WO2020214003A1 - B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물 및 이의 방법 - Google Patents

B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물 및 이의 방법 Download PDF

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이규준
이정민
김균환
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건국대학교 글로컬산학협력단
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present application relates to a method of inhibiting the proliferation of various genotypes of hepatitis B virus.
  • the present application relates to a composition for inhibiting the proliferation of various genotypes of hepatitis B virus.
  • the present application relates to various uses of compositions for inhibiting the proliferation of hepatitis B viruses of various genotypes.
  • Hepatitis B is an inflammation of the liver caused by the hepatitis B virus (HBV).
  • Hepatitis B virus infection is not only highly incidence worldwide, but can be infected by anyone, regardless of age or race, and the path of infection varies.
  • the hepatitis B therapeutic agent developed so far frequently improves symptoms for some genotypes of hepatitis B, among the genotypes of the hepatitis B virus, where various genotypes exist.
  • An object of the present application is to provide a method for suppressing the proliferation of hepatitis B virus by targeting conserved regions of hepatitis B virus of various genotypes.
  • Another object of the present application is to provide a composition targeting conserved regions of hepatitis B virus of various genotypes.
  • Another object of the present application is to provide a conserved sequence of conserved regions of hepatitis B virus of various genotypes.
  • the present application may provide a method of inhibiting the proliferation of hepatitis B virus (HBV) in order to solve the above-described problem.
  • HBV hepatitis B virus
  • the hepatitis B virus is at least two or more HBV genotypes selected from HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type or HBV G type,
  • the guide nucleic acid is characterized in that it comprises any one or more selected from SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 and 89, respectively You can provide a way to do it.
  • a method comprising forming an indel in a nucleic acid sequence in a hepatitis B virus gene by the introduction may be provided.
  • the present application may provide a method of inactivating a conserved sequence in a hepatitis B virus (HBV) gene in order to solve the above-described problem.
  • the hepatitis B virus gene is at least one selected from among HBV genotypes consisting of HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type, or HBV G type, and the
  • the conserved sequence is a sequence conserved between the sequences of the HBV genotype, and in this case, the conserved sequence is SEQ ID NO. It is any one or more selected from 1 to 45, and the inactivation is to cleavage the conserved sequence,
  • the guide nucleic acid is a sequence that is partially or entirely complementary to the conserved sequence or a sequence having homology, and the guide nucleic acid is SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87, and 89 may provide a method characterized in that each comprises any one or more selected from.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic diagram of the design of CRISPR gRNAs capable of targeting HBV genotypes B, C, and D.
  • FIG. 2 is a diagram showing a virtual universal HBV genome for HBV genotype B produced based on an open database.
  • FIG. 3 is a diagram showing a virtual universal HBV genome for HBV genotype C produced based on an open database.
  • FIG. 4 is a diagram showing a virtual universal HBV genome for HBV genotype D produced based on an open database.
  • 5 is a diagram showing the distribution of the gRNA of SpCas9 capable of targeting the virtual universal HBV genotype B or C or D.
  • FIG. 6 is a diagram showing the distribution of CjCas9 that can target a virtual universal HBV genotype B or C or D.
  • FIG. 7 is a diagram showing the distribution of SpCas9 gRNAs targeting a conserved region based on the derived open database, a HBV genotype C derived from Korean patients, and a region commonly conserved in the sequence of an available HBV cell model. to be.
  • FIG. 8 is a diagram showing the distribution of CjCas9 gRNAs targeting a conserved region based on the derived open database, a Korean patient-derived HBV genotype C, and a region commonly conserved in the sequence of an available HBV cell model. to be.
  • FIG. 9 is a diagram showing a target region of HBV gRNA of the present application.
  • 10 to 13 and 18 are diagrams showing the results of measuring HBsAg and HBeAg of HBV D genotype of gRNA candidates (Cj#06, Cj#45, Cj#47, Cj#57) for CjCas9.
  • gRNA candidates for SpCas9 (Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp #197) is a diagram showing the measurement results of HBsAg and HBeAg of the HBV D genotype.
  • gRNA candidates for SpCas9 (Sp#17, Sp#90, Sp#193, Sp#197, Sp#17+90+193, Sp#17+90+197, Sp#17+193+197 , Sp#90+193+197) is a diagram showing the results of measuring HBsAg and HBeAg in Huh7 (HBV D genotype) and HepG2 (HBV D genotype) cell lines.
  • FIGS. 20 and 21 are diagram summarizing the results of FIGS. 20 and 21.
  • HBV genotype A is a diagram showing the results of measuring HBsAg and HBeAg for each.
  • FIG. 27 is a diagram showing a vector map designed to express one SpgRNA, Cas9 and a fluorescent protein in one plasmid.
  • 28 is a diagram showing a vector map designed to express one CjgRNA, Cas9 and a fluorescent protein in one plasmid.
  • 29 is a diagram showing a vector map designed to express three SpgRNAs, Cas9, and a fluorescent protein in one plasmid.
  • Hepatitis B is not only one of the widespread infectious diseases around the world, but also a disease that is highly likely to progress to chronic liver diseases such as cirrhosis and liver cancer.
  • Hepatitis B virus a hepatitis B virus that causes hepatitis B
  • HBV Hepatitis B virus
  • hepatitis B virus is a DNA virus belonging to Hepadnaviridae and is an incomplete double helix virus composed of about 3.2 kb (3200 bp) bases.
  • HBV has an incomplete complementary structure of positive-stranded DNA located inside the complete circular negative-stranded DNA.
  • HBV genome In the HBV genome, four ORFs (open reading frames) overlap, each with genes that designate pre-S/S, C, P, and X.
  • the ORF of the HBV genome has more than 50% overlapping portions.
  • HBV polymerase overlaps with the entire pre-S/S and with other ORFs. So, mutations that occur during HBV replication can affect more than one ORF, making mutations particularly prone to HBV replication.
  • HBV is known to exist in a total of 7 types of genotypes A to G. Each subtype differs by more than 8% on the entire HBV nucleotide sequence.
  • HBV The genotype of HBV has distinct distribution patterns depending on the region. In Western Europe and North America, A and D types are known as the main species, and in Asia, B and C types are known as the main species. Type E is confined to Africa and Type F is common in Central America. In particular, there are reports that HBV types B and C maintain viral proliferation for a longer period compared to other types (J Infect Dis 1997; 176:851-858).
  • HBV hepatitis B virus
  • hepatitis B virus not only causes diseases such as hepatitis and liver cancer, it is known that there are a total of seven different genotypes for HBV genotypes.
  • Interferon ⁇ which was first developed as a treatment for hepatitis B, promotes the destruction of HBV-infected hepatocytes by promoting the expression of Major Histocompatibility Complex I (MHC I) antigens in HBV-infected hepatocytes.
  • the document EP2014830911 discloses hundreds of guide nucleic acid candidates targeting the conserved region of the hepatitis B virus. Among them, about 24 guide nucleic acid candidates selected for screening whether the proliferation of the hepatitis B virus is inhibited have been disclosed. Furthermore, as a result of the screening, it is reported that about 3 guide nucleic acids that can substantially inhibit the proliferation of hepatitis B virus out of about 24 guide nucleic acid candidates.
  • World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9554-9565) also discloses about 15 guide nucleic acid candidates targeting conserved regions of the hepatitis B virus.
  • about 15 guide nucleic acids were screened for inhibition of hepatitis B virus alone or in combination, but it is reported that the effects of each guide nucleic acid candidates are different, as in the EP2014830911 document.
  • the hepatitis B virus proliferation inhibitory effect is targeting a conserved region of the hepatitis B virus, the hepatitis B virus proliferation inhibitory effect appears only in specific sequences. Therefore, according to this known fact, it can be seen that it is not possible to easily predict that the effect of inhibiting the proliferation of other genotypes of hepatitis B virus occurs only by the effect of inhibiting the proliferation of some genotypes of hepatitis B virus among various genotypes of hepatitis B virus have.
  • the present application provides methods and compositions for inhibiting the proliferation of various genotypes of hepatitis B virus.
  • the present application is designed to target and extract the conserved region of the hepatitis B virus from a more diverse target than the prior art, thereby providing another specific target sequence having a substantial proliferation inhibitory effect against the hepatitis B virus of various genotypes. Use.
  • the present application relates to a composition targeting a specific conserved region of the hepatitis B virus and a method of using the same, in particular, characterized in that it can simultaneously suppress the hepatitis B virus of various genotypes.
  • a specific region on the HBV genome targeted in the present application is derived through a method different from the prior art, and this specific region determined in the present application is clearly different from the region disclosed in the prior art.
  • the target for extracting a specific region of the hepatitis B virus is derived by combining information from the existing database, information from a patient infected with the hepatitis B virus, and information from the cell line injected with the hepatitis B virus. do.
  • the present application is for various HBV genotypes, for example, HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type and HBV G type, treatment considering the sequence of each genotype
  • effective treatment methods can be applied to all genotypes using the same sequence (region). That is, it is possible to suppress the proliferation of the hepatitis B virus with one type of composition without great restrictions on various HBV genotypes.
  • the method of inhibiting the hepatitis B virus proliferation of the present application is to inactivate a specific sequence conserved in the hepatitis B virus gene.
  • the conserved specific sequence is a conserved sequence as a region in which mutation does not occur easily between sequences of various HBV genotypes. Therefore, the method of the present application can be applied without limitation to various HBV genotypes.
  • at least two or more HBV genotypes selected from HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type or HBV G type can be simultaneously suppressed.
  • composition and method for suppressing the hepatitis B virus proliferation by targeting a specific region of the present application it is possible to exhibit a therapeutic effect using one type of specific region for the hepatitis B virus of various HBV genotypes. That is, by using the same composition and method, hepatitis B according to HBV A, HBV B, HBV C, HBV D, HBV E, HBV F, or HBV G can be treated.
  • An aspect of the present application relates to being able to suppress the proliferation of hepatitis B viruses of various genotypes by using a common target region.
  • the method of inhibiting the proliferation of the hepatitis B virus of the present application is to suppress the proliferation of the hepatitis B virus by using a technique that targets a common conserved specific region of the hepatitis B virus of various genotypes.
  • the genotype of the hepatitis B virus may be selected from HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type and HBV G type, but is not limited thereto.
  • the method of inhibiting the proliferation of hepatitis B virus of the present application is one or more genotypes selected from HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type and HBV G type. Hepatitis virus growth can be simultaneously inhibited.
  • the term "conserved area” should be interpreted as follows. Hepatitis B virus genotype HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type, or HBV G type. do.
  • the target of obtaining the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genotype is preserved between the base sequences of the HBV genotype selected by considering both the database, as well as the cell model derived from the patient infected with the hepatitis B virus, and the cell model injected with the hepatitis B virus. Means area.
  • the nucleic acid sequence of the conserved region is also referred to as a "conserved sequence”.
  • the conserved sequence of the present application can be obtained using the following method. .
  • the method of finding the conserved sequence of the hepatitis B virus of various genotypes is a simple method of finding the conserved sequence of the hepatitis B virus of various genotypes
  • the conserved sequence obtained by the above method is SEQ ID NO. It may be any one or more selected from 1 to 45.
  • AGG Sp20-viHBV-B-#159 AGGAGGCTGTAGGCATAAAT (SEQ ID NO. 25) TGG Sp20-viHBV-B-#186 CGGAAGTGTTGATAAGATAG (SEQ ID NO. 26) GGG Sp20-viHBV-B-#187 CCGGAAGTGTTGATAAGATA (SEQ ID NO. 27) GGG Sp20-viHBV-B-#193 GCGAGGGAGTTCTTCTTCTA (SEQ ID NO. 28) GGG Sp20-viHBV-B-#194 GACCTTCGTCTGCGAGGCGA (SEQ ID NO. 29) GGG Sp20-viHBV-B-#196 GATTGAGACCTTCGTCTGCG (SEQ ID NO.
  • AGG Sp20-viHBV-B-#197 CTCCCTCGCCTCGCAGACGA (SEQ ID NO. 31) AGG Sp20-viHBV-B-#198 GATTGAGATCTTCTGCGACG (SEQ ID NO. 32) CGG Sp20-viHBV-B-#199 GTCGCAGAAGATCTCAATCT (SEQ ID NO. 33) CGG Sp20-viHBV-B-#200 TCGCAGAAGATCTCAATCTC (SEQ ID NO. 34) GGG Cj22-viHBV-B-#06 TGTCAACAAGAAAAACCCCGCC (SEQ ID NO.
  • the conserved sequence of the present application obtained by the above method is, for example, SEQ ID NO. It may be any one or more selected from 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, and 44.
  • the most preferable method of finding the conserved sequence of the hepatitis B virus of various genotypes of the present application is to obtain a target for obtaining the hepatitis B virus nucleotide sequence of various genotypes by expanding, as described above.
  • the conserved sequence determined above is SEQ ID NO. 1 to 45, more preferably SEQ ID NO. Sequences of 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, and 44; And a sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% homology with respect to the sequences.
  • the conserved sequence of the hepatitis B virus targeted by the method of the present application described above is, preferably, the base sequence information for the hepatitis B virus of various genotypes, derived from a database, patient-derived, and a variety of cell models. It can be obtained from a combination of subjects.
  • the specific conserved sequence determined in this way can be a target capable of inhibiting the proliferation of hepatitis B virus without limitation to the HBV genotype, unlike the conventional case.
  • composition of the present application which will be described in more detail below, is designed to target conserved regions of the various genotypes of hepatitis B virus.
  • One embodiment of the present application relates to a composition for inhibiting the proliferation of hepatitis B viruses of various genotypes.
  • composition targets conserved regions of hepatitis B virus of various genotypes.
  • targets collectively refers to a mechanism that induces a sequence modification or inactivation of a function of a conserved region of the hepatitis B virus, thereby exhibiting a proliferation inhibitory or killing effect of the hepatitis B virus.
  • composition of the present application for inhibiting the proliferation of various genotypes of hepatitis B virus is not limited as long as it has a function of targeting a predetermined common specific region, that is, a conserved region (sequence).
  • a composition capable of introducing a mutation of the conserved region on the hepatitis B virus genomic DNA, or a composition capable of inhibiting translation of the conserved region on the mRNA of the hepatitis B virus may all be included.
  • composition of the present application comprises a CRISPR system.
  • it may include a guide nucleic acid and a Cas protein targeting the conserved region of the present application.
  • This CRISPR system is a system capable of introducing an artificial mutation by targeting a target sequence around a PAM (proto-spacer-adjacent Motif) sequence on genomic DNA.
  • the guide nucleic acid and the Cas protein bind to (or interact with each other) to form a guide nucleic acid-Cas protein complex, and by cutting the desired DNA sequence, a mutant indel can be induced on genomic DNA.
  • the composition of the present application can inhibit the proliferation or function of the hepatitis virus by introducing indels to the preserved region described above.
  • the Cas protein is one or more proteins selected from the group consisting of a Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes (Sp) and a Cas9 protein derived from Campylobacter jejuni (Cj) or encoding it It may include one or more selected from among the following nucleic acid sequences.
  • the Cas9 protein functions to recognize a PAM (proto-spacer-adjacent Motif) sequence on a genomic DNA sequence of a subject and to cleave a DNA sequence at a position adjacent to the PAM sequence by interacting with a guide nucleic acid.
  • PAM proto-spacer-adjacent Motif
  • the guide nucleic acid may be complementary to the target sequence of the hepatitis B virus genomic DNA sequence by using the conserved sequence of the present application as a target sequence.
  • the guide nucleic acid includes a site complementary to the target sequence (hereinafter referred to as a guide site) and a site involved in forming a complex with the Cas protein (hereinafter referred to as a complex formation site).
  • the guide portion is SEQ ID NO. 1 to 45, more preferably SEQ ID NO. It may be a sequence having homology with the sequence of 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, and 44 or a sequence having complementarity. Even if 0 to 5 mismatches are included in the guide site binding to the target sequence, it is not a problem if there is no effect on the function of the complex.
  • the sequence targeting the conserved sequence of the hepatitis B virus may be any one selected from SEQ ID NO.46 to 90 of [Table 2].
  • the guide nucleic acid interacts with the SpCas9 protein, and may be any one selected from SEQ ID NO.46 to 79.
  • the guide nucleic acid interacts with CjCas9 proteinyl, and may include any one selected from SEQ ID NO.80 to 90.
  • the complex formation site may be determined according to the type of the Cas9 protein-derived microorganism.
  • the complex formation site may include 5'-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3', and in the case of a CjCas9 GAGUGUGAGCAAAA, the guide that interacts with the CjCas9 GAGUGAGCAAAAAAAA' Can include'.
  • the guide site sequence (SEQ ID NOs: 46 to 90) of the guide nucleic acid of the present application is a sequence capable of complementarily binding to SEQ ID NOs: 1 to 45, which are conserved sequences described in Table 1 above, and is adjacent to the conserved sequence. It is designed in consideration of the PAM (proto-spacer-adjacent Motif) sequence that is located.
  • NGG N is A, T, C, or G
  • cjCas9 protein N is each independently A , T, C or G, R is A or G, and Y is C or T.
  • the composition may contain one or more guide nucleic acids.
  • the guide nucleic acid of the present application is SEQ ID NO.
  • One or more selected from 46 to 90 may be selected and used.
  • Preferably, a combination of two or more of the above sequences may be selected and used.
  • one of SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87, and 89 may be selected or a combination of two or more may be selected and used. .
  • a combination of SEQ ID NO.51, 57 and 73 or a combination of SEQ ID NO.51, 73 and 76 was used.
  • composition of the present application for example,
  • a guide nucleic acid comprising at least one selected from SEQ ID NO. 51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76 or a nucleic acid sequence encoding the same; And SpCas protein or a nucleic acid sequence encoding the same.
  • a guide nucleic acid comprising one or more selected from SEQ ID NO.80, 85, 87, 89 or a nucleic acid sequence encoding the same; And CjCas protein or a nucleic acid sequence encoding the same.
  • composition of the present application is a composition of the present application.
  • composition of the present application may be a vector form or a RNP (ribonucleoprotein) form. Therefore, the composition
  • a vector including a nucleic acid sequence encoding a guide nucleic acid and/or a Cas protein may be formed at the same time or individually.
  • the vector may include a guide nucleic acid and a nucleic acid sequence encoding a Cas protein at the same time, for another example, the vector may individually include a guide nucleic acid and a nucleic acid sequence encoding a Cas protein.
  • one or more of the guide nucleic acid and/or Cas protein may be used.
  • two or three guide nucleic acids may be used in combination.
  • the vector may be a viral vector or a plasmid.
  • the viral vector may be one or more selected from the group consisting of retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), vaccinia virus, poxvirus, and herpes simplex virus.
  • the composition is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl
  • the guide nucleic acid of a) is any one selected from SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 and 76, and the Cas protein of b) is Streptococcus pyogenes ) Derived from Cas9 protein.
  • the guide nucleic acid may be a combination of SEQ ID NO.51, 57 and 73 or a combination of SEQ ID NO.51, 73 and 76.
  • composition is a mixture of two or more of the composition.
  • the guide nucleic acid of a) is SEQ ID NO. It is any one selected from 80, 85, 87, and 89, and the Cas protein of b) may include the Cas9 protein derived from Campylobacter jejuni.
  • composition may be configured in the form of RNP (ribonucleoprotein).
  • composition of the present application targets a specific conserved region of various hepatitis B viruses, thereby inhibiting proliferation of the virus without significant limitation to the genotype of the hepatitis B virus.
  • the guide nucleic acid and Cas protein complex of the composition target the conserved region in the HBV genomic DNA of the hepatitis B virus, and cleavage the double sequence of the conserved region.
  • indels that is, artificial mutations are formed in the conserved region to inactivate the virus, thereby inhibiting the proliferation of the hepatitis B virus.
  • “Inactivation” means that the target gene or the nucleic acid encoding it does not undergo a normal expression process in a cell, or disables or inhibits its function. This can be achieved by inducing a state in which transcription and/or translation of the target gene or nucleic acid is not possible.
  • “Knockout” specifically includes methods of erasing genetic information, eg, when cutting a DNA fragment of a gene, and the like. Through the knockout, it is possible to inhibit transcription and/or translation of a disease-causing gene or a gene having an abnormal function.
  • “Knockdown” is specifically blocking the translation of a gene into a protein, and may include blocking the production of an mRNA into a protein using, for example, a specific substance such as iRNA or miRNA.
  • composition of the present application in particular, can generate indels by NHEJ on the HBV genome by introducing DNA cleavage into the target sequence of interest. This can exert an effect of inhibiting the proliferation or function of HBV.
  • the present application by targeting the conserved region of the hepatitis B virus, proliferation of the hepatitis B virus may be suppressed, and the generation or expression of the hepatitis B virus antigen may be suppressed.
  • composition of the present application is a composition of the present application.
  • HBV A type Two or more types of HBV selected from HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type, and HBV G type can simultaneously inhibit proliferation.
  • It relates to a method for inhibiting the growth of hepatitis B virus by using the above composition.
  • the method of inhibiting the proliferation of the hepatitis B virus of the present application may be performed by introducing or administering the composition of the present application to a subject, in which case, the composition is
  • Cas protein or a nucleic acid sequence encoding it may include.
  • the guide nucleic acid is characterized in that it comprises any one or more selected from SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 and 89, respectively To do.
  • indels are formed in the nucleic acid sequence in the hepatitis B virus gene by the composition.
  • the method of the present application can simultaneously inhibit proliferation of a plurality of HBV genotype hepatitis B viruses among the various HBV genotype hepatitis B viruses with one and the same composition of the present application.
  • the present application relates to a method of inactivating a conserved sequence in a hepatitis B virus (HBV) gene.
  • HBV hepatitis B virus
  • the method is characterized by targeting a specific conserved sequence irrespective of the hepatitis B virus genotype.
  • the conserved sequence is a sequence conserved between sequences of the HBV genotype, for example, the conserved sequence SEQ ID NO. Any one or more selected from 1 to 45, preferably SEQ ID NO. It is intended to inactivate at least one conserved sequence selected from 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, and 44. In this case, the inactivation includes cleavage of the conserved sequence.
  • the genotype is not greatly limited, i.e., among HBV genotypes consisting of HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type or HBV G type.
  • HBV genotypes consisting of HBV A type, HBV B type, HBV C type, HBV D type, HBV E type, HBV F type or HBV G type.
  • One or more viruses of choice can be inactivated.
  • the guide nucleic acid may include any one or more selected from SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 and 89 have.
  • the guide nucleic acid may be a combination of SEQ ID NO.51, 57 and 73 or a combination of SEQ ID NO.51, 73 and 76.
  • the method of the present application is to inactivate the conserved sequence in the hepatitis B virus (HBV) gene.
  • HBV hepatitis B virus
  • the method of the present application has an effect of treating hepatitis B.
  • composition of the present application can be carried out by introducing or administering the composition of the present application to a subject in need of administration.
  • the subject may be a mammal infected with the hepatitis B virus, in one embodiment, a human, a monkey, a mouse, a rat, etc., but is not limited thereto.
  • HBV A type HBV A type
  • HBV B type HBV C type
  • HBV D type HBV D type
  • HBV E type HBV F type
  • HBV G type HBV G type
  • the present application since the present application has the effect of simultaneously inhibiting various genotype B-type viruses, using the composition and method of the present application, it is possible to effectively inhibit proliferation regardless of the specific type of infected B-type virus, and B Hepatitis can be cured.
  • the administration can be carried out in any convenient manner, such as injection, transfusion, implantation or transplantation.
  • the route of administration is subretinal, subcutaneously, intradermaliy, intraocularly, intravitreally, intratumorally, intracutaneous, intramedullary, intramuscular intramuscularly), intravenous (intravenous), intralymphatic (intralymphatic), intraperitoneally, etc. can be selected.
  • a single dose of the composition is 104-109 cells per kg body weight of the administration subject, such as 105 to 106 cells/kg (body weight). It may be selected from all integer values within, but is not limited thereto, and may be appropriately prescribed in consideration of the age, health and weight of the subject to be administered, the type of treatment to be received at the same time, the frequency of treatment, if any, and the characteristics of the desired effect. have.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of designing CRISPR gRNAs capable of targeting HBV genotypes B, C, and D.
  • a genetic scissors capable of multi-targeting all of the genomes of the Korean patient-derived HBV genotype C, HBV genotype B, C, D, and HBV cell models of the open database was designed.
  • HBV genotypes HBV genome data base (HBVdb, https://hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex) for HBV B, C, D genotypes 1638, 2136, and 923 full sequences were collected. The collected sequences were sequenced to create a virtual HBV genome (hereinafter, vHBV) sequence.
  • vHBV virtual HBV genome
  • the virtual HBV genome sequence B-type, C-type, and D-type were constructed based on a site with 80% sequence homology among the aligned sequences of each of the obtained HBV B-type, C-type, and D-type full sequences (Fig. 2 to 4).
  • SEQ ID NO. 91 corresponds to the sequence of FIG. 2
  • SEQ ID NO. 92 corresponds to the sequence of FIG. 3
  • SEQ ID NO. 93 corresponds to the sequence in FIG. 4.
  • FIG. 2 SEQ ID NO. 91 GGACTGTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCaTACTCACAACTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCtTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAA virtual HBV C genotype sequences (Fig. 3) SEQ ID NO.
  • CRISPR target gRNAs were designed based on the virtual universal HBV genome of each of the HBV genotypes B, C, and D types obtained in Example 1.
  • the gRNA design for SpCas9 (from Streptococcus pyogenes (5'-NGG-3' for target, 5'-NRG-3' for off-target)) and CjCas9 (from Campylobacter jejuni: 5'-NNNNRYAC-3') is Cas -Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/) was used, and gRNAs with mismatch 1 and 2 as off-targets were excluded.
  • vHBV B, C D genotype conserved gRNA was obtained as shown in Figures 5 to 6.
  • Target for virtual universal HBV genotype B (gRNA 150 for SpCas9, gRNA 80 for CjCas9)
  • target for HBV genotype C gRNA 168 for SpCas9, gRNA 66 for CjCas9
  • target for HBV genotype D (GRNA 158 for SpCas9, gRNA target 71 for CjCas9) was derived.
  • 34 gRNAs for SpCas9 which can simultaneously target virtual universal HBV genotypes B, C, and D, and 11 gRNAs for CjCas9 were obtained (FIGS. 5 to 6 ).
  • the gRNAs of 46 to 90 are gRNAs that can target at least one of the HBV genotypes B, C, and D, among which, SEQ ID NO. 46 to 79 are gRNAs of SpCas9, SEQ ID NO. 80 to 90 are CjCas9 gRNAs.
  • SpCas9 gRNAs that can target both four virus-derived HBV C-type viruses and two cell lines (D-type) commonly used in HBV experiments are shown in [Table 2] in SEQ ID NO. 51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 and 76, and the gRNA of CjCas9 is SEQ ID NO. 80, 85, 87 and 89.
  • the conserved sequence based on the Open database obtained in Example 3 the HBV target site targeted by the gRNA targeting the conserved region in the sequence of the HBV genotpye C and HBV cell model derived from Korean patients was screened as a result of screening the HBV target site of FIG. It was confirmed that at least one of P, X, PreS1, PreS2, C, S, and PreC was targeted.
  • a vector construction for introducing the gRNA obtained in Example 3 into cells was prepared (FIGS. 27 to 29 ).
  • Fig. 27 is designed to express one SpgRNA, Cas9 and a fluorescent protein in one plasmid.
  • Fig. 28 is designed to express one CjgRNA, Cas9, and a fluorescent protein in one plasmid.
  • 29 is designed to express three SpgRNAs, Cas9 and a fluorescent protein in one plasmid.
  • HBV 1.2 plasmid encoding 1.2 copies of the HBV genome (genotype D, Addgene #51294), pAAV HBV genotype A, B and C (kindly provided by Pei-Jer Chen, Taipei city, Taiwan), Cj gRNA of CRISPR Cas9 (Cj #06, Cj#45, Cj#47, Cj#57) plasmids (Toolgen), Sp CRISPR Cas9 gRNA (Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp#197, N#17, N#90, N#193, N#197, N#17-90-193, N#17-90-197, N# 17-193-197, N#90-193-197) plasmids (Toolgen)
  • Human liver cancer cell lines Huh7 and HepG2 were obtained from Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Cell culture and maintenance are used by adding 10% fetal bovine serum (Capricorn, Ebsdorfer ground, Germany) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA) to Dulbecco's modified Eagle's medium (Welgene, Gyeongsan-si, Korea) I did. The maintenance of the cells was maintained in an incubator maintained at 37°C and 5% CO 2 .
  • Huh7 or HepG2 cells were seeded with 4 x 10 ⁇ 5 cells in each well of a 6-well plate, and 1 ⁇ g of replicon and 1 ⁇ g of CRISPR Cas9 (SpCas9 or CjCas9) and a plasmid expressing gRNA were prepared using Lipofectamin 2000. Transfected. After 24 hours, the cell medium was replaced with fresh medium. After 3 days, a supernatant of cells was obtained for ELISA.
  • HBsAg ELISA Kit WB-2496, Wantai Pharm Inc., Beijing, China
  • HBsAg ELISA Kit WB-2296, Wantai Pharm Inc., Beijing, China
  • the absorbance of HBeAg and HBsAg was measured in a wavelength range of 450 nm using the SPECTRA max PLUS 384 Microplate Reader and SoftMax Pro 5.2 program.
  • HBeAg and HBsAg were measured for each of the SpCas9 gRNA candidates and the CjCas9 gRNA candidates obtained in Example 3 using HBV D genotype HBV 1.2.
  • Cj#47 had the lowest amount of HBeAg and HBsAg (Fig. 10 to 13, Fig. 18). In other words, it could be expected that Cj#47 would have the best effect as a CjCas9 target gRNA.
  • SpCas9 gRNA candidates Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp#197 of HBeAg and HBsAg were obtained. As a result of measuring the amount, most of the amount of HBeAg was small, but the amount of HBsAg was relatively high.
  • gRNAs targeting the conserved sequence of the hepatitis B virus may have different inhibitory abilities for each of HBeAg and HBsAg.
  • HBV type A, HBV type B, HBV type C, and HBV type D (respectively named as Genotype A, Genotype B, Genotype C, and Genotype D) in which pAAV HBV genotypes A, B, C and D were introduced into human liver cancer cell line Huh7.
  • HBeAg and HBsAg are different in each of the cell lines of HBV A, HBV B, HBV C, and HBV D types of the spCas9 gRNA candidates, respectively.
  • N#193 and N#197 (single gRNA) showed a tendency to decrease HBeAg, but did not decrease HBsAg, but N#17-90. It was confirmed that -193, N#17-193-197 effectively reduced HBeAg and HBsAg.
  • N#17-90-193 and N#17-193-197 effectively inhibited HBV of all Genotypes A, B, C, and D.
  • the present application relates to a method of inhibiting the proliferation of various genotypes of hepatitis B virus.

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Abstract

본 출원은 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물 및 이의 방법
본 출원은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.
B형 간염(Hepatitis B)은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)에 의해 생기는 간의 염증이다.
B형 간염 바이러스의 감염은 전세계적으로 발생빈도가 높을 뿐만 아니라, 나이나 인종과 관계없이 누구나 감염될 수 있으며 감염의 경로도 다양하다.
지금까지 개발된 B형 간염 치료제는 다양한 유전자형이 존재하는 B형 간염바이러스의 유전자형 중 일부 유전자형의 B형 간염에 대해서, 증상만 호전시키기 때문에 재발이 빈번하게 일어난다.
또한, B형 간염 바이러스의 활성을 줄이고자, CRISPR/Cas시스템을 이용하여 B형 간염 바이러스 증식 억제를 하고자 연구한 여러 문헌(특허 제EP2014830911호, 논문 World J Gastroenterol. 2015 Aug 28; 21(32): 9554-9565.)들에서도 B형 간염 바이러스의 타겟 부위에 따라 B형 간염 바이러스 억제 효과가 상이하며, 또한, HBV 유전자형 각각에 대해 상이한 효과가 있음이 보고되고 있다.
이와 같이, B형 간염 바이러스의 재발을 줄이고자 하는 노력과 더불어, 다양한 B형 간염 바이러스 유전자형에 대한 증식 억제의 필요성이 여전히 존재한다.
본 출원의 일 과제는, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하여 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 또 다른 과제는, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역의 보존서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 증식을 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 B형 간염 바이러스는 적어도 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 선택되는 2이상의 HBV 유전자형이고,
상기 방법은,
a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을 대상에 도입함;을 포함하고,
이 때, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공할 수 있다. 특히, 이 때, 상기 도입으로 B형 간염 바이러스 유전자 내 핵산서열에 인델(indel)을 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법이 제공될 수 있다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유전자 내 보존된 서열을 불활성화하는 방법을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 B형 간염 바이러스 유전자는 적어도 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형으로 구성된 HBV 유전자형 중 선택되는 1이상이고, 상기 보존된 서열은 상기 HBV 유전자형의 서열간 보존되는 서열이고, 이 때, 상기 보존된 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 45 중 선택되는 어느 하나 이상이고, 상기 불활성화는 상기 보존된 서열을 절단(cleavage)하는 것이고,
상기 방법은,
a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을 대상에 도입함;을 포함하고,
상기 가이드핵산은 상기 보존된 서열과 일부 또는 전체가 상보적인 서열 또는 상동성을 가진 서열이고, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함 것을 특징으로 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하여 유전자형에 크게 제한받지 않고 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 방법을 제공할 수 있게 된다.
둘째, 본 출원에 의하면, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하는 조성물을 제공할 수 있게 된다. 이 때, 상기 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대하여 동일한 조성물을 사용하여 치료 효과를 나타낼 수 있다.
셋째, 본 출원에 의하면, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 제공할 수 있게 된다.
도 1은 HBV genotype B, C, D를 타겟할 수 있는 CRISPR gRNAs 설계 모식도를 도시한 도면이다.
도 2는 Open Database를 기반으로 제작한 HBV genotype B에 대한 virtual universal HBV genome을 도시한 도면이다.
도 3은 Open Database를 기반으로 제작한 HBV genotype C에 대한 virtual universal HBV genome을 도시한 도면이다.
도 4은 Open Database를 기반으로 제작한 HBV genotype D에 대한 virtual universal HBV genome을 도시한 도면이다.
도 5는 virtual universal HBV genotype B 또는 C 또는 D를 타겟할 수 있는 SpCas9의 gRNA의 분포를 도시한 도면이다.
도 6은 virtual universal HBV genotype B 또는 C 또는 D를 타겟할 수 있는 CjCas9의 분포를 도시한 도면이다.
도 7은 도출된 Open database 기반의 보존된 영역을 표적하는 서열, 한국환자유래 HBV genotype C, 그리고 가용할 HBV 세포모델의 서열에서 공통적으로 보존된 영역을 표적 하는 SpCas9의 gRNA의 분포를 도시한 도면이다.
도 8은 도출된 Open database 기반의 보존된 영역을 표적하는 서열, 한국환자유래 HBV genotype C, 그리고 가용할 HBV 세포모델의 서열에서 공통적으로 보존된 영역을 표적 하는 CjCas9의 gRNA의 분포를 도시한 도면이다.
도 9는 본 출원의 HBV gRNA의 타겟영역을 도시한 도면이다.
도 10 내지 13, 18은 CjCas9을 위한 gRNA후보(Cj#06, Cj#45, Cj#47, Cj#57)들의 HBV D genotype의 HBsAg 및 HBeAg를 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 14 내지 17, 19는 SpCas9을 위한 gRNA후보(Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp#197)들의 HBV D genotype의 HBsAg 및 HBeAg를 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 20 및 21은 SpCas9을 위한 gRNA후보(Sp#17, Sp#90, Sp#193, Sp#197, Sp#17+90+193, Sp#17+90+197, Sp#17+193+197, Sp#90+193+197)들의 Huh7(HBV D genotype) 및 HepG2(HBV D genotype) 세포주에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 22는 도 20 및 21의 결과를 정리한 도면이다.
도 23 내지 26은 SpCas9을 위한 gRNA후보(Sp#193, Sp#197, Sp#17+90+197, Sp#17+193+197)들의 HBV genotype A형, HBV genotype B형, HBV genotype C형, HBV genotype D형 각각에 대한 HBsAg 및 HBeAg를 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 27은 SpgRNA 1개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계한 벡터맵을 도시한 도면이다.
도 28은 CjgRNA 1개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계한 벡터맵을 도시한 도면이다.
도 29는 SpgRNA 3개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계한 벡터맵을 도시한 도면이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
B형 간염은 전세계적으로 널리 발생하는 감염질환의 하나일 뿐만 아니라 간경변이나 간암과 같은 만성간질환으로 진행될 가능성이 높은 질병이다.
B형 간염을 일으키는 B형 간염 바이러스인 HBV(Hepatitis B virus)는 Hepadnaviridae에 속하는 DNA 바이러스로서, 약 3.2kb(3200bp)의 염기로 구성된 불완전한 이중 나선 바이러스이다.
HBV는 완전한 원형의 음성가닥(minus strand) DNA 안쪽에 불완전한 상보적 구조의 양성가닥(plus strand) DNA가 위치한다.
HBV 게놈에는 ORF(open reading frames) 4개가 겹쳐있는데 각각 pre-S/S, C, P, X를 지정하는 유전자를 가진다. HBV 유전체의 ORF는 서로 겹쳐 있는 부분이 50%가 넘는다. 특히 HBV polymerase는 pre-S/S 전체와 겹치며 다른 ORF와도 겹친다. 그래서 HBV 복제 시에 생기는 돌연변이는 한 개 이상의 ORF에 영향을 미칠 수 있어 HBV 복제 시에 돌연변이가 특히 더 잘 일어난다.
HBV는 지금까지 A형 내지 G형으로 총 7종류의 다양한 유전자형이 존재하는 것으로 알려져 있다. 각각의 아형은 HBV 전체 염기 서열상에서 8% 이상 차이가 난다.
HBV의 유전자형은 지역에 따라 분포양상이 뚜렷하다. 서유럽과 북아메리카에는 A형과 D형이 주종이며 아시아에는 B형과 C형이 주종으로 알려져 있다. E형은 아프리카에 국한되어 있으며 F형은 중앙아메리카에 흔하다. 특히, HBV B형과 C형이 다른 형에 비해 바이러스 증식이 장기간 유지된다는 보고도 있다(J Infect Dis 1997; 176:851-858).
이와 같이 B형 간염 바이러스는 다양한 유전자형이 존재하기 때문에, 이러한 유전자형에 크게 제한받지 않으면서 B형 간염 바이러스 증식을 억제할 수 있는 효과적인 방법이 필요하다.
● 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 증식 억제의 어려움
상기와 같이 B형 간염 바이러스는 간염, 간암 등의 질병의 원인이 될 뿐만 아니라, HBV 유전자형은 총 7종류의 다양한 유전자형이 존재하는 것으로 알려져 있다.
HBV가 혈액 내로 침입하면 주로 간세포 속에 자리잡게 되는데, 우리 몸은 HBV를 제거하기 위해 면역반응이 일어난다. 그래서 B형 간염 치료제로 가장 처음 개발된 인터페론 알파(Interferon α)는 HBV에 감염된 간세포에서 주조직 접합성 복합체 I(Major Histocompatibility Complex I, MHC I) 항원의 발현을 촉진시켜 HBV에 감염된 간세포의 파괴를 촉진하도록 개발되었다.
하지만 이는 다양한 HBV 유전자형 모두에 효과가 있는 것이 아니라, 일부 유전자형에만 효과가 있을 뿐, 간세포에 인테그레이션(integration)되어 활성화된 HBV DNA를 불활성화하는 것이 아니기 때문에 재발의 가능성이 존재한다.
최근 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 인테그레이션된 HBV DNA를 불활성화 하여 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고자 하는 연구가 이루어지고 있다(EP2014830911;, World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9554-9565).
구체적으로 살펴보면, EP2014830911 문헌에서는 B형 간염 바이러스의 보존된 영역(conserved region)을 타겟하는 수백 개의 가이드핵산 후보를 개시하고 있다. 이 중 B형 간염 바이러스의 증식이 억제되는지 스크리닝 하기 위해 선택한 가이드핵산 후보는 약 24개를 개시하고 있다. 더군다나, 스크리닝 결과, 약 24개의 가이드핵산 후보 중 실질적으로 B형 간염 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 가이드핵산은 약 3개 정도로 보고하고 있다.
World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9554-9565) 문헌에서도 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 타겟하는 가이드핵산 후보를 약 15개 정도 개시하고 있다. 해당 문헌에서도 약 15개 가이드핵산에 대해 단독 및 조합으로 B형 간염 바이러스 억제에 대해 스크리닝 하였으나, EP2014830911 문헌과 마찬가지로 가이드핵산 후보들 각각 효과가 상이함이 보고되고 있다. 또한, 특정 가이드핵산 조합 중에서도 일부에서만 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스 억제 효과가 발생함을 보고하고 있다.
이와 같이, 여러 문헌들의 보고에 의하면, B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하는 조성물일지라도 B형 간염 바이러스 증식 억제 효과는 일부에서만 나타났으며, 또한 다양한 B형 간염바이러스 유전자형에 적용 가능한 가이드핵산도 극히 일부에 불과했다.
다시 말해, B형 간염 바이러스 증식 억제 효과는 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하는 경우라고 할 지라도, 특정 서열들에서만 B형 간염 바이러스 증식 억제 효과가 나타난다는 것이다. 그러므로, 이러한 공지 사실에 따르면, B형 간염 바이러스의 다양한 유전자형 중 일부 유전자형의 B형 간염 바이러스 증식 억제 효과만으로, 다른 유전자형의 B형 간염 바이러스 증식 억제 효과가 발생함을 용이하게 예측할 수 없음을 알 수 있다.
따라서, 당업계에서 HBV DNA를 불활성화 하여 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고자 하는 연구에 있어서, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대하여 실질적인 증식 억제 효과가 있는 특정 대상 서열을 찾는 것이 요구되고 있다.
이러한 요구에 대하여, 본 출원은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 출원은 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 종래 보다 좀 더 다양한 대상으로부터 추출하여 이를 표적 하도록 설계함으로써, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대하여 실질적인 증식 억제 효과가 있는 또 다른 특정 대상 서열을 이용한다.
● 본 출원의 기술적 특징
본 출원은 B형 간염 바이러스의 보존된 특정 영역을 표적하는 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것으로, 특히 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스를 동시에 억제할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 출원에서 표적하는 HBV 게놈 상에서의 특정 영역은 종래 기술과 상이한 방법을 통해 도출하고, 본 출원에서 결정된 이러한 특정 영역은 종래의 기술에서 개시하고 있는 영역과 명백히 상이하다.
구체적으로, B형 간염 바이러스의 보존된 특정 영역을 추출하는 대상을 기존에 데이터베이스의 정보, 실질적인 B형 간염 바이러스에 감염된 환자 유래의 정보 및 B형 간염 바이러스를 주입한 세포주 유래의 정보를 조합하여 도출한다.
이러한 방법으로 결정된 HBV 게놈 상에서의 특정 영역을 표적함으로써, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대해서 모두 효과적으로 증식 억제 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 출원은 다양한 HBV 유전자형, 예를 들어, HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 및 HBV G형에 대하여, 각 유전자형의 서열을 고려한 치료 방법이 아닌, 동일한 서열(영역)을 이용하여 각 유전자형에 대해 모두 효과적인 치료 방법을 적용할 수 있다. 즉, 다양한 HBV 유전자형에 대한 큰 제한없이 B형 간염 바이러스를 한 종류의 조성물로 증식을 억제할 수 있다.
그러므로, 본 출원은 다음과 같은 기술적 특징을 보유한다.
첫째, 본 출원의 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 방법은 B형 간염바이러스 유전자 내 보존된 특정 서열을 불활성화 하는 것이다. 이 때, 상기 보존된 특정 서열은 다양한 HBV 유전자형의 서열간에 변이가 잘 일어나지 않는 영역으로서 보존된 서열이다. 그래서 다양한 HBV 유전자형에 제한없이 본 출원의 방법을 적용할 수 있다. 본 출원에서는 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 선택되는 적어도 2이상의 HBV 유전자형을 동시에 억제할 수 있다.
둘째, 본 출원의 특정 영역을 표적하여 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 조성물 및 방법에 따르면, 다양한 HBV 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대하여 한 종류의 특정 영역을 이용하여 치료 효과를 나타낼 수 있다. 즉, 동일한 조성물 및 방법을 이용하여, HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형에 따른 B형 간염을 치료할 수 있다.
이하에서 본 출원의 상기 기술적 특징을 가진 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 방법에 대해 보다 자세하게 설명하도록 한다.
다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 공통된 표적을 이용하는 증식 억제 방법
본 출원의 일 태양은 공통된 표적 영역을 이용하여 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 것에 관한 것이다.
구체적으로, 본 출원의 상기 B형 간염 바이러스 증식 억제 방법은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 공통의 특정 영역을 표적하는 기술을 이용하여 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 것이다.
상기 B형 간염 바이러스의 유전자형은 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 및 HBV G형 중 선택될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 B형 간염 바이러스 증식 억제 방법은 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 및 HBV G형 중 선택되는 1개 또는 복수개의 유전자형의 B형 간염 바이러스 증식을 동시에 억제할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존된 영역"은 다음과 같이 해석되어야 한다. B형 간염 바이러스 유전자형인 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 선택된 적어도 2이상의 유전자형의 서열간에 변이가 잘 일어나지 않은 부분을 의미한다. 특히, B형 간염 바이러스 유전자형의 염기서열을 수득하는 대상을 데이터베이스뿐만 아니라, B형 감염 바이러스에 감염된 환자유래, B형 간염 바이러스를 주입한 세포모델을 모두 고려하여 선택한 HBV 유전자형의 염기서열 간의 보존된 영역을 의미한다. 본 명세서에서 상기 보존된 영역의 핵산 서열을 "보존된 서열"로 지칭하기도 한다.
본 출원의 상기 보존된 서열은 다음과 방법을 이용하여 수득할 수 있다. .
임의의 실시예로, 상기 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 서열을 찾는 방법은,
HBV B형, HBV C형, HBV D형 각각의 염기서열을 데이터 베이스로부터 수득하여 정렬하는 단계;
상기 정렬한 HBV B형, HBV C형 및 HBV D형 서열을 비교하여 보존된 서열을 찾는 단계:
로 수행할 수 있다.
상기 방법으로 수득한 보존된 서열은 하기 [표 1]의 SEQ ID NO. 1 내지 45 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
Name sequence (5'→ 3') PAM
Sp20-viHBV-B-#10 GTAACACGAGCAGGGGTCCT (SEQ ID NO. 1) AGG
Sp20-viHBV-B-#11 CCCCGCCTGTAACACGAGCA (SEQ ID NO. 2) GGG
Sp20-viHBV-B-#12 ACCCCGCCTGTAACACGAGC (SEQ ID NO. 3) AGG
Sp20-viHBV-B-#13 AGGACCCCTGCTCGTGTTAC (SEQ ID NO. 4) AGG
Sp20-viHBV-B-#14 ACCCCTGCTCGTGTTACAGG (SEQ ID NO. 5) CGG
Sp20-viHBV-B-#17 CACCACGAGTCTAGACTCTG (SEQ ID NO. 6) TGG
Sp20-viHBV-B-#20 GGACTTCTCTCAATTTTCTA (SEQ ID NO. 7) GGG
Sp20-viHBV-B-#52 CCTACGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO. 8) TGG
Sp20-viHBV-B-#53 CCATTTGTTCAGTGGTTCGT (SEQ ID NO. 9) AGG
Sp20-viHBV-B-#54 CATTTGTTCAGTGGTTCGTA (SEQ ID NO. 10) GGG
Sp20-viHBV-B-#89 GGGTTGCGTCAGCAAACACT (SEQ ID NO. 11) TGG
Sp20-viHBV-B-#90 TTTGCTGACGCAACCCCCAC (SEQ ID NO. 12) TGG
Sp20-viHBV-B-#101 TCCGCAGTATGGATCGGCAG (SEQ ID NO. 13) AGG
Sp20-viHBV-B-#102 AGGAGTTCCGCAGTATGGAT (SEQ ID NO. 14) CGG
Sp20-viHBV-B-#103 TCCTCTGCCGATCCATACTG (SEQ ID NO. 15) CGG
Sp20-viHBV-B-#113 CGTCCCGCGCAGGATCCAGT (SEQ ID NO. 16) TGG
Sp20-viHBV-B-#117 CCGCGGGATTCAGCGCCGAC (SEQ ID NO. 17) GGG
Sp20-viHBV-B-#118 TCCGCGGGATTCAGCGCCGA (SEQ ID NO. 18) CGG
Sp20-viHBV-B-#119 CCCGTCGGCGCTGAATCCCG (SEQ ID NO. 19) CGG
Sp20-viHBV-B-#138 GTAAAGAGAGGTGCGCCCCG (SEQ ID NO. 20) TGG
Sp20-viHBV-B-#140 GGGGCGCACCTCTCTTTACG (SEQ ID NO. 21) CGG
Sp20-viHBV-B-#142 GAAGCGAAGTGCACACGGTC (SEQ ID NO. 22) CGG
Sp20-viHBV-B-#143 GGTCTCCATGCGACGTGCAG (SEQ ID NO. 23) AGG
Sp20-viHBV-B-#154 AATGTCAACGACCGACCTTG (SEQ ID NO. 24) AGG
Sp20-viHBV-B-#159 AGGAGGCTGTAGGCATAAAT (SEQ ID NO. 25) TGG
Sp20-viHBV-B-#186 CGGAAGTGTTGATAAGATAG (SEQ ID NO. 26) GGG
Sp20-viHBV-B-#187 CCGGAAGTGTTGATAAGATA (SEQ ID NO. 27) GGG
Sp20-viHBV-B-#193 GCGAGGGAGTTCTTCTTCTA (SEQ ID NO. 28) GGG
Sp20-viHBV-B-#194 GACCTTCGTCTGCGAGGCGA (SEQ ID NO. 29) GGG
Sp20-viHBV-B-#196 GATTGAGACCTTCGTCTGCG (SEQ ID NO. 30) AGG
Sp20-viHBV-B-#197 CTCCCTCGCCTCGCAGACGA (SEQ ID NO. 31) AGG
Sp20-viHBV-B-#198 GATTGAGATCTTCTGCGACG (SEQ ID NO. 32) CGG
Sp20-viHBV-B-#199 GTCGCAGAAGATCTCAATCT (SEQ ID NO. 33) CGG
Sp20-viHBV-B-#200 TCGCAGAAGATCTCAATCTC (SEQ ID NO. 34) GGG
Cj22-viHBV-B-#06 TGTCAACAAGAAAAACCCCGCC (SEQ ID NO. 35) TGTAACAC
Cj22-viHBV-B-#20 AAGCCCTACGAACCACTGAACA (SEQ ID NO. 36) AATGGCAC
Cj22-viHBV-B-#23 TTACCAATTTTCTTTTGTCTTT (SEQ ID NO. 37) GGGTATAC
Cj22-viHBV-B-#40 ACGTCCCGCGCAGGATCCAGTT (SEQ ID NO. 38) GGCAGCAC
Cj22-viHBV-B-#44 GTGCACACGGTCCGGCAGATGA (SEQ ID NO. 39) GAAGGCAC
Cj22-viHBV-B-#45 GTGCCTTCTCATCTGCCGGACC (SEQ ID NO. 40) GTGTGCAC
Cj22-viHBV-B-#46 CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAA (SEQ ID NO. 41) GTGCACAC
Cj22-viHBV-B-#47 TGCGACGTGCAGAGGTGAAGCG (SEQ ID NO. 42) AAGTGCAC
Cj22-viHBV-B-#48 GACCGTGTGCACTTCGCTTCAC (SEQ ID NO. 43) CTCTGCAC
Cj22-viHBV-B-#57 ATGTCCATGCCCCAAAGCCACC (SEQ ID NO. 44) CAAGGCAC
Cj22-viHBV-B-#67 GACCACCAAATGCCCCTATCTT (SEQ ID NO. 45) ATCAACAC
다른 예로서, 본 출원의 상기 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 서열을 찾는 방법은,
다음의 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스 염기서열을 다음으로부터 수득하는 단계,
HBV B형, HBV C형, HBV D형 각각의 데이터 베이스의 염기서열
HBV D형 세포 모델의 염기서열
HBV C형에 감염된 환자유래의 염기서열;
상기 수득한 염기서열들을 정렬(alignment)하는 단계; 및
상기 정렬한 서열에서 보존된 서열을 찾는 단계:
로 수행할 수 있다.
상기 방법으로 수득되는 본 출원의 보존된 서열은 예를 들어 [표 1]의 SEQ ID NO. 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, 및 44 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 서열을 찾는 가장 바람직한 방법은 앞서 설명한 바와 같이, 비해 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스 염기서열을 수득하는 대상을 확장하여 수득하는 것이다.
이러한 방법을 통해서, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대해서 동시에 억제 효과를 나타낼 수 있는, 본 출원의 공통의 보존된 영역을 결정할 수 있다. 상기 결정된 보존된 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 45, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO. 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, 및 44의 서열; 및 상기 서열들에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80%이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 상동성을 가지는 서열일 수 있다.
이와 같이, 상기에서 서술한 본원 방법이 표적하는 B형 간염 바이러스의 보존된 서열은, 바람직하게는, 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스에 대한 염기서열 정보를 데이터베이스 유래, 환자유래, 세포모델 유래의 다양한 대상의 조합으로부터 수득할 수 있다.
이렇게 결정된 상기 특정의 보존된 서열은, 종래의 경우와 달리, HBV 유전자형에 제한없이 B형 간염 바이러스의 증식을 억제시킬 수 있는 대상이 될 수 있다.
하기에서 조금 더 구체적으로 서술할 본 출원의 조성물은 상기 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하도록 설계한 것이다.
본 출원의 일 구현예는 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식 억제를 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적한다.
상기 "표적한다"는 용어는 B형 간염 바이러스의 보존된 영역 자체의 서열의 변형 또는 기능의 불활성화를 유도하여 B형 간염 바이러스의 증식억제 또는 사멸효과를 나타내는 메커니즘을 통칭하여 의미한다.
다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식 억제를 위한 본 출원의 상기 조성물은 앞서 결정된 공통의 특정 영역, 즉 보존된 영역(서열)을 표적하는 기능을 가지는 것이라면 제한이 없다. 예를 들어, B형 간염 바이러스 게놈 DNA 상의 보존된 영역의 돌연변이를 도입할 수 있는 조성물, 또는 B형 간염 바이러스의 mRNA 상의 보존된 영역의 번역을 저해할 수 있는 조성물 등이 모두 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원의 상기 조성물은 CRISPR 시스템을 포함한다.
구체적으로, 본 출원의 보존된 영역을 표적하는 가이드핵산 및 Cas단백질을 포함할 수 있다.
이러한 CRISPR 시스템은 게놈 DNA 상에서 PAM(proto-spacer-adjacent Motif)서열 주변의 대상 서열을 표적하여 인위적인 돌연변이를 도입할 수 있는 시스템이다. 구체적으로, 상기 가이드핵산과 Cas단백질은 서로 결합하여(또는 상호작용하여) 가이드핵산-Cas단백질 복합체를 형성하고, 목적하는 DNA 서열을 절단함으로써, 게놈 DNA 상에 돌연변이 인델(indel)을 유도할 수 있다. 본 출원의 조성물은 상기 설명한 보존된 영역에 인델을 도입함으로써 형 간염 바이러스의 증식 또는 기능을 억제시킬 수 있다.
상기 가이드핵산, Cas단백질, 가이드핵산-Cas단백질 복합체에 대한 보다 구체적인 설명은 한국 공개특허 제10-2017-0126636호를 참조할 수 있다.
본 출원에서, 상기 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes, Sp) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni, Cj) 유래의 Cas9 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열 중 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 대상의 게놈 DNA 서열 상에서 PAM(proto-spacer-adjacent Motif)서열을 인지하고 가이드핵산과 상호작용하여 PAM 서열 인접 위치에서 DNA 서열을 절단하는 기능을 한다.
본 출원에서, 상기 가이드핵산은 본 출원의 보존된 서열을 대상서열로 하여, B형 간염 바이러스 게놈 DNA 서열 중 상기 대상서열에 상보적 결합을 할 수 있다.
가이드 핵산은 상기 대상서열과 상보적으로 결합하는 부위(이하 가이드 부위로 칭함)와 Cas단백질과 복합체를 형성하는데 관여하는 부위(이하, 복합체 형성 부위로 칭함)를 포함한다.
이 때, 상기 가이드 부위는 SEQ ID NO. 1 내지 45, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO. 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, 및 44의 서열과 상동성을 가지는 서열 또는 상보성을 가지는 서열일 수 있다. 상기 가이드 부위가 대상서열과 결합함에 있어서 0 내지 5개의 미스매치가 포함되어 있어도 그 복합체의 기능에 영향이 없다면 크게 문제되지 않는다.
상기 B형 간염 바이러스의 보존된 서열을 표적하는 서열은 [표 2]의 SEQ ID NO.46 내지 90 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 예에서, 상기 가이드핵산은 SpCas9 단백질과 상호작용하며, SEQ ID NO.46 내지 79 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
다른 예에서, 상기 가이드핵산은 CjCas9 단백질일과 상호작용하며, SEQ ID NO.80 내지 90중 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 복합체 형성 부위는 Cas9 단백질 유래 미생물의 종류에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, SpCas9단백질과 상호작용하는 가이드핵산일 경우, 상기 복합체 형성부위는 5'-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3'를 포함할 수 있고, CjCas9단백질과 상호작용하는 가이드핵산일 경우, 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'를 포함할 수 있다.
NO. Name sequence (5'→ 3')
SEQ ID NO. 46 Sp20-viHBV-B-#10G GUAACACGAGCAGGGGUCCU
SEQ ID NO. 47 Sp20-viHBV-B-#11G CCCCGCCUGUAACACGAGCA
SEQ ID NO. 48 Sp20-viHBV-B-#12G ACCCCGCCUGUAACACGAGC
SEQ ID NO. 49 Sp20-viHBV-B-#13G AGGACCCCUGCUCGUGUUAC
SEQ ID NO. 50 Sp20-viHBV-B-#14G ACCCCUGCUCGUGUUACAGG
SEQ ID NO. 51 Sp20-viHBV-B-#17G CACCACGAGUCUAGACUCUG
SEQ ID NO. 52 Sp20-viHBV-B-#20G GGACUUCUCUCAAUUUUCUA
SEQ ID NO. 53 Sp20-viHBV-B-#52G CCUACGAACCACUGAACAAA
SEQ ID NO. 54 Sp20-viHBV-B-#53G CCAUUUGUUCAGUGGUUCGU
SEQ ID NO. 55 Sp20-viHBV-B-#54G CAUUUGUUCAGUGGUUCGUA
SEQ ID NO. 56 Sp20-viHBV-B-#89G GGGUUGCGUCAGCAAACACU
SEQ ID NO. 57 Sp20-viHBV-B-#90G UUUGCUGACGCAACCCCCAC
SEQ ID NO. 58 Sp20-viHBV-B-#101G UCCGCAGUAUGGAUCGGCAG
SEQ ID NO. 59 Sp20-viHBV-B-#102G AGGAGUUCCGCAGUAUGGAU
SEQ ID NO. 60 Sp20-viHBV-B-#103G UCCUCUGCCGAUCCAUACUG
SEQ ID NO. 61 Sp20-viHBV-B-#113G CGUCCCGCGCAGGAUCCAGU
SEQ ID NO. 62 Sp20-viHBV-B-#117G CCGCGGGAUUCAGCGCCGAC
SEQ ID NO. 63 Sp20-viHBV-B-#118G UCCGCGGGAUUCAGCGCCGA
SEQ ID NO. 64 Sp20-viHBV-B-#119G CCCGUCGGCGCUGAAUCCCG
SEQ ID NO. 65 Sp20-viHBV-B-#138G GUAAAGAGAGGUGCGCCCCG
SEQ ID NO. 66 Sp20-viHBV-B-#140G GGGGCGCACCUCUCUUUACG
SEQ ID NO. 67 Sp20-viHBV-B-#142G GAAGCGAAGUGCACACGGUC
SEQ ID NO. 68 Sp20-viHBV-B-#143G GGUCUCCAUGCGACGUGCAG
SEQ ID NO. 69 Sp20-viHBV-B-#154G AAUGUCAACGACCGACCUUG
SEQ ID NO. 70 Sp20-viHBV-B-#159G AGGAGGCUGUAGGCAUAAAU
SEQ ID NO. 71 Sp20-viHBV-B-#186G CGGAAGUGUUGAUAAGAUAG
SEQ ID NO. 72 Sp20-viHBV-B-#187G CCGGAAGUGUUGAUAAGAUA
SEQ ID NO. 73 Sp20-viHBV-B-#193G GCGAGGGAGUUCUUCUUCUA
SEQ ID NO. 74 Sp20-viHBV-B-#194G GACCUUCGUCUGCGAGGCGA
SEQ ID NO. 75 Sp20-viHBV-B-#196G GAUUGAGACCUUCGUCUGCG
SEQ ID NO. 76 Sp20-viHBV-B-#197G CUCCCUCGCCUCGCAGACGA
SEQ ID NO. 77 Sp20-viHBV-B-#198G GAUUGAGAUCUUCUGCGACG
SEQ ID NO. 78 Sp20-viHBV-B-#199G GUCGCAGAAGAUCUCAAUCU
SEQ ID NO. 79 Sp20-viHBV-B-#200G UCGCAGAAGAUCUCAAUCUC
SEQ ID NO. 80 Cj22-viHBV-B-#06G UGUCAACAAGAAAAACCCCGCC
SEQ ID NO. 81 Cj22-viHBV-B-#20G AAGCCCUACGAACCACUGAACA
SEQ ID NO. 82 Cj22-viHBV-B-#23G UUACCAAUUUUCUUUUGUCUUU
SEQ ID NO. 83 Cj22-viHBV-B-#40G ACGUCCCGCGCAGGAUCCAGUU
SEQ ID NO. 84 Cj22-viHBV-B-#44G GUGCACACGGUCCGGCAGAUGA
SEQ ID NO. 85 Cj22-viHBV-B-#45G GUGCCUUCUCAUCUGCCGGACC
SEQ ID NO. 86 Cj22-viHBV-B-#46G CGACGUGCAGAGGUGAAGCGAA
SEQ ID NO. 87 Cj22-viHBV-B-#47G UGCGACGUGCAGAGGUGAAGCG
SEQ ID NO. 88 Cj22-viHBV-B-#48G GACCGUGUGCACUUCGCUUCAC
SEQ ID NO. 89 Cj22-viHBV-B-#57G AUGUCCAUGCCCCAAAGCCACC
SEQ ID NO. 90 Cj22-viHBV-B-#67G GACCACCAAAUGCCCCUAUCUU
본 출원의 상기 가이드 핵산의 가이드부위 서열(서열번호 46 내지 90)은 앞서 표 1에 기재한 보존된 서열인 서열번호 1 내지 45에 상보적으로 결합할 수 있는 서열로서, 상기 보존된 서열에 인접해서 위치하고 있는 PAM(proto-spacer-adjacent Motif)서열을 고려하여 설계된 것이다.
상기 PAM(proto-spacer-adjacent Motif)서열로서, spCas9 단백질을 사용하는 경우 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)가 고려되고, cjCas9 단백질을 사용하는 경우 NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임)가 고려된다.
상기 조성물은 가이드핵산을 1개 또는 복수개 포함할 수 있다.
임의의 예에서, 본 출원의 가이드핵산은 [표 2]의 SEQ ID NO. 46 내지 90 중 선택되는 1 이상을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 서열 중 2이상의 조합을 선택하여 이용할 수 있다.
일 구체예에서 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중에서 하나를 선택하여 또는 2 이상의 조합을 선택하여 이용할 수 있다. 일 실시예에서, SEQ ID NO.51, 57 및 73의 조합 또는 SEQ ID NO.51, 73 및 76의 조합을 이용하였다.
본 출원의 조성물은 예를 들어,
SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76 중 선택되는 1 이상을 포함하는 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 SpCas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을 포함할 수 있다.
또는, SEQ ID NO.80, 85, 87, 89 중 선택되는 1 이상을 포함하는 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 CjCas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 조성물은
HBV A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형 중 선택되는 어느 2 이상의 B형 간염 바이러스 유전자형의 보존된 영역을 동시에 표적할 수 있다.
일 예에서,
HBV B형, C형, 및 D형의 B형 간염 바이러스 유전자형의 보존된 영역을 동시에 표적 할 수 있다.
본 출원의 조성물의 형태는 벡터형태 또는 RNP(ribonucleoprotein)형태일 수 있다. 그러므로 상기 조성물은
a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;
을 포함한다.
이 때, 벡터 형태의 조성물인 경우, 가이드핵산 및/또는 Cas단백질을 암호화하는 핵산서열을 동시에 또는 개별적으로 포함하는 벡터로 구성할 수 있다. .
예를 들어, 상기 벡터는 가이드핵산과 Cas단백질을 암호화하는 핵산서열을 동시에 포함할 수 있고, 다른 예를 들어, 상기 벡터는 가이드핵산과 Cas단백질을 암호화하는 핵산서열을 개별적으로 포함할 수 있다.
이 때, 상기 가이드핵산 및/또는 Cas 단백질은 1종 이상을 사용할 수도 있다. 일 구체예에서 상기 가이드 핵산을 2개 또는 3개를 조합하여 이용할 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은
a)의 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 및 76 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질을 포함할 수 있다. 이 때, 일 실시예에서, 상기 가이드 핵산은 SEQ ID NO.51, 57 및 73의 조합 또는 SEQ ID NO.51, 73 및 76의 조합을 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은
a)의 가이드핵산은 SEQ ID NO. 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질을 포함할 수 있다.
한편, 상기 조성물은 RNP(ribonucleoprotein)형태로 구성할 수도 있다.
이는, 본 출원의 가이드핵산 RNA 서열 및 Cas단백질이 서로 결합한(또는 상호작용하여 형성한) 복합체(complex) 형태를 의미한다.
본 출원의 조성물은 다양한 B형 간염 바이러스의 특정 보존된 영역을 표적함으로써, B형 간염 바이러스의 유전자형에 크게 제한없이 상기 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
상기 조성물의 가이드핵산 및 Cas단백질 복합체가 B형 간염 바이러스의 HBV 게놈 DNA 내 보존된 영역을 표적하여 상기 보존된 영역의 이중 서열을절단(cleavage)한다. 그 결과, 상기 보존된 영역 내에 인델(indel), 즉 인위적인 돌연변이(mutation)가 형성되어 상기 바이러스를 불활성화시킴으로써B형 간염 바이러스의 증식을 억제한다.
상기 불활성화의 결과로서, 넉다운(knock down), 넉아웃(knock out) 형태를 모두 포함한다.
"불활성화"는 표적 유전자 또는 이를 코딩하는 핵산이 세포 내에서 정상적인 발현과정을 거치지 않도록 하거나 그 기능을 불능화시키거나 억제시키는 것을 의미한다. 이는 표적 유전자 또는 핵산의 전사 및/또는 번역이 되지 못하는 상태를 유도함으로써 이루어질 수 있다.
"넉아웃(knockout)"은 특히 유전 정보를 삭제하는 방법, 예를 들어, 유전자의 DNA 단편을 절단하는 경우 등을 포함한다. 상기 넉아웃을 통해 질병을 유발하는 유전자 또는 비정상적 기능을 가지는 유전자의 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있다.
"넉다운(knockdown)"은 특히 유전자가 단백질로 번역되는 것을 차단하는 것으로, 예를 들어 iRNA, miRNA 등과 같은 특정물질의 이용하여 mRNA에서 단백질로의 생성을 차단하는 경우를 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 특히, 표적하는 대상 서열 내에 DNA 절단을 도입함으로써 HBV 게놈 상에 NHEJ에 의한 인델(indel)을 생성시킬 수 있다. 이를 통해 HBV의 증식 또는 기능을 억제하는 효과를 발휘할 수 있다.
본 출원에서, 상기 B형 간염 바이러스의 보존된 영역을 표적하면, B형 간염 바이러스의 증식이 억제되고, B형 간염 바이러스 항원의 생성 또는 발현이 억제될 수 있다.
본 출원의 상기 조성물은
HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형, HBV G형 중 선택되는 2종 이상의 HBV를 동시에 증식을 억제할 수 있다. 또한, HBsAg, HBeAg, HBcAg 중 선택되는 어느 하나 이상의 B형 간염 바이러스 항원의 생성 또는 발현을 억제할 수 있다.
본 출원의 다른 태양으로,
상기 조성물을 이용하여, B형 간염 바이러스 증식 억제 방법에 관한 것이다.
본 출원의 상기 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 방법은, 본 출원의 조성물을 대상에 도입 또는 투여함으로써 수행될 수 있고, 이 때, 상기 조성물은
a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 조성물에 의해 B형 간염 바이러스 유전자 내 핵산서열에 인델(indel)이 형성된다. 이러한 방법에 의해 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 2종 이상의 HBV의 증식을 동시에 억제시킬 수 있다.
본 출원의 상기 방법은, 본 출원의 하나의 동일한 조성물로 상기 다양한 HBV 유전자형의 B형 간염 바이러스 중 복수개의 HBV 유전자형의 B형 간염 바이러스를 동시에 증식 억제시킬 수 있다.
한편, 본 출원은 또 다른 태양으로, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유전자 내 보존된 서열을 불활성화하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 B형 간염 바이러스 유전자형과 무관하게 특정 보존 서열을 표적하는 것을 특징으로 한다. 상기 보존된 서열은 상기 HBV 유전자형의 서열간 보존되는 서열이고, 예를 들어, 보존된 서열 SEQ ID NO. 1 내지 45 중 선택되는 어느 하나 이상, 바람직하게는 SEQ ID NO. 6, 7, 11, 12, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 35, 40, 42, 및 44 중 선택되는 하나 이상의 보존 서열을 불활성화 시키는 것을 목적으로 한다. 이 때, 상기 불활성화는 상기 보존된 서열을 절단(cleavage)하는 것을 포함한다.
이러한 방법을 이용하면, 유전자형에 크게 제한받지 않고, 즉 예를 들어, HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형으로 구성된 HBV 유전자형 중 선택되는 1 이상의 바이러스를 불활성화시킬 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서는, 이러한 방법을 실시하기 위하여,
a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을
대상에 도입 또는 투여할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 57 및 73의 조합 또는 SEQ ID NO.51, 73 및 76의 조합을 이용할 수 있다.
본 출원의 상기 방법은, 상기 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유전자 내 보존된 서열을 불활성화하는 것이다. 이 때, 다양한 HBV 유전자형의 서열간에 변이가 잘 일어나지 않는 보존된 서열을 이용하기 때문에, 다양한 HBV 유전자형에 제한없이 본 출원의 방법을 적용하여 B형 간염 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
본 출원의 상기 방법은 B형 간염을 치료하는 효과를 가진다.
본 출원의 조성물을 투여가 필요한 대상에게 도입 또는 투여함으로써 실시할 수 있다.
상기 대상은 B형 간염 바이러스에 감염된 포유동물, 일 구체예에서 인간, 원숭이, 마우스, 래트 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
이 때, 상기 대상이 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 임의의 종에 감염되어 있는 경우에 실시할 수 있다. 흔치않으나, 이들 중 2 이상 종에 동시 감염되어 있는 경우도 포함할 수 있다.
즉, 본 출원은 다양한 유전자형의 B형 바이러스를 동시에 억제할 수 있는 효과를 가지기 때문에, 본 출원의 조성물 및 방법을 사용하면, 감염된 B형 바이러스의 구체적 종류와 무관하게 효과적으로 증식을 억제할 수 있고 B형 간염을 치료할 수 있다.
상기 투여는 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 망막하(subretinal), 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 안구내(intraocularly), 유리체내(intravitreally) 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막내(intraperitoneally) 등에서 선택될 수 있다.
투여시, 조성물의 1회 투여량(소정의 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량)은 투여 대상의 체중 kg 당 104-109 세포, 예컨대, 105 내지 106 세포/kg(체중) 정도로 상기 수치 범위들 내의 모든 정수값들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 투여 대상의 연령, 건강 및 체중, 동시에 받는 치료의 종류, 만약 있다면 치료의 빈도, 원하는 효과의 특성 등을 고려하여 적절히 처방될 수 있다.
[발명의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
본 출원의 다양한 HBV 유전자형을 표적하는 조성물을 만드는 설계도는 도 1에 도시되어 있다. 도 1에 HBV genotype B, C, D를 타겟할 수 있는 CRISPR gRNAs를 설계하는 모식도를 도시하였다.
도 1에 도시한 바와 같이, 한국환자유래 HBV genotype C, open database의 HBV genotype B, C, D, 및 HBV 세포모델의 genome 모두 다중(multi) 표적 할 수 있는 유전자가위를 디자인하였다.
이하에서, 도 1의 모식도를 자세하게 설명한다
실시예 1. HBV genotype B, C, D에 대한 genome query & alignment
HBV 유전자형 B형, C형, D형의 genome query를 위해 HBV genome data base (HBVdb, https://hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex)로부터 HBV B, C, D genotype에 대한 각각의 full sequence 1638개, 2136개, 923개를 수집하였다. 수집한 서열들을 sequence alignment를 통해 virtual HBV genome (이하 vHBV) sequence를 만들었다.
virtual HBV genome sequence B형, C형, D형은 수득한 HBV B형, C형, D형 full sequence 각각의 정렬된 서열들 중 80% sequence 상동성(homology) 있는 부위를 바탕으로 제작하였다(도 2 내지 도 4).
SEQ ID NO. 91은 도 2의 서열과 상응, SEQ ID NO. 92는 도 3의 서열과 상응, SEQ ID NO. 93은 도 4의 서열과 상응한다. SEQ ID NO. 91 내지 93의 서열에서 대문자로 표시된 부분은 본 출원에서 분석한 서열과 상동성이 80% 이상이고, 소문자로 표시된 부분은 상동성이 80% 이하이다.
virtual HBV B genotype sequences (도 2) SEQ ID NO. 91GGACTGTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCaTACTCACAACTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCtTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAA
virtual HBV C genotype sequences (도 3) SEQ ID NO. 92gGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACAACAGTGCCAGcAGCaCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAA
virtual HBV D genotype sequences (도 4) SEQ ID NO. 93ATAcTACAAACcTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCcTCtACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCgCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAA
실시예 2. gRNA 설계(guide RNA design)
실시예 1에서 수득한 HBV 유전자형 B형, C형, D형 각각의 Virtual universal HBV genome기반으로 CRISPR 타겟 gRNAs를 설계하였다.
SpCas9(from Streptococcus pyogenes(5'-NGG-3' for target, 5'-NRG-3' for off-target))과 CjCas9(from Campylobacter jejuni: 5'-NNNNRYAC-3')에 대한 gRNA design은 Cas-Designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)로 하였으며 off-target이 mismatch 1과 2를 가진 gRNA는 제외 하였다. vHBV B, C D genotype 보존된 gRNA는 도 5 내지 6과 같이 수득하였다.
설계 결과 virtual universal HBV genotype B에 대한 타겟 (SpCas9을 위한 gRNA 150, CjCas9을 위한 gRNA 80), HBV genotype C에 대한 타겟 (SpCas9을 위한 gRNA 168, CjCas9을 위한 gRNA 66) 그리고 HBV genotype D에 대한 타겟 (SpCas9을 위한 gRNA 158, CjCas9을 위한 gRNA 타겟 71)이 도출 되었다. 또한, virtual universal HBV genotype B, C, D를 동시에 타겟 할 수 있는 SpCas9을 위한 gRNA는 34개, CjCas9을 위한 gRNA는 11개를 수득하였다(도 5 내지 도 6).
상기 [표 2]의 SEQ ID NO. 46 내지 90의 gRNA들은 HBV genotype인 B, C 및 D 중 최소 1개라도 타겟 할 수 있는 gRNA들이며, 그 중, SEQ ID NO. 46 내지 79는 SpCas9의 gRNA이며, SEQ ID NO. 80 내지 90은 CjCas9의 gRNA이다.
실시예 3. HBV genotype B, C, D를 모두 타겟하는 gRNA 선정
도출된 Open database 기반의 보존된 영역을 표적하는 서열과 한국환자유래 HBV genotype C, 그리고 가용할 HBV 세포모델의 서열에서 공통적으로 보존된 영역을 표적 하는 gRNA는, 총 SpCas9의 gRNA는 10개, CjCas9의 gRNA는 4개가 디자인 되었다(도 7 내지 도 8).
환자유래 HBV C 타입인 4개의 바이러스와 일반적으로 HBV 실험에 사용하는 두 개의 세포라인(D 타입)을 모두 타겟 할 수 있는 SpCas9의 gRNA는 [표 2]의 SEQ ID NO. 51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 및 76이고, CjCas9의 gRNA는 [표 2]의 SEQ ID NO. 80, 85, 87 및 89이다.
실시예 4. HBV 타겟부위 스크리닝
실시예 3에서 수득한 Open database 기반의 보존된 서열, 한국환자유래 HBV genotpye C 및 HBV 세포모델의 서열에서 공통적으로 보존된 영역을 표적 하는 gRNA가 타겟하는 HBV 타겟 부위를 스크리닝 한 결과 도 9의 HBV P, X, PreS1, PreS2, C, S, PreC 중 1 이상을 타겟하는 것을 확인할 수 있었다.
각 gRNA가 타겟하는 HBV의 타겟 부위는 [표 4]에 정리하였다
NO. Name Note. cccDNA target region
SEQ ID NO. 51 Sp20-viHBV-B-#17G SpCas9 target P, PreS1, PreS2, S
SEQ ID NO. 52 Sp20-viHBV-B-#20G P, PreS1, PreS2, S
SEQ ID NO. 56 Sp20-viHBV-B-#89G P
SEQ ID NO. 57 Sp20-viHBV-B-#90G P
SEQ ID NO. 69 Sp20-viHBV-B-#154G X
SEQ ID NO. 70 Sp20-viHBV-B-#159G X
SEQ ID NO. 73 Sp20-viHBV-B-#193G P, SP, PreC, C
SEQ ID NO. 74 Sp20-viHBV-B-#194G P, SP, PreC, C
SEQ ID NO. 75 Sp20-viHBV-B-#196G P, SP, PreC, C
SEQ ID NO. 76 Sp20-viHBV-B-#197G P, SP, PreC, C
SEQ ID NO. 80 Cj22-viHBV-B-#06G CjCas9 target P, PreS1, PreS2, S
SEQ ID NO. 85 Cj22-viHBV-B-#45G P, X
SEQ ID NO. 87 Cj22-viHBV-B-#47G P, X
SEQ ID NO. 89 Cj22-viHBV-B-#57G PreC
실시예 5. 세포 배양 및 트랜스펙션(transfection)
i) 벡터
실시예 3에서 수득한 gRNA를 세포에 도입하기 위한 벡터 컨스트럭션(construction)을 준비하였다(도 27 내지 29).
각 gRNA는 gRNA의 sense와 antisense oligo를 각 200 pmol씩 T4 ligase buffer와 섞어 95 ℃에서 2분, 95-85 ℃에서 -2℃/s 5 cycles, 85-25 ℃에서 -1℃/s 60 cycles로 oligo annealing을 한 후 제한효소로 플라스미드의 U6 promoter뒤에 삽입하였다.
도 27은 SpgRNA 1개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계하였다.
도 28은 CjgRNA 1개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계하였다.
도 29는 SpgRNA 3개, Cas9 및 형광단백질을 한 플라스미드에서 발현할 수 있도록 설계하였다.
ii) 재료
HBV 게놈 1.2 카피가 코딩되어 있는 HBV 1.2 플라스미드(genotype D, Addgene #51294), pAAV HBV genotype A, B 및 C (kindly provided by Pei-Jer Chen, Taipei city, Taiwan), Cj CRISPR Cas9의 gRNA (Cj#06, Cj#45, Cj#47, Cj#57) plasmids (Toolgen), Sp CRISPR Cas9의 gRNA (Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp#197, N#17, N#90, N#193, N#197, N#17-90-193, N#17-90-197, N#17-193-197, N#90-193-197) plasmids (Toolgen)
인간 간암 세포주인 Huh7와 HepG2는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 수득하였다. 세포 배양 및 유지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Welgene, Gyeongsan-si, Korea)에 10% fetal bovine serum (Capricorn, Ebsdorfergrund, Germany) 와 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 사용하였다. 세포의 유지는, 37℃ 온도와 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 유지하였다.
Huh7 또는 HepG2 세포는 6웰 플레이트 각각의 웰에 4 x 10^5개의 세포를 씨딩하고, 1 μg 의 replicon과 1 μg 의 CRISPR Cas9(SpCas9 또는 CjCas9)과 gRNA를 발현하는 플라스미드를 Lipofectamin 2000을 이용하여 트랜스펙션 하였다. 24시간 후, 세포 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 이후 3일 뒤, ELISA를 위해 세포의 상층액을 수득하였다.
실시예 6. HBsAg 및 HBeAg 측정
실시예 5에서 수득한 세포의 상층액 내 HBsAg와 HBeAg의 양을 측정하기 위해, 상업적 ELISA 키트 HBeAg ELISA Kit (WB-2496, Wantai Pharm Inc., Beijing, China), HBsAg ELISA Kit (WB-2296, Wantai Pharm Inc., Beijing, China )를 사용하였고, 키트의 프로토콜에 따라 측정하였다. 세포의 상층액은 PBS로 HBeAg는 1/10, HBsAg는 1/25로 희석하여 사용하였다. HBeAg, HBsAg의 흡광도는 SPECTRA max PLUS 384 Microplate Reader와 SoftMax Pro 5.2 프로그램을 이용하여 Wavelength range 450nm에서 측정되었다.
결과 1) SpCas9의 gRNA 후보 및 CjCas9 타겟 gRNA 후보 스크리닝
실시예 3에서 수득한 SpCas9의 gRNA 후보 및 CjCas9의 gRNA 후보들 각각을 HBV D genotype HBV 1.2를 이용하여, HBeAg, HBsAg양을 측정하였다.
CjCas9의 gRNA 후보들인 Cj#06, Cj#45, Cj#47, Cj#57 각각의 HBeAg, HBsAg의 양을 측정한 결과, Cj#47가 HBeAg와 HBsAg의 양이 가장 적은 것을 알 수 있었다(도 10 내지 13, 도 18). 즉, Cj#47가 CjCas9 타겟 gRNA로 효과가 가장 좋을 것으로 예상할 수 있었다.
SpCas9의 gRNA 후보들인 Sp#17, Sp#20, Sp#89, Sp#90, Sp#154, Sp#159, Sp#193, Sp#194, Sp#196, Sp#197 각각의 HBeAg, HBsAg의 양을 측정한 결과, 대부분 HBeAg의 양은 적었으나, 상대적으로 HBsAg의 양이 높았다.
다양한 gRNA의 후보들의 HBeAg, HBsAg의 양을 측정하였을 때, 각 후보들 마다 HBeAg, HBsAg 각각에 대한 억제 정도가 상이함을 알 수 있었다(도 14 내지 17, 도 19).
즉, B형 간염 바이러스의 보존된 서열을 표적하는 gRNA일지라도, 이와 같이 HBeAg, HBsAg 각각에 대한 억제능이 상이할 수 있음을 확인할 수 있었다.
결과 2) SpCas9의 gRNA 후보들의 B형 간염 바이러스 세포 모델(HBV D형)에서의 HBeAg 및 HBsAg 억제능 확인
인간 간암 세포주인 Huh7(pAAV HBV D genotype 도입한 세포) 및 HepG2(pAAV HBV D genotype 도입한 세포) 각각에서 SpCas9의 gRNA 후보들 중 Sp#17(N#17로 명명), Sp#90(N#90으로 명명), Sp#193(N#193으로 명명), Sp#197(N#197로 명명), Sp#17+Sp#90+Sp#193 조합(N#17-90-193으로 명명), Sp#17+Sp#90+Sp#197 조합(N#17-90-197로 명명), Sp#17+Sp#193+Sp#197 조합(N#17-193-197로 명명)에 대한 HBeAg 및 HBsAg의 양을 측정하였다(도 20 내지 22).
Huh7 및 HepG2 세포주 모두에서 Sp#17, Sp#90, Sp#193, Sp#197 단독으로의 가이드핵산 보다 Sp#17+Sp#90+Sp#197 조합 또는 Sp#17+Sp#193+Sp#197 조합의 가이드핵산을 사용했을 때, HBeAg 및 HBsAg의 억제능이 뛰어남을 알 수 있었다.
결과 3) SpCas9의 gRNA 후보들의 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형 의 B형 간염 바이러스의 HBeAg 및 HBsAg 억제능 확인
인간 간암 세포주인 Huh7에 pAAV HBV genotype A, B, C, D 각각을 도입시킨 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형(각각 Genotype A, Genotype B, Genotype C, Genotype D로 명명) 각각의 세포주에서 SpCas9의 gRNA 후보들 Sp#193(N#193으로 명명), Sp#197(N#197로 명명), Sp#17+90+197(N#17+90+197로 명명), Sp#17+193+197(N#17+193+197로 명명)의 HBeAg 및 HBsAg의 양을 측정하였다.
SpCas9의 gRNA 후보들 각각 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형 각각의 세포주에서 HBeAg 및 HBsAg 의 억제능 상이함을 알 수 있다.
Genotype A, B, C, D의 모든 결과를 비교해보았을 때, N#193, N#197(single gRNA)는 HBeAg을 감소시키는 경향을 보이기는 했으나, HBsAg는 감소시키지 못하였으나, N#17-90-193, N#17-193-197는 HBeAg, HBsAg을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
즉, N#17-90-193, N#17-193-197이 Genotype A, B, C, D 모두의 HBV를 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
본 출원은 다양한 유전자형의 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.

Claims (17)

  1. B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 증식을 억제하는 방법으로서,
    상기 B형 간염 바이러스는 적어도 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형 중 선택되는 2이상의 HBV 유전자형이고,
    상기 방법은,
    a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
    b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을
    대상에 도입함;을 포함하고,
    이 때, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함하고,
    상기 도입으로 B형 간염 바이러스 유전자 내 핵산서열에 인델(indel)을 형성시키는 것
    을 특징으로 하는 방법.
  2. B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유전자 내 보존된 서열을 불활성화하는 방법으로서,
    상기 B형 간염 바이러스 유전자는 적어도 HBV A형, HBV B형, HBV C형, HBV D형, HBV E형, HBV F형 또는 HBV G형으로 구성된 HBV 유전자형 중 선택되는 1이상이고,
    상기 보존된 서열은 상기 HBV 유전자형의 서열간 보존되는 서열이고,
    이 때, 상기 보존된 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 45 중 선택되는 어느 하나 이상이고,
    상기 불활성화는 상기 보존된 서열을 절단(cleavage)하는 것이고,
    상기 방법은,
    a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
    b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;을
    대상에 도입함;을 포함하고,
    상기 가이드핵산은 상기 보존된 서열과 일부 또는 전체가 상보적인 서열 또는 상동성을 가진 서열이고,
    이 때, 상기 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함하는
    것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    상기 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    a) 의 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 및 76 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    a)의 가이드핵산은 SEQ ID NO. 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    상기 가이드핵산과 Cas단백질은 벡터의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 가이드핵산은
    SEQ ID NO.51, 57 및 73 이 함께 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4항에 있어서,
    상기 가이드핵산은
    SEQ ID NO.51, 73 및 76 이 함께 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    상기 B형 간염 바이러스의 항원인 HBeAg, HBsAg 중 선택되는 어느 하나 이상이 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 게놈 내 보존된 서열을 표적하는 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 조성물로서,
    상기 조성물은,
    a) 가이드핵산 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
    b) Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;
    을 포함하고,
    상기 가이드핵산은 SEQ ID NO. 51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나 이상을 각각 포함하고,
    상기 보존된 서열은 SEQ ID NO. 1 내지 45 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 조성물은 벡터 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11항에 있어서,
    a)의 가이드핵산은 SEQ ID NO.51, 52, 56, 57, 69, 70, 73, 74, 75 및 76 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 11항에 있어서,
    a)의 가이드핵산은 SEQ ID NO. 80, 85, 87 및 89 중 선택되는 어느 하나이고, b)의 Cas단백질은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 11항에 있어서,
    상기 조성물은 SEQ ID NO.51, 57 및 73을 포함하는 가이드 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 11항에 있어서,
    상기 조성물은 SEQ ID NO.51, 73 및 76을 포함하는 가이드 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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