振盪機中、２８℃で２０～２４時間振盪培養した。細菌を含む溶液をＬＢ培地中で６～７時間インキュベートした。培養した細菌溶液を５０ｍＬの滅菌遠心管に注いだ。チューブを６０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、適量のＤＭ懸濁液を加えた。溶液をよく振盪し、感染菌溶液のＯＤ６００値を約０．６～０．８に設定した。
（iii）外植片の感染と共生培養：調製した感染菌液を氷上で活性化し、暗所で培養した苗の胚軸を滅菌鉗子とメスで垂直に切り取った。切り取った外植片をディッシュ内で１２分間感染させ、感染中６分ごとにディッシュを振盪した。感染後、外植片を滅菌濾紙に移し、過剰な感染溶液を吸引した。次に、外植片をＭ１培地に置き、２４℃で４８時間共培養した。
（iv）カルス誘導：共培養後、外植片をＭ２培地に移し、そこで１８～２０日間カルスを誘導した。培養条件：２２～２４℃で光培養。１６時間明／８時間暗。分化培養、発根培養の条件は現段階と同様とした。
（v）誘導発芽：分化培養用のＭ３培地にカルスを移し、発芽まで１４日ごとに継代を行った。
（vi）発根培養と移植：芽が分化して明らかな成長点が確認された後、滅菌鉗子とメスを使用して芽をカルスから慎重に切り取った。余分なカルスを可能な限り取り除き、芽をＭ４培地に移して根を張った。発根した植物を培養土に移植した。Ｔ１世代の種子は、Ｔ０世代の再生植物の袋詰め自家受粉によって得られた。
このプロセス中に使用した培地の配合は次のとおりです。
Figure 2024516693000188
 ＤＭ変換緩衝液
Figure 2024516693000189
 共培養培地Ｍ１
スクリーニング培地Ｍ２
Figure 2024516693000190
分化培地Ｍ３
Figure 2024516693000191
発根培地Ｍ４
Figure 2024516693000192
実生の出現後、分子同定のためにＴ０実生から葉を採取しました。以下の表の検出プライマーを使用して、両側に標的部位を含む断片、または予測された３０ＳＲプロモーターとＢｎＣ９．ＰＰＯ２コード領域の融合から生成された断片を増幅した。ｋｌｅｎｏｗ断片が除去された場合、ＰＣＲ産物の長さは約７００ｂｐになるはずであった。
Figure 2024516693000193
４つのベクターの形質転換から得られた３６３個のＴ０実生がテストされた。クレノウ断片欠失事象は１８植物で観察された。クレノウ断片の欠失の確率は標的の組み合わせによって異なる。同じ標的の組み合わせであっても、クレノウ断片の欠失の確率は異なる可能性がある。ｐＱＹ２５３４ベクターは最も高い確率（１０．９６％）を示したが、ｐＱＹ２５３５ベクターは最も低い確率（２％）を示した。平均確率は５．５６％程度であった。
陽性ノックアウトされた１８個の個々の植物の配列決定結果の分析：１０個の個々の植物の配列決定結果は、２つのターゲット間のシームレスなクレノウ断片欠失を示した。ホモ接合性シームレスノックアウトがＱＹ２５３３／ｗ－７で発生し、ヘテロ接合性ノックアウトが他の９植物で発生した。欠失後の予想配列と比較して、塩基の小さな断片の挿入または欠失が８つの個別の植物で観察された。３０ＳＲプロモーター領域では最大３２塩基が欠失していたが、これがプロモーター活性に影響を与えるとは予想されなかった。ホモ接合性ノックアウトは、ＱＹ２５３３／ｗ－３６、ＱＹ２５３３／ｗ－４２、ＱＹ２５３５／ｗ－３２、およびＱＹ２５３６／ｗ－１２４で観察された。結果の詳細は次のとおりある。
Figure 2024516693000194
配列決定の結果は、３０ＳＲプロモーターをＢｎＣ９．ＰＰＯ２ＣＤＳ領域に直接接続して、標的間配列の欠失後に強力なプロモーター駆動発現を行う新規ＰＰＯ２遺伝子を作成できることを示した。３０ＳＲプロモーター融合ＢｎＣ９．ＰＰＯ２ＣＤＳ領域の配列決定結果を配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に示した。
Ｔ０実生試験結果は、本発明で提示された方法が、３０ＳＲプロモーターによって駆動されるＢｎＣ９．ＰＰＯ２ＣＤＳ領域によって発現される新規遺伝子の作製を可能にすることを示した。したがって、本発明で提示された新規遺伝子を作成する方法がアブラナにも適用できることは明らかである。イネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、およびアブラナに関する試験の結果は、本発明によって提供される方法が、単子葉植物および双子葉植物の両方において、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの組み合わせを有する新規遺伝子を意図的に正確に作製するために設計されたことを実証する。
実施例２３：内因性遺伝子ＯｓＷＡＫ１のノックアップ発現によるイネいもち病抵抗性の創出
ＯｓＷＡＫ１は、新規の機能性プロテインキナーゼある。ＯｓＷＡＫ１遺伝子の過剰発現がイネいもち病に対する抵抗性を与える可能性があることが報告された（Li et al. A novel wall-associated receptor-like protein kinase gene, OsWAK1, plays important roles in rice blast disease resistance. Plant Mol Biol, 2009, 69: 337-346）。ＯｓＷＡＫ１遺伝子はイネの１番染色体上に位置する。バイオインフォマティクス解析により、イネで高発現しているＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ０４４３５０（以下、４４３５０）遺伝子がＯｓＷＡＫ１遺伝子の約２６ｋｂ上流に位置し、４４３５０遺伝子とＯｓＷＡＫ１が存在することが分かった。遺伝子は染色体上で逆方向にある。４４３５０遺伝子プロモーターは、ＯｓＷＡＫ１遺伝子の発現を増加させる反転に使用できる。同様に、イネで高発現しているＢＢＴＩ１２（ＭＳＵＩＤ：ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ０４０５０）は、ＯｓＷＡＫ１遺伝子の約２０６ｋｂ上流に位置し、染色体上でＢＢＴＩ１２遺伝子とＯｓＷＡＫ１遺伝子は同じ方向を向いている。ＢＢＴＩ１２遺伝子プロモーターを複製に使用して、ＯｓＷＡＫ１遺伝子の発現を増加させることができる。
同様に、デュアルターゲットの組み合わせ ＯｓＷＡＫ１ｔｓ２：５’ＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣＡＡ３’および４４３５０ｔｓ２：５’ＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＡ３’を使用して、重複編集ベクターｐＱＹ１０８５を構築した。使用した構築プライマーはｂｓａＩ－ＯｓＷＡＫ１５’ＵＴＲｔｓ２－Ｆであった：
５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡｇｇｃＡＴＴＣａｇｃｔａｇｃｔｇｃｔａｃａｃａａＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴ３’およびｂｓａＩ－４４３５０５’ＵＴＲｔｓ２－Ｒ：
５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｇｃｃｇｃｇｃ３’。
同様に、デュアルターゲットの組み合わせＯｓＷＡＫ１ｔｓ２：５’ＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣＡＡ３’およびＢＢＴＩ１２ｔｓ２：５’ＣＡＡＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡ３’を使用して、重複編集ベクターｐＱＹ１０８９を構築した。使用した構築プライマーはｂｓａＩ－ＯｓＷＡＫ１５’ＵＴＲｔｓ２－Ｆであった：
５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴ３’およびｂｓａＩ－ＢＢＴＩ１２５’ＵＴＲｔｓ２－Ｒ：
５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣ３’。
上記の２つのプラスミドを抽出して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ． ＥＨＡ１０５．を形質転換し、受容イネ品種Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８をアグロバクテリウム媒介形質転換によって形質転換し、形質転換方法は実施例２を参照した。形質転換プロセス中に、イネカルスの接合領域での遺伝子型同定が行われ、反転または重複イベント陽性カルスが選択され、苗の再生のための分化段階に入った。
ｐＱＹ１０８５形質転換イネカルスの場合、ｐｒｉｍｅｒ４４３５０ｔｓｄｅｔ－Ｆ＋ｐｒｉｍｅｒＯｓＷＡＫ１ｔｓｄｅｔ－Ｆの組み合わせを使用して、染色体断片の逆位後の中央結合部の融合断片を検出し、ＰＣＲ産物の長さは７１３ｂｐであると予想された。
Figure 2024516693000195
ｐＱＹ１０８９形質転換イネカルスの場合、プライマーＯｓＷＡＫ１ｔｓｄｅｔ－Ｆ＋プライマーＢＢＴＩ１２ｔｓｄｅｔ－Ｒの組み合わせを使用して、染色体断片の複製後の中央結合部の融合断片を検出し、ＰＣＲ産物の長さは８３７ｂｐであると予想された。
Figure 2024516693000196
上記の２つのベクターは、イネカルスのアグロバクテリウム媒介形質転換について実施例２で参照された。カルスが同定された後、反転または重複イベント陽性カルスが区別され、最終的に陽性編集実生が得られた。分子同定の結果を図４７に示す。示されるように、ｐＱＹ１０８５で形質転換された実生は、Ｏｓ０１ｇ０４４３５０プロモーターがＯｓＷＡＫ１遺伝子発現を駆動し、したがって新しいＯｓＷＡＫ１遺伝子が形成される逆転編集イベントを同定するために検出された。配列決定された反転事象の代表的な配列、ＱＹ１０８５／８１８－５７、ＱＹ１０８５／８１８－１０７、ＱＹ１０８５／８１８－１６７、ＱＹ１０８５／８１８－２３を配列番号６２、配列番号６４、配列番号６４に示す。６５および配列番号６６。
図４８に示すように、ｐＱＹ１０８９で形質転換された実生を検出して、ＢＢＴＩ１２プロモーターがＯｓＷＡＫ１遺伝子発現を駆動し、別の新しいＯｓＷＡＫ１遺伝子も形成される重複編集事象を同定した。配列決定された重複事象の代表的な配列、ＱＹ１０８９／８１８－５９５、ＱＹ１０８９／８１８－３２１、ＱＹ１０８９／８１８－３１２を配列番号６３、配列番号６７および配列番号６８に示す。
実施例２４：イネにおける内因性ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子のノックアップ発現によるいもち病抵抗性イネの作出
環状ヌクレオチド依存性チャネル（ＣＮＧＣ）遺伝子ファミリーは、一連の非特異的Ｃａ２＋透過性陽イオンチャネルをコードする。ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子の過剰発現によりイネいもち病に対する耐性が付与される可能性があることが報告された（Wang et al. A cyclic nucleotide-gated channel mediates cytoplasmic calcium elevation and disease resistance in rice. Cell Research, 2019, epub）。ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子はイネ９番染色体上に位置する。バイオインフォマティクス解析により、ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子の約３１４ｋｂ下流にイネで高発現しているＬＯＣ＿Ｏｓ０９ｇ３９１８０（以下、３９１８０）遺伝子が存在し、３９１８０遺伝子とＯｓＣＮＧＣ９が存在することが分かった。遺伝子は同じ染色体上で逆方向にあった。３９１８０遺伝子プロモーターは、ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子の発現を増加させる反転に使用できる。また、イネで高発現しているＬＯＣ＿Ｏｓ０９ｇ３９３９０（以下、３９３９０）はＯｓＣＮＧＣ９遺伝子の約４５６ｋｂ下流に位置しており、３９３９０遺伝子とＯｓＣＮＧＣ９遺伝子は同一染色体上で同一方向を向いていた。３９３９０遺伝子プロモーターを複製に使用して、ＯｓＣＮＧＣ９遺伝子の発現を増加させることができる。
デュアルターゲットの組み合わせＯｓＣＮＧＣ９ｔｓ１：５’ＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＣＧＧＧ３’および３９１８０ｔｓ１：５’ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡ３’を使用して、反転編集ベクターｐＱＹ１０９０を構築した。使用した構築プライマーは、ｂｓａＩ－ＯｓＣＮＧＣ９５’ＵＴＲｔｓ１－Ｆ：５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴ３’およびｂｓａＩ－３９１８０５’ＵＴＲｔｓ１－Ｒ：５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣ３’であった。
デュアルターゲットの組み合わせＯｓＣＮＧＣ９ｔｓ１：５’ＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＣＧＧＧ３’および３９３９０ｔｓ１：５’ＣＴＡＣＴＧＧＣＣＴＣＧＡＴＴＣＧＴＣＧ３’を使用して、重複編集ベクターｐＱＹ１０９４を構築した。使用した構築プライマーは、ｂｓａＩ－ＯｓＣＮＧＣ９５’ＵＴＲｔｓ１－Ｆ：５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴ３’およびｂｓａＩ－３９３９０５’ＵＴＲｔｓ１－Ｒ：５’ＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣ３’であった。
上記の２つのプラスミドを抽出して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＥＨＡ１０５．を形質転換し、受容イネ品種Ｊｉｎｊｉｎｇ８１８をアグロバクテリウム媒介形質転換によって形質転換し、形質転換方法は実施例２を参照した。形質転換プロセス中に、イネカルスの分子同定が行われ、反転または重複イベント陽性カルスが選択され、分化段階および実生の再生に進んだ。
ｐＱＹ１０９０形質転換カルスについては、プライマー３９１８０ｔｓｄｅｔ－Ｒ＋プライマーＯｓＣＮＧＣ９ｔｓｄｅｔ－Ｒの組み合わせを使用して、染色体断片の逆位後の中央結合部の融合断片を検出し、ＰＣＲ産物の長さは７７８ｂｐであると予想された。
Figure 2024516693000197
ｐＱＹ１０９４形質転換カルスについては、プライマー３３９０ｔｓｄｅｔ－Ｆ３＋プライマーＯｓＣＮＧＣ９ｔｓｄｅｔ－Ｒの組み合わせを使用して、染色体断片の複製後の中央結合部の融合断片を検出し、ＰＣＲ産物の長さは８９５ ｂｐであると予想されました。
Figure 2024516693000198
上記の２つのベクターは、イネカルスのアグロバクテリウム媒介形質転換について実施例２で参照された。カルスを同定した後、反転または重複イベント陽性カルスを区別し、最終的に陽性編集実生を得た。配列決定の結果は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０９ｇ３９１８０プロモーターがＯｓＣＮＧＣ９遺伝子発現を駆動し、したがって新しいＯｓＣＮＧＣ９遺伝子が形成される逆転編集イベントを同定するためにｐＱＹ１０９０形質転換実生が検出されたことを証明する。配列決定された反転事象ＱＹ１０９０／８１８－１９２、ＱＹ１０９０／８１８－５５４およびＱＹ１０９０／８１８－５４１の代表的な配列を配列番号６９、配列番号７０および配列番号７１に示す。
配列決定の結果は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０９ｇ３９３９０プロモーターがＯｓＣＮＧＣ９遺伝子発現を駆動し、したがって別の新しいＯｓＣＮＧＣ９遺伝子も形成される重複編集イベントを同定するためにｐＱＹ１０９４形質転換実生が検出されたことを証明している。配列決定された重複イベントＱＹ１０９４／８１８－２０２の代表的な配列を配列番号７２に示す。
実施例２５：ブタＩＧＦ２遺伝子発現ノックアップ
ＩＧＦ－２（インスリン様成長因子２）は、インスリンと類似した構造を持つ３つのタンパク質ホルモンのうちの１つである。ＩＧＦ２は肝臓から分泌され、血液中を循環する。有糸分裂を促進し、成長を調節する作用がある。
ＴＮＮＩ２とＴＮＮＴ３はそれぞれ筋トロポニンＩとトロポニンＴをコードしており、これらは筋線維の中心成分である。これら２つのタンパク質をコードする遺伝子は、筋肉組織で構成的に高度に発現されている。したがって、これら２つの遺伝子のプロモーターを使用してＩＧＦ２遺伝子の発現を駆動すると、筋細胞におけるその発現が大幅に増加し、成長が促進されることが期待される。これら２つの遺伝子の方向は同じ染色体上のＩＧＦ２とは逆であるため、ＩＧＦ２のノックアップは、染色体セグメントの反転を介したプロモーターの交換によって達成される可能性がある。
実験手順は次のとおりである：
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位の選択とベクターの構築：
ＣＲＩＳＰＲターゲットオンライン設計ツール（http://crispr.mit.edu/）を使用して、ブタＩＧＦ２、ＴＮＮＩ２、およびＴＮＮＴ３遺伝子の５’ＵＴＲ領域内の２０ｂｐｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチド配列をそれぞれ選択した。ｓｇＲＮＡオリゴは、青島のＢＧＩによって合成された。
ＩＧＦ２－ｓｇＲＮＡ：５’ｃｃｇｇｇｔｇｇａａｃｃｔｔｃａｇｃａａ３’
ＴＮＮＩ２－ｓｇＲＮＡ：５’ａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｇａｃｇｇｇ３’
ＴＮＮＴ３－ｓｇＲＮＡ：５’ａｃａｇｔｇｇｇｃａｃａｔｃｃｃｔｇａｃ３’
合成したｓｇＲＮＡオリゴを反応系（１０μＬ）内で脱イオン水で１００μｍｏｌ／Ｌに希釈：プラス鎖オリゴ１μＬ、逆鎖オリゴ１μＬ、脱イオン水８μＬ。サーマルサイクラーのアニーリングプログラムは次のように設定した。３７℃で３０分間インキュベートした。９５℃で５分間インキュベートした後、５℃／分の速度で２５℃まで徐々に温度を下げた。アニーリング後、脱イオン水を使用してオリゴを２５０倍に希釈した。ｐＸ４５９プラスミドをＢｂｓＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化し、アニーリングした生成物をライゲーションし、コンピテントＤＨ５αに形質転換し、単一コロニーをシェーカーチューブに採取し、３７℃で１２～１６時間インキュベートし、細菌溶液の１ｍＬアリコートをシーケンス用に送った。配列確認後、菌液を凍結抽出し、プラスミドｐＸ４５９－ＩＧＦ２、ｐＸ４５９－ＴＮＮＩ２、ｐＸ４５９－ＴＮＮＴ３を調製した。これらのプラスミドは、次の実験でトランスフェクションに使用された。
２．細胞のトランスフェクション：
ブタ初代線維芽細胞を解凍して培養し、培地を除去し、トランスフェクション前に洗浄のために予熱したＰＢＳを加え、その後ＰＢＳを除去し、３７℃に予熱したトリプシン溶液２ｍｌを加えた。室温で３分間消化してから、消化を終了した。細胞をヌクレオフェクション溶液に懸濁し、体積を１０６／１００μｌに希釈し、プラスミドを最終濃度５μｇ／１００μｌで添加し、エレクトロポレーターで最適化されたプログラムでエレクトロトランスフォーメーションを実行し、予熱した培地５００μｌを添加し、細胞を培養した。濃度２０％ＦＢＳＤＭＥＭ培地、３７℃、二酸化炭素５％、飽和湿度。
３．細胞のスクリーニングと検査：
細胞が１００％の細胞密度に達したら、ＮＰ４０バッファーで細胞を溶解した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより目的領域を増幅した。
結果を図４９に示す。プライマーペア（Ｔ２－Ｆ２：ｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｃａｔｔｔａｔｃ／ＩＧＦ２－Ｒ２：ａｃａｇｃｔｃｇｃｃａｃｔｃａｔｃｃ）を使用して、ＴＮＮＩ２プロモーターとＩＧＦ２遺伝子の融合イベントを検出することに成功した。
図５０に示すように、プライマーペア（ＴＮＮＴ３－Ｒ：ＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＡＧ／ＩＧＦ２－Ｆ：ＣＴＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＣＣ）を使用して、ＩＧＦ２プロモーターとＴＮＮＴ３遺伝子の融合イベントを検出することに成功した。反復配列の影響を受けるため、ＴＮＮＴ３プロモーターとＩＧＦ２遺伝子の融合イベントを検出する努力がまだ行われている。
本発明は、染色体セグメントの反転編集事象を通じてインビボでブタＴＮＮＩ２プロモーターをＩＧＦ２タンパク質コード領域と融合させ、継続的に高い発現を示す新たなＩＧＦ２遺伝子を形成した。これらの編集イベントにより、急速に成長する新しいブタ細胞株が作成されました。この実施例は、本発明の方法を使用して哺乳類生物において新規遺伝子を作製できることを示す。
実施例２６：ニワトリのＩＧＦ１発現ノックアップ
ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）は、鶏の成長と発達に密接に関係している。ＭＹＢＰＣ１（ミオシン結合プロテインＣ）は、ＩＧＦ１の下流で高度に発現される遺伝子である。ＩＧＦ１コード配列を駆動するＭＹＢＰＣ１プロモーターを持つ新規遺伝子は、デュアルターゲット編集ベクターを使用したゲノム編集によって作成された。
実験手順は次のとおりです。
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位の選択と標的切断ベクターの構築：
ＣＲＩＳＰＲターゲットオンライン設計ツール（http://crispr.mit.edu/）を使用して、ニワトリＩＧＦ１遺伝子およびＭＹＢＰＣ１遺伝子の５’ＵＴＲ領域に２０ｂｐのｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチド配列をそれぞれ設計した。ｓｇＲＮＡオリゴはＢＧＩによって合成された。合成したｓｇＲＮＡオリゴを反応系（１０μＬ）内で脱イオン水で１００μｍｏｌ／Ｌに希釈する：プラス鎖オリゴ１μＬ、逆鎖オリゴ１μＬ、脱イオン水８μＬ；サーマルサイクラーのアニーリングプログラムは次のように設定した。３７℃で３０分間インキュベートした。９５℃で５分間インキュベートし、その後５℃／分の速度で温度を２５℃まで徐々に下げた。アニーリング後、オリゴを２５０倍量の脱イオン水で希釈した。ｐＸ４５９プラスミドをＢｂｓＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化し、アニーリングした生成物をライゲーションし、コンピテントＤＨ５αに形質転換し、単一コロニーを振盪チューブに採取し、３７℃で１２～１６時間インキュベートし、細菌溶液のアリコート１ｍＬをシーケンシング用に送液した。配列確認後、細菌溶液を凍結および抽出してプラスミドｐＸ４５９－ＩＧＦ１およびｐＸ４５９－ＭＹＢＰＣ１を調製し、これらの二重標的編集プラスミドをニワトリＤＦ－１細胞のトランスフェクションに使用した。
２．細胞培養とＤＦ－１細胞の継代：
ＤＦ－１（ＤｏｕｇｌａｓＦｏｓｔｅｒ－１）細胞は、活発な増殖能力を持つニワトリ胚線維芽細胞であるため、ｉｎｖｉｔｒｏ研究で最も一般的な細胞株である。ＤＦ－１細胞を３７℃の水浴中で解凍し、次いでペトリ皿に播種し、細胞培養のために３７℃、５％ＣＯ２の定温インキュベーターに置いた。培地は９０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳである。細胞密度が９０％以上に達したら、細胞を１：２または１：３の比率で継代する。
３．ＤＦ－１細胞のトランスフェクション：
（i）１．５ｍｌＥＰチューブを２本用意し、それぞれＡチューブ、Ｂチューブとマークする。
（ii）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地２５０μｌ、プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００TM試薬５μｌをチューブＡに入れる。
（iii）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地２５０μｌとリポフェクタミン（登録商標）３０００試薬３．７５μｌをチューブＢに入れる。
（iv）ピペットでチューブＡからチューブＢに液体を移し、チューブＡとチューブＢの液体を素早く混合し、１０秒間ボルテックスする。
（v）ＡＢチューブ混合物（リポソーム－ＤＮＡ複合体）をボルテックスし、室温で１５分間インキュベートする。
（vi）最後に、培地をピペットで除去した後、リポソーム－ＤＮＡ複合体をＤＦ－１細胞皿にゆっくりと加える。
４．ＤＦ－１細胞のスクリーニングと検査：
（i）ＤＦ－１／ＰＧＣｓ細胞を培養し、コンフルエンスが６０～７０％に達するとトランスフェクション効率が最も高くなる。
（ii）トランスフェクションの２日後、スクリーニングのために１μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加する。
（iii）導入４日後、新しい細胞培養液に交換してツプロマイシンを除去し、導入後７日目まで培養を続けて細胞数を増やす。
（iv）取扱説明書に従って、細胞を収集し、ＴｉａｎｇｅｎのゲノムＤＮＡキットを使用して細胞ＤＮＡを抽出する。
（v）二重化または反転が予想される新規遺伝子断片を増幅するためのプライマーを設計する。
本発明は、染色体セグメントの二重編集事象を通じて、ニワトリＭＹＢＰＣ１プロモーターを生体内でＩＧＦ１ＣＤＳ領域と融合させ、継続的に高い発現を示す新たなＩＧＦ１遺伝子を形成した。これらの編集イベントにより、急速に成長する新しい鳥類細胞株が作成された。この実施例は、本発明の方法を使用して鳥類生物において新規遺伝子を作製できることを示す。
実施例２７：酵母における染色体セグメント逆位による遺伝子発現の誘導
ＦＰＰは、酵母内の多くの化合物の重要な前駆体である。しかしながら、酵母内の多くの代謝経路によって分解される可能性があり、テルペノイド等の外因性生成物の最終収量に影響を与える。ＦＰＰを基質として使用するスクアレンの合成は、エルゴステロール代謝経路の最初のステップであり、ＥＲＧ９遺伝子によってコードされるスクアレン合成酵素によって触媒される。しかしながら、ＥＲＧ９遺伝子を直接ノックアウトすると酵母細胞は増殖できなくなるため、スクアレン合成酵素の発現レベルを特異的に制御することによって、自身の増殖を維持しながら細胞内ＦＰＰ濃度を蓄積させることしかできなかった。ＨＸＴプロモーターは、弱グルコース応答性のプロモーターであり、外部環境のグルコース濃度の低下に伴って発現強度が低下するが、これは発酵過程における糖代謝過程と一致しており、理想的な誘導性プロモーターである。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムデータベースＷｅｂサイト（https://www.yeastgenome.org/）にあるように、ＨＸＴ１遺伝子とＥＲＧ９遺伝子は両方とも第ＶＩＩＩ染色体の長腕端に位置し、逆方向に転写されるため、内因性ＥＲＧ９酵母の遺伝子プロモーターは、染色体セグメントの反転編集イベントを通じて、発現強度がグルコース濃度に応答するＨＸＴ１プロモーターに置き換えることができる。ＥＲＧ９遺伝子発現の特異的誘導により、酵母におけるＦＰＰの蓄積という目的が達成されることが期待される。
１．ベクターの設計と構築
ベクター設計には、Ｃａｓ９ベクターとｇＲＮＡベクターが含まれており、これらは２つの異なるバックボーンに構築される。Ｃａｓ９ベクターには、酵母ＴＥＦ１プロモーターによって駆動されるｐＵＣ１９バックボーンを使用した。Ｃａｓ９配列は酵母コドンに最適化されている。ｇＲＮＡベクターは、ｐＵＣ５７バックボーン、ＳＮＲ５２プロモーター、およびＳＵＰ４ターミネーターを使用した。ｓｇＲＮＡはオンラインツール（http://crispor.tefor.net/）を使用して設計され、テスト用にＨＸＴ１およびＥＲＧ９遺伝子のプロモーターとコード領域の間の次のターゲットを選択した。ＥＲＧ９ｓｇＲＮＡ：ＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧ；ＨＸＴ１ｓｇＲＮＡ：ＣＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＧ。ベクターが完成したら、それらを混合して変換する。
２．エレクトロポレーションによる酵母の形質転換
１）新しいプレートからより良く増殖したモノクローンをピックアップし、５ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、２２０ｒｐｍ、３０℃で一晩激しく振盪しながら増殖させた。２）初期ＯＤ６６０が約０．２となるように５０ｍＬのＹＰＤ培地に移し、ＯＤ６６０が約１．２となるように３０℃、２２０ｒｐｍで激しく振とう培養した。３）酵母を氷上に３０分間静置した後、４℃、５０００ｇ、５分間遠心分離して菌体を回収した。４）上清を捨て、予め冷却した滅菌水で細胞を２回洗浄し、その後遠心分離した。５）上清を捨て、予め冷却した１ｍｏｌ／Ｌソルビトール溶液で細胞を３回洗浄した。６）遠心分離して細胞を回収し、予め冷却した２００μＬの１ｍｏｌ／Ｌソルビトール溶液で細胞を３回洗浄した。７）２０μＬ（約５μｇ）のプラスミドまたはＤＮＡ断片を細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合し、氷上で１０分間インキュベートした。８）混合物を予冷したカップに移し、１５００Ｖで５ミリ秒間ショックを与えた。９）カップ内の細胞を１ｍＬＹＰＤ培地で再懸濁し、ボルテックスしながら３０℃で１～２時間インキュベートした。１０）回収した細胞を滅菌水で洗浄し、最後に１ｍＬの滅菌水で再懸濁し、１００μＬを対応するプレートに採取した。１１）３０℃の恒温恒温器で３～５日間培養し、トランスを選択した。
３．酵母ゲノムＤＮＡの抽出
１）一晩培養した培地５ｍｌを採取し、遠心分離して細胞を回収し、１ｍＬＰＢＳで２回洗浄した後、最大速度で１分間遠心分離して細胞を回収した。２）５００μＬのソルビトール緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、その後５０Ｕのリチカーゼを加え、３７℃で４時間インキュベートした。３）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を収集した。４）５００μＬの酵母ゲノムＤＮＡ抽出緩衝液を加えて再懸濁し、５０μＬの１０％ＳＤＳを加え、すぐに６５℃の水浴に３０分間置いた。５）２００μＬの５ＭＫＡｃ（ｐＨ８．９）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。６）１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに移した。７）等量のイソプロピルアルコールを加え、１２０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。８）上清を捨て、５００μＬの７５％エタノールを加えてＤＮＡを洗浄し、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。９）沈殿後、５０μＬのＴＥ緩衝液を加えて溶解した。１０）電気泳動検査用に３μＬのＤＮＡを採取し、残りは－２０℃の冷蔵庫に保存した。
４．反転イベントの検出
以下のプライマーを使用した形質転換酵母細胞のＰＣＲ検出：ＨＸＴ１ｐｒｏ－ｄｅｔＦ：ＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴおよびＥＲＧ９ｃｄｓ－ｄｅｔＲ：ＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴそれぞれ。ＰＣＲ産物の長さは６１６ｂｐであると予想された。
本発明は、標的部位間の染色体断片の反転編集事象を通じてインビボで酵母ＥＲＧ９遺伝子プロモーターをＨＸＴ１プロモーターに置き換え、グルコース濃度によって調節される新しいＥＲＧ９遺伝子を形成する。この実施例は、本発明の方法を使用して真菌生物において新規遺伝子を作製できることを示す。
実施例２８：２９３Ｔ細胞株におけるＥＰＯ遺伝子のノックアップ発現
ＥＰＯ（エリスロポエチン）はヒトにおける重要なサイトカインであり、ＰＳＭＣ２（プロテアソーム２６ＳサブユニットＡＴＰａｓｅ２）は２６Ｓプロテアーゼ複合体の調節サブユニットであり、細胞内で遍在的に発現されます。デュアルターゲット編集ベクターを設計することにより、２９３Ｔ細胞株でＰＳＭＣ２プロモーターによって駆動される新しいＥＰＯ遺伝子を同定およびスクリーニングする。
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のターゲット設計とベクター構築の編集
ＣＲＩＳＰＲのターゲット設計オンラインツール（http://crispr.mit.edu/）を使用して、２０ｂｐｓｇＲＮＡオリゴの配列をヒトＥＰＯ遺伝子とＰＳＭＣ２遺伝子の５’ＵＴＲ領域にそれぞれ設計した。オリゴは、ＢＧＩ Ｃｏｍｐａｎｙ（青島、中国）によって合成された。合成ｓｇＲＮＡオリゴを脱イオン水で１００μｍｏｌ／Ｌに希釈した。反応系（１０μＬ）：フォワードオリゴ１μｌ、リバースオリゴ１μｌ、脱イオン水８μＬ；ＰＣＲに使用したアニーリングプログラム：３７℃で３０分間インキュベートし、９５℃で５分間インキュベートし、その後５℃／分で２５℃まで徐々に冷却し、アニーリング後にオリゴを２５０倍に希釈した。生成物を添加し、ライゲーションした生成物をＤＨ５ａコンピテントセルに形質転換し、遠心管で単一クローンを選択し、３７℃で１２～１６時間振盪インキュベートした後、１ｍＬに分注して配列を決定し、配列決定後、プラスミドを抽出した。トランスフェクション用のプラスミドｐＸ４５９－ＥＰＯおよびｐＸ４５９－ＰＳＭＣ２の調製。
２．２９３Ｔ細胞の蘇生：凍結したチューブを液体窒素または－８０℃の冷蔵庫容器から取り出し、３７℃の温水浴に直接浸し、一定間隔で振ってできるだけ早く溶かした。凍結したチューブを３７℃のウォーターバスから取り出し、ウルトラクリーンテーブルの蓋を開け、チップで細胞懸濁液を吸い出し（遠心チューブには細胞完全培地３ｍｌがあらかじめ添加されています）、そして混合した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を穏やかに再懸濁し、１０％ＦＢＳ細胞培地を加え、細胞を穏やかに再懸濁し、細胞密度を調整し、シャーレに播種し、３７℃でインキュベートした。翌日、細胞培地を１回交換した。
３．移行ステップ：二酸化炭素インキュベーターから細胞シャーレ（６０ｍｍ）を取り出し、超クリーン作業台でボトル内の培地を吸引し、２ｍｌの１×ＰＢＳ溶液を加え、シャーレを静かに回転させて細胞を洗浄し、シャーレを廃棄します。１×ＰＢＳ溶液；トリプシン０．５ｍｌを加え、３～５分間インキュベートした。インキュベーション中、消化された細胞を倒立顕微鏡で観察し、細胞が丸くなり、細胞同士が結合しなくなった場合は、直ちに超清浄作業台に２容量の完全培地（血清を含む）を加え、１ｍＬの完全培地を加え、吹き飛ばしてセルを浮遊状態に保った。細胞懸濁液を吸い出し、１５ｍｌの遠心管に入れ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。消化液を捨て、遠心管の底を軽く叩いて細胞を再懸濁させた。２．５ｍｌの完全培地を２つの新しい６０ｍｍペトリ皿に加え、元の消化皿にも２．５ｍｌの完全培地を加え、それにマークを付けた。遠心管内の細胞懸濁液を３枚のシャーレに０．５ｍｌ／シャーレで滴下し、チップで細胞を数回吹き飛ばし、炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
４．トリプシンで細胞を消化し、１００ｍｍペトリ皿で計数すると、トランスフェクション当日の密度が６０％～７０％増加した。最大容量２４．０μｇのプラスミドＤＮＡを底面積１００ｍｍの細胞ペトリ皿に加え、１．５ｍＬの無血清培地で希釈し、混合し、室温で５分間インキュベートした。
５．細胞トランスフェクション：（１）８０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００試薬を１．５ｍｌの無血清培地で希釈し、希釈したＤＮＡを５分以内に混合した。（２）希釈プラスミドＤＮＡと希釈ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００を混合し、室温で２０分間インキュベートした。（３）次に、上記の混合物を細胞に均一に添加した。（４）３７℃、５％ＣＯ２、１００％飽和湿度で６時間保温し、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭ培養物１２ｍｌを各ペトリ皿に加えた。２４時間後、古い培地を１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地に交換し、インキュベートを続けた。
６．トランスフェクションの４８時間後、遠心分離して細胞を収集した。２９３Ｔ細胞からのＤＮＡは、ＴｉａｎｇｅｎのＴＩＡＮａｍｐゲノムＤＮＡキットを使用して抽出された。プライマーは、標的領域のＰＣＲ増幅用にも設計された。
実施例２９：遺伝子プロモーターまたはコード領域断片の転座による異なる発現パターンを持つ新規遺伝子の作成
二重標的の組み合わせは、染色体２でＯｓＵｂｉ２遺伝子のプロモーター領域を切断するように設計され、標的１はＯｓＵｂｉ２開始コドンの直前にあり、標的２はＯｓＵｂｉ２プロモーターの上流にあった。３番目のターゲット（ターゲット３）は、染色体４にあるＯｓＰＰＯ２遺伝子のプロモーターと開始コドンの間を切断するように設計された。３つのターゲットに対して設計されたｓｇＲＮＡ配列は次のとおりである。
ターゲット１：ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－７ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ｇａａａｔａａｔｃａｃｃａａａｃａｇａｔ３’
ターゲット２：ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－１９６０ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ａｔｇｇａｔａｔｇｇｔａｃｔａｔａｃｔａ３’
ターゲット３：ＯｓＰＰＯ２ｃｄｓ－６ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ｔｔｇｇｇｇｃｔｃｔｔｇｇａｔａｇｃｔａ３’。
図５４に示すように、ＯｓＰＰＯ２遺伝子を駆動するＯｓＵｂｉ２プロモーターである新規遺伝子カセットが、設計された転座の結果として生成される。ＯｓＵｂｉ２プロモーターの転座により、ＯｓＵｂｉ２プロモーターと新規遺伝子または新規遺伝子発現カセットであるＯｓＰＰＯ２コード領域の組み合わせが生じた。つまり、ＯｓＵｂｉ２プロモーターはＯｓＰＰＯ２発現を駆動した。このような期待される新規遺伝子を保持するカルスまたはカルスに由来する小植物は、ＰＣＲスクリーニングおよびジェノタイピングを通じて得ることができる。
設計されたｓｇＲＮＡ配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（中国、南京）に注文された。これらのｓｇＲＮＡはそれぞれＳｐＣａｓ９と集合してＲＮＰ複合体を形成し、３つのＲＮＰ複合体を等しい比率で混合した。この混合物を、イネカルスのバイオリスティック形質転換に供した（特定の実験手順については、国際公開第２０２１０８８６０１Ａ１号を参照）。
形質転換されたカルスを２週間培養し、次のプライマーペアを使用してサンプリングしてテストした。
ＯｓＵＢｉ２ｐｒｏ－１６４８Ｆ：５’ｇｇａａｔａｔｇｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔｇａｔｃｃｇ３’
ＯｓＰＰＯ２－ｇＤＮＡ－２３６Ｒ：５’ｃａｇａａｃｔｇａａｃｃｃａｃｇｇａｇａｇ３’
ＯｓＰＰＯ２を駆動するＯｓＵｂｉ２プロモーターである新規遺伝子が生成されたかどうかを検出するために、ＰＣＲ検出を実行した。転座陽性カルスを２週間培養し続け、その後、再度ＰＣＲ検出を行った。３ラウンドの検出後、陽性カルスは実生に分化し、これもＰＣＲ検出のためにサンプリングされた。陽性のＴ０実生の配列を決定して、特定の遺伝子型を同定した。ＯｓＰＰＯ２を駆動するＯｓＵｂｉ２プロモーターを持つ合計４つの異なる遺伝子型が得られた。
ＱＹ３７８－１６：Ｕｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳ
５’ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＧＴ３’
ＱＹ３７８－１８：Ｕｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳ
５’ＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧ３’
ＱＹ３７８－４１：Ｕｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳ
５’ＡＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＴａＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴｃＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧ３’
ＱＹ３７８－３７４：Ｕｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳ
５’ＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧ３’
Ｔ１世代の苗木をＴ０植物から収穫し、ＰＣＲを使用してテストした。その結果、上記の遺伝子型は安定して遺伝する可能性があることが確認された。ＱＹ３７８－１６のＴ１世代を選択し、葉面散布により化合物Ａで処理した。図５５に示すように、それは、ＰＰＯ阻害除草剤化合物Ａに対する顕著な改善された耐性を示した。野生型イネは２ｇａｉ／ｍｕの速度で枯死したが、Ｕｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－を有するＱＹ３７８－１６のＴ１世代は、ＣＤＳ遺伝子型は４ｇａｉ／ｍｕの速度でも生き残ることができ、新しいＰＰＯ２遺伝子が化合物Ａに対する植物の耐性を改善したことを示している。
この技術的ルートを参照して、編集エージェントとしてＳｐＣａｓ９タンパク質を使用して、ＯｓＵＢｉ２、ＯｓＰＰＯ２、およびＯｓＰＰＯ１に対してさまざまなターゲットの組み合わせが設計された。
１．ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－１９６０ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ａｔｇｇａｔａｔｇｇｔａｃｔａｔａｃｔａ３’
２．ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－７ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ａｔｃｔｔｔｇｔｇａａｇａｃａｔｔｇａｃ３’
３．ＯｓＰＰＯ２ｃｄｓ－６ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ｔｔｇｇｇｇｃｔｃｔｔｇｇａｔａｇｃｔａ３’
４．ＯｓＰＰＯ２ｃｄｓ－１４ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ｇｃａｇｇａｇａｇａｇｃａｔｃｔｇａｔｔ３’
５ ＯｓＰＰＯ１ｃｄｓ－４ＮＧＧｓｇＲＮＡ：５’ｃｃａｔｇｔｃｃｇｔｃｇｃｔｇａｃｇａｇ３’
ｓｇＲＮＡ１＋２＋３およびｓｇＲＮＡ１＋２＋４とＣａｓ９タンパク質の組み合わせをＲＮＰ形質転換に供し、ＰＣＲスクリーニング選択後にＵｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳによる新しい遺伝性遺伝子を同定した。同様に、ｓｇＲＮＡ１＋２＋５とＣａｓ９タンパク質の組み合わせもＲＮＰ形質転換に供され、ＰＰＯ１－ＣＤＳを駆動するＵｂｉ２プロモーターを持つ新しい遺伝性遺伝子も得られた。
ＭＡＤ７タンパク質を編集エージェントとして使用した：
１．ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－１８９６ＭＡＤ７ｃｒＲＮＡ：５’ｇｔｔｇｇａｇｇｔｃａａａａｔａａｃａｇｇ３’
２．ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－１４ＭＡＤ７ｃｒＲＮＡ：５’ｔｇａａｇａｃａｔｔｇａｃｃｇｇｃａａｇａ３’
３．ＯｓＵｂｉ２ｐｒｏ－１７ＭＡＤ７ｃｒＲＮＡ：５’ｇｔｇａｔｔａｔｔｔｃｔｔｇｃａｇａｔｇｃ３’
４．ＯｓＰＰＯ２ｃｄｓ－９ＭＡＤ７ｃｒＲＮＡ：５’ｇｇｇｃｔｃｔｔｇｇａｔａｇｃｔａｔｇｇａ３’
５．ＯｓＰＰＯ１ｃｄｓ－１２５ＭＡＤ７ｃｒＲＮＡ：５’ｃｃａｔｔｃｃｇｇｔｇｇｇｃｃａｔｔｃｃｇ３’
ｃｒＲＮＡ１＋２＋４およびｃｒＲＮＡ１＋３＋４とＭＡＤ７タンパク質の組み合わせをＲＮＰ形質転換に供し、ＰＣＲスクリーニング選択後にＵｂｉ２ｐｒｏ＋ＰＰＯ２－ＣＤＳによる新しい遺伝性遺伝子を同定した。同様に、ＭＡＤ７タンパク質を添加したｃｒＲＮＡ１＋２＋５およびｃｒＲＮＡ１＋３＋５の組み合わせをＲＮＰ形質転換に供し、ＰＰＯ１－ＣＤＳを駆動するＵｂｉ２プロモーターを有する新しい遺伝性遺伝子も得た。
これらの実施例では、別の遺伝子のコード領域の上流に転座されたプロモーターを挿入することによって、異なる発現パターンを持つ新規遺伝子が生成された。同様に、同じ技術アイデアに従って、転座された遺伝子コード領域を別のプロモーターの下流領域に挿入することによって、異なる発現パターンを有する新規遺伝子を生成することもでき、これは本願の技術的解決範囲に含まれる。
説明で言及されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各刊行物または特許出願が個別かつ具体的に参照により本明細書に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
上記の発明は、明確な理解のために例および実施形態によってより詳細に説明されているが、特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであり、そのような変更および修正はすべて本発明の範囲内にある。

Claims (58)

  1. 生物において新規遺伝子を作製する方法であって、下記の工程：
    前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特異的部位でＤＮＡ切断を同時に生成する工程であって、前記特異的部位が、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離できるゲノム部位であり、前記ＤＮＡ切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復により互いに連結される前記工程、元のゲノム配列と異なる遺伝要素またはタンパク質ドメインの新規組み合わせを生成し、それにより前記新規遺伝子を作製する工程を含む方法；または
    生物において安定に継承される新規遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで作製する方法であって、下記の工程：
    （１）前記生物のゲノム中の２つ以上の異なる特異的部位で二本鎖ＤＮＡ切断を同時に生成する工程であって、前記特異的部位が、異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインを分離することができ、前記ＤＮＡ切断が次いで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復により互いに連結される前記工程、元のゲノム配列に由来する異なる遺伝要素または異なるタンパク質ドメインの新規組み合わせまたはアセンブリを生成し、それにより前記新規遺伝子を生成する工程
    を含む方法であって；
    好ましくは、（２）前記新規組み合わせまたはアセンブリを特異的に検出できるプライマー対を設計する工程であって、次いで、前記新規遺伝子を含む細胞または組織がＰＣＲ検査によってスクリーニングされ得、前記遺伝要素の新規組み合わせの特徴的な配列がシーケンシングにより決定され得る前記工程；および
    （３）前記スクリーニングされた細胞または組織を培養してＴ０世代生物を得、Ｔ０世代およびその育種されたＴ１を含む連続的な２世代または少なくとも連続的な３世代の生物に対してＰＣＲ試験およびシーケンシングを行って、前記遺伝要素の新規組み合わせの特徴的な配列を含む前記生物を選択する工程、すなわち安定に継承される新規遺伝子を生物において製造する工程
    を含み；
    任意に、（４）前記新規遺伝子の機能に関連する生物学的形質または表現型を試験して、前記生物に有益な形質をもたらすことができる遺伝子型を決定し、安定に継承される新規機能的遺伝子を得る工程を含む、前記方法。
  2. 前記工程（１）において、前記ＤＮＡ切断が前記生物のゲノム中の２つの異なる特異的部位で同時に生成され、一方の部位が、遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間のゲノム遺伝子座であり、他方の部位が、異なる発現パターンを有する別の遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間にあり、それにより一方の遺伝子のプロモーターと、異なる発現パターンを有する他方の遺伝子のコード領域との新規組み合わせが生じ；好ましくは、強力なプロモーターと目的の遺伝子との組み合わせが最終的に生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（１）において、前記ＤＮＡ切断が前記生物のゲノム中の３つの異なる特異的部位で同時に生成され、該３つの特異的部位が、高度に発現される遺伝子のプロモーター領域を切断することができる２つのゲノム部位の組み合わせ、および異なる発現パターンを有する目的の遺伝子のコード領域とプロモーター領域との間の第３のゲノム部位を含むか；または、高度に発現される遺伝子のプロモーター領域とコード領域との間のゲノム部位、および異なる発現パターンを有する目的の遺伝子のコード領域断片を切断できる別の２つのゲノム部位の組み合わせを含み；次いで、上記部位における遺伝子編集により、目的の遺伝子のコード領域の上流に挿入される強力なプロモーター断片、または目的の遺伝子のコード領域断片が高度に発現される別の遺伝子のプロモーターの下流に挿入される転座編集イベントが発生し、最終的に、一つの遺伝子のプロモーターと、異なる発現パターンを有する別の目的の遺伝子のコード領域との組み合わせが生成される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記２つ以上の異なる特異的部位が、同一の染色体上または異なる染色体上に位置し、好ましくは、前記２つ以上の異なる特異的部位が、少なくとも２つの異なる遺伝子上の特異的部位であってもよく、同一の遺伝子上の少なくとも２つの異なる特異的部位であってもよく；前記少なくとも２つの異なる遺伝子は、同じまたは異なる転写方向を有していてもよい、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記遺伝要素が、プロモーター、５’非翻訳領域、コード領域または非コードＲＮＡ領域、３’非翻訳領域、前記遺伝子のターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記異なる遺伝要素の組み合わせが、異なる発現パターンを有する前記２つの遺伝子の一方の遺伝子のプロモーターと、他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域との組み合わせであるか、または前記異なる遺伝要素の組み合わせが、異なる発現パターンを有する前記２つの遺伝子の一方のプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域と、他方の遺伝子のＣＤＳまたは非コードＲＮＡ領域との組み合わせであるか、または異なる遺伝要素の組み合わせが、同一の遺伝子の隣接する遺伝要素の組み合わせであり；好ましくは、前記異なる発現パターンが、異なるレベルの遺伝子発現、異なる組織特異的な遺伝子発現、または異なる発生段階特異的な遺伝子発現である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記タンパク質ドメインが、タンパク質の特定の機能ドメインに対応するＤＮＡ断片であり；好ましくは、限定されないが、核局在化シグナル、葉緑体リーディングペプチド、ミトコンドリアリーディングペプチド、リン酸化部位、メチル化部位、膜貫通ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、受容体活性化ドメイン、または酵素触媒中心を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記異なるタンパク質ドメインの組み合わせが、異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質の一方の局在化シグナル領域と、前記他の遺伝子の成熟タンパク質コード領域との組み合わせであるか、または前記異なる生物学的機能を有する２つのタンパク質ドメインの組み合わせであるか、または前記同一の遺伝子の隣接するタンパク質ドメインの組み合わせであり；好ましくは、前記異なる細胞内局在が、核局在、細胞質局在、細胞膜局在、葉緑体局在、ミトコンドリア局在、および小胞体膜局在からなる群から選択され；好ましくは、前記異なる生物学的機能が、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドへの結合、小分子シグナルへの結合、イオンへの結合、特異的酵素反応、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４および７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記遺伝要素とタンパク質ドメインとの組み合わせが、タンパク質ドメインと、同一の遺伝子の隣接するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーターとの組み合わせである、請求項１～５および７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記生物が非ヒト動物、植物または菌類である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記異なる遺伝要素の組み合わせが下記のいずれかから選択される、請求項１に記載の方法：
    （１）一方の要素が植物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方がＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯ、ＡＬＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＧＳ、ＰＤＳ、ＤＨＰＳ、ＤＸＰＳ、ＨＳＴ、ＳＰＳ、同一の植物のセルロース合成、ＶＬＣＦＡＳ、脂肪酸チオエステラーゼ、セリンスレオニンプロテインホスファターゼまたはリコペンシクラーゼ遺伝子コード領域である；
    （２）一方の要素が生物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一の生物内のＰ４５０ファミリーのいずれかの遺伝子コード領域である；
    （３）一方の要素がイネまたはトウモロコシの強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一の生物内のＯｓＣＹＰ８１Ａ遺伝子またはＺｍＣＹＰ８１Ａ９遺伝子の遺伝子コード領域である；
    （４）一方の要素がトウモロコシの強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素がトウモロコシ遺伝子ＺＭＭ２８（Ｚｍ００００１ｄ０２２０８８）、ＺｍＫＮＲ６またはＺｍＢＡＭ１ｄのコード領域である；
    （５）一方の要素がイネの強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素がイネ遺伝子ＣＯＬＤ１またはＯｓＣＰＫ２４のコード領域である；
    （６）一方の要素が生物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方の要素が同一の生物内のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である；
    （７）一方の要素が植物の強力な内因性プロモーターであるか、または植物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一の植物内のＮＡＣ転写因子ファミリー（例えば、ＯｓＮＡＣ０４５、ＯｓＮＡＣ６７、ＺｍＳＮＡＣ１、ＯｓＮＡＣ００６、ＯｓＮＡＣ４２、ＯｓＳＮＡＣ１またはＯｓＳＮＡＣ２）のいずれか１つの遺伝子コード領域である；
    （８）一方の要素が植物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一の植物内のＭＹＢ、ＭＡＤＳ、ＤＲＥＢおよびｂＺＩＰ転写因子ファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である；
    （９）一方の要素が表Ａに列挙される過剰発現または組織特異的発現イネ遺伝子のいずれか１つのプロモーターであり、他方がイネの遺伝子に対応する選択されたプロモーターとは異なる別の遺伝子のタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域である；
    （１０）一方の要素が表Ｂ～Ｋに列挙される生物学的機能遺伝子のいずれか１つから選択されるタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域であり、他方が選択された遺伝子に対応する生物学的ゲノムの選択された機能遺伝子とは異なる別の遺伝子のプロモーター領域である；
    （１１）一方の要素が生物の強力な内因性プロモーターであるか、または強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一の生物内のＧＳＴ（グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ）ファミリーのいずれか１つの遺伝子コード領域である；
    （１２）一方の要素がコムギまたはトウモロコシの強力な内因性プロモーターであるか、または生物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方が同一生物内のコムギＧＳＴ Ｃｌａ４７（ＡＹ０６４４８０．１）遺伝子、コムギＧＳＴ １９Ｅ５０（ＡＹ０６４４８１．１）、コムギＧＳＴ２８Ｅ４５（ＡＹ４７９７６４．１）、トウモロコシＺｍＧＳＴＩＶ、トウモロコシＺｍＧＳＴ６、トウモロコシＺｍＧＳＴ３１、トウモロコシＧＳＴＩ、トウモロコシＧＳＴＩＩＩ、トウモロコシＧＳＴＩＶ、トウモロコシＧＳＴ５またはトウモロコシＧＳＴ７の遺伝子コード領域である；
    （１３）一方の要素がイネの強力な内因性プロモーターであるか、または生物の強力なプロモーターから５’ＵＴＲまでの領域であり、他方がイネの遺伝子タンパク質ＧＩＦ１（Ｏｓ０４ｇ０４１３５００）、ＮＯＧ１（Ｏｓ０１ｇ０７５２２０）、ＬＡＩＲ（Ｏｓ０２ｇ０１５４１００）、ＯＳＡ１（Ｏｓ０３ｇ０６８９３００）、ＯｓＮＲＴ１．１Ａ（Ｏｓ０８ｇ０１５５４００）、ＯｓＮＲＴ２．３Ｂ（Ｏｓ０１ｇ０７０４１００）、ＯｓＲａｃ１（Ｏｓ０１ｇ０２２９４００）、ＯｓＮＲＴ２．１（Ｏｓ０２ｇ０１１２１００）、ＯｓＧＩＦ１（Ｏｓ０３ｇ０７３３６００）、ＯｓＮＡＣ９（Ｏｓ０３ｇ０８１５１００）、ＣＰＢ１／Ｄ１１／ＧＮＳ４（Ｏｓ０４ｇ０４６９８００）、ｍｉＲ１４３２（Ｏｓ０４ｇ０４３６１００）、ＯｓＮＬＰ４（Ｏｓ０９ｇ０５４９４５０）、ＲＡＧ２（Ｏｓ０７ｇ０２１４３００）、ＬＲＫ１（Ｏｓ０２ｇ０１５４２００）、ＯｓＮＨＸ１（Ｏｓ０７ｔ０６６６９００）、ＧＷ６（Ｏｓ０６ｇ０６２３７００）、ＷＧ７（Ｏｓ０７ｇ０６６９８００）、Ｄ１１／ＯｓＢＺＲ１（Ｏｓ０４ｇ０４６９８００、Ｏｓ０７ｇ０５８０５００）、ＯｓＡＡＰ６（Ｏｓ０７ｇ０１３４０００）、ＯｓＬＳＫ１（Ｏｓ０１ｇ０６６９１００）、ＩＰＡ１（Ｏｓ０８ｇ０５０９６００）、ＳＭＧ１１（Ｏｓ０１ｇ０１９７１００）、ＣＹＰ７２Ａ３１（Ｏｓ０１ｇ０６０２２００）、ＳＮＡＣ１（Ｏｓ０３ｇ０８１５１００）、ＺＢＥＤ（Ｏｓ０１ｇ０５４７２００）、ＯｓＳｔａ２（Ｏｓ０２ｇ０６５５２００）、ＯｓＡＳＲ５（Ｏｓ１１ｇ０１６７８００）、ＯｓＣＰＫ４（Ｏｓ０２ｇ０３４１０）、ＯｓＤｊＡ９（Ｏｓ０６ｇ０１１６８００）、ＥＵＩ（Ｏｓ０５ｇ０４８２４００）、ＪＭＪ７０５（Ｏｓ０１ｇ６７９７０）、ＷＲＫＹ４５（Ｏｓ０５ｔ０３２２９００）、ＯｓＲＳＲ１（Ｏｓ０５ｇ０１２１６００）、ＯｓＲＬＣＫ５（Ｏｓ０１ｇ０１１４１００）、ＡＰＩＰ４（Ｏｓ０１ｇ０１２４２００）、ＯｓＰＡＬ６（Ｏｓ０４ｔ０５１８４００）、ＯｓＰＡＬ８（Ｏｓ１１ｇ０７０８９００）、ＴＰＳ４６（Ｏｓ０８ｔ０１６８０００）、ＯｓＥＲＦ３（Ｏｓ０１ｇ５８４２０）およびＯｓＹＳＬ１５（Ｏｓ０２ｇ０６５０３００）のいずれか１つのコード領域である；
    （１４）一方の要素が魚の強力な内因性プロモーターであり、他方が選択された魚のＧＨ１（成長ホルモン１）の遺伝子コード領域である。
  12. 前記異なる遺伝要素（１）～（１４）の組み合わせのいずれか１つによって形成される新規遺伝子がそれぞれ下記の特性を有する、請求項１１に記載の方法により作製される新規遺伝子：
    （１）前記新規遺伝子の発現レベルが、前記植物の内因性の野生型ＨＰＰＤ、ＥＰＳＰＳ、ＰＰＯ、ＡＬＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＧＳ、ＰＤＳ、ＤＨＰＳ、ＤＸＰＳ、ＨＳＴ、ＳＰＳ、セルロース合成、ＶＬＣＦＡＳ、脂肪質酸チオエステラーゼ、セリンスレオニンプロテインホスファターゼ、またはリコペンシクラーゼ遺伝子と比較して上方制御されている；
    （２）前記新規遺伝子の発現レベルが、前記生物の対応する内因性の野生型Ｐ４５０遺伝子と比較して上方制御されている；
    （３）前記新規遺伝子の発現レベルが、それぞれイネの内因性のＯｓＣＹＰ８１Ａ６遺伝子またはトウモロコシの内因性のＺｍＣＹＰ８１Ａ９遺伝子と比較して上方制御されている；
    （４）前記新規遺伝子の発現レベルが、それぞれ前記植物の内因性の野生型ＺＭＭ２８遺伝子、ＺｍＫＮＲ６遺伝子またはＺｍＢＡＭ１ｄ遺伝子と比較して上方制御されている；
    （５）前記新規遺伝子の発現レベルが、それぞれ前記イネの内因性の野生型ＣＯＬＤ１遺伝子またはＯｓＣＰＫ２４と比較して上方制御されている；
    （６）前記新規遺伝子の発現レベルが、前記生物の対応する内因性の野生型ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター遺伝子と比較して上方制御されている；
    （７）前記新規遺伝子の発現レベルが、対応する植物の内因性の野生型ＮＡＣ転写因子ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている；
    （８）前記新規遺伝子発現のレベルが、それぞれ対応する前記植物の内因性の野生型ＭＹＢ転写因子遺伝子、ＭＡＤＳ転写因子ファミリー遺伝子、ＤＲＥＢ転写因子ファミリー遺伝子コード領域またはｂＺＩＰ転写因子ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている；
    （９）前記新規遺伝子の発現パターンが、前記イネの内因性の遺伝子の選択されたタンパク質コード領域または非コードＲＮＡ領域と比較して変化している；
    （１０）前記新規遺伝子の発現パターンが、選択された機能遺伝子と比較して変化している；
    （１１）前記新規遺伝子発現のレベルが、前記生物の対応する内因性のＧＳＴ（グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ）ファミリー遺伝子と比較して上方制御されている；
    （１２）前記新規遺伝子発現のレベルが、それぞれ内因性のコムギＧＳＴ Ｃｌａ４７（ＡＹ０６４４８０．１）遺伝子、コムギＧＳＴ １９Ｅ５０（ＡＹ０６４４８１．１）遺伝子、コムギＧＳＴ２８Ｅ４５（ＡＹ４７９７６４．１）遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ６遺伝子、トウモロコシＺｍＧＳＴ３１遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＩＩ遺伝子、トウモロコシＧＳＴＩＶ遺伝子、トウモロコシＧＳＴ５遺伝子またはトウモロコシＧＳＴ７遺伝子と比較して上方制御されている；
    （１３）前記新規遺伝子発現のレベルが、対応する内因性の遺伝子と比較して上方制御されている；
    （１４）前記新規遺伝子が、魚の内因性の高発現ＧＨ１遺伝子である。
  13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって得られる新規遺伝子の、動物および植物の育種の分野における使用。
  14. 請求項１２に記載の新規遺伝子の、下記のそれぞれの側面における使用：
    （１）植物細胞、植物組織、植物部分または植物における対応するＨＰＰＤの阻害、ＥＰＳＰＳの阻害、ＰＰＯの阻害、ＡＬＳの阻害、ＡＣＣａｓｅの阻害、ＧＳの阻害、ＰＤＳの阻害、ＤＨＰＳの阻害、ＤＸＰＳの阻害、ＨＳＴの阻害、ＳＰＳの阻害、セルロース合成の阻害、ＶＬＣＦＡＳの阻害、脂肪酸チオエステラーゼの阻害、セリンスレオニンプロテインホスファターゼの阻害、またはリコペンシクラーゼ除草剤の阻害に対する抵抗性または耐性の改善の側面；
    （２）生物学的解毒能力、ストレス耐性または二次代謝能力の増強の側面；
    （３）除草剤に対するイネまたはトウモロコシの抵抗性または耐性の改善の側面；
    （４）トウモロコシの収量の向上の側面；
    （５）イネの耐寒性の向上の側面；
    （６）生物学的解毒能力またはストレス耐性の増強の側面；
    （７）植物のストレス耐性または植物収量の向上の側面；
    （８）植物のストレス耐性の増強または植物の成長および発達の調節の側面；
    （９）イネの成長および発達の調節の側面；
    （１０）生物の成長および発達の調節の側面；
    （１１）生物学的解毒能力またはストレス耐性の増強の側面；
    （１２）除草剤に対するコムギまたはトウモロコシの抵抗性または耐性の改善の側面；
    （１３）イネの育種の側面；
    （１４）魚の育種の側面。
  15. 前記異なるタンパク質ドメインの組み合わせが下記のいずれかから選択される、請求項１に記載の方法：
    （ａ）一方の要素がコムギの内因性のタンパク質の葉緑体局在化シグナルドメインであり、他方が細胞質局在化ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩｃ）のコムギ成熟タンパク質コード領域である；
    （ｂ）一方の要素がイネのタンパク質葉緑体局在化シグナルドメイン（ＣＴＰ）であり、他方がＯｓＧＬＯ３、ＯｓＯＸＯ３またはＯｓＣＡＴＣの成熟タンパク質コード領域である。
  16. 請求項１５に記載の方法により作製される新規遺伝子であって、前記異なるタンパク質ドメイン（ａ）～（ｂ）のいずれかの組み合わせにより形成される前記新規遺伝子が、それぞれ下記の特性を有する、前記新規遺伝子：
    （ａ）前記新規遺伝子が、コーディング細胞質と関連してホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子の位置を特定し、その成熟タンパク質が葉緑体に位置する；
    （ｂ）前記新規遺伝子の成熟タンパク質が、ＯｓＧＬＯ３、ＯｓＯＸＯ３またはＯｓＣＡＴＣとは異なる葉緑体に位置する。
  17. 請求項１６に記載の新規遺伝子の、下記のそれぞれの側面における使用：
    （ａ）コムギの収量の向上の側面；
    （ｂ）イネの光合成効率の向上の側面。
  18. 葉緑体局在化タンパク質ＯｓＣＡＣＴであって、該タンパク質をコードするヌクレオチドが：
    （１）配列番号２８に示される核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記葉緑体局在化タンパク質ＯｓＣＡＣＴ。
  19. 葉緑体局在化タンパク質ＯｓＧＬＯ３であって、該タンパク質をコードするヌクレオチドが
    （１）配列番号２９に示される核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記葉緑体局在化タンパク質ＯｓＧＬＯ３。
  20. イネの光合成効率の向上における、請求項１８または１９に記載のタンパク質の使用。
  21. 外来性ＤＮＡドナー断片と独立して、生物における標的内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを調節するための編集方法であって、下記の工程：
    プロモーターと、標的内因性遺伝子および所望の発現パターンを有する任意の内因性誘導性発現遺伝子または組織特異的発現遺伝子のコード領域との間の選択された部位で別々に同時にＤＮＡ切断を生成する工程；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同修復によりＤＮＡ切断を互いに連結し、それによって前記標的内因性遺伝子のコード領域と前記任意の誘導性または組織特異的発現プロモーターとのｉｎ ｖｉｖｏ融合を生成して、予想される発現パターンを有する新規遺伝子を形成する工程であって、前記標的内因性遺伝子、および所望の発現パターンを有する任意の内因性誘導発現遺伝子または組織特異的発現遺伝子が、同一の染色体上または異なる染色体上に位置する前記工程
    を含み；好ましくは、前記標的内因性遺伝子は酵母ＥＲＧ９遺伝子であり、前記内因性誘導発現遺伝子はＨＸＴ１遺伝子であり、前記誘導性発現プロモーターはグルコース濃度に応答するＨＸＴ１である、前記編集方法。
  22. 請求項２１に記載の編集方法により得られる、酵母内因性誘導型ＥＲＧ９遺伝子。
  23. 請求項２２に記載の合成生物学における、酵母内因性誘導性ＥＲＧ９遺伝子の使用。
  24. 高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子であって：
    （１）配列番号２７に示される核酸配列またはその一部もしくはその相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子。
  25. 高発現イネ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
    （１）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６もしくは配列番号４７に示される核酸配列、またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネ内因性ＰＰＯ２遺伝子。
  26. 高発現トウモロコシ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
    （１）配列番号４８もしくは配列番号４９に示される核酸配列、またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現トウモロコシ内因性ＰＰＯ２遺伝子。
  27. 高発現コムギ内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
    （１）配列番号５０、配列番号５、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６に示される核酸配列、またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現コムギ内因性ＰＰＯ２遺伝子。
  28. 高発現アブラナの内因性ＰＰＯ２遺伝子であって：
    （１）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０もしくは配列番号６１に示される核酸配列、またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現アブラナの内因性ＰＰＯ２遺伝子。
  29. 植物細胞、植物組織、植物部分または植物における対応する阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性の改善における、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の遺伝子の使用。
  30. 請求項１２または請求項２４～２８のいずれか一項に記載の遺伝子（１）、（３）または（１２）を含む植物細胞から再生される、植物またはその後代。
  31. 除草剤に対する抵抗性または耐性が増大した植物の製造方法であって、請求項１２または請求項２４～２８のいずれか一項に記載の遺伝子（１）、（３）または（１２）を含む植物細胞を植物またはその後代において再生することをを含み；好ましくは、前記除草剤に対する抵抗性または耐性が増大した植物が、植物宿主細胞から再生される植物と野生型植物とを交配して、遺伝子分離を通じて外因性トランスジェニック因子を除去することにより得られる非トランスジェニック株である、前記製造方法。
  32. 請求項１２に記載のイネ新規遺伝子（３）、請求項２４に記載の高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子、および請求項２５に記載の高発現イネ内因性ＨＰＰＤ遺伝子の１種または２種以上の組み合わせを含む、除草剤耐性のイネであって；好ましくは、非トランスジェニックである、前記イネ。
  33. 請求項１２に記載のトウモロコシ新規遺伝子（３）、請求項１２に記載のコムギまたはトウモロコシ新規遺伝子（１２）、請求項２６に記載のトウモロコシ高発現ＰＰＯ２遺伝子、請求項２７に記載のコムギ高発現ＰＰＯ２遺伝子、および請求項２８に記載の高発現アブラナＰＰＯ２遺伝子の１種または２種以上の組み合わせを含む、除草剤耐性のトウモロコシ、コムギまたはアブラナであって；好ましくは、非トランスジェニックである前記トウモロコシ、コムギまたはアブラナは。
  34. 植物の栽培場所における雑草を防除するための方法であって、前記植物が、請求項３１に記載の方法によって調製される植物からなる群から選択され、前記栽培場所に、１つ以上または複数の対応する抑制性除草剤を、前記雑草を効果的に防除する量で適用することを含む、前記方法。
  35. 前記除草剤が、ＨＰＰＤの阻害、ＥＰＳＰＳの阻害、ＰＰＯの阻害、ＡＬＳの阻害、ＡＣＣａｓｅの阻害、ＧＳの阻害、ＰＤＳの阻害、ＤＨＰＳの阻害、ＤＸＰＳの阻害、ＨＳＴの阻害、ＳＰＳの阻害、セルロース合成の阻害、ＶＬＣＦＡＳの阻害、脂肪酸チオエステラーゼの阻害、セリンスレオニンプロテインホスファターゼの阻害またはリコピンシクラーゼ除草剤の阻害の１種または２種以上の組み合わせを含む、請求項１４または２９に記載の使用、請求項３１または３４に記載の方法。
  36. 植物における内因性のＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子のコード領域と植物の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて、それぞれ新規の高発現植物内因性ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子を形成すること；好ましくは下記の工程：プロモーターと、前記ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を相互に連結する工程、前記ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合をｉｎ ｖｉｖｏで生成して新規高発現ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子を形成する工程を含む、前記編集方法。。
  37. 請求項３６に記載の編集方法により得られる、高発現植物内因性ＷＡＫ遺伝子またはＣＮＧＣ遺伝子。
  38. 高発現イネＷＡＫ遺伝子であって：
    （１）配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７もしくは配列番号６８に示される核酸配列、またはそれらの一部またはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネＷＡＫ遺伝子。
  39. 高発現イネＣＮＧＣ遺伝子であって：
    （１）配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１もしくは配列番号７２に示される核酸配列、またはそれらの一部もしくはそれらの相補配列；
    （２）（１）で規定される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列；または
    （３）（１）または（２）に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸配列
    からなる群から選択される配列を有する、前記高発現イネＣＮＧＣ遺伝子。
  40. イネにおけるいもち病に対する抵抗性の付与または改善における、請求項３８または３９に記載の遺伝子の使用。
  41. 請求項３８に記載のイネ高発現ＷＡＫ遺伝子および請求項３９に記載の高発現イネＣＮＧＣ遺伝子のいずれか１種または２種以上の組み合わせを含む、イネいもち病抵抗性のイネであって；好ましくは、非トランスジェニックである、前記イネ。
  42. 魚類における内因性ＧＨ１遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＧＨ１遺伝子のコード領域と魚類の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子を形成すること；好ましくは下記の工程：プロモーターと、前記ＧＨ１遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を相互に連結する工程、前記ＧＨ１遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合体をｉｎ ｖｉｖｏで生成して、新規高発現ＧＨ１遺伝子を形成する工程を含み；前記強力なプロモーターは、好ましくは、対応する魚類ＣｏｌＩＡ１ａ（Ｉ型コラーゲンα１ａ）遺伝子プロモーター、ＲＰＳ１５Ａ（リボソームタンパク質Ｓ１５ａ）遺伝子プロモーター、アクチンプロモーターまたはＤＤＸ５［ＤＥＡＤ（Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ）ボックスヘリカーゼ５］遺伝子プロモーターである、前記編集方法。
  43. ブタにおける内因性ＩＧＦ２（インスリン様増殖因子２）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＩＧＦ２遺伝子のコード領域とブタの強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子を形成すること；好ましくは、下記の工程：プロモーターと、前記ＩＧＦ２遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を相互に連結する工程、前記ＩＧＦ２遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合体をｉｎ ｖｉｖｏで生成して、新規高発現ＩＧＦ２遺伝子を形成する工程を含み；前記強力なプロモーターは、好ましくはブタＴＮＮＩ２遺伝子プロモーターおよびＴＮＮＴ３遺伝子プロモーターのうちの１種である、前記編集方法。
  44. ニワトリ胚線維芽細胞における内因性ＩＧＦ１（インスリン様増殖因子１）遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＩＧＦ１遺伝子のコード領域とニワトリの強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現ニワトリ内因性ＩＧＦ１遺伝子を形成すること；好ましくは、下記の工程：プロモーターと、前記ＩＧＦ１遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を相互に連結する工程、前記ＩＧＦ１遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合体をｉｎ ｖｉｖｏで生成して、新規高発現ＩＧＦ１遺伝子を形成する工程を含み；前記強力なプロモーターは、好ましくはニワトリＭＹＢＰＣ１（ミオシン結合プロテインＣ）遺伝子プロモーターである、前記編集方法。
  45. 請求項４２、４３または４４に記載の編集方法により得られる、高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子、高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子、または高発現ニワトリ内因性高発現ＩＧＦ１遺伝子。
  46. 請求項４５に記載の高発現魚類内因性ＧＨ１遺伝子、高発現ブタ内因性ＩＧＦ２遺伝子または高発現ニワトリ内因性ＩＧＦ１遺伝子の、それぞれ対応する生物学的育種における使用。
  47. 動物細胞における内因性ＥＰＯ（エリスロポエチン）遺伝子またはｐ５３遺伝子の発現をノックアップするための編集方法であって、前記ＥＰＯまたはｐ５３遺伝子のコード領域と動物の強力な内因性プロモーターとをｉｎ ｖｉｖｏで融合させて新規の高発現内因性ＥＰＯまたはｐ５３遺伝子を形成すること；好ましくは、下記の工程：プロモーターと、前記ＥＰＯまたはｐ５３遺伝子および任意の内因性高発現遺伝子のそれぞれのコード領域との間の選択された特異的部位にそれぞれＤＮＡ切断を同時に生成する工程、細胞内修復経路により前記ＤＮＡ切断を相互に連結する工程、前記ＥＰＯまたはｐ５３遺伝子のコード領域と任意の強力な内因性プロモーターとの融合体をｉｎ ｖｉｖｏで生成して、新規高発現ＥＰＯまたはｐ５３遺伝子を形成する工程を含む、前記編集方法。
  48. 請求項４７に記載の編集方法により得られる、高発現動物内因性ＥＰＯ遺伝子またはｐ５３遺伝子。
  49. 動物育種における請求項４８に記載の高発現動物内因性ＥＰＯ遺伝子の使用、または動物育種もしくは癌予防における請求項４８に記載の高発現動物内因性ｐ５３遺伝子の使用。
  50. 前記ＤＮＡ切断が、ターゲティング特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞内に送達してゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成され；好ましくは、前記ターゲティング特性を有するヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムまたはＣａｓ１２ヌクレアーゼシステム等）からなる群から選択され；より好ましくは、前記ターゲティング特性を有するヌクレアーゼは、ＤＮＡの形態、またはＤＮＡではなくｍＲＮＡもしくはタンパク質の形態で存在する、請求項１～１１、２１、３６、４２～４４および４７のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ターゲティング特性を有するヌクレアーゼが：１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）電気ショック形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃法；６）アグロバクテリウム媒介形質転換法；７）ウイルスベクター媒介形質転換法；または８）ナノ磁気ビーズ媒介形質転換によって細胞内に送達される、請求項５０に記載の方法。
  52. 請求項１２、１６、２２、２４～２８、３７～３９、４５および４８のいずれか一項に記載の遺伝子を含む、ＤＮＡ。
  53. 請求項１２、１６、２２、２４～２８、３７～３９、４５および４８のいずれか一項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片。
  54. 請求項１２、１６、２２、２４～２８、３７～３９、４５および４８のいずれか一項に記載の遺伝子、およびそれらに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換え発現ベクター。
  55. 請求項１２、１６、２２、２４～２８、３７～３９、４５および４８のいずれか一項に記載の遺伝子を含む、発現カセット。
  56. 請求項５５に記載の発現カセットを含む宿主細胞であって；好ましくは、植物細胞、動物細胞または真菌細胞である、前記宿主細胞。
  57. 請求項５６に記載の宿主細胞から再生される、生物。
  58. （ａ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方の遺伝子のプロモーター、および他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域；
    （ｂ）異なる発現パターンを有する２つの遺伝子の一方の遺伝子の５’非翻訳領域のプロモーター、および他方の遺伝子のコード領域または非コードＲＮＡ領域；
    （ｃ）異なる細胞内局在を有する２つのタンパク質コード遺伝子の一方の局在シグナル領域、および他方の遺伝子の成熟タンパク質コード領域、
    （ｄ）２つの異なる機能的タンパク質コード遺伝子に由来する２つの異なる機能ドメインをコードするＤＮＡ領域；
    を含む組成物であって、
    前記遺伝要素の組み合わせは、天然には存在せず、設計どおり安定に継承されるに結合した染色体セグメントであり；
    好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで融合され；より好ましくは、前記異なる発現パターンは、異なる遺伝子発現レベル、異なる組織特異的な遺伝子発現、または異なる発生段階特異的な遺伝子発現であるか；または、前記異なる細胞内位置は、核の位置、細胞質の位置、細胞膜の位置、葉緑体の位置、ミトコンドリアの位置、小胞体膜の位置、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、または、異なる生物学的機能は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡの保存配列の認識、遺伝子発現の活性化、タンパク質リガンドへの結合、小分子シグナルへの結合、イオンへの結合、特定の酵素反応、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
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