JP2023544382A - Ｒｎａによる単純ヘルペスｉ型およびその他の関連するヒトヘルペスウイルスの根絶 - Google Patents

Ｒｎａによる単純ヘルペスｉ型およびその他の関連するヒトヘルペスウイルスの根絶 Download PDF

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Abstract

本開示は、ヘルペスウイルスの感染力を阻害するための組成物および方法に関する。 本開示は、一般に、単純ヘルペスウイルス感染を治療または根絶する組成物および方法に関する。 本開示は、特に、遺伝子編集複合体による単純ヘルペスウイルス遺伝子の標的化に関する。【選択図】図１Ａ－１、１Ａ－２

Description

本開示は、一般に、単純ヘルペスウイルス感染を治療または根絶する組成物および方法に関する。本開示は、特に、遺伝子編集複合体による単純ヘルペスウイルス遺伝子の標的化に関する。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１０月２日に出願された米国仮出願第６３／０８６，６４８号（特許文献１）および２０２０年１１月４日に出願された米国仮出願第６３／１０９，５１１号（特許文献２）の利益を主張し、それぞれの出願は参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレオシド類似体による薬理学的治療は、ＨＳＶ１ の初感染およびウイルス再活性化イベントに対する治療の主流です。 これらの薬剤は、他の細胞への ＨＳＶ１ 感染の拡大に起因する損傷を効果的に制限できるが、潜在的な ＨＳＶ１ 再活性化の確立や将来の ＨＳＶ１ 再活性化イベントには影響を与えません。 現在の治療法の限界を考慮すると、当技術分野では、溶解性ＨＳＶ１感染および潜在性ＨＳＶ１感染の両方の治療および予防のための組成物および方法が必要とされている。
米国仮出願第６３／０８６，６４８号 米国仮出願第６３／１０９，５１１号
一態様では、本開示は、ヘルペスウイルス感染を治療または予防するための組成物を提供する。組成物は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドまたはＣａｓペプチドをコードする単離された核酸を含む。 ｂ）単離されたガイド核酸、またはガイド核酸をコードする単離された核酸であって、ガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノム中の標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドまたはＣａｓペプチドをコードする単離された核酸；およびａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドを含む。 ｂ）単離されたガイド核酸、またはガイド核酸をコードする単離された核酸であって、ガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノム中の標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドをコードする発現ベクターおよびガイド核酸を含み、ガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノム中の標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。 いくつかの実施形態において、本開示は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
特定の実施形態では、対象におけるヘルペスウイルス感染症またはヘルペスウイルス関連障害を治療または予防する方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、または Ｃａｓペプチドをコードする単離された核酸。 ｂ）単離されたガイド核酸、またはガイド核酸をコードする単離された核酸であって、ガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノム中の標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、組成物は複数の単離されたガイド核酸を含み、各ガイド核酸はヘルペスウイルスゲノム内の異なる標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。 特定の実施形態では、組成物は１つ以上の単離された核酸を含み、１つ以上の単離された核酸は複数のガイド核酸をコードし、各ガイド核酸はヘルペスウイルスゲノム中の異なる標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ＣａｓペプチドはＣａｓ９またはその変異体である。 特定の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｈ９８２Ａ、ＫＩ００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｎ４９７Ａからなる群から選択される、野生型化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）と比較して、１つ以上の点突然変異を含む。 、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ、および Ｍ６９８Ａ。 いくつかの実施形態では、ＣａｓペプチドはＣｐｆ１またはその変異体である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓペプチドをコードする単離された核酸は、ヒト細胞における発現のために最適化される。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０ドメイン内の配列を含む。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡが実質的に相補的である標的配列は、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内にある。
特定の実施形態では、ＨＳＶ標的配列は、ＩＣＰ０遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、またはそれらの組み合わせ内にある。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、 配列番号１～９６、１９４～２１２および３５６～３７１に対する９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～９６、１９４～２１２、および３５６～３７１を含む核酸配列を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１～９６、１９４～２１２、および３５６～３７１を含む核酸配列を含む治療有効量の１つまたは複数のｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１～９６、１９４～２１２、および３５６～３７１を含む核酸配列を含む治療有効量の２つ以上のｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１～９６、１９４～２１２および３５６～３７１を含む核酸配列を含む治療有効量の３つ以上のｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１～９６、１９４～２１２、および３５６～３７１を含む核酸配列を含む治療有効量の４つ以上のｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１～９６、１９４～２１２、および３５６～３７１を含む核酸配列を含む、治療有効量の５または６または７または８または９または１０以上のｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％など）を有する核酸配列を含む。 、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）配列番号９７～１９３、２１３～２３１またはそれらの組み合わせに対する配列同一性。
いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、配列番号９７～１９３、２１３～２３１、またはそれらの組み合わせを含む核酸配列を含む。
特定の実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペスイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、ヒトヘルペスウイルス－４（ＨＨＶ－４；エプスタイン－３）を含む。 バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペスウイルス－５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペスウイルス－６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス－７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペスウイルス－８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス （ＫＳＨＶ））。
特定の実施形態では、クラスター化規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；を含む組成物が本明細書に開示される。 第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近傍にある第１の標的核酸配列に相補的であり、 第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近傍にある第２の標的核酸配列に相補的であり、 第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
いくつかの実施形態では、組成物は、第４のガイド核酸、または第４のガイド核酸をコードする核酸配列をさらに含み、第４のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第４の標的核酸配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列とは異なる。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＯエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化される。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１のいずれか１つの相補体を含む。 －９６ または ３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つ、または配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つの相補体と少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。 ９６または３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号７による配列またはその相補体を含み、そして第３の標的核酸配列は、配列番号７による配列またはその相補体を含む。 標的核酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号７またはその相補体による配列を含み、第３の標的核酸配列は、 酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補体を含む。 いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘぺスウイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、ヒトヘルペスウイルス－４からなる群から選択される。 （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペスウイルス－５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペスウイルス－６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス－７ （ＨＨＶ－７） ）、およびヒトヘルペスウイルス－８（ＨＨＶ－８；カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））。
特定の実施形態において、クラスター化規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列； 第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近傍にある第１の標的核酸配列に相補的であり、 第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近くの第２の標的核酸配列に相補的であり、 第３のガイド核酸または第３のガイド核酸をコードする核酸配列第３のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第３の標的核酸配列に相補的である。ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＩエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化される。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ９６または３７２－３７５。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体と少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は配列番号２もしくは７に従う配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含み、 第３の標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補配列を含む。 いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペスウイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、ヒトヘルペスウイルス－４（ＨＳＶ－３）からなる群から選択される。 ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペスウイルス－５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペスウイルス－６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス－７ （ＨＨＶ－７） 、およびヒトヘルペスウイルス－８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス （ＫＳＨＶ））。
本明細書では、特定の実施形態において、以下を含むＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムが開示される。配列番号２もしくは７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはその相補体と相補的な核酸配列を含む、第１のガイド核酸； 第２のガイド核酸は、配列番号３７６もしくは３７７またはその相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列に相補的な核酸配列を含む。 配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、第２のガイド核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のガイド核酸は、配列番号３７６に対して相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号２および第２のガイドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 第２のガイド核酸は、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸は、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸は配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列に相補的な核酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸が開示される。
特定の実施形態では、以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書に開示される。第１のガイド核酸であって、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近傍にある第１の標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； 第２のガイド核酸であって、第２のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近くの第２の標的核酸配列に相補的である第２のガイド核酸。 第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
いくつかの実施形態では、ベクターは第４のガイド核酸をさらに含み、第４のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第４の標的核酸配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列とは異なる。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化される。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ９６または３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ９６または３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体と少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。 、３７１、または３７４－３７７。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、そして第３の標的は、 核酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２による配列を含む。ここで、第２の標的核酸配列は配列番号７による配列またはその相補体を含み、第３の標的核酸配列は配列番号３７６による配列またはその相補体を含み、そして第４の標的核酸配列は配列番号３７６による配列またはその相補体を含む。 標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補体を含む。 いくつかの実施形態では、核酸はプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プロモーターは遍在性プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。 いくつかの実施形態では、核酸はエンハンサー要素をさらに含む。 いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントはヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである。 いくつかの実施形態では、核酸は５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である。 いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペスイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、ヒトヘルペスウイルス－４（ＨＳＶ－３）からなる群から選択される。 ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペスウイルス－５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペスウイルス－６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス－７ （ＨＨＶ－７） 、およびヒトヘルペスウイルス－８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス （ＫＳＨＶ））。
特定の実施形態において、以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書に開示される。 第１のガイド核酸であって、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその近傍にある第１の標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； 第２のガイド核酸であって、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的である第２のガイド核酸； 第３のガイド核酸は、ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である。 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＩエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化される。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＲＮＡである。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体と少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。 、３７１、または３７４－３７７。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は配列番号２もしくは７に従う配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含み、かつ 第３の標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補配列を含む。 いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペスウイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ））、ヒトヘルペスウイルス－４（ＨＳＶ－３）からなる群から選択される。 ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペスウイルス－５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペスウイルス－６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス－７ （ＨＨＶ－７） 、およびヒトヘルペスウイルス－８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス （ＫＳＨＶ））。
いくつかの実施形態では、核酸はプロモーターをさらに含む。 秒いくつかの実施形態では、プロモーターは遍在性プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。 いくつかの実施形態では、プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。 いくつかの実施形態では、核酸はエンハンサー要素をさらに含む。 いくつかの実施形態では、エンハンサーエレメントはヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである。 いくつかの実施形態では、核酸は５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である。
特定の実施形態では、細胞からヘルペスウイルス配列の一部または全部を切除する方法が本明細書に開示され、この方法は、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、または本明細書に記載のＡＡＶベクターを細胞に提供することを含む。
特定の実施形態では、細胞におけるヘルペスウイルス複製を阻害または低減する方法が本明細書に開示され、この方法は、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、または本明細書に記載のＡＡＶベクターを細胞に提供することを含む。 いくつかの実施形態では、細胞は対象内にある。 いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
ヘルペスウイルスゲノムおよびヘルペスウイルスゲノムを標的とする際に使用される遺伝子編集ベクターの概略図である。 ヘルペスウイルスゲノムおよびヘルペスウイルスゲノムを標的とする際に使用される遺伝子編集ベクターの概略図である。 ヘルペスウイルスゲノムおよびヘルペスウイルスゲノムを標的とする際に使用される遺伝子編集ベクターの概略図である。 細胞内での遺伝子編集ベクターの送達発現を示すデータを示す図である。 細胞におけるＤＮＡ切除アッセイを実証するデータを示す図である。 細胞におけるＤＮＡ切除アッセイを実証するデータを示す図である。 細胞内でのＨＳＶ複製を示すデータを示す図である。 細胞におけるｇＲＮＡ発現を示すデータを示す図である。 細胞におけるｇＲＮＡ発現を示すデータを示す図である。 細胞内のヘルペスウイルスモデルのデータを示す図である。 細胞におけるＤＮＡ切除アッセイを実証するデータを示す図である。 細胞におけるＤＮＡ切除アッセイを実証するデータを示す図である。 感染細胞における標的遺伝子の発現の減少を示すデータを示す図である。
（定義）
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。 本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。
本明細書で使用する場合、以下の各用語は、このセクション内でそれに関連付けられた意味を持ちます。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の １ つまたは複数（つまり、少なくとも １ つ）を指すために使用される。 一例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±の変動を包含することを意味する。 指定値から０．１％であり、そのような変動は開示された方法を実行するのに適切である。
「異常な」という用語は、生物、組織、細胞、またはそれらの成分との関連で使用される場合、少なくとも １つの観察可能なまたは検出可能な特徴 （例： 年齢、治療、時間など） が異なる生物、組織、細胞またはその成分を指す。 「正常な」（期待される）それぞれの特性を示すそれらの生物、組織、細胞、またはその成分から得たもの。 ある細胞または組織タイプでは正常または予想される特性が、別の細胞または組織タイプでは異常である可能性がある。
本明細書で使用される場合、物品、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義または説明された要素に関連して、「含む」、「含む」または「含む」という用語、およびその変形は、以下のことを意味する。 包括的または無制限で、追加の要素を許可し、それによって、定義または記述された品目、組成、装置、方法、プロセス、システムなどが、指定された要素、または必要に応じてそれらの等価物を含むこと、および他の要素が含まれる可能性があることを示する。 それでも、定義された品目、構成、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義内に収まります。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持できない健康状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける。
対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持することはできるが、動物の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態のことです。 病気を治療せずに放置しても、必ずしも動物の健康状態がさらに悪化するとは限りません。
疾患または障害の症状の重症度、患者がそのような症状を経験する頻度、またはその両方が減少する場合、疾患または障害は「緩和」される。
「コード化」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、または ｍＲＮＡ などのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列が、生物学的プロセスにおいて、次のいずれかの定義された配列を有する他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして機能する、固有の特性を指する。 ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列、およびそれらから生じる生物学的特性。 したがって、遺伝子に対応する ｍＲＮＡ の転写と翻訳が細胞または他の生物学的系でタンパク質を生成する場合、遺伝子はそのタンパク質をコードする。 ヌクレオチド配列が ｍＲＮＡ 配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子または ｃＤＮＡ の転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、 タンパク質、またはその遺伝子または ｃＤＮＡ の他の産物。
化合物の「有効量」または「治療有効量」とは、化合物が投与される対象に有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。 送達ビヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合または送達するのに十分な量である。
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。 発現ベクターには、発現に十分なシス作用性エレメントが含まれる。 発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系で供給され得る。 発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で知られているすべてのベクターが含まれる。
「相同」とは、２つのポリペプチド間または ２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指する。 ２つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマー サブユニットによって占められている場合、たとえば ２ つの ＤＮＡ 分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同です。 ２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列が共有する一致または相同な位置の数を、比較される位置の数で割った値×１００ の関数です。たとえば、２つの配列の位置のうち １０ 個のうち ６ 個が一致または相同である場合、 この場合、２つの配列は ６０％ 相同です。 一例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。 一般に、比較は、２つの配列をアラインメントして最大の相同性を得るときに行われます。
「隔離された」とは、自然な状態から変更または除去されたことを意味する。 例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていませんが、同じ核酸またはペプチドが自然状態の共存物質から部分的または完全に分離された場合は「単離」される。 単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することもできる。
本開示の文脈では、一般的に存在する核酸塩基に対する以下の略語が使用される。 「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指する。
特に指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。 タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含む場合がある限り、イントロンも含み得る。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、インビトロまたはインサイチュを問わず、本明細書に記載の方法に記載の任意の動物またはその細胞を指す。 特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個人はヒトである。
組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、または注入技術が含まれる。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。 さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーです。 したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは交換可能である。 当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、加水分解されて単量体「ヌクレオチド」になり得るという一般知識を有する。 モノマーヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解される。 本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、組換え手段、すなわち、組換えライブラリーまたは細胞からの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。 通常のクローニング技術と ＰＣＲ（登録商標） を使用して、ゲノムを解析する。および同様のもの、および合成手段による。
特に指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。 タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含む場合がある限り、イントロンも含み得る。
「薬学的に許容される」（または「薬理学的に許容される」）という用語は、必要に応じて、動物またはヒトに投与された場合に有害な反応、アレルギー反応、またはその他の好ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。 本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語には、使用され得るあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル、界面活性剤などが含まれる。 薬学的に許容される物質の媒体として。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。 タンパク質またはペプチドには少なくとも ２ つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はありません。 ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。 本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す。 多くの種類がある。 「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。 ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
本明細書で使用する場合、「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。 場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であり、他の場合には、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。 プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結した場合、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするか特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される「または」という用語は、内容が明確に別段の指示をしない限り、一般に「および／または」を含む意味で使用される。
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子をコードする、または遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に細胞が対応する組織型の細胞である場合にのみ細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「治療的」治療とは、病理学的兆候を示す対象に、それらの兆候を軽減または除去する目的で施される治療法である。
本明細書で使用される場合、「疾患または障害を治療する」とは、患者が疾患または障害の症状を経験する頻度を減らすことを意味する。 疾患と障害は、本明細書では同じ意味で使用される。
本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、疾患または状態を予防または治療する（発症を遅らせたり防止したり、進行を予防したり、阻害したり、軽減したり、逆転させたり）のに十分または効果的な量を指し、 そのような病気の症状を軽減することも含まれる。
疾患を「治療する」という用語が本明細書で使用される場合、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの兆候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。
「変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、参照核酸配列またはペプチド配列とはそれぞれ配列が異なるが、参照分子の本質的な特性を保持する核酸配列またはペプチド配列である。 核酸変異体の配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変更しないこともあり、あるいはアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断を引き起こすこともある。 ペプチド変異体の配列の変更は通常、限定的または保存的であるため、参照ペプチドと変異体の配列は全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一です。 変異体と参照ペプチドは、１ つ以上の置換、付加、欠失の任意の組み合わせによってアミノ酸配列が異なる場合がある。 核酸またはペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものであってもよいし、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。 核酸およびペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術または直接合成によって作製され得る。
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物である。 線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが当技術分野で知られている。 したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。 この用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むものと解釈されるべきである。 ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
範囲：本開示全体を通じて、本開示のさまざまな態様は範囲形式で表すことができる。 範囲形式での説明は単に便宜および簡潔にするためのものであり、本開示の範囲を柔軟に制限するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。 したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。 例えば、１ から ６ などの範囲の説明は、１ から ３、１ から ４、１ から ５、２ から ４、２ から ６、３ から ３ などの部分範囲を具体的に開示しているとみなされる必要がある。 から ６ など、およびその範囲内の個々の数値 （１、２、２．７、３、４、５、５．３、６ など）。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
（詳細な説明）
（ヘルペスウイルス標的化）
実施形態は、それを必要とする対象におけるヘルペスウイルス感染症を治療および予防するための組成物および方法を含む。 例えば、特定の実施形態では、本開示は、ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内の標的配列を特異的に切断し、それによってウイルスの複製能力を防止または低下させ、したがってヘルペスウイルスの感染力を阻害する組成物を提供する。
特定の実施形態では、ヒト単純ヘルペスウイルスに特異的な単一および多重構成のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集複合体は、ウイルスＤＮＡ配列の完全性を損ない、その結果、標的ＨＳＶ領域間のＨＳＶゲノムが切除される。例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ分子は、ＨＳＶゲノムの大きなセグメントを除去し、感染細胞内でウイルスが複製する能力を無効にする可能性がある。 したがって、本開示は、新規な治療および予防戦略として、急性または潜在性ＨＳＶ１感染におけるウイルスゲノムの破壊のために、感染細胞内のＨＳＶゲノムを標的とする組成物および方法を提供する。
特定の実施形態において、ＨＳＶゲノムの標的化に関連する組成物および方法が本明細書に記載される。 いくつかの実施形態では、組成物および方法は、ＨＳＶゲノムを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。 いくつかの実施形態では、組成物および方法は、ＨＳＶゲノムの一部または全部を切除することをもたらす。 いくつかの実施形態では、組成物および方法は、ＨＳＶゲノムの１、２、３、４、５、または６つの異なる遺伝子におけるＨＳＶゲノム内の配列の一部または全部を切除することをもたらす。 いくつかの実施形態では、組成物および方法は、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００の切除をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドまたはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチドをコードする核酸配列と、複数のガイド核酸または複数のガイド核酸をコードする核酸配列とを含む方法および組成物が本明細書に提供される。 ガイド核酸のこと。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上を含む。６ ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、４つまたは少なくとも４つの異なるｇＲＮＡを含む。 特定の実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノム中の１つまたは複数の異なる領域または配列（例えば、ＩＣＰ０およびＩＣＰ２７）を標的とする。
いくつかの実施形態では、異なるｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノム内の異なる配列を標的とする。 いくつかの実施形態では、異なるｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノム内の異なる標的配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、標的配列は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内またはその近くにある。 特定の実施形態では、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内またはその近くの領域にハイブリダイズする。 いくつかの実施形態では、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内の領域は、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。 いくつかの実施形態では、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子の近傍の領域は、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子の周囲の５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５塩基位置を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４内の領域を標的とする（例えば、ハイブリダイズまたはアニールする）か、またはそれに相補的な、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 ＩＣＰ２７、またはＨＳＶゲノムのその組み合わせ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む、またはＨＳＶゲノムの ＩＣＰＯ 遺伝子を標的とする ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６、 または、ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ４ 遺伝子を標的とする ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６、 または、ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子を標的とする ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６、 または、ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ４ 遺伝子を標的とする ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６、 または、ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子を標的とする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６、 または、ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子を標的とする ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、複合物本明細書に記載の方法および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子を標的とする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子を標的とする２つの異なるｇＲＮＡとを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、 ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰＯ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つまたは ６つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む。 、または ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ４ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む。 、または ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む。 、または ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ４ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む。 、または ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、または６を超える異なるｇＲＮＡ、および１、２、３、４、５、６を含む。 、または ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子にハイブリダイズする ６ つを超える異なる ｇＲＮＡ。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰＯ遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶ ｇのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。ｅｎｏｍｅ と ＨＳＶ ゲノムの ＩＣＰ２７ 遺伝子にハイブリダイズする ２つの異なる ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ０遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡと、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡとを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子にハイブリダイズする１つのｇＲＮＡ、およびＨＳＶゲノムのＩＣＰ２７遺伝子にハイブリダイズする２つの異なるｇＲＮＡを含む。
本明細書では、特定の実施形態において、４つのガイド核酸を使用してＨＳＶゲノムを標的化するための方法および組成物が提供される。 いくつかの実施形態では、複数のガイド核酸のうちの第１のガイド核酸は、ＨＳＶゲノム内の第１の標的配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、複数のガイド核酸のうちの第２のガイド核酸は、ＨＳＶゲノム内の第２の標的配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、複数のガイド核酸のうちの第３のガイド核酸は、ＨＳＶゲノム内の第３の標的配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、複数のガイド核酸のうちの第４のガイド核酸は、ＨＳＶゲノム内の第４の標的配列に相補的である。 いくつかの実施形態では、第１の標的配列、第２の標的配列、第３の標的配列、および第４の標的配列は異なる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６または３７２～３７３のいずれか１つに対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。の配列を含む。 、表４に示す配列に対していくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、 少なくとも、または約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７３のいずれか１つと相補的な配列、または表４に従う配列と少なくとも９５％または約９５％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７３のいずれか１つと相補的な配列に対して少なくともまたは約９５％相同性の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１のいずれか１つに相補的な配列に対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。 ９６または３７２～３７３、または表４に従う配列。
場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６または３７２～３７３のいずれか１つまたは表４に従う配列に対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。 ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７３のいずれか１つに相補的な配列、または表４に示される配列に対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。 ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７３のいずれか１つまたは表４に示される配列に対して少なくともまたは約１００％相同性の配列を含む。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、 配列番号１～９６もしくは３７２～３７３のいずれか１つに相補的な配列、または表４に従う配列に対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、配列番号１～９６のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０または２０ヌクレオチドを超える配列 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４の配列を含む。 、配列番号１～９６または３７２～３７３のいずれか１つまたは表４に従う配列に相補的な配列の１６、１７、１８、１９、２０または２０ヌクレオチドを超えるヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して、％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。 、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つと相補的な配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％相同性の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して相補的な配列に対して少なくともまたは約９５％相同性の配列を含む。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに相補的な配列に対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。
場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに相補的な配列に対して少なくともまたは約９９％相同な配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに相補的な配列に対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の配列を含む。 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの２０ヌクレオチド。 いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の配列を含む。 ３６３、３７１、または ３７４ ～ ３７７ のいずれか１つに相補的な配列の ２０ ヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ０配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、 配列番号３７２または３７３のいずれか１つと９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性、および第２のｇＲＮＡによって標的化されるＩＣＰ２７配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、 配列番号３７４または３７５のいずれか１つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号３７２～３７５のいずれか１つに従う配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。配列番号３７２に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性。 第２のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含み、 配列番号３７３に対して９９％または１００％の配列同一性。 第３のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含み、 配列番号３７４と９９％または１００％の配列同一性。 そして、第４のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含む 、配列番号３７５に対して９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２、７、３７６、または３７７のいずれか１つに従う配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくとも または配列番号と約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 ： ２ またはその補数。 第２のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含み、 配列番号７またはその相補体と９９％または１００％の配列同一性； 第３のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含み、 配列番号３７６またはその相補体と９９％または１００％の配列同一性； そして、第４のｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含む 、配列番号３７７またはその相補体と９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態において、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％の配列を含むＰＡＭ配列を含む組成物および方法が本明細書に記載される。 、配列番号９７～１９３のいずれか１つまたは表４に従う配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくとも 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号９７～１９３のいずれか１つまたは表４に従う配列に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号９７～１９３のいずれか１つまたは表４に従う配列に対して少なくともまたは約９９％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号９７～１９３のいずれか１つまたは表４に従う配列に対して少なくともまたは約１００％相同性の配列を含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約１００％の相同性を有する配列を含む。 配列番号９７～１９３または表４に示される配列のいずれか１つの、１、２、３、４、５、６、または６を超えるヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約７０のヌクレオチドを含む。 配列番号のいずれか１つに対する％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 ：９７～１９３は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つに対して９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。 、配列番号１９４～２１２のいずれか１つまたは表１に従う配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約９５％の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号１９４～２１２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む： 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号１９４～２１２のいずれか１つまたは表１に示される配列に対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号１９４～２１２のいずれか１つまたは表１に示される配列に対して少なくともまたは約１００％相同性の配列を含む。 ｇＲＮＡは、配列番号のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０または２０ヌクレオチドを超える配列を含む ： １９４－２１２ または表 １ に従う配列。
いくつかの実施形態において、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％の配列を含むＰＡＭ配列を含む組成物および方法が本明細書に記載される。 、配列番号２１３～２３１のいずれか１つまたは表１に従う配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくとも 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２１３～２３１のいずれか１つまたは表１に従う配列に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２１３～２３１のいずれか１つまたは表１に従う配列に対して少なくともまたは約９９％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２１３～２３１のいずれか１つまたは表１に従う配列に対して少なくともまたは約１００％の相同性を有する配列を含む。 配列番号２１３～２３１または表１に従う配列のいずれか１、２、３、４、５、６、または６を超えるヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約７０個のヌクレオチドを含む。 配列番号のいずれか１つに対する％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 ：２１３～２３１は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む配列を標的とするｇＲＮＡとともに使用される。 配列番号１９４～２１２のいずれか１つに対して、％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。 、配列番号２３２～２４３のいずれか１つまたは表２に従う配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約９５％の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２３２～２４３のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む： 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２３２～２４３または表２に示される配列のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２３２～２４３のいずれか１つまたは表２に示す配列と少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。 ２． いくつかの例では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の配列を含む。 配列番号２３２～２４３のいずれか１つまたは表２に従う配列の２０ヌクレオチドよりも多い。
いくつかの実施形態において、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％の配列を含むＰＡＭ配列を含む組成物および方法が本明細書に記載される。 、配列番号２４４～２５５のいずれか１つまたは表２に従う配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくとも 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２４４～２５５のいずれか１つまたは表２に従う配列に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２４４～２５５のいずれか１つまたは表２に従う配列に対して少なくともまたは約９９％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号２４４～２５５のいずれか１つまたは表２に従う配列に対して少なくともまたは約１００％の相同性を有する配列を含む。 配列番号２４４～２５５または表２に示される配列のいずれか１つの、１、２、３、４、５、６、または６を超えるヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約７０のヌクレオチドを含む。 配列番号のいずれか１つに対する％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 ：２４４～２５５は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、 配列番号２３２～２４３のいずれか１つに対して９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む。 、配列番号２５６～３０５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、少なくともまたは約９５％の配列を含む。 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２５６～３０５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む： 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２５６～３０５のいずれか１つまたは表３に示す配列に対して少なくともまたは約９９％の相同性を有する配列を含む。 ３． 場合によっては、ｇＲＮＡによって標的化される配列は、配列番号２５６～３０５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。 ｇＲＮＡは、配列番号のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０または２０ヌクレオチドを超える配列を含む ： ２５６－３０５ または表 ３ に従う配列。
いくつかの実施形態において、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％の配列を含むＰＡＭ配列を含む組成物および方法が本明細書に記載される。 、配列番号３０６～３５５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくとも 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号３０６～３５５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号３０６～３５５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して少なくともまたは約９９％の相同性を有する配列を含む。 場合によっては、ＰＡＭ配列は、配列番号３０６～３５５のいずれか１つまたは表３に従う配列に対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約１００％の相同性を有する配列を含む。 配列番号３０６～３５５または表３に示される配列のいずれか１つの、１、２、３、４、５、６、または６を超えるヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくともまたは約７０のヌクレオチドを含む。 配列番号のいずれか１つに対する％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性 ：３０６～３５５は、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％の配列を含む配列を標的とするｇＲＮＡとともに使用される。 配列番号２５６～３０５のいずれか１つに対して、％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性。
特定の実施形態において、ＨＳＶゲノム内の配列を標的とするための組成物および方法が本明細書に記載される。 いくつかの実施形態では、構築物またはベクターは、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用される。 いくつかの実施形態では、構築物またはベクターは、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含む。 場合によっては、構築物またはベクターは、配列番号３８０に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。場合によっては、構築物またはベクターは、 場合によっては、構築物またはベクターは、配列番号３８０に対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。配列番号３８０。いくつかの例では、構築物またはベクターは、配列番号３８０に対して少なくともまたは約１００％相同な配列を含む。いくつかの例では、構築物またはベクターは、少なくともまたは約１００、２００、２００％の配列を含む。 ３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８ ００、４０００、４２００、４４００、 ４６００、４８００、５０００、５２００、５４００、５６００、５８００、６０００、６２００、６４００、６６００、６８００、７０００、７２００、７４００、７６００、７８００、８０００、８２００、８４００、またはそれ以上配列番号の８４００ヌクレオチドよりも 特定の実施形態では、構築物またはベクターは、配列番号３８０のＣＲＩＳＰＲーＣａｓ酵素配列およびｇＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、構築物またはベクターは、７０％、８０％を有するＣＲＩＳＰＲーＣａｓ酵素配列およびｇＲＮＡ配列を含む。 配列番号３８０のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素配列およびｇＲＮＡ配列に対して、％、８５％、９０％、９５％の配列同一性。
特定の実施形態において、ＨＳＶゲノム内の配列を標的とするための組成物および方法が本明細書に記載される。 いくつかの実施形態では、核酸構築物またはベクターが、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用される。 いくつかの実施形態では、構築物またはベクターは、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列を含む。 場合によっては、構築物またはベクターは、配列番号３８１に対して少なくともまたは約９５％の相同性を有する配列を含む。場合によっては、構築物またはベクターは、 場合によっては、構築物またはベクターは、配列番号３８１に対して少なくともまたは約９７％相同性の配列を含む。場合によっては、構築物またはベクターは、配列番号３８１に対して少なくともまたは約９９％相同性の配列を含む。 場合によっては、構築物またはベクターは、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００の配列を含む、配列番号３８１のヌクレオチド。
さらに、ＩＣＰ０遺伝子の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡ、および／またはＩＣＰ２７遺伝子の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸が提供される。 いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２および／または配列番号７に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２および／または配列番号７に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする配列を含む。 いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２、７、３７６、および３７７のいずれか１つによる１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする配列を含む。 いくつかの実施形態では、核酸は、約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％を有する１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列を含む。 、配列番号２、７、３７６、および３７７のいずれか１つに対して９９％、または１００％の配列同一性を有する。
さらに、特定の実施形態では、ＩＣＰ０遺伝子の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡ、および／またはＩＣＰ２７遺伝子の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸が提供される。 遺伝子。 いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１～３７７のいずれか１つによる１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする配列を含む。 いくつかの実施形態では、核酸は、約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、 配列番号１～３７７のいずれか１つに対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性。 いくつかの実施形態では、核酸は５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む。 いくつかの実施形態では、核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージされるように構成される。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。 いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＩエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘルペスウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象におけるヘルペスウイルス感染症の治療または予防のための組成物を提供する。 いくつかの実施形態では、組成物は、ヘルペスウイルスゲノム中の標的領域に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの単離されたガイド核酸を含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体を含む。 単離された核酸ガイド分子と ＣＲＩＳＰＲ 関連 （Ｃａｓ） ペプチドは一緒に機能して、ヘルペスウイルスゲノム内の標的部位に １ つ以上の変異を導入し、それによってウイルスの感染力を阻害する。
組成物はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つ以上の要素をコードする単離された核酸を包含する。 例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、ガイド核酸およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つをコードする単離された核酸を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヘルペスウイルス感染症の治療または予防を必要とする対象におけるヘルペスウイルス感染症の治療または予防のための方法を提供する。 いくつかの実施形態では、方法は、ガイド核酸およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。 特定の場合には、この方法は、単離された核酸を含む組成物を投与することを含む。ガイド核酸およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つをコードする、 特定の実施形態では、本方法は、ヘルペスウイルス感染症を発症するリスクがある、ヘルペスウイルス感染症と診断された対象に本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペスウイルス－３（ＨＨＶ－３；水痘帯状疱疹ウイルス）を含むがこれらに限定されないヘルペス」ウイルス感染症を治療または予防するために使用される。 （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス（ＫＳＨＶ））。
（ヘルペス」ウイルス）
ヘルペス」ウイルス属は、アルファヘルペス」ウイルス（ＨＳＶ１、性器ヘルペスを引き起こす単純ヘルペス２型、水痘や帯状疱疹を引き起こす水痘・帯状疱疹ウイルスなど）の３つの属に分けられます。 ベータヘルペス」ウイルス（例：６番目の疾患を引き起こすＨＨＶ－６、および乳児バラ疹を引き起こすＨＨＶ－７）。 ガンマヘルペス」ウイルス（例：単核球症やその他の疾患を引き起こすエプスタイン・バーウイルス、カポジ肉腫を引き起こすＨＨＶ－８）。 アルファヘルペス」ウイルスは、同様のライフサイクルを共有するだけでなく、ウイルスの複製と再活性化に不可欠なウイルスタンパク質の多くに相同な ＤＮＡ 配列を持っている。
単純ヘルペス １ 型 （ＨＳＶ１） は、カプセル化された １５３ キロベース （ｋＢ） の二本鎖 ＤＮＡ ウイルスで、ほぼ遍在するヒトの病原体です。 米国人口の最大 ６０％ が ４０ 代までに ＨＳＶ１ に感染している。 一次感染は通常、幼児期に起こり、発熱と頬粘膜および歯肉粘膜の病変を特徴とするが、不顕性感染も頻繁に発生する。 ＨＳＶ１ の初感染は性的接触によっても発生する可能性があり、性器ヘルペスの原因として ＨＳＶ１ が増加していることが判明している。 通常、初感染の症状はかなり軽いですが、特に新生児期に感染した場合や免疫不全の人が ＨＳＶ１ に接触した場合には、生命を脅かす感染症が発生する可能性がある。
一次感染後、ＨＳＶ１ ゲノムは感覚ニューロン内で長期間休眠状態になることがある。 ウイルスのライフサイクルのこの段階では、ＨＳＶ１ ゲノムは潜在的に感染したニューロンの核内にスーパーコイル状のエピソーム状態で存在する。 この状態では、ウイルスタンパク質は生成されず、ウイルス転写物である潜時関連転写物 （ＬＡＴ）が１つだけ生成される。ストレスや紫外線などのさまざまな刺激により、潜伏感染したニューロンからのウイルスの再活性化が引き起こされる可能性がある。 再活性化は、最初の感染から何年も経ってから繰り返し起こる可能性がある。 ＨＳＶ１ の再活性化によって引き起こされる症状は、初感染部位と再活性化の程度によって異なる。 ＨＳＶ１ 再活性化の最も一般的に認識されている形態は口唇ヘルペスです。 これらは通常、紫外線暴露などのさまざまな刺激の後に、口の朱色の境界に現れます。 性器を神経支配する後根神経節ニューロンに蓄えられたウイルスが再活性化すると、再発性性器ヘルペスの形になる。 ＨＳＶ１ 再活性化の口腔口唇および肛門生殖器の症状は、その領域における最初の前駆的なチクチク感と、それに続く感染性ウイルスを含む痛みを伴う水疱の出現によって特徴付けられ、潰瘍化して最終的には治癒する。 その他、よりまれな ＨＳＶ１ 再活性化の症状には、ベル麻痺、耳科手術後の遅発性顔面神経麻痺、前庭神経炎などがある。 ＨＳＶ１ の再活性化は、ヘルペス脳炎や播種性ヘルペスなどのより深刻な症状を引き起こす可能性がある。
一次感染中に、定義された一連のタンパク質発現が発生する。
一次感染中にウイルスが細胞に侵入すると、ウイルスのカプシドが細胞質内で放出され、外皮タンパク質である ＶＨＳ／ＵＬ４１ によって宿主タンパク質の合成が停止される。 ２ 番目の外皮タンパク質である ＶＰ １６ は、宿主タンパク質 Ｏｃｔｉ および ＨＣＦ と複合体を形成して、即時初期 ＨＳＶ１ 転写を誘導する。 これらの最初期遺伝子は、チミジンキナーゼ （ＴＫ） やウイルス ＤＮＡ ポリメラーゼ （ＵＬ３０） など、ウイルス ＤＮＡ 複製に必要な ＨＳＶ１ コード化酵素の発現を誘導する。 ウイルスの ＤＮＡ 生成が進行するにつれて、ウイルスの細胞への侵入に必要なキャプシドタンパク質、外皮タンパク質、糖タンパク質などの後期ウイルスタンパク質が生成される。 ウイルス粒子が集合し、ウイルス ＤＮＡ がキャプシドにパッケージングされる。 最終的には、感染性のウイルス粒子が生成され、周囲の細胞の感染を引き起こし、他の人への感染を可能にする。
ウイルス再活性化の一連の初期段階は、再活性化の後期段階で潜伏感染したニューロンにおけるＨＳＶ１の再活性化中に反映されると考えられている。 ＶＰ １６ などの溶解性感染において重要な役割を果たすタンパク質は、再活性化において同様の重要な役割を果たすと考えられている。 ＨＳＶ１ 再活性化のプロセスが進行するにつれて、すぐに初期の遺伝子発現が起こり、続いて初期、そして後期のタンパク質生成が起こる。 最終的には感染性ウイルス粒子の生成が起こり、隣接する細胞や非感染者への感染伝播につながります。
近年、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および最近ではクラスター化された規則的に間隔をあけられた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）など、内因性遺伝子を標的とするいくつかのシステムが開発されている。 ） 部位特異的二本鎖 ＤＮＡ 切断 （ＤＳＢ） 媒介 ＤＮＡ 修復機構を利用する関連システム ９ （Ｃａｓ９） タンパク質。 これらの酵素は、ＤＳＢ を介した ＤＮＳ 修復メカニズムを介して、正確かつ効率的なゲノム切断を誘導する。 これらの ＤＳＢ を介したゲノム編集技術により、標的遺伝子の欠失、挿入、または修飾が可能になる。
ここ数年、ＺＦＮ と ＴＡＬＥＮ はゲノム編集に革命をもたらしました。 ＺＦＮ と ＴＡＬＥＮ の主な欠点は、制御不能なオフターゲット効果と、各標的部位に合わせたカスタム ＤＮＡ 結合融合タンパク質の退屈で高価な操作であり、普遍的な適用と臨床安全性が制限される。
ＲＮＡ 誘導型 Ｃａｓ９ バイオテクノロジーは、オフターゲット効果を検出することなくゲノム編集を誘導する。 この技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 遺伝子座が移動性遺伝要素 （ウイルス、転移因子、接合プラスミド） に対する ＲＮＡ 誘導適応免疫システムをコードする細菌のゲノム防御機構を利用している。 ３つのタイプ （Ｉ ～ ＩＩＩ） の ＣＲＩＳＰＲ システムが特定されている。 ＣＲＩＳＰＲ クラスターには、先行する可動要素に相補的な配列であるスペーサーが含まれている。 ＣＲＩＳＰＲ クラスターは転写され、成熟 ＣＲＩＳＰＲ （Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ） ＲＮＡ （ｃｒＲＮＡ） に処理される。 Ｃａｓ９ は ＩＩ 型 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ システムに属し、標的 ＤＮＡ を切断する強力なエンドヌクレアーゼ活性を持っている。
Ｃａｓ９ は、約 ２０ 塩基対 （ｂｐ） の固有の標的配列 （スペーサーと呼ばれる） と、リボヌクレアーゼ ＩＩ を利用した ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ のプロセシングのガイドとして機能するトランス活性化低分子 ＲＮＡ （ｔｒａｃｒＲＮＡ） を含む成熟 ｃｒＲＮＡ によってガイドされる。 。 ｃｒＲＮＡ： ｔｒａｃｒＲＮＡ 二重鎖は、ｃｒＲＮＡ 上のスペーサーと標的 ＤＮＡ （ｔＤＮＡ） 上の相補配列 （プロトスペーサーと呼ばれる） の間の相補的塩基対形成を介して、Ｃａｓ９ を標的 ＤＮＡ に導きます。 Ｃａｓ９ は、トリヌクレオチド （ＮＧＧ） プロトスペーサー隣接モチーフ （ＰＡＭ） を認識して、切断部位 （ＰＡＭ から ３ 番目のヌクレオチド） を指定する。 ｃｒＲＮＡ と ｔｒａｃｒＲＮＡ は、別々に発現させることも、合成ステムループ （ＡＧＡＡＡＵ） を介して人工融合スモールガイド ＲＮＡ （ｇＲＮＡ） に操作して、天然の ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ 二重鎖を模倣することもできる。 このようなｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと同様に、直接ＲＮＡトランスフェクションのために合成またはインビトロ転写することができ、あるいはＲＮＡ発現ベクター（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター駆動ベクター）から発現させることができる。 したがって、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ テクノロジーでは、Ｃａｓ９ タンパク質と ｇＲＮＡ の発現が必要です。これにより、標的ゲノム内の特定の標的 ＤＮＡ 結合部位で遺伝子編集複合体が形成され、標的 ＤＮＡ の切断／変異が引き起こされる。
しかしながら、本開示は、Ｃａｓ９媒介遺伝子編集の使用に限定されない。 むしろ、本開示は、ｇＲＮＡを使用して標的配列に標的化することができ、目的の標的部位に編集することができる他のＣＲＩＳＰＲ関連ペプチドの使用を包含する。 例えば、いくつかの実施形態では、本開示はＣｐｆｌを利用して対象の標的部位を編集する。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＳＶ１ゲノムを標的とする新規なＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ技術を使用し、ＨＳＶ１前初期遺伝子、感染細胞タンパク質０（ＩＣＰ０）の特定のドメインを編集することによる遺伝的戦略を採用する。 その表現を廃止する。
しかしながら、本開示は、ＨＳＶ１の予防または治療に限定されない。 むしろ、本開示は、他のヘルペス」ウイルスを治療または予防するために使用することができる。 例えば、ＨＳＶ２ゲノムはＨＳＶ１ゲノムに類似しているため、本明細書に記載の戦略は、ＨＳＶ２の治療または予防に有効であると考えられる。
（ヌクレアーゼ）
操作された ＣＲＩＳＰＲ システムには通常、ガイド ＲＮＡ （ｇＲＮＡ または ｓｇＲＮＡ） と ＣＲＩＳＰＲ 関連エンドヌクレアーゼ （Ｃａｓ タンパク質） の２つのコンポーネントが含まれている。 自然界では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ 関連 （Ｃａｓ） システムは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ （ｃｒＲＮＡ） を使用して侵入核酸のサイレンシングを誘導することにより、細菌や古細菌にウイルスやプラスミドに対する適応免疫を提供する。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ は、配列特異的な検出と外来核酸のサイレンシングを低分子 ＲＮＡ 分子に依存する ＲＮＡ 媒介適応防御システムです。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ システムは、オペロンで構成された ｃａｓ 遺伝子と、ゲノムを標的とする配列 （スペーサーと呼ばれる） で構成される ＣＲＩＳＰＲ アレイで構成される。 本明細書では、細胞内のＨＳＶ ＤＮＡを検出してサイレンシングする操作されたＣＲＩＳＰＲシステムが提供される。
本明細書に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムは、一般に、標的ポリヌクレオチドの領域に相補的または実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ配列と、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質とを含む酵素システムを指す。 ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムには、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、およびそれらの誘導体が含まれる。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ システムには、自然に発生する ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ システムに由来する、操作および／またはプログラムされたヌクレアーゼ システムが含まれる。 特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムは、操作されたおよび／または変異したＣａｓタンパク質を含む。 いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは一般に、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。 いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは一般に、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断することができる。 ニッカーゼは、ＤＮＡ 二重鎖の １ 本鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型システムであり得る。 適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓｉｏ、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨが挙げられる。 、ＣａｓＸ、Ｃａｓ＜Ｄ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４ 、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕｉ ９６６ ． によって さらなる例として、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲーＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓｉｏ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２である。Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２ 、Ｃｓｆ３ 、Ｃｓｆ４、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ２ （例： Ｃａｓｌ２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓｌ２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ｋ、Ｃａｓｌ２ｊ／ Ｃａｓ＜Ｄ、Ｃａｓｌ２Ｌ など）、Ｃａｓ １３ （例： Ｃａｓｌ３ａ、Ｃａｓｌ３ｂ （Ｃａｓｌ３ｂ－ｔｌ、Ｃａｓｌ３ｂ－ｔ２、Ｃａｓｌ３ｂ など） －ｔ３）、Ｃａｓｌ３ｃ、Ｃａｓｌ３ｄ など）、Ｃａｓｌ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、または Ｃａｓ タンパク質の操作された形態。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはエンドヌクレアーゼはＣａｓ１２である。特定の実施形態では、Ｃａｓｌ２ポリペプチドは、Ｃａｓｌ２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓｌ２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ｅ、Ｃａｓｌ２ｇ、Ｃａｓｌ２ｈ、Ｃａｓｌ２ｉ、Ｃａｓｌ２ＬまたはＣａｓｌ２Ｊである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはエンドヌクレアーゼはＣａｓＸである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはエンドヌクレアーゼはＣａｓＹである。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはエンドヌクレアーゼはＣａｓ（登録商標）である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、サーモフィルス連鎖球菌、ストレプトコッカス種、ノカルディオプシス・ダソンビレイ、ストレプトミセス・プリスティナエスピラリス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランに由来するか、またはそれに由来することができる。イウム ロセウム、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス、バチルス シュードミコイデス、バチルス セレニティレデューセンス、エクシグオバクテリウム・シビリクム、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・サリバリウス、ミクロシラ・マリーナ、バークホルデリアル細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポーラー・オモナス属、クロコスファエラ・ワトソーニ、シアノテセス属、ミクロシスティス・アエルギノーサ、シネココッカス属、アセトハロビウム・アラバティクム、アンモニフェックス デゲンシー、カルディセルロシロプトル ベクシー、カンディダトゥス デスルフォルディス 、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、ファイン・ゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクラム・ザ・ロモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ヴィノサム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィラス、ニトロソコッカス・ワトソーニ、シュードアルター・オモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エヴェスティガタム、アナベナ・バリアビリス、 Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ Ｍｏｂｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、または Ａｃａｒｙｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍａｒｉｎａ。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、またはその機能的断片もしくは誘導体を含む。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むがこれに限定されないエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型化膿連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のＣａｓ９アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、他の種、例えばサーモフィラスなどの他の連鎖球菌種由来のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列を含む。 緑膿菌、大腸菌、またはその他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、またはその他の原核微生物。 本開示に有用な他のＣａｓタンパク質は、公知であるか、当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０：１１１６－１１２１を参照）。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、その天然源と比較して、修飾されたアミノ酸配列を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ タンパク質は、少なくとも １ つの ＲＮＡ 認識ドメインおよび／または ＲＮＡ 結合ドメインを含みます。 ＲＮＡ 認識ドメインおよび／または ＲＮＡ 結合ドメインは、ガイド ＲＮＡ （ｇＲＮＡ） と相互作用する。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含むこともできる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または野生型もしくは修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、核酸結合親和性および／または特異性を増加させ、酵素活性を変更し、および／またはタンパク質の別の特性を変化させるために修飾することができる。 例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、修飾、欠失、または不活性化することができる。 あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 様タンパク質を切断して、Ｃａｓ タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去することもできる。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 様タンパク質は、Ｃａｓ タンパク質のエフェクター ドメインの活性を最適化するために切断または修飾することもできる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質またはその断片に由来することができる。 いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は修飾されたＣａｓ９タンパク質である。 例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を改変して、野生型または別のＣａｓタンパク質と比較してタンパク質の１つまたは複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変更することができる。 あるいは、修飾されたＣａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるように、ＲＮＡ誘導性切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインをタンパク質から除去することもできる。
開示されるＣＲＩＳＰＲーＣａｓ組成物はまた、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、ｓａＣａｓ９、Ｃａｓ９タンパク質）と実質的な相同性を有する任意の形態のタンパク質を含むと解釈されるべきである。 いくつかの実施形態では、「実質的に相同」であるタンパク質は、Ｃａｓのアミノ酸配列に対して約５０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９５％相同、または約９９％相同である。 本明細書に開示されるタンパク質。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体を含む。 特定の実施形態では、Ｃａｓペプチドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むがこれに限定されないエンドヌクレアーゼである。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ペプチドは、野生型化膿連鎖球菌Ｃａｓ９アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓペプチドは、他の種、例えば、サーモフィルス、緑膿菌、大腸菌などの他の連鎖球菌種、または他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物由来のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。 。 本開示に有用な他のＣａｓペプチドは、公知であるか、当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０：１１１６－１１２１を参照）。 特定の実施形態では、Ｃａｓペプチドは、その天然源と比較して、修飾されたアミノ酸配列を含み得る。 例えば、いくつかの実施形態では、野生型化膿連鎖球菌Ｃａｓ９配列を改変することができる。 特定の実施形態では、アミノ酸配列は、ヒト細胞（すなわち、「ヒト化」）または目的の種における効率的な発現のためにコドン最適化され得る。 ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７に列挙される発現ベクターのいずれかによってコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であり得る。 ＫＭ０９９２３２．１ ＧＬ６６９１９３７６１； または ＫＭ０９９２３３．１ ＧＬ６６９１９３７６５。 あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）からのＰＸ３３０またはＰＸ２６０などの市販のベクター内に含まれる配列であってもよい。 いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体または断片であるアミノ酸配列を有することができる。 ＫＭ０９９２３２．１ ＧＬ６６９１９３７６１ ； またはＫＭ０９９２３３．１ ＧＬ６６９１９３７６５、またはＰＸ３３０もしくはＰＸ２６０のＣａｓ９アミノ酸配列（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。
Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性な変異体をコードするように修飾することができ、これらの変異体は、例えば、１つまたは複数の突然変異（例えば、 付加、欠失、置換変異、またはそのような変異の組み合わせ）。 １つまたは複数の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）であり得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓペプチドは変異体Ｃａｓ９であり、変異体Ｃａｓ９は野生型Ｃａｓ９と比較してオフターゲット効果を低減する。 いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ９は化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）変異体である。
いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｈ９８２Ａ、ＫＩ００３Ａ、およびＲ１０６０Ａを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の点突然変異を含む（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、２０１６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５１（６２６８）） ：８４－８８）。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、ＤＩ１３５Ｅ点突然変異を含む（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ， ５２３（７５６１）： ４８１－４８５）。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ、およびＹ４５０Ａ（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１６、Ｎａｔｕｒｅ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ６５２６）。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ、およびＭ６９８Ａを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の点突然変異を含む。 Ｙ４５０ は疎水性塩基対のスタッキングに関与している。 Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６ は、オフターゲット効果に寄与する残基と塩基の水素結合に関与している。 Ｎ４９７ ペプチド骨格を介した水素結合。 Ｌ１６９Ａ は疎水性塩基対のスタッキングに関与している。 Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ、および Ｈ６９８Ａ は、疎水性塩基対のスタッキングに関与している。
いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、以下の残基の１つ以上に１つ以上の点突然変異を含む：Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｈ９８２、ＫＩ００３、Ｒ１０６０、ＤＩ１３５、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６、Ｌ１６９、 Ｙ４５０、Ｍ４９５、Ｍ６９４、Ｍ６９８。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａの群から選択される１つ以上の点突然変異を含む。 、 そしてＭ６９８Ａ。
いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＤ１１３５Ｅの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＬ１６９Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＹ４５０Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＭ４９５Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＭ６９４Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＨ６９８Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、ＤＩ１３５Ｅ、およびＬ１６９Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、ＤＩ１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ４９５Ａの点変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ６９４Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ６９８Ａの点変異を含む。
いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＤＩ１３５Ｅの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＬ１６９Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＹ４５０Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＭ４９５Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＭ６９４Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、およびＨ６９８Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、ＤＩ１３５Ｅ、およびＬ１６９Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ４９５Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ６９４Ａの点突然変異を含む。 いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、およびＭ６９８Ａの点突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ９は、ＰＡＭ特異性を変化させる１つまたは複数の変異を含む（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔｕｒｅ， ５２３（７５６１）：４８１－４８５；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３３（１２） ： １２９３－１２９８）。 いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣのＤ１０ＡおよびＨＮＨのＨ８４０Ａを含むがこれらに限定されない、Ｃａｓ９の触媒活性を変化させる１つまたは複数の変異を含む（Ｃｏｎｇら、２０１３；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：９１９ー８２３、Ｇａｓｉｕｂａｓら） 、２０１２；ＰＮＡＳ １０９：Ｅ２５７９－２５８６ Ｊｉｎｅｋら；２０１２；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１）。
しかしながら、本開示は、Ｃａｓ９媒介遺伝子編集の使用に限定されない。 むしろ、本開示は、ｇＲＮＡを使用して標的配列に標的化することができ、目的の標的部位に編集することができる他のＣＲＩＳＰＲ関連ペプチドの使用を包含する。 例えば、いくつかの実施形態では、本開示はＣｐｆｌを利用して対象の標的部位を編集する。 Ｃｐｆｌ は、ヒト細胞内の標的 ＤＮＡ 配列を効果的に編集できる単一の ｃｒＲＮＡ 誘導型クラス ２ ＣＲＩＳＰＲ エフェクター タンパク質です。 例示的なＣｐｆｌには、アシダミノコッカス種が含まれるが、これに限定されない。 Ｃｐｆｌ （ＡｓＣｐｆｌ） およびラクノスピラ科細菌Ｃｐｆｌ （ＬｂＣｐｆｌ）。
本開示はまた、本明細書に開示されるＣａｓペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と実質的な相同性を有するペプチドの任意の形態を含むと解釈されるべきである。 好ましくは、「実質的に相同」であるペプチドは、約５０％相同であり、より好ましくは約７０％相同であり、さらにより好ましくは約８０％相同であり、より好ましくは約９０％相同であり、さらにより好ましくは約９５％相同であり、さらにそれ以上である。 好ましくは、本明細書に開示されるＣａｓペプチドのアミノ酸配列に対して約９９％相同である。
あるいは、ペプチドは、組換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製されてもよい。 ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認できる。
本開示によるペプチドの変異体は、（ｉ） １つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されているもの、およびそのような置換アミノ酸であり得る。 残基は、遺伝暗号によってコードされる残基であってもなくてもよい、（ｉｉ） １ つまたは複数の修飾アミノ酸残基が存在する残基、例えば、置換基の結合によって修飾される残基、（ｉｉｉ） ペプチドが含まれる残基 本開示のペプチドの選択的スプライス変異体であり、（ｉｖ） ペプチドの断片、および／または（ｖ） ペプチドがリーダー配列もしくは分泌配列または使用される配列などの別のペプチドと融合したものである。 精製用（例：Ｈｉｓタグ）または検出用（例：Ｓｖ５エピトープタグ）。 フラグメントには、元の配列のタンパク質分解的切断 （複数部位のタンパク質分解を含む） によって生成されたペプチドが含まれる。 変異体は翻訳後修飾または化学修飾を受ける場合がある。 このような変形例は、本明細書の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
当該技術分野で知られているように、２つのペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。 変異体は、元の配列とは異なるペプチド配列、好ましくは対象セグメント当たり残基の４０％未満が元の配列と異なり、より好ましくは対象セグメント当たり残基の２５％未満が元の配列と異なるペプチド配列を含むように定義され、 より好ましくは、対象のセグメントあたり残基の１０％未満の差があり、最も好ましくは、対象のセグメントあたりわずか数残基において元のタンパク質配列と異なり、同時に元の配列と十分に相同であり、元のタンパク質の機能を保存する。 順序。 本開示は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似または同一であるアミノ酸配列を含む。 。 ２つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定される。 ２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 ２１５： ４０３－４１０ （１９９０）］。
本開示のペプチドは、翻訳後修飾することができる。 例えば、本開示の範囲に含まれる翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディングおよびタンパク質分解プロセシングなどが含まれる。いくつかの修飾またはプロセシング事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする。 。 例えば、シグナルペプチド切断およびコアグリコシル化などのプロセシング事象は、イヌミクロソーム膜またはアフリカツメガエル卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応に添加することによって検査される。
本開示のペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成された非天然アミノ酸を含み得る。 タンパク質の翻訳中に非天然アミノ酸を導入するには、さまざまなアプローチが利用できる。
本開示のペプチドまたはタンパク質は、タンパク質などの他の分子と結合して、融合タンパク質を調製することができる。 これは、例えば、得られる融合タンパク質がＣａｓペプチドの機能を保持しているという条件で、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る。
本開示のペプチドまたはタンパク質は、Ｒｅｅｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている方法などの従来の方法を使用してリン酸化され得る。 （ＥＭＢＯ ジャーナル １１（４）： １３６５、１９９２）。
本開示のペプチドの環状誘導体も本開示の一部である。 環化により、ペプチドは他の分子と結合するためにより好ましい立体構造をとることができる可能性がある。 環化は、当技術分野で知られている技術を使用して達成することができる。 例えば、ジスルフィド結合は、遊離スルフヒドリル基を有する適切に離間した２つの成分間で形成され得るか、またはアミド結合は、ある成分のアミノ基と別の成分のカルボキシル基との間に形成され得る。 環化はまた、Ｕｌｙｓｓｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ． 化学。 社会 １９９５、１１７、８４６６－８４６７。 結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、またはその ２ つの組み合わせである場合がある。 本開示の一実施形態では、環状ペプチドは、正しい位置にベータターンを含み得る。 ベータターンは、アミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを正しい位置に付加することによって、本開示のペプチドに導入され得る。
上述のペプチド結合を含む環状ペプチドよりも柔軟性のある環状ペプチドを生成することが望ましい場合がある。 より柔軟なペプチドは、ペプチドの右側と左側の位置にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することによって調製できる。 ２つのシステインはβシートを変形させず回転しないように配置されている。 このペプチドは、ジスルフィド結合の長さとベータシート部分の水素結合の数が少ないため、より柔軟になる。 環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって決定できる。
本開示はまた、標的タンパク質に融合または統合されたＣａｓペプチド、および／またはキメラタンパク質を所望の細胞成分または細胞型または組織に向けることができる標的化ドメインを含むペプチドに関する。 キメラ
タンパク質には追加のアミノ酸配列またはドメインが含まれる場合もある。 キメラタンパク質は、さまざまな成分が異なる供給源に由来し、自然界では一緒に見出されない（すなわち、異種である）という意味で組換えである。
いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、またはタンパク質を例えば小胞または核と結合させる配列であり得る。 いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ペプチドを特定の細胞型または組織に標的化することができる。 例えば、標的化ドメインは、細胞表面リガンド、または標的組織（例えば、癌性組織）の細胞表面抗原に対する抗体であり得る。 標的化ドメインは、本開示のペプチドを細胞成分に標的化することができる。 特定の実施形態では、標的化ドメインは、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を標的とする。
他の分子と結合した本開示のペプチドまたはキメラタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術を通じて、ペプチドまたはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端と、 所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択可能なマーカーの配列。 得られた融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたＣａｓペプチドまたはキメラタンパク質を含む。 融合タンパク質の調製に使用できるタンパク質の例には、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、ヘマグルチニン （ＨＡ）、および切断型 ｍｙｃ が含まれる。
本開示のペプチドは、従来の技術によって合成され得る。 例えば、本開示のペプチドは、固相ペプチド合成を使用する化学合成によって合成され得る。 これらの方法は、固相または液相合成法のいずれかを使用する（例えば、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ（１９８４）およびＧ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、 固相合成技術については、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｌｏｇｙ 編集者 Ｅ． Ｇｒｏｓｓ および Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ Ｖｏｌ． ２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０、ｐｐ． ３－２５４、および Ｍ Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、 ベルリン １９８４、および Ｅ． Ｇｒｏｓｓ および Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ 編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ、上巻、古典的な溶液合成について。）。
本開示のペプチドは、ペプチド合成の標準的な化学的または生物学的手段によって調製され得る。 生物学的方法には、宿主細胞またはインビトロ翻訳系におけるペプチドをコードする核酸の発現が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のペプチドの生物学的調製には、所望のペプチドをコードする核酸の発現が含まれる。 このようなコード配列を含む発現カセットは、所望のペプチドを生成するために使用され得る。 例えば、本開示のペプチドをコードする核酸配列のサブクローンは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：に記載されているような、遺伝子断片をサブクローニングするための従来の分子遺伝子操作を使用して生成することができる。実験室マニュアル、コールド スプリングス研究所、コールド スプリングス ハーバー、ニューヨーク （２０１２）、および Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（１９９９年およびそれ以前の版）、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。 次いで、サブクローンを細菌細胞内でインビトロまたはインビボで発現させて、特定の活性について試験できるより小さなタンパク質またはポリペプチドを生成する。
発現ベクターに関して、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入することができる。 本開示の所望のペプチドのコード配列は、本明細書で実証されるように発現効率を改善するために、意図される宿主細胞のコドン使用に基づいてコドン最適化され得る。 コドン使用パターンは文献で見つけることができる（ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２９２）。 適切な宿主の代表例としては、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌の細胞などの細菌細胞が挙げられる。 酵母細胞やアスペルギルス細胞などの真菌細胞。 ショウジョウバエ Ｓ２ 細胞やスポドプテラ Ｓｆ９ 細胞などの昆虫細胞。 動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞； そして植物細胞。
線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが当技術分野で知られている。 したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。 この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むものと解釈されるべきである。 ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターは、本明細書の他の箇所で詳細に論じられるように、物理的、生物学的または化学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
化学合成技術または生物学的合成技術のいずれかから得られたペプチドが所望のペプチドであることを確認するために、ペプチド組成の分析を実施することができる。 このようなアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するために高分解能質量分析法を使用して実施され得る。 あるいは、またはさらに、ペプチドのアミノ酸含有量は、酸水溶液中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣまたはアミノ酸分析装置を使用して混合物の成分を分離、同定および定量することによって確認することができる。 ペプチドを順次分解してアミノ酸を順番に識別するプロテインシークエネーターも、ペプチドの配列を明確に決定するために使用できる。
本開示のペプチドおよびキメラタンパク質は、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸と反応させることによって医薬塩に変換することができる。 、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼを含む遺伝子編集システムが本明細書に記載される。 いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。 いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。 これらの遺伝子編集システムは、ＤＮＡ 認識のモードに基づいて２ つのカテゴリに大まかに分類できる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼはタンパク質－ＤＮＡ 相互作用を介して特異的な ＤＮＡ 結合を達成するが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ システムは短い ＲＮＡ ガイドによって特定の ＤＮＡ 配列を標的とする。 タンパク質と ＤＮＡ の相互作用によって、標的 ＤＮＡ と直接塩基対を形成する分子。 したがって、タンパク質ターゲティングまたは核酸ターゲティングを使用して、本明細書に記載のＨＳＶゲノムをターゲティングすることができる。
（ガイド核酸）
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの単離されたガイド核酸またはその断片を含み、ガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノム中の１つまたは複数の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。 いくつかの実施形態では、ガイド核酸はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を含む。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の天然の二重鎖を模倣するステムループを含む。 いくつかの実施形態では、ステムループは、ＡＧＡＡＡＵを含むヌクレオチド配列を含む。 例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、ｃｒＲＮＡ、ステム、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む合成またはキメラガイドＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、組成物は、ハイブリダイズして天然の二本鎖を形成する単離されたｃｒＲＮＡおよび／または単離されたｔｒａｃｒＲＮＡを含む。 例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ターゲティング配列を含むｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヘルペス」ウイルスゲノム内の標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。 ヘルペス」ウイルスゲノム内の標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 媒介遺伝子編集によりゲノムの突然変異とウイルス感染力の阻害が生じるコード領域または非コード領域の任意の配列でありえます。特定の実施形態では、ｇＲＮＡが実質的に相補的である標的配列は、ＵＬ５６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子内にある。
ＩＣＰＯ遺伝子を標的とする例示的なｇＲＮＡヌクレオチド配列には、ｃｃａｔｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇａ（配列番号１）；ｃｃａｔｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇａ（配列番号１）； ｇｔａｃｃｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔ （配列番号２）； ｇａｃａｃｇｇｇｃａｃｃａｃａｃａｃｃａ （配列番号３）； ｔｃｃｃｇｃｇｔｃａａｔｃａｇｃａｃｃｃ （配列番号４）； ｔｃａｃｔｔｔｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｃ （配列番号５）； ｃｃｔｔａｃｔｃａｃａｃｇｃａｔｃｔａｇ （配列番号６）； ｃｔｃａｇｇｃｃｇｃｇａａｃｃａａｇａａ （配列番号７）； ｇｔｔｃｇｃｇｇｃｃｔｇａｇｃｃａｇｇｇ （配列番号８）； ｇｃｔａａｇｇｇｇａａａａａｇｇｇｇｇ（配列番号９）； ｔｔｔｇａｃｔｃａｇａｃｇｃａｇｇｇｃｃ （配列番号１０）； ｔｔｔｔｔｔｃｃｃｃｔｔａｇｃｃｃｇｃｃ （配列番号１１）； ｃａａｃａｇａｃａｇｃａａａａａａｔｃｃｃ （配列番号１２）； ｔｃｇａａｃａｇｃａｔｇｔｔｃｃｃｃａｃ （配列番号１３）； ｇａｃｃｃｔａｔａｔａｃａｇｇｇａｃ（配列番号１４）； ｇｃｇｇｇａｇａａｇａｇｇｇａａｇａａｇ （配列番号１５）； ｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｇｔｃｔｃｇｃｔ （配列番号１６）； ｃｃｃｃａｃｔｔｃｇｇｔｃｔｃｃｇｃｃｔ （配列番号１７）； ｇｇｔｇｃｇｔｃｃｇａｇｇａａｇａｇｇｃ （配列番号１８）； ｇｃｇｔｃｇｇａｇｔｇｇａａｃａｇｃｃｔ （配列番号１９）； ｇｇｔｃｔｇｃａａｃｃａａａｇｇｔｇｇｔ （配列番号２０）； ｇｇｔｃｔｇｔａｔａｔａｔａａａｇｔｃａ （配列番号２１）； ｃｔｃｃｃｇｃｃｃｔｃｃａｇａｃｇｃａｃ （配列番号２２）； ｇｔｇｔｃｔｃｔｇｔｇｔａｔｇａｇｔｃａ （配列番号２３）； ｔｇｃａｔｃｃｃｇｔｇｃａｔｇａａａａｃ （配列番号２４）； ｇｇｇｔａａｃｃａｃｇｔｇａｔｇｃｃｃｃ （配列番号２５）； ｔｇａｔｇｃｇｇａｇａｇｇｇｇｇｃｇｇｃ （配列番号２６）； ｃｇｔｇｃｔｇｔｃｃｇｃｃｔｃｇｇａｇｇ （配列番号２７）； ｇａｇｇｃｃｇｃｃｇａｇｇａｃｇｔｃａｇ（配列番号２８）； ｔｔａｃｃｃｇｃｇｇｔｃｔｃｇｇｇｇａｇ （配列番号２９）； ｃｃｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔａｇａｔｇｃｇｔ （配列番号３０）； ｃｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃａａｇｇｇｇｇ （配列番号３１）； ガガッガガガガガッグト（配列番号３２）； ｇｇｇｇｇａｇｔｃｇｃｔｇａｔｃａｃｔａ （配列番号３３）； ｇｃａｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃｇａｇａｃｃ （配列番号３４）； ｃｇｇａａｇｔｃｃａｇｇｇｃｇｃｃｃｃａｃ （配列番号３５）； ｇａｔａｇｔｇｇｇｃｇｔｇａｃｇｃｃｃａ （配列番号３６）； ｇｇｃｇａｃｃｃｃｇｇｇｃｃｃｔｇｃｇｔ （配列番号３７）； ｇｔｃｔｇｇｇｇｇｔｃｇｔｔｃａｃｇａｔ （配列番号３８）； ｔｇｃａｔｃｃａｇｇｔｔｔｔｃａｔｇｃａ （配列番号３９）； ｔｃｇｔｃｃｇｔｇｇｔｇｇｇｃｔｃｃｇｇ （配列番号４０）； ｔｃｃｃｔｇｔａｔａｔａｔａｇｔｇｔｃａ （配列番号４１）； ｃａｃａａｃａａａｃａｃａｃａｇｇｇａｃ （配列番号４２）； ｇｇｇａａａａａａｇｇｇｇｇｇｃｇｇｇｔ （配列番号４３）； ｇｇｇｇｃｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｃｃｇｇ （配列番号４４）； ｇｇｇａｃｇｃｇｔｇｇａｃｔｇｇｇｇｇｇ （配列番号４５）； ａｃｃｃｇｇａｇｃｃｃａｃｃａｃｇｇａｃ （配列番号４６）； ｃｃｃｔａａｔａａａａａａａａｃｔｃａ （配列番号４７）； ｔｇｇｇｇｇｃｇｇｃｃｃｔｃａｇｇｃｃｇ （配列番号４８）； ｃｃｃｃｇｇｃｃｃｔｇａｇｔｃｇｇａｇｇ （配列番号４９）； ｔｃｃｃｔｇｔａｔａｔａｔａｇｇｇｔｃａ （配列番号５０）； ｇｃｃｃｔｃａｃｃｇｔｇｔｇｃｃｃｃｃｃ （配列番号５１）； ｃｃａｃｔｃｃｇａｃｇｃｇｇｇｇｇｃｃｇ （配列番号５２）； ａｃｇｇｃｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃｔｃｃａｔ（配列番号５３）； ａｔｇｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔｃｃａｔｇｔｃ （配列番号５４）； ｃｃｃｇｇｃｔｃｃｃｇｔｇｔａｔｇａｇｔ （配列番号５５）； ｇｃｇａｃｇｔｇｔｇｃｇｃｃｇｔｇｔｇｃ （配列番号５６）； ａｔｇｇｃｇｃｃｃｇｇｃｔｃｃｃｇｔｇｔ （配列番号５７）； ｇｇｇｇｇｃｇｃｃｃｃｃｇｃａａｃｔｇｃ （配列番号５８）； ａｔｇｇｇｇｇｔｃｇｔａｔｇｃｇｇｃｔｇ （配列番号５９）； ｃｃｃｔｅｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｃｃ （配列番号６０）； ｇｔｇｇｇｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｔｇｔ （配列番号６１）； ｃｃｇｇｇｇａｃｃｇｃｇｇｃｃｃｇｃａｇ （配列番号６２）； ｇｔｃｇｃｇｇａｃｇｇａｇｇｇｔｃｃｃｔ （配列番号６３）； ｇｇｇｇｇｃｇｇｇｔａａｇａａｔｇｇｇｇ （配列番号６４）； ｃｃｔｇｔｇｇｇｇａｇａｇｇｃｃｇｇｇｇ （配列番号６５）； ｃｃｔｔａｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇａｔｇｔ （配列番号６６）； ａｇｇｇｇｃｃａｔｇｔｇｔａｔｇｔｇｔｔ （配列番号６７）； ａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｇｔｔｃｃａｇｔｇｔ （配列番号６８）； ｃｇｇｃｔｇｇａｇｇｇｔｃｇｃｇｇａｃｇ （配列番号６９）； ａｇｇｔｇｇｔｃｔｇｇｇｔｃｃｇｔｃｃｔ （配列番号７０）； ｃｃｔａｔｇｔｔｔｔｃｃｃｔｃｇｔｃ（配列番号７１）； ｃｃｇｇｔｔｃｃａｇｔｇｔａａｇｇｇｔｃ （配列番号７２）； ｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｔｃｃａｔ （配列番号７３）； ｃｃｔｃｇｇａａｇａｇｇｇｇｇｇａｇａａ （配列番号７４）； ｇａｃｃｃｃｇｇｔｃｃｃｔｇｔａｔａｔａ（配列番号７５）； ｃｔｇｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｃｃｃｃｇｇｃｃ （配列番号７６）； ｇｇｇｇｇｇｔｔｇｇｇｇｔｔｇｇｇｇｔ（配列番号７７）； ｇｇｇｇａｇｇｇｇｇｇｇｔｃｇｇｇｃｇ（配列番号７８）； ｇｇｇｇｇｇｇａｇａｇｇｇｇｇａａｃｔｃ （配列番号７９）； ｇｃｇｇａａｇａｇｇｃｇｇｃｃｃｃｃｇｃ （配列番号８０）； ａｃｇｃｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｃｔｃ （配列番号８１）； ｔｇａｇｔａａｇｇｇｇｇｇｃｃｔｇｃｇｔ （配列番号８２）； ｇｇａｃｃｇｇｇｇｇｃｇｃｃａｔｇｔｔａ （配列番号：８３）； ｃｃｃｃｇｔｇｔｔｔｇｔｇｇｇｇａｇｇｇ （配列番号８４）； ａｔｃｃｔｃｇｔｃｃｇｔｇｇｔｇｇｇｃｔ （配列番号８５）； ｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｃｃｇｇｇｇｇｇｔ （配列番号８６）； アガガガッグッグッグガッグ（配列番号８７）； ｃｃａｃｇｇｃｃｇｃｇｃｇｇｇｇｇｃｇｃ （配列番号８８）； ｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｇｃｃｇｇｇｃｇｔｇ （配列番号８９）； ｃｃｔｃｃａｇａｃｇｃａｃｃｇｇａｇｔｃ （配列番号９０）； ｃｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃｇｇａｃｃ （配列番号９１）； ｃｔｃｇｇｃｃｔｃｃａｔｇｃｇｇｇｔｃｔ （配列番号９２）； ｇｇｇａｃｃｇｇｇｇｔｃｇｃｃｃｔｇｔｔ （配列番号９３）； ｃｃｃｔｃｃｇｇｇｇｇｇｇｇｔｔｇｇｇｇｔ （配列番号９４）； ｇｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃａｇｇｇｃ （配列番号９５）； ｃａｇｇｇｃｃｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｇｃ （配列番号９６）。
ｇＲＮＡとともに使用される例示的なＰＡＭ配列 配列番号１～９６：
ｇｃｇａｇｔ （配列番号９７）； ｃｇｇａｇｔ（配列番号９８）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号９９）； ａｃｇａｇｔ（配列番号１００）； ａｃｇｇａｔ（配列番号１０１）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１０２）； ｃａｇａｇｔ （配列番号１０３）； ａｃｇａｇｔ（配列番号１０４）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１０５）； ｃｇｇｇｇｔ（配列番号１０６）； ｃｃｇｇａｔ （配列番号１０７）； ｃｔｇａｇｔ （配列番号１０８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１０９）； ｃｇｇｇｇｔ（配列番号１１０）； ａｇｇｇｇｔ （配列番号１１１）； ｃｃｇａｇｔ （配列番号１１２）； ｃａｇａｇｔ （配列番号１１３）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１１４）； ｃｔｇｇａｔ （配列番号１１５）； ｃｔｇｇｇｔ （配列番号１１６）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１１７）； ｃｇｇａｇｔ（配列番号１１８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１１９）； ｃｔｇｇａｔ （配列番号１２０）； ｃｃｇａｇｔ （配列番号１２１）； ｃｃｇａｇｔ （配列番号１２２）； ｃｇｇａｇｔ（配列番号１２３）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１２４）； ｃａｇｇｇｔ（配列番号１２５）； ｇｔｇａｇｔ （配列番号１２６）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１２７）； ｃｇｇｇａｔ （配列番号１２８）； ｔｇｇｇｇｔ （配列番号１２９）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１３０）； ｔａｇｇｇｔ （配列番号１３１）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１３２）； ｃｔｇａｇｔ （配列番号１３３）； ｃｇｇｇａｔ （配列番号１３４）； ｃｇｇｇａｔ （配列番号１３５）； ｇｔｇｇｇｔ （配列番号１３６）； ｃｇｇｇｇｔ（配列番号１３７）； ｃｇｇｇｇｔ（配列番号１３８）； ａａｇａａｔ （配列番号：１３９）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１４０）； ａｇｇｇｇｔ （配列番号１４１）； ガガット（配列番号１４２）； ｇｇｇｇａｔ（配列番号１４３）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１４４）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１４５）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１４６）； ｃａｇｇｇｔ（配列番号１４７）； ｔｃｇｇｇｔ （配列番号１４８）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１４９）； カガット（配列番号１５０）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１５１）； ａｃｇｇａｔ（配列番号１５２）； ａｔｇａｇｔ （配列番号１５３）； ｃｇｇｇｇｔ（配列番号１５４）； ｇａｇｇｇｔ（配列番号１５５）； ｃａｇｇｇｔ（配列番号１５６）； ａｔｇａｇｔ （配列番号１５７）； ｃｃｇｇｇｔ （配列番号１５８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１５９）； ｇｇｇｇａｔ（配列番号１６０）； ｇｇｇａｇｔ（配列番号１６１）； ｃｔｇｇｇｔ （配列番号１６２）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１６３）； ａａｇｇｔ （配列番号１６４）； ｇａｇｇｇｔ（配列番号１６５）； ｔｔｇｇａｔ （配列番号１６６）； ｃｃｇｇｇｔ （配列番号１６７）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１６８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１６９）； ａｇｇｇｇｔ （配列番号１７０）； ｔａｇｇｇｔ （配列番号１７１）； ｃｔｇａｇｔ （配列番号１７２）； ｔｇｇｇｇｔ （配列番号１７３）； ｃｔｇｇｇｔ （配列番号１７４）； ｇｔｇｇｇｔ （配列番号１７５）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１７６）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１７７）； ａｔｇａｇｔ （配列番号１７８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１７９）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１８０）； ｃｃｇｇｇｔ （配列番号１８１）； ｔｇｇｇｇｔ （配列番号１８２）； アガート（配列番号１８３）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号１８４）； ｇａｇｇｇｔ（配列番号１８５）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１８６）； 配列番号１８７）； ａｃｇｇｇｔ （配列番号１８８）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１８９）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号１９０）； ｔｇｇｇｇｔ （配列番号１９１）； ｇｔｇｇａｔ （配列番号１９２）； ｃａｇｇｇｔ（配列番号１９３）。
ＵＬ５６遺伝子を標的とするための例示的なｇＲＮＡヌクレオチド配列には、ｃｃｇｃｇｃｔｃｃａｔａａａｃｃｃｇｃｇ （配列番号１９４）； ｃｔｇｇｔｔｔｃｃｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号１９５）； ｃａｃｇｇａｃａａｃａｇｇｇｇｃｃｃａｇ （配列番号１９６）； ｇｃｔｔａｃｃｇｃｃａｃａｇｇａａｔａｃ（配列番号１９７）； ｃｃｃｔｃｔｃｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｇｇ （配列番号１９８）； ｔｔｇｇｇｃｃｃｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｃ （配列番号１９９）； ａｃａａｇａｇｇｔｃｃｃｔｔｇｔｇａｔｇ （配列番号２００）； ｃａａｇｃｔａｔｃｇｔａｇｇｇｇｇｃｇ（配列番号２０１）； ｃｃｇａａｃｇａｃｇｔｇｃｇｃａｇｃｇｃ （配列番号２０２）； ｃａｃｇａｃａｇｔｇｇｃａｔａｇｇｔｔｇ （配列番号２０３）； ａｃａｇｇｇｇｃｇｃｔｔｔａｃｃｇｃｃａｃ （配列番号２０４）； ｃｔｇｔｇｇｃｇｇｔａａｇｃｇｃｃｃｃｔ （配列番号２０５）； ｇｃｇｃｃｇｇａｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃｔｇ （配列番号２０６）； ｃｃｃａｇｃａｇａｇｔａｃｇｇｔｇｇａｇ （配列番号２０７）； ｃｃｔａｇｇａｇｇｃｃｇｃｃａｃｇｃｇｃ （配列番号２０８）； ｔａｃｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｔｃｃｇｔ （配列番号２０９）； ｃｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｃａａｃｃｃｇａｃ （配列番号２１０）； ｇｔｇｔｇｇｃｇｃｃａｔｇｃｔｇｔａｔｔ （配列番号２１１）； ｔｃｇｇｇｃｇｃｇｔｇｇｃｇｇｃｃｔｃｃ （配列番号２１２）。
配列番号１９４～２１２とともに使用するための０１７１ＰＡＭ配列には、以下が含まれる：
ｔｃｇｇｇｔ （配列番号２１３）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号２１４）； ｃａｇａｇｔ （配列番号２１５）； カガート（配列番号２１６）； ｃｇｇａａｔ （配列番号２１７）； ｇｃｇａａｔ （配列番号２１８）； ｔｃｇｇｇｔ （配列番号２１９）； ｇｇｇｇａｔ（配列番号２２０）； ｃｇｇａｇｔ（配列番号２２１）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号２２２）； アガート（配列番号２２３）； ｇｔｇａｇｔ （配列番号２２４）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号２２５）； ｇｔｇｇｇｔ （配列番号２２６）； ｃｃｇａｇｔ （配列番号２２７）； ｇｇｇｇｇｔ （配列番号２２８）； ｇｃｇｇｇｔ （配列番号２２９）； ｔｇｇｇｇｔ （配列番号２３０）； ｔａｇｇｇｔ （配列番号２３１）。
１１０ のオフターゲット ｇＲＮＡ 配列：
ｃａｇｃａｃｔｇｃａｔａａａｃｃｃｔｃｇ （配列番号２３２）； ｃｃｇｃｔｔｔｃｃｇｔａａａｃｃｃｇｇｇ （配列番号２３３）； ｃｃｇｃｇｇｔｔｃｃｔａａａａｃｃｇｃｇ （配列番号２３４）； ｃｃｇｇｇｃｔｃｃｃｔｇａａｃｔｃｇｃｇ （配列番号２３５）； ｇｃｇｇｇｃｔｃｃａｔａａａｇｃｃｃｃｇ （配列番号２３６）； ｃｃｇｇｇｇｔｃｃａｔａａａｃｃｃｔｃｔ （配列番号２３７）； ｃｃａｃｇｃｔｃｃａｔｃａａｃｃｃｔｃｃ （配列番号２３８）； ｃｃｇａｇｃｔｃｃａｔｃｔａｃｃｃａｃｇ （配列番号２３９）； ｃｃｇｃｃｃｔｃｃａｃａｇａｃａｃｇｃｇ （配列番号２４０）； ｃｃｇｃａｃｔｃｃａｔｇｃａｃｇｃｇｃｇ （配列番号２４１）； ｃｃｇｃｃｃｔｃｃａｇａａａｇｃｃｃｃｇ （配列番号２４２）； ｃｃｇｃｇｃｔｃｃｃａａａａｇｃｃｃｃｇ （配列番号２４３）。
配列番号２３２～２３１で使用するための ＰＡＭ配列には、以下が含まれる：
カガ（配列番号２４４）； ｃｃｇｇｇ （配列番号２４５）； ｇｔｇａａ （配列番号２４６）； ｃｃｇｇｇ （配列番号２４７）； ｃｔｇｇａ （配列番号２４８）； ｇｇｇａａ（配列番号２４９）； ｃｔｇａａ （配列番号２５０）； ｃｃｇａｇ （配列番号２５１）； ｃｇｇｇｇ （配列番号２５２）； ａｔｇｇｇ （配列番号２５３）； ｃｇｇｇｇ （配列番号２５４）； ｇｃｇｇｇ （配列番号： ２５５）。
４１７ のオフターゲット ｇＲＮＡ 配列：
ｃｔｃｃｔｔｔｃｃａｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２５６）； ｃｔｇｇｔｔｔｃｔｇｔａａｇａａａｃａｇ （配列番号２５７）； ｃｔｃｃｔｔｔｃｔｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２５８）； ｇｔｇｇｔｔｔｃｃａａａａｇａａａｃａｇ （配列番号２５９）； ｔａａｇｔｔｔｃｃｔｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６０）； ｇｔｔｔｔｔｔｃｃｔｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６１）； ｃｔｇｔａｔｔｔｃａｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６２）； ａｔｇｔｔｔｃｃｃａｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６３）； ｇｔｔｇｔｔｔｇａｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６４）； ａａｇａｔｔｔｃａｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６５）； ｃｔｃｇｃｔａｃｃｔｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６６）； ａｔｔｃｔｔｔｃｔｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６７）； ｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｃａａｇａａａｃａｇ （配列番号２６８）； ｃａｇｇｔｔｔｃｔｇｇａａｇａａｔｃａｇ （配列番号２６９）； ｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇｇａａｇａａｇｃａｇ （配列番号２７０）； ｃｔｇｇａｔｔｃｃｔｇａａｇｇａａｃａｇ （配列番号２７１）； ｔｔｇｇｔｔｔｇｃｔｇａａｇａａａｃｇｇ （配列番号２７２）； ｃｔｇｔｔｔａａｇｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７３）； ｇｔｇａｔｔｔｃｔｇｃａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７４）； ｃｔａｇｃａｇｃｃｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７５）； ａｔａｇｔｔｔｃｔｇａａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７６）； ｔｔｇｇｔｔｔａｔｇａａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７７）； ｃｔｔｇｔａｔｇｇｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７８）； ｃｔｔｔｔｇｔｃａｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２７９）； ｃｔｇｃｃｃｔｃｔｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２８０）； ｃｔｃａｔｔｔｃｔｇｇａａｇａａａａｃａａ （配列番号２８１）； ｃｔｇｇｔｔａｇｇａｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２８２）； ｃｔｇｃｃｔｔｃｔｇｇａａｇａａａａｃａａ （配列番号２８３）； ｃｔｇａｔｔｔａｇｇａａａｇａａａｃａｇ （配列番号２８４）； ｃｔｔｇｔｔｔｔｔｇｇｇａｇａａａｃａｇ （配列番号２８５）； ｃｔｔｇｔｔｔｔｇｇｇｇａｇａａａｃａｇ （配列番号２８６）； ｃｔｇｃｔｔｔｇａｇｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２８７）； ａｔｇｇｔｔｔｃａｔｇｔａｇａａａｃａｇ （配列番号２８８）； ｃａｔｇｔｔｔｃａｇｇａａｇａａｔｃａｇ （配列番号２８９）； ｔｔｇｇｔｔｔａｃａｇａａｇｇａａｃａｇ （配列番号２９０）； ｃｔｇｇｔｇｔｃｃｃｇａａｇｔａａｃａｇ （配列番号２９１）； ｃｔｇｇｔｔｔｇｔａａａａｇａａａｃａｇ （配列番号２９２）； ｔｔｇｔｔｔｔｃａｇｇａｇｇａａａｃａｇ （配列番号２９３）； ｃｔｇｇｃｔｔｃｃｃｃｔａａｇａａａｃａａ （配列番号２９４）； ｃａｇｇｔｔｔｇａｇｇａｃｇａａａｃａｇ （配列番号２９５）； ｇｔｇｇａｔｔｃｃｔｇａａｇａａａａａｇ （配列番号２９６）； ｃｔｇｃｔｔｔｔａｇｇａｇｇａａａｃａｇ （配列番号２９７）； ｃｇｇｇｃｔｔｃｃｔｇａａｇａａａｇａｇ （配列番号２９８）； ｃｔｇｇｔｇｃｇａｇｇａａｇａａａｃａｇ （配列番号２９９）； ｃｔｇｃａｔｔｃｃａｇａａｇａａａａａｇ （配列番号３００）； ａｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃａａ （配列番号３０１）； ｃｔｇａｔｔｔａｃａｇａａｇａａａａａｇ （配列番号３０２）； ｃｔｇｔｔｔｔａｃｔｇａａｇａａａｇａｇ （配列番号３０３）； ｇｔｇａｔｔｔｃｃａｇａａｇａｃａｃａｇ （配列番号３０４）； ｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｇｃａｇａａａｃａｇ （配列番号３０５）。
配列番号２５６～３０５で使用するための０１７５ ＰＡＭ配列には、以下が含まれる：
ｔａｇａａ （配列番号３０６）； カガ（配列番号３０７）； ｔｇｇｇａ （配列番号３０８）； ａｔｇａｇ （配列番号３０９）； ｔａｇｇｇ （配列番号３１０）； ｃａｇｇｇ （配列番号３１１）； ｔｃｇａａ （配列番号３１２）； ａａｇａｇ （配列番号３１３）； ａａｇｇａ （配列番号３１４）； ａａｇｇａ （配列番号３１５）； ガガ（配列番号３１６）； ｃａｇｇｇ （配列番号３１７）； ガガグ（配列番号３１８）； ａａｇａａ （配列番号：３１９）； ａｇｇｇｇ （配列番号３２０）； タガ（配列番号３２１）； ｔｇｇａａ （配列番号３２２）； ｃａｇｇｇ （配列番号３２３）； ｃｔｇａａ （配列番号３２４）； ｔｔｇａａ （配列番号３２５）； ａａｇａａ （配列番号：３２６）； ｃｇｇａｇ （配列番号３２７）； ｔａｇａａ （配列番号３２８）； ｃｔｇａａ （配列番号３２９）； ａａｇａｇ （配列番号３３０）； ｇａｇｇｇ（配列番号３３１）； ガガ（配列番号３３２）； ａａｇａａ （配列番号：３３３）； ガガ（配列番号３３４）； ａａｇｇｇ （配列番号３３５）； カガア（配列番号３３）６）； ｔｔｇａａ （配列番号３３７）； ｔａｇａａ （配列番号３３８）； ｔｔｇｇｇ （配列番号３３９）； ａａｇａａ （配列番号３４０）； ｃａｇａｇ （配列番号３４１）； カガ（配列番号３４２）； ｔｇｇｇａ （配列番号３４３）； ｔｇｇａａ （配列番号３４４）； ｃｔｇｇｇ （配列番号３４５）； ｃｔｇｇｇ （配列番号３４６）； カガ（配列番号３４７）； ガガ（配列番号３４８）； ｇｇｇａｇ（配列番号３４９）； ａａｇｇａ （配列番号３５０）； ｔａｇａａ （配列番号３５１）； ａａｇｇａ （配列番号３５２）； ａａｇｇｇ （配列番号３５３）； ａｇｇｇａ （配列番号３５４）； ｃａｇｇｇ（配列番号３５５）。
特定の実施形態では、標的に実質的に相補的なｇＲＮＡの配列は、長さが約１０～３０ヌクレオチドである。 特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノムの標的配列に結合するヌクレオチド配列を含む。 例えば、特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、したがって標的配列に結合する。 例えば、特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、以下からなる群から選択されるＨＳＶゲノムの標的配列に実質的に相補的である：
ＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＣ （配列番号３５６、「２Ａ」）；
ＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＣＧ（配列番号３５７、「２Ｂ」）ＧＣＡＴＣＣＣＧＴＧＣＡＴＧＡＡＡＡＣ（配列番号３５８、「２Ｃ」）；
ＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧ－３´ （配列番号３５９、「２Ｄ」）； ＧＣＧＡＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡ （配列番号３６０、「１」）；
ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＧＧＧ （配列番号３６１、「３」）；
ＴＴＣＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡ （配列番号３６２、「ＩＣＰ４ ｍｌ」） ＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＧ （配列番号３６３、「ＩＣＰ２７ ｍｌ」）
特定の実施形態では、標的配列はＰＡＭ配列に先行する。 例えば、いくつかの実施形態では、標的配列はＮＧＧ ＰＡＭ配列に先行する。 例示的な標的配列＋ＰＡＭ配列（ＰＡＭ配列には下線が引かれている）は以下のとおりである。
ＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧ （配列番号３６４、「２Ａ」）；
ＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＣＧＧＧＧ （配列番号３６５、「２Ｂ」）
ＧＣＡＴＣＣＣＧＴＧＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧ （配列番号３６６、「２Ｃ」）；
ＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＴＧＧ （配列番号３６７、「２Ｄ」）； ＧＣＧＡＧＴＡＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧ （配列番号３６８、「１」）；
ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６９、「３」）；
ＴＴＣＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＣＧＧ （配列番号３７０、「ＩＣＰ４ ｍｌ」） ＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＧＡＧＧ （配列番号３７１、「ＩＣＰ２７ ｍｌ」） ＧＴＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＧＡＧＴ （配列番号３７２、「ＩＣＰ０－Ｍ１」） ＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＴ （配列番号３７３、「ＩＣ」） Ｐ０ －Ｍ２”） ＡＡＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧＴ （配列番号３７４、「ＩＣＰ２７－Ｍ１」） ＴＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＴ （配列番号３７５、「ＩＣＰ２７－Ｍ２」） ＡＡＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＧＣＣ （配列番号３７６、「ＩＣＰ２７－Ｍ１」） ＴＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧ （配列番号３７５、「ＩＣＰ２７－Ｍ２」） ＮＯ：３７７、「ＩＣＰ２７－Ｍ２」）
さらに、本開示は、本明細書に開示される核酸と実質的な相同性を有する単離された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を包含する。 特定の実施形態では、単離された核酸は、本明細書の他の場所に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する。
ガイドＲＮＡ配列は、センス配列またはアンチセンス配列であり得る。 化膿菌由来の ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ システムでは、通常、標的 ＤＮＡ は ５´－ＮＧＧ プロトスペーサー隣接モチーフ （ＰＡＭ） の直前にある。 他の Ｃａｓ９ オルソログは異なる ＰＡＭ 特異性を有する可能性がある。 たとえば、Ｓ． サーモフィラス由来の Ｃａｓ９ は、ＣＲＩＳＰＲ １ には ５´－ＮＮＡＧＡＡ、ＣＲＩＳＰＲ には ５’－ＮＧＧＮＧ を必要とする ３）、髄膜炎菌は ５´－ＮＮＮＮＧＡＴＴ を必要とする）。 ガイド ＲＮＡ の具体的な配列はさまざまですが、配列に関係なく、有用なガイド ＲＮＡ 配列は、ヘルペス」ウイルス標的配列の高効率変異を達成しながら、オフターゲット効果を最小限に抑えるものになる。 ガイド ＲＮＡ の具体的な配列はさまざまですが、配列に関係なく、有用なガイド ＲＮＡ 配列は、ＨＳＶ ゲノムの高効率編集を達成しながらオフターゲット効果を最小限に抑えるものになる。 ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチド以上まで変動することができ、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９である。 、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０以上のヌクレオチド。 有用な選択方法は、外来ウイルスゲノムと宿主細胞ゲノムの間で相同性が極めて低い領域を同定するもので、オフターゲットのヒトトランスクリプトームまたは（まれに）非翻訳ゲノム部位を除外するための標的配列＋ＮＧＧターゲット選択基準を使用するバイオインフォマティクススクリーニング、およびＷＧＳ、Ｓａｎｇｅｒを含みます。 シーケンスおよび ＳＵＲＶＥＹＯＲ アッセイにより、潜在的なオフターゲット効果を特定して除外する。 ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ （ＣＲＩＳＰＲ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ） などのアルゴリズムを使用して、使用する Ｃａｓ ペプチドの種類 （つまり、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ バリアント、Ｃｐｆｌ） によって定義される必須の ＰＡＭ 配列またはそれに近い標的配列を同定することができる。
特定の実施形態では、組成物は、それぞれが異なる標的配列を標的とする複数の異なるｇＲＮＡを含む。 特定の実施形態では、この多重化戦略は、有効性の向上をもたらす。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、約１ｇＲＮＡから約６ｇＲＮＡを利用する。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、少なくとも約１個のｇＲＮＡを利用する。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、最大約６個のｇＲＮＡを利用する。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、約１ｇＲＮＡ～約２ｇＲＮＡ、約１ｇＲＮＡ～約３ｇＲＮＡ、約１ｇＲＮＡ～約４ｇＲＮＡ、約１ｇＲＮＡ～約５ｇＲＮＡ、約１ｇＲＮＡ～約６ｇＲＮＡ、 ２ｇＲＮＡ～約３ｇＲＮＡ、約２ｇＲＮＡ～約４ｇＲＮＡ、約２ｇＲＮＡ～約５ｇＲＮＡ、約２ｇＲＮＡ～約６ｇＲＮＡ、約３ｇＲＮＡ～約４ｇＲＮＡ、約３ｇＲＮＡ～約５ｇＲＮＡ、約３ｇＲＮＡ ～約６ｇＲＮＡ、約４ｇＲＮＡ～約５ｇＲＮＡ、約４ｇＲＮＡ～約６ｇＲＮＡ、または約５ｇＲＮＡ～約６ｇＲＮＡ。 いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、約１ｇＲＮＡ、約２ｇＲＮＡ、約３ｇＲＮＡ、約４ｇＲＮＡ、約５ｇＲＮＡ、または約６ｇＲＮＡを利用する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾核酸塩基を含むように操作され得る。 例えば、ＲＮＡの既知の修飾は、例えば、Ｌｅｗｉｓ編、Ｇｅｎｅｓ ＶＩ、第９章（「遺伝暗号の解釈」）に見出すことができる。 （１９９７年、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク）、およびＲＮＡの修正と編集、ＧｒｏｓｊｅａｎおよびＢｅｎｎｅ編。 （１９９８年、ＡＳＭプレス、ワシントンＤＣ）。 修飾された ＲＮＡ コンポーネントには次のものが含まれる。 Ｎ４ －メチルシチジン； Ｎ４－２´－Ｏ－ジメチルシチジン； Ｎ４－アセチルシチジン； ５－メチルシチジン； ５，２´－Ｏ－ジメチルシチジン； ５－ヒドロキシメチルシチジン； ５－ホルミルシチジン； ２´－Ｏ－メチル－５－ホルマリンシチジン； ３－メチルシチジン； ２－チオシチジン； リシジン； ２´－Ｏ－メチルウリジン； ２－チオウリジン； ２－チオ－２´－Ｏ－メチルウリジン； ３，２´－Ｏ－ジメチルウリジン； ３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン； ４－チオウリジン； リボシルチミン； ５，２´－Ｏ－ジメチルウリジン； ５－メチル－２－チオウリジン； ５－ヒドロキシウリジン； ５－メトキシウリジン； ウリジン ５－オキシ酢酸； ウリジン ５－オキシ酢酸メチルエステル； ５－カルボキシメチルウリジン； ５－メトキシカルボニルメチルウリジン； ５－メトキシカルボニルメチル－２´－Ｏ－メチルウリジン； ５－メトキシカルボニルメチル－２´－チオウリジン； ５－カルバモイルメチルウリジン； ５－カルバモイルメチル－２´－Ｏ－メチルウリジン； ５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン； ５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル； ５－アミノメチル－２－チオウリジン； ５－メチルアミノメチルウリジン； ５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン； ５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン； ５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン； ５－カルボキシメチルアミノメチル－２´－Ｏ－メチルウリジン； ５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン； ジヒドロウリジン； ジヒドロリボシルチミン； ２´－メチルアデノシン； ２－メチルアデノシン； Ｎ６Ｎ－メチルアデノシン； Ｎ６、Ｎ６－ジメチルアデノシン； Ｎ６，２´－Ｏ－トリメチルアデノシン； ２－メチルチオ－Ｎ６Ｎ－イソペンテニルアデノシン； Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）－アデノシン； ２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）－アデノシン； Ｎ６－グリシニルカルバモイル）アデノシン； Ｎ６ －トレオニルカルバモイル アデノシン； Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル アデノシン； ２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル アデノシン； Ｎ６ －ヒドロキシノルバリルカルバモイル アデノシン； ２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル アデノシン； ２´－Ｏ－リボシルアデノシン （リン酸）； イノシン； ２´Ｏ－メチルイノシン； １－メチルイノシン； １；２´－Ｏ－ジメチルイノシン； ２´－Ｏ－メチルグアノシン； １－メチルグアノシン； Ｎ２ －メチルグアノシン； Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン； Ｎ２，２´－Ｏ－ジメチルグアノシン； Ｎ２、Ｎ２、２´－Ｏ－トリメチルグアノシン； ２´－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）； ７－メチルグアノシン； Ｎ２；７－ジメチルグアノシン； Ｎ２； Ｎ２；７－トリメチルグアノシン； ウィオシン。 メチルウォシン； 修飾が不十分なヒドロキシウィブトシン。 ウィブトシン； ヒドロキシウィブトシン； ペルオキシウィブトシン； キューオシン； エポキシキューオシン； ガラクトシル－クエオシン； マンノシル－クエオシン； ７－シアノ－７－デアザグアノシン； アラケエオシン ［７－ホルムアミド－７－デアザグアノシンとも呼ばれる］； および７－アミノメチル－７－デアザグアノシン。 本開示の方法または当技術分野の他の方法を使用して、追加の修飾ＲＮＡを同定することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは合成オリゴヌクレオチドである。 いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。 ヌクレオシド間リンカー （つまり骨格） の修飾を利用して、安定性や薬力学特性を向上させることができる。 例えば、ヌクレオシド間リンカー修飾は、細胞ヌクレアーゼによる分解を防止または低減し、その結果、ｇＲＮＡ の薬物動態および生物学的利用能が増加する。 一般に、修飾されたヌクレオシド間リンカーには、２つのヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）ライナー以外の任意のリンカーが含まれる。 いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシド間リンカーは、ホスホジエステルリンカーと比較して、ｇＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させる。 天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間リンカーには、隣接するヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成するリン酸基が含まれる。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数のｉを含む。天然のホスホジエステルから修飾されたヌクレオシド間リンカー。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオシド間リンカーまたはその連続ヌクレオチド配列のすべてが修飾される。 例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの硫黄（Ｓ）を含む。
リボース糖または核酸塩基への修飾も本明細書で利用することができる。
一般に、修飾ヌクレオシドには、糖部分または核酸塩基部分の１つまたは複数の修飾の導入が含まれる。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、記載されるように、修飾糖部分を含む１つまたは複数のヌクレオシドを含み、修飾糖部分は、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）およびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾である。 。 主に親和性および／または安定性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを目的として、リボース糖部分を修飾した多数のヌクレオシドを利用できる。 このような修飾には、リボース環構造が修飾される修飾が含まれる。 これらの修飾には、ヘキソース環 （ＨＮＡ）、リボース環上の Ｃ２ 炭素と Ｃ４ 炭素の間にビラジカル架橋を持つ二環式環 （例： ロックド核酸 （ＬＮＡ））、または典型的には結合が欠如している非結合リボース環による置換が含まれる。 Ｃ２ および Ｃ３ 炭素 （ＵＮＡ など）。 他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸または三環式核酸が含まれる。 修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドも含まれる。
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、または ＤＮＡ および ＲＮＡ ヌクレオシドに天然に見られる ２´－ＯＨ 基以外の基に変更することによって行われる修飾も含まれる。 置換基は、例えば、２´、３´、４´または５´位に導入され得る。 修飾糖部分を有するヌクレオシドには、２´置換ヌクレオシドなどの２´修飾ヌクレオシドも含まれる。 実際、２´ 置換ヌクレオシドの開発には多くの焦点が費やされており、多数の ２´ 置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ヌクレオシド耐性の向上や親和性の向上など、有益な特性を有することが判明している。 ２´糖修飾ヌクレオシドは、２´位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２´置換ヌクレオシド）、または２´結合ビラディクルを含むヌクレオシドであり、２´置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ（２´－ ４´ ビラジクル架橋） ヌクレオシド。 ２´ 置換修飾ヌクレオシドの例は、２´－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２´－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２´－アルコキシ－ＲＮＡ、２´－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ （ＭＯＥ）、２´－アミノ－ＲＮＡ です。 ＤＮＡ、２´－フルオロ－ＲＮＡ、および ２´－Ｆ－ＡＮＡ ヌクレオシド。 さらなる例として、いくつかの実施形態では、リボース基における修飾は、リボース基の２´位における修飾を含む。 いくつかの実施形態では、リボース基の２´位の修飾は、２´－Ｏ－メチル、２´－フルオロ、２´－デオキシ、および２´－Ｏ－（２－メトキシエチル）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の修飾糖を含む。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは修飾糖のみを含む。 特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％を超える修飾糖を含む。 いくつかの実施形態では、修飾糖は二環式糖である。 いくつかの実施形態では、修飾糖は２´－Ｏ－メトキシエチル基を含む。 いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオシド間リンカー修飾およびヌクレオシド修飾の両方を含む。
標的特異性は、標的ポリヌクレオチド配列もしくは領域（例えば、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子またはＩＣＰ２７遺伝子）に特異的なガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡに関して使用することができ、選択的にアニーリング／ハイブリアリングすることができるヌクレオチドの配列をさらに含む 標的ポリヌクレオチド（例えば標的に対応する）、例えば標的ＤＮＡの標的（配列または領域）に適合すること。 いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはその誘導体は、標的ＤＮＡ配列の領域に相補的な標的特異的ヌクレオチド領域を含む。 いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはその誘導体は、標的特異的ヌクレオチド領域以外の他のヌクレオチド配列を含む。 いくつかの実施形態では、他のヌクレオチド配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に由来する。
ｇＲＮＡは一般に足場によって支持されており、ここで足場とは、天然の生物種にわたって実質的に同一であるか、または高度に保存されている（例えば、標的特異性を与えていない）配列を含むｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子の部分を指す。 足場には、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、およびｃｒＲＮＡセグメントの５´末端またはその近くのポリヌクレオチドターゲティングガイド配列以外のｃｒＲＮＡセグメントの部分が含まれ、天然のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに保存されていない配列を含む任意の不天然部分は除外される。 いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡは修飾配列を含む。 特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、または１５個の修飾塩基（例えば、修飾された天然塩基配列）を含む。
本明細書で使用される相補的とは、一般に、特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの識別領域に選択的にアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。 本明細書で使用される場合、用語「実質的に相補的」および文法的等価物は、特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの識別領域に特異的にアニールすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味することを意図する。 アニーリングとは、二重鎖、三重鎖、またはその他の高次構造の形成をもたらす、ある核酸と別の核酸のヌクレオチド塩基対形成相互作用を指す。 一次相互作用は通常、ワトソン・クリック型およびフーグスティーン型の水素結合による、ヌクレオチド塩基特異的（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃなど）です。 いくつかの実施形態では、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用も二本鎖の安定性に寄与し得る。 ポリヌクレオチドが標的核酸の相補的または実質的に相補的な領域にアニールする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．（ １９８５）およびＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、Ｍｏｌ． バイオル。 ３１：３４９ （１９６８）。 アニーリング条件は特定の用途に依存し、当業者であれば過度の実験をすることなく日常的に決定することができる。 ハイブリダイゼーションは一般に、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。 得られる二本鎖ポリヌクレオチドは「ハイブリッド」または「二重鎖」です。 特定の例では、ハイブリダイゼーションには１００％の配列同一性は必要とされず、特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える配列同一性で起こる。 特定の実施形態では、配列同一性には、非同一核酸塩基に加えて、挿入および／または欠失を含む配列が含まれる。
ＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）またはＲＮＡをコードする核酸を含む本開示の核酸は、標準的な技術によって生成され得る。 例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を得ることができる。 ＰＣＲ を使用すると、全ゲノム ＤＮＡ または全細胞 ＲＮＡ からの配列を含む、ＤＮＡ および ＲＮＡ からの特定の配列を増幅できる。 様々なＰＣＲ法は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００３年に記載されている。 増幅される鋳型の反対側の鎖と配列が同一または類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用される。 部位特異的なヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸に導入できるさまざまな ＰＣＲ 戦略も利用できる。
単離された核酸は、単一の核酸として（例えば、ホスホラミダイト技術を使用した３´から５´方向の自動ＤＮＡ合成を使用）、または一連のオリゴヌクレオチドとして化学合成することもできる。 本開示の単離された核酸はまた、例えば、天然に存在する部分ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはＣａｓ９をコードするＤＮＡの突然変異誘発によって得ることもできる。
特定の実施形態において、単離されたＲＮＡは、本明細書の他の場所で詳細に記載されるように、ＲＮＡ分子をコードする発現ベクターから合成される。
（核酸とベクター ９
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲーＣａｓ系の１つ以上の要素をコードする単離された核酸を含む。 例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする単離された核酸を含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体をコードする単離された核酸を含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードし、Ｃａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体をコードする単離された核酸を含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸を含み、Ｃａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体をコードする単離核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書の他の場所に記載されるように、ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離された核酸を含み、ｇＲＮＡは、ＨＳＶゲノムの標的配列に実質的に相補的である。 いくつかの実施形態では、組成物は、ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離された核酸を含み、ｇＲＮＡは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、 ９８％ または ９９％ 配列ホモ本明細書に記載の標的配列に対する研究。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書の他の場所に記載されるＣａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体をコードする少なくとも１つの単離された核酸を含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列を有するＣａｓペプチドをコードする少なくとも１つの単離された核酸を含む。 本明細書の他の場所に記載されているＣａｓペプチドとの相同性。
単離された核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意のタイプの核酸を含み得る。 例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、本開示のｇＲＮＡもしくはペプチド、またはその機能的断片をコードする単離ｃＤＮＡを含む単離ＤＮＡを含む。 いくつかの実施形態では、組成物は、本開示のペプチドまたはその機能的断片をコードする単離されたＲＮＡを含む。 単離された核酸は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して合成することができる。
本開示は、本明細書に記載される単離された核酸が挿入されるベクターの使用を含むことができる。 当技術分野には、本開示において有用な適切なベクターが豊富にある。 ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびレトロウイルスなど）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびに他の高分子複合体が挙げられる。 宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介すること。 ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、あるいは標的細胞に有益な特性を提供する他の成分または機能を含むこともできる。 このような他の成分としては、例えば、細胞への結合または標的化に影響を与える成分（細胞型または組織特異的な結合を媒介する成分を含む）が挙げられる。 細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分。 取り込み後の細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（核局在化を媒介する薬剤など）。 ポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分。 このような成分には、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用できる検出可能および／または選択可能マーカーなどのマーカーも含まれる可能性がある。 このような成分は、ベクターの自然な特徴として提供することもできるし（結合および取り込みを媒介する成分または機能を有する特定のウイルスベクターの使用など）、またはベクターを修飾してそのような機能を提供することもできる。 他のベクターには、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ；によって記載されたベクターが含まれる。 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４： １６７－１７１ （２００３）。 多種多様なそのようなベクターが当技術分野で知られており、一般に入手可能である。
簡単に要約すると、ＲＮＡおよび／またはペプチドをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＲＮＡおよび／またはペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現に組み込むことによって達成される。 ベクター。 使用されるベクターは、真核細胞での複製、および場合によっては組み込みに適している。 典型的なベクターには、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターが含まれている。
本開示のベクターはまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫化および遺伝子治療に使用することもできる。 遺伝子送達の方法は当技術分野で知られている。 例えば、米国特許第５，６１１，１１２号を参照されたい。 その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号。 別の実施形態では、本開示は遺伝子治療ベクターを提供する。
本開示の単離された核酸は、多くのタイプのベクターにクローン化することができる。 例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。 特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。 ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク）、および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。 ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス」ウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。 一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ ０１／９６５８４、ＷＯ ０１／２９０５８、および米国特許第５，５１０，１０２号）。 ．米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、ウイルスに基づく多くのシステムが開発されている。 たとえば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。 選択された遺伝子は、当技術分野で知られている技術を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。 次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達することができる。 多くのレトロウイルス系が当技術分野で知られている。 いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。 多くのアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。 いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクター使用されている。
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期安定した組み込みおよび娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適したツールである。 レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに比べてさらなる利点を持っている。 また、免疫原性が低いという追加の利点もある。 いくつかの実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。 アデノ随伴ウイルス （ＡＡＶ） ベクターは、さまざまな疾患の治療のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。 ＡＡＶ ベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、安定かつ効率的な方法で分裂終了細胞に形質導入する能力など、遺伝子治療に理想的に適した多くの特徴を備えている。 ＡＡＶ 血清型、プロモーター、送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、ＡＡＶ ベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現を１つ以上の種類の細胞に特異的に標的化できる。
さらに、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸が提供される。 本明細書では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが提供される。 特定の例では、ＡＡＶベクターには、ＡＡＶの成分を含むか、またはＡＡＶの成分に由来し、脳、心臓、肺、骨格筋などの多くの組織型のいずれかの哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）に感染するのに適した任意のベクターが含まれる。 、インビトロかインビボかを問わず、肝臓、腎臓、脾臓、または膵臓。 特定の例では、ＡＡＶベクターは、目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム）をコードする核酸を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（またはビリオン）を含む。 いくつかの実施形態では、本明細書にさらに記載されるように、本明細書に開示されるＡＡＶは、血清型の組み合わせ（例えば、「偽型」ＡＡＶ）を含む様々な血清型に由来するか、または様々なゲノム（例えば、一本鎖または自己相補的）に由来する。 いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはヒト血清型ＡＡＶベクターである。 このような実施形態では、ヒト血清型ＡＡＶは、任意の既知の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９に由来する。 いくつかの実施形態では、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である。
いくつかの実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。 ＡＡＶ ベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、安定かつ効率的な方法で分裂終了細胞に形質導入する能力など、遺伝子治療に理想的に適した多くの特徴を備えている。 ＡＡＶ 血清型、プロモーター、送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、ＡＡＶ ベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現を １ つ以上の種類の細胞に特異的に標的化できる。
様々な異なるＡＡＶキャプシドが記載されており、使用することができるが、肝臓を優先的に標的にし、および／または高効率で遺伝子を送達するＡＡＶが特に望ましい。 ＡＡＶ８ の配列はさまざまなデータベースから入手できる。 実施例では同じキャプシドを有するＡＡＶベクターを利用するが、遺伝子編集ベクターのキャプシドとＡＡＶターゲティングベクターのキャプシドは同じＡＡＶキャプシドである。 別の適切なＡＡＶは、例えば、ｒｈｌ０（ＷＯ ２００３／０４２３９７）である。 さらに他のＡＡＶ源には、例えば、ＡＡＶ９（例えば、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第２０１１－０２３６３５３－Ａ１号を参照）、および／またはｈｕ３７（例えば、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第２０１１－０２３６３５３号を参照）が含まれる。 －Ａ１）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、（米国特許第７，７９０，４４９号； 米国特許第７，２８２，１９９号、ＷＯ ２００３／０４２３９７； ＷＯ ２００５／０３３３２１、ＷＯ ２００６／１１０６８９；米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；米国特許第７，５８８，７７２号）。 さらに他のＡＡＶを選択することができ、選択されたＡＡＶカプシドの組織優先性を任意に考慮する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムをコードする核酸を含む。 いくつかの実施形態では、核酸はまた、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）などの、目的のタンパク質の発現、およびいくつかの実施形態では分泌を可能にする１つまたは複数の調節配列を含む。 ）、タンパク質導入ドメイン（「ＰＴＤ」）をコードする配列など。 したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、感染細胞における目的のタンパク質の発現を引き起こすかまたは改善するために、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター領域を含む。 このようなプロモーターは、例えば、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ安定した産生を可能にするために、遍在性、細胞または組織特異的、強い、弱い、調節された、キメラなどであり得る。 特定の実施形態において、プロモーターは、コードされたタンパク質に対して相同であるか、または異種であるが、一般に、開示された方法で使用されるプロモーターはヒト細胞において機能する。 調節されたプロモーターの例としては、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。 特定の実施形態において、使用される他のプロモーターには、腎臓、脾臓、および膵臓などの組織に特異的なプロモーターが含まれる。
遍在性プロモーターの例には、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、およびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびβ－アクチンプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれる。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶキャプシド内にパッケージ化された核酸、一般に５´ＡＡＶ ＩＴＲ、本明細書に記載の発現カセット、および３´ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸を含む。 本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、発現カセットは各発現カセット内のオープンリーディングフレームの調節エレメントを含み、核酸は場合により追加の調節エレメントを含む。 いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、全長ＡＡＶ５´逆末端反復（ＩＴＲ）および全長３´ＩＴＲを含む。 短いＡＩＴＲと呼ばれる、Ｄ配列と末端解決部位（ｔｒｓ）が削除された５´ＩＴＲの改良バージョンが記載されている。 略語「ｓｃ」は自己相補性を意味する。 「自己相補的ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された構築物を指す。 感染すると、第 ２ 鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶ の ２ つの相補的半分が会合して、すぐに複製および転写できる状態にある １ つの二本鎖 ＤＮＡ （ｄｓＤＮＡ） ユニットを形成する （たとえば、ＤＭ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ を参照） ａｌ、「自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、ＤＮＡ合成とは無関係に効率的な形質導入を促進する」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（２００１年８月）；例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、および第７，４５６，６８３号も参照） 。 シュードタイプ化されたＡＡＶが生成される場合、ＩＴＲは、キャプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。 例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織、またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶキャプシドとともに使用するために選択される。 いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ＡＩＴＲ）は、便宜上、および規制当局の承認を促進するために使用される（すなわち、シュードタイプ化）。 いくつかの実施形態では、一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが使用される。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成および単離するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７号；ＷＯ２００５／０３３３２１号を参照） 国際公開第２００６／１１０６８９号、および米国特許第７，５８８，７７２ Ｂ２号、米国特許第５，１３９，９４１号、５，７４１，６８３号、６，０５７，１５２号、６，２０４，０５９号、６，２６８，２１３号、６，４９１，９０７号、６，６６０，５１４号、および６，６６０，５１４号。 ６，９５１，７５３； ７，０９４，６０４； ７，１７２，８９３； ７，２０１，８９８； ７，２２９，８２３； および ７，４３９，０６５）。 １つのシステムでは、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物およびｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物で一時的にトランスフェクトされる。 第 ２ のシステムでは、ｒｅｐ と ｃａｐ を安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲ が隣接する導入遺伝子をコードする構築物を （一時的または安定的に） トランスフェクトする。 これらの各系では、ヘルパー アデノウイルスまたはヘルペス」ウイルスの感染に応答して ＡＡＶ ビリオンが生成されるため、汚染ウイルスから ｒＡＡＶ を分離する必要がある。 より最近では、ＡＡＶ、つまり必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４、またはヘルペス」ウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペス」ウイルスポリメラーゼ）を回復するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としないシステムが開発された。 ） もシステムによってトランスで供給される。 これらの新しいシステムでは、必要なヘルパー機能をコードする構築物を細胞に一過性トランスフェクションすることによってヘルパー機能を供給することも、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように細胞を操作することもでき、その発現を制御することができる。 転写レベルまたは転写後レベル。 さらに別のシステムでは、ＩＴＲ および ｒｅｐ／ｃａｐ 遺伝子に隣接した導入遺伝子が、バキュロウイルスベースのベクターの感染によって昆虫細胞に導入される。
ＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、例えばＣａｓ９、および／または任意の本ＲＮＡ、例えばガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスもしくは他のウイルスベクタータイプ、あるいはそれらの組み合わせを使用して送達することができる。Ｃａｓ９ および １ つ以上のガイド ＲＮＡ は、１ つ以上のウイルスベクターにパッケージ化できる。 いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射によって目的の組織に送達されるが、他の場合には、ウイルス送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、経口、粘膜、または他の送達方法を介して行われる。 このような送達は、単回投与または複数回投与のいずれかを介して行うことができる。 当業者は、本明細書で送達される実際の用量が、選択されたベクター、標的細胞、生物、または組織、治療される対象の全身状態、治療対象の全身状態などの様々な要因に応じて大きく変わり得ることを理解する。 求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与方法、求められる形質転換／修飾の種類など。
ポックスウイルスベクターは、細胞の細胞質に遺伝子を導入する。 Ａｖｉｐｏｘ ウイルスベクターでは、核酸が短期間しか発現されない アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペス」ウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、いくつかの実施形態の適応となり得る。 アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期間（例えば、約１ヶ月未満）の発現をもたらすが、いくつかの実施形態では、はるかに長い発現を示し得る。 選択される特定のベクターは、標的細胞および治療される状態によって異なる。
特定の実施形態では、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞、または本開示によって産生されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含む。 本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列と、トランスでまたは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方が含まれる。 発現制御配列には、適切な転写開始、転写終結、プロモーターおよびエンハンサー配列が含まれる。 スプライシングやポリアデニル化 （ポリ Ａ） シグナルなどの効率的な ＲＮＡ プロセシングシグナル。 細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列。 翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）。 タンパク質の安定性を高める配列。 そして必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列。 天然、構成的、誘導性および／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術分野で知られており、利用することができる。
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。 通常、これらは開始部位の ３０ ～ １１０ ｂｐ 上流の領域に位置するが、最近では多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含むことが示されている。 プロモーター要素間の間隔は多くの場合柔軟であるため、要素が相互に反転または移動された場合でもプロモーターの機能は維持される。 チミジンキナーゼ （ｔｋ） プロモーターでは、スパプロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に ５０ ｂｐ まで増やすことができる。 プロモーターに応じて、個々の要素が協力的にまたは独立して機能して転写を活性化できる。
適切なプロモーターの選択は容易に達成できる。 特定の態様では、高発現プロモーターが使用されるであろう。 適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。 このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。 ラウス肉腫ウイルス （ＲＳＶ） および ＭＭＴ プロモーターも使用できる。 特定のタンパク質は、ネイティブ プロモーターを使用して発現できる。 エンハンサーや、ｔａｔ 遺伝子や ｔａｒ エレメントなどの高レベルの発現をもたらすシステムなど、発現を増強できる他のエレメントも含めることができる。 次いで、このカセットをベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクター、または例えば大腸菌複製起点を含む他の既知のプラスミドベクターに挿入することができる。
適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１ａ（ＥＦ－１ａ）である。 しかしながら、これらに限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶを含む他の構成的プロモーター配列も使用され得る。 プロモーター、鳥白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびこれらに限定されない。 クレアチニンキナーゼプロモーター。 さらに、本開示は構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。 誘導性プロモーターも本開示の一部として企図される。 誘導性プロモーターの使用は、発現が望ましい場合に作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。 誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクター上に見られるエンハンサー配列も、ベクターに含まれる遺伝子の発現を調節する。 通常、エンハンサーはタンパク質因子と結合して、遺伝子の転写を強化する。 エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に位置する場合がある。 エンハンサーは、特定の細胞または組織タイプでの転写を増強するために組織特異的である場合もある。 いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進するための１つまたは複数のエンハンサーを含む。
核酸および／またはペプチドの発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方を含むこともできる。 ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染しようとしている細胞の数。 他の態様では、選択マーカーは別個のＤＮＡ片上に保持され、コトランスフェクション手順で使用され得る。 選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方には、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列が隣接していてもよい。 有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定したり、調節配列の機能を評価したりするために使用される。 一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織には存在または発現されず、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。 レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡ がレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。 適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９： ７９－８２）。 適切な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することも、市販されている場合もある。 一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の ５´ フランキング領域を持つ構築物がプロモーターとして同定される。 このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は当技術分野で知られている。 発現ベクターの場合、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。 例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。 ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。 たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． を参照してください。 （２０１２、分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク）。 ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。 ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。 他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペス」ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。 例えば、米国特許第５，６１１，１１２号を参照されたい。 米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号。
ポリヌクレオチドを導入するための化学的手段宿主細胞への導入には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。 インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。 脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために企図される。 別の態様では、核酸は脂質と結合していてもよい。 脂質に結合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結合する連結分子を介してリポソームに結合し、リポソームに捕捉され得る。 、リポソームと複合体を形成する、脂質を含む溶液中に分散する、脂質と混合する、脂質と結合する、脂質中に懸濁液として含まれる、ミセルに含まれるか複合体を形成する、またはその他の方法で脂質と結合する。 脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連した組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。 たとえば、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在する可能性がある。 また、それらは単に溶液中に分散しているだけであり、サイズや形状が均一ではない凝集体を形成する可能性がある。 脂質は脂肪物質であり、天然に存在する脂質でも合成脂質でもよい。 たとえば、脂質には、細胞質内に自然に発生する脂肪滴のほか、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は商業的供給源から入手できる。 例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａから入手できる。 リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から入手できる。 コレステロール （「Ｃｈｏｉ」） は Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇ から入手できる。 ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ． （アラバマ州バーミンガム） から入手できる。 クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約 －２０°Ｃ で保存できる。 クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。 「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、さまざまな単層および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。 リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を備えた小胞構造を有するとして特徴づけられます。 多重層リポソームには、水性媒体によって分離された複数の脂質層がある。 リン脂質が過剰な水溶液に懸濁すると、それらは自発的に形成される。 脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水および溶解溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５： ５０５－１０）。 しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。 例えば、脂質はミセル構造をとることもあれば、単に脂質分子の不均一な集合体として存在することもある。 リポフェクタミン－核酸複合体もまた企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。 このようなアッセイには、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイが含まれる。 「生化学」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）によって、または本開示の範囲内に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出することなど。
特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される１つ以上の単離された核酸および／またはペプチドを発現するように遺伝子改変された細胞を含む。 例えば、細胞は、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓペプチドをコードする単離された核酸配列を含む１つまたは複数のベクターでトランスフェクトまたは形質転換され得る。 細胞は被験者の細胞であっても、ハプロタイプが一致した細胞や細胞株であってもよい。 複製を防ぐために細胞に放射線を照射することができる。 いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞株、自己細胞株、またはそれらの組み合わせである。 他の実施形態では、細胞は幹細胞であり得る。 例えば、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））などが挙げられる。 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（人工多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多くの動物種から樹立されている。 これらのタイプの多能性幹細胞は、多能性を維持しながら活発に分裂する能力を保持しながら、適切な分化誘導によってほぼすべての臓器に分化することができるため、再生医療のための最も有用な細胞源と考えられます。 ｉＰＳ細胞の一部特に、胚の破壊によって作製されるＥＳ細胞と比較して、自己由来の体細胞から樹立できるため、倫理的および社会的問題を引き起こす可能性が低いです。 さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるため、再生医療や移植治療の最大の障害である拒絶反応を回避することが可能です。
（医薬組成物）
本明細書に記載の組成物は、上述の様々な薬物送達システムでの使用に適している。 さらに、投与された化合物のインビボ血清半減期を延長するために、組成物をカプセル化するか、リポソームの内腔に導入するか、コロイドとして調製するか、または血清半減期を延長する他の従来の技術を使用することができる。 組成物の寿命。 例えば、Ｓｚｏｋａらの米国特許第５，６１１，００８号に記載されているように、リポソームを調製するために様々な方法が利用可能である。 これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。 さらに、標的薬物送達システム、例えば組織特異的抗体でコーティングされたリポソームで薬物を投与することもできる。 リポソームは臓器を標的として選択的に取り込まれます。
本開示はまた、本明細書に記載の組成物の１つ以上を含む医薬組成物を提供する。 製剤は、従来の賦形剤、すなわち、創傷または治療部位への投与に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質と混合して使用することができる。 医薬組成物は滅菌することができ、所望であれば、補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝剤に影響を与える塩、着色料、および／または芳香物質などと混合してもよい。 それらはまた、所望に応じて、他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせてもよい。
本開示の組成物の投与は、例えば、非経口、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、もしくは腹腔内注射によって、または注入によって、または任意の他の許容可能な全身的方法によって実施され得る。 組成物の投与のための製剤には、直腸、鼻、経口、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適したものが含まれる。 製剤は、都合よく単位剤形、例えば、単位剤形で提供され得る。 錠剤および徐放性カプセルが挙げられ、薬学の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「追加の成分」には、以下の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。 界面活性剤； 分散剤； 不活性希釈剤。 造粒剤および崩壊剤； 結合剤； 潤滑剤； 着色剤； 防腐剤； ゼラチンなどの生理分解性組成物。 水性ビヒクルおよび溶媒。 油性ビヒクルおよび溶剤。 懸濁剤。 分散剤または湿潤剤。 乳化剤、粘滑剤； バッファー。 塩。 増粘剤； 充填剤； 乳化剤； 酸化防止剤； 抗生物質； 抗真菌剤； 安定化剤； および薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料。 本開示の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」は当技術分野で知られており、例えば、Ｇｅｎａｒｏ編、２００６年に記載されている。 （１９８５年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ペンシルバニア州）、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の組成物は、組成物の総重量の約０．００５％～２．０％の防腐剤を含んでもよい。 防腐剤は、環境中の汚染物質にさらされた場合の腐敗を防ぐために使用される。 本開示に従って有用な防腐剤の例には、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミジュレアおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。 特に好ましい防腐剤は、約０．５％～２．０％のベンジルアルコールと０．０５％～０．５％のソルビン酸の組み合わせである。
一実施形態では、組成物は、抗酸化剤と、組成物の１つ以上の成分の分解を阻害するキレート剤とを含む。 いくつかの化合物にとって好ましい酸化防止剤は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～０．３重量％の好ましい範囲のＢＨＴ、ＢＨＡ、αートコフェロールおよびアスコルビン酸であり、より好ましくは０．０３重量％～０．１重量％の範囲のＢＨＴである。 好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量の０．０１重量％～０．５重量％の量で存在する。 特に好ましいキレート剤には、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～０．２０重量％の範囲、より好ましくは０．０２重量％～０．１０重量％の範囲のエデト酸塩（例えばエデト酸二ナトリウム）およびクエン酸が含まれる。 キレート剤は、製剤の保存寿命に悪影響を与える可能性がある組成物中の金属イオンをキレートするのに有用である。 ＢＨＴおよびエデト酸二ナトリウムは、それぞれいくつかの化合物にとって特に好ましい酸化防止剤およびキレート剤であるが、当業者には公知であるように、他の適切かつ同等の酸化防止剤およびキレート剤を代用してもよい。
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクル中に本開示の組成物を懸濁させる従来の方法を使用して調製され得る。 水性ビヒクルには、例えば、水および等張食塩水が含まれる。 油性ビヒクルには、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油などの植物油、分画植物油、および流動パラフィンなどの鉱油が含まれる。 液体懸濁液は、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香料、着色剤、および甘味剤を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよい。 油性懸濁液は、増粘剤をさらに含んでもよい。 公知の懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、水素添加食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。 公知の分散剤または湿潤剤には、レシチンなどの天然リン脂質、アルキレンオキシドと脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸から誘導された部分エステルとの縮合生成物、および ヘキシトール、または脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステル（例えば、それぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を伴う。 既知の乳化剤には、レシチンおよびアカシアが含まれるが、これらに限定されない。 既知の防腐剤には、メチル、エチル、またはｎ－プロピル－パラ－ヒドロキシ安息香酸塩、アスコルビン酸、およびソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。
（治療方法）
本開示は、ヘルペス」ウイルス媒介感染を治療または予防する方法を提供する。 いくつかの実施形態では、方法は、ガイド核酸およびＣａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つを含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。 いくつかの実施形態では、この方法は、ガイド核酸およびＣａｓペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体のうちの少なくとも１つをコードする単離された核酸を含む組成物を投与することを含む。 特定の実施形態では、方法は、ヘルペス」ウイルス感染症と診断された対象、ヘルペス」ウイルス感染症を発症するリスクがある対象、潜在性ヘルペス」ウイルス感染症を有する対象などに、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
本明細書では、特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムまたは組成物を使用して、細胞（例えば、宿主細胞）のゲノム内のヘルペス」ウイルス配列を修飾および／または編集する方法が提供される。 一般に、細胞（例えば、宿主細胞）のゲノム内のヘルペス」ウイルス配列を改変および／または編集することは、ＵＬ５６、ＩＣＰ０内の１つまたは複数の領域を標的とするＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムまたは組成物を細胞に接触させること、または細胞に提供することを含む。 、ＩＣＰ４、またはＩＣＰ２７遺伝子。 いくつかの実施形態では、方法は、細胞のゲノムから配列を除去または切除することを含む。 いくつかの実施形態では、この方法は、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または ＨＳＶ ゲノムの ９０００ 塩基対以上。
本明細書では、特定の実施形態において、以下を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。 ｂ）第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である； ｃ）第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である； ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。 いくつかの実施形態では、方法は、第４のガイド核酸、または第４のガイド核酸をコードする核酸配列を投与するステップをさらに含み、第４のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその付近の第４の標的核酸配列に相補的である。 。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列および ３ 番目の標的核酸配列とは異なる。
本明細書では、特定の実施形態において、以下を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。 ｂ）第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である； ｃ）第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的であり、 ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である； ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
本明細書では、特定の実施形態において、以下を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を投与することを含む方法が提供される。 ｂ）第１のガイド核酸であって、配列番号２もしくは７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはその相補体と相補的な核酸配列を含む第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸、第２のガイド核酸は、配列番号３７６もしくは３７７またはその相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第２のガイド核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、 第２のガイド核酸は、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な酸配列を含み、第２のガイド核酸は、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のガイド核酸は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸は、配列番号３７６との同一性を有する核酸配列を含む。 配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的である。
本明細書では、特定の実施形態において、以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法が提供される。 ｂ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸。第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である。 ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。 いくつかの実施形態では、方法は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第４の標的核酸配列に相補的である第４のガイド核酸を投与するステップをさらに含む。
ここに規定されている、特定のｅｍ実施態様は、以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法である。 ｂ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸。第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的である。 ｄ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的な第３のガイド核酸； ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１のいずれか１つの相補体を含む。 －９６ または ３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６のいずれか１つの相補体を含む。 または３７２－３７５。 いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つによる配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つ、または配列番号３６３のいずれか１つの相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含み、 ３７１、または ３７４ ～ ３７７。 いくつかの実施形態では、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、そして第３の標的は、 核酸配列は、配列番号３７８による配列またはその相補体を含む。 いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列は、配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号７またはその相補体による配列を含み、第３の標的核酸配列は、 酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補体を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶー３；水痘帯状疱疹ウイルス）を含むがこれらに限定されないヘルペス」ウイルス感染症を治療または予防するために使用される。 （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７（ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８（ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペスウイルス （ＫＳＨＶ））。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、口唇ヘルペス、性器ヘルペス、ヘルペス性脳炎、水痘、帯状疱疹、ベル麻痺、前庭疾患を含むがこれらに限定されない、ヘルペス」ウイルス感染症に関連する疾患および障害の治療または予防に使用される。 神経炎、帯状疱疹性神経痛など。
本開示の医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび他の霊長類、非ヒト霊長類、牛、豚、馬、羊、猫などの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。 犬。 治療薬はメトロノームレジメンに従って投与することができる。 本明細書で使用される場合、「メトロノーム」療法とは、低用量の治療薬を継続的に投与することを指す。
組成物は、１つ以上の治療と併せて（例えば、前、同時、または後に）投与することができる。 例えば、特定の実施形態では、本方法は、ＴＫ阻害剤、ＵＬ３０阻害剤、アシクロビル、フォスカメット、シドフォビル、およびそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない追加の抗ヘルペス療法と併用して本開示の組成物を投与することを含む。
本発明の組成物の用量、毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えばＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（治療上有効な用量）を決定することによって決定することができる。 人口の５０％に存在する）。 毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０ の比として表すことができる。 高い治療指数を示すＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物が好ましい。 有毒な副作用を示す Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ 組成物が使用される可能性がある一方で、そのような組成物を標的とする送達システムの設計には注意が必要である。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための用量範囲を処方する際に使用することができる。 このような組成物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。 用量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。 本開示の方法で使用される任意の組成物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。 用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで処方され得る。 このような情報は、ヒトにおける有用な線量をより正確に決定するために使用できる。 血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本明細書で定義されるように、組成物の治療有効量（すなわち、有効用量）は、治療上（例えば、臨床上）望ましい結果を生み出すのに十分な量を意味する。 組成物は、１日１回以上から１週間に１回以上投与することができる。 一日おきを含む。 当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、およびその他の要因を含むがこれらに限定されない、特定の要因が対象を効果的に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。
さらに、治療有効量の本開示の組成物による対象の治療には、単一の治療または一連の治療が含まれ得る。 ｇＲＮＡ発現カセットは、当技術分野で知られている方法によって対象に送達することができる。 いくつかの態様では、Ｃａｓは、Ｃａｓ分子の活性ドメインが含まれるフラグメントであってもよく、それによって分子のサイズが縮小される。 したがって、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ 分子は、現在の遺伝子治療で採用されているアプローチと同様に、臨床的に使用できる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ガイド核酸および／またはＣａｓペプチドを発現するように細胞を遺伝子改変することを含む。 例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を、ガイド核酸および／またはＣａｓペプチドをコードする単離された核酸と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター媒介送達の場合、用量は、少なくとも１×１０ ５ 粒子から約１×１０ １５ 粒子を含む。 いくつかの実施形態では、送達は、アデノウイルスベクターの少なくとも１×１０ ５ 粒子（粒子ユニット、ｐｕとも呼ばれる）を含む単回用量など、アデノウイルスを介して行われる。 いくつかの実施形態では、用量は、少なくとも約１×１０ ６ 粒子（例えば、約１×１０ ６ ～１×１０ １２ 粒子）、少なくとも約１×１０ ７ 粒子、少なくとも約１×１０ ８ 粒子（例えば、約１×１０×１０ １１ 粒子）である。 粒子または約１×１０８～１×１０１２粒子）、少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９～１×１０１０粒子または約１×１０×１０１２粒子）、または少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、 約１ ｘ １０ － １ ｘ １０ １２ 粒子）のアデノウイルスベクター。 あるいは、用量は、約１×１０１４個以下の粒子、約１×１０１３個以下の粒子、約１×１０１２個以下の粒子、約１×１０１１個以下の粒子、および約１×１０１０個以下の粒子を含む（例えば、 約１×１０９個の粒子を超える）。 したがって、いくつかの実施形態では、用量は、例えば、約１×１０ ６ 粒子単位（ｐｕ）、約２×１０ ６ ｐｕ、約４×１０ ６ ｐｕ、約１×１０ ７ ｐｕ、約２×１０ ７ ｐｕ、約４×１０ ６ ｐｕ、約４×１０ ６ ｐｕ、約４×１０ ６ ｐｕのアデノウイルスベクターの単回用量を含む。 ×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ 、約４×１０ １０ ｐｕ、約１×１０ １２ ｐｕ、約２×１０ １０ ｐｕ、約４×１０ １２ ｐｕ、約１×１０ １２ ｐｕ、約２×１０ １２ ｐｕ、または約４×１０ １２ ｐｕのアデノウイルスベクター。 いくつかの実施形態では、アデノウイルスは複数回投与によって送達される。
いくつかの実施形態では、送達はＡＡＶを介して行われる。 ヒトへのＡＡＶのインビボ送達のための治療上有効な用量は、約１×１０ １０ ～約１×１０ １０ の機能的ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する生理食塩水の約２０～約５０ｍｌの範囲内であると考えられる。 投与量は、副作用に対する治療効果のバランスをとるために調整できる。 いくつかの実施形態では、ＡＡＶ用量は、一般に、約１×１０５～１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８～１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０～約１×１０１６ゲノム、または 約１×１０１１から約１×１０１６ゲノムＡＡＶ。 いくつかの実施形態では、ヒト用量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶである。 いくつかの実施形態では、このような濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ、または約１０～約２５ｍｌのキャリア溶液で送達される。 他の有効用量は、当業者であれば日常的に容易に設定することができる。用量反応曲線を確立する試験（例えば、米国特許第８，４０４，６５８号を参照）。
いくつかの実施形態では、細胞は、治療が意図される対象においてインビボで遺伝子改変される。 特定の態様では、インビボ送達の場合、核酸は対象に直接注射される。 例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、組成物が必要とされる部位に送達される。 Ｉｎ ｖｉｖｏ 核酸導入技術には、アデノウイルス、単純ヘルペス Ｉ ウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターによるトランスフェクション、脂質ベースのシステム （脂質を介した遺伝子導入に有用な脂質は ＤＯＴＭＡ など） が含まれるが、これらに限定されません。 、ＤＯＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏｌなど）、裸のＤＮＡ、トランスポゾンベースの発現システム。 例示的な遺伝子治療プロトコールは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３ （１９９２）を参照されたい。 ＷＯ９３／２５６７３およびそこに引用されている参考文献も参照のこと。 特定の実施形態では、この方法は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを対象に直接投与することを含む（例えば、Ｚａｎｇｉら、２０１３ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１：８９８－９０７を参照）。
エクスビボ治療の場合、単離された細胞はエクスビボまたはインビトロ環境で改変される。 いくつかの実施形態では、細胞は、治療が意図される対象にとって自己のものである。 あるいは、細胞は、対象に関して同種、同系、または異種であり得る。 次いで、修飾された細胞を対象に直接投与することができる。
当業者は、単離された核酸を細胞に投与するために異なる送達方法が利用され得ることを認識する。 例えば、（１）エレクトロポレーション（電気）、遺伝子銃（物理的力）、大量の液体（圧力）などの物理的手段を利用する方法。 （２）核酸またはベクターが、リポソーム、凝集タンパク質または輸送体分子などの別の実体と複合体を形成する方法。
細胞あたりに添加されるベクターの量は、ベクターに挿入される治療用遺伝子の長さと安定性、さらには配列の性質によって異なる可能性が高く、特に経験的に決定する必要があるパラメーターです。 は、本開示の方法に固有ではない要因（例えば、合成に関連するコスト）により変更される可能性がある。 当業者であれば、特定の状況の緊急性に応じて必要な調整を容易に行うことができる。
遺伝子組み換え細胞には、自殺遺伝子、すなわち細胞を破壊するために使用できる産物をコードする遺伝子も含まれる場合がある。 多くの遺伝子治療の状況では、治療目的で宿主細胞内で遺伝子を発現できることだけでなく、宿主細胞を意のままに破壊できることが望ましい。 治療薬は、活性化剤化合物の非存在下では発現が活性化されない自殺遺伝子に結合することができる。 薬剤と自殺遺伝子の両方が導入された細胞の死滅が望ましい場合、活性化剤化合物が細胞に投与され、それによって自殺遺伝子の発現が活性化され、細胞が死滅する。 使用できる自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペス」ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビルです。 酸化還元酵素とシクロヘキシミド。 シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン。 チミジンキナーゼ、チミジル酸キナーゼ （Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ） および ＡＺＴ。 デオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシド。
以下の実験例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。 これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に指定がない限り、限定することを意図したものではない。 したがって、本開示は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
（実施例）
実施形態１は、以下を含む組成物を含む：ａ）クラスター化規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列； ｂ）第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である； ｃ）第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である； ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
実施形態２は、実施形態１の組成物を含み、第４のガイド核酸をさらに含む。第４のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第４の標的核酸配列に相補的である、第４のガイド核酸、または第４のガイド核酸をコードする核酸配列。 実施形態３は、第４の標的核酸配列が、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列とは異なる、実施形態１～２のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態４は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～３のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態５は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、実施形態１～４のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態６は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～５のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態７は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～６のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態８は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがヒト細胞における発現のために最適化されている、実施形態１～７のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態９は、ガイド核酸がＲＮＡである、実施形態１～８のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態１０は、ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、実施形態１～９のいずれか１つの組成物を含む。
実施形態１１は、実施形態１～１０のいずれか１つの組成物を含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、または 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つの相補体。 実施形態１２は、実施形態１～１１のいずれか１つの組成物を含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯＳ： １ ～ ９６ または ３７２ ～ ３７５。 実施形態１３は、実施形態１～１２のいずれか１つの組成物を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つの相補体。 実施形態１４は、実施形態１～１３のいずれか１つの組成物を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ：１～９６または３７２～３７５。 実施形態１５は、実施形態１～１４のいずれか１つの組成物を含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。
実施形態１６は、実施形態１～１５のいずれか１つの組成物を含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ＩＤ ＮＯ： ３６３、３７１、または ３７４ ～ ３７７。 実施形態１７は、実施形態１～１６のいずれか１つの組成物を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つの組成物を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯ： ３６３、３７１、または ３７４－３７７。 実施形態１９は、第１の標的核酸配列が配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列が配列番号２による配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの組成物を含む。 ：７またはその相補体であり、第３の標的核酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含む。 実施形態２０は、第１の標的核酸配列が配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列が配列番号２による配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの組成物を含む。 ：７またはその相補体であって、第３の標的核酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３７７またはその相補体による配列を含む。
実施形態２１は、実施形態１～２０のいずれか１つの組成物を含み、ヘルペス」ウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶー３；およびＨＳＶー３）からなる群から選択される。 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４（ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５（ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６（ＨＨＶ－６； ロセオロウイルス） ）、ヒトヘルペス」ウイルス７（ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８（ＨＨＶ－８；カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス（ＫＳＨＶ）） 実施形態２２は、以下を含む組成物を含む： ａ）クラスター化された規則的に間隔をあけられた短いパリンドロームリピート（ ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列； ｂ）第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である； ｃ）第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的であり、 ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である； ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。 実施形態２３は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～２２のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態２４は、いずれか１つの組成物を含む。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、実施形態１～２３の実施形態。 実施形態２５は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～２４のいずれか１つの組成物を含む。
実施形態２６は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～２５のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態２７は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがヒト細胞における発現のために最適化されている、実施形態１～２６のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態２８は、ガイド核酸がＲＮＡである、実施形態１～２７のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態２９は、ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、実施形態１～２８のいずれか１つの組成物を含む。 実施形態３０は、実施形態１～２９のいずれか１つの組成物を含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つの相補体。
実施形態３１は、実施形態１～３０のいずれか１つの組成物を含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～３０のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯＳ： １ ～ ９６ または ３７２ ～ ３７５。 実施形態３２は、実施形態１～３１のいずれか１つの組成物を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態３３は、実施形態１～３２のいずれか１つの組成物を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ：３６３、３７１、または３７４～３７７。 実施形態３４は、実施形態１～３３のいずれか１つの組成物を含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態３５は、実施形態１～３４のいずれか１つの組成物を含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯ： ３６３、３７１、または ３７４－３７７。
実施形態３６は、実施形態１～３５のいずれか１つの組成物を含み、第１の標的核酸配列は、配列番号２もしくは７による配列、またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号２もしくは７による配列を含む。 配列番号３７６またはその相補配列を含み、第３の標的核酸配列は配列番号３７７またはその相補配列を含む。 実施形態３７は、ヘルペス」ウイルスが、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶー３；水痘）からなる群より選択される、実施形態１～３６のいずれか１つの組成物を含む。 帯状疱疹ウイルス （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス） 、ヒトヘルペス」ウイルス７（ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８（ＨＨＶ－８；カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス（ＫＳＨＶ））。 リピート （ＣＲＩＳＰＲ） 関連エンドヌクレアーゼ。 ｂ）第１のガイド核酸であって、配列番号２もしくは７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列またはその相補体と相補的な核酸配列を含む第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸、第２のガイド核酸は、配列番号３７６もしくは３７７またはその相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 実施形態３９は、第１のガイド核酸が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態１～３８のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムを含む。実施形態４０は、 第１のガイド核酸が、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態１～３９のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム。
実施形態４１は、実施形態１～４０のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムを含み、第２のガイド核酸は、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 第２のガイド核酸が、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態１～４１のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。 実施形態４３は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。 第１のガイド核酸が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸が相補的な核酸配列を含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載のシステム。 実施形態４４は、第１のガイド核酸が、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態１～４３のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムを含む。 配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、第２のガイド核酸は、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。実施形態４５は、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 第１のガイド核酸が配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、第２のガイド核酸が配列番号７に対して相補的な核酸配列を含む、実施形態１～４４のいずれか１つ。 配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列。
実施形態４６は、実施形態１～４５のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムを含み、第１のガイド核酸は、配列番号７および第２のガイドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む。 実施形態４７は、実施形態１～４６のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステムをコードする核酸を含む。 実施形態４８は、以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む：ａ）クラスター化規則的に間隔をあけた短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ； ｂ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸。第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である。 ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的であり、 ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。 実施形態４９は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第４の標的核酸配列に相補的である第４のガイド核酸をさらに含む、実施形態１～４８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５０は、第４の標的核酸配列が、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、及び第３の標的核酸配列とは異なる、実施形態１～４９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態５１は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～５０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５２は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓｌ２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、実施形態１～５１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５３は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～５２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５４は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～５３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５５は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがヒト細胞における発現のために最適化されている、実施形態１～５４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態５６は、ガイド核酸がＲＮＡである、実施形態１～５５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５７は、ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、実施形態１～５６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態５８は、実施形態１～５７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、または 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つの相補体。 実施形態５９は、実施形態１～５８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～５８のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯＳ： １ ～ ９６ または ３７２ ～ ３７５。 実施形態６０は、実施形態１～５９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または 配列番号１～９６または３７２～３７５のいずれか１つの相補体。
実施形態６１は、実施形態１～６０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第２の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ＩＤ ＮＯ： １ ～ ９６ または ３７２ ～ ３７５。 実施形態６２は、実施形態１～６１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、ここで、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態６３は、実施形態１～６２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号：３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯ： ３６３、３７１、または ３７４－３７７。 実施形態６４は、実施形態１～６３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態６５は、以下のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。第４の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、実施形態１～６４。
実施形態６６は、実施形態１～６５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号２による配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号２による配列を含む。 配列番号７またはその相補配列であり、第３の標的核酸配列は配列番号３７６またはその相補配列を含む。 実施形態６７は、実施形態１～６６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号２に従う配列を含む。 ここで、第３の標的核酸配列は、配列番号３７６による配列またはその相補体を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３７７による配列またはその相補体を含む。 実施形態６８は、核酸がプロモーターをさらに含む、実施形態１～６７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態６９は、プロモーターがユビキタスプロモーターである、実施形態１～６８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７０は、プロモーターが組織特異的プロモーターである、実施形態１～６９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態７１は、プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態１～７０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７２は、プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態１～７１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７３は、核酸がエンハンサーエレメントをさらに含む、実施形態１～７２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７４は、エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、実施形態１～７３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７５は、核酸が５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む、実施形態１～７４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態７６は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターがＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、実施形態１～７５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態７７は、実施形態１～７６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、 またはＡＡＶＤＪ／８。 実施形態７８は、実施形態１～７７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、ヘルペス」ウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶー３；ＨＨＶー３）からなる群より選択される。 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４（ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５（ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６（ＨＨＶ－６； ロセオロウイルス） ）、ヒトヘルペス」ウイルス７（ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８（ＨＨＶ－８；カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス（ＫＳＨＶ））をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む実施形態７９ ： ａ） Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔ （ＣＲＩＳＰＲ） 関連エンドヌクレアーゼ。 ｂ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸； ｃ）第２のガイド核酸。第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的である。 ｄ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的な第３のガイド核酸； ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。 実施形態８０は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～７９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態８１は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、実施形態１～８０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態８２は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～８１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態８３は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～８２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態８４は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがヒト細胞における発現のために最適化されている、実施形態１～８３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態８５は、ガイド核酸がＲＮＡである、実施形態１～８４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態８６は、ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、実施形態１～８５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態８７は、第１の標的核酸配列が配列を含む、実施形態１～８６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 実施形態８８は、実施形態１～８７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む。 ＮＯＳ： １ ～ ９６ または ３７２ ～ ３７５。 実施形態８９は、実施形態１～８８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、または 配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態９０は、実施形態１～８９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第２の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。
実施形態９１は、実施形態１～９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。 または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体。 実施形態９２は、実施形態１～９１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第３の標的核酸配列は、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む。 ＩＤ ＮＯ： ３６３、３７１、または ３７４ ～ ３７７。 実施形態９３は、実施形態１～９２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、第１の標的核酸配列は、配列番号２もしくは７に従う配列、またはその相補体を含み、第２の標的核酸配列は、配列番号２もしくは７に従う配列を含む。 配列番号３７６またはその相補配列を含み、第３の標的核酸配列は配列番号３７７またはその相補配列を含む。 実施形態９４は、実施形態１～９３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、ヘルペス」ウイルスは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶー３；ＨＨＶー２）からなる群より選択される。 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４（ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５（ＨＨＶ－５； サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６（ＨＨＶ－６； ロセオロウイルス） 実施形態９５は、実施形態１～９４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、ここで、 核酸はプロモーターをさらに含む。
実施形態９６は、プロモーターがユビキタスプロモーターである、実施形態１～９５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態９７は、プロモーターが組織特異的プロモーターである、実施形態１～９６６８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態９８は、プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態１～９７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態９９は、プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態１～９８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態１００は、核酸がエンハンサーエレメントをさらに含む、実施形態１～９９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態１０１は、エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、実施形態１～１００のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態１０２は、核酸が５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む、実施形態１～１０１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態１０３は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターがＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、実施形態１～１０２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。 実施形態１０４は、実施形態１～１０３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含み、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪである。 、またはＡＡＶＤＪ／８。 実施形態１０５は、細胞からヘルペス」ウイルス配列の一部または全部を切除する方法を含み、この方法は、実施形態１～１０４のいずれか１つの組成物、実施形態１～１０４のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、を細胞に提供することを含む。 または実施形態１～１０４のいずれか１つのＡＡＶベクター。 実施形態１０６は、細胞におけるヘルペス」ウイルス複製を阻害または低減する方法を含み、この方法は、実施形態１～１０４のいずれか１つの組成物、実施形態１～１０４のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲーＣａｓシステム、またはＡＡＶを細胞に提供することを含む。 実施形態１～１０４のいずれか１つのベクター。 実施形態１０７は、細胞が対象内にある、実施形態１～１０６のいずれか１つの方法を含む。 実施形態１０８は、対象がヒトである、実施形態１～１０７のいずれか１つの方法を含む。
（実施例）
（実施例１）
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（実施例２－遺伝子編集によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳＶ－１複製の阻害）
単純ヘルペス」ウイルス １ 型 （ＨＳＶ－１） は、世界中の人口の大部分に感染するヒト神経向性ウイルスであり、無症状の正常な個人における血清有病率は ９０％ です。 ＨＳＶ－１ の初感染と疾患の再活性化に対する現在の治療法は非選択的であり、潜伏感染の確立やウイルスの再活性化を防ぐことができず、有害な副作用がある。 紫外線刺激、高体温、社会的ストレス、薬剤などの環境要因は、潜在的な ＨＳＶ－１ ゲノムの再活性化を引き起こし、疾患の進行につながる可能性がある。 現在の抗 ＨＳＶ 薬は ＨＳＶ－１ 感染の拡大を制限できるが、潜伏期の確立や ＨＳＶ の再活性化を阻害することはできない。
現在の治療の限界を考慮すると、ウイルス複製を効果的に抑制するだけでなく、潜在ウイルスゲノムを根絶する新しい治療アプローチが必要である。 したがって、本明細書に記載し提供するように、インデル変異を作製するか、ウイルス複製に重要なウイルスＤＮＡ配列の大きなセグメントを除去する目的でＨＳＶ－１ゲノムを特異的に標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＨＳＶ－１を阻害することができる。 レプリケーション。 特に、ＨＳＶ－１ の ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ 遺伝子を標的にすると、ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ の発現レベルが大幅に低下し、ＨＳＶ－１ 感染の抑制につながります。 本明細書で提供されるように、ＨＳＶー１ゲノム内の遺伝子変異／除去に対するターゲティング戦略（例えば、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７）の特異性は、インビトロ細胞培養モデルの遺伝子分析によって検証されている。 さらに、細胞内での ＨＳＶ－１ 向け Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ の発現により、細胞がＨＳＶ－１感染から保護された。
図１Ａは、ＨＳＶ－１ゲノム、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７遺伝子の概略図を示す。 記載されている研究では、ウイルス遺伝子 ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ 遺伝子が ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ 遺伝子編集システムの標的となっている。 ＰＡＭを含むｇＲＮＡの位置およびヌクレオチド組成を示す（配列番号３７２～３７５）。 ヌクレオチドの位置は、ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００１８０６．２ を参照する。 イチジク。 図１Ｂは、プラスミドＰ３１のグラフ表示を提供する。 プラスミドは、４つのｇＲＮＡ、下流Ｕ６プロモーターにクローニングされたＩＣＰＯを標的とする２つのｇＲＮＡ（ｍ１およびｍ２）およびＩＣＰ２７を標的とする２つのｇＲＮＡ（ｍ１およびｍ２）、および１コピーのＳａＣａｓ９遺伝子を含む。 Ｐ３１はＡＡＶ２粒子にパッケージされ、ＡＡＶ２－ＨＳＶ構築物となった。 ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７ ｇＲＮＡを含まないｐｘ６０１（「ｐｘ６０１」または「ｐｘ６０１ｓａＣａｓ９」）をさらに対照として使用した。
ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ を標的とすることは、ＨＳＶ－１ 複製を効果的に阻害する。 イチジク。 ＳａＣａｓ９およびＩＣＰＯ関連ｇＲＮＡおよびＩＣＰ２７関連ｇＲＮＡの発現と切除を確認するための、ＨＳＶ－１ ＮＳ１臨床株およびＨＳＶ－１ ＧＦＰパットン株に感染したＴＣ６２０細胞株のｐｘ６０１ Ｐ３１一過性トランスフェクションの概略図を示す。 遺伝子ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７に対する活性。 さらに、ＴＣ６２０ ヒト希突起膠腫に感染した臨床株 ＨＳＶ－１ ＮＳ１ （左パネル） および ＨＳＶ－１ ＧＦＰ （右パネル） における ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ の検出のためのウェスタンブロット分析により、ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ の減少が実証されました。 一時的にトランスフェクトされた ＴＣ６２０ ヒト希突起膠腫細胞株 プラスミドＰ３１による。 ＳａＣａｓ９ およびハウスキーピング ＧＡＰＤＨ タンパク質の発現も示されている。 ＩＣＰＯ と ＩＣＰ２７ をターゲットにすると、実質的に ＩＣＰＯ と ＩＣＰ２７ が編集される。 イチジク。 図３は、Ｐ３１プラスミドによる一過性トランスフェクション後の、ＨＳＶー１ ＮＳ１（左パネル）およびＨＳＶー１ ＧＦＰ（右パネル）に感染したＴＣ６２０細胞株において、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７特異的プライマーによって得られたアンプリコンを示す、アガロースゲル上のＤＮＡ切除アッセイからのデータを示す。 ＤＮＡ シーケンシングにより、各標的遺伝子の特定の ｇＲＮＡ および ＳａＣａｓ９ によって誘導される特異的な切除が特定された（下のパネル）。
図４は、Ｐ３１プラスミドによって一過性にトランスフェクトされたＴＣ６２０細胞株におけるＨＳＶー１ ＧＦＰ複製の免疫蛍光評価からのデータを示す。 ＨＳＶ－１ ＮＳ１ および ＨＳＶ－１ ＧＦＰ 感染 ＴＣ６２０ 細胞株からの上清を使用した代表的なプラークアッセイ。感染細胞の ＳａＣａｓ９ および ｇＲＮＡ 編集による ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ の抑制の結果としてプラーク数が大幅に減少することを示す。 逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ（図５）を使用して、プラスミドＰ３１によるＴＣ６２０細胞株の一過性トランスフェクションおよびＨＳＶ－１ ＮＳ１（右パネル）およびＨＳＶ－１ ＧＦＰ（左パネル）による感染後のｇＲＮＡ発現を確認した。
ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７を標的としたＨＳＶ－１複製の阻害は、ＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎臓）細胞においてさらに証明された。 イチジク。 ＳａＣａｓ９およびＩＣＰＯ関連ｇＲＮＡおよびＩＣＰ２７関連ｇＲＮＡの発現を確認するための、ＨＳＶ－１ ＮＳ１臨床株およびＨＳＶ－１ ＧＦＰパットン株に感染したＶＥＲＯ細胞株のＡＡＶ２－ＨＳＶコンストラクト形質導入の概略図を示す。 遺伝子ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７に対する切除活性。 ＡＡＶ２－ＨＳＶ構築物によって形質導入された臨床株ＨＳＶ－１ ＮＳ１（左パネル）およびＨＳＶ－１ ＧＦＰ（右パネル）に感染したＶＥＲＯヒト細胞株におけるＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７の検出に関するウェスタンブロット分析によって実証されるように、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７は効果的に抑制される。 表現ＳａＣａｓ９ およびハウスキーピング ＧＡＰＤＨ タンパク質のタンパク質も示されている。 ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ をターゲットにすると、ＶＥＲＯ 細胞内の ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７ が効果的に編集される。 ＡＡＶ２ーＨＳＶ構築物による形質導入後に、ＨＳＶー１ ＮＳ１およびＨＳＶー１ ＧＦＰに感染したＶＥＲＯ細胞株においてＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７特異的プライマーによって得られたアンプリコンを示す、アガロースゲル上のＤＮＡ切除アッセイからのデータを示す。 ＡＡＶ２－ＨＳＶ構築物によるＶＥＲＯ細胞株の形質導入後のｇＲＮＡ発現を確認するための逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ（右パネル）。 ＤＮＡ シーケンスにより、各標的遺伝子の特定の ｇＲＮＡ および ＳａＣａｓ９ によって誘導される特異的な切除が特定された（下）。
図８は、ＨＳＶー１ ＮＳ１（左パネル）およびＨＳＶー１ ＧＦＰ（右パネル）に感染したＶＥＲＯ細胞株からの上清を使用したプラークアッセイからのデータを示し、感染細胞のＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡが感染細胞を編集することにより、ＩＣＰＯ および ＩＣＰ２７が抑圧されたことの結果としてプラークの数が劇的に減少したことを示す。

Claims (108)

  1. 組成物であって：
    ａ）クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と；
    ｂ）第１のガイド核酸、または前記第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、前記第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である、前記第１のガイド核酸、または前記第１のガイド核酸をコードする核酸配列と；
    ｃ）第２のガイド核酸、または前記第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、前記第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である、第２のガイド核酸、または前記第２のガイド核酸をコードする核酸配列と；および
    ｄ）第３のガイド核酸、または前記第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、前記第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である、前記第３のガイド核酸、または前記第３のガイド核酸をコードする核酸配列と；
    を有し、前記第１の標的核酸配列、前記第２の標的核酸配列、および前記第３の標的核酸配列は異なる、ことを特徴とする組成物。
  2. 第４のガイド核酸、または前記第４のガイド核酸をコードする核酸配列をさらに含み、前記第４のガイド核酸が、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその付近の第４の標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記第４の標的核酸配列が、前記第１の標的核酸配列、前記第２の標的核酸配列、および前記第３の標的核酸配列とは異なる、ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌のＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ヒト細胞における発現のために最適化されている、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記ガイド核酸がＲＮＡである、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ガイド核酸が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  12. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  13. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  14. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６、３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  15. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  16. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  17. 前記第４の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
  18. 前記第４の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
  19. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、 第３の標的核酸配列は、配列番号３７６に従う配列またはその相補配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  20. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、 第３の標的核酸配列は、配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含み、第４の標的核酸配列は、配列番号３７７に従う配列またはその相補体を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
  21. 前記ヘルペス」ウイルスが、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶ－３、水痘帯状疱疹）ウイルス （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５；サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス （ＫＳＨＶ））からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 組成物であって：
    ａ）クラスター化規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と；
    ｂ）第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１の標的核酸配列に相補的である、第１のガイド核酸、または第１のガイド核酸をコードする核酸配列と；
    ｃ）第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的である、第２のガイド核酸、または第２のガイド核酸をコードする核酸配列と； そして
    ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である、第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列と；
    を有し、
    ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる、ことを特徴とする組成物。
  23. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  25. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  26. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌のＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ヒト細胞における発現のために最適化されている、ことを特徴とする請求項２２～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ガイド核酸がＲＮＡである、ことを特徴とする請求項２２～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ことを特徴とする請求項２２～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  31. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  32. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  33. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  34. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  35. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、または３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
  36. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２もしくは７に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含み、前記第３の標的核酸配列は、配列番号３７７に従う配列またはその相補体を含むことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。 。
  37. 前記ヘルペス」ウイルスが、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶ－３、水痘帯状疱疹） ウイルス （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５；サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス （ＫＳＨＶ））からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項２２～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって：
    ａ）クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと；
    ｂ）第１のガイド核酸であって、配列番号２もしくは７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列、またはその相補体を含む第１のガイド核酸と； および
    ｃ）第２のガイド核酸であって、第２のガイド核酸は、配列番号３７６もしくは３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列、またはその相補体を含む第２のガイド核酸と；
    を有する、ことを特徴とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  39. 前記第１のガイド核酸が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  40. 前記第１のガイド核酸が、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  41. 前記第２のガイド核酸が、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  42. 前記第２のガイド核酸が、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  43. 前記第１のガイド核酸が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、前記第２のガイド核酸が、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。。
  44. 前記第１のガイド核酸が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、前記第２のガイド核酸が、 配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的である。
  45. 前記第１のガイド核酸が、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、前記第２のガイド核酸が、配列番号３７６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  46. 前記第１のガイド核酸が、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含み、前記第２のガイド核酸が、配列番号３７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に相補的な核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  47. 請求項３８～４６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸。
  48. 以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター：
    ａ）クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；
    ｂ）ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第１標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸と；
    ｃ）第２のガイド核酸であって、第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ０遺伝子内またはその付近の第２の標的核酸配列に相補的である、第２のガイド核酸；そして
    ｄ）第３のガイド核酸、または第３のガイド核酸をコードする核酸配列であって、第３のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である、第３のガイド核酸；
    ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる、ことを特徴とする
  49. 第４のガイド核酸をさらに含み、前記第４のガイド核酸が、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第４の標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  50. 前記第４の標的核酸配列が、前記第１の標的核酸配列、前記第２の標的核酸配列、および前記第３の標的核酸配列とは異なる、ことを特徴とする請求項４９に記載のＡＡＶベクター。
  51. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項４８～５０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  52. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項４８～５０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  53. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項４８～５０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  54. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌のＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項５３に記載のＡＡＶベクター。
  55. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ヒト細胞における発現のために最適化されている、ことを特徴とする請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  56. ガイド核酸がＲＮＡである、ことを特徴とする請求項４８～５５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  57. ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ことを特徴とする請求項４８～５６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  58. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  59. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  60. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  61. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  62. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  63. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  64. 前記第４の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４９に記載のＡＡＶベクター。
  65. 前記第４の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項４９に記載のＡＡＶベクター。
  66. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、前記第３の標的核酸配列は、配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含むことを特徴とする請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
  67. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号７に従う配列またはその相補体を含み、前記第３の標的核酸配列は、配列番号３７６に従う配列またはその相補体を含み、前記第４の標的核酸配列は、配列番号３７７に従う配列またはその相補体を含む、ことを特徴とする請求項４９に記載のＡＡＶベクター。
  68. 核酸がプロモーターをさらに含む、ことを特徴とする請求項４８～６７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  69. 前記プロモーターが遍在性プロモーターである、ことを特徴とする請求項６８に記載のＡＡＶベクター。
  70. 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、ことを特徴とする請求項６８に記載のＡＡＶベクター。
  71. 前記プロモーターが構成的プロモーターである、ことを特徴とする請求項６８に記載のＡＡＶベクター。
  72. 前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、ことを特徴とする請求項６８に記載のＡＡＶベクター。
  73. 前記核酸がエンハンサーエレメントをさらに含む、ことを特徴とする請求項４８～７２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  74. 前記エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、ことを特徴とする請求項９５に記載のＡＡＶベクター。
  75. 前記核酸が、５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む、ことを特徴とする請求項４９～９６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  76. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、ことを特徴とする請求項４８～７５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  77. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である、ことを特徴とする請求項４８～７５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  78. 前記ヘルペス」ウイルスが、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶ－３、水痘）帯状疱疹ウイルス （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５；サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス （ＫＳＨＶ））からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項４８～７７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  79. 以下をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター：
    ａ）クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；
    ｂ）第１のガイド核酸であって、前記第１のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰＯ遺伝子内またはその近傍の第１の標的核酸配列に相補的である第１のガイド核酸；
    ｃ）第２のガイド核酸であって、前記第２のガイド核酸は、ヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍の第２の標的核酸配列に相補的である第２のガイド核酸； および
    ｄ）第３のガイド核酸であって、前記第３のガイド核酸はヘルペス」ウイルスゲノムのＩＣＰ２７遺伝子内またはその近傍にある第３の標的核酸配列に相補的である第３のガイド核酸；
    ここで、第１の標的核酸配列、第２の標的核酸配列、および第３の標的核酸配列は異なる。
  80. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  81. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓＱエンドヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  82. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  83. Ｃａｓ９ヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項８２記載のＡＡＶベクター。
  84. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ヒト細胞における発現のために最適化されている、ことを特徴とする請求項７９～８３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  85. ガイド核酸がＲＮＡである、ことを特徴とする請求項７９～８４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  86. ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ことを特徴とする請求項７９～８４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  87. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  88. 前記第１の標的核酸配列が、配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つに従う配列、または配列番号１～９６もしくは３７２～３７５のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  89. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７の相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  90. 前記第２の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  91. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  92. 前記第３の標的核酸配列が、配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つに従う配列、または配列番号３６３、３７１、もしくは３７４～３７７のいずれか１つの相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  93. 前記第１の標的核酸配列が配列番号２もしくは７に従う配列またはその相補体を含み、前記第２の標的核酸配列が配列番号３７６または３７６に従う配列を含み、前記第３の標的核酸配列は、配列番号３７７に従う配列またはその相補体を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載のＡＡＶベクター。
  94. 前記ヘルペス」ウイルスが、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス」ウイルス２型（ＨＳＶ２）、ヒトヘルペス」ウイルス３（ＨＨＶ－３、水痘） 帯状疱疹ウイルス （ＶＺＶ）、ヒトヘルペス」ウイルス４ （ＨＨＶ－４； エプスタイン・バーウイルス （ＥＢＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス５ （ＨＨＶ－５；サイトメガロウイルス （ＣＭＶ））、ヒトヘルペス」ウイルス６ （ＨＨＶ－６； ロゼオロウイルス）、ヒトヘルペス」ウイルス７ （ＨＨＶ－７）、およびヒトヘルペス」ウイルス８ （ＨＨＶ－８； カルポジ肉腫関連ヘルペス」ウイルス （ＫＳＨＶ））からなる群より選択される、ことを特徴とする請求項７９～９３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  95. 前記核酸がプロモーターをさらに含む、ことを特徴とする請求項７９～９４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  96. 前記プロモーターが遍在性プロモーターである、ことを特徴とする請求項９５に記載のＡＡＶベクター。
  97. 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、ことを特徴とする請求項９５６８に記載のＡＡＶベクター。
  98. 前記プロモーターが構成的プロモーターである、ことを特徴とする請求項９５に記載のＡＡＶベクター。
  99. 前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、ことを特徴とする請求項９５に記載のＡＡＶベクター。
  100. 前記核酸がエンハンサーエレメントをさらに含む、ことを特徴とする請求項７９～９９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  101. 前記エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、ことを特徴とする請求項１００に記載のＡＡＶベクター。
  102. 前記核酸が、５´ＩＴＲエレメントおよび３´ＩＴＲエレメントをさらに含む、ことを特徴とする請求項７９～１０１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  103. 前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、ことを特徴とする請求項７９～１０２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  104. 前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、またはＡＡＶＤＪ／８である、ことを特徴とする請求項７９～１０２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  105. 細胞からヘルペス」ウイルス配列の一部または全部を切除する方法であって、前記方法は、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物、請求項３８～４６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、または請求項４８～１０４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを前記細胞に提供するステップを有する、ことを特徴とする方法。
  106. 細胞におけるヘルペス」ウイルス複製を阻害または低減する方法であって、前記方法は、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物、請求項３８～４６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、または請求項４８～１０４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、を前記細胞に提供するステップを有する、ことを特徴とする方法。
  107. 前記細胞が対象内にある、ことを特徴とする請求項１０５～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記対象がヒトである、ことを特徴とする請求項１０７に記載の方法。
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EP3126497B1 (en) * 2014-04-01 2018-12-12 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
EP3985115A1 (en) * 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
WO2017075475A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
CN109415728A (zh) * 2016-02-15 2019-03-01 天普大学-联邦高等教育系统 逆转录病毒核酸序列的切除

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