CN108440672B

CN108440672B - 一条光呼吸代谢改造支路及其在c3植物中的应用

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Publication number: CN108440672B
Application number: CN201810203402.XA
Authority: CN
Inventors: 彭新湘; 沈博然; 张建军
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108440672A

Abstract

本发明公开一条光呼吸代谢改造支路及其在C3植物中的应用，涉及植物基因工技术程领域。该支路包括OsGLO3、OsCAT2与OsOXO3三个蛋白。将该支路对C3植物光呼吸进行改造，从而降低光呼吸，提高光合效率，进而提高植物生物量。实验结果表明，转GOC光呼吸代谢改造支路植株表现为光合速率提高、生物量增加、叶绿素增加。该发明对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少CO₂排放均具有深远意义，在实际应用中可以将GOC光呼吸代谢改造支路转入不同的C3植物中以培育更加高产想的品种。

Description

一条光呼吸代谢改造支路及其在C3植物中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工技术程领域，具体涉及一条光呼吸代谢改造支路及其相关基因与该支路在C3植物中的应用。

背景技术

光呼吸又称为C2循环，是指植物绿色组织利用光能，吸收O₂并放出CO₂的过程，光呼吸需要叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和细胞质的共同参与，并依赖光和O₂，两者缺一不可(Bauwe H,Hagemann M,Fernie A R.Photorespiration:players,partners and origin[J].Trends in Plant Science,2010,15(6):330-336)。光呼吸是C3植物中仅次于光合作用的第二大代谢流，正常环境条件下，C3植物光呼吸可消耗其光合产物的25～30％，而高温、干旱、高光等逆境条件下这种损耗会更为严重(Leegood R C,Lea P J,Adcock M D,etal..The regulation and control of photorespiration.Journal of ExperimentalBotany,1995,46(290):1397-1414；Somerville C R.An early Arabidopsisdemonstration.Resolving a few issues concerning photorespiration.PlantPhysiology,2001,125(1):20-24)。高光呼吸不但会降低植物光合效率，而且其释放的CO₂对大气的碳排放的贡献也不容小觑；据估测，植物呼吸作用每年能向大气排放30Gt左右的碳，其中大部分来自光呼吸(Guillaume T.Is the recovery of(photo)respiratoryCO₂and intermediates minimal？.Neurosurgery,2013,198(2):334-338)。针对如何降低C3植物高呼吸，提高光能转化效率，科学家们已做了大量的研究探索，例如尝试提高Rubisco的羧化/加氧比或将C4光合机理导入C3植物，然而，局限于技术和理论基础，这两方面至今尚未获得预期效果(Zhu X G,Long S P,Ort D R.Improving photosyntheticefficiency for greater yield.Annual Review of Plant Biology,2010,61(4):235-261；Von C S,Quick W P,Furbank R T.The development of C4rice:current progressand future challenges.Science,2012,336(6089):1671-1672)。

近年来，通过在C3植物叶绿体中构建光呼吸代谢支路从而创建CO₂浓缩机制(CCMs)已成为研究的热点。2007年，Kebeish等人将大肠杆菌中代谢乙醇酸的3个酶(GDH、GCL、TSR)导入拟南芥并定位到叶绿体中，在叶绿体中形成了一条分流乙醇酸形成甘油酸同时释放CO₂的光呼吸捷径，这样不但能节省能量，还能提高叶绿体中Rubisco周围的CO₂浓度，形成新的光合CO₂浓缩机制，从理论分析判断可以显著提高植物光合效率进而提高生物量。他们随后对转基因植株的分析结果显示，相对于野生型，转基因植株的光合效率和生物量确实得到了显著提升(Kebeish R,Niessen M,Thiruveedhi K,et al..Chloroplasticphotorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production inArabidopsis thaliana.Nature Biotechnology,2007,25(5):593-599)。在这以后，Maier等(2012)尝试将植物中的乙醇酸氧化酶(GLO)、过氧化氢酶(CAT)、苹果酸合酶(MS)等基因导入拟南芥并定位到叶绿体中，转基因植株的分析结果显示，虽然其光合功能指标无明显改善，但生物量却有一定提升(Maier A,Fahnenstich H,von Caemmerer S,etal..Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A.thalianaChloroplasts Leads to Growth Improvement.Frontiers in Plant Science,2012,3:38)；2015年，Dalal等人成功在生物能源作物亚麻荠中重复了Kebeish等人的结果，获得了油籽产量提高了57～73％的亚麻荠植株(Dalal J,Lopez H,Vasani N B,et al..Aphotorespiratory bypass increases plant growth and seed yield in biofuel cropCamelina sativa[J].Biotechnology for Biofuels,2015,8(1):175.)。研究者认为，Kebeish等人的光呼吸代谢改造支路最为成功，有望应用于实际生产(Peterhansel C,Maurino V G.Photorespiration redesigned.Plant Physiology,2011,155(1):49-55)。然而，目前尚未有对粮食作物光呼吸进行代谢的报道，同时，新的更为高效的光呼吸代谢改造支路还有待进一步发掘。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一条光呼吸代谢改造支路(GOC支路)，对C3植物光呼吸进行改造，从而降低光呼吸，提高光合效率，进而提高植物生物量。

本发明提供了一条新的光呼吸代谢改造支路，并证实可在粮食作物水稻中应用，获得了光合速率提高、生物量增加的水稻转基因株系，对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少CO₂排放均具有深远意义。

本发明的另一目的是提供构成上述光呼吸代谢改造支路的三个融合蛋白TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3和TPC-OsCATC。

本发明的又一目的是提供上述融合蛋白TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3和TPC-OsCATC的编码基因。

本发明的又一目的是提供用于表达上述融合蛋白TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3和TPC-OsCATC的编码基因的表达盒序列。

本发明的再一目的在于提供上述光呼吸代谢改造支路、融合蛋白、编码基因或表达盒序列在制备转基因植物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一条GOC光呼吸代谢改造支路，该支路包括OsGLO3、OsCAT2与OsOXO3三个蛋白。

构成上述GOC光呼吸代谢改造支路的三个融合蛋白，包括TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3和TPC-OsCATC；

为了将上述三个蛋白定位于植物叶绿体，在上述蛋白的N端融合水稻叶绿体信号肽TPC，从而组成TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3与TPC-OsCATC融合蛋白。

TPC-OsGLO3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与SEQ ID NO:3所示序列相同的序列。

上述TPC-OsGLO3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO:1所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:1杂交并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次，或者与SEQ ID NO:1的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子。

上述TPC-OsGLO3融合蛋白编码基因的表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos。该表达盒基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:2杂交的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次，或者与SEQ ID NO:2的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

TPC-OsOXO3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与SEQ ID NO:6所示序列相同的序列。

上述TPC-OsOXO3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO:4所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:4杂交并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO:4的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述TPC-OsOXO3融合蛋白的DNA分子。

上述TPC-OsOXO3融合蛋白编码基因的表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s。该表达盒的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:5杂交的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO:5的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

TPC-OsCATC融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与SEQ ID NO:9所示序列相同的序列。

上述TPC-OsCATC融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO:7所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:7杂交并且编码上述TPC-OsCATC融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO:7的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述TPC-OsCATC融合蛋白的DNA分子。

上述TPC-OsCATC融合蛋白编码基因的表达盒Pubi-TPC-OsCATC-Tnos。该表达盒的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:8杂交的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO:8的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)的序列。

一种能够将GOC光呼吸代谢改造支路引入植物的表达载体，是由上述TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3及TPC-OsCATC融合蛋白的编码基因表达盒通过插入多克隆位点或通过重组构建而成。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。

以上所述任意一种表达载体，所述的表达载体优选为pYL1305、pYLTAC380GW或其他衍生植物表达载体。

所述GOC光呼吸代谢改造支路在制备转基因C3植物中的应用。

所述GOC光呼吸代谢改造支路在制备提高C3植物光合效率与生物量中的应用。

携带有本发明的GOC光呼吸代谢改造表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

一种对水稻光呼吸代谢进行改造的方法，GOC光呼吸代谢改造支路相关基因转化水稻愈伤组织细胞，再将转化后的水稻愈伤组织细胞培育成植株。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

实验结果表明，转GOC光呼吸代谢改造支路植株表现为光合速率提高、生物量增加、叶绿素增加。该发明对深入阐明高光效机理、对作物与可再生能源生产、甚至对减少CO₂排放均具有深远意义，在实际应用中可以将GOC光呼吸代谢改造支路转入不同的C3植物中以培育更加高产想的品种。

附图说明

图1是DI载体核心部分；其中，LoxP、1L、2R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；MCS：多克隆位点。

图2是Pubi-DI载体核心部分；其中，LoxP、1L、2R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；pUbi：玉米泛素基因启动子；Tnos：nos终止子；MCS：多克隆位点。

图3是2×P35s-DII载体核心部分；其中，LoxP、2L、1R为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；2×P35s：花椰菜花叶病毒35S增强型启动子；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；MCS：多克隆位点。

图4是pYL1305载体核心部分；其中，LoxP、A2为重组位点；I-Sce I为归为内切酶位点；HPT，潮霉素抗性基因；LB，左边界；RB，右边界。

图5是GOC-pYL1305载体核心部分；其中，LoxP、1L、2RL为重组位点；I-Sce I和PI-Sce I为归位内切酶位点；pUbi：玉米泛素基因启动子；Tnos：nos终止子；2×P35s：花椰菜花叶病毒35S增强型启动子；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；MCS：多克隆位点；HPT，潮霉素抗性基因；LB，左边界；RB，右边界。

图6是转基因植株的阳性检测；其中，CK+：阳性对照；WT：野生型水稻；1到6为T0代转化苗。

图7是半定量PCR分析转基因植株中GOC光呼吸代谢改造支路基因的表达；其中，WT：野生型；GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3：GOC-pYL1305转基因株系；β-actin为内参基因，扩增循环数为27。

图8是GOC-pYL1305转基因植株在灌浆期表型观察；其中，WT：野生型；GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3：GOC-pYL1305转基因株系。

图9是GOC-pYL1305转基因植株的净光合速率测定；其中，WT：野生型；GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3：GOC-pYL1305转基因株系。

图10是GOC-pYL1305转基因植株地上部分生物量测定；其中，WT：野生型；GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3：GOC-pYL1305转基因株系。

图11是GOC-pYL1305转基因植株叶片叶绿素含量测定；其中，WT：野生型；GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3：GOC-pYL1305转基因株系。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例中所用的材料：粳稻品种中花11号为常规市售产品。

Pubi-DI，对载体pYL322d1(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Zhu,Q.,Yu,S.,etal.Development of"Purple Endosperm Rice"by Engineering AnthocyaninBiosynthesis in the Endosperm with a High-Efficiency Transgene StackingSystem.Molecular plant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为首先利用常规的分子克隆手段对pYL322d1的多克隆位点的两个NotI间进行改造，改造后的载体命名为DI，载体图谱见图1。然后利用常规的分子克隆手段在DI的多克隆位点内的XbaI与PstI之间插入Pubi启动子序列及BamHI与SmaI之间插入Tnos终止子序列，载体图谱见图2。其中，Pubi启动子序列和Tnos终止子序列来源于载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Ma,X.,Zhang,Q.,et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Molecularplant 2015,8:1274-1284)。

2×P35s-DII，对载体pYL322d2(由华南农业大学刘耀光研究员提供，Zhu,Q.,Yu,S.,et al.Development of"Purple Endosperm Rice"by Engineering AnthocyaninBiosynthesis in the Endosperm with a High-Efficiency Transgene StackingSystem.Molecular plant,2017,10(7):918-929)改造获得。改造方法为利用常规的分子克隆手段在载体pYL322d2的多克隆位点内的EcoRI与XhoI之间插入2×P35s启动子序列及SalI与Hind III之间插入T35S终止子序列，载体图谱见图3。其中，2×P35s启动子序列和T35S终止子序列来源于载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(由华南农业大学刘耀光研究员提供)。

pYL1305，由华南农业大学刘耀光研究员提供。该载体由商业载体pCAMBIA1305.1改造而得，改造方法为利用常规分子克隆手段在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点区的PstI单酶切插入loxP/Cre同源重组序列，载体图谱见图4。其中，loxP/Cre同源重组序列来源于载体pYLTAC380GW。pYLTAC380GW在文献“Zhu,Q.,Yu,S.,et al.Development of"PurpleEndosperm Rice"by Engineering Anthocyanin Biosynthesis in the Endosperm witha High-Efficiency Transgene Stacking System.Molecular plant,2007,10(7):918-929”中公开。

实施例1 TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3、TPC-OsCATC融合蛋白表达基因的获得

(1)TPC-OsGLO3融合蛋白表达基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsGLO3和TPC的cDNA序列设计引物，引物序列如下：

OsGLO3-F：5′-catgagatctatggagctaatcacaaac-3′(下划线为限制性内切酶BglII识别位点)。

OsGLO3-R：5′-ttaatggtgatggtgatgatgcctgtcgctgtcggtgat-3′(下划线部分为HIS标签序列)。

TPC-1F：5′-ATGGCCCCCTCCGTGATG-3′；

TPC-1R：5′-ctacagatctcatgcacctgatcctgcc-3′(下划线为限制性内切酶BglII识别位点)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsGLO3-F和OsGLO3-R，引物TPC-1F和TPC-1R的引导下，用常规方法分别扩增OsGLO3与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化OsGLO3(约1100bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过BglII酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与OsGLO3-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-OsGLO3的DNA片段(约1300bp)，将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-TPC-OsGLO3载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示；编码序列表中SEQ ID NO:3所示的蛋白。

(2)TPC-OsOXO3融合蛋白表达基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsOXO3和TPC的cDNA序列设计引物，引物序列如下：

OsOXO3-F：5′-catgggtaccatggagtacggcttcaaa-3′(下划线为限制性内切酶KpnI识别位点)。

OsOXO3-R：5′-ATCCTTAGTACCCGCCGGTGAA-3′；

TPC-2R：5′-ctacggtacccatgcacctgatcctgcc-3′(下划线为限制性内切酶KpnI识别位点)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsOXO3-F和OsOXO3-R，引物TPC-1F和TPC-2R的引导下，用常规方法分别扩增OsOXO3与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化OsOXO3(约700bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过KpnI酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与OsOXO3-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-OsOXO3的DNA片段(约900bp)，将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-TPC-OsOXO3载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列SEQ ID NO:4所示；编码序列表中SEQ ID NO:6所示的蛋白。

(3)TPC-OsCATC融合蛋白表达基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsCATC的cDNA序列设计引物，引物序列如下：

OsCATC-F：5′-catgggtaccatggatccctacaagcat-3′(下划线为限制性内切酶KpnI识别位点)。

OsCATC-R：5′-ttaatggtgatggtgatgatgcatgctcggcttcgcgctgag-3′(下划线部分为HIS标签序列)。

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsCATC-F和OsCATC-R，引物TPC-1F和TPC-2R的引导下，用常规方法分别扩增OsCATC与TPC基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化OsCATC(约1500bp)与TPC(约150bp)的DNA片段；将上述回收片段经过KpnI酶切消耗后，用T4连接酶连接，并作为模板，在引物TPC-1F与OsCATC-R的引导下，进行第二轮PCR扩增。反应结束后，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化TPC-OsCATC的DNA片段(约1700bp)，将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-TPC-OsCATC载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列如SEQ ID NO:7所示；编码序列表中SEQ ID NO:9所示的蛋白。

实施例2 TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3、TPC-OsCATC融合蛋白表达盒序列的获得

(1)TPC-OsGLO3融合蛋白表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos的获得

根据TPC-OsGLO3融合蛋白表达基因序列(SEQ ID NO:1)设计引物，引物序列如下：

TPC-OsGLO3-F：5′-gactctgcagatggccccctccgtgatg-3′(下划线为PstI识别位点)。

TPC-OsGLO3-R：5′-cagtggatccctaatggtgatggtgatgatg-3′(下划线为BamHI识别位点)。

以实施例1中所述pMD18-TPC-OsGLO3载体为模板，在引物TPC-OsGLO3-F和TPC-OsGLO3的引导下，用常规方法扩增TPC-OsGLO3基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体Pubi-DI(载体图谱见图2)多克隆位点的PstI和BamHI酶切位点之间，得到载体Pubi-DI-TPC-OsGLO3。

根据Pubi-DI载体上的Pubi启动子序列和Tnos终止子序列设计引物，引物序列如下：

Pubi-F：5′-GAATTCGTCGTGCCCCTCTC-3′；

Tnos-R：5′-CCCGATCTAGTAACATAGAT-3′；

以上述Pubi-DI-TPC-OsGLO3载体为模板，在引物Pubi-F和Tnos-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsGLO3基因表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18--Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

(2)TPC-OsOXO3融合蛋白表达表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s的获得

根据TPC-OsOXO3融合蛋白表达基因序列(SEQ ID NO:4)设计引物，引物序列如下：

TPC-OsOXO3-F：5′-ataggaattcatggccccctccgtgatg-3′(下划线为EcoRI识别位点)。

TPC-OsOXO3-R：5′-ccatggatccttagtacccgccggtgaa-3′(下划线为BamHI识别位点)。

以实施例1中所述pMD18-TPC-OsOXO3载体为模板，在引物TPC-OsOXO3-F和TPC-OsOXO3-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsOXO3基因，电泳回收后将该基因克隆入植物瞬时表达载体2×P35s-DII(载体图谱见图3)多克隆位点的EcoRI和BamHI酶切位点之间，得到载体2×P35s-DII-TPC-OsOXO3。

根据2×P35s-DII载体上的2×P35s启动子序列和T35s终止子序列设计引物，引物序列如下：2×P35s-F：5′-GAATTCGTCGTGCCCCTCTC-3′；

T35s-R：5′-CCCGATCTAGTAACATAGAT-3′；

以上述2×P35s-DII-TPC-OsOXO3载体为模板，在引物2×P35s-F和T35s-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsOXO3基因表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18-2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列如SEQ ID NO:5所示。

(3)TPC-OsCATC融合蛋白表达表达盒Pubi-TPC-OsCATC-Tnos的获得

根据TPC-OsCATC融合蛋白表达基因序列(SEQ ID NO:7)设计引物，引物序列如下：

TPC-OsCATC-F：5′-gtacaagcttatggccccctccgtgatg-3′(下划线为HindIII识别位点)。

TPC-OsCATC-R：5′-gatcactagtttaatggtgatggtgatg-3′(下划线为SpeI识别位点)。

以实施例1中所述pMD18-TPC-OsCATC载体为模板，在引物TPC-OsCATC-F和TPC-OsCATC-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsCATC基因，电泳回收后将该基因克隆入重组供体载体Pubi-DI(载体图谱见图2)多克隆位点的HindIII和SpeI酶切位点之间，得到载体Pubi-DI-TPC-OsCATC。

以上述Pubi-DI-TPC-OsCATC载体为模板，在上述引物Pubi-F和Tnos-R的引导下，用常规方法扩增TPC-OsCATC基因表达盒Pubi-TPC-OsCATC-Tnos，电泳回收后将该表达盒克隆入pMD18-T载体得到载体pMD18--Pubi-TPC-OsCATC-Tnos。送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，DNA片段的序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例3 GOC光呼吸代谢支路改造载体GOC-pYL1305的获得

以Pubi-DI-TPC-OsGLO3、2×P35s-DII-TPC-OsOXO3和Pubi-DI-TPC-OsCATC为供体载体，pYL1305(载体图谱见图4)为受体载体，参考Lin等人的方法(Lin L,Liu Y G,Xu X,etal..Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assemblyand transformation vector system.Proceedings of the National Academy ofSciences,2003,100(10):5962-5967)，通过三轮重组，最终获得GOC光呼吸代谢改造支路载体GOC-pYL1305，载体图谱如图5所示。具体重组方法如下：

(1)供体质粒和受体质粒的准备

收集过夜的菌液10mL，采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，电泳检测并测质粒浓度，质粒浓度控制在100～200ng/μL。

(2)供体质粒与受体质粒共转重组

按供体受体质粒摩尔比3：1的比例混合质粒3～4μL，混匀后按热激转化的方法转化NS3529感受态细胞(购买于Takara，Japan)；涂布500μL转化菌液于准备好的双抗LB平板上，培养过夜；奇数轮重组使用含50mg/L卡那霉素和17mg/L氯霉素的LB平板，偶数轮重组使用50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB平板。

(3)洗板与质粒提取

用无菌水将过夜培养的平板上的菌落洗下，离心收集菌体；采用质粒提取试剂盒提取质粒，回收后的质粒测浓度，控制在200ng/μL左右。

(4)质粒酶切

采用归位内切酶I-SceI(奇数轮)或PI-SceI(偶数轮)37℃酶切2h，酶切后的质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购买于Takara，Japan)并涂布与含50mg/L卡那霉素的LB平板上，培养过夜。

(5)重组子的筛选

进行菌液PCR筛选阳性克隆，一次检验94个克隆，没有发现阳性克隆的情况下，重复一次，筛选出阳性克隆后进行测序确认；上游引物和测序引物均为I-CeuI-F(5′-CCAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG-3′)，检测的下游引物根据目标基因接入供体的方向选择，如果目标基因的接入方向与MCS的标注方向相同(上游为LoxP位点)，采用接入目标基因的反向引物，反之采用正向引物。

实施例4 GOC-pYL1305的获得及表型分析与光合指标分析

将GOC光呼吸代谢改造支路载体GOC-pYL1305利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述(Hiei et al,Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA,Plant J.1994,6:271-282)，经过预分化、分化，得到6株转化植株，经过PCR鉴定潮酶素抗性基因HPT，全部为阳性(图6)，PCR引物序列如下：

HPT-F：5′-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3′；

HPT-R：5′-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3′；

PCR扩增条件为：94℃2min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

经过PCR鉴定为阳性的转基因植株后，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液(调pH为4.8)培养水稻至4叶期，然后提取水稻RNA，检测总RNA浓度和完整度后再合成cDNA第一链，以水稻Actin作为内参基因，加入等量的cDNA模板，在PCR仪进行半定量分析，从图7可以看出，在转基因植株叶片中TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3、TPC-OsCATC三个基因均有表达；所用PCR引物序列如下：

Actin扩增引物：Actin-F：5′-GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT-3′；

Actin-R：5′-TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGAA-3′；

TPC-OsGLO3扩增引物：GLO3-TF：5′-CCAAGTTGACCGCTCTCT-3′；

HIS-R：5′-ATGGTGATGGTGATGATG-3′；

TPC-OsCATC扩增引物：CATC-TF：5′-TCGCTCAAGCCCAACCCC-3′；

HIS-R：5′-ATGGTGATGGTGATGATG-3′；

TPC-OsOXO3：OXO3-TF：5′-GAGGTGACGGTGAACGGG-3′；

OXO3-TR：5′-TGAGCGGGACGAAGACGA-3′；

PCR扩增条件为：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，27个循环；60～95℃分析溶解曲线。

木村B营养液具体配方为：(NH4)₂SO₄(0.365mM)，KH₂PO₄(0.182mM)，KNO₃(0.183mM)，K₂SO₄(0.086mM)，Ca(NO₃)₂(0.366mM)，MgSO₄(0.548mM)，EDTA-FeIII(0.020mM)，MnCl₂·4H₂O(0.091×10^-3mM)，ZnSO₄·7H₂O(0.77×10^-3mM)，CuSO₄·5H₂O(0.32×10^-3mM)，H₃BO₃(0.0462mM)，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(0.145×10^-3mM)。

通过以上实验，我们成功将GOC光呼吸代谢改造支路引入水稻，获得了具有明显表型的转基因水稻株系GOC2-3-7、GOC3-6-6和GOC4-2-3(图8)，相对于野生型，其表型主要有光合效率提高(图9)、生物量增加(图10)、叶绿素含量增加(图11)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一条光呼吸代谢改造支路及其在C3植物中的应用

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsGLO3融合蛋白编码基因序列

<400> 1

atggccccct ccgtgatggc gtcgtcggcc accaccgtcg ctcccttcca ggggctcaag 60

tccaccgccg gcatgcccgt cgcccgccgc tccggcaact ccagcttcgg caacgtcagc 120

aatggcggca ggatcaggtg catgagatct atggagctaa tcacaaacgt ctccgagtat 180

gagcagcttg caaagcagaa gctgccgaag atgatctacg actactacgc ctctggtgca 240

gaagatcaat ggactctcaa ggagaacagg gaggccttct caagaattct gtttcgaccg 300

cgaatactga ttgatgtatc ccgtatcaac atggctacaa atgtcttggg cttcaacatt 360

tccatgccca taatgattgc tccctcagcc atgcagaaaa tggcccaccc cgaaggagag 420

cttgctactg caagagcagc ttctgctgca ggaacaataa tgacattgtc ttcatggtcc 480

acttctagtg ttgaagaggt taattcagca gcgccgggga tacgtttctt ccaactctat 540

gtttacaagg ataggaatat agtacggcaa cttgtcagaa gggctgaatt ggctggtttt 600

aaggcgattg cactcactgt cgacactcca aggcttggtc gcagggaagc tgacatcaag 660

aacagattca acttacctcc acatctggta ttgaagaatt ttgaagcgct ggatctcggc 720

aagatggaca agacaaatga ttctggcctt gcttcctatg ttgctagcca agttgaccgc 780

tctctgtctt ggacggacgt gaagtggcta cagacaatca cctcgttgcc gatcttagtg 840

aaaggagtca tgactgcaga agatactagg cttgctgtcg aaagtggcgc ggccggtatc 900

atcgtgtcca accatggagc tcgccagcta gattatgttc ctgcaactat cagctgcctg 960

gaagaggtcg tcagggaggc aaaggggcgg ctgccggtgt tcctcgacgg cggcgtccgc 1020

cgtggcacgg acgtgttcaa ggccctggcg ctgggagctt caggagtatt tattggcagg 1080

ccggtgctgt tctcgctggc cgtggacggc gaggccggcg tgaggaaggt gctgcagatg 1140

ctccgcgacg agctggagct caccatggcg ctcagcggat gcacgtcgct ggccgagatc 1200

acccgcaacc acgtcatcac cgacagcgac aggcatcatc accatcacca ttag 1254

<210> 2

<211> 3602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsGLO3融合蛋白表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos序列

<400> 2

gaattcgtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt 60

accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata 120

tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag 180

agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca 240

ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct 300

tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg 360

gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa 420

gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa 480

ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat 540

ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac 600

accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc 660

tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt 720

cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc 780

tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc 840

cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg 900

ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc 960

gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg 1020

ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt 1080

gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac 1140

gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt 1200

tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc 1260

cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt 1320

tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa 1380

ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca 1440

tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1500

gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg 1560

atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa 1620

ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta 1680

cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt 1740

actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac 1800

ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg 1860

atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt 1920

tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt taggtgttac ttctgcagat 1980

gactagtgga tccacgcgtc ctacatcgta taaattagcc tatacgaagt tatgttccac 2040

tgagcgtcag accgagcgca gcgagtttgg tgttacttct gcagatggcc ccctccgtga 2100

tggcgtcgtc ggccaccacc gtcgctccct tccaggggct caagtccacc gccggcatgc 2160

ccgtcgcccg ccgctccggc aactccagct tcggcaacgt cagcaatggc ggcaggatca 2220

ggtgcatgag atctatggag ctaatcacaa acgtctccga gtatgagcag cttgcaaagc 2280

agaagctgcc gaagatgatc tacgactact acgcctctgg tgcagaagat caatggactc 2340

tcaaggagaa cagggaggcc ttctcaagaa ttctgtttcg accgcgaata ctgattgatg 2400

tatcccgtat caacatggct acaaatgtct tgggcttcaa catttccatg cccataatga 2460

ttgctccctc agccatgcag aaaatggccc accccgaagg agagcttgct actgcaagag 2520

cagcttctgc tgcaggaaca ataatgacat tgtcttcatg gtccacttct agtgttgaag 2580

aggttaattc agcagcgccg gggatacgtt tcttccaact ctatgtttac aaggatagga 2640

atatagtacg gcaacttgtc agaagggctg aattggctgg ttttaaggcg attgcactca 2700

ctgtcgacac tccaaggctt ggtcgcaggg aagctgacat caagaacaga ttcaacttac 2760

ctccacatct ggtattgaag aattttgaag cgctggatct cggcaagatg gacaagacaa 2820

atgattctgg ccttgcttcc tatgttgcta gccaagttga ccgctctctg tcttggacgg 2880

acgtgaagtg gctacagaca atcacctcgt tgccgatctt agtgaaagga gtcatgactg 2940

cagaagatac taggcttgct gtcgaaagtg gcgcggccgg tatcatcgtg tccaaccatg 3000

gagctcgcca gctagattat gttcctgcaa ctatcagctg cctggaagag gtcgtcaggg 3060

aggcaaaggg gcggctgccg gtgttcctcg acggcggcgt ccgccgtggc acggacgtgt 3120

tcaaggccct ggcgctggga gcttcaggag tatttattgg caggccggtg ctgttctcgc 3180

tggccgtgga cggcgaggcc ggcgtgagga aggtgctgca gatgctccgc gacgagctgg 3240

agctcaccat ggcgctcagc ggatgcacgt cgctggccga gatcacccgc aaccacgtca 3300

tcaccgacag cgacaggcat catcaccatc accattaggg atcctatcac gttcaaacat 3360

ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 3420

atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 3480

gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 3540

aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg 3600

gg 3602

<210> 3

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsGLO3融合蛋白质序列

<400> 3

Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe

1 5 10 15

Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly

20 25 30

Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met

35 40 45

Arg Ser Met Glu Leu Ile Thr Asn Val Ser Glu Tyr Glu Gln Leu Ala

50 55 60

Lys Gln Lys Leu Pro Lys Met Ile Tyr Asp Tyr Tyr Ala Ser Gly Ala

65 70 75 80

Glu Asp Gln Trp Thr Leu Lys Glu Asn Arg Glu Ala Phe Ser Arg Ile

85 90 95

Leu Phe Arg Pro Arg Ile Leu Ile Asp Val Ser Arg Ile Asn Met Ala

100 105 110

Thr Asn Val Leu Gly Phe Asn Ile Ser Met Pro Ile Met Ile Ala Pro

115 120 125

Ser Ala Met Gln Lys Met Ala His Pro Glu Gly Glu Leu Ala Thr Ala

130 135 140

Arg Ala Ala Ser Ala Ala Gly Thr Ile Met Thr Leu Ser Ser Trp Ser

145 150 155 160

Thr Ser Ser Val Glu Glu Val Asn Ser Ala Ala Pro Gly Ile Arg Phe

165 170 175

Phe Gln Leu Tyr Val Tyr Lys Asp Arg Asn Ile Val Arg Gln Leu Val

180 185 190

Arg Arg Ala Glu Leu Ala Gly Phe Lys Ala Ile Ala Leu Thr Val Asp

195 200 205

Thr Pro Arg Leu Gly Arg Arg Glu Ala Asp Ile Lys Asn Arg Phe Asn

210 215 220

Leu Pro Pro His Leu Val Leu Lys Asn Phe Glu Ala Leu Asp Leu Gly

225 230 235 240

Lys Met Asp Lys Thr Asn Asp Ser Gly Leu Ala Ser Tyr Val Ala Ser

245 250 255

Gln Val Asp Arg Ser Leu Ser Trp Thr Asp Val Lys Trp Leu Gln Thr

260 265 270

Ile Thr Ser Leu Pro Ile Leu Val Lys Gly Val Met Thr Ala Glu Asp

275 280 285

Thr Arg Leu Ala Val Glu Ser Gly Ala Ala Gly Ile Ile Val Ser Asn

290 295 300

His Gly Ala Arg Gln Leu Asp Tyr Val Pro Ala Thr Ile Ser Cys Leu

305 310 315 320

Glu Glu Val Val Arg Glu Ala Lys Gly Arg Leu Pro Val Phe Leu Asp

325 330 335

Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr Asp Val Phe Lys Ala Leu Ala Leu Gly

340 345 350

Ala Ser Gly Val Phe Ile Gly Arg Pro Val Leu Phe Ser Leu Ala Val

355 360 365

Asp Gly Glu Ala Gly Val Arg Lys Val Leu Gln Met Leu Arg Asp Glu

370 375 380

Leu Glu Leu Thr Met Ala Leu Ser Gly Cys Thr Ser Leu Ala Glu Ile

385 390 395 400

Thr Arg Asn His Val Ile Thr Asp Ser Asp Arg His His His His His

405 410 415

His

<210> 4

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsOXO3融合蛋白编码基因序列

<400> 4

atggccccct ccgtgatggc gtcgtcggcc accaccgtcg ctcccttcca ggggctcaag 60

tccaccgccg gcatgcccgt cgcccgccgc tccggcaact ccagcttcgg caacgtcagc 120

aatggcggca ggatcaggtg catgggtacc atggagtacg gcttcaaagc agctgggttg 180

gtgttcgtcg tgctgctcct gcagcaggcg cccgtgttaa tccgagccac cgacgcggac 240

cctctgcagg atttctgcgt cgctgacctc aacagcgagg tgacggtgaa cgggcacgcg 300

tgcaagccgg cgtcggccgc cggcgacgag ttcctcttct cctccaagat tgccacgggc 360

ggcgacgtga acgccaaccc gaacggctcc aacgtcacgg agctcgacgt cgccgagtgg 420

cccggcgtca acacgctcgg cgtgtccatg aaccgcgtcg acttcgcgcc cggtggcacc 480

aacccgccgc acgtccaccc gcgcgccacc gaggtcggca tcgtgctccg cggcgagctc 540

ctcgtcggca tcatcggcac cctcgacacc gggaacaggt actactccaa ggtggtccgt 600

gccggcgaga cgttcgtcat cccgaggggg ctcatgcact tccagttcaa cgttggcaag 660

acggaggcca ccatggtggt gtccttcaac agccagaacc ccggcatcgt cttcgtcccg 720

ctcacattgt tcggctccaa cccgcccatc ccgacgccgg tgcttgtcaa ggcactccgc 780

gtggatgctg gtgtagttga gctgctcaag tccaaattca ccggcgggta ctaa 834

<210> 5

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsOXO3融合蛋白表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s序列

<400> 5

aaagcaagtg gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa 60

tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat 120

atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt 180

ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga 240

agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 300

aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga 360

cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 420

ttcatttcat ttggagagga cgtcgagagt tctcaacaca acatatacaa aacaaacgaa 480

tctcaagcaa tcaagcattc tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca 540

aaagcaattt tctgaaaatt ttcaccattt acgaacgata ggaattcatg gccccctccg 600

tgatggcgtc gtcggccacc accgtcgctc ccttccaggg gctcaagtcc accgccggca 660

tgcccgtcgc ccgccgctcc ggcaactcca gcttcggcaa cgtcagcaat ggcggcagga 720

tcaggtgcat gggtaccatg gagtacggct tcaaagcagc tgggttggtg ttcgtcgtgc 780

tgctcctgca gcaggcgccc gtgttaatcc gagccaccga cgcggaccct ctgcaggatt 840

tctgcgtcgc tgacctcaac agcgaggtga cggtgaacgg gcacgcgtgc aagccggcgt 900

cggccgccgg cgacgagttc ctcttctcct ccaagattgc cacgggcggc gacgtgaacg 960

ccaacccgaa cggctccaac gtcacggagc tcgacgtcgc cgagtggccc ggcgtcaaca 1020

cgctcggcgt gtccatgaac cgcgtcgact tcgcgcccgg tggcaccaac ccgccgcacg 1080

tccacccgcg cgccaccgag gtcggcatcg tgctccgcgg cgagctcctc gtcggcatca 1140

tcggcaccct cgacaccggg aacaggtact actccaaggt ggtccgtgcc ggcgagacgt 1200

tcgtcatccc gagggggctc atgcacttcc agttcaacgt tggcaagacg gaggccacca 1260

tggtggtgtc cttcaacagc cagaaccccg gcatcgtctt cgtcccgctc acattgttcg 1320

gctccaaccc gcccatcccg acgccggtgc ttgtcaaggc actccgcgtg gatgctggtg 1380

tagttgagct gctcaagtcc aaattcaccg gcgggtacta aggatccatg ggcccgggac 1440

tagtcgacgt ccgcaaaaat caccagtctc tctctacaaa tctatctctc tctatttttc 1500

tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcttat agggtttcgc 1560

tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat 1620

caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtgaca agctt 1665

<210> 6

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsOXO3融合蛋白质序列

<400> 6

Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe

1 5 10 15

Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly

20 25 30

Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met

35 40 45

Gly Thr Met Glu Tyr Gly Phe Lys Ala Ala Gly Leu Val Phe Val Val

50 55 60

Leu Leu Leu Gln Gln Ala Pro Val Leu Ile Arg Ala Thr Asp Ala Asp

65 70 75 80

Pro Leu Gln Asp Phe Cys Val Ala Asp Leu Asn Ser Glu Val Thr Val

85 90 95

Asn Gly His Ala Cys Lys Pro Ala Ser Ala Ala Gly Asp Glu Phe Leu

100 105 110

Phe Ser Ser Lys Ile Ala Thr Gly Gly Asp Val Asn Ala Asn Pro Asn

115 120 125

Gly Ser Asn Val Thr Glu Leu Asp Val Ala Glu Trp Pro Gly Val Asn

130 135 140

Thr Leu Gly Val Ser Met Asn Arg Val Asp Phe Ala Pro Gly Gly Thr

145 150 155 160

Asn Pro Pro His Val His Pro Arg Ala Thr Glu Val Gly Ile Val Leu

165 170 175

Arg Gly Glu Leu Leu Val Gly Ile Ile Gly Thr Leu Asp Thr Gly Asn

180 185 190

Arg Tyr Tyr Ser Lys Val Val Arg Ala Gly Glu Thr Phe Val Ile Pro

195 200 205

Arg Gly Leu Met His Phe Gln Phe Asn Val Gly Lys Thr Glu Ala Thr

210 215 220

Met Val Val Ser Phe Asn Ser Gln Asn Pro Gly Ile Val Phe Val Pro

225 230 235 240

Leu Thr Leu Phe Gly Ser Asn Pro Pro Ile Pro Thr Pro Val Leu Val

245 250 255

Lys Ala Leu Arg Val Asp Ala Gly Val Val Glu Leu Leu Lys Ser Lys

260 265 270

Phe Thr Gly Gly Tyr

275

<210> 7

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsCATC融合蛋白编码基因序列

<400> 7

atggccccct ccgtgatggc gtcgtcggcc accaccgtcg ctcccttcca ggggctcaag 60

tccaccgccg gcatgcccgt cgcccgccgc tccggcaact ccagcttcgg caacgtcagc 120

aatggcggca ggatcaggtg catgggtacc atggatccct acaagcaccg cccgtcgagc 180

tcgttcaacg gcccgctgtg gagcaccaac tccggcgccc ccgtatggaa caacaacaac 240

tcgctcaccg tcggctcccg aggcccgatc cttctggagg actaccacct ggttgagaag 300

ctggccaact tcgacaggga gcgtatcccg gagcgcgtgg tgcacgcccg cggcgccagc 360

gccaagggct tcttcgaggt cacccacgac atcacccacc tcacctgcgc cgacttcctc 420

cgcgccccgg gcgtccagac cccggtcatc gtccgcttct ccaccgtcat ccacgagcgc 480

ggcagcccgg agaccctccg cgacccgcgt ggcttcgcca tcaagttcta cacccgggag 540

ggcaactggg acctcgtcgg caacaacttc cccgtcttct tcatccgcga cggcatgaag 600

ttcccggaca tggtgcactc gctcaagccc aaccccaagt cgcacgtcca ggagaactgg 660

cgcatcctcg acttcttctc ccaccacccg gagagcctcc acatgttcac cttcctcttc 720

gatgacatcg gcatccccgc cgactaccgc cacatggacg gctccggcgt caacacctac 780

acgctcgtca accgcgccgg caagtcgcac tacgtcaagt tccactggaa gcccacctgc 840

ggcgtcaagt cgctgctcga cgacgaggcc gtcaccgtcg gcgggaccaa ccacagccac 900

gccacgcagg acctctacga ctccatcgcc gccggcaact tcccggagtg gaagctgttc 960

atccagacca tcgaccccga ccacgaggac cgcttcgact tcgacccgct cgacgtcacc 1020

aagacgtggc ccgaggacat cgtcccgctg cagcccgtgg ggaggatggt gctcaaccgc 1080

aacatcgaca acttcttctc ggagaacgag cagctggcgt tctgccccgg gatcatcgtg 1140

ccggggatct actactccga cgacaagctg ctgcagacga ggatcttctc ctactccgac 1200

acgcagcgcc accgcctcgg accaaactac ctgctgctcc cgcccaacgc gcccaagtgc 1260

gcccaccaca acaaccacta cgacggcttc atgaacttca tgcaccgcga cgaggaggtc 1320

gactacttcc catcccgcta cgatcctgcc aagcacgccc cccgctaccc catcccctcc 1380

gccaccctca ccggccgccg cgagaaggtg gtgattgcca aggagaacaa cttcaagcag 1440

ccaggggaga ggtaccgttc atgggatccg gcaaggcaag accggttcat caagagatgg 1500

atcgacgcac tctctgaccc tcgcctcacc cacgagatca ggagcatctg gctctcctac 1560

tggtctcagg ctgacaggtc tctgggtcag aaactggcga gccgtctcag cgcgaagccg 1620

agcatgcatc atcaccatca ccattaa 1647

<210> 8

<211> 3939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsCATC融合蛋白表达盒Pubi-TPC-OsCATC-Tnos序列

<400> 8

gaattcgtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt 60

accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata 120

tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag 180

agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca 240

ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct 300

tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg 360

gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa 420

gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa 480

ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat 540

ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac 600

accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc 660

tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt 720

cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc 780

tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc 840

cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg 900

ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc 960

gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg 1020

ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt 1080

gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac 1140

gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt 1200

tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc 1260

cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt 1320

tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa 1380

ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca 1440

tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1500

gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg 1560

atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa 1620

ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta 1680

cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt 1740

actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac 1800

ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg 1860

atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt 1920

tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcagaa 1980

gcttatggcc ccctccgtga tggcgtcgtc ggccaccacc gtcgctccct tccaggggct 2040

caagtccacc gccggcatgc ccgtcgcccg ccgctccggc aactccagct tcggcaacgt 2100

cagcaatggc ggcaggatca ggtgcatggg taccatggat ccctacaagc accgcccgtc 2160

gagctcgttc aacggcccgc tgtggagcac caactccggc gcccccgtat ggaacaacaa 2220

caactcgctc accgtcggct cccgaggccc gatccttctg gaggactacc acctggttga 2280

gaagctggcc aacttcgaca gggagcgtat cccggagcgc gtggtgcacg cccgcggcgc 2340

cagcgccaag ggcttcttcg aggtcaccca cgacatcacc cacctcacct gcgccgactt 2400

cctccgcgcc ccgggcgtcc agaccccggt catcgtccgc ttctccaccg tcatccacga 2460

gcgcggcagc ccggagaccc tccgcgaccc gcgtggcttc gccatcaagt tctacacccg 2520

ggagggcaac tgggacctcg tcggcaacaa cttccccgtc ttcttcatcc gcgacggcat 2580

gaagttcccg gacatggtgc actcgctcaa gcccaacccc aagtcgcacg tccaggagaa 2640

ctggcgcatc ctcgacttct tctcccacca cccggagagc ctccacatgt tcaccttcct 2700

cttcgatgac atcggcatcc ccgccgacta ccgccacatg gacggctccg gcgtcaacac 2760

ctacacgctc gtcaaccgcg ccggcaagtc gcactacgtc aagttccact ggaagcccac 2820

ctgcggcgtc aagtcgctgc tcgacgacga ggccgtcacc gtcggcggga ccaaccacag 2880

ccacgccacg caggacctct acgactccat cgccgccggc aacttcccgg agtggaagct 2940

gttcatccag accatcgacc ccgaccacga ggaccgcttc gacttcgacc cgctcgacgt 3000

caccaagacg tggcccgagg acatcgtccc gctgcagccc gtggggagga tggtgctcaa 3060

ccgcaacatc gacaacttct tctcggagaa cgagcagctg gcgttctgcc ccgggatcat 3120

cgtgccgggg atctactact ccgacgacaa gctgctgcag acgaggatct tctcctactc 3180

cgacacgcag cgccaccgcc tcggaccaaa ctacctgctg ctcccgccca acgcgcccaa 3240

gtgcgcccac cacaacaacc actacgacgg cttcatgaac ttcatgcacc gcgacgagga 3300

ggtcgactac ttcccatccc gctacgatcc tgccaagcac gccccccgct accccatccc 3360

ctccgccacc ctcaccggcc gccgcgagaa ggtggtgatt gccaaggaga acaacttcaa 3420

gcagccaggg gagaggtacc gttcatggga tccggcaagg caagaccggt tcatcaagag 3480

atggatcgac gcactctctg accctcgcct cacccacgag atcaggagca tctggctctc 3540

ctactggtct caggctgaca ggtctctggg tcagaaactg gcgagccgtc tcagcgcgaa 3600

gccgagcatg catcatcacc atcaccatta aactagtgat cggatcctac aagtgtgaat 3660

tggtgaccag ctcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 3720

tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 3780

atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 3840

tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 3900

aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggg 3939

<210> 9

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsCATC融合蛋白质序列

<400> 9

Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe

1 5 10 15

Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly

20 25 30

Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met

35 40 45

Gly Thr Met Asp Pro Tyr Lys His Arg Pro Ser Ser Ser Phe Asn Gly

50 55 60

Pro Leu Trp Ser Thr Asn Ser Gly Ala Pro Val Trp Asn Asn Asn Asn

65 70 75 80

Ser Leu Thr Val Gly Ser Arg Gly Pro Ile Leu Leu Glu Asp Tyr His

85 90 95

Leu Val Glu Lys Leu Ala Asn Phe Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg

100 105 110

Val Val His Ala Arg Gly Ala Ser Ala Lys Gly Phe Phe Glu Val Thr

115 120 125

His Asp Ile Thr His Leu Thr Cys Ala Asp Phe Leu Arg Ala Pro Gly

130 135 140

Val Gln Thr Pro Val Ile Val Arg Phe Ser Thr Val Ile His Glu Arg

145 150 155 160

Gly Ser Pro Glu Thr Leu Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Ile Lys Phe

165 170 175

Tyr Thr Arg Glu Gly Asn Trp Asp Leu Val Gly Asn Asn Phe Pro Val

180 185 190

Phe Phe Ile Arg Asp Gly Met Lys Phe Pro Asp Met Val His Ser Leu

195 200 205

Lys Pro Asn Pro Lys Ser His Val Gln Glu Asn Trp Arg Ile Leu Asp

210 215 220

Phe Phe Ser His His Pro Glu Ser Leu His Met Phe Thr Phe Leu Phe

225 230 235 240

Asp Asp Ile Gly Ile Pro Ala Asp Tyr Arg His Met Asp Gly Ser Gly

245 250 255

Val Asn Thr Tyr Thr Leu Val Asn Arg Ala Gly Lys Ser His Tyr Val

260 265 270

Lys Phe His Trp Lys Pro Thr Cys Gly Val Lys Ser Leu Leu Asp Asp

275 280 285

Glu Ala Val Thr Val Gly Gly Thr Asn His Ser His Ala Thr Gln Asp

290 295 300

Leu Tyr Asp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Phe Pro Glu Trp Lys Leu Phe

305 310 315 320

Ile Gln Thr Ile Asp Pro Asp His Glu Asp Arg Phe Asp Phe Asp Pro

325 330 335

Leu Asp Val Thr Lys Thr Trp Pro Glu Asp Ile Val Pro Leu Gln Pro

340 345 350

Val Gly Arg Met Val Leu Asn Arg Asn Ile Asp Asn Phe Phe Ser Glu

355 360 365

Asn Glu Gln Leu Ala Phe Cys Pro Gly Ile Ile Val Pro Gly Ile Tyr

370 375 380

Tyr Ser Asp Asp Lys Leu Leu Gln Thr Arg Ile Phe Ser Tyr Ser Asp

385 390 395 400

Thr Gln Arg His Arg Leu Gly Pro Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Pro Asn

405 410 415

Ala Pro Lys Cys Ala His His Asn Asn His Tyr Asp Gly Phe Met Asn

420 425 430

Phe Met His Arg Asp Glu Glu Val Asp Tyr Phe Pro Ser Arg Tyr Asp

435 440 445

Pro Ala Lys His Ala Pro Arg Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Thr Leu Thr

450 455 460

Gly Arg Arg Glu Lys Val Val Ile Ala Lys Glu Asn Asn Phe Lys Gln

465 470 475 480

Pro Gly Glu Arg Tyr Arg Ser Trp Asp Pro Ala Arg Gln Asp Arg Phe

485 490 495

Ile Lys Arg Trp Ile Asp Ala Leu Ser Asp Pro Arg Leu Thr His Glu

500 505 510

Ile Arg Ser Ile Trp Leu Ser Tyr Trp Ser Gln Ala Asp Arg Ser Leu

515 520 525

Gly Gln Lys Leu Ala Ser Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ser Met His His

530 535 540

His His His His

545

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsGLO3-F

<400> 10

catgagatct atggagctaa tcacaaac 28

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsGLO3-R

<400> 11

ttaatggtga tggtgatgat gcctgtcgct gtcggtgat 39

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-1F

<400> 12

atggccccct ccgtgatg 18

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-1R

<400> 13

ctacagatct catgcacctg atcctgcc 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsOXO3-F

<400> 14

catgggtacc atggagtacg gcttcaaa 28

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsOXO3-R

<400> 15

atccttagta cccgccggtg aa 22

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-2R

<400> 16

ctacggtacc catgcacctg atcctgcc 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCATC-F

<400> 17

catgggtacc atggatccct acaagcat 28

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCATC-R

<400> 18

ttaatggtga tggtgatgat gcatgctcgg cttcgcgctg ag 42

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsGLO3-F

<400> 19

gactctgcag atggccccct ccgtgatg 28

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsGLO3-R

<400> 20

cagtggatcc ctaatggtga tggtgatgat g 31

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Pubi-F

<400> 21

gaattcgtcg tgcccctctc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Tnos-R

<400> 22

cccgatctag taacatagat 20

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsOXO3-F

<400> 23

ataggaattc atggccccct ccgtgatg 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsOXO3-R

<400> 24

ccatggatcc ttagtacccg ccggtgaa 28

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2×P35s-F

<400> 25

gaattcgtcg tgcccctctc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T35s-R

<400> 26

cccgatctag taacatagat 20

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsCATC-F

<400> 27

gtacaagctt atggccccct ccgtgatg 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPC-OsCATC-R

<400> 28

gatcactagt ttaatggtga tggtgatg 28

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> I-CeuI-F

<400> 29

ccaactataa cggtcctaag gtagcg 26

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPT-F

<400> 30

ctgaactcac cgcgacgtct gtc 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPT-R

<400> 31

tagcgcgtct gctgctccat aca 23

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-F

<400> 32

gacattcagc gttccagcca tgtat 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-R

<400> 33

tggagcttcc atgccgatga gagaa 25

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GLO3-TF

<400> 34

ccaagttgac cgctctct 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HIS-R

<400> 35

atggtgatgg tgatgatg 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CATC-TF

<400> 36

tcgctcaagc ccaacccc 18

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OXO3-TF

<400> 37

gaggtgacgg tgaacggg 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OXO3-TR

<400> 38

tgagcgggac gaagacga 18

Claims

1.一种改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：在植物光呼吸中引入GOC光呼吸代谢改造支路，包括通过表达载体表达OsGLO3、OsCAT2与OsOXO3三个蛋白；

构成所述的GOC光呼吸代谢改造支路的融合蛋白，包括TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3和TPC-OsCATC；

所述的OsGLO3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3中自N端第50位～411位氨基酸残基所示；

所述的OsOXO3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6中自N端第50位～277位氨基酸残基所示；

所述的OsCATC蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9中自N端第50位～542位氨基酸残基所示。

2.根据权利要求1所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的TPC-OsGLO3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的TPC-OsOXO3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的TPC-OsCATC融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1或2所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的TPC-OsGLO3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:1杂交并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ ID NO:1的序列有90％以上的同源性，并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子；

所述的TPC-OsOXO3融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:4杂交并且编码上述TPC-OsGLO3融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ ID NO:4的序列有90％以上的同源性，并且编码上述TPC-OsOXO3融合蛋白的DNA分子；

所述的TPC-OsCATC融合蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:7杂交并且编码上述TPC-OsCATC融合蛋白的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ ID NO:7的序列有90％以上的同源性，并且编码上述TPC-OsCATC融合蛋白的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的TPC-OsGLO3融合蛋白编码基因的表达盒为Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos；

所述TPC-OsOXO3融合蛋白编码基因的表达盒为2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s；

所述的TPC-OsCATC融合蛋白编码基因的表达盒为Pubi-TPC-OsCATC-Tnos。

5.根据权利要求4所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的表达盒Pubi-TPC-OsGLO3-Tnos的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:2杂交的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ IDNO:2的序列有90％以上的同源性的序列；

所述的表达盒2×P35s-TPC-OsOXO3-T35s的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:5杂交的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQID NO:5的序列有90％以上的同源性的序列；

所述的表达盒Pubi-TPC-OsCATC-Tnos的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；或在严格条件下能与SEQ ID NO:8杂交的DNA分子，所述的严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ IDNO:8的序列有90％以上的同源性的序列。

6.根据权利要求4或5所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的表达载体是由TPC-OsGLO3、TPC-OsOXO3及TPC-OsCATC融合蛋白的编码基因表达盒通过插入多克隆位点或通过重组构建而成。

7.根据权利要求6所述的改造植物光呼吸代谢的方法，其特征在于：

所述的表达载体还包括在植物中表达能产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因；

所述的表达载体为pYL1305或pYLTAC380GW。

8.权利要求1～7任一项所述的改造植物光呼吸代谢的方法在制备转基因植物中的应用，其特征在于：所述的改造植物光呼吸代谢的方法在制备提高C3植物光合效率与生物量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：将GOC光呼吸代谢改造支路相关基因转化水稻愈伤组织细胞，再将转化后的水稻愈伤组织细胞培育成植株。