WO2019143201A1 - 재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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WO2019143201A1
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최헌식
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이혜선
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김준성
홍지은
이은진
강혜수
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    • C12N2710/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus comprising a cancer therapeutic gene and a pharmaceutical composition containing the recombinant vaccinia virus.
  • Vaccinia virus is a coat DNA virus having double-stranded linear genomic DNA of about 200 kbp encoding about 200 independent genes.
  • Vaccinia virus was first developed as a preventive vaccine for smallpox in the eighteenth century by Edward Zener as a variety of preventive vaccines.
  • Early vaccinia virus vaccines used wild-type virus, and serious adverse events such as systemic or progressive infection were seen in the vaccine-treated patients.
  • modified vaccinia viruses such as MVA (modified vaccinia Ankara), LC16m8 (derived from the Lister strain) and NYVAC (derived from the Copenhagen vaccinia strain, New York Vaccinia virus) .
  • Vaccines against various diseases have been developed based on these vaccinia viruses and vaccinia virus strains such as Western Reserve (WR), NYVAC, Wyeth and Lister have been developed as tumor killing virus Is also being developed.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant Vaccinia virus as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a composition comprising the recombinant Vaccinia virus as an active ingredient.
  • the recombinant vaccinia virus containing the cancer therapeutic gene according to the present invention or inhibiting the expression of some genes including the cancer therapeutic gene has an excellent antitumor effect. Therefore, the recombinant Vaccinia virus of the present invention can be useful for treating cancer.
  • Figure 1 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W vaccinia virus (IHD-W-VV01) in which VGF, TK and K3L are deleted. Viral gene deletion, and therapeutic gene introduction are as shown in Table 1 below.
  • Figure 2 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W-VV02 in which VGF, TK and K3L are deleted and the sPD1-Fc gene is inserted.
  • Fig. 3 shows the result of the electrophoresis of the gDNA of IHD-W-VV02 to confirm that the sPD1-Fc gene was inserted.
  • FIG. 4 shows the expression of the sPD1-Fc gene by Western blotting the secreted protein from HeLa cells infected with IHD-W-VV02.
  • FIG. 5 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W-VV03 in which VGF, TK and K3L are deleted and the PH20 gene is inserted.
  • Fig. 6 is a graph showing that the gDNA of IHD-W-VV03 was electrophoresed and the PH20 gene was inserted therein.
  • FIG. 7 shows the expression of PH20 gene by Western blotting of the protein secreted from HeLa cells infected with IHD-W-VV03.
  • FIG. 8 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W-VV04 in which VGF, TK and K3L are deleted and IL-12 gene is inserted.
  • FIG. 9 shows that the gDNA of IHD-W-VV04 was electrophoresed and the IL-12 gene was inserted.
  • FIG. 10 shows the expression of IL-12 gene by Western blotting the secreted protein from HeLa cells infected with IHD-W-VV04.
  • FIG. 11 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W-VV05 in which VGF, TK and K3L are deleted and sPD1-Fc and PH20 genes are inserted.
  • Fig. 12 shows the results of electrophoresis of gDNA of IHD-W-VV05 to confirm that sPD1-Fc and PH20 genes were inserted.
  • FIG. 13 shows Western blotting of secreted proteins from HeLa cells infected with IHD-W-VV05 to confirm expression of sPD1-Fc and PH20 genes.
  • FIG. 14 is a schematic representation of the gene structure of IHD-W-VV06 in which VGF, TK and K3L are deleted and sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes are inserted.
  • Fig. 15 shows the results of electrophoresis of gDNA of IHD-W-VV06 to confirm that sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes were inserted.
  • FIG. 16 shows Western blotting of secreted proteins from HeLa cells infected with IHD-W-VV06 to confirm expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes.
  • FIG. 17 is a schematic representation of the gene structure of WR Vaccinia virus (WR-VV01) in which VGF, TK and K3L expression is inactivated.
  • VGF WR Vaccinia virus
  • TK TK
  • K3L expression is inactivated.
  • Table 2 The meanings of terms used for virus gene inactivation and therapeutic gene introduction are as shown in Table 2 below.
  • FIG. 18 is a schematic representation of the gene structure of WR-VV06 in which the expression of VGF, TK and K3L is inactivated and the sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes are inserted.
  • Fig. 19 shows that the gDNA of WR-VV06 was electrophoresed to insert the sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes.
  • FIG. 20A shows the expression of sPD1-Fc and PH20 genes by Western blotting the secreted proteins from HeLa cells infected with WR-VV06.
  • 20B shows ELISA of the protein secreted from HeLa cells infected with WR-VV06 to confirm expression of the IL-12 gene.
  • FIG. 21 is a schematic representation of the gene structure of Lister vaccinia virus (Lister-VV01) in which VGF, TK and K3L are deleted. Viral gene deletion, and therapeutic gene introduction are as shown in Table 3 below.
  • Figure 22 is a schematic representation of the gene structure of Lister-VV06 in which VGF, TK and K3L are deleted and sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes are inserted.
  • FIG. 23 is a graph showing the insertion of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes by electrophoresis of gDNA of Lister-VV06.
  • 24A shows Western blotting of secreted proteins from HeLa cells infected with Lister-VV06 to confirm expression of sPD1-Fc and PH20 genes.
  • 24B shows the expression of IL-12 gene by ELISA in the protein secreted from HeLa cells infected with Lister-VV06.
  • FIG. 25 shows the results of confirming the growth of cancer cells after intratumoral administration of IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 and IHD-W-VV05 in a colon cancer mouse model.
  • FIG. 26 shows the results of confirming the growth of cancer cells after administration of IHD-W-VV01 and HD-W-VV05 into a melanoma mouse model in a tumor.
  • FIG. 27 shows the results of confirming the growth of cancer cells after administration of IHD-W-VV01 and HD-W-VV05 in a tumor to a lung cancer mouse model.
  • FIG. 28 shows the results of cancer cell growth after intratumoral administration of IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 and IHD-W-VV06 in a colon cancer mouse model.
  • FIG. 29 shows the results of confirming the growth of cancer cells after intratumoral administration of IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 and IHD-W-VV06 in a lung cancer mouse model.
  • FIG. 30 shows the results of confirming the growth of cancer cells after intratumoral administration of IHD-W-VV05 and IHD-W-VV06 to a colon cancer mouse model.
  • 31 shows the results of confirming the growth of cancer cells after administration of IHD-W-VV05 and IHD-W-VV06 in a melanoma mouse model in a tumor.
  • FIG. 32 shows the results of confirming the growth of cancer cells after intra-tumor administration of IHD-W-VV05 and IHD-W-VV06 in a lung cancer mouse model.
  • FIG. 33 shows the results of confirming the growth of cancer cells after administration of IHD-W-VV01 and IHD-W-VV06 into a melanoma mouse model in a tumor.
  • FIG. 34 shows the results of confirming the growth of cancer cells after intratumoral administration of IHD-W-VV01 and IHD-W-VV06 to a lung cancer mouse model.
  • FIG. 35 shows the results of confirming the growth of cancer cells after administration of WR-VV01 and WR-VV06 into a lung cancer mouse model.
  • FIG. 36 shows the result of confirming the growth of cancer cells after administration of Lister-VV01 and Lister-VV06 in a tumor to a lung cancer mouse model.
  • FIG. 37 shows the results of confirming in vitro cell killing ability of IHD-W-VV06, WR-VV06 and Lister-VV06.
  • the recombinant Vaccinia virus may further comprise a gene encoding IL-12.
  • sPD-1 used in the present invention refers to the extracellular domain of PD-1 (programmed death-1), a 55-kDa type I epidermal protein well known as an auxiliary inhibitor of T cells belonging to the immunoglobulin molecule group Means a fragment thereof.
  • the sPD-1 may be used to include a fragment of sPD-1 or an sPD-1 fusion protein in which an sPD-1 total length and an immunoglobulin Fc region are fused.
  • the fusion protein may be sPD-1-Fc in which sPD-1 is bound to an immunoglobulin Fc region. At this time, sPD-1 and Fc can be bound directly or through a linker.
  • the linker may be a peptide consisting of 1 to 50, 2 to 45, 3 to 40, 5 to 30, and 7 to 25 amino acids. Specifically, the linker may be a peptide consisting of 3 to 40 amino acids have.
  • the linker GGGGS (SEQ ID NO: 123), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 124), SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS (SEQ ID NO: 125), GGSGGSGGSGGSGGSEQEER (SEQ ID NO: 126), GGGGSGGGGSGGS (SEQ ID NO: 127), SGGGGSGGGGSGGGGSGTHTCPPCP (SEQ ID NO: 128), GGSGGGGS (SEQ ID NO: 129 ) And GGGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 130), but is not limited thereto.
  • the sPD-1 may be a part of the sequence of GenBank NM_008798.2, and is not limited to any one sequence. Specifically, the sPD-1 may be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or SEQ ID NO: 133. In addition, sPD-1 is about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96%, 97%, 98% or 99%, and most preferably about 99% or more homology.
  • sPD-1 gene used in the present invention refers to a gene encoding a sPD-1 protein or a sPD-1 fusion protein in which a sPD-1 protein and a target protein are fused with another protein do.
  • the sPD-1 gene may encode an sPD-1 fusion protein (sPD1-Fc) comprising an Fc region.
  • the sPD-1 gene may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 132 or 134.
  • the sPD-1 gene has about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 134 without altering the function of sPD- , 96%, 97%, 98% or 99%, and most preferably about 99% or more homology.
  • hyaluronidase used in the present invention means an enzyme that degrades hyaluronic acid.
  • the hyaluronidase may be of a positive, negative, mouse or human origin.
  • the hyaluronidase may be human hyaluronidase (PH20) or recombinant human hyaluronidase (rHuPH20).
  • the hyaluronidase may be a sequence of GenBank: NM003117.4, but is not limited thereto.
  • the hyaluronidase may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135. More specifically, the hyaluronidase gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 136.
  • the hyaluronidase gene has about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 136, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, and most preferably about 99% or more homology.
  • IL-12 used in the present invention is a molecule belonging to a cytokine, which is related to the immune system.
  • the IL-12 may be the same as that obtainable from any animal such as human (hIL-12), mouse (mIL-12), horse, cow, pig and the like.
  • the IL-12 may be the sequence disclosed in GenBank's NM_000882.3 (hIL-12A), AY008847.1 (hIL-12B), NM_001159424.2 (mIL-12 ⁇ ), or NM_001303244.1 It is not limited.
  • the IL-12 may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137.
  • the IL-12 gene may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 138, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 139 (p35 subunit), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 140 (p40 subunit) .
  • the IL-12 gene may have about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 138 to SEQ ID NO: 140, , About 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, and most preferably about 99% or more homology.
  • the recombinant Vaccinia virus may be Vaccinia virus comprising the sPD-1 gene, Vaccinia virus containing the hyaluronidase gene, or Vaccinia virus including the IL-12 gene.
  • the sPD-1 gene, hyaluronidase gene, and / or IL-12 gene can be inserted into the vaccinia virus genome.
  • the genes may be inserted at different positions of the vaccinia virus genome, but may be inserted at the same or similar positions. For example, it may be inserted at the TK, K3L or VGF position of the vaccinia virus.
  • the recombinant vaccinia virus is capable of expressing sPD-1, hyaluronidase and / or IL-12 in a host cell.
  • the recombinant vaccinia virus may include at least two genes selected from the sPD-1 gene, the hyaluronidase gene, and the IL-12 gene.
  • vaccinia virus with inserted sPD-1 gene and hyaluronidase gene vaccinia virus or hyaluronidase gene with sPD-1 gene and IL-12 gene inserted, and IL-12 gene inserted Lt; / RTI > virus.
  • the recombinant vaccinia virus may comprise the sPD-1 gene, the hyaluronidase gene and the IL-12 gene. That is, it may be a vaccinia virus capable of expressing sPD-1 gene, hyaluronidase gene and IL-12 gene.
  • the above described vaccinia virus can be inhibited in expression of any one selected from the group consisting of a gene encoding K3L, a gene encoding TK (thymidine kinase), a gene encoding VGF (vaccinia growth factor), and combinations thereof .
  • the combination may mean two or more of genes encoding K3L, genes encoding TK, and genes encoding VGF.
  • the recombinant vaccinia virus may be selected from the group consisting of vaccinia virus having sPD-1 gene, vaccinia virus having hyaluronidase gene, vaccinia virus having sPD-1 gene and hyaluronidase gene, sPD-1 A vaccinia virus having a gene and an IL-12 gene, a vaccinia virus having a hyaluronidase gene and an IL-12 gene, or a vaccinia virus having an sPD-1 gene, a hyaluronidase gene and an IL-12 gene , The K3L gene, the TK gene, and the VGF gene, or a combination thereof.
  • VGF vaccinia growth factor.
  • the Vaccinia growth factor is an enzyme exhibiting similar activity to the epithelial growth factor.
  • Vaccinia growth factors encoded by the VGF gene exhibit growth factor activity when infected with the virus and can be synthesized at the initial stage of infection by the virus.
  • the VGF may be, but is not limited to, a sequence of GenBank: AAO89288.1, ABD52455.1 or AIX98927.1. Specifically, the VGF may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141.
  • the VGF gene may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 142.
  • said VGF comprises an amino acid sequence that is at least about 70% or 75%, preferably at least about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% It can be more than 89%. Also, the VGF gene has about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more, preferably about 95%, 96%, 97%, 98% And most preferably, about 99% or more homology.
  • TK as used in the present invention means thymidine kinase.
  • the thymidine kinase is an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides.
  • the thymidine carnase encoded by the TK gene can bind nucleotides constituting the viral DNA by binding phosphorylated ATP gamma ( ⁇ ) to thymidine.
  • the TK may be, but is not limited to, a sequence of GenBank: AAO89373.1, ABD52560.1 or AIX99011.1. Specifically, the TK may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143.
  • the TK gene may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 144.
  • the TK comprises an amino acid sequence that is at least about 70% or 75%, preferably at least about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% It can be more than 89%.
  • the TK gene has about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more, preferably about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: %, And most preferably, at least about 99% homology.
  • K3L used in the present invention means K3L protein.
  • the K3L protein encoded by the K3L gene is a protein having homology with eIF-2 ⁇ (translation initiation factor-2 ⁇ ), and can inhibit the action of PKR (protein kinase R), an interferon activator.
  • the K3L may be, but is not limited to, the sequence of GenBank: AAO89313.1, ABD52483.1 or AGB75754.1. Specifically, the K3L may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 145.
  • the K3L gene may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 146.
  • the K3L is at least about 70% or 75%, preferably at least about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% It can be more than 89%. Also, the K3L gene has about 90%, 91%, 92%, 93%, or 94% or more, preferably about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: %, And most preferably, at least about 99% homology.
  • Inhibition of the expression of a gene according to the present invention means that a gene is not expressed or only a part of the gene is expressed by the deletion of part or all of the gene or insertion of a foreign gene into the gene, do.
  • the method of deleting the gene or inserting the foreign gene can be carried out by a method well known in the art. For example, methods described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian WJ Mahy and Hillar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors.
  • a foreign gene was inserted using pGEM-T Easy (Promega, Cat No. A1360) or pGEM-T (Promega, Cat No. A3600) plasmid system.
  • the vaccinia virus may be selected from the group consisting of Western Reserve (WR), New York Vaccinia Virus (NYVAC), Wyeth (NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tian Tan, USSR, TashKent, Evans, IHD-J, International Health Division-White, variants thereof, and combinations thereof. But is not limited thereto.
  • the vaccinia virus may be WR, Lister or IHD-W vaccinia virus, and may have the sequence of GenBank: AY243312.1, DQ121394.1 or AIX98951.1.
  • the vaccinia virus may be IHD-W.
  • V "or” virus V "used in the present invention means a recombinant vaccinia virus in which VGF is deleted as a vaccinia growth factor gene, and the virus does not express the VGF gene because the VGF gene is deleted.
  • T "or” virus T used in the present invention means a recombinant vaccinia virus in which a thymidine kinase (TK) gene has been deleted, and the virus does not express the TK gene due to deletion of the TK gene .
  • TK thymidine kinase
  • K "or” virus K "used in the present invention means a recombinant vaccinia virus in which the K3L gene is deleted, and the virus does not express the K3L gene because the K3L gene is deleted.
  • VT or virus VT “as used in the present invention means a recombinant vaccinia virus in which the VGF and TK genes have been deleted. Methods for inactivating the expression of the vaccinia growth factor and thymidine kinase are as described above.
  • IHD-W-VV01 as used in the present invention means a recombinant IHD-W vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted. Methods for inactivating the expression of the vaccinia growth factor, thymidine kinase and K3L protein are as described above.
  • IHD-W-VV02 as used in one embodiment of the present invention means recombinant IHD-W vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted and expression of sPD1-Fc gene is induced.
  • IHD-W-VV03 used in an embodiment of the present invention means a recombinant IHD-W vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted and expression of PH20 gene is induced.
  • IHD-W-VV04 as used in one embodiment of the present invention means a recombinant IHD-W vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted and IL-12 gene expression is induced.
  • IHD-W-VV05 used in an embodiment of the present invention means recombinant IHD-W vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted and expression of sPD1-Fc and PH20 genes is induced do.
  • IHD-W-VV06 used in one embodiment of the present invention is a recombinant IHD-W vaccine strain in which VGF, TK and K3L genes are deleted and expression of sPD1-Fc, PH20 and IL- Nia virus.
  • examples of the recombinant vaccinia virus according to the present invention include the following.
  • the mutant of WR vaccinia virus may be one in which expression of at least one of VGF, TK and K3L of WR vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced.
  • the mutant of NYVAC Vaccinia virus may be one in which gene expression of one or more of VGF, TK and K3L of NYVAC vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • the mutant of Wyeth Vaccinia virus may be one in which gene expression of one or more of VGF, TK and K3L of Wyeth Vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • mutants of Lister vaccinia virus may be one in which the expression of one or more of VGF, TK and K3L of Lister vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • the mutant of Tian tan vaccinia virus is one in which the expression of one or more of VGF, TK and K3L of Tian Tan vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • the mutant of USSR Vaccinia virus may be one in which the expression of at least one of VGF, TK and K3L of USSR vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • the mutant of TashKent vaccinia virus may be one in which the expression of at least one of VGF, TK and K3L of TashKent vaccinia virus is inhibited and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • mutants of IHD-J vaccinia virus inhibited the expression of at least one of VGF, TK and K3L of IHD-J vaccinia virus, and expressed at least one of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 .
  • mutants of the IHD-W vaccinia virus inhibit the expression of at least one of VGF, TK and K3L of IHD-W vaccinia virus, and at least one gene expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 is induced .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising recombinant Vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient.
  • the recombinant Vaccinia virus may be one in which the expression of sPD1-Fc, PH20, IL-12 gene, or a combination thereof is induced and the expression of VGF, TK, K3L gene or a combination thereof is inhibited.
  • the sPD1-Fc, PH20, IL-12, VGF, TK and K3L genes are as described above.
  • the term "cancer” may be solid cancer or blood cancer.
  • the solid tumors may be selected from the group consisting of lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, fibrosarcoma, esophageal cancer, skin cancer, thymic cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, Cancer, pancreatic cancer, and combinations thereof.
  • the cancer may be lung cancer, liver cancer, prostate cancer, head and neck cancer, fibrosarcoma, brain cancer, breast cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, skin cancer or colon cancer.
  • the blood can be selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia, multiple myeloma, and combinations thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of excipients, lubricants, wetting agents, sweetening agents, fragrances and preservatives.
  • composition of the present invention can be formulated according to a conventional method. And may be formulated employing methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient, especially after administration to a mammal. According to the formulation, the composition of the present invention can be administered to an individual as appropriate. Such administration may be parenteral administration, and examples thereof may include intratumoral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, epidural and oral routes and the like. The form of the preparation for parenteral administration may be injectable.
  • the present invention provides a method of preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a composition comprising the recombinant Vaccinia virus according to the present invention as an active ingredient.
  • the arm is as described above.
  • the subject may be a mammal, but the mammal may be a primate (e.g., human), a cow, a sheep, a goat, a horse, a pig, a dog, a cat, a rabbit, a rat, a mouse, . Specifically, it may be human.
  • the composition of the present invention can be suitably administered by a person skilled in the art according to the age, sex, weight, degree of pathology and administration route of the patient. The administration may be once a day or several times a day, and may be repeatedly administered at appropriate intervals.
  • the preferred dosage of the composition comprising the recombinant Vaccinia virus of the present invention varies depending on the condition and the weight of the individual, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the patient may be administered with 1 x 10 5 to 1 x 10 18 virus particles, infectious virus units (TCID 50 ) or plaque forming units (pfu), preferably 1 x 10 5 , 2 x 10 5 , 5x10 5, 1x10 6, 2x10 6, 5x10 6, 1x10 7, 2x10 7, 5x10 7, 1x10 8, 2x10 8, 5x10 8, 1x10 9, 2x10 9, 1x10 10, 5x10 10, 1x10 11, 5x10 11 , 1 ⁇ 10 12 , 1 ⁇ 10 13 , 1 ⁇ 10 14 , 1 ⁇ 10 15 , 1 ⁇ 10 16 , 1 ⁇ 10 17 or more viral particles, infectious viral units or plaque forming units can do.
  • TID 50 infectious virus units
  • plaque forming units preferably 1 x 10 5 , 2 x 10 5 , 5x10 5, 1x10 6, 2x10 6, 5x10 6, 1x10 7, 2x10 7, 5x10 7, 1x10 8, 2x10 8, 5x10 8, 1x10 9, 2x10
  • virus dose can be adjusted to any value and range between 0.1 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml or more, .
  • the present inventors have produced recombinant vaccinia virus plasmids in which deletion or inactivation of TK, VGF and K3L genes are inactivated. Using these plasmids, recombinant vaccinia viruses in which the expression of the genes are inhibited are prepared and their characteristics as anticancer substances Respectively.
  • the recombinant vaccinia virus plasmid in which the sPD1-Fc, PH20, IL-12 gene was inserted into the recombinant Vaccinia virus plasmid was prepared. Using these plasmids, recombinant vaccinia virus Were prepared and compared with their anticancer properties.
  • Example 1.1 IHD-W-VV01 virus production
  • Example 1.1.1 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking VGF gene
  • genomic DNA of IHD-W vaccinia virus was amplified by PCR using genes located on both sides of the VGF gene. Primer information used for amplification of homologous nucleotide sequences on both sides of the VGF gene is shown in Table 4 below.
  • IHD-W or pGEM-T (IHD-W) fragments were obtained by ligating with the pGEM-T Easy plasmid after obtaining the VGF-L Easy-VGF-R (IHD-W) was prepared.
  • VGF-L forward (IHD-W) CGAAAGCTTGTAAGATGTTTAGAAAATGGATATTTC SEQ ID NO: 1
  • VGF-L reverse direction (IHD-W) CTGGGATCCTAGGCTAGCGTGTAAATAATATAAAAATAACAATACAATATTG SEQ ID NO: 2
  • VGF-R forward (IHD-W) CTGGAATTCGATTTAATTAATTTTTATAAATTTTTTTTATGAGTATTTTTACAAAAAAA
  • VGF-R reverse direction (IHD-W) TAGGGATCCCATCGATAGTACAATAACTTTTATGAAAT SEQ ID NO: 4
  • the pGEM-T Easy-VGF-R (IHD-W) and pSP72 were treated with EcoRI and BglII, respectively, followed by ligation to prepare pSP72-VGF-R (IHD-W).
  • the resulting pSP72-VGF-R (IHD-W) and pGEM-T Easy-VGF-L (IHD-W) were treated with HindIII and BamHI, ).
  • IHD-W VGF-L-p11-LacZ-VGF-R
  • Example 1.1.2 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking TK gene
  • IHD-W IHD-W
  • TK-R IHD-W
  • TK-R fragments as a result of performing PCR to obtain genes located on both sides of the TK gene in the genomic DNA of IHD-W vaccinia virus ≪ / RTI >
  • the primers used at this time are shown in Table 5 below.
  • the obtained TK-R (IHD-W) fragment and pSP72 plasmid were treated with EcoRI and BglII, respectively, and ligated to prepare pSP72-TK-R (IHD-W).
  • the pSP72-TK-L-TK-R (IHD-W) was prepared by treating the pSP72-TK-R (IHD-W) and TK-L (IHD-W) fragments with PstI and BamHI, Respectively.
  • L-p7.5-Gpt-TK-R (IHD-W) (hereinafter referred to as "IHD-W") was treated with EcoRI and NotI and ligated with 5-TK- IHD-W TK shuttle plasmid ").
  • Example 1.1.3 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking K3L gene
  • genes located on both sides of the K3L gene in the genomic DNA of IHD-W vaccinia virus were PCR amplified and inserted into pGEM-T Easy, respectively, to construct pGEM-T Easy-K3L-L (IHD- T Easy-K3L-R (IHD-W).
  • the primers used are shown in Table 6 below.
  • the p7.5-DsRed gene cassette was amplified by PCR using the WR K3L (i) shuttle plasmid prepared in Example 2.1.3 below, and then ligated into pGEM-T Easy To construct pGEM-T Easy-p7.5-DsRed.
  • the primer sequences used for the amplification of the p7.5 promoter and the DsRed gene are shown in Table 6 below.
  • the prepared pGEM-T Easy-p7.5-DsRed and pSP72 plasmids were treated with HindIII and EcoRV, respectively, followed by ligation to complete pSP72-p7.5-DsRed.
  • the prepared pSP72-p7.5-DsRed and pGEM-T Easy-K3L-R (IHD-W) prepared above were treated with EcoRV and BamHI and ligated to obtain pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R IHD-W).
  • IHD-W K3L shuttle plasmid the prepared pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R (IHD-W) and pGEM-T Easy-K3L-L (IHD-W) were treated with SalI and HindIII, -L-p7.5-DsRed-K3L-R (IHD-W) (hereinafter referred to as "IHD-W K3L shuttle plasmid").
  • Example 1.1.4 Production of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking VGF gene
  • IHD-W VGF shuttle plasmid prepared in Example 1.1.1.
  • Recombinant IHD-W vaccinia virus was produced by deletion of the VGF gene in the following manner.
  • HeLa cells were prepared in a 6-well plate in MEM medium containing 3 ⁇ 10 5 cells / well and 2% fetal bovine serum. Then, 2 ⁇ g of the IHD-W K3L shuttle plasmid was subjected to jetPRIME , And co-treated with 0.05 MOI of IHD-W wild-type vaccinia virus. After 4 hours of incubation, the cells were replaced with MEM medium containing 5% fetal bovine serum and then further cultured for 48 hours. Finally, the infected cells were collected with 500 ⁇ l of the medium, and then the cells were lysed by repeating freezing and thawing three times, and the crude virus was obtained. The plaque isolation was repeated using the above-mentioned crude virus in a conventional manner to obtain a purely isolated recombinant IHD-W vaccinia virus V.
  • Example 1.1.5 Production of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking VGF and TK genes
  • Example 1.1.4 The same procedure as in Example 1.1.4 was carried out except that the IHD-W TK shuttle plasmid prepared in Example 1.1.2 and the recombinant IHD-W Vaccinia virus V prepared in Example 1.1.4 were used. Recombinant IHD-W vaccinia virus VT in which VGF and TK genes were deleted was obtained under the conditions and methods.
  • Example 1.1.3 Except for using the IHD-W K3L shuttle plasmid prepared in Example 1.1.3 and the recombinant IHD-W vaccinia virus VT prepared in Example 1.1.5., The same as in Example 1.1.4. Recombinant IHD-W-VV01 lacking the VGF, TK and K3L genes was obtained under the conditions and methods, and the gene structure was visualized in Fig.
  • Example 1.2 IHD-W-VV02 virus production
  • Example 1.2.1 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus with deletion of TK gene and induction of expression of sPD1-Fc gene
  • the sPD1-Fc gene was amplified by PCR using the pE3.1 (EF1a.sPD-1.Fc) plasmid (provided by the National Cancer Center Research Institute for Urinary Tract Cancer) as a template to construct a gene expression cassette inside the TK shuttle plasmid, T easy to prepare pGEM-T easy-sPD1-Fc.
  • the p7.5 promoter was amplified by PCR using pGL4.1 p7.5 luciferase plasmid as template and inserted into pGEM-T easy to construct pGEM-T easy-p7.5.
  • the prepared pGEM-T easy-p7.5 and pGEM-T easy-sPD1-Fc plasmids were treated with PacI and NheI, respectively, followed by ligation to complete pGEM-T easy-p7.5-sPD1-Fc.
  • the primer sequences used for the amplification of the p7.5 promoter and the sPD1-Fc gene are shown in Table 7 below.
  • Example 1.2.2 Production of recombinant IHD-W vaccinia virus lacking VGF and K3L genes
  • Example 1.1.3 W K3L shuttle plasmid prepared in Example 1.1.3 and the recombinant IHD-W vaccinia virus V prepared in Example 1.1.4 were used in the same manner as in Example 1.1.4.
  • the recombinant IHD-W vaccinia virus VK prepared in Example 1.2.2 was used in place of the IHD-W TK (sPD1-Fc) shuttle plasmid prepared in Example 1.2.1,
  • the recombinant IHD-W-VV02 in which the VGF, TK and K3L genes were deleted and the expression of the sPD1-Fc gene was induced was obtained under the same conditions as in Example 4, and the gene structure was shown in Fig.
  • Example 1.2.4 Insertion and expression confirmation of sPD1-Fc gene in IHD-W-VV02
  • the gDNA of the recombinant IHD-W-VV02 prepared in Example 1.2.3 was obtained using a Nucleospin prep kit (Cat # 740956250), and the structure of the recombinant virus gDNA was confirmed using the primers shown in Table 8 below. As shown in FIG. 3, the DNA structure of the VGF, TK, and K3L positions showed that the PCR fragment size at the gene insertion site was changed relative to the control group.
  • Example 1.3 IHD-W-VV03 virus production
  • Example 1.3.1 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus with deletion of TK gene and induction of PH20 gene expression
  • the pHYb promoter DNA was synthesized from the pGL4.1-pHyb plasmid using the primers shown in Table 9, and inserted into pGEM-T easy vector by infusion cloning method to prepare pGEM-T easy-pHyb.
  • Exon2, Exon3 and Exon4 were synthesized by PCR from gDNA of A549 cells in order to insert PH20 gene into pGEM-T Easy-pHyb. The primers used at this time are shown in Table 9 below.
  • the pGEM-T easy-pHyb plasmid was treated with SpeI to insert PH20-Exon2.
  • the pGEM-T easy-pHyb-PH20-Exon2 plasmid was constructed by synthesizing PH20-Exon2 through PCR and then inserted into the linearized pGEM-T easy-pHyb by infusion cloning method.
  • the resulting pGEM-T Easy-pHyb-PH20-Exon2 plasmid was digested with SacI and PCR was performed to synthesize PH20-Exon3 and PH20-Exon4, followed by infusion cloning to obtain pGEM-T easy-pHyb- Respectively.
  • IHD-W TK (PH20) shuttle plasmid The IHD-W TK shuttle plasmid prepared in Example 1.1.2. was treated with EcoRI and SalI, and then the pHyb-PH20 gene cassette was inserted by infusion cloning to obtain pSP72-TK-L-TF-pSE / L-EGFP (Hereinafter referred to as " IHD-W TK (PH20) shuttle plasmid ") was finally prepared.
  • the primer sequences used in the infusion cloning procedure are shown in Table 9 below.
  • Example 1.1.4 except that the IHD-W TK (PH20) shuttle plasmid prepared in Example 1.3.1 and the recombinant IHD-W vaccinia virus VK prepared in Example 1.2.2 were used.
  • the recombinant IHD-W-VV03 in which the VGF, TK and K3L genes were deleted and the expression of the PH20 gene was induced was obtained under the same conditions as in Example 1, and the gene structure was shown in Fig.
  • the gDNA of the recombinant IHD-W-VV03 prepared in Example 1.3.2 was obtained using the Nucleospin prep kit (Cat # 740956250), and the structure of the recombinant virus gDNA was confirmed using the primer shown in Table 10 below. As shown in FIG. 6, the DNA structure of the VGF, TK, and K3L positions showed that the PCR fragment size at the gene insertion site was changed compared to the control group.
  • Example 1.4 IHD-W-VV04 virus production
  • Example 1.4.1 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus with deletion of K3L gene and induction of IL-12 gene expression
  • the pGL4.1-pI1L-B19R plasmid was amplified with a primer of the following Table 11 as a DNA template, and pI1L-B19R promoter DNA was synthesized and inserted by infusion cloning method to prepare pGEM-T Easy-pI1L-B19R plasmid.
  • IL-12 p40 and p35 subunit genes were amplified with the primers of Table 11 below using the pVAX1-IL-12 plasmid as a DNA template to insert a single peptide IL-12 gene into the plasmid.
  • the pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12 plasmid was constructed by inserting the amplified IL-12 gene into the plasmid pGEM-T Easy-pI1L-B19R linearized with XhoI by infusion cloning.
  • the pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12 plasmid prepared above and the IHD-W K3L shuttle plasmid prepared in Example 1.1.3 were treated with NotI and ligated to obtain pSP72-K3L-L-p7 .
  • the plasmid of the present invention was constructed by using the plasmid pSR-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R.
  • PCR was carried out from DH1 gDNA using the primers shown in Table 11 below, and the obtained gusA-labeled gene was inserted into pGEM-T easy to prepare pGEM-T easy-gusA.
  • the plasmid was used as a template to obtain a gusA fragment using the primers shown in Table 11, and the pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R plasmid IL-12-TF-TF-K3L-R (hereinafter referred to as "IHD-W K3L (IL -12) shuttle plasmid ").
  • the primer sequences used in the above procedure are shown in Table 11 below.
  • the recombinant IHD-W vaccinia virus VT prepared in Example 1.1.5 was used in place of the IHD-W K3L (IL-12) shuttle plasmid prepared in Example 1.4.1.
  • the recombinant IHD-W-VV04 in which the VGF, TK and K3L genes were deleted and the IL-12 gene expression was induced was obtained under the same conditions and methods as in Example 4, and the gene structure is shown in FIG.
  • the gDNA of the recombinant IHD-W-VV04 prepared in Example 1.4.2 was obtained using a Maxwell purification kit (Cat # AS1330), and the structure of the recombinant virus gDNA was confirmed using the primers shown in Table 12 below. As shown in FIG. 9, the DNA structure of the VGF, TK, and K3L positions showed that the PCR fragment size of the gene insertion site was changed relative to the control group.
  • Example 1.5.1 Plasmid preparation of recombinant IHD-W vaccinia virus with deletion of TK gene and induction of expression of sPD1-Fc and PH20 gene
  • the IHD-W TK shuttle plasmid and the pGEM-T Easy-p7.5-sPD1-Fc plasmid prepared in Example 1.1.2 were treated with NheI and SalI and ligated to obtain pSP72-TK-L-TF- sPD1-Fc-p7.5-TK-R (IHD-W) plasmid.
  • the plasmid and pGEM-T Easy-pHyb-PH20 plasmid were treated with SalI and BamHI and ligated to obtain pSP72-TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK- IHD-W).
  • the pSE / L-EGFP gene was synthesized by PCR using the IHD-W TK shuttle plasmid as a template.
  • the primers used at this time are shown in Table 13 below.
  • the resulting pSE / L-EGFP gene was amplified by Infusion (Invitrogen), and the pSP72 TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R (IHD-W) shuttle plasmid was treated with PacI. (IHD-W) (hereinafter referred to as "IHD-PF7-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK- -W TK (sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid ").
  • IHD-W TK sPD1-Fc + PH20 shuttle plasmid prepared in Example 1.5.1 and the recombinant IHD-W Vaccinia virus VK prepared in Example 1.2.2 were used.
  • the recombinant IHD-W-VV05 in which the VGF, TK and K3L genes were deleted and the expression of sPD1-Fc and PH20 genes were induced was obtained under the same conditions and with the same conditions as in Example 1.1.4, and the gene structure is shown in Fig.
  • the gDNA of the recombinant IHD-W-VV05 prepared in Example 1.5.2 was obtained using a Nucleospin prep kit (Cat # 740956250), and the structure of the recombinant virus gDNA was confirmed using the primers shown in Table 14 below. As shown in FIG. 12, the DNA structure of the VGF, TK, and K3L positions showed that the PCR fragment size at the gene insertion site was changed relative to the control group.
  • the primary antibody of the sPD1-Fc gene used was anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299), the secondary antibody was anti-Goat and the primary antibody of PH20 gene was anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909), the secondary antibody is anti-Rabbit, and the expression results are shown in Fig.
  • Example 1.6.1 Production of recombinant IHD-W vaccinia virus with deletion of VGF, TK and K3L genes and induction of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 gene expression
  • the recombinant IHD-W-VV06 in which the VGF, TK and K3L genes were deleted and the expression of the sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes was induced was obtained under the same conditions and methods as described above, and the gene structure is shown in Fig.
  • Example 1.6.2 Insertion and expression confirmation of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 gene in IHD-W-VV06
  • the gDNA of the recombinant IHD-W-VV06 prepared in Example 1.6.1 was obtained using a Maxwell purification kit (Cat # AS1330), and the structure of the recombinant virus gDNA was confirmed using the primers shown in Table 15 below. As shown in FIG. 15, the DNA structure of each VGF, TK, and K3L positions showed that the PCR fragment size at the gene insertion site was changed compared to the control group.
  • the primary antibody of the sPD1-Fc gene used was anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299), the secondary antibody was anti-Goat and the primary antibody of PH20 gene was anti-hPH20 (LsBio, Cat # IL-23 p40 (R & D systems, Cat # MAB4991), secondary antibody is anti-Rat, and the expression of the IL-12 gene Is shown in Fig.
  • Example 2.1.1 Plasmid preparation of recombinant WR vaccinia virus with inactivated VGF gene expression
  • LacZ whose expression is regulated by the p11 promoter, was used as a marker for screening for recombinant viruses at the VGF gene site.
  • the p11 promoter region in the WR gDNA was amplified by PCR and the LacZ gene in pAAV-LacZ (Stratagene, Cat No. 240071-52) was amplified by PCR and inserted into pGEM-T Easy and pGEM-T, p11 and pGEM-T-LacZ, respectively.
  • the primer information used for the amplification of the p11 promoter and LacZ is shown in Table 19.
  • PvuII and PstI were treated with pGEM-T Easy-VGF-L (WR) to construct a shuttle plasmid in which the function of the VGF gene was partially deleted, and a vector obtained by treating PvuII and PstI with pSP72 (Promega, Cat No. P2191) To prepare pSP72-VGF-L (WR). Further, pGFP-VGF-L-VGF-R (WR) was treated with EcoRV and BamHI and ligated with a vector obtained by treating pSP72-VGF-L (WR) prepared above with EcoRV and BamHI, -R (WR).
  • pGEM-T Easy-p11 was treated with SalI and NheI and ligated with a vector treated with SalI and NheI to pSP72-VGF-L-VGF-R (WR) -p11-VGF-R (WR).
  • the prepared pSP72-VGF-L-p11-VGF-R (WR) was treated with EcoRI and PacI, and the pGEM-T-LacZ prepared above was cut with EcoRI and PacI and ligated to obtain the VGF shuttle plasmid pSP72-VGF-L p11-LacZ-VGF-R (WR) (hereinafter referred to as "WR VGF (i) shuttle plasmid").
  • Example 2.1.2 Plasmid preparation of recombinant WR vaccinia virus with inactivated TK gene expression
  • the gDNA of WR was amplified by PCR, and the base sequence fragments identical to the left and right of the TK gene were amplified by pGEM-T Easy T Easy-TK-L (WR) and pGEM-T Easy-TK-R (WR).
  • the primer information used for the amplification of the nucleotide sequence homologous to both of the TK genes is shown in Table 17 below.
  • EGFP whose expression is regulated by the pSE / L promoter
  • Gpt whose expression is regulated by the p7.5 promoter
  • the p7.5 promoter region was amplified by PCR using WR gDNA as a template and the EGFP gene in pEGFP-N3 (Clontech, Cat No. 6080-1) and the Gpt gene in DH5 ⁇ (Takara, Cat No. 9057) And pGEM-T Easy-p7.5, pGEM-T Easy-EGFP, and pGEM-T Easy-Gpt were prepared respectively.
  • the pSE / L promoter and TF were also prepared by primer annealing. The primer sequences used in the experiments are shown in Table 17 above.
  • pGEM-T Easy-p7.5 and annealed pSE / L promoters were treated with BamHI and PstI, respectively, and ligated to prepare pGEM-T Easy-pSE / L-p7.5.
  • EGFP-pSE / L-p7.5 was prepared by treating the prepared pGEM-T Easy-pSE / L-p7.5 and pGEM-T Easy-EGFP with BglII and XhoI, .
  • TK-R (WR) was treated with EcoRI and BamHI followed by ligation to construct pSP72-TK-R (WR), which was treated with EcoRI and BglII to construct a shuttle plasmid in which the TK gene function was partially deleted. (WR).
  • the prepared pSP72-TK-R (WR) was treated with XhoI and PstI and ligated with pSEM-T Easy-TK-L treated with SalI and PstI to produce pSP72-TK-L-TK-R Respectively.
  • EGFP expression cassette was treated with EcoRI and PstI and ligated with pSP72-TK-L-TK-R (WR) and pGEM-T Easy-EGFP-pSE / L- TK-L-EGFP-pSE / L-p7.5-TK-R (WR).
  • the pSP72-TK-L-TF-L-TF-RL (WR) and annealed TF oligomers were treated with PstI and NotI, respectively, and ligated to the pSP72-TK- EGFP-pSE / L-p7.5-TK-R (WR).
  • pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE / L-p7.5-TK-R (WR) and pGEM-T Easy-Gpt were treated with EcoRI and SpeI (Hereinafter referred to as " WR TK (i) shuttle plasmid ") was finally prepared by ligating the TK shuttle plasmid pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE / L-p7.5-Gpt-TK-R
  • Example 2.1.3 Plasmid preparation of recombinant WR vaccinia virus with inactivated K3L gene expression
  • the gene located on the left side and the part of K3L gene were amplified by PCR with the K3L gene as the center.
  • the start codon of the K3L gene was amplified by putting it immediately after the K3L-L sequence, and the primers used for the homologous sequence amplification on the left side of the K3L gene are shown in Table 18 below.
  • the K3L-L-K3Li (WR) fragment amplified with the post-codon except for the start codon of the K3L gene was obtained and ligated with pGEM-T Easy vector to obtain pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li ).
  • the IHD-W K3L shuttle plasmid and pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li (WR) prepared in Example 1.1.3 were treated with SnaBI and HindIII and ligated to pSP72-K3L-L-K3Li-p7 . 5-DsRed-TF-K3L-R (WR).
  • Point mutations were performed using the primers shown in Table 18 to introduce the start codon of K3L into the prepared pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R (WR) (hereinafter, referred to as " WR K3L (i) shuttle plasmid ") was prepared in the same manner as in Example 1, except that pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L ATG- K3L-R
  • Example 2.1.4 Production of recombinant WR vaccinia virus with inactivated VGF and TK gene expression
  • recombinant WR Vaccinia virus Vi in which the expression of VGF gene was inactivated, was obtained under the same conditions and methods as in Example 1.1.4, except that WR VGF (i) shuttle plasmid and WR wild type virus were used. Thereafter, recombinant WR Vaccinia virus ViTi in which expression of VGF and TK genes was inactivated was obtained in the same manner as above except that WR TK (i) shuttle plasmid and recombinant WR vaccinia virus Vi were used.
  • WR vaccine in which expression of VGF, TK, and K3L genes was inactivated by the same conditions and methods as in Example 1.1.4, except that WR K3L (i) shuttle plasmid and recombinant WR vaccinia virus ViTi were used.
  • Nial virus WR-VV01 was obtained and the gene structure was depicted in Fig.
  • Example 2.2.1 Plasmid preparation of recombinant WR vaccinia virus with inactivated TK gene expression and induction of sPD1-Fc and PH20 gene expression
  • WR TK (i) shuttle plasmid prepared in Example 2.1.2 and the IHD-W TK (sPD1-Fc) shuttle plasmid prepared in Example 1.2.1 were treated with BamHI and EcoRI, respectively, (Hereinafter referred to as "WR TKi (sPD1-Fc) shuttle plasmid") was prepared by the method described in Example 1, Respectively.
  • Example 1.3.1 the IHD-W TK (PH20) shuttle plasmid prepared in Example 1.3.1 was treated with BamHI and PacI, respectively, and ligated to obtain pSP72-TK-L-TF-pSE / L-EGFP- (Hereinafter referred to as " WR TKi (sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid ") was finally prepared.
  • Example 2.2.2 Plasmid preparation of recombinant WR vaccinia virus in which K3L gene expression is inactivated and expression of IL-12 gene is induced
  • the WR K3Li shuttle plasmid prepared in Example 2.1.3 and the IHD-W K3L (IL-12) shuttle plasmid prepared in Example 1.4.1 were treated with SalI (Hereinafter referred to as "WR K3Li (IL-12) shuttle plasmid") was subjected to final ligation to obtain pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF_K3L- Respectively.
  • Example 2.1.3 First, except for using the WR K3Li shuttle plasmid prepared in Example 2.1.3 and the recombinant WR Vaccinia virus Vi prepared in Example 2.1.4, the same conditions and conditions as in Example 1.1.4 were used. To obtain recombinant WR Vaccinia virus ViKi in which VGF and K3L gene expression were inactivated.
  • Example 2.2.1 Except that the WR TKi (sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid prepared in Example 2.2.1. And the recombinant WR Vaccinia virus ViKi were used, the same conditions and methods as in Example 1.1.4 were used, The recombinant WR vaccinia virus WR-VV05 in which the expression of TK and K3L genes was inactivated and the expression of sPD1-Fc and PH20 genes was induced was obtained.
  • VGF, TK, and K3L genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4) were obtained under the same conditions and procedures as in Example 1.1.4, except that the WR K3Li (IL-12) shuttle plasmid and recombinant WR- The recombinant WR-VV06 in which the expression was inactivated and the expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 gene was induced, and the gene structure is shown in Fig.
  • the primary antibody of the sPD1-Fc gene used was anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299), the secondary antibody was anti-Goat and the primary antibody of PH20 gene was anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909), the secondary antibody is anti-Rabbit, and the expression results are shown in Fig. 20a.
  • ELISA was performed to confirm that the inserted IL-12 gene was expressed in infected cells through a recombinant virus.
  • HeLa cells were treated with recombinant WR-VV06 at 0.05 MOI, and the cells were harvested after 44 to 52 hours, and the expressed proteins were obtained. Protein expression was determined using the Mouse IL-12 p70 Quantikine ELISA kit (R & D Systems, Cat # M1270). At this time, the crude protein solution was diluted to 1 / 5,000 and used. The measurement results are shown in Fig. 20B.
  • Example 3.1.1 Plasmid preparation of recombinant Lister Vaccinia virus lacking VGF gene
  • genes located on both sides of the VGF gene in the genomic DNA of Lister vaccinia virus were amplified by PCR and inserted into pGEM-T easy, respectively, to generate pGEM-T Easy-VGF-L (Lister) and pGEM-T Easy-VGF-R (Lister).
  • Primer information used for amplification of homologous nucleotide sequences on both sides of the VGF gene is shown in Table 20 below.
  • the pSP72 vector and pGEM-T Easy-VGF-L were treated with HindIII and SalI, respectively, and ligated to prepare pSP72-VGF-L (Lister).
  • the pSP72-VGF-L (Lister) and pGEM-T Easy-VGF-R (Lister) were treated with PacI and KpnI respectively and ligated to prepare pSP72-VGF-L-VGF-R (Lister).
  • the prepared pSP72-VGF-L-VGF-R (Lister) vector and the IHD-W VGF shuttle plasmid prepared in Example 1.1.1 were treated with NheI and PacI and ligated to obtain pSP72-VGF- LacZ-VGF-R (Lister) (hereinafter referred to as "Lister VGF shuttle plasmid").
  • VGF-L forward (Lister) ATGAAGCTTTAAAACTTGTCTGTATATGTAAGATGTTT SEQ ID NO: 105
  • VGF-L Reverse (Lister) ACCCGGGTTTAATTAACATGCTAGCGTGTAAATAATATAAAAATAACAATACAATATTG
  • VGF-R forward (Lister) Gt
  • VGF-R Reverse (Lister) TCCCGGGCATCGATAGTACAATAACTTTTATGAAAT SEQ ID NO: 108
  • Example 3.1.2 Plasmid preparation of recombinant Lister Vaccinia virus lacking TK gene
  • the genes located on both sides of the TK gene in the genomic DNA of Lister vaccinia virus were amplified by PCR and inserted into pGEM-T Easy, respectively, to construct pGEM-T Easy-TK-L ) and pGEM-T Easy-TK-R (Lister).
  • the primer information used for amplification of homologous nucleotide sequences on both sides of the TK gene is shown in Table 21 below.
  • TK-L-TK-R (Lister) was obtained by treating and digesting pGEM-T Easy-TK-L (Lister) vector and pGEM-T Easy- Respectively.
  • pSP72-TK-L-TK-R (Lister) was prepared by treating pSP72 vector and pGEM-T Easy-TK-L-TK-R (Lister) with SpeI and XmaI, respectively.
  • the resulting pSP72-TK-L-TK-R (Lister) vector and the IHD-W TK shuttle plasmid prepared in Example 1.1.2 were treated with NotI and SalI, pSE / L-EGFP-TK-R (Lister) (hereinafter referred to as "Lister TK shuttle plasmid").
  • Example 3.1.3 Plasmid preparation of recombinant Lister Vaccinia virus lacking K3L gene
  • the IHD-W K3L shuttle plasmid prepared in Example 1.1.3 was treated with BglII and EcoRV, and the genes (R-1, R-2 and R-3) located on the right side of the K3L gene in the Lister vaccinia virus genome (ATCC, VR- p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R (Lister) was constructed by PCR amplification and insertion by infusion cloning method.
  • Lister K3L shuttle plasmid (Hereinafter referred to as " Lister K3L shuttle plasmid ") was prepared by PCR amplification, and then inserted by infusion cloning method to prepare pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R (Lister).
  • the primer sequences used in the infusion cloning procedure are shown in Table 22 below.
  • Example 3.1.4 Production of recombinant Lister vaccinia virus lacking VGF gene
  • the recombinant Lister Vaccinia virus V (SEQ. ID. NO: 2) lacking the VGF gene was amplified by the same conditions and procedures as in Example 1.1.4, except that the Lister wild type vaccinia virus and the Lister VGF shuttle plasmid prepared in Example 3.1.1 were used. ≪ / RTI >
  • Example 3.1.5 Production of recombinant Lister Vaccinia virus lacking VGF and TK genes
  • Example 3.1.4 The recombinant Lister Vaccinia virus V prepared in Example 3.1.4 and the Lister TK shuttle plasmid prepared in Example 3.1.2 were used under the same conditions and in the same manner as in Example 1.1.4 Recombinant Lister Vaccinia virus VT in which the VGF and TK genes were deleted was obtained.
  • Example 1.1.4 The same conditions and methods as those of Example 1.1.4 were used, except that the recombinant Lister Vaccinia virus VT prepared in Example 3.1.5 and the Lister K3L shuttle plasmid prepared in Example 3.1.3 were used. Recombinant Lister-VV01 lacking the VGF, TK and K3L genes was obtained, and the gene structure was depicted in FIG.
  • Example 3.2.1 Plasmid preparation of recombinant Lister Vaccinia virus with deletion of TK gene and induction of expression of sPD1-Fc and PH20 gene
  • the pSP72-TK-L-TK-R (Lister) vector prepared in Example 3.1.2 and the IHD-W TK (sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid prepared in Example 1.5.1 were transformed into NotI and NheI (Hereinafter referred to as "Lister TK (sPD1-Fc ”) (hereinafter, referred to as " sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid ").
  • Example 3.2.2 Plasmid preparation of recombinant Lister Vaccinia virus with deletion of K3L gene and induction of IL-12 gene expression
  • the Lister K3L shuttle plasmid prepared in Example 3.1.3 and the IHD-W K3L (IL-12) shuttle plasmid prepared in Example 1.4.1 were treated with SalI (Hereinafter referred to as "Lister K3L (IL-12) shuttle plasmid") was obtained by ligation of the plasmid pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R- .
  • Example 1.1.4 the same conditions and conditions as in Example 1.1.4 were used, except that the recombinant Lister Vaccinia virus V prepared in Example 3.1.4 and the Lister K3L shuttle plasmid prepared in Example 3.1.3 were used. To obtain a recombinant Lister Vaccinia virus VK in which the VGF and K3L genes have been deleted.
  • Example 1.1.4 The same conditions and procedures as those of Example 1.1.4 were used to prepare VGF, Listeria tumefaciens, and Listeria viruses, except that the Lister TK (sPD1-Fc + PH20) shuttle plasmid prepared in Example 3.2.1 and the recombinant Lister Vaccinia virus VK were used.
  • the recombinant Lister Vaccinia virus Lister-VV05 in which the TK and K3L genes were deleted and the expression of sPD1-Fc and PH20 genes was induced was obtained.
  • VGF, TK, and K3L genes were obtained under the same conditions and procedures as in Example 1.1.4, except that the Lister K3L (IL-12) shuttle plasmid and the recombinant Lister-VV05 prepared in Example 3.2.2 were used.
  • Lister K3L (IL-12) shuttle plasmid and the recombinant Lister-VV05 prepared in Example 3.2.2 were used.
  • the gDNA of the recombinant Lister-VV06 prepared in Example 3.2.3 was obtained using Maxwell viral total nucleic acid purification kit (Promega, Cat # AS1330), and the recombinant virus Lister-VV06 Of the gDNA structure. As shown in FIG. 23, the result of DNA structure of each VGF, TK, and K3L positions confirmed that the size of the PCR fragment at the gene insertion site was changed relative to the control group. Western blotting was performed to confirm that the inserted sPD1-Fc gene was expressed in infected cells via recombinant virus. First, HeLa cells were transfected with recombinant Lister-VV06 at 0.05 MOI. After 44 to 52 hours, the cells were changed to a medium not containing fetal bovine serum and cultured for 16 to 20 hours. Then, the medium and cells were separated to obtain proteins.
  • the prepared protein was quantified by the Bradford assay method, and the expression of the protein was confirmed by Western blotting.
  • the primary antibody used was anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) and the secondary antibody was anti-Goat.
  • Western blotting was performed to confirm that the inserted PH20 gene was expressed in infected cells through recombinant virus.
  • the primary antibody used was anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) and the secondary antibody was anti-Rabbit.
  • the expression results are shown in FIG.
  • an ELISA was performed to confirm that the inserted IL-12 gene was expressed in infected cells through a recombinant virus.
  • HeLa cells were infected with recombinant Lister-VV06 at 0.05 MOI, and 44 to 52 hours after the infection, but expressing the expressed protein was obtained. Protein expression was determined using the Mouse IL-12 p70 Quantikine ELISA kit (R & D Systems, Cat # M1270). At this time, the crude protein solution was diluted to 1 / 5,000 and used. The measurement results are shown in FIG. 24B.
  • Experimental Example 1 Animal model of recombinant IHD-W strain vaccinia virus in which VGF, TK and K3L genes are deleted and expression of sPD1-Fc or PH20 or IL-12 gene is induced.
  • colon cancer cell line CT26.WT was prepared by culturing in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding an excipient (RPMI medium). 1x10 6 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of BALB / c mouse (BALB / cAnHsd; Koatech, Korea) to prepare a colon cancer mouse model.
  • BALB / c mouse BALB / cAnHsd; Koatech, Korea
  • mice were divided into four groups (PBS, IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 and IHD-W-VV05) Welgene, Cat No. LB001-02) or 50 ul of each virus to 1x10 7 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 ul.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the administration of the virus is shown in Fig.
  • the tumor volume on day 14 after virus treatment showed that tumor volumes of IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, and IHD-W-VV05 groups were smaller than those of PBS Respectively.
  • the volume of tumor in IHD-W-VV05 group was smaller than that of IHD-W-VV02 group and IHD-W-VV03 group.
  • skin cancer cell line B16F10 was prepared by culturing in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding excipients (DMEM medium). 5x10 5 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to prepare a skin cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mice per group were divided into PBS, IHD-W-VV01, and IHD-W-VV05 groups when the tumors were grown to a volume of about 70 to 100 ⁇ by volume.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001 -02
  • each virus was administered in a single dose in a tumor with 1 x 10 6 TCID 50/50 ul.
  • the results of confirming the volume of the tumor after the administration of the virus are shown in Fig.
  • the tumor volume of the IHD-W-VV05-treated group was smaller than that of the IHD-W-VV01 treated group after 12-day tumor volume measurement after viral treatment.
  • tumor volume reached an average of 2,000 mm 3 before 12 days of virus administration and was excluded by euthanasia.
  • a lung cancer cell line LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) using the composition of DMEM medium 37 °C and 5% CO 2 Lt; / RTI > incubator.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • mice were divided into two groups: PBS, IHD-W-VV01, and IHD-W-VV05.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL.
  • FIG. 27 shows the result of confirming the volume of the tumor after the administration of the virus.
  • the tumor volume on day 14 after virus treatment showed that the tumor volume of the IHD-W-VV01 administration group and the IHD-W-VV05 administration group was smaller than that of the PBS administration group.
  • the tumor volume of the IHD-W-VV05 group was smaller than that of the IHD-W-VV01 group.
  • colon cancer cell line CT26.WT was prepared by culturing in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding an excipient (RPMI medium). 1x10 6 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of BALB / c mouse (BALB / cAnHsd; Koatech, Korea) to prepare a colon cancer mouse model.
  • BALB / c mouse BALB / cAnHsd; Koatech, Korea
  • IHD-W-VV03, IHD-W-VV04, and IHD-W-VV06 administration groups each of which was administered with PBS, IHD-W-VV02, and then separated into PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul of each virus or 1x10 7 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 ul.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus or 1x10 7 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 ul.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • a lung cancer cell line LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) using the composition of DMEM medium 37 °C and 5% CO 2 Lt; / RTI > incubator.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • IHD-W-VV03, IHD-W-VV04, IHD-W-VV04, and IHD-W-VV02 administration groups were administered to each mouse of a mouse model prepared when the volume of the tumor grew by about 70 to 100 ⁇ after one week. .
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL. The result of confirming the volume of the tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • the tumor volume on day 14 after virus treatment showed that tumor volumes of IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 and IHD- And the tumor volume was small.
  • the volume of tumor in IHD-W-VV06 group was smaller than that of IHD-W-VV02 group, IHD-W-VV03 group and IHD-W-VV04 group.
  • colon cancer cell line CT26.WT was prepared by culturing in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding an excipient (RPMI medium). 1x10 6 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of BALB / c mouse (BALB / cAnHsd; Koatech, Korea) to prepare a colon cancer mouse model.
  • BALB / c mouse BALB / cAnHsd; Koatech, Korea
  • mice were divided into four groups of PBS, IHD-W-VV05, and IHD-W-VV06, and the mice were divided into two groups: PBS (Welgene, Cat No. LB001 -02) or 50 ul of each virus to 1x10 7 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 ul.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001 -02
  • 50 ul of each virus to 1x10 7 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 ul.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • the volume of tumor on day 14 after viral treatment showed that the tumor volume of the IHD-W-VV05-treated group and the IHD-W-VV06-treated group was smaller than that of the PBS-treated group.
  • the tumor volume of the IHD-W-VV06 treated group was smaller than that of the IHD-W-VV05 treated group.
  • skin cancer cell line B16F10 was prepared by culturing in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding excipients (DMEM medium). 5x10 5 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to prepare a skin cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mice per group were divided into PBS, IHD-W-VV05, and IHD-W-VV06 groups, and the mice were grown in PBS (Welgene, Cat No. LB001 -02) or each virus was administered in a single dose in a tumor with 1 x 10 6 TCID 50/50 ul.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001 -02
  • each virus was administered in a single dose in a tumor with 1 x 10 6 TCID 50/50 ul.
  • the results of confirming the volume of the tumor after the administration of the virus are shown in Fig.
  • the tumor volume on day 12 after virus treatment showed that the tumor volume of the IHD-W-VV06-treated group was smaller than that of the IHD-W-VV05-treated group.
  • tumor volume reached an average of 2,000 mm 3 before 12 days of virus administration and was excluded by euthanasia.
  • a lung cancer cell line LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) using the composition of DMEM medium 37 °C and 5% CO 2 Lt; / RTI > incubator.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mice were divided into six mice, each of which received PBS, IHD-W-VV05 and IHD-W-VV06.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL.
  • the result of confirming the volume of tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • the tumor volume on day 14 after virus treatment showed that the tumor volume of the IHD-W-VV05-treated group and the IHD-W-VV06-treated group was smaller than that of the PBS-treated group.
  • the tumor volume of the IHD-W-VV06 treated group was smaller than that of the IHD-W-VV05 treated group.
  • skin cancer cell line B16F10 was prepared by culturing in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Cells that were being cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 were prepared for cancer cell inoculation when the cells were 70-80% of the dish. The prepared cancer cells were centrifuged at 4 ° C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove all of the supernatant, and cells were prepared by adding excipients (DMEM medium). 5x10 5 cells prepared were injected subcutaneously to the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to prepare a skin cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mice were divided into four groups of mice (PBS, IHD-W-VV01 and IHD-W-VV06) -02) or each virus was administered in a single dose in a tumor with 1 x 10 6 TCID 50/50 ul.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the administration of the virus is shown in Fig.
  • the volume of the tumor on day 14 after virus treatment showed that the tumor volume of the IHD-W-VV01 administration group was smaller than that of the IHD-W-VV06 administration group.
  • tumor volume reached an average of 2,000 mm 3 before 12 days of virus administration and was excluded by euthanasia.
  • a lung cancer cell line LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) using the composition of DMEM medium 37 °C and 5% CO 2 Lt; / RTI > incubator.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mice were divided into six groups, each of which received PBS, IHD-W-VV01 and IHD-W-VV06.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL.
  • the result of confirming the tumor volume after the administration of the virus is shown in Fig.
  • the tumor volume on day 14 after virus treatment showed that tumor volumes of IHD-W-VV01 and IHD-W-VV06 were smaller than those of PBS.
  • the tumor volume of the IHD-W-VV06 treated group was smaller than that of the IHD-W-VV01 treated group.
  • the lung cancer cell line the LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) 37 °C by using the composition, and DMEM medium with 5% CO 2 conditions Lt; / RTI > incubator.
  • Cells were harvested when cells were inoculated into the culture plates at 70-80% of the area during the last pass passage after three passages. The supernatant of the harvested cells was removed and an excipient (DMEM) was added to prepare a cell concentration of 1 x 10 7 / mL.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mouse models were divided into six mice per group by PBS, WR-VV01 and WR-VV06.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • the tumor volume of the WR-VV01-treated group and the WR-VV06-treated group was smaller than the tumor volume of the PBS-treated group on the 14th day after the virus treatment.
  • the tumor volume of the virus-administered group was compared, it was confirmed that the tumor volume of the WR-VV06-treated group was smaller than that of the WR-VV01-treated group.
  • the lung cancer cell line the LLC1 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 1% antibiotics-antimycotics (GIBCO, Cat No. 15240-062) 37 °C by using the composition, and DMEM medium with 5% CO 2 conditions Lt; / RTI > incubator.
  • Cells were harvested when cells were inoculated into the culture plates at 70-80% of the area during the last pass passage after three passages. The supernatant of the harvested cells was removed and an excipient (DMEM) was added to prepare a cell concentration of 1 x 10 7 / mL.
  • DMEM excipient
  • a cell suspension containing 1x10 6 cells prepared was injected subcutaneously into the right side of C57BL / 6N mouse (C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea) to construct a lung cancer mouse model.
  • C57BL / 6N mouse C57BL / 6NHsd; Koatech, Korea
  • mouse models were divided into six mice per group by PBS, Lister-VV01, and Lister-VV06.
  • PBS Welgene, Cat No. LB001-02
  • 50 ul of each virus to 1x10 6 TCID 50 / single dose were administered in the tumor by 50 uL.
  • the result of confirming the volume of the tumor after the virus administration is shown in Fig.
  • the tumor volume of the Lister-VV06-treated group was smaller than the tumor volume of the PBS-administered group as a result of measurement of the cancer cell size on day 14 after virus treatment.
  • the volume of tumor in Lister-VV06 group was smaller than that of Lister-VV01 group.
  • the recombinant Vaccinia virus IHD-W-VV06 produced in Example 1 the recombinant Vaccinia virus WR-VV06 produced in Example 2, and the recombinant Vaccinia virus Lister-VV06 produced in Example 3 were used as various types of cancer cells CCK-8 assay was performed to determine if it was capable of killing.
  • cancer cell lines were prepared as shown in Table 24 below, cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 , Lt; / RTI >
  • the number of cells per well is CT26-WT
  • Hep-55.1C was 2 X 10 4 gae
  • CMT93 and B16F10 are 1 X 10 4 gae
  • JC was dispensed such that the dog 2 X 10 3.
  • the recombinant vaccinia virus IHD-W-VV06 was added to 1 MOI, WR-VV06 to 1 MOI, and Lister-VV06 to 10 MOI in consideration of the cell killing ability of the wild type virus of each recombinant virus
  • the cell line was infected. At this time, cells not treated with virus were used as control groups. After 3 days, the cells were stained with CCK-8 (Dojindo, Cat No. CK04) solution to determine the cancer cell survival rate. The result is shown in FIG. 37
  • recombinant Vaccinia viruses in which the expression of VGF, TK and K3L genes are inactivated or deleted regardless of Vaccinia strain and the expression of sPD1-Fc, PH20 and IL-12 genes are induced Type cancer cells.

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Abstract

본 발명은 sPD-1 또는 히알루로니다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 치료 유전자를 포함하고, 백시니아 바이러스의 K3L, TK 또는 VGF 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스는 항종양 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 발명은 암 치료 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
최근 암 치료제 개발 목적으로 다양한 바이러스를 유전적으로 조작하여 변형시킨 종양 살상 바이러스(Oncolytic virus)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지는 종양 살상 바이러스의 문제점이 완전히 해결되지 못하고 있는 상황이다. 예를 들어, 항암제로 개발하기 위하여 유전적 조작을 통해 종양 선택적 복제능을 갖는 바이러스를 제작하였으나, 암세포뿐만 아니라 정상세포를 살상한다는 문제점이 발견되기도 하였고, 항암 효과가 충분하지 못한 문제점도 발견되었다. 따라서, 종양 살상 바이러스가 정상세포에 미치는 영향을 최소화하면서, 암세포에 대한 선택성 및 효능을 높일 수 있는 기술의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
한편, 백시니아 바이러스는 약 200개의 독립 유전자를 인코딩하는 약 200 kbp의 이중가닥 선형 게놈 DNA를 갖는 피막 DNA 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 18세기에 에드워드 제너가 최초로 천연두(smallpox)의 예방백신으로 사용한 이후 다양한 예방 백신들로 개발되었다. 초기의 백시니아 바이러스 백신은 야생형 바이러스를 사용하였고, 백신을 투여한 환자에서 전신감염 또는 진행성 감염 등의 심각한 부작용이 나타났었다. 이에, 부작용을 줄이기 위해 앙카라(MVA, modified vaccinia Ankara), LC16m8(derived from the Lister strain) 및 NYVAC(derived from the Copenhagen vaccinia strain, New York Vaccinia Virus) 등과 같이 독성이 약화된 변형 백시니아 바이러스들이 개발되었다. 이러한 백시니아 바이러스들을 기반으로 다양한 질환에 적용가능한 백신들이 개발되었고, 특히, 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC, Wyeth, 리스터(Lister) 등의 백시니아 바이러스 종(strain)들은 종양 살상 바이러스로도 개발되고 있다.
본 발명의 목적은 암 치료 유전자를 포함하거나 암 치료 유전자를 포함하면서 일부 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스, 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 sPD-1(soluble programmed cell death protein-1)을 코딩하는 유전자, 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암 치료 유전자를 포함하거나 암 치료 유전자를 포함하면서 일부 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스는 항종양 효과가 우수한 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 VGF, TK 및 K3L이 결실된 IHD-W 백시니아 바이러스(IHD-W-VV01)의 유전자 구조를 도식화한 것이다. 바이러스 유전자 결실 및 치료유전자 도입에 대해 약기한 용어의 의미는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2019000797-appb-I000001
도 2는 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, sPD1-Fc 유전자가 삽입된 IHD-W-VV02의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 3은 IHD-W-VV02의 gDNA를 전기영동하여 sPD1-Fc 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 4는 IHD-W-VV02가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 sPD1-Fc 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 5는 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, PH20 유전자가 삽입된 IHD-W-VV03의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 6은 IHD-W-VV03의 gDNA를 전기영동하여 PH20 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 7은 IHD-W-VV03가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 PH20 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 8은 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, IL-12 유전자가 삽입된 IHD-W-VV04의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 9는 IHD-W-VV04의 gDNA를 전기영동하여 IL-12 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 10은 IHD-W-VV04가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 IL-12 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 11은 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, sPD1-Fc 및 PH20 유전자가 삽입된 IHD-W-VV05의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 12는 IHD-W-VV05의 gDNA를 전기영동하여 sPD1-Fc 및 PH20 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 13은 IHD-W-VV05가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 sPD1-Fc 및 PH20 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 14는 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 IHD-W-VV06의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 15는 IHD-W-VV06의 gDNA를 전기영동하여 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 16은 IHD-W-VV06가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 17은 VGF, TK 및 K3L 발현이 비활성화된 WR 백시니아 바이러스(WR-VV01)의 유전자 구조를 도식화한 것이다. 바이러스 유전자 비활성화 및 치료유전자 도입에 대해 약기한 용어의 의미는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2]
Figure PCTKR2019000797-appb-I000002
도 18은 VGF, TK 및 K3L 발현이 비활성화되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 WR-VV06의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 19는 WR-VV06의 gDNA를 전기영동하여 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 20a는 WR-VV06가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 sPD1-Fc, PH20 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 20b는 WR-VV06가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 ELISA 하여 IL-12 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 21은 VGF, TK 및 K3L이 결실된 Lister 백시니아 바이러스(Lister-VV01)의 유전자 구조를 도식화한 것이다. 바이러스 유전자 결실 및 치료유전자 도입에 대해 약기한 용어의 의미는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
Figure PCTKR2019000797-appb-I000003
도 22는 VGF, TK 및 K3L이 결실되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 Lister-VV06의 유전자 구조를 도식화한 것이다.
도 23은 Lister-VV06의 gDNA를 전기영동하여 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 삽입된 것을 확인한 것이다.
도 24a는 Lister-VV06가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 웨스턴 블롯하여 sPD1-Fc, PH20 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 24b는 Lister-VV06가 감염된 HeLa 세포에서 분비된 단백질을 ELISA로 IL-12 유전자가 발현된 것을 확인한 것이다.
도 25는 대장암 마우스 모델에 IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 및 IHD-W-VV05를 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 26은 흑색종 마우스 모델에 IHD-W-VV01 및 HD-W-VV05를 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 27은 폐암 마우스 모델에 IHD-W-VV01 및 HD-W-VV05를 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 28은 대장암 마우스 모델에 IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 29는 폐암 마우스 모델에 IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 30은 대장암 마우스 모델에 IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 31은 흑색종 마우스 모델에 IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 32는 폐암 마우스 모델에 IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 33은 흑색종 마우스 모델에 IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 34는 폐암 마우스 모델에 IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 35는 폐암 마우스 모델에 WR-VV01 및 WR-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 36은 폐암 마우스 모델에 Lister-VV01 및 Lister-VV06을 종양 내 투여한 후 암세포 성장을 확인한 결과이다.
도 37은 IHD-W-VV06, WR-VV06 및 Lister-VV06의 in vitro 세포 살상능을 확인한 결과이다.
본 발명은 일 측면으로, sPD-1(soluble programmed cell death protein-1)을 코딩하는 유전자, 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 백시니아 바이러스는 IL-12를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "sPD-1"은 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려진 55 kDa의 제I형 경막 단백질인 PD-1(programmed death-1)의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 의미한다. 또한, 상기 sPD-1은 sPD-1의 단편 또는 sPD-1 전장과 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 sPD-1 융합 단백질을 포함하는 의미로 사용될 수 잇다. 상기 융합 단백질의 일 구체예로는 sPD-1과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 sPD-1-Fc일 수 있다. 이때, sPD-1과 Fc는 직접 또는 링커를 통해 결합할 수 있다. 이때, 상기 링커는 1 내지 50개, 2 내지 45개, 3 내지 40개, 5 내지 30개, 7 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로, 3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있다. 상기 링커는 GGGGS(서열번호 123), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 124), SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS(서열번호 125), GGSGGSGGSGGSGGSEQEER(서열번호 126), GGGGSGGGGSGGS(서열번호 127), SGGGGSGGGGSGGGGSGTHTCPPCP(서열번호 128), GGSGGGGS(서열번호 129) 및 GGGGSGGGGSGGGS(서열번호 130)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 sPD-1은 GenBank: NM_008798.2의 서열의 일부일 수 있으며, 어느 하나의 서열로 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 sPD-1은 서열번호 131 또는 서열번호 133의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, sPD-1은 sPD-1의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 131의 아미노산 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "sPD-1 유전자"는 "sPD-1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 목적 단백질인 sPD-1 단백질과 기타 단백질이 융합된 sPD-1 융합 단백질"을 코딩하는 유전자를 의미한다. 구체적으로, 상기 sPD-1 유전자는 Fc 영역을 포함하는 sPD-1 융합 단백질(sPD1-Fc)을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 sPD-1 유전자는 서열번호 132 또는 134의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, sPD-1 유전자는 sPD-1의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 134의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "히알루로니다아제"는 히알루론산을 분해하는 효소를 의미한다. 상기 히알루로니다아제는 양, 소, 마우스 또는 인간 유래의 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 히알루로니다아제는 인간 히알루로니다아제(PH20) 또는 재조합 인간 히알루로니다아제(rHuPH20)일 수 있다. 상기 히알루로니다아제는 GenBank: NM_003117.4의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 히알루로니다아제는 서열번호 135의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 구체적으로, 상기 히알루로니다아제 유전자는 서열번호 136의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 히알루로니다아제 유전자는 히알루로니다아제의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 136의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "IL-12"는 사이토카인에 속하는 분자로 면역체계와 관련이 있다. 상기 IL-12는, 예를 들어, 인간(hIL-12), 마우스(mIL-12), 말, 소, 돼지 등의 임의의 동물로부터 수득될 수 있는 것과 동일한 것일 수 있다. 상기 IL-12는 GenBank의 NM_000882.3(hIL-12A), AY008847.1(hIL-12B), NM_001159424.2(mIL-12α) 또는 NM_001303244.1(mIL-12β)에 개시된 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 IL-12는 서열번호 137의 아미노산 서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-12 유전자는 서열번호 138의 염기서열로 표시되는 링커, 서열번호 139의 염기서열(p35 서브유닛), 또는 서열번호 140(p40 서브유닛)의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, IL-12 유전자는 IL-12의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 138 내지 서열번호 140의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 sPD-1 유전자를 포함하는 백시니아 바이러스, 히알루로니다아제 유전자를 포함하는 백시니아 바이러스 또는 IL-12 유전자를 포함하는 백시니아 바이러스일 수 있다. 이때, sPD-1 유전자, 히알루로니다아제 유전자 및/또는 IL-12 유전자는 백시니아 바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 또한, 상기 유전자들은 백시니아 바이러스 게놈의 서로 다른 위치에 삽입될 수도 있으나, 동일하거나 비슷한 위치에 삽입될 수 있다. 일례로, 백시니아 바이러스의 TK, K3L 또는 VGF 위치에 삽입될 수 있다. 바람직하게, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 sPD-1, 히알루로니다아제 및/또는 IL-12를 숙주세포내에서 발현할 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 sPD-1 유전자, 히알루로니다아제 유전자 또는 IL-12 유전자 중 적어도 두 종의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, sPD-1 유전자 및 히알루로니다아제 유전자가 삽입된 백시니아 바이러스, sPD-1 유전자 및 IL-12 유전자가 삽입된 백시니아 바이러스 또는 히알루로니다아제 유전자 및 IL-12 유전자가 삽입된 백시니아 바이러스일 수 있다. 바람직하게 상기 재조합 백시니아 바이러스는 sPD-1 유전자, 히알루로니다아제 유전자 및 IL-12 유전자를 모두 포함할 수 있다. 즉, sPD-1 유전자, 히알루로니다아제 유전자 및 IL-12 유전자의 발현이 가능한 백시니아 바이러스일 수 있다.
상술한 백시니아 바이러스는 K3L을 코딩하는 유전자, TK(thymidine kinase)를 코딩하는 유전자 및 VGF(vaccinia growth factor)를 코딩하는 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 발현이 억제될 수 있다. 이때, 상기 조합은 K3L을 코딩하는 유전자, TK를 코딩하는 유전자 및 VGF를 코딩하는 유전자 중 2종 이상을 의미하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 sPD-1 유전자를 가지는 백시니아 바이러스, 히알루로니다아제 유전자를 가지는 백시니아 바이러스, sPD-1 유전자 및 히알루로니다아제 유전자를 가지는 백시니아 바이러스, sPD-1 유전자 및 IL-12 유전자를 가지는 백시니아 바이러스, 히알루로니다아제 유전자 및 IL-12 유전자를 가지는 백시니아 바이러스, 또는 sPD-1 유전자, 히알루로니다아제 유전자 및 IL-12 유전자를 가지는 백시니아 바이러스 중에서, K3L 유전자, TK 유전자 및 VGF 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 발현이 억제된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "VGF"는 백시니아 성장인자를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자는 상피세포 성장인자와 유사한 활성을 나타내는 효소이다. 상기 VGF 유전자에 의해 코딩된 백시니아 성장인자는 바이러스에 감염되었을 때 성장인자의 활성을 나타내고, 바이러스에 의한 감염 초기에 합성될 수 있다. 상기 VGF는 GenBank: AAO89288.1, ABD52455.1 또는 AIX98927.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 VGF는 서열번호 141의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 VGF 유전자는 서열번호 142의 염기서열일 수 있다. 상기 VGF는 서열번호 141의 아미노산 서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 VGF 유전자는 서열번호 142의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK"는 티미딘 키나아제를 의미한다. 상기 티미딘 키나아제는 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 TK 유전자에 의해 코딩된 티미딘 카나아제는 ATP의 감마(γ) 위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 바이러스 DNA를 구성하는 뉴클레오티드들을 만들 수 있다. 상기 TK는 GenBank: AAO89373.1, ABD52560.1 또는 AIX99011.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 TK는 서열번호 143의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 TK 유전자는 서열번호 144의 염기서열일 수 있다. 상기 TK는 서열번호 143의 아미노산 서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 TK의 유전자는 서열번호 144의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "K3L"은 K3L 단백질을 의미한다. 상기 K3L 유전자에 의해 코딩되는 K3L 단백질은 eIF-2α(translation initiation factor-2α)와 상동성을 갖는 단백질로, 인터페론 활성화 인자인 PKR(protein kinase R)의 작용을 억제할 수 있다. 상기 K3L은 GenBank: AAO89313.1, ABD52483.1 또는 AGB75754.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 K3L은 서열번호 145의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 K3L 유전자는 서열번호 146의 염기서열일 수 있다. 상기 K3L은 서열번호 145의 아미노산 서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 K3L의 유전자는 서열번호 146의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 발현 억제란, 유전자 일부 또는 전부의 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입됨으로써, 유전자가 발현되지 않거나, 유전자의 일부만 발현되어 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 나타나지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자를 결실시키거나, 외래 유전자를 삽입하는 방법은 통상의 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Methods described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis(2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro(1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son(1998), Chapter 16에 개시되어 있는 외래 유전자를 삽입하는 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 pGEM-T Easy(Promega, Cat No. A1360) 또는 pGEM-T(Promega, Cat No. A3600) 플라스미드 시스템을 이용하여 외래 유전자를 삽입하였다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White), 이들의 변이체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 WR, Lister 또는 IHD-W 백시니아 바이러스일 수 있으며, GenBank: AY243312.1, DQ121394.1 또는 AIX98951.1의 서열을 가지는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 상기 백시니아 바이러스는 IHD-W일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "V" 또는 "바이러스 V"는 백시니아 성장인자 유전자인 VGF가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 VGF 유전자가 결실되어, VGF 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "T" 또는 "바이러스 T"는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 TK 유전자가 결실되어, TK 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "K" 또는 "바이러스 K"는 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 K3L 유전자가 결실되어, K3L 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "VT" 또는 "바이러스 VT"는 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자 및 티미딘 키나아제의 발현을 비활성화 시키는 방법은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "IHD-W-VV01"은 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자, 티미딘 키나아제 및 K3L 단백질의 발현을 비활성화 시키는 방법은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 용어 "IHD-W-VV02"는 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고, sPD1-Fc 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 용어 "IHD-W-VV03"은 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고, PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 용어 "IHD-W-VV04"는 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고, IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 용어 "IHD-W-VV05"는 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고, sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 용어 "IHD-W-VV06"은 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 의미한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 일 예로는 다음과 같은 것들이 가능하다. WR 백시니아 바이러스의 변이체는 WR 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, NYVAC 백시니아 바이러스의 변이체는 NYVAC 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, Wyeth 백시니아 바이러스의 변이체는 Wyeth 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, Lister 백시니아 바이러스의 변이체는 Lister 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, Tian tan 백시니아 바이러스의 변이체는 Tian tan 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, USSR 백시니아 바이러스의 변이체는 USSR 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, TashKent 백시니아 바이러스의 변이체는 TashKent 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
또한, IHD-J 백시니아 바이러스의 변이체는 IHD-J 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
나아가, IHD-W 백시니아 바이러스의 변이체는 IHD-W 백시니아 바이러스의 VGF, TK 및 K3L 중 1종 이상의 유전자 발현이 억제되고, sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 중 1종 이상의 유전자 발현이 유도된 것일 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 재조합 백시니아 바이러스는 상술한 바와 같이 sPD1-Fc, PH20, IL-12 유전자 또는 이들의 조합의 발현이 유도되고, VGF, TK, K3L 유전자 또는 이들의 조합의 발현이 억제된 것일 수 있다. 상기 sPD1-Fc, PH20, IL-12, VGF, TK 및 K3L 유전자는 상술한 바와 같다.
본 발명에서 사용한 용어 "암"은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 이때, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 섬유육종, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 암은 폐암, 간암, 전립선암, 두경부암, 섬유육종, 뇌암, 유방암, 난소암, 췌장암, 피부암 또는 대장암일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제가 추가로 함유될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 특히 포유동물에 투여된 후 유효성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 상기 제형에 따라 본 발명의 조성물은 개체에 적절하게 투여될 수 있다. 상기 투여는 비경구 투여일 수 있고, 그 예로는 종양 내, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 동맥 내, 피하 내, 코안, 경막외 및 구강경로 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 형태는 주사제일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이때, 상기 암은 상술한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나 상기 포유동물은 영장류(예컨대 인간), 소, 양, 염소, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등일 수 있다. 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회 또는 1일 수회일 수 있으며, 적절한 주기로 반복하여 투여될 수 있다.
본 발명의 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 환자에게 1x105 내지 1x1018 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다. 또한, 바이러스 투여량은 0.1 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖ 또는 그 이상, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 재조합 백시니아 바이러스 제조
본 발명자들은 TK, VGF 및 K3L 유전자가 결실 또는 발현이 비활성된 재조합 백시니아 바이러스 플라스미드를 제작하였으며, 이들 플라스미드를 이용하여 상기 유전자들의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하여 항암 물질로써의 특성을 비교하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 재조합 백시니아 바이러스 플라스미드에 sPD1-Fc, PH20, IL-12 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스 플라스미드를 제작하였으며, 이들 플라스미드를 이용하여 상기 유전자들의 발현이 유도된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하여 항암 물질로써의 특성을 비교하였다.
실시예 1. 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
실시예 1.1. IHD-W-VV01 바이러스 제조
실시예 1.1.1. VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
먼저, IHD-W 백시니아 바이러스(ATCC, Cat No. VR-1441)의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭하였다. 이때 VGF 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 4에 나타내었다. 이를 통해 VGF-L(IHD-W) 및 VGF-R(IHD-W) 단편을 수득한 후 pGEM-T Easy 플라스미드와 라이게이션하여 pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W) 또는 pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF-L 정방향(IHD-W) CGAAAGCTTGTAAGATGTTTAGAAAATGGATATTTC 서열번호 1
VGF-L 역방향(IHD-W) CTGGGATCCTAGGCTAGCGTGTAAATAATATAAAAATAACAATACAATATTG 서열번호 2
VGF-R 정방향(IHD-W) CTGGAATTCGATTTAATTAATTTTTATAAATTTTTTTTATGAGTATTTTTACAAAAAA 서열번호 3
VGF-R 역방향(IHD-W) TAGGGATCCCATCGATAGTACAATAACTTTTATGAAAT 서열번호 4
상기 pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)과 pSP72를 EcoRI 및 BglII로 각각 처리한 뒤 라이게이션하여 pSP72-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다. 제작된 pSP72-VGF-R(IHD-W)과 pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)을 각각 HindIII 및 BamHI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다.
다음으로, 상기 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)에 p11 프로모터 및 LacZ 유전자를 도입하기 위하여, 하기 실시예 2.1.1.에서 제작한 WR VGF(i) 셔틀 플라스미드 내 p11-LacZ 발현 카세트 및 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)을 NheI과 PacI으로 처리하고, 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)(이하, "IHD-W VGF 셔틀 플라스미드")를 제작하였다.
실시예 1.1.2. TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
먼저, IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 TK 유전자를 중심으로, 양옆에 위치한 유전자들을 확보하기 위하여 PCR을 수행한 결과로 TK-L(IHD-W) 및 TK-R(IHD-W) 단편을 수득하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 5에 나타내었다. 확보한 TK-R(IHD-W) 단편 및 pSP72 플라스미드를 각각 EcoRI 및 BglII로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-R(IHD-W)을 제작하였다. 또한, 상기 pSP72-TK-R(IHD-W) 및 TK-L(IHD-W) 단편을 각각 PstI 및 BamHI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)을 제작하였다.
제작된 pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W) 플라스미드 및 하기 실시예 2.1.2.에서 제작한 WR TK(i) 셔틀 플라스미드인 pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)를 각각 EcoRI 및 NotI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(IHD-W)(이하"IHD-W TK 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
TK-L 정방향(IHD-W) GATCTGCAGCCCTCTTCAAGAACCCATTAG 서열번호 5
TK-L 역방향(IHD-W) TAGGGATCCTAGGCGGCCGCATGACAATAAAGAATTAATTATTGTTCACTT 서열번호 6
TK-R 정방향(IHD-W) CATGAATTCTATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAAAAATAAACAT 서열번호 7
TK-R 역방향(IHD-W) AGATCTATCGCTTTAGTAGTAGGAAATGTTTTATTG 서열번호 8
실시예 1.1.3. K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
먼저, IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로, 양옆에 위치한 유전자들을 PCR한 후 pGEM-T Easy에 각각 삽입하여 pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W), pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)을 제작하였다. 이때, 사용된 프라이머는 하기 표 6에 나타내었다.
K3L 셔틀 플라스미드 내부의 유전자 발현 카세트를 제작하기 위하여 하기 실시예 2.1.3.에서 제작한 WR K3L(i) 셔틀 플라스미드를 주형으로 p7.5-DsRed 유전자 카세트를 PCR로 증폭한 후 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-p7.5-DsRed를 제작하였다. p7.5 프로모터와 DsRed 유전자의 증폭에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 6에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
K3L-L 정방향(IHD-W) TCGGTCGACCATATGTTTAAACGACGCATTATCTG 서열번호 9
K3L-L 역방향(IHD-W) TCGAAGCTTTTTTTATACCGAACATAAAAATAAGGTTAATTAT 서열번호 10
K3L-R 정방향(IHD-W) CGCAGATAAAAATCACTTGTTAACGGGCTCGTAA 서열번호 11
K3L-R 역방향(IHD-W) AAGCGCTAACATGGATTAGGAAGCGCTAACATGG 서열번호 12
p7.5-DsRed 정방향 AGGAAGCTTTCCAAACCCACCCGCTTTTTAT 서열번호 13
p7.5-DsRed 역방향 CGGATATCTTTTTATCTGCGCGGTTAAC 서열번호 14
제작된 pGEM-T Easy-p7.5-DsRed와 pSP72 플라스미드를 각각 HindIII와 EcoRV로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-p7.5-DsRed를 완성하였다. 또한 제작된 pSP72-p7.5-DsRed와 상기 제작한 pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)을 EcoRV와 BamHI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)을 제작하였다. 다음으로, 제작된 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)와 pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)을 SalI과 HindIII으로 각각 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)(이하, "IHD-W K3L 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다.
실시예 1.1.4. VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
상기 실시예 1.1.1.에서 제작한 IHD-W VGF 셔틀 플라스미드를 이용하여 다음과 같은 방법으로 VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 생산하였다.
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에 3x105세포/웰 조건 및 2% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지 상태로 준비한 후, 상기 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 2 ㎍을 jetPRIME을 이용하여 형질주입시키고, IHD-W 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 동시 처리하였다. 4시간 배양 후, 세포를 5% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지로 교체한 후 48시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 배지 500 ㎕와 함께 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복하여 세포를 용해시키고, 크루드 바이러스를 수득하였다. 상기 크루드 바이러스를 이용하여 통상적인 방법으로 플라크 분리를 반복하여 순수 분리된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 수득하였다.
실시예 1.1.5. VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
상기 실시예 1.1.2.에서 제작한 IHD-W TK 셔틀 플라스미드와 실시예 1.1.4.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 수득하였다.
실시예 1.1.6. IHD-W-VV01 바이러스 제조
상기 실시예 1.1.3.에서 제작한 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드와 실시예 1.1.5.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W-VV01를 수득하였으며, 유전자 구조는 도 1에 도식화하였다.
실시예 1.2. IHD-W-VV02 바이러스 제조
실시예 1.2.1. TK 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
TK 셔틀 플라스미드 내부의 유전자 발현 카세트를 제작하기 위하여 pE3.1(EF1a.sPD-1.Fc) 플라스미드(국립암센터 비뇨생식기암연구과 제공)를 주형으로 sPD1-Fc 유전자를 PCR로 증폭한 후 pGEM-T easy에 삽입하여 pGEM-T easy-sPD1-Fc를 제작하였다. 또한, pGL4.1 p7.5 luciferase 플라스미드를 주형으로 p7.5 프로모터를 PCR로 증폭한 후 pGEM-T easy에 삽입하여 pGEM-T easy-p7.5를 제작하였다. 제작된 pGEM-T easy-p7.5와 pGEM-T easy-sPD1-Fc 플라스미드를 각각 PacI과 NheI으로 처리한 후 라이게이션하여 pGEM-T easy-p7.5-sPD1-Fc를 완성하였다. p7.5 프로모터와 sPD1-Fc 유전자의 증폭에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타내었다. 실시예 1.1.2.에서 제작한 IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 EcoRI 과 SalI 으로 처리 한 후, p7.5-sPD1-Fc 유전자 카세트를 Infusion cloning 방법으로 삽입하여, pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)(이하, "IHD-W TK(sPD1-Fc) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다. Infusion cloning 과정에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
sPD1-Fc 정방향 AGTGAATTCAGTGCTAGCAGTAAGCTTATGTGGGTCCGGCAGGTAC 서열번호 15
sPD1-Fc 역방향 ACTTTAATTAATCATTTACCCGGAGTCCGGG 서열번호 16
p7.5 정방향 GAATTCATCGAGCTCTCCAAACCCACCCGCTTTTTA 서열번호 17
p7.5 역방향 ATTAATTAAATACTAGTGATGCTAGCGATGGATCCCCGTGCAATAAATTAGAATATATTTTC 서열번호 18
Infusion 정방향(sPD1-Fc) AAATATAATAGAATTCGATTTGCTAGCTCCAAAC 서열번호 19
Infusion 역방향(sPD1-Fc) TGGGCCCTATGTCGACGGATCCCGAGAAA 서열번호 20
실시예 1.2.2. VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
상기 실시예 1.1.3.에서 제작한 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드와 실시예 1.1.4.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 수득하였다.
실시예 1.2.3. IHD-W-VV02 바이러스 제조
상기 실시예 1.2.1.에서 제작한 IHD-W TK(sPD1-Fc) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.2.2.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W-VV02를 수득하였으며, 유전자 구조는 도 2에 도식화하였다.
실시예 1.2.4. IHD-W-VV02에서 sPD1-Fc 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 1.2.3.에서 제작한 재조합 IHD-W-VV02의 gDNA를 Nucleospin prep kit(Cat# 740956250)를 이용하여 수득하고, 하기 표 8의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 sPD1-Fc 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 IHD-W-VV02를 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 primary antibody는 anti-mPdcd1(E-18)(Santacruz, Cat# SC-10299), secondary antibody는 anti-Goat 이며, 발현 결과는 도 4에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 21
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 22
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 23
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 24
K3L 정방향 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT 서열번호 25
K3L 역방향 ACTGCGACGAGATACAACCGGA 서열번호 26
실시예 1.3. IHD-W-VV03 바이러스 제조
실시예 1.3.1. TK 유전자가 결실되고 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
pGL4.1-pHyb 플라스미드로부터 하기 표 9에 나타난 프라이머를 이용하여 pHyb 프로모터 DNA를 합성한 후, infusion cloning 방법으로 pGEM-T easy 벡터에 삽입하여 pGEM-T easy-pHyb를 제작하였다. 제작한 pGEM-T Easy-pHyb에 PH20 유전자를 삽입하기 위해 A549 세포의 gDNA로부터 PCR 과정을 통해 PH20 Exon2, Exon3, Exon4를 각각 합성하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 9에 나타내었다.
먼저 PH20-Exon2를 삽입하기 위해 pGEM-T easy-pHyb 플라스미드를 SpeI으로 처리하였다. PCR 과정을 통해 PH20-Exon2를 합성한 후, 선형화된 pGEM-T easy-pHyb에 infusion cloning 방법으로 삽입하여 pGEM-T easy-pHyb-PH20-Exon2 플라스미드를 제작하였다. 제작한 pGEM-T Easy-pHyb-PH20-Exon2 플라스미드를 SacI으로 처리하고, PCR 과정을 통해 PH20-Exon3, PH20-Exon4를 합성한 후 infusion cloning 방법으로 삽입하여, pGEM-T easy-pHyb-PH20을 제작하였다. 실시예 1.1.2.에서 제작한 IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 EcoRI 과 SalI으로 처리 한 후, pHyb-PH20 유전자 카세트를 Infusion cloning 방법으로 삽입하여, pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TK-R(IHD-W)(이하, "IHD-W TK(PH20) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다. Infusion cloning 과정에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 9에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
pHyb 프로모터 정방향 TGTCGACCTAGCACGCGTGTTTAAACGTT 서열번호 27
pHyb 프로모터 역방향 CAACAGTACCGGATTGCCAA 서열번호 28
Exon2 정방향 ACTGTTGAATACTAGATGGGAGTGCTAAAATTCAAGCAC 서열번호 29
Exon2 역방향 CCGCGAATTCACTAGAGCTCTTGAGAAAGGAATTTCAAAACTTGAT 서열번호 30
Exon3 정방향 AATTCCTTTCTCAAGATGAACTTGTGTATACATTTGGC 서열번호 31
Exon3 역방향 GAGCAAGCAAGATTTCATACTTCGCATTATACTGAGGGTT 서열번호 32
Exon4 정방향 AAATCTTGCTTGCTCCTAGACAATT 서열번호 33
Exon4 역방향 ATCCAACGCGTTGGGATCCGCATAAAAATGCATAAAAATTTATAGTGTGGAGGGTGAAGCATTG 서열번호 34
Infusion 정방향(PH20) TGGGCCCTATGTCGACCTAGCACGCGTGTTTAAA 서열번호 35
Infusion 역방향(PH20) AAATATAATAGAATTCGCTAGCGTTGGGATCCGCATAA 서열번호 36
실시예 1.3.2. IHD-W-VV03 바이러스 제조
상기 실시예 1.3.1.에서 제작한 IHD-W TK(PH20) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.2.2.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W-VV03를 수득하였고, 유전자 구조는 도 5에 도식화 하였다.
실시예 1.3.3. IHD-W-VV03에서 PH20 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 1.3.2.에서 제작한 재조합 IHD-W-VV03의 gDNA를 Nucleospin prep kit(Cat# 740956250)를 이용하여 수득하고, 하기 표 10의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 PH20 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 IHD-W-VV03를 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 primary antibody는 anti-hPH20(LsBio, Cat# LS-C331909), secondary antibody는 anti-Rabbit이며, 발현 결과는 도 7에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 37
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 38
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 39
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 40
K3L 정방향 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT 서열번호 41
K3L 역방향 ACTGCGACGAGATACAACCGGA 서열번호 42
실시예 1.4. IHD-W-VV04 바이러스 제조
실시예 1.4.1. K3L 유전자가 결실되고 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
pGL4.1-pI1L-B19R 플라스미드를 DNA 주형으로 하기 표 11의 프라이머로 증폭하여 pI1L-B19R 프로모터 DNA를 합성한 후, Infusion cloning 방법으로 삽입하여 pGEM-T Easy-pI1L-B19R 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드에 단일 펩타이드의 IL-12 유전자를 삽입하기 위해, pVAX1-IL-12 플라스미드를 DNA 주형으로 IL-12 p40과 p35 서브유닛 유전자를 하기 표 11의 프라이머로 증폭하였다. 이때, p40의 역방향 프라이머 5' 말단과 p35의 정방향 프라이머 3' 말단에 링커를 구성하는 서열을 삽입하였다. 상기에서 증폭한 IL-12 유전자를 XhoI으로 선형화시킨 pGEM-T Easy-pI1L-B19R 플라스미드에 infusion cloning 방법으로 삽입하여 pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12 플라스미드를 제작하였다. 상기 제작한 pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12 플라스미드와 상기 실시예 1.1.3.에서 제작한 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드에 각각 NotI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R 플라스미드를 제작하였다.
DH1 gDNA로부터 하기 표 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고 수득한 gusA 표시유전자를 pGEM-T easy에 삽입하여 pGEM-T easy-gusA를 제작하였다. 상기 플라스미드를 주형으로 하기 표 11의 primer를 이용하여 gusA 단편을 수득하고, 상기 제작한 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R 플라스미드를 BamHI과 SacII으로 처리한 후 infusion cloning으로 pSP72-K3L-L-p7.5-gusA-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R(이하, "IHD-W K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다. 상기 과정에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 11에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
pI1L-B19R 프로모터 정방향 ACTGTCGACTTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTT 서열번호 43
pI1L-B19R 프로모터 역방향 GTATCTCGAGTAGGCCTTTATACGGCACTAAAATATTTATATAATATC 서열번호 44
Infusion 정방향(IL-12 P40) TAAAGGCCTACTCGACATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC 서열번호 45
Infusion 역방향(IL-12 P40) CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCGGATCGGACCCTGCAGGGA 서열번호 46
Infusion 정방향(IL-12 P35) GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTAGGGTCATTCCAGTCTCTGGAC 서열번호 47
Infusion 역방향(IL-12 P35) GTGATTGTATCTCGAGTAGTCGACCTATAAAAACCTATAAAAACTCAGGCGGAGCTCAGATAGC 서열번호 48
PCR 정방향(gusA) ATCTGCAGAAGCTTCAATACTCGAGATGTTACGTCCTGTAGAAACCC 서열번호 49
PCR 역방향(gusA) CGTTCTAGAGTTAATTAATCATTGTTTGCCTCCCTGCTG 서열번호 50
Infusion 정방향(gusA) TATTGCACGGGGATCAGCTCGAGATGTTACGTCCT 서열번호 51
Infusion 역방향(gusA) AGTAATCGAATTCCCagaaaaatTCATTGTTTGCCTCC 서열번호 52
실시예 1.4.2. IHD-W-VV04 바이러스 제조
상기 실시예 1.4.1.에서 제작한 IHD-W K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.1.5.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W-VV04를 수득하였고, 유전자 구조는 도 8에 나타내었다.
실시예 1.4.3. IHD-W-VV04에서 IL-12 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 1.4.2.에서 제작한 재조합 IHD-W-VV04의 gDNA를 Maxwell purification kit(Cat# AS1330)를 이용하여 수득하고, 하기 표 12의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 9에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 IL-12 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 IHD-W-VV04를 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 primary antibody는 anti-mIL-12/IL-23 p40(R&D systems, Cat# MAB4991), secondary antibody는 anti-Rat이며, 발현 결과는 도 10에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 53
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 54
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 55
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 56
K3L 정방향 CGAATAGCCAAACGGCGAGAAG 서열번호 57
K3L 역방향 ACGGATACATGTGGAGCATCTATTA 서열번호 58
실시예 1.5. IHD-W-VV05 바이러스 제조
실시예 1.5.1. TK 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
실시예 1.1.2.에서 제작한 IHD-W TK 셔틀 플라스미드와 pGEM-T Easy-p7.5-sPD1-Fc 플라스미드를 NheI과 SalI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W) 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드와 pGEM-T Easy-pHyb-PH20 플라스미드를 SalI과 BamHI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)을 제작하였다. 상기 플라스미드에 표지유전자 EGFP를 삽입하기 위하여, IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 주형으로 PCR 과정을 통해 pSE/L-EGFP 유전자를 합성하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기 표 13에 나타내었다. pSP72 TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W) 셔틀 플라스미드를 PacI으로 처리하고, 상기 합성된 pSE/L-EGFP 유전자를 Infusion cloning 방법으로 삽입하여 pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)(이하, "IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드")를 제작하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
pSE/L-EGFP 정방향 CAGATAAAAATTAATTAAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAA 서열번호 59
pSE/L-EGFP 역방향 AGAGCTCAGATTAATATCGATTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 서열번호 60
실시예 1.5.2. IHD-W-VV05 바이러스 제조
상기 실시예 1.5.1.에서 제작한 IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.2.2.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W-VV05를 수득하였고, 유전자 구조는 도 11에 나타내었다.
실시예 1.5.3. 재조합 IHD-W 백시니아 IHD-W-VV05에서 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 1.5.2.에서 제작한 재조합 IHD-W-VV05의 gDNA를 Nucleospin prep kit(Cat# 740956250)를 이용하여 수득하고, 하기 표 14의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 12에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 sPD1-Fc 및 PH20 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 IHD-W-VV05를 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 sPD1-Fc 유전자의 primary antibody는 anti-mPdcd1(E-18)(Santacruz, Cat# SC-10299), secondary antibody는 anti-Goat이고, PH20 유전자의 primary antibody는 anti-hPH20(LsBio, Cat# LS-C331909), secondary antibody는 anti-Rabbit이며, 발현 결과는 도 13에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 61
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 62
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 63
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 64
K3L 정방향 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT 서열번호 65
K3L 역방향 ACTGCGACGAGATACAACCGGA 서열번호 66
실시예 1.6. IHD-W-VV06 바이러스 제조
실시예 1.6.1. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
상기 실시예 1.4.1.에서 제작한 IHD-W K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.5.2.에서 제작한 IHD-W-VV05를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W-VV06을 수득하였고, 유전자 구조는 도 14에 나타내었다.
실시예 1.6.2. IHD-W-VV06에서 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 1.6.1.에서 제작한 재조합 IHD-W-VV06의 gDNA를 Maxwell purification kit(Cat# AS1330)를 이용하여 수득하고, 하기 표 15의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 15에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 IHD-W-VV06을 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 sPD1-Fc 유전자의 primary antibody는 anti-mPdcd1(E-18)(Santacruz, Cat# SC-10299), secondary antibody는 anti-Goat이고, PH20 유전자의 primary antibody는 anti-hPH20(LsBio, Cat# LS-C331909), secondary antibody는 anti-Rabbit이고, IL-12 유전자의 primary antibody는 anti-mIL-12/IL-23 p40(R&D systems, Cat# MAB4991), secondary antibody는 anti-Rat이며, 발현 결과는 도 16에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 67
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 68
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 69
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 70
K3L 정방향 CGAATAGCCAAACGGCGAGAAG 서열번호 71
K3L 역방향 ACGGATACATGTGGAGCATCTATTA 서열번호 72
실시예 2. 재조합 WR 백시니아 바이러스 제조
실시예 2.1. WR-VV01 바이러스 제조
실시예 2.1.1. VGF 유전자 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
WR 백시니아 바이러스(ATCC, Cat No. VR-1354) 의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭한 후, 각각 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-VGF-L(WR), pGEM-T Easy-VGF-R(WR)을 제작하였다. VGF 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 16에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF-L 정방향(WR) CGCAGCTGTGTTATCGATTGATAGTGGTGTCCT 서열번호 73
VGF-L 역방향(WR) CTGCAGCGCTAGCACCGCATAATCTGATAGCTGGAATA 서열번호 74
VGF-R 정방향(WR) CGGGATCCGTTAATTAAACTCGACGAACTAAACTACCTATAC 서열번호 75
VGF-R 역방향(WR) CGATATCGGAAAATGTCTGTTAGTAAATAACCATC 서열번호 76
p11 프로모터 정방향 CGGCTAGCTCTAGAAGCGATGCTACGCTAG 서열번호 77
p11 프로모터 역방향 CAAGCTTCGGTTGCCTCGAGGAATTCATTTATAGCATAGAA 서열번호 78
LacZ 정방향 CGCTCGAGGGATCCCGTCGTTTTACAACGTC 서열번호 79
LacZ 역방향 AAGCTTCTTAATTAAGGATCCCCCCTGCCCGGTTATTATTATTTTTGACACCAGACCAACT 서열번호 80
VGF 유전자 위치에 재조합이 일어난 바이러스를 선별하기 위한 표지자로 p11 프로모터에 의해 발현이 조절되는 LacZ를 이용하였다. WR gDNA내의 p11 프로모터 부위를 PCR로 증폭하고 pAAV-LacZ(Stratagene, Cat No. 240071-52)내의 LacZ 유전자를 PCR로 증폭한 후 각각 pGEM-T Easy 및 pGEM-T에 삽입하여 pGEM-T Easy-p11 및 pGEM-T-LacZ를 각각 제작하였다. p11 프로모터와 LacZ의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 표 19에 나타내었다.
VGF 유전자의 기능이 일부 결실된 셔틀 플라스미드를 제작하기 위하여 pGEM-T Easy-VGF-L(WR)에 PvuII와 PstI을 처리하고, pSP72(Promega, Cat No. P2191)에 PvuII와 PstI을 처리한 벡터와 라이게이션하여 pSP72-VGF-L(WR)을 제작하였다. 또한 pGEM-T Easy-VGF-R(WR)을 EcoRV와 BamHI으로 처리하고, 위에서 제작한 pSP72-VGF-L(WR)을 EcoRV와 BamHI으로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)을 확보하였다. LacZ 발현 카세트를 도입하기 위하여 pGEM-T Easy-p11은 SalI과 NheI로 처리하고, pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)을 SalI과 NheI으로 처리한 벡터와 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)을 EcoRI과 PacI으로 처리한 후 앞서 제작한 pGEM-T-LacZ를 EcoRI과 PacI으로 자르고 라이게이션하여 VGF 셔틀 플라스미드인 pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(WR)(이하 “WR VGF(i) 셔틀 플라스미드”)을 완성하였다.
실시예 2.1.2. TK 유전자 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
WR 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 TK 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 확보하기 위하여, WR의 gDNA를 PCR로 증폭한 후 TK 유전자의 왼쪽과 오른쪽에 상동한 염기 서열 조각을 각각 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-TK-L(WR), pGEM-T Easy-TK-R(WR)을 제작하였다. TK 유전자의 양쪽과 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 17에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
TK-L 정방향(WR) AGGTCGACTTGCGATCAATAAATGGATCACAAC 서열번호 81
TK-L 역방향(WR) TTAGCTGCAGTATGCGGCCGCAACAATGTCTGGAAAGAACTGTCC 서열번호 82
TK-R 정방향(WR) CGGAATTCTGTGAGCGTATGGCAA 서열번호 83
TK-R 역방향(WR) TCGGGATCCTCAGTCTCATGTTCTCACCGG 서열번호 84
p7.5 프로모터 정방향 AGGAAGCTTTCCAAACCCACCCGCTTTTTAT 서열번호 85
p7.5 프로모터 역방향 GAATTCGCACTAGTTCCGATCGCCGTGCAATAAATTAGAATATACCC 서열번호 86
EGFP 정방향 CGCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG 서열번호 87
EGFP 역방향 TGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 서열번호 88
Gpt 정방향 CGACTAGTACACAAGACAGGCTTGCGAG 서열번호 89
Gpt 역방향 CGGAATTCGGCCCACTCATAAATCCAGTT 서열번호 90
pSE/L 프로모터 정방향 CGAGCTGCAGATAAAAATTAATTAATTACCCGGGTACCAGGCCTAGATCTGTCGACTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTCGGGATCCGCAA 서열번호 91
pSE/L 프로모터 역방향 TTGCGGATCCCGAAGCTTAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAGCTCGAGTCGACAGATCTAGGCCTGGTACCCGGGTAATTAATTAATTTTTATCTGCAGCTCG 서열번호 92
TF 정방향 ATCGGCGGCCGCTTTTTATCTGCGCGGTTAACCGCCTTTTTATCCATCAGGTGATCTGTTTTTATTGTGGAGCTGCAGCGAT 서열번호 93
TF 역방향 ATCGCTGCAGCTCCACAATAAAAACAGATCACCTGATGGATAAAAAGGCGGTTAACCGCGCAGATAAAAAGCGGCCGCCGAT 서열번호 94
TK 유전자 위치에 재조합이 일어난 바이러스를 선별하기 위한 표지자로 pSE/L 프로모터에 의해 발현이 조절되는 EGFP와 p7.5 프로모터에 의해 발현이 조절되는 Gpt를 이용하였다. WR gDNA를 주형으로 PCR 하여 p7.5 프로모터 부위를 증폭하였고, pEGFP-N3(Clontech, Cat No. 6080-1)내의 EGFP 유전자와 DH5α(Takara, Cat No. 9057)내의 Gpt 유전자 또한 PCR로 증폭한 후 각각을 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-p7.5, pGEM-T Easy-EGFP 및 pGEM-T Easy-Gpt를 각각 제작하였다. 또한 프라이머 어닐링을 통해 pSE/L 프로모터 및 TF를 제작하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 상기 표 17에 나타내었다.
pGEM-T Easy-p7.5와 어닐링한 pSE/L 프로모터를 각각 BamHI와 PstI으로 처리하고 라이게이션하여 pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5를 제작하였다. 제작된 pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5와 pGEM-T Easy-EGFP를 각각 BglII와 XhoI으로 처리한 후 라이게이션하여 pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5를 제작하였다.
TK 유전자의 기능이 일부 결실된 셔틀 플라스미드를 제작하기 위하여 pSP72를 EcoRI과 BglII로 처리하고, pGEM-T Easy-TK-R(WR)은 EcoRI과 BamHI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-TK-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-TK-R(WR)을 XhoI과 PstI으로 처리하고, SalI과 PstI으로 처리한 pGEM-T Easy-TK-L과 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TK-R(WR)을 제작하였다. EGFP 발현 카세트의 도입을 위하여, 제작된 pSP72-TK-L-TK-R(WR)과 pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5를 각각 EcoRI와 PstI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)을 제작하였다.
또한, 제작된 pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)과 어닐링한 TF 올리고머를 각각 PstI과 NotI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)을 제작하였다. Gpt 발현 카세트를 도입하기 위하여, 제작된 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)과 pGEM-T Easy-Gpt를 각각 EcoRI과 SpeI으로 처리한 후 라이게이션하여 TK 셔틀 플라스미드인 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(WR)을(이하 “WR TK(i) 셔틀 플라스미드”) 최종 제작하였다.
실시예 2.1.3. K3L 유전자 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
WR 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로 왼쪽에 위치한 유전자와 K3L 유전자 일부를 PCR로 증폭하였다. 이때 K3L 유전자의 시작 코돈은 K3L-L 서열 바로뒤에 두어 증폭하였으며, K3L 유전자 왼쪽의 상동한 염기서열 증폭에 사용된 프라이머는 하기 표 18에 나타내었다. 이때, K3L 유전자의 시작 코돈을 제외한 이후 부분을 포함하여 증폭한 K3L-L-K3Li(WR) 단편을 수득한 후 pGEM-T Easy 벡터와 라이게이션하여 pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)를 제작하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
K3L-Li 정방향 TGTACGTATATTTAGATGTTTTCAGCT 서열번호 95
K3L-Li 역방향 ATAAGCTTCTTGCATTTTGTTATTCGT 서열번호 96
K3L-Ri 정방향 CGCAGATAAAAACATATCCTTGTTAAC 서열번호 97
K3L-Ri 역방향 GTTAACAAGGATATGTTTTTATCTGCG 서열번호 98
실시예 1.1.3.에서 제작한 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드와 pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)을 SnaBI 과 HindIII로 처리하고, 라이게이션을 통해 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR)에 K3L의 시작 코돈을 도입하기 위해 상기 표 18에 나타낸 프라이머를 이용하여 point mutation을 수행하였으며, 최종적으로 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3LATG-K3L-R(WR)(이하 “WR K3L(i) 셔틀 플라스미드”)을 제작하였다.
실시예 2.1.4. VGF 및 TK 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 제조
먼저, WR VGF(i) 셔틀 플라스미드와 WR 야생형 바이러스를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 Vi를 수득하였다. 그 후, WR TK(i) 셔틀 플라스미드 및 재조합 WR 백시니아 바이러스 Vi를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 및 TK 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTi를 수득하였다.
실시예 2.1.5. WR-VV01 바이러스 제조
먼저, WR K3L(i) 셔틀 플라스미드와 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTi를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4과 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 WR-VV01를 수득하였으며, 유전자 구조는 도 17에 도식화하였다.
실시예 2.2. WR-VV06 바이러스 제조
실시예 2.2.1. TK 유전자 발현이 비활성화되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
먼저, 실시예 2.1.2.에서 제작한 WR TK(i) 셔틀 플라스미드와 실시예 1.2.1.에서 제작한 IHD-W TK(sPD1-Fc) 셔틀 플라스미드를 각각 BamHI과 EcoRI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-TF-EGFP-pSE/L-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR)(이하, "WR TKi(sPD1-Fc) 셔틀 플라스미드")를 제작하였다. 이후, 실시예 1.3.1.에서 제작한 IHD-W TK(PH20) 셔틀 플라스미드를 각각 BamHI과 PacI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR)(이하, "WR TKi(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다.
실시예 2.2.2. K3L 유전자 발현이 비활성화되고 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
WR K3Li 셔틀 플라스미드 내부의 유전자 발현 카세트를 제작하기 위하여 실시예 2.1.3.에서 제작한 WR K3Li 셔틀 플라스미드와 실시예 1.4.1.에서 제작한 IHD-W K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드를 SalI 처리하고 라이게이션하여 pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF_K3L-R(WR)(이하, "WR K3Li(IL-12) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다.
실시예 2.2.3. WR-VV06 바이러스 제조
먼저, 상기 실시예 2.1.3.에서 제작한 WR K3Li 셔틀 플라스미드와 실시예 2.1.4.에서 제작한 재조합 WR 백시니아 바이러스 Vi를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 K3L 유전자 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViKi를 수득하였다.
상기 실시예 2.2.1.에서 제작한 WR TKi(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드와 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViKi를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자 발현이 비활성화되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 WR 백시니아 바이러스 WR-VV05를 수득하였다.
상기 실시예 2.2.2.에서 제작한 WR K3Li(IL-12) 셔틀 플라스미드와 재조합 WR-VV05를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자 발현이 비활성화되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 WR-VV06을 수득하였고, 유전자 구조는 도 18에 나타내었다.
실시예 2.2.4. WR-VV06에서 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 2.2.2.에서 제작한 재조합 WR-VV06의 gDNA를 Maxwell purification kit(Cat# AS1330)를 이용하여 수득하고, 하기 표 19의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 gDNA의 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 19에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다.
삽입된 sPD1-Fc 및 PH20 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 WR-VV06을 0.05 MOI로 44 내지 52시간 처리하였다. 그 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20시간 배양하고, 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 sPD1-Fc 유전자의 primary antibody는 anti-mPdcd1(E-18)(Santacruz, Cat# SC-10299), secondary antibody는 anti-Goat이고, PH20 유전자의 primary antibody는 anti-hPH20(LsBio, Cat# LS-C331909), secondary antibody는 anti-Rabbit이며, 발현 결과는 도 20a에 나타내었다.
또한 삽입된 IL-12 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 ELISA를 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 WR-VV06을 0.05 MOI로 처리하고 44 내지 52시간 후 배지만 분리하여 발현된 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 Mouse IL-12 p70 Quantikine ELISA kit(R&D Systems, Cat# M1270)를 이용하여 단백질의 발현량을 확인하였다. 이때, 단백질 원액을 1/5,000으로 희석하여 사용하였고 측정 결과는 도 20b에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 99
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 100
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 101
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 102
K3L 정방향 CGAATAGCCAAACGGCGAGAAG 서열번호 103
K3L 역방향 ACGGATACATGTGGAGCATCTATTA 서열번호 104
실시예 3. 재조합 Lister 백시니아 바이러스 제조
실시예 3.1. Lister-VV01 바이러스 제조
실시예 3.1.1. VGF 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
먼저, Lister 백시니아 바이러스(ATCC, VR-1549)의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양 옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭한 후, 각각 pGEM-T easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-VGF-L(Lister), pGEM-T Easy-VGF-R(Lister)를 제작하였다. VGF 유전자 양 옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 20에 나타내었다.
pSP72 벡터와 pGEM-T Easy-VGF-L(Lister)를 각각 HindIII 및 SalI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-VGF-L(Lister)을 제작하였다. 또한, 상기 pSP72-VGF-L(Lister) 및 pGEM-T Easy-VGF-R(Lister)를 각각 PacI 및 KpnI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister)를 제작하였다.
제작된 pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister) 벡터 및 실시예 1.1.1.에서 제작한 IHD-W VGF 셔틀 플라스미드를 각각 NheI 및 PacI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(Lister)(이하 "Lister VGF 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
이름 서열(5' → 3') 서열번호
VGF-L 정방향(Lister) ATGAAGCTTTAAAACTTGTCTGTATATGTAAGATGTTT 서열번호 105
VGF-L 역방향(Lister) ACCCGGGTTTAATTAACATGCTAGCGTGTAAATAATATAAAAATAACAATACAATATTG 서열번호 106
VGF-R 정방향(Lister) GCTTAATTAAGGCGGCCGCTTTTTATAAATTTTTTTTATGAGTATTTTTACAAAAAT 서열번호 107
VGF-R 역방향(Lister) TCCCGGGCATCGATAGTACAATAACTTTTATGAAAT 서열번호 108
실시예 3.1.2. TK 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
Lister 백시니아 바이러스(ATCC, VR-1549)의 게놈 DNA에서 TK 유전자를 중심으로 양 옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭한 후, 각각 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-TK-L(Lister), pGEM-T Easy-TK-R(Lister)를 제작하였다. TK 유전자 양 옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 21에 나타내었다.
pGEM-T Easy-TK-L(Lister) 벡터와 pGEM-T Easy-TK-R(Lister)를 각각 BamHI 및 XmaI으로 처리하고 라이게이션하여 pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister)을 제작하였다. 또한, pSP72 벡터와 pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister)을 각각 SpeI 및 XmaI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TK-R(Lister)을 제작하였다.
제작된 pSP72-TK-L-TK-R(Lister) 벡터 및 실시예 1.1.2.에서 제작한 IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 각각 NotI 및 SalI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TK-R(Lister)(이하 "Lister TK 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
이름 서열(5' → 3') 서열번호
TK-L 정방향(Lister) CCCCGGGATAGGATCCATAGTCGACTTTAATTAATGCGGCCGCATGACAATAAAGAATTAATTATTGTTCAC 서열번호 109
TK-L 역방향(Lister) AGACTAGTCCCTCTTCAAGAACCCATTAG 서열번호 110
TK-R 정방향(Lister) CCCCGGGGCTTTAGTAGTAGGAAATGTTTTATTG 서열번호 111
TK-R 역방향(Lister) TAAGGATCCTCTGCTAGCTATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAAAAATAAACAT 서열번호 112
실시예 3.1.3. K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
상기 실시예 1.1.3.에서 제작한 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드를 BglII과 EcoRV으로 처리하고, Lister 백시니아 바이러스의 게놈(ATCC, VR-1549) DNA에서 K3L 유전자의 오른편에 위치한 유전자들(R-arm)을 PCR로 증폭한 후 Infusion cloning 방법으로 삽입하여 pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)을 제작하였다.
제작된 pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)을 XhoI와 HindIII으로 처리하고, Lister 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자의 왼편에 위치한 유전자들(L-arm)을 PCR로 증폭한 후 Infusion cloning 방법으로 삽입하여 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)(이하, "Lister K3L 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다. Infusion cloning 과정에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 22에 나타내었다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
K3L-L 정방향(Lister) CACTATAGAACTCGAGCATATGTTTAAACGACGCATTATCTG 서열번호 113
K3L-L 역방향(Lister) TGGGTTTGGAAAGCTTTTTTTATACCGAACATAAAAATAAGG 서열번호 114
K3L-R 정방향(Lister) CGCAGATAAAAAGATATCCTTGTTAACGGGCTCGTAAATTG 서열번호 115
K3L-R 역방향(Lister) GGAGACCGGCAGATCTTGATAATACACATATTTATTTAGGAAGCG 서열번호 116
실시예 3.1.4. VGF 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 제조
Lister 야생형 백시니아 바이러스와 상기 실시예 3.1.1.에서 제작한 Lister VGF 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 V를 수득하였다.
실시예 3.1.5. VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 제조
상기 실시예 3.1.4.에서 제작한 재조합 Lister 백시니아 바이러스 V와 상기 실시예 3.1.2.에서 제작한 Lister TK 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VT를 수득하였다.
실시예 3.1.6. Lister-VV01 바이러스 제조
상기 실시예 3.1.5.에서 제작한 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VT와 상기 실시예 3.1.3.에서 제작한 Lister K3L 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister-VV01을 수득하였으며, 유전자 구조는 도 21에 도식화하였다.
실시예 3.2. Lister-VV06 바이러스 제조
실시예 3.2.1. TK 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
실시예 3.1.2.에서 제작된 pSP72-TK-L-TK-R(Lister) 벡터 및 실시예 1.5.1에서 제작한 IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드를 각각 NotI 및 NheI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(Lister)(이하 "Lister TK(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
실시예 3.2.2. K3L 유전자가 결실되고 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 플라스미드 제작
Lister K3L 셔틀 플라스미드 내부의 유전자 발현 카세트를 제작하기 위하여 실시예 3.1.3.에서 제작한 Lister K3L 셔틀 플라스미드와 실시예 1.4.1.에서 제작한 IHD-W K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드를 SalI 처리하고 라이게이션하여 pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R(Lister)(이하, "Lister K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드")를 최종 제작하였다.
실시예 3.2.3. Lister-VV06 바이러스 제조
먼저, 상기 실시예 3.1.4.에서 제작한 재조합 Lister 백시니아 바이러스 V와 상기 실시예 3.1.3.에서 제작한 Lister K3L 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4와 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VK를 수득하였다.
상기 실시예 3.2.1.에서 제작한 Lister TK(sPD1-Fc+PH20) 셔틀 플라스미드와 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VK를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 및 PH20 유전자의 발현이 유도된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 Lister-VV05를 수득하였다.
상기 실시예 3.2.2.에서 제작한 Lister K3L(IL-12) 셔틀 플라스미드와 재조합 Lister-VV05를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1.4.와 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 Lister-VV06을 수득하였고, 유전자 구조는 도 22에 나타내었다.
실시예 3.2.4. Lister-VV06에서 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 삽입 및 발현 확인
상기 실시예 3.2.3.에서 제작한 재조합 Lister-VV06의 gDNA를 Maxwell viral total nucleic acid purification kit(Promega, Cat# AS1330)를 이용하여 수득하고, 하기 표 23의 프라이머를 이용하여 재조합 바이러스 Lister-VV06의 gDNA 구조를 확인하였다. 각 VGF, TK, K3L 위치의 DNA 구조 결과는 도 23에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 유전자 삽입 위치의 PCR 조각 사이즈가 변동된 것을 확인하였다. 삽입된 sPD1-Fc 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 Lister-VV06을 0.05 MOI로 감염시켜 44 내지 52시간 후 우태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 갈아주어 16 내지 20 시간 배양한 뒤 배지와 세포를 분리하여 각각 단백질을 수득하였다.
준비된 단백질을 브래드포드(Bradford) 어세이방법으로 정량한 후, 웨스턴 블롯을 통해 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 이때 사용한 primary antibody는 anti-mPdcd1(E-18)(Santacruz, Cat# SC-10299), secondary antibody는 anti-Goat이었다. 또한, 삽입된 PH20 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이때 사용한 primary antibody는 각 anti-hPH20(LsBio, Cat# LS-C331909), secondary antibody는 anti-Rabbit이며, 발현 결과는 도 24a에 나타내었다. 또한 삽입된 IL-12 유전자가 재조합 바이러스를 매개로 감염 세포에서 발현하는 것을 확인하고자 ELISA를 수행하였다. 먼저, HeLa 세포에 재조합 Lister-VV06을 0.05 MOI로 감염시킨 후 44 내지 52시간 후에 배지만 분리하여 발현된 단백질을 수득하였다. 준비된 단백질을 Mouse IL-12 p70 Quantikine ELISA kit(R&D Systems, Cat# M1270)를 이용하여 단백질의 발현량을 확인하였다. 이때, 단백질 원액을 1/5,000으로 희석하여 사용하였고 측정 결과는 도 24b에 나타내었다.
이름 서열(5' → 3') 서열번호
VGF 정방향 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG 서열번호 117
VGF 역방향 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA 서열번호 118
TK 정방향 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT 서열번호 119
TK 역방향 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA 서열번호 120
K3L 정방향 GACGCTGAACACGCTAACGATAGT 서열번호 121
K3L 역방향 ACTGCGACGAGATACAACCGGA 서열번호 122
Ⅱ. In vivo 에서 재조합 백시니아 바이러스의 종양 살상능 확인
실험예 1. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되고 sPD1-Fc 또는 PH20 또는 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 IHD-W strain 백시니아 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
실험예 1.1. IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 및 IHD-W-VV05 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 및 IHD-W-VV05간 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
대장암 모델
먼저, 대장암 세포주인 CT26.WT를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(RPMI 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 1x106개를 BALB/c 마우스(BALB/cAnHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 대장암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 4마리씩 PBS, IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 및 IHD-W-VV05 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x107 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군 및 IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 1.2. IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV05 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV05간 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
피부암 모델
다음으로, 피부암 세포주인 B16F10을 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(DMEM 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 5x105개를 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 피부암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV05 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 12일차 종양 부피 측정 결과, IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV01 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다. PBS 투여군의 경우, 바이러스 투여 12일차 전 이미 종양 부피가 평균 2,000 mm3 에 도달하였기에 안락사함으로써 제외되었다.
폐암 모델
다음으로, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS 투여군, IHD-W-VV01 투여군과 IHD-W-VV05 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, IHD-W-VV01 투여군, IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV01 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 1.3. IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 및 IHD-W-VV06 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 및 IHD-W-VV06간 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
대장암 모델
먼저, 대장암 세포주인 CT26.WT를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(RPMI 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 1x106개를 BALB/c 마우스(BALB/cAnHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 대장암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 4마리씩 PBS, IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x107 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 종양 부피 측정 결과, IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군, IHD-W-VV04 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군 및 IHD-W-VV04 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
폐암 모델
다음으로, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군, IHD-W-VV04 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군, IHD-W-VV04 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV02 투여군, IHD-W-VV03 투여군 및 IHD-W-VV04 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 1.4. IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06의 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
대장암 모델
먼저, 대장암 세포주인 CT26.WT를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(RPMI 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 1x106개를 BALB/c 마우스(BALB/cAnHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 대장암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 4마리씩 PBS, IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x107 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 종양 부피 측정 결과, IHD-W-VV05 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
피부암 모델
다음으로, 피부암 세포주인 B16F10을 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(DMEM 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 5x105개를 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 피부암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 12일차 종양 부피 측정 결과, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다. PBS 투여군의 경우, 바이러스 투여 12일차 전 이미 종양 부피가 평균 2,000 mm3 에 도달하였기에 안락사함으로써 제외되었다.
폐암 모델
다음으로, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, IHD-W-VV05 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, IHD-W-VV05 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV05 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 2. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실 또는 발현이 비활성화 되고 sPD1-Fc 또는 PH20 또는 IL-12 유전자의 발현이 유도된 다양한 재조합 백시니아 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
실험예 2.1. IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06의 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다
피부암 모델
다음으로, 피부암 세포주인 B16F10을 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(DMEM 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 5x105개를 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 피부암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 4마리씩 PBS, IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리한 후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 ul로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 종양 부피 측정 결과, IHD-W-VV01 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다. PBS 투여군의 경우, 바이러스 투여 12일차 전 이미 종양 부피가 평균 2,000 mm3 에 도달하였기에 안락사함으로써 제외되었다.
폐암 모델
다음으로, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, IHD-W-VV01 및 IHD-W-VV06 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, IHD-W-VV01 투여군 및 IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, IHD-W-VV06 투여군의 종양 부피가 IHD-W-VV01 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 2.2. WR-VV01 및 WR-VV06 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 2에서 제작한 재조합 WR-VV01 및 WR-VV06의 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
폐암 모델
먼저, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, WR-VV01 및 WR-VV06 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, WR-VV01 투여군 및 WR-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, WR-VV06 투여군의 종양 부피가 WR-VV01 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
실험예 2.3. Lister-VV01 및 Lister-VV06 바이러스의 동물모델 암 억제 효능 확인
상기 실시예 3에서 제작한 재조합 Lister-VV01 및 Lister-VV06의 항종양 효과를 마우스 모델에서 비교하였다.
폐암 모델
먼저, 폐암 세포주인 LLC1을 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine 및 1% antibiotics-antimycotics(GIBCO, Cat No. 15240-062)로 조성된 DMEM 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세 번의 계대배양 후 마지막 계대 배양 시 세포가 배양 plate의 70-80%의 면적만큼 차지했을 때 세포를 수확하였다. 수확한 세포의 상등액을 제거하고, 부형제(DMEM)를 첨가하여 세포의 농도가 1x107/mL가 되도록 준비하였다. 준비된 세포 1x106개가 포함된 세포 현탁액을 C57BL/6N 마우스(C57BL/6NHsd; Koatech, Korea)의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 폐암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 부피가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, Lister-VV01 및 Lister-VV06 투여군으로 분리하였다. 이후 PBS(Welgene, Cat No. LB001-02) 50 ul 혹은 각 바이러스를 1x106 TCID50/50 uL로 종양 내 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 종양의 부피를 확인한 결과를 도 36에 나타내었다.
도 36에 나타난 바와 같이 바이러스 처리 후 14일차 암세포 크기 측정 결과, Lister-VV06 투여군의 종양 부피가 PBS 투여군의 종양 부피에 비해 작은 것을 확인하였다. 바이러스 투여 군간 종양 부피를 비교했을 때, Lister-VV06 투여군의 종양 부피가 Lister-VV01 투여군의 종양 부피 비해 작은 것을 확인하였다.
Ⅲ. VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 비활성화되거나 결실되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 백시니아 바이러스의 in vitro 세포 살상능 확인
실험예 1. IHD-W-VV06, WR-VV06, Lister-VV06 투여에 따른 암세포 살상 효능 확인
상기 실시예 1에서 생산한 재조합 백시니아 바이러스 IHD-W-VV06, 실시예 2에서 생산한 재조합 백시니아 바이러스 WR-VV06, 실시예 3에서 생산한 재조합 백시니아 바이러스 Lister-VV06이 다양한 종류의 암세포를 대상으로 살상능을 나타내는지 확인하기 위하여 CCK-8 분석을 수행하였다.
다양한 쥐(mouse) 암세포주에서 재조합 바이러스의 세포 살상능을 확인하기 위하여 하기 표 24에 나타낸 바와 같이 암 세포주를 준비하고, 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양한 후, 이를 96-웰 플레이트에 분주하였다.
암종 세포주 사용 배지(배양 배지: 우태아 혈청 10% 포함)
대장암 CT26-WT 2% 우태아 혈청과 2 mM 엘-글루타민이 포함된 RPMI 배지
신장암 Renca 2% 우태아 혈청과 2 mM 엘-글루타민이 포함된 RPMI 배지
간암 Hep-55.1C 2% 우태아 혈청과 4 mM 엘-글루타민이 포함된 DMEM 배지
폐암 LLC1 2% 우태아 혈청과 2 mM 엘-글루타민이 포함된 DMEM 배지
유방암 JC 2% 우태아 혈청과 2 mM 엘-글루타민이 포함된 RPMI 배지
유방암 4T1 2% 우태아 혈청과 2 mM 엘-글루타민이 포함된 RPMI 배지
직장암 CMT93 2% 우태아 혈청과 4 mM 엘-글루타민이 포함된 DMEM 배지
흑색종 B16F10 2% 우태아 혈청과 4 mM 엘-글루타민이 포함된 DMEM 배지
이때, 웰당 세포수는 CT26-WT, Hep-55.1C는 2 X 104개, Renca, LLC1, 4T1, CMT93 및 B16F10은 1 X 104개, JC는 2 X 103개가 되도록 분주하였다. 배양 24시간 후, 각 재조합 바이러스의 야생형 바이러스가 갖는 세포 살상능을 고려하여 다음과 같이 재조합 백시니아 바이러스 IHD-W-VV06 를 1 MOI, WR-VV06 를 1 MOI, Lister-VV06 를 10 MOI가 되도록 상기 세포주에 감염시켰다. 이때, 각 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 3일 후, CCK-8(Dojindo, Cat No. CK04) 용액으로 세포를 염색하여 암세포주 생존율을 확인한 결과를 도 37에 나타내었다
도 37에 나타낸 바와 같이, 백시니아 종(strain)에 관계 없이 VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 비활성화되거나 결실되고 sPD1-Fc, PH20 및 IL-12 유전자의 발현이 유도된 재조합 백시니아 바이러스가 다양한 종류의 암세포에 대한 살상능이 있음을 확인하였다.

Claims (19)

  1. sPD-1(soluble programmed cell death protein-1)을 코딩하는 유전자, 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 코딩하는 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 sPD-1은 서열번호 131 또는 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 sPD-1을 코딩하는 유전자는 서열번호 132 또는 서열번호 134의 염기 서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 히알루로니다아제는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 히알루로니다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 136의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 IL(interleukin)-12를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 IL-12는 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 IL-12를 코딩하는 유전자는 서열번호 138 내지 서열번호 140 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 K3L를 코딩하는 유전자, TK(thymidine kinase)를 코딩하는 유전자, VGF(vaccinia growth factor)를 코딩하는 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 발현이 억제된 것인, 재조합 백시니아 바이러스.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White), 이들의 변이체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 재조합 백시니아 바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 IHD-W인, 재조합 백시니아 바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료 방법.
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