WO2023048532A1 - 레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도 - Google Patents

레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023048532A1
WO2023048532A1 PCT/KR2022/014373 KR2022014373W WO2023048532A1 WO 2023048532 A1 WO2023048532 A1 WO 2023048532A1 KR 2022014373 W KR2022014373 W KR 2022014373W WO 2023048532 A1 WO2023048532 A1 WO 2023048532A1
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WO
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reovirus
cancer
virus
gene
epitope
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PCT/KR2022/014373
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유행준
미셸 알랭토미
한상경
이연숙
시앙샤오
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바이로큐어 주식회사
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel vaccine platform based on a reovirus and its use.
  • Viruses are small, non-cellular organisms made up of genetic material and proteins, and there are different types of viruses.
  • a virus can be a DNA virus that replicates within the host's nucleus, or an RNA virus that replicates within the cytoplasm of a cell.
  • Viruses can be double-stranded or single-stranded.
  • single-stranded RNA viruses can be positive (+, sense) stranded or negative (-) stranded.
  • Vaccination is the most important measure of protection today to combat viral infections and limit their spread. Modern vaccines, in principle, induce the formation of antibodies against surface viral antigens. Vaccine effectiveness is directly dependent on the degree of correspondence between the antigenic structure of the virus contained in the vaccine and the strain circulating in the population. The surface proteins of most viruses undergo constant antigenic variation (antigenic drift) and require continuous renewal of the vaccine strain composition.
  • the development of highly immunogenic and safe vaccines that induce a broad-spectrum immune response is currently one of the major challenges facing effective cancer or infectious disease prevention.
  • In order to prevent the spread and continuous infection of global pandemic diseases such as the recently spread SARS-CoV-2 caused by coronavirus infection-19 (COVID-19), it is necessary to develop a vaccine. Accordingly, many virus-based vaccines are currently being developed worldwide using platforms such as vesicular stomatitis virus (VSV), measles virus (MeV), adenovirus (Ad), and baculovirus.
  • VSV vesi
  • oncolytic virus is a virus capable of self-replication and selectively infects, proliferates, and kills only cancer cells, not normal cells. Destruction of tumor cells by an anticancer virus induces infection of surrounding tumor cells again, and this phenomenon is repeated to amplify the anticancer effect.
  • anticancer viruses in addition to directly attacking cancer cells, anticancer viruses also have a function of inhibiting the generation of new blood vessels through infection in vascular endothelial cells of tumors.
  • Reovirus is a representative anticancer virus.
  • Reoviruses are viruses characterized as being non-enveloped and infect cells via the oral-fecal route.
  • the genome of reovirus has 10 split dsRNAs encoding 8 structural proteins and 3 non-structural proteins.
  • Mammalian reoviruses have T1L (Lang), T2J (Jones), T3D (Dearing), T3A (Abney), and T4N (Ndelle). It is known that reovirus can efficiently infect and lyse cancer cells.
  • clinical trials for intratumoral or intravenous administration of reovirus were conducted to confirm high therapeutic stability and anticancer efficacy.
  • anticancer virus immunotherapeutic agents have high entry barriers due to the high difficulty of development and production technology.
  • the present invention was made to solve the above problems, and the mutant S1 gene of the reovirus can be fused with an exogenous epitope-coding gene, and thus can be used as a vaccine platform for the prevention and treatment of various diseases It is completed by checking the .
  • an object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a mutant S1 gene of a reovirus and an exogenous epitope-encoding gene.
  • Another object of the present invention is to provide a mutant S1 protein in which an exogenous epitope-encoding gene is fused.
  • Another object of the present invention is to provide a cell into which the recombinant vector according to the present invention is introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant reovirus comprising a mutant S1 gene and an exogenous epitope-encoding gene.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising, as an active ingredient, the recombinant vector according to the present invention, a cell into which the vector has been introduced, or a reovirus expressed from the recombinant vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of viral infection comprising a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and a viral epitope-encoding gene as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and a tumor antigen epitope-encoding gene.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a reovirus mutant S1 gene and an exogenous epitope-coding gene, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the mutant S1 gene may be characterized in that it encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, but is not limited thereto.
  • the mutant S1 gene may be characterized in that it comprises any one polynucleotide sequence selected from the group consisting of, but is not limited thereto:
  • the exogenous epitope-encoding gene may be characterized in that it is located downstream of the mutant S1 gene, but is not limited thereto.
  • mutant S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene may be co-expressed to produce a fusion protein, but is not limited thereto.
  • the exogenous epitope may be one or more epitopes selected from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, allergens, and tumor antigens, but is not limited thereto.
  • the virus is SARS-CoV-2 virus, norovirus, influenza virus, Ebola virus, human papillomavirus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, Marburg virus , human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, rabies virus, human immunodeficiency virus, dengue virus, polio virus, cytomegalovirus, dengue fever virus, yellow fever virus, adenovirus, Japanese encephalitis virus, smallpox virus, and Zika virus It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the tumor antigen is Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13R ⁇ 2 (Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM (Neural cell adhesion molecule), FBP (Folate binding protein), Le(Y) (Lewis-Y antigen), PSCA (Prostate stem cell antigen), PSMA (Prostate-specific membrane antigen), CEA (Carcinoembryonic antigen), HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6 (Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1 (receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1 (folate receptor), It may be one or more selected from the group consisting of WT1 (Wilm's tumor antigen), V
  • the recombinant vector may further include one or more genes selected from the group consisting of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4, but is not limited thereto no.
  • the present invention provides a mutant sigma 1 protein fused with the exogenous epitope expressed from the recombinant vector.
  • the present invention provides a cell into which the recombinant vector is introduced.
  • the cells may be further introduced with a vector containing one or more genes selected from the group consisting of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4 of reovirus.
  • a vector containing one or more genes selected from the group consisting of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4 of reovirus.
  • the present invention provides a recombinant reovirus comprising a mutant S1 gene and an exogenous epitope-coding gene, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at codon 251 from the start codon.
  • the reovirus may express the exogenous epitope, but is not limited thereto.
  • said exogenous epitope is expressed as an extrinsic capsid protein.
  • the recombinant reovirus may be produced from a cell into which the recombinant vector according to the present invention is introduced, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising, as an active ingredient, the recombinant vector according to the present invention, a cell into which the recombinant vector is introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell.
  • the vaccine may be a vaccine for preventing infectious diseases and/or cancer.
  • said infectious disease and/or cancer may be a disease and/or cancer associated with said exogenous epitope.
  • the present invention provides a use of the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector is introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell for the production of a vaccine for preventing infectious diseases and/or cancer.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and a viral epitope-encoding gene, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a virus comprising, as an active ingredient, a recombinant reovirus produced from the cell
  • the mutant S1 gene provides a pharmaceutical composition for preventing or treating viral infections, characterized in that it has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and a viral epitope-encoding gene, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a virus comprising, as an active ingredient, a recombinant reovirus produced from the cell
  • the mutant S1 gene provides a food composition for preventing or improving viral infections, characterized in that it has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the food composition includes a health functional food composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a viral infection, comprising administering the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell to a subject in need thereof do.
  • the present invention provides a use of the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell for the production of a drug for preventing or treating a viral infection.
  • the present invention provides a use of the recombinant vector, cells into which the recombinant vectors have been introduced, or recombinant reovirus produced from the cells to prevent or treat viral infections.
  • the virus is SARS-CoV-2 virus, norovirus, influenza virus, Ebola virus, human papillomavirus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, Marburg virus, to human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, rabies virus, human immunodeficiency virus, dengue fever virus, polio virus, cytomegalovirus, dengue fever virus, yellow fever virus, adenovirus, Japanese encephalitis virus, smallpox virus, and zika virus It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention is directed to a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and an epitope-encoding gene of a tumor antigen, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus generated from the cell as an active ingredient,
  • the mutant S1 gene provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, characterized in that it has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the present invention is directed to a recombinant vector containing a mutant S1 gene of a reovirus and an epitope-encoding gene of a tumor antigen, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus generated from the cell as an active ingredient,
  • the mutant S1 gene provides a food composition for preventing or improving cancer, characterized in that it has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the food composition includes a health functional food composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell to a subject in need thereof. .
  • the present invention provides a use of the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector is introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell for the production of a drug for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a use of the recombinant vector, a cell into which the recombinant vector has been introduced, or a recombinant reovirus produced from the cell for preventing or treating cancer.
  • the tumor antigen is Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13R ⁇ 2 (Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3 , CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen) ), HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6 (Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1 (receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1 (folate receptor), WT1 (Wilm's tumor antigen), VEGFR2 (Vascular end
  • the cancer is squamous cell carcinoma, lung cancer, adenocarcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, melanoma, cutaneous melanoma, intraocular melanoma, rectal cancer, perianal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, Endocrine cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, blood cancer, liver cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine cancer, It may be at least one selected from the group consisting of salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, and brain cancer, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a novel vaccine platform based on a reovirus, in which a part of the S1 gene of a reovirus can be replaced with various exogenous epitope-coding genes, and the recombinant reovirus prepared through this infects a target cell and has an epitope It was completed by confirming that diseases related to the epitope can be effectively prevented and treated by not only inducing expression, but also activating the immune function of immune cells for the epitope.
  • vaccines carrying various epitopes can be prepared through relatively simple genetic manipulation technology, and can be administered in various ways, including oral administration, so that SARS-CoV-2 virus infection can be prevented. It can be used in the prevention and treatment of various infectious diseases and cancer, including
  • Figure 1a is a comparison of the ⁇ 1 protein of wild-type reovirus (left) and the mutated ⁇ 1 protein of reovirus RP116 (right).
  • Figure 1b is a diagram illustrating the manufacturing principle of the reovirus-based vaccine platform according to the present invention.
  • 1c is a diagram illustrating the operating principle of the reovirus-based vaccine platform according to the present invention.
  • Figure 1d is a schematic diagram of the construct design of the reovirus-based vaccine platform according to the present invention.
  • Figure 1e is a picture showing the manufacturing principle of the reovirus-based vaccine according to the present invention.
  • Figure 2a is a negative control (Mock), wild-type reovirus (WT ReoV), 251 of the S1 gene to confirm the ability of the vaccine platform according to an embodiment of the present invention to induce neutralizing antibody production against the SARS-CoV-2 virus.
  • Figure 2b is the result of detecting the RBD gene through RT-qPCR in cells infected with Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, or ReoV+RBD.
  • Figure 2c shows the results of detecting SARS-CoV-2 neutralizing antibody (NeuAb; top) and anti-reovirus antibody (bottom) in cells infected with Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, or ReoV+RBD.
  • NeuAb SARS-CoV-2 neutralizing antibody
  • Bottom anti-reovirus antibody
  • FIG. 3a and 3b show that in order to confirm the ability of the reovirus-based vaccine platform of the present invention to express foreign antigens, various recombinant reoviruses having a mutant S1 gene fused with a T cell epitope were prepared, infected cells, and then incubated in cell lysates. This is the result of detecting the existing reovirus-derived protein (FIG. 3a) and the RNA product of the foreign epitope (FIG. 3b).
  • 3c and 3d show that in order to confirm the ability of the reovirus-based vaccine platform of the present invention to express foreign antigens, various recombinant reoviruses having a mutant S1 gene fused with a B cell epitope were prepared, infected cells, and then incubated in cell lysates. This is the result of detecting the existing reovirus-derived protein (FIG. 3c) and the RNA product of the foreign epitope (FIG. 3d).
  • Ovalbumin epitope Ovalbumin epitope
  • Figure 5 is a recombinant reovirus (ReoV + p15E) introduced with a T cell epitope recognizing cancer cells or a reovirus introduced with the SARS-CoV-2 epitope S21P2 (2), after infecting cells, reovirus proteins and tagging proteins (Myc, FLAG), and the result of detecting SARS-CoV-2 protein.
  • the black arrow indicates the position of a band with a size corresponding to the ⁇ 1 protein recombined with the SARS-CoV-2 epitope S21P2(2).
  • Figure 6a is a schematic diagram of the S1 gene of recombinant reovirus introduced with the S21P2 or OVA257-264 epitope tagged with Myc and FLAG.
  • Figure 6b shows the results of detecting reovirus and FLAG tag protein after infecting cells with S21P2 or OVA257-264 epitope-introduced recombinant reovirus.
  • Figure 7a shows the process of administering the reovirus vaccine (reovirus vaccine into which SARS-CoV-2 antigen S21P2 was introduced) to mice in order to confirm the in vivo efficacy of the reovirus-based vaccine according to the present invention. It is a schematic diagram shown.
  • Figure 7b is a graph comparing the body weight of mice administered with wild-type or recombinant reovirus.
  • 7c is a graph comparing the ability to inhibit HEK293T cell infection by neutralizing antibodies isolated from serum of mice administered with wild-type or recombinant reovirus.
  • 7d shows the result of detecting SARS-CoV-2 spike protein-specific immunoglobulin in the serum of mice administered with wild-type or recombinant reovirus.
  • FIG. 8b and 8c show the results of measuring the ratio of CD8 + T cells expressing TNF ⁇ and/or INF ⁇ by flow cytometry after infecting cells with various recombinant reoviruses (Fig. 8b) and quantification graphs thereof (Fig. 8c).
  • Figure 9a is a picture showing the RP116 reovirus ⁇ 1 protein to which the tumor epitope is fused.
  • Figure 9b shows the results of detecting reovirus proteins (left) and ovalbumin epitope (OVA257-267)-tagged Myc and FLAG proteins (right) by Western blot after cells were infected with various reoviruses for 72 hours.
  • 9c is a diagram showing the principle of inducing an immune response of the reovirus-based vaccine platform of the present invention.
  • Figure 10a is a diagram showing the process of injecting tumor cells after administering wild-type or foreign epitope (OVA257-264)-introduced reovirus to mice to confirm the cancer prevention effect of the reovirus-based vaccine of the present invention in vivo. am.
  • OVA257-264 wild-type or foreign epitope
  • Figure 10b shows the results of comparing the tumor sizes of mice injected with tumor cells after reovirus administration.
  • tumors on the left are tumors developed from normal B16F10 cells, and on the right are tumors developed from B16F10 cells expressing the Ovalbumin-specific antigen.
  • 10C is a graph comparing body weights of mice administered with wild-type or recombinant reovirus.
  • FIG. 10D is a result of quantifying the size of tumors developed from normal B16F10 cells and B16F10 cells expressing an Ovalbumin-specific antigen after reovirus administration.
  • 11a is a diagram showing an in vivo experimental schedule and conditions for confirming the therapeutic effect of the reovirus-based vaccine of the present invention on melanoma.
  • Figure 11b shows the results of tumor growth over time after administration of recombinant reovirus to a melanoma mouse model (Vehicle, untreated control group; S1-Q251*, recombinant reovirus-administered group with no introduced epitope; and S1- Recombinant reovirus-administered group into which OVA and Ovalbumin antigens were introduced).
  • FIG. 11c and 11d show the results of observing (FIG. 11c) and quantifying the level of OVA-specific T cell activation produced after administration of recombinant reovirus to a melanoma mouse model (FIG. 11d).
  • the present invention relates to a vaccine platform based on Quick Change using reverse genetics technology of reovirus, in which the head part of Sigma 1 protein ( ⁇ 1 protein) of reovirus can be replaced with various foreign peptides, and thus various It was completed by confirming that it can be used as a preventive or therapeutic vaccine for various diseases, including infectious diseases or cancer, by introducing an antigenic epitope. That is, the present inventors use reverse genetics technology to insert an epitope sequence so that an epitope for cancer or infectious disease is fused and expressed in a reovirus sigma 1 protein attenuated by cleavage at a specific amino acid sequence position. Through the method, a vaccine platform based on an attenuated reovirus was developed.
  • the mutant Sigma 1 protein according to the present invention is a mutant Sigma 1 protein of RP116, a mutant reovirus, which is truncated, in which amino acids 251 to 455 are deleted (based on the N-terminus) compared to wild-type Sigma 1 protein. It is characterized by being a protein.
  • the truncated Sigma 1 is encoded by a mutant S1 gene into which a stop codon is introduced.
  • the mutant S1 gene as the 763rd nucleotide C from the 5' end is substituted with T, the 251st codon from the start codon (start codon) ( That is, as 763 CAA, encoding 251 Q) is characterized in that it is substituted with a stop codon.
  • the present inventors confirmed that when the gene encoding the exogenous peptide is ligated after the stop codon, the exogenous peptide is fused and expressed together with the truncated Sigma 1, and as a result, the expression of the exogenous peptide can be stably induced by infecting cells. It was confirmed that a recombinant reovirus that can be produced can be produced. Accordingly, the present inventors have prepared various recombinant reoviruses by introducing various antigenic proteins, including SARS-CoV-2 epitope and tumor antigen, downstream of the mutant S1 gene, and the recombinant reoviruses are resistant to antigens introduced from infected cells. It was confirmed that the expression can be stably induced and the immune function of immune cells for the antigen can be activated.
  • the recombinant reovirus-based vector according to the present invention is not limited in the types of antigens that can be introduced, it can be used as a vaccine platform for preventing and treating cancer as well as infectious diseases caused by various viruses, bacteria, and fungi.
  • recombinant reovirus is a safe virus that has been confirmed not to cause disease by itself, there is no risk of unexpected side effects, and since it can maintain stability even under harsh environmental conditions, it can be used at room temperature or as low as 4°C, as well as at -20°C. It can be stored even at low temperatures. Therefore, the composition according to the present invention has the advantage of being orally administered in the form of a beverage or food.
  • reovirus is highly productive and the production process is well established, large quantities of virus-based vaccines can be produced at relatively low cost.
  • the main object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a mutant S1 gene of a reovirus and an exogenous epitope-encoding gene.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a reovirus mutant S1 gene and an exogenous epitope-coding gene, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • Respiratory enteric orphan virus is a non-enveloped icosahedral virus that has a double-stranded RNA fragment as its genome.
  • Reoviruses are commonly isolated from the digestive and respiratory tracts of healthy humans and are non-pathogenic viromes.
  • reovirus is known as an oncolytic virus capable of infecting and killing various tumor cells.
  • reovirus like general oncolytic viruses, can specifically infect cancer cells and induce their death while having little effect on normal cells, so it has the advantage of low side effects, It has the advantage that it can infect surrounding and distant cancer cells, which can cause a wide range of anticancer effects.
  • the reovirus genome consists of 10 distinct segments that encode 8 structural and 3 non-structural proteins: 3 Large segments (L1, L2, L3) and 3 Medium segments (M1, M2, M3), and four Small segments (S1, S2, S3, and S4).
  • the outer capsid of reovirus is composed of four proteins: sigma-1, sigma-3, lambda-2, and mu-1.
  • Sigma-1 is a reovirus cell-adhesion protein that binds to receptors on target cells, enabling the virus to infect cells.
  • wild-type reovirus has utility as an anti-cancer virus.
  • wild-type reovirus has a problem that its anticancer function may be weakened by neutralizing antibodies when injected into the body, and there is a risk that the anticancer function of the reovirus may be suppressed by the tumor microenvironment of cancer cells.
  • the reovirus infects normal cells rather than cancer cells and causes abnormalities in the host.
  • the present inventors found that an immature STOP codon (TAA) was present in the middle of the wild-type Sigma 1 protein coding gene, resulting in a truncated form of Sigma 1 protein (i.e., a mutant Attenuated reovirus (AV) expressing Sigma 1 protein) was prepared.
  • TAA immature STOP codon
  • AV Attenuated reovirus
  • the attenuated reovirus is characterized in that the toxicity to the host is further reduced compared to the wild-type reovirus.
  • the attenuated reovirus according to the present invention has glutamine (Q), the 251st amino acid of the protein, in the gene (S1 gene) encoding sigma 1, an attachment protein exposed to the outside, in the capsid of wild-type reovirus. It may include a mutation in which 763CAA is converted to 763TAA (stop codon) as the 763rd C from the 5' end of the encoding code is substituted with T.
  • the attenuated reovirus according to the present invention is truncated (deleted) from the 251st amino acid of the wild-type sigma 1 protein due to the immature stop codon mutation, and thus the globular head may be truncated (deleted).
  • the attenuated reovirus may be RP116.
  • the sigma 1 protein according to the present invention is a truncated sigma 1 protein in which amino acids 251 to 455 from the N-terminus are deleted compared to the wild-type sigma 1 protein.
  • the sigma 1 protein according to the present invention is characterized in that it comprises the sequence of amino acids 1 to 250 of the wild-type reovirus sigma 1 protein, and is preferably composed of the sequence of amino acids 1 to 250 above.
  • the truncated sigma 1 protein that is, the mutated sigma 1 protein is attenuated compared to the sigma 1 protein of wild-type reovirus.
  • the Sigma 1 protein of wild-type reovirus is encoded (encoded) by the S1 segment (also referred to as “S1 gene”, etc.). Therefore, the mutant sigma 1 protein according to the present invention can be encoded by a mutant S1 gene having a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the mutant sigma 1 protein according to the present invention may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the mutant sigma 1 protein according to the present invention may be one in which amino acids 251 to 455 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted.
  • mutant S1 gene according to the present invention may be characterized by having a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • the substitution of the stop codon may be caused by substitution of T at the 763rd nucleotide from the 5' end of the S1 gene.
  • mutant S1 gene according to the present invention may include or consist of any one polynucleotide sequence selected from the group consisting of:
  • SEQ ID NO: 4 is a polynucleotide consisting of nucleotides 1 to 765 of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the gene (nucleic acid molecule) with a specific sequence number may include the base sequence (polynucleotide sequence) of the sequence number or consist of the base sequence of the sequence number, and the modified reovirus according to the present invention As long as the purpose and function of is maintained, variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention.
  • a nucleic acid molecule of a nucleotide sequence represented by a specific sequence number is a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting it, for example, a portion of the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule is subject to deletion, substitution, or insertion.
  • nucleic acid molecule represented by a specific sequence number is 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the nucleotide sequence represented by the corresponding sequence number. It may contain nucleotide sequences having homology.
  • sequence homology includes a polynucleotide having.
  • the “% of sequence homology” for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to (not including).
  • a polypeptide (protein) accompanied by a specific sequence number may include the amino acid sequence of the sequence number or consist of the amino acid sequence of the sequence number, as long as the purpose and function of the modified reovirus according to the present invention are maintained. , variants of that amino acid sequence are included within the scope of the present invention.
  • a polypeptide of an amino acid sequence represented by a specific sequence number is a functional equivalent of a polypeptide molecule constituting it, for example, although some amino acid sequences of the polypeptide have been modified by deletion, substitution, or insertion, the above It is a concept that includes variants that can have the same functional action as a polypeptide.
  • the polypeptide represented by a specific sequence number is 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of the amino acid sequence represented by the corresponding sequence number. It may include amino acid sequences having homology. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology It includes a polypeptide having.
  • the "percentage of sequence homology" for a polypeptide is determined by comparing two optimally aligned sequences with a region of comparison, wherein a portion of the amino acid sequence in the region of comparison is a reference sequence (without additions or deletions) to the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to not including).
  • the modified reovirus according to the present invention may include the same wild-type nucleotide sequence and amino acid sequence as the wild-type reovirus except for the above-mentioned mutations. However, it is obvious that deletion, substitution, and/or insertion mutation of some bases or amino acids may occur even in the wild-type sequence due to the nature of the virus within the range of maintaining the function and characteristics of the virus. Therefore, the modified reovirus according to the present invention may further include a variant of the wild-type sequence that does not compromise the functions of the virus (e.g., neutralizing antibody production induction effect against an antigen, anticancer effect, etc.) in addition to the above mutations.
  • the genome sequence of the wild-type reovirus according to the present invention is described in detail in the sequence listing of the present specification.
  • a modified reovirus according to the present invention may be derived from any wild-type reovirus and may be a member of the Reovirus family, which may be obtained from a variety of sources.
  • the modified reovirus according to the present invention may be derived from a wild type human reovirus.
  • the wild-type reovirus may be selected from human reovirus type 1, human reovirus type 2, human reovirus type 3 and human reovirus type 4. More preferably, the wild-type reovirus may be selected from human reovirus type 1 strain Lang, human reovirus type 2 strain Jones, human reovirus type 3 strain Dearing or Abney and human reovirus type 4 strain Ndelle.
  • the wild-type reovirus according to the present invention may be a type 3 reovirus.
  • the modified reovirus according to the present invention can be applied to primates (chimps, gorillas, macaques, monkeys, etc.), rodents (mice, rats, garybils rats, hamsters, rabbits, guinea pigs, etc.) , can be derived from one or more reoviruses exhibiting tropism for cells of other mammalian species, including, but not limited to, dogs, cats, and livestock (cattle, horses, pigs, goats).
  • exogenous epitope refers to an exogenous peptide to be delivered to a cell or body through a reovirus for the purpose of preventing or treating a specific disease.
  • epitope antigenic determinant or epitope
  • epitope refers to a specific region of an antigen identified by antibodies, B cells, T cells, etc., and the immune system can recognize a foreign epitope and initiate an immune response against it. It is obvious that the exogenous epitope is not limited to a specific type or sequence of epitopes, and those skilled in the art can select a desired epitope according to the purpose without limitation.
  • the epitope may be an epitope of an antigen that induces cancer or an infectious disease.
  • the disease (infectious disease, cancer, etc.) in the present invention may be a disease induced or caused by an antigen containing an epitope according to the present invention.
  • cancer may be a cancer expressing an antigen (tumor antigen) comprising an epitope according to the present invention.
  • exogenous epitope-encoding genes may be included in the recombinant vector according to the present invention.
  • the genes may be of the same type or different types.
  • infection means that pathogenic microorganisms such as viruses invade, develop, and proliferate in the body of an organism that serves as a host, and mean that they colonize and proliferate in tissues, body fluids, and surfaces of humans, animals, and plants. As a result, the host undergoes pathological changes and may develop disease.
  • infectious disease means a disease caused by the establishment and proliferation of pathogenic microorganisms on tissues, body fluids, and surfaces of humans, animals, and plants, and can be classified into several types depending on the infection route and contagiousness .
  • the infections include viral infections, fungal infections, bacterial infections, protozoal infections and parasitic infections.
  • the infectious disease is hepatitis C, influenza, human immunodeficiency virus (HIV)-induced AIDS, tuberculosis, coronavirus infection-19 (COVID-19), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS) -CoV-2) infection, infantile enteritis caused by rotavirus, and non-bacterial acute gastroenteritis caused by norovirus.
  • coronavirus infection -19 but is not limited thereto.
  • the exogenous epitope may be one or more selected from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, allergens, and tumor antigens.
  • the viruses include SARS-CoV-2 virus, norovirus, influenza virus, Ebola virus, human papillomavirus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus , mumps virus, rabies virus, human immunodeficiency virus, dengue fever virus, polio virus, cytomegalovirus, dengue fever virus, yellow fever virus, adenovirus, Japanese encephalitis virus, smallpox virus, and Zika virus, A protein or peptide unique to the virus can be applied as an exogenous peptide.
  • the peptides include viral envelope proteins, capsid proteins, spike proteins, membrane proteins, receptor binding domains, nucleic acids (DNA or RNA), viral enzymes ( viral enzymes), and hemaglutinin, but those skilled in the art can select an appropriate viral protein depending on the viral infection to be prevented or treated.
  • the present inventors prepared a recombinant reovirus into which a SARS-CoV-2 epitope (SARS-CoV-2 receptor binding domain) was introduced through specific examples, and confirmed its SARS-CoV-2 infection prevention and treatment effects. Therefore, the recombinant reovirus into which the SARS-CoV-2 epitope is introduced can be used for prevention or treatment of coronavirus infection-19 (COVID-19).
  • SARS-CoV-2 epitope SARS-CoV-2 receptor binding domain
  • the recombinant reovirus into which the SARS-CoV-2 epitope has been introduced according to the present invention can be used to treat sepsis caused by SARS-CoV-2 virus infection, acute respiratory syndrome, pneumonia, cytokine storm, cytokine release syndrome, Systemic inflammatory response syndrome, multiple organ failure, pulmonary fibrosis, etc. can be prevented or treated.
  • the SARS-CoV-2 epitope may be a SARS-CoV-2 receptor binding domain, but is not limited thereto. More preferably, the SARS-CoV-2 epitope may be encoded by a polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 19 or 22, but is not limited thereto.
  • coronavirus infection-19 is a severe respiratory syndrome caused by SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 severe respiratory syndrome caused by SARS-CoV-2.
  • the first case was reported in China in December 2019, and it has become a pandemic as it spreads around the world.
  • Symptoms of COVID-19 vary, but include fever, cough, headache, fatigue, shortness of breath, and loss of smell and taste. Symptoms appear within 1 to 14 days of being infected with the virus. In particular, one-third of infected people are asymptomatic and do not show any noticeable symptoms. 81% of people who are notable enough to be classified as ill develop mild to severe symptoms, 14% develop symptoms such as shortness of breath and hypoxia, and 5% develop severe symptoms such as respiratory failure and shock. Occurs. Older adults are more likely to develop severe symptoms, and organ damage has been observed in some people due to COVID-19, which they encountered long after recovery.
  • SARS-CoV-2 has 30 kb of nucleotides and has 4 important structural proteins; Nucleocapsid (N), Spike (S), Membrane (M), and Envelope (E) proteins. Among them, the S protein is an important site as it binds to the receptor of the host cell, delivers the viral nucleocaspid into the cell, and replicates.
  • SARS-CoV-2 The simplest and most direct way to combat SARS-CoV-2 is to neutralize the virus entering human cells. SARS-CoV-2 enters the cells, where they replicate and secrete new virions to infect other cells. It is to block the mechanism that does it.
  • SARS-CoV-2 is known to be capable of viral replication by binding to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor in human cells.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • the receptor-binding domain is a key region that binds to the host cell's ACE2 receptor and has multiple conformational-dependent epitopes that induce strong neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 infection. ), it can be a key target for treatment and vaccine development of COVID-19 (J. Immunol 2005;174:4908-4915).
  • tumor antigens are included without limitation as long as they are expressed specifically in cancer cells or have particularly high expression in cancer cells, but are not limited to specific types, such as Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13R ⁇ 2 (Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM (Neural cell adhesion molecule), FBP (Folate binding protein), Le(Y) (Lewis-Y antigen), PSCA (Prostate stem cell antigen), PSMA (Prostate-specific membrane antigen), CEA (Carcinoembryonic antigen), HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6 (Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3 , ROR1 (receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1 (fo
  • the present inventors prepared a recombinant reovirus into which an ovalbumin antigen (OVA257-264, “OVA antigen”) was introduced through a specific example, and confirmed the function of activating immune cells by the virus, and when the recombinant virus was administered, the antigen It was confirmed that the growth of the expressing tumor was prevented and inhibited. Therefore, the recombinant reovirus according to the present invention can be used for preventing or treating cancer by introducing various tumor antigens.
  • OVA257-264 ovalbumin antigen
  • the epitope may be one or more selected from the group consisting of CD4 + T cells, CD8 + T cells, and B-cell epitopes, and according to an embodiment of the present invention, SARS-CoV-2 RBD, OVA 257-264 , It may be an epitope comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of OVA 323-339 , Adpgk, Rpl18, P15E, S21P2(1), and S21P2(2), but is not limited thereto.
  • the epitope may form or constitute a fusion protein at the carboxy terminus of the attenuated reovirus sigma 1 protein, but is not limited thereto.
  • the term “recombinant vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid molecule to which it has been linked. Specifically, the vector refers to any medium for the introduction and/or transfer of a base into a host cell in vitro, in vivo or in vivo, and replication capable of binding other DNA fragments to result in replication of the linked fragment. It may be a replica. “Replication unit” means any genetic unit (eg, plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus, etc.) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, that is, is capable of replicating under its own control.
  • Such vectors include, but are not limited to, bacteria, plasmids, phages, cosmids, episomes, viruses, and insertable DNA fragments, i.e. fragments that can be inserted into the host cell genome by homologous recombination.
  • the vector according to the present invention may be composed of double-stranded DNA such as plasmid DNA, linear DNA, hairpin DNA, or minicircle DNA, or may be a recombinant viral vector, but is not limited thereto.
  • the vector may be used without limitation as long as it includes a transposon sequence and target DNA and can be delivered into a target cell, and those skilled in the art can select and use various vectors known in the art.
  • the recombinant vector of the present invention preferably includes a promoter, which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds, an arbitrary operator sequence for regulating transcription, an enhancer sequence, and a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site. It may include a sequence controlling termination of transcription and translation, a terminator, and the like, more preferably a polyhistidine tag (an amino acid motif composed of at least 5 or more histidine residues), a signal peptide gene, and a signal peptide remaining in the endoplasmic reticulum (endoplasmic reticulum retention signal peptide), a cloning site, etc.
  • a promoter which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds
  • an arbitrary operator sequence for regulating transcription an enhancer sequence
  • a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site may include a sequence controlling termination of transcription and translation, a terminator, and the like,
  • the polynucleotide sequence of each gene is operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence, such as a promoter sequence, and another nucleotide sequence, whereby the control sequence is involved in the transcription of the other nucleotide sequence. and/or regulate detoxification.
  • the recombinant vector may be constructed using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host.
  • a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (eg, pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.) ), a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence.
  • a strong promoter capable of promoting transcription eg, pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • the origin of replication at which the vector operates in the eukaryotic cell may include, but is not limited to, the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, and the BBV origin of replication.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallotionine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • the signal sequence may include poly A signal (poly A signal), but is not limited thereto.
  • the gene for the tag examples include Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag (polyhistidine tag), Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, and CTB.
  • tag Softag 1 tag, Softag 3 tag, Strep tag, TC tag, V5 tag, VSV tag, Xpress tag, etc.
  • the vector according to the present invention may contain a myc tag.
  • the location of the tag in the vector is not limited, but may preferably be located downstream of the mutant S1 gene. Alternatively, the tag may be located on one side or both sides of the exogenous epitope-encoding gene, but is not limited thereto.
  • the vectors can be delivered into cells through various techniques commonly used to introduce exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • the vector according to the present invention can be used for calcium phosphate coprecipitation; electroporation; Microfluidics gene editing; nucleofection; cell squeezing; sonoporation; optical transfection; impalefection; gene gun; magnetofection; viral transduction; DEAE-dextran transfection; lipofection; Alternatively, it may be inserted into cells by transfection through dendrimers, liposomes, or cationic polymers, but is not limited thereto.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules. Also includes modified analogs. The sequence of a nucleic acid according to the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides. A nucleic acid according to the present invention also includes a nucleotide sequence exhibiting substantial identity to the nucleotide sequence. Substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequence are aligned so as to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. A nucleotide sequence exhibiting homology, more preferably at least 90% homology, most preferably at least 95% homology.
  • the exogenous epitope-coding gene is characterized in that it is located downstream of the mutant S1 gene.
  • the exogenous epitope-coding gene according to the present invention may be located downstream of codon 251 (ie, stop codon) of the mutant S1 gene to replace the deleted region of the S1 gene.
  • the exogenous epitope-coding gene is substituted or inserted at a position after the 763rd nucleotide (preferably, after the 765th nucleotide) from the 5' end of the nucleotide sequence encoding the sigma 1 protein of the attenuated reovirus It may, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence encoding the epitope is 763 (or 766) from the 5' end in the nucleotide sequence of the S1 gene (eg, SEQ ID NO: 4 or 5) encoding the sigma 1 protein of the attenuated reovirus. It may be substituted instead of the nucleotide sequence at a specific position among the positions of nucleotides to 1416, or may be inserted between the nucleotide sequences at a specific position.
  • exogenous epitope-coding genes are 10 to 400, 10 to 300, 10 to 250, 10 to 220, 50 to 400, 50 to 300, 50 to 250, 100 to 400, It may be 100 to 300, 100 to 250, or 150 to 250 nucleotides in length, but is not limited thereto.
  • the exogenous epitope-coding gene may be directly linked to the mutant S1 gene, or may be linked to the mutant S1 gene through a tag gene or linker.
  • one or more amino acids selected from the group consisting of a linker, Myc protein, FLAG protein, and 2A peptide before and after the amino acid sequence of the epitope included in the 251-455th amino acid position in the sigma 1 protein of the attenuated reovirus It may further include sequences, but is not limited thereto, and there is no restriction on their order.
  • the 2A peptide may be selected from 2A peptides including, for example, P2A, T2A, E2A, or F2A, and the type is not limited.
  • the mutant S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene are expressed together to produce a fusion protein. That is, when the recombinant vector according to the present invention is introduced into a cell, a mutated (truncated) sigma 1 protein and a protein in a state in which the exogenous epitope is fused through transcription and translation can be produced.
  • the fusion protein may be characterized in that the head of the wild-type sigma 1 protein is replaced with an exogenous epitope.
  • the present invention provides a mutant sigma 1 protein in which the exogenous epitope is fused, expressed from the recombinant vector.
  • the mutant sigma 1 protein is characterized in that it comprises amino acid sequences from positions 1 to 250 of the wild-type reovirus sigma 1 protein.
  • the mutant sigma 1 protein does not include an amino acid sequence after the 250th amino acid of the sigma 1 protein of the wild type reovirus.
  • the mutant sigma 1 protein may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the fusion protein produced from the S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene is expressed as a reovirus capsid. That is, the fusion protein expressed from the recombinant vector according to the present invention can be assembled together with other reovirus components and displayed externally as a recombinant reovirus capsid protein. After the recombinant reovirus infects a cell, an exogenous epitope located at the head of the sigma 1 protein is exposed to the cell, and thus an immune response to the epitope can be induced.
  • the recombinant vector according to the present invention may further include other reovirus genes necessary for the production of reovirus in addition to the mutant S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene.
  • the recombinant vector may contain essential genes of a reovirus.
  • the essential gene may be selected from the group consisting of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4, but is not limited thereto.
  • recombinant proteins expressed from the mutant S1 gene and exogenous epitope-encoding genes can be assembled with other reovirus components expressed from essential genes of the reovirus to form an intact reovirus.
  • the reovirus essential genes may be introduced into a vector separate from the recombinant vector containing the mutant S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene, and expressed independently of the recombinant vector of the present invention.
  • the expression products generated from each vector can be assembled together to form an intact reovirus. Therefore, since the fusion protein expressed from the recombinant vector according to the present invention assembles with other reovirus components to form an intact reovirus, it can be exposed to cells through a viral infection mechanism.
  • Essential genes of reovirus are known, and their sequence information can be confirmed through public databases.
  • sequence information of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4 genes of reovirus are GenBank accession numbers EF494435.1, EF494436.1, EF494437.1, EF494438.1, EF494439, respectively. 1, EF494440.1, EF494441.1, EF494442.1, EF494443.1, and EF494444.1, but these are representative examples and are not limited to the above sequence information.
  • reovirus gene sequences are specifically presented in the Sequence Listing herein.
  • the present invention also provides a cell into which the recombinant vector according to the present invention has been introduced (ie, transformed, transfected, or transfected).
  • the cell can express the gene inserted into the introduced recombinant vector to produce a mutant sigma 1 protein fused with an exogenous epitope.
  • the cell produces a recombinant reovirus containing a mutant sigma 1 protein to which the epitope is fused. Therefore, to produce an intact reovirus, a vector containing one or more genes selected from the group consisting of L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, and S4 of the reovirus may be further introduced into the cell. There is. Alternatively, the genes may exist inserted into the genome of the cell, or may be inserted together into a recombinant vector containing a mutant S1 gene and an exogenous epitope-encoding gene.
  • the cell may further contain other components capable of assisting in the expression of the recombinant protein and production of the recombinant reovirus.
  • vaccinia virus capping enzyme heterodimers of D1R and D12L, and FAST-p10, a fusion protein of Reovirus, may be further included.
  • the present invention provides a recombinant reovirus comprising a mutant S1 gene and an exogenous epitope-coding gene, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at codon 251 from the start codon. That is, the present invention provides a recombinant reovirus comprising the mutant S1 gene and the exogenous epitope-encoding gene according to the present invention in its genome.
  • the recombinant reovirus is characterized by expressing the exogenous epitope.
  • the exogenous epitope is located at the head of the mutated (truncated) sigma 1 protein and is present on the external capsid of the virus.
  • the recombinant reovirus is produced from a recombinant vector according to the present invention. That is, the recombinant reovirus may be characterized in that it includes a fusion protein of the mutant sigma 1 and the exogenous epitope expressed from the recombinant vector according to the present invention.
  • the present invention provides a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising, as an active ingredient, a recombinant vector according to the present invention, a cell into which the recombinant vector is introduced, or a reovirus expressed from the recombinant vector.
  • vaccine is a biological agent containing an antigen that induces an immune response in a living body, which is injected or orally administered to humans or animals to prevent infection or cancer, thereby inducing immunity to the living body. refers to the immunogen.
  • the animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to pigs, cows, horses, dogs, goats, sheep, etc., but is not limited thereto.
  • Immunologically active components of a vaccine may contain suitable elements of live or dead viruses (subunit vaccines), whereby these elements destroy the whole virus or its growing culture, which then destroys the desired structure(s).
  • Vaccines may include one or more than one of the components described above and may be prepared by methods known in the art.
  • the vaccine can be prepared based on an attenuated reovirus by cleavage of the sigma 1 protein, so that epitopes causing various cancers or infectious diseases are expressed in a fused form at the cleaved site, ,
  • it may be prepared in the form of a polypeptide comprising the truncated sigma 1 protein and epitope amino acid sequence of the attenuated reovirus, a polynucleotide encoding the same, and a viral vector comprising the polynucleotide, but is limited thereto It doesn't work.
  • the vaccine of the present invention may be in any form known in the art, for example, in the form of solutions and injections, or in a solid form suitable for suspension, but is not limited thereto. These formulations may also be emulsified or encapsulated into liposomes or soluble glass, or prepared in aerosol or spray form. They can also be incorporated into transdermal patches.
  • the vaccine according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable vaccine protecting agent, an immunostimulating agent, a diluent, an absorption promoter, and the like, if necessary.
  • vaccine protectants include, but are not limited to, eg, lactose phosphate glutamate gelatin mixtures.
  • the vaccine When the vaccine is a solution or injection, it may contain propylene glycol and sodium chloride in an amount (eg, about 1%) sufficient to prevent hemolysis, if necessary.
  • the material used as the adjuvant is not particularly limited, for example, alum, monophosphoryl lipid A (MPL), aluminum hydroxide, mineral oil, or added to other oils or vaccines, or induced by these additional components. It can be, but is not limited to, ancillary molecules produced by the body after
  • the disease may be a disease associated with an exogenous epitope according to the present invention.
  • the disease may be a disease caused by an antigen containing the epitope, and if the disease is cancer, the cancer may be a cancer expressing a tumor antigen containing an exogenous epitope according to the present invention.
  • the vaccine composition according to the present invention can achieve the following characteristics through recombinant reovirus:
  • one or more epitopes introduced into the recombinant reovirus of the present invention can cause T cells or B cells to identify antigens, thereby generating neutralizing antibodies in the host or inducing cellular immunity, thereby triggering an immune response, but is not limited thereto.
  • neutralizing antibody refers to any antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a pathogen and interferes with the ability of the pathogen to infect cells or cause disease.
  • cellular immunity refers to an immune activity in which a lymphoid cell directly causes an immune response to a certain antigen. It refers to an immune activity in which white blood cells act on an antigen to eat the cell and act as a phagocytosis, or cause a toxic cell reaction to remove the antigen. It constitutes the immune system together with humoral immunity performed by serum antibodies in the body, and representatively, the action of T cells having cytotoxicity is mentioned. T cells combine with B cells to form antibodies and then directly contact the antigen to destroy the antigen.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease comprising, as an active ingredient, the recombinant vector according to the present invention, a cell into which the vector is introduced, or a reovirus to be expressed from the recombinant vector.
  • the mutant S1 gene is characterized in that it has a stop codon at codon 251 from the start codon, and the disease may be characterized in that it is associated with the epitope.
  • the recombinant reovirus according to the present invention can be used for preventing or treating infectious diseases caused by the virus by introducing various viral epitopes. That is, the present invention relates to a recombinant vector comprising a mutant S1 gene of a reovirus and a viral epitope-coding gene; cells into which the recombinant vector has been introduced; Or a pharmaceutical composition for preventing or treating a viral infection, comprising a recombinant reovirus produced from the cell as an active ingredient, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at the 251st codon from the start codon, virus Provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating infections.
  • the recombinant reovirus according to the present invention can be used for prevention or treatment of cancer by introducing various tumor antigens. That is, the present invention relates to a recombinant vector comprising a mutant S1 gene of a reovirus and a tumor antigen epitope-coding gene; cells into which the recombinant vector has been introduced; Or a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a recombinant reovirus produced from the cell as an active ingredient, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at the 251st codon from the start codon.
  • a pharmaceutical composition for prevention or treatment is provided.
  • the cells may be mammalian cells, but are not limited thereto.
  • the term “cancer” is characterized by uncontrolled cell growth, which results in the formation of a cell mass called a tumor, infiltrating surrounding tissues and, in severe cases, metastasizing to other organs in the body.
  • the cancer may be solid cancer or hematological cancer, squamous cell carcinoma, glioma, lung cancer, adenocarcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, eye cancer, rectal cancer, proximal anal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, adenocarcinoma of the appendix.
  • Thyroid cancer adrenal cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, blood cancer, liver cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colon cancer, endometrial cancer, uterine cancer, salivary gland cancer, kidney It may be selected from the group consisting of cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, oral cancer, tongue cancer, brain cancer, and stromal tumor.
  • the blood cancer may be leukemia, lymphoma, multiple myeloma, and the like.
  • the skin cancer may be selected from squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma.
  • the melanoma may be metastatic melanoma.
  • the cancer may be a cancer that expresses or does not express PD-L1.
  • the cancer may be a cancer having a mutation of a cancer onset suppressor gene (p53, Rb, etc.) or a RAS activating mutation. More preferably, the cancer according to the present invention may be a cancer resistant to wild-type reovirus.
  • the content of the recombinant vector, the cells, or the recombinant reovirus in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the progress of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9 based on the weight of the total composition. % by weight, or 0.001 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.
  • compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods.
  • tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate It can be formulated and used in the form of external preparations such as warning agents, lotions, pasta agents, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, and the external agents are creams, gels, patches, sprays, ointments, and warning agents.
  • lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for the liquid formulation according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (tween esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like may be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or a sweetener may be used, and aromatics, coloring agents, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickeners, etc. may be used as necessary.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.
  • Suspension agents according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Agents may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, twins, nijuntinamide, hexamine, and dimethylacetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumins, peptones, and gums; tonicity agents such as
  • the suppository according to the present invention includes cacao butter, lanolin, witapsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lannet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolen (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Buytyrum Tego-G -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxycote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hyde Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. ) or by mixing lactose and gelatin.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.
  • the reovirus since the reovirus has a very high stability, it can be orally administered in the form of a beverage or food.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and is generally 0.001 to 150 mg per 1 kg of body weight, preferably 0.01 to 100 mg per day or every other day, or 1 It can be administered in 1 to 3 divided doses per day.
  • the dosage is not limited to the scope of the present invention in any way.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. of mammals.
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of a desired disease
  • treatment means that the desired disease and its resulting metabolic abnormality are improved or improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. All actions that are advantageously altered are meant, and “improvement” means any action that reduces a parameter related to a target disease, for example, the severity of a symptom, by administration of the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a mutant S1 gene of a reovirus and an exogenous epitope-coding gene; cells into which the recombinant vector has been introduced; Or a food composition for preventing or improving various infectious diseases, allergies, or cancers, comprising the recombinant reovirus produced from the cells as an active ingredient, wherein the mutant S1 gene has a stop codon at the 251st codon from the start codon Characterized by providing a food composition.
  • the vector, cell, or recombinant reovirus can be added as is or used together with other foods or food ingredients. Depending on the method, it can be used appropriately.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the vector, cell, or recombinant reovirus of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less based on the raw material when preparing food or beverage.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount greater than the above range.
  • Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice creams, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in a conventional sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, A carbonation agent used in carbonated beverages and the like may be contained.
  • the composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • health functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and refers to foods with high medical and medical effects that are processed to efficiently display bioregulatory functions in addition to nutritional supply.
  • the food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills in order to obtain useful effects for preventing or improving infectious diseases, allergies, and/or cancers.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • unlike general drugs there is an advantage in that there is no side effect that may occur when taking a drug for a long time by using food as a raw material, and it can be excellent in portability.
  • the present invention provides a method for preparing a reovirus-based vaccine composition according to the present invention, comprising the following steps:
  • the recombinant vector may be a reverse evolutionary viral vector, but is not limited thereto.
  • the reverse evolutionary viral vector may refer to a viral vector prepared to produce S1 segment RNA encoding an attenuated reovirus sigma 1 protein in a host cell, and may be prepared by a method known in the art.
  • the vector is constructed so that the viral RNA segment can be transcribed from the T7 RNA polymerase promoter, and the 3' end is naturally formed by the ribozyme in the vector. Since RNA is produced and viral proteins are synthesized using it, it is called a reverse genetics system. This is a useful method to design and create RNA virus mutants.
  • the manufacturing method may include, but is not limited to, introducing the recombinant vector prepared in step (S2) into cells after step (S2) (S3).
  • the cells may preferably be cells.
  • the cell may be one or more selected from the group consisting of BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, and Vero cells, but is not limited thereto.
  • the virus introduced into the cell can replicate and proliferate by expressing viral genes within the cell.
  • the term "combination thereof" included in the expression of the Markush form means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the expression of the Markush form, It means including one or more selected from the group consisting of components.
  • Example 1 Manufacturing principle of reovirus-based vaccine platform
  • the ⁇ 1 protein (Sigma 1 protein) is an external capsid protein of wild-type (WT) reovirus, and the reovirus enters the cell by recognizing and binding JAM-A, a protein on the target cell surface, through the ⁇ 1 protein.
  • Reovirus RP116 is a reovirus mutant in which nucleotide 763 in the S1 segment (S1 gene) expressing the ⁇ 1 protein is substituted from C to T. Due to the substitution of this nucleotide, RP116 has a unique mutation in which CAA (amino acid 251Q) is replaced with 763TAA (STOP codon). Thus, RP116 produces a shorter ⁇ 1 protein compared to the ⁇ 1 protein produced by wild-type reovirus.
  • RP116 can be produced with high titer and has high stability, so it can be used as oncolytic immunotherapy through intratumoral, intravenous, and/or oral administration (FIG. 1a).
  • the production of the unique ⁇ 1 protein of RP116 suggests that the globular head of the ⁇ 1 protein of wild-type reovirus is not essential for viral replication. Therefore, the present inventors predicted that the globular head of the ⁇ 1 protein could be replaced with antigenic fragments from various other pathogens. Now, the present inventors tried to prepare an innovative and safe reovirus vaccine platform that can be prepared in various ways by adding an antigenic region of 200 amino acids or more to the RP116-derived ⁇ 1 protein (FIG. 1b).
  • the non-enveloped reovirus is stable even under harsh environmental conditions, and thus has the advantage of being able to be administered in the form of a beverage or food.
  • reovirus preferentially infects M cells of the small intestine, and various tumor-specific antigens and pathogens recombined to the ⁇ 1 protein can induce an immune response to the antigen (FIG. 1c).
  • the present inventors prepared a vaccine platform using a quick exchange technology based on the reverse genetics system of reovirus.
  • the reovirus reverse genetics system consists of vectors carrying either individual fragments of a total of 10 viral genes (Kobayshi et al., 2007) or multiple gene fragments (Kobayashi et al., 2010).
  • the present inventors used the pUC19 vector as a vector for inserting a reovirus-derived gene, but this is a representative example and is not limited thereto.
  • pS1Att, pS1XX, pL1, pSet2, pSet3, and pSet4 may be used as vectors for expressing the reovirus sigma 1 protein according to the present invention.
  • viral genes are transcribed in cells into which the recombinant vector is introduced, and ultimately replicable reovirus particles are produced within 24 to 72 hours.
  • a STOP codon mutation (amino acid position 251 of the ⁇ 1 protein of wild-type reovirus) was designed and introduced after (i.e., downstream) a restriction enzyme recognition site, so that the site from 251 to C-terminus (i.e., wild-type reovirus Amino acids 251 to 455 of the ⁇ 1 protein) can be conveniently replaced with non-reovirus antigens.
  • a Myc tag and a FLAG tag for detection may be combined, and various foreign epitopes may be fused.
  • the production rate of recombinant reovirus can be further improved by co-transfection with auxiliary vectors, such as vaccinia virus capping enzyme, heterodimers of D1R and D12L, and FAST-p10, a fusion protein of Reovirus.
  • auxiliary vectors such as vaccinia virus capping enzyme, heterodimers of D1R and D12L, and FAST-p10, a fusion protein of Reovirus.
  • auxiliary vectors such as vaccinia virus capping enzyme, heterodimers of D1R and D12L, and FAST-p10, a fusion protein of Reovirus.
  • chymotrypsin treatment is performed before virus infection, virus attachment and entry into production cell lines (BHK, L929, vero cells, etc.) can be further facilitated (FIG. 1e).
  • the sigma 1 protein (showing two sequences) of the modified reovirus (RP116) used in the examples of the present invention and the gene sequence encoding them are shown in Table 1 below.
  • the amino acid sequence of the epitope used in the examples of the present invention, the construct amino acid sequence, and the codon-optimized construct DNA sequence are shown in Table 2 below.
  • Example 2 Confirmation of SARS-CoV-2 neutralizing antibody production induction ability of recombinant reovirus introduced with SARS-CoV-2 epitope
  • codon-optimized ⁇ 1 protein of RP116 reovirus Reo-RBD (ReoV-RBD) fused to the SARS-CoV-2 receptor binding domain (RBD) was prepared. That is, Reo-RBD has a gene into which the SARS-CoV-2 receptor binding domain (RBD) base sequence is introduced after codon 251 of the S1 gene of RP116, and from this, SARS-CoV-2 in a fused form with the ⁇ 1 protein A receptor binding domain is created.
  • the present inventors expressed the recombinant reovirus in BHK21 cells, and infected L929 cells with the obtained virus. The presence of the recombinant reovirus was detected through a SARS-CoV-2 neutralizing antibody.
  • L929 cells were infected with a wild-type reovirus (WT ReoV), a mutant reovirus (ReoV+Q251*) having a truncated ⁇ 1, and a recombinant reovirus (ReoV+RBD) introducing an RBD antigen group, respectively.
  • WT ReoV wild-type reovirus
  • ReoV+Q251* mutant reovirus
  • ReoV+RBD recombinant reovirus
  • Cell lysates were analyzed after 96 hours.
  • the recombinant RBD used as a positive control in this example was Dr. It was used prepared in John Bell's laboratory (Azad et al., 2020), and SARS-CoV-2 NeuAb (40592-MM57) was purchased and used from Sino Biological (Wayne, PA, USA).
  • the reovirus protein could be detected (FIG. 2a).
  • nucleic acid molecules were isolated from each cell, and RT-qPCR using RBD gene-specific primers was performed.
  • RBD gene was not detected in the cells, but the RBD gene was detected in the cells infected with ReoV+RBD (FIG. 2b).
  • the reovirus-based vaccine platform according to the present invention can react with SARS-CoV-2 neutralizing antibodies through the ⁇ 1 protein to which the SARS-CoV-2 RBD antigen group is fused. , it was verified that the vaccine platform of the present invention can express various foreign epitopes in addition to the above antigen groups.
  • recombinant reoviruses fused with various CD4 + and CD8 + T cell epitopes ovalbumin fragment, ADP-dependent Glucokinase (Adpgk), ribosomal protein L18 (Rpl18)
  • Adpgk ADP-dependent Glucokinase
  • Rpl18 ribosomal protein L18
  • the reovirus-based vaccine platform according to the present invention can express epitopes of various foreign antigens, and therefore, it can be used for screening for new vaccine development by introducing epitopes of various diseases into the vaccine platform of the present invention. suggests that it can express epitopes of various foreign antigens.
  • a recombinant reovirus into which an ovalbumin (OVA) epitope was introduced was prepared, and its ability to express foreign antigens was confirmed.
  • OVA ovalbumin
  • the OVA257-264 epitope to which Myc and FLAG tags are bound on each side is fused.
  • the Myc and FLAG tags can be detected by immunocytochemical analysis. Since the fluorescence of the tagged proteins overlaps the fluorescence signal of the reovirus-derived protein, it indirectly indicates that the antigen of the foreign epitope is expressed in cells infected with the recombinant virus.
  • Vero cells cultured on coverslips were infected with ReoV, ReoV+Q251*, or ReoV+OVA257-264 (a recombinant reovirus into which OVA257-264 was introduced) for 48 hours. Then, the cells were fixed in 3.7% PFA and reacted with anti-ReoV (1:1000, rabbit serum), anti-Myc (1:200), and anti-FLAG (1:200) for 1 hour, and anti- Anti-rabbit antibody labeled with Alexa Fluor 488 for detecting ReoV and antibody labeled with Alexa Fluor 594 for detecting anti-Myc or anti-FLAG were treated and incubated for 45 minutes.
  • the stained coverslips were mounted with Fluoromount G with DAPI for nuclear counter staining. Samples were photographed on an Olympus confocal microscope with a 60X oil objective. As a result, as shown in FIG. 4, in the cells infected with the OVA-introduced reovirus, both the fluorescence signal of the reovirus protein and the fluorescence signal of the tag proteins indicating the presence of the OVA antigen were detected.
  • the reovirus-based vaccine platform according to the present invention is infectious to mammalian cells and can effectively express the introduced epitope.
  • Example 5 Confirmation of foreign epitope expression ability of recombinant reovirus introduced with T cell epitope or SARS-CoV-2 epitope recognizing cancer cells
  • BHK21 cells were infected with wild-type reovirus (WT); recombinant reovirus expressing the T cell epitope p15E (ReoV+p15E); Alternatively, they were infected with a reovirus expressing the SARS-CoV-2 epitope S21P2 (ReoV+S21P2(2)). Each epitope was tagged with Myc and FLAG.
  • the SARS-CoV-2 epitope is described by Poh et al. (Nat. Comm., 2020), it was verified that it induces the production of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Western blotting was performed on each cell lysate 48 hours after infection.
  • the stability of the reovirus-based vaccine platform according to the present invention was confirmed.
  • a recombinant reovirus expressing the S1 protein into which the S21P2 epitope or OVA257-264 was introduced was constructed (FIG. 6a).
  • Each epitope was designed to include a Myc or FLAG tag at the N-terminus and C-terminus, respectively, and it was confirmed whether the epitopes were stably expressed in cells through the reovirus.
  • BHK21 cells were infected with the recombinant reovirus for 48 hours, and then Western blotting was performed with anti-reovirus antibodies (anti-ReoV) and anti-FLAG antibodies (anti-FLAG). Both the reovirus protein band and the FLAG band were detected in the cells (FIG. 6b). The above bands were detected with very high intensity in cells that had passed 5 passages, which proves that the expression of the foreign epitope by the recombinant reovirus of the present invention occurs stably even after several cell passages.
  • the ability of the reovirus-based vaccine platform according to the present invention to express foreign antigens and the ability to induce neutralizing antibody production against the antigen was confirmed.
  • the ability of the vaccine platform to induce neutralizing antibody production in vivo Confirmed As a representative example of the recombinant reovirus, a recombinant reovirus into which the SARS-CoV-2 epitope S21P2 was introduced was used.
  • Figure 7a is a schematic diagram showing the administration dose, route, and schedule of the recombinant reovirus-based vaccine.
  • the reovirus-based vaccine was inoculated three times at weekly intervals by oral or intraperitoneal route, and after one week, the mice were sacrificed and necropsied, and serum and spleen were used for analysis.
  • FIG. 7b As a result of comparing the body weight of each group on the 21st day of administration, which was the end of the experiment, no significant difference in body weight was observed (FIG. 7b).
  • the group treated with neutralizing antibodies isolated from the serum of mice vaccinated with the S21P2 epitope-expressing reovirus vaccine showed that the SARS-CoV-2-like virus was neutralized and the ability to infect ACE2-expressing HEK293T cells was reduced compared to the control group. It was confirmed (Fig. 7c).
  • a reovirus-based vaccine introduced with a foreign epitope activates immune cells.
  • OVA257-264 ovalbumin epitope
  • MHC-I major histocompatibility complex-I
  • L929-H2JKB cells were inoculated with wild-type reovirus (WT ReoV), a vaccine platform without introducing an epitope (ReoV + Q257*), or a reovirus into which OVA257-264 was introduced. (ReoV+OVA257-264) and co-cultured with OT-I mouse splenocytes. The cultured cells were collected and flow cytometry was performed using various T cell protein-specific antibodies and intracellular cytokine-specific antibodies. The results are shown in Figures 8b and 8c.
  • the ratio of CD8 + T cells expressing IFN ⁇ and TNF ⁇ in cells infected with reovirus into which the Ovalbumin epitope was introduced increased, indicating that Ovalbumin epitope-specific T cells was found to be active.
  • the above results show that the reovirus-based vaccine of the present invention can infect cells to induce epitope expression and antigen presentation by antigen-presenting cells, and thus can effectively induce immune function activation of immune cells for the epitope.
  • Example 9 Cancer prevention and treatment mechanism of the reovirus-based vaccine platform of the present invention
  • the reovirus-based vaccine platform according to the present invention can also be used for the prevention and treatment of cancer.
  • a recombinant reovirus repetitively expressing the tumor epitope can be prepared by fusing the tumor epitope to the ⁇ 1 protein of the reovirus RP116 of the present invention (FIG. 9a).
  • the stable cell infectivity and foreign epitope expression ability of the recombinant reovirus of the present invention have been confirmed through several experiments.
  • reovirus-derived proteins were detected in all experimental groups, and a tag protein tagged with the epitope was detected in cells infected with the reovirus having an ovalbumin epitope (FIG. 9B).
  • the reovirus-based vaccine platform of the present invention can be used as a material for preventing and treating various diseases including cancer as well as infectious diseases caused by various viruses, bacteria, and fungi (FIG. 9c).
  • the cancer prevention effect of the reovirus-based vaccine was confirmed in vivo .
  • wild-type reovirus or Ovalbumin antigen (S1OVA257-264)-introduced reovirus was administered intraperitoneally to C57BL/6 mice three times at weekly intervals, and B16F10 melanoma cells and B16F10 melanoma cells and Melanoma cells expressing Ovalbumin-specific antigen (B16F10-OVA) were subcutaneously injected into the left and right flanks at 3 ⁇ 10 6 each (FIG. 10a). Then, tumor development and growth in the mice were monitored, and tumor size was measured using electronic calipers.
  • mice When the tumor volume reached >1500 mm 3 or the vital signs reached the euthanasia criteria, the mice were sacrificed and the tumors were removed. As a result of comparing the tumor sizes of the euthanized mice, the mice that were vaccinated with the OVA antigen-introduced reovirus vaccine (ReoV + OVA257-264) had a significantly reduced B16F10-OVA tumor size compared to other groups. It was confirmed that the reovirus vaccine effectively prevented tumor growth (FIG. 10B). For accurate verification, the sizes of tumors developed from normal B16F10 cells and those from B16F10 cells expressing the Ovalbumin-specific antigen were measured and compared from each mouse.
  • the OVA antigen-introduced reovirus vaccine ReoV + OVA257-264
  • mice inoculated with reovirus into which Ovalbumin antigen was introduced the size of tumors expressing Ovalbumin-specific antigen was significantly reduced compared to normal tumors, and Ovalbumin antigen-expressing tumors compared to mice inoculated with control and wild-type reovirus. 10d)
  • the reovirus vaccine of the present invention effectively inhibited the growth of Ovalbumin-expressing tumors by inducing enhancement of immune function against the Ovalbumin antigen.
  • no significant difference in body weight was found between the control group and the reovirus vaccine-administered group, confirming that the reovirus-based vaccine of the present invention was not toxic (FIG. 10c).
  • melanoma B16F10-OVA cells expressing an Ovalbumin epitope (OVA), a tumor cell-specific antigen were subcutaneously injected into the flanks of C57BL/6 mice at 3 ⁇ 10 5 each. Tumor onset and growth were then monitored and tumor size was measured using electronic calipers.
  • a recombinant reovirus vaccine expressing an OVA-specific antigen was administered intravenously or orally three times on days 4, 11, and 18 after transplantation of tumor cells.
  • the same amount of reovirus (S1-Q251*) not expressing the Vehicle or OVA epitope was administered (FIG. 11a).
  • the tumor volume reached >2500 mm 3 or the vital signs reached the euthanasia criteria, the mice were sacrificed and the tumors were removed.
  • the tumor growth of mice administered with the recombinant reovirus into which the OVA epitope was introduced was noticeably delayed compared to other groups, confirming the tumor growth inhibitory effect of the reovirus into which the epitope was introduced. (FIG. 11b).
  • CD8 + T cells isolated from splenocytes of mice were cultured and treated with the Ovalbumin peptide SIINFEKL to compare the activation levels of T cells.
  • the T cells isolated from the mice administered with the recombinant reovirus into which the OVA epitope was introduced showed a higher level of activation by the antigen SIINFEKL than those of other groups (FIGS. 11c and 11d).
  • the reovirus-based vaccine of the present invention effectively induced the immune function of anticancer immune cells against tumor antigens.
  • the above results prove that the reovirus-based vaccine of the present invention can effectively expose tumor epitopes to the body, activate immune function against tumor antigens, and significantly suppress tumor growth.
  • the present invention relates to a novel vaccine platform based on a reovirus, in which a part of the S1 gene of a reovirus can be replaced with various exogenous epitope-coding genes, and the recombinant reovirus prepared through this infects a target cell and has an epitope It was completed by confirming that diseases related to the epitope can be effectively prevented and treated by not only inducing expression, but also activating the immune function of immune cells for the epitope.
  • vaccines carrying various epitopes can be prepared through relatively simple genetic manipulation technology, and can be administered in various ways, including oral administration, so that SARS-CoV-2 virus infection can be prevented. It can be used in the prevention and treatment of various infectious diseases and cancer, including

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Abstract

본 발명은 레오바이러스 기반의 신규한 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 S1 유전자의 일부를 다양한 외인성 에피토프-코딩 유전자로 대체할 수 있으며, 이를 통해 제조된 재조합 레오바이러스는 타겟 세포를 감염시켜 에피토프의 발현을 유도할 뿐만 아니라, 상기 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화하여 해당 에피토프와 관련된 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼을 이용하면 비교적 간편한 유전자 조작 기술을 통해 다양한 에피토프가 담지된 백신을 제조할 수 있으며, 경구투여를 포함한 다양한 방식으로 투여가 가능하므로, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 포함한 여러 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료 분야에 활용 가능하다.

Description

레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도
본 발명은 레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 2021년 9월 24일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0126694호 및 2022년 9월 26일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0121618호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
바이러스는 유전 물질과 단백질로 이루어진 작은 비세포성 유기체로서, 상이한 유형의 바이러스들이 존재한다. 예를 들어 바이러스는 숙주의 핵 내에서 복제하는 DNA 바이러스, 또는 세포의 세포질 내에서 복제하는 RNA 바이러스일 수 있다. 바이러스는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 더욱이 단일 가닥 RNA 바이러스는 양성(+, 센스) 가닥 또는 음성(-) 가닥일 수 있다. 이와 같은 상이한 유형의 바이러스는 다양한 바이러스성 감염을 유발한다.
오늘날 바이러스 감염에 대항하고 그 확산을 제한하기 위한 가장 중요한 보호 조치는 예방 접종이다. 현대의 백신은 원칙적으로 표면 바이러스 항원에 대한 항체 형성을 유도한다. 백신 효과는 백신에 함유된 바이러스의 항원 구조와 개체군에서 순환하는 균주 사이의 일치 정도에 직접적으로 의존적이다. 대다수 바이러스의 표면 단백질은 일정한 항원 변이(antigenic variation)(항원 소변이(drift))를 겪으며, 백신 균주 조성의 지속적인 갱신이 필요하다. 광범위한 작용의 면역 반응을 유도하는 고도의 면역원성 및 안전한 백신의 개발은 현재 효율적인 암 또는 감염성 질환 예방에서 부딪히는 주요한 문제 중 하나이다. 최근 확산한 SARS-CoV-2에 의한 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 등과 같은 전 세계적인 유행성 질병의 확산과 지속적인 감염을 막기 위해서는 백신의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 아데노바이러스(Ad), 배큘로바이러스 등과 같은 플랫폼을 사용하여 현재 전 세계적으로 많은 바이러스 기반 백신이 개발되고 있다.
바이러스, 세균, 진균 등에 의한 감염성 질환뿐만 아니라 종양을 예방하기 위한 다양한 백신이 개발되고 있으며, 특히 다양한 항원을 담지하여 체내에 약독화된 항원을 안정적으로 전달할 수 있는 전달체에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 상기 전달체로서 다양한 폴리머 기반의 나노입자, 엑소좀, 펩티드 등이 사용되어 왔으나, 체내 안정성이나 독성과 같은 문제가 있으며, 특히 안정적인 항원 전달이 불가능하다는 한계가 있다. 이에, 바이러스의 복제가능성 및 유전자 발현 유도능을 기초로 바이러스 벡터 기반의 백신을 제조하려는 시도가 있었으나, 체내에 부작용을 일으키지 않으면서 외인성 항원을 안정적으로 발현할 수 있는 바이러스 기반 벡터는 아직까지 발굴되지 않고 있다.
한편,　항암바이러스는 (oncolytic virus)는 스스로 복제가 가능하며 정상 세포가 아닌 암세포에만 선택적으로 감염, 증식 및 살상을 유도하는 바이러스로서, 향후 항암제 시장을 변화시킬 제4세대 항암제로 대두되고 있다. 항암 바이러스에 의한 종양 세포의 파괴는 주위 종양 세포들의 감염을 다시 유도하고 이 현상이 반복되어 항암효과가 증폭될 수 있다는 장점이 있다. 특히, 항암 바이러스는 직접 암세포를 공격하는 것 외에도 종양의 혈관내피세포내 감염을 통해 신생혈관 생성을 억제하는 기능도 있다.
대표적인 항암바이러스로는 레오바이러스(Reovirus)가 있다. 레오바이러스는 외피가 없는 것을 특징으로 하는 바이러스로서, 구강-대변 경로를 통해 세포를 감염시킨다. 레오바이러스의 유전체는 8개의 구조 단백질 및 3개의 비구조 단백질을 코딩하는 10개의 분할된 dsRNA를 가지며, 포유류 레오바이러스는 T1L(Lang), T2J(Jones), T3D(Dearing), T3A(Abney), 및 T4N(Ndelle)의 4가지 혈청형이 존재한다. 레오바이러스는 암세포를 효율적으로 감염시키고 용해(lysis)시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 레오바이러스의 종양 내 또는 정맥투여에 대한 임상 시험이 진행되어 높은 치료 안정성 및 항암 효능이 확인되기도 하였다.
항암 바이러스의 반복성 및 항암 효능 등을 기반으로 암은 물론 다양한 질환의 백신 플랫폼으로 활용하려는 시도가 있었으나, 항암 바이러스 면역치료제는 개발 및 생산기술의 난이도가 매우 커 진입장벽이 크다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 레오바이러스의 변이 S1 유전자가 외인성 에피토프-코딩 유전자와의 융합이 가능하며, 따라서 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 백신플랫폼으로 활용될 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 외인성 에피토프-코딩 유전자가 융합된 돌연변이 S1 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에피토프일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로부터 발현된, 상기 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 외인성 에피토프는 외부 캡시드 단백질로서 발현된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된 세포로부터 생성된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신은 감염성 질환 및/또는 암의 예방용 백신일 수 있다. 바람직하게는, 상기 감염성 질환 및/또는 암은 상기 외인성 에피토프와 연관된 질환 및/또는 암일 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 감염성 질환 및/또는 암의 예방용 백신의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 레오바이러스 기반의 신규한 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 S1 유전자의 일부를 다양한 외인성 에피토프-코딩 유전자로 대체할 수 있으며, 이를 통해 제조된 재조합 레오바이러스는 타겟 세포를 감염시켜 에피토프의 발현을 유도할 뿐만 아니라, 상기 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화하여 해당 에피토프와 관련된 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼을 이용하면 비교적 간편한 유전자 조작 기술을 통해 다양한 에피토프가 담지된 백신을 제조할 수 있으며, 경구투여를 포함한 다양한 방식으로 투여가 가능하므로, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 포함한 여러 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료 분야에 활용 가능하다.
도 1a는 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질(좌측) 및 레오바이러스 RP116의 변이된 σ1 단백질(우측)의 비교도이다.
도 1b는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 제조 원리를 도식화한 그림이다.
도 1c는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 작동 원리를 도식화한 그림이다.
도 1d는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 구조체(construct) 설계의 개략도이다.
도 1e는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신의 제조 원리를 나타낸 그림이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 백신플랫폼의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화항체 생성 유도 능력을 확인하기 위해, 음성 대조군(Mock), 야생형 레오바이러스(WT ReoV), S1 유전자의 251번 아미노산 위치에 STOP 코돈 돌연변이를 갖는 돌연변이 레오바이러스(ReoV+Q251*), 또는 돌연변이 S1 유전자에 SARS-Cov-2 수용체 결합 도메인(RBD)이 융합된 재조합 레오바이러스(ReoV+RBD)로 세포를 감염시킨 후 웨스턴 블롯으로 레오바이러스 단백질을 검출한 결과이다.
도 2b는 Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+RBD로 감염된 세포에서 RT-qPCR을 통해 RBD 유전자를 검출한 결과이다.
도 2c는 Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+RBD로 감염된 세포에서 SARS-CoV-2 중화항체(NeuAb; 상단) 및 항-레오바이러스 항체(하단)를 검출한 결과이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능을 확인하기 위해, T 세포 에피토프가 융합된 돌연변이 S1 유전자를 갖는 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물에 존재하는 레오바이러스 유래 단백질(도 3a) 및 외래 에피토프의 RNA 산물(도 3b)을 검출한 결과이다.
도 3c 및 3d는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능을 확인하기 위해, B 세포 에피토프가 융합된 돌연변이 S1 유전자를 갖는 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물에 존재하는 레오바이러스 유래 단백질(도 3c) 및 외래 에피토프의 RNA 산물(도 3d)을 검출한 결과이다.
도 4는 Myc 및 FLAG로 태깅된 Ovalbumin 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 포유동물 세포에 감염시킨 후, 레오바이러스 단백질 및 태그 단백질들의 형광 신호를 검출한 결과이다(스케일 바 = 50μm).
도 5는 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스(ReoV+p15E) 또는 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2(2)가 도입된 레오바이러스로 세포를 감염시킨 후, 레오바이러스 단백질, 태깅 단백질 (Myc, FLAG), 및 SARS-CoV-2 단백질을 검출한 결과이다. 검은색 화살표는 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2(2)와 재조합된 σ1 단백질에 해당하는 크기의 밴드 위치를 나타낸다.
도 6a는 Myc 및 FLAG로 태깅된 S21P2 또는 OVA257-264 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 S1 유전자의 개략도이다.
도 6b는 S21P2 또는 OVA257-264 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스로 세포를 감염시킨 후 레오바이러스 및 FLAG 태그 단백질을 검출한 결과이다.
도 7a는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신의 in vivo 효능을 확인하기 위해, 일 실시예에 따른 레오바이러스 백신(SARS-CoV-2 항원 S21P2이 도입된 레오바이러스 백신)을 마우스에 투여한 과정을 나타낸 개략도이다.
도 7b는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 체중을 비교한 그래프이다.
도 7c는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 혈청에서 분리한 중화항체에 의한 HEK293T 세포 감염 저지능을 비교한 그래프이다.
도 7d는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 면역글로불린을 검출한 결과이다.
도 8a는 다양한 재조합 레오바이러스를 세포에 감염시킨 후 유세포분석으로 MHC-I에 결합된 에피토프를 검출한 결과이다(SIINFEKL: OVA257-264 에피토프).
도 8b 및 8c는 다양한 재조합 레오바이러스를 세포에 감염시킨 후 유세포분석으로 TNFα 및/또는 INFγ를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 측정한 결과(도 8b) 및 이의 정량화 그래프(도 8c)이다.
도 9a는 종양 에피토프가 융합된 RP116 레오바이러스 σ1 단백질을 나타낸 그림이다.
도 9b는 다양한 레오바이러스를 세포에 72시간 동안 감염시킨 후 웨스턴 블롯으로 레오바이러스 단백질(좌측) 및 ovalbumin 에피토프(OVA257-267)에 태깅된 Myc 및 FLAG 단백질을 검출한 결과(우측)이다.
도 9c는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 면역반응 유도 원리를 나타낸 그림이다.
도 10a는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 마우스에 야생형 또는 외래 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 투여한 후 종양세포를 주입한 과정을 나타낸 그림이다.
도 10b는 레오바이러스 투여 후 종양세포가 주입되었던 마우스들의 종양 크기를 비교한 결과를 나타낸다. 각 개체에서, 좌측의 종양은 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양이며, 우측은 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양이다.
도 10c는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 체중을 비교한 그래프이다.
도 10d는 레오바이러스 투여 후 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양과 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양 크기를 정량화한 결과이다.
도 11a는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 흑색종 치료 효과를 확인하기 위한 in vivo 실험 스케쥴 및 조건을 나타낸 그림이다.
도 11b는 흑색종 마우스 모델에 재조합 레오바이러스를 투여한 후 시간에 따른 종양 성장 정도를 비교한 결과이다(Vehicle, 미처리 대조군; S1-Q251*, 에피토프가 도입되지 않은 재조합 레오바이러스 투여군; 및 S1-OVA, Ovalbumin 항원이 도입된 재조합 레오바이러스 투여군).
도 11c 및 11d는 흑색종 마우스 모델에 재조합 레오바이러스를 투여한 후 생성된 OVA 특이적 T 세포 활성화의 수준을 관찰하고(도 11c), 정량화한 결과(도 11d)이다.
본 발명은 레오바이러스의 역유전학(Reverse genetics) 기술을 이용한 Quick Change-기반 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 Sigma 1 단백질(δ1 단백질)의 헤드 부분이 다양한 외래 펩티드로 교체될 수 있으며, 따라서 다양한 항원 에피토프를 도입하여 감염성 질환이나 암을 포함한 다양한 질환의 예방 내지 치료용 백신으로 활용될 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 즉, 본 발명자들은 역유전학 기술을 이용하여, 특정 아미노산 서열 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질에 암 또는 감염성 질환에 대한 에피토프가 융합하여 발현되도록 에피토프 염기 서열을 삽입하는 “빠른 교환” 방법을 통해, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 플랫폼을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 변이 Sigma 1 단백질은 돌연변이 레오바이러스인 RP116의 돌연변이 Sigma 1 단백질로서 야생형 Sigma 1 단백질과 비교하여 (N 말단 기준) 251번 내지 455번 아미노산이 결실된, 절단된(truncated) 단백질인 것을 특징으로 한다. 상기 절단된 Sigma 1은 종결 코돈이 도입된 돌연변이 S1 유전자에 의해 코딩되는데, 상기 돌연변이 S1 유전자는 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드 C가 T로 치환됨에 따라, 시작코돈(개시코돈)으로부터 251번째 코돈(즉, 763CAA으로서, 251Q를 코딩함)이 종결 코돈으로 치환된 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 상기 종결 코돈 이후에 외인성 펩타이드를 코딩하는 유전자를 연결하면 절단된 Sigma 1과 함께 상기 외인성 펩타이드가 융합되어 발현되는 것을 확인하였으며, 결과적으로 세포를 감염하여 외인성 펩타이드의 발현을 안정적으로 유도할 수 있는 재조합 레오바이러스를 제작할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 SARS-CoV-2 에피토프 및 종양항원을 포함한 다양한 항원 단백질들을 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 도입하여 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하였으며, 상기 재조합 레오바이러스는 감염된 세포에서 도입된 항원의 발현을 안정적으로 유도하며 해당 항원에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 재조합 레오바이러스 기반 벡터는 도입할 수 있는 항원의 종류에 제한이 없으므로 다양한 바이러스, 세균, 진균 등에 의한 감염성 질환은 물론 암의 예방 및 치료를 위한 백신플랫폼으로 사용 가능하다. 또한, 재조합 레오바이러스는 그 자체로서는 질병을 일으키지 않는 것으로 확인된 안전한 바이러스이므로 예상치 못한 부작용의 위험이 없으며, 가혹한 환경 조건에서도 안정성을 유지할 수 있으므로 실온이나 4℃의 낮은 온도는 물론, -20℃의 저온에서도 보관이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 음료 또는 식품의 형태로 경구투여가 가능한 이점이 있다. 또한 레오바이러스는 생산성이 높으며 생산공정이 잘 확립되어 있기 때문에, 비교적 저비용으로 다량의 바이러스 기반 백신을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로를 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
레오바이러스(respiratory enteric orphan virus, REO virus)는 이중가닥의 RNA 단편을 게놈으로 갖는, 외피가 없는 (non-enveloped) 20면체의 바이러스이다. 레오바이러스는 건강한 인간의 소화기 및 호흡기에서 흔하게 분리되며, 병원성이 없는 바이롬(virome)이다. 특히, 레오바이러스는 다양한 종양세포를 감염 및 사멸시킬 수 있는 종양용해성 바이러스(oncolytic virus)로 알려져 있다. 즉, 레오바이러스는 일반적인 종양용해성 바이러스와 마찬가지로 정상세포에는 영향을 거의 미치지 않으면서 암세포만 특이적으로 감염시켜 이의 사멸을 유도할 수 있으므로 부작용의 문제가 낮은 장점이 있으며, 1차 감염된 암세포에서 증식한 후 주변 및 멀리 떨어진 암세포까지 감염시킬 수 있어 광범위한 항암효과를 일으킬 수 있다는 장점이 있다. 레오바이러스 유전체는 8개의 구조 단백질 및 3개의 비구조 단백질을 코딩하는 10개의 개별 세그먼트(segments)로 구성되어 있다: 3개의 Large 세그먼트(L1, L2, L3), 3개의 Medium 세그먼트(M1, M2, M3), 및 4개의 Small 세그먼트(S1, S2, S3, 및 S4). 레오바이러스의 외부 캡시드는 4가지 단백질로 구성된다: 시그마-1, 시그마-3, 람다-2, 및 mu-1. 시그마-1은 레오바이러스의 세포-부착 단백질로서, 타겟세포의 수용체에 결합하여 바이러스가 세포를 감염할 수 있게 한다.
상술한 바와 같이 야생형 레오바이러스는 항암 바이러스로서의 유용성을 갖는다. 그러나, 야생형 레오바이러스는 체내 주입시 중화항체 등에 의해 항암 기능이 약화될 수 있는 문제점이 있고, 암세포의 종양미세환경 등에 의해 레오바이러스의 항암 기능이 억제될 수 있는 위험이 있다. 나아가, 레오바이러스가 암세포가 아닌 정상 세포를 감염시켜 숙주에 이상을 일으킬 문제점도 여전히 존재한다. 본 발명자들은 야생형 레오바이러스의 숙주 독성 문제를 해결하기 위해 야생형 시그마 1 단백질(Sigma 1 protein) 코딩 유전자 중간에 미성숙 STOP 코돈(TAA)이 존재하여 절단된(truncated) 형태의 시그마 1 단백질(즉, 돌연변이 시그마 1 단백질)을 발현하는 약독화된 레오바이러스 (attenuated reovirus, AV)를 제조하였다. 상기 약독화된 레오바이러스는 야생형 레오바이러스와 비교해 숙주에 대한 독성이 더욱 감소된 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 야생형 레오바이러스의 캡시드 중 외부로 노출되는 부착 단백질인 시그마 1을 코딩하는 유전자(S1 유전자)에서, 단백질의 251번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)을 암호화하는, 5' 말단으로부터 763번째 C가 T로 치환됨에 따라 763CAA가 763TAA(종결 코돈)로 전환되는 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 상기 미성숙 종결 코돈 돌연변이로 인해 야생형 시그마 1 단백질의 251번째 아미노산부터 절단(결실)되어, 구형 헤드가 절단(결실)된 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 약독화된 레오바이러스는 RP116일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 시그마 1 단백질은 야생형 시그마 1 단백질과 비교하여 N 말단으로부터 251번 내지 455번 아미노산이 결실된, 절단된(truncated) 시그마 1 단백질이다. 달리 말하면, 본 발명에 따른 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스 시그마 1 단백질의 1번 내지 250번째 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 1번 내지 250번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 상기 절단된 시그마 1 단백질, 즉 변이된 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질에 비해 약독화된 것을 특징으로 한다. 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질은 S1 세그먼트(S1 segment; “S1 유전자” 등으로도 지칭됨)에 의해 암호화(코딩)된다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 돌연변이 S1 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열의 251번 내지 455번 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 종결 코돈으로의 치환은 S1 유전자의 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환되어 발생한 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다:
(a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
서열번호 4는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1번 내지 765번 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 각 gene segment의 염기서열 및 이들이 코딩하는 각 단백질의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열목록에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 특정 서열번호가 병기된 유전자(핵산 분자)는, 해당 서열번호의 염기서열(폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하거나 해당 서열번호의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 염기서열의 핵산 분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 핵산 분자는 해당 서열번호로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
마찬가지로, 특정 서열번호가 병기된 폴리펩타이드(단백질)는, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하거나 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드는 이를 구성하는 폴리펩타이드 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 결실, 치환, 또는 삽입에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩타이드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 폴리펩타이드는 해당 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상술한 돌연변이 외에는 야생형 레오바이러스와 동일한 야생형 염기 서열 및 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다만, 바이러스의 특성상 야생형 서열이라도 바이러스의 기능 및 특성이 유지되는 범위 내에서 일부 염기 또는 아미노산의 결실, 치환, 및/또는 삽입의 돌연변이가 일어날 수 있음은 자명하다. 따라서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상기 돌연변이 외에도 바이러스의 기능 (항원에 대한 중화항체 생성 유도 효과, 항암효과 등)을 헤치지 않는 야생형 서열의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스의 유전체 서열은 본 명세서의 서열목록에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 임의의 야생형 레오바이러스로부터 유래될 수 있으며, 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있는 레오바이러스과 (Reovirus family)의 구성원일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 야생형 인간 레오바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1, 인간 레오바이러스 타입 2, 및 인간 레오바이러스 타입 3, 인간 레오바이러스 타입 4에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1 균주 Lang, 인간 레오바이러스 타입 2 균주 Jones, 인간 레오바이러스 타입 3 균주 Dearing 또는 Abney 및 인간 레오바이러스 타입 4 균주 Ndelle 에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스는 타입 3 레오바이러스일 수 있다. 뿐만 아니라, 또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 인간을 제외한 영장류 (챔팬지, 고릴라, 짧은 꼬리 원숭이, 원숭이 등), 설치류 (생쥐, 쥐, 게리빌스쥐, 햄스터, 토끼, 기나아피그 등), 개, 고양이, 일반 가축 (소, 말, 돼지, 염소)을 포함하는 기타 포유류 종의 세포에 대해 향성 (tropism)을 나타내는 하나 또는 그 이상의 레오바이러스로부터 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “외인성 에피토프”란 특정 질환의 예방 또는 치료 등의 목적을 위해 레오바이러스를 통해 세포 또는 신체에 전달하고자 하는 외인성 펩타이드를 지칭한다. “에피토프(항원 결정기 또는 항원기)”란 항체, B 세포, T 세포 등이 식별하는 항원의 특정 부위를 지칭하는 것으로서, 면역계는 외래의 에피토프를 인식하여 이에 대한 면역반응을 일으킬 수 있다. 외인성 에피토프는 특정 종류나 서열의 에피토프로 한정되지 않는다는 것이 자명하며, 당업자는 목적에 따라 원하는 에피트포를 제한 없이 선택할 수 있다. 예컨대, 레오바이러스를 이용하여 특정 질환의 예방 또는 치료의 목적을 달성하고자 하는 경우, 해당 질환과 연관성이 있는 항원의 에피토프를 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프일 수 있다. 또는, 본 발명에 있어서 질환(감염성 질환, 암 등)은 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 항원에 의해 유도되거나 발생하는 질환일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 있어서 암은 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 항원(종양항원)을 발현하는 암일 수 있다. 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 본 발명에 따른 재조합 벡터 내에 하나 이상 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터가 2 이상의 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 경우, 상기 유전자는 서로 동일하거나 서로 상이한 종류일 수 있다.
본 명세서에서, “감염”은 바이러스와 같은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여 발육, 증식하는 것으로, 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식하는 것을 의미하며, 그 결과 숙주는 병리학적인 변화를 받아 질병이 발생할 수 있다.
본 발명에 있어서, “감염성 질환”이란 병원성 미생물이 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식함으로써 발생하는 질환을 의미하며, 감염 경로, 전염성 여부에 따라 여러 종류로 구분될 수 있다. 상기 감염은 바이러스성 감염, 진균 감염, 세균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 감염성 질환은 C형 간염, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유도 에이즈(AIDS), 결핵, 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증, 로타바이러스(rotavirus)에 의한 영유아장염, 및 노로바이러스(norovirus)에 의한 비세균성 급성위장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 코로나 바이러스 감염증-19일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 해당 바이러스 특유의 단백질 또는 펩티드를 외인성 펩타이드로 적용할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 바이러스의 외피 단백질(envelope proteins), 캡시드 단백질, 스파이크 단백질(spike proteins), 막 단백질(membrane proteins), 수용체 결합 도메인(receptor binding domains), 핵산 (DNA 또는 RNA), 바이러스 효소(viral enzymes), 및 헤마글루티닌(hemaglutinin) 등으로부터 선택될 수 있으나, 당업자는 예방 또는 치료를 목적하는 바이러스 감염증에 따라 적절한 바이러스 단백질을 선택할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 SARS-CoV-2 에피토프(SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인)가 도입된 재조합 레오바이러스를 제작하여 이의 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 효과를 확인하였다. 따라서, SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른, SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 패혈증, 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 사이토카인 폭풍(cytokine storm), 사이토카인 방출 증후군, 전신 염증반응 증후군, 다발성 장기부전, 폐섬유증 등을 예방 또는 치료할 수 있다. 바람직하게는, 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 상기 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 서열번호 19 또는 22의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)”는 SARS-CoV-2가 일으키는 중증 호흡기 증후군이다. 2019년 12월에 중국에서 첫 사례가 보고되었고, 전 세계적으로 퍼져나가면서 유행병으로 자리잡았다. COVID-19의 증상은 다양하지만 발열, 기침, 두통, 피로, 호흡 곤란, 후각 및 미각 상실 등이 있다. 증상은 바이러스에 감염된지 1~14일 안에 나타난다. 특히 감염된 사람 중 3분의 1은 무증상 감염자로 눈에 띄는 증상이 나타나지 않는다. 환자로 분류될 만큼 눈에 띄는 81%의 사람들은 경증에서 중증의 증상이 발생하며, 14%의 사람들은 호흡 곤란, 저산소증 등 증상이 발생하며, 5%의 사람들은 호흡기 부전, 쇼크 등 심각한 증상이 발생한다. 고령자는 심각한 증상이 발생할 확률이 더 높으며, 일부 사람들은 회복 후 긴 시간동안 접한 COVID-19 때문에 장기 손상이 관찰되었다.
SARS-CoV-2는 30 kb의 뉴클레오티드를 가지며 4개의 중요한 구조 단백질을 가지고 있다; Nucleocapsid(N), Spike(S), Membrane(M), Envelope(E) 단백질. 그 중 S 단백질은 숙주 세포의 수용체(receptor)와 결합하는 것으로 중요한 부위이며, 세포 내로 viral nucleocaspid를 전달하며 복제(replication)가 이루어진다.
SARS-CoV-2를 combating하는 가장 간단하고 직접적인 방법은 인간 세포로 들어가는 바이러스를 중화시키는 것으로, SARS-CoV-2가 세포 내로 유입되어 복제가 일어나고 새로운 비리온(virion)이 분비되어 다른 세포를 감염시키는 메커니즘을 차단하는 것이다.
SARS-CoV-2는 인간 세포의 angiotensin converting enzyme 2(ACE2) 수용체와 결합하여 바이러스 복제가 가능한 것으로 알려졌다. 코로나 바이러스의 S 단백질 중 receptor-binding domain(RBD)는 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 영역이며, SARS-CoV-2 감염에 대한 강력한 중화 항체를 유도하는 다중 형태 의존적 에피토프(multiple conformational-dependent epitopes)를 포함하고 있기 때문에 코로나바이러스 감염증-19의 치료 및 백신 개발에 핵심 표적이 될 수 있다(J. Immunol 2005;174:4908-4915).
본 발명에 있어서 종양항원은 암세포 특이적으로 발현되거나 암세포에서 특히 발현이 높은 것이라면 제한 없이 포함되고, 구체적인 종류로 제한되는 것은 아니나, Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS 등으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 치료하고자 하는 암 종류에 따라 당업계에 공지된 적절한 종양항원을 선택하여 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 ovalbumin 항원 (OVA257-264, “OVA 항원”)이 도입된 재조합 레오바이러스를 제작하여 상기 바이러스에 의한 면역세포 활성화 기능을 확인하였으며, 상기 재조합 바이러스가 투여시 상기 항원을 발현하는 종양의 성장이 예방 및 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 종양항원을 도입하여 암의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
이외에도, 상기 에피토프는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 SARS-CoV-2 RBD, OVA257-264, OVA323-339, Adpgk, Rpl18, P15E, S21P2(1), 및 S21P2(2) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 에피토프는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 카르복시 말단에서 융합 단백질을 형성하거나 구성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 “재조합 벡터(recombinant vector)”는 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 구체적으로, 상기 벡터는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 의미하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드 (cosmid), 에피솜, 바이러스, 및 삽입 가능한 DNA 단편, 즉 동종 재조합에 의해 숙주 세포 게놈에 삽입될 수 있는 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 DNA, 헤어핀 DNA, 또는 미니서클 DNA로서 이중가닥의 DNA로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 트랜스포존 서열 및 목적 DNA를 포함하여 이를 타겟 세포 내로 전달할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 당업자는 당업계에 공지된 다양한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 인핸서 (enhancer) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있고, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우, 벡터가 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 또한, 신호 서열로 poly A signal (폴리 A 시그널) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 myc 태그를 포함할 수 있다. 상기 태그의 벡터 내 위치에는 제한이 없으나, 바람직하게는 돌연변이 S1 유전자의 하류에 위치할 수 있다. 또는, 상기 태그는 외인성 에피토프-코딩 유전자의 일측 측면 또는 양측 측면에 위치할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 다양한 기술을 통해 세포 내로 전달될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 벡터는 인산칼슘 공동 침전 (calcium phosphate coprecipitation); 전기천공법 (electroporation); 미세유체 유전자 편집 (Microfluidics gene editing); 뉴클레오펙션 (nucleofection); 세포 스퀴징 (cell squeezing); 소노포레이션 (sonoporation); 광학 형질감염 (optical transfection); 임페일펙션 (impalefection); 유전자 총 (gene gun); 마그네토펙션 (magnetofection); 바이러스 형질도입 (viral transduction); DEAE-덱스트란 트랜스펙션; 리포펙션 (lipofection); 또는 덴드리머, 리포좀, 또는 양이온성 중합체를 통한 형질감염에 의해 세포에 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에 따른 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인(align) 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 251번 코돈(즉, 종결 코돈)의 하류에 위치하여 S1 유전자의 결실된 부위를 대체할 수 있다. 예컨대, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 약독화된 레오바이러스의시그마 1 단백질을 암호화하는 염기서열의 5' 말단에서 763번째 뉴클레오티드 이후(바람직하게는, 765번째 뉴클레오티드 이후)의 위치에 치환 또는 삽입되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질을 암호화하는 S1 유전자 (예를 들어, 서열번호 4 또는 5)의 염기서열에서 5' 말단으로부터 763번 (또는 766번) 내지 1416번째 뉴클레오티드의 위치 중에서 특정 위치의 염기 서열 대신 치환되는 것일 수 있고, 특정 위치의 염기 서열 사이에 삽입되는 것일 수도 있다.
본 발명에 따른 외인성 에피토프-코딩 유전자는 10 내지 400개, 10 내지 300개, 10 내지 250개, 10 내지 220개, 50 내지 400개, 50 내지 300개, 50 내지 250개, 100 내지 400개, 100 내지 300개, 100 내지 250개, 또는 150 내지 250개 뉴클레오티드 길이일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자에 직접 연결될 수도 있으나, 태그 유전자 또는 링커 등을 매개로 돌연변이 S1 유전자에 연결될 수도 있다. 예컨대, 상기 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질에서 251-455번째 아미노산 위치에 포함되는 에피토프의 아미노산 서열의 전후로 링커(linker), Myc 단백질, FLAG 단백질, 및 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이들의 순서에는 제한이 없다. 상기 2A 펩타이드는 예컨대 P2A, T2A, E2A, 또는 F2A 등을 포함하는 2A 펩타이드 중 선택될 수 있으며, 이의 종류에 제한은 없다.
상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 세포 내로 도입시 전사 및 번역을 거쳐 변이된(절단된) 시그마 1 단백질 및 상기 외인성 에피토프가 융합된 상태의 단백질을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 야생형 시그마 1 단백질의 헤드 부분을 외인성 에피토프가 대체한 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로부터 발현된, 상기 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 제공한다. 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질의 1번 내지 250번째 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질의 250번째 아미노산 이후의 아미노산 서열은 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
바람직하게는, 상기 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자로부터 생성되는 융합 단백질은 레오바이러스의 캡시드(capsid)로서 발현되는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 융합단백질은 기타 레오바이러스 성분과 함께 조립되어, 재조합 레오바이러스의 캡시드 단백질로서 외부에 디스플레이(display)될 수 있다. 상기 재조합 레오바이러스가 세포에 감염되고 나면, 시그마 1 단백질의 헤드 부분에 위치하는 외인성 에피토프가 세포에 노출되므로, 상기 에피토프에 대한 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 상기 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자 외에 레오바이러스의 생성에 필요한 기타 레오바이러스 유전자를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 레오바이러스의 필수 유전자를 포함할 수 있다. 상기 필수 유전자는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자로부터 발현된 재조합 단백질은 레오바이러스의 필수 유전자들로부터 발현된 기타 레오바이러스 성분과 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성할 수 있다. 또는, 상기 레오바이러스 필수 유전자들은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 별개의 벡터에 도입되어, 본 발명의 재조합 벡터와 독립적으로 발현될 수 있다. 이 때, 각 벡터로부터 생성된 발현 산물은 함께 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 융합단백질은 기타 레오바이러스 성분과 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성하므로, 바이러스 감염 기작을 통해 세포에 노출될 수 있다. 레오바이러스의 필수 유전자들은 공지되어 있으며, 이의 서열정보는 공공 데이터베이스를 통해 확인될 수 있다. 예컨대, 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4 유전자의 서열정보는 각각 GenBank 등록번호 EF494435.1, EF494436.1, EF494437.1, EF494438.1, EF494439.1, EF494440.1, EF494441.1, EF494442.1, EF494443.1, 및 EF494444.1로 확인할 수 있으나, 이는 대표예일뿐, 상기 서열정보로 한정되는 것은 아니다. 이외에도, 레오바이러스 유전자 서열은 본 명세서의 서열목록에 구체적으로 제시되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된(즉, 형질전환, 형질감염, 또는 형질주입된) 세포를 제공한다. 상기 세포는 도입된 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자를 발현하여 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 생성할 수 있다.
궁극적으로는, 상기 세포는 상기 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 포함하는 재조합 레오바이러스를 생성한다. 따라서, 온전한 레오바이러스의 생성을 위해 상기 세포에는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입될 수 있다. 혹은, 상기 유전자들은 상기 세포의 유전체 내에 삽입되어 존재할 수도 있고, 혹은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 함께 삽입되어 있을 수 있다.
또한, 상기 세포에는 상기 재조합 단백질의 발현 및 재조합 레오바이러스의 생성을 보조할 수 있는 기타 성분들을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 백시니아 바이러스 캡핑 효소, D1R 및 D12L의 이종이량체, 및 Reovirus의 융합 단백질인 FAST-p10 등을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스를 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 유전체 내에 포함하는 재조합 레오바이러스를 제공한다. 따라서, 상기 재조합 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 외인성 에피토프는 변이된(절단된) 시그마 1 단백질의 헤드에 위치하여 바이러스의 외부 캡시드에 존재한다. 바람직하게는, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 생성된 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 돌연변이 시그마 1 및 외인성 에피토프의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, “백신 (vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증이나 암 등의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다.
백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 백신은 시그마 1 단백질이 절단되어 약독화된 레오바이러스를 기반으로 하여, 이의 절단된 부위에 여러 가지 암 또는 감염성 질환을 유발하는 에피토프가 융합된 형태로 발현되도록 제조될 수 있으며, 예컨대, 상기 약독화된 레오바이러스의 절단된 시그마 1 단백질 및 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
상기 면역증강제(adjuvant)로 사용하는 물질에는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 명반(Alum), MPL(monophosphoryl lipid A), 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 레오바이러스에는 본 명세서에 기재된 에피토프를 포함한 다양한 외인성 에피토프가 도입될 수 있으며, 상기 레오바이러스의 투여시 상기 외인성 에피토프의 안정적이고 반복적인 발현을 유도하여 상기 에피토프에 대한 면역세포 등의 면역기능을 증진시킬 수 있는 바, 다양한 질환의 예방 내지 치료를 위한 백신플랫폼을 제공한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에서 상기 질환은 본 발명에 따른 외인성 에피토프와 연관된 질환일 수 있다. 예컨대, 상기 질환은 상기 에피토프를 포함하는 항원에 의해 유발되는 질환일 수 있으며, 상기 질환이 암인 경우, 상기 암은 본 발명에 따른 외인성 에피토프를 포함하는 종양항원을 발현하는 암일 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 백신 조성물은 재조합 레오바이러스를 통해 하기와 같은 특징을 달성할 수 있다:
(a) 상기 재조합 레오바이러스로 감염된 세포에서 상기 외인성 에피토프의 발현을 유도함;
(b) 항원제시세포에 의한 상기 외인성 에피토프의 제시를 유도함;
(c) 상기 외인성 에피토프에 의한 T 세포의 사이토카인 생성을 활성화함; 및
(d) 상기 외인성 에피토프에 대한 중화항체의 생성을 유도함.
또한, 본 발명의 재조합 레오바이러스에 도입된 하나 이상의 에피토프는 T 세포 또는 B 세포가 항원을 식별하게 하여, 숙주에서 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도함으로써 면역 반응을 일으킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “중화 항체(neutralizing antibody)”란 병원체에 결합하여 세포를 감염시키거나 질환을 야기하는 병원체의 능력을 방해하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 의미한다.
본 발명에 있어서, “세포성 면역”이란 한 림프계 세포가 어떤 항원에 직접적으로 면역반응을 일으키는 면역 활동을 말한다. 백혈구 세포가 한 항원에 작용하여 그 세포를 먹는 대식작용을 하거나, 독성 세포 반응을 일으켜 항원을 제거하는 면역 활동을 말한다. 체내에서 혈청 항체에 의해 행해지는 체액성 면역과 함께 면역계를 구성하고 있으며, 대표적으로 세포 독성을 가지는 T 세포의 작용을 들 수 있다. T 세포는 B 세포와 결합하여 항체를 구성한 후 직접적으로 항원과 접촉해 항원을 파괴시킨다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현될 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 질환은 상기 에피토프와 연관된 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 바이러스 에피토프를 도입하여 해당 바이러스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 종양항원을 도입하여 해당 암의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 세포는 포유동물 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바이러스 에피토프 및 종양항원은 상술하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 피부암은 편평상피세포암, 기저세포암, 및 흑색종에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 흑색종은 전이성 흑색종일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 PD-L1을 발현 또는 발현하지 않는 암일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 암 발병억제 유전자 (p53, Rb 등)의 돌연변이 또는 RAS 활성 돌연변이를 갖는 암일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 암은 야생형 레오바이러스에 대해 저항성이 있는 암일 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 재조합 벡터, 상기 세포, 또는 상기 재조합 레오바이러스의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 특히, 레오바이러스는 매우 높은 안정성을 가지므로 음료 또는 식품의 형태로 경구투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상술한 약학적 조성물에 대한 설명은 백신 조성물에도 동일하게 적용된다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 다양한 감염성 질환, 알러지, 또는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 재조합 레오바이러스를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 벡터, 세포, 또는 재조합 레오바이러스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 벡터, 세포, 또는 재조합 레오바이러스는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 감염성 질환, 알러지, 및/또는 암의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(S1) 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(S2) 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류에 외인성 에피토프-코딩 유전자를 삽입하거나, 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류 서열을 외인성 에피토프-코딩 유전자로 치환하는 단계.
상기 재조합 벡터는 역진화 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 역진화 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 S1 세그먼트 RNA를 생산할 수 있도록 제조된 바이러스 벡터를 의미할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 통해 제조될 수 있다. T7 RNA 중합효소 프로모터로부터 바이러스 RNA 세그먼트(segment)가 전사될 수 있도록 벡터를 구성하며, 3' 말단은 벡터에 있는 리보자임(ribozyme)에 의해 자연히 형성되어 벡터를 도입한 T7 중합효소 발현세포에서 바이러스 RNA가 생산되고 이를 이용하여 바이러스 단백질이 합성되게 되어 역진화 시스템(reverse genetics sytem)이라고 명명하고 있다. 이는 RNA 바이러스의 변이주를 디자인하여 만들어내는 유용한 방법이다.
상기 제조방법은 상기 단계 (S2) 이후에 (S3) 상기 (S2) 단계에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 세포는 바람직하게는 세포일 수 있다. 또는, 상기 세포는 BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 세포에 도입된 바이러스는 세포 내에서 바이러스 유전자를 발현하여 복제 및 증식될 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 레오바이러스 기반 백신 플랫폼의 제조 원리
σ1 단백질(시그마 1 단백질)은 야생형(WT) 레오바이러스 외부 캡시드 단백질로, 레오바이러스는 σ1 단백질을 통해 타겟 세포 표면의 단백질인 JAM-A를 인식 및 결합하여 세포 내로 진입한다. 레오바이러스 RP116은 σ1 단백질을 발현하는 S1 세그먼트(S1 유전자) 중 763번 뉴클레오티드가 C에서 T로 치환된 레오바이러스 돌연변이이다. 상기 뉴클레오티드의 치환으로 인해 RP116은 CAA(아미노산 251Q)가 763TAA(STOP 코돈)로 대체되는 독특한 돌연변이를 갖는다. 따라서, RP116은 야생형 레오바이러스가 생성하는 σ1 단백질에 비해 짧은 σ1 단백질을 생성한다. RP116은 높은 역가로 생성될 수 있으며 안정성이 높아 종양 내, 정맥 내, 및/또는 경구 투여를 통한 종양용해 면역요법으로 활용될 수 있다(도 1a).
RP116의 독특한 σ1 단백질의 생성은 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 구형 헤드가 바이러스 복제에 필수적이지 않다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 σ1 단백질의 구형 헤드를 다양한 기타 병원체 유래의 항원 단편으로 교체할 수 있으리라고 예측하였다. 이제, 본 발명자들은 RP116 유래 σ1 단백질에 200개의 아미노산 이내 혹은 그 이상의 항원부위를 추가하여 다양한 방식으로 제조 가능한 혁신적이고 안전한 레오바이러스 백신 플랫폼을 제조하고자 하였다(도 1b). 특히, 피막이 없는 레오바이러스는 가혹한 환경 조건에도 안정하며, 따라서 음료 또는 식품 등의 형태로도 투여가 가능한 이점이 있다. 경구투여시 레오바이러스는 소장의 M세포를 우선적으로 감염시키며, σ1 단백질에 재조합된 다양한 종양 특이적 항원 및 병원체등이 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다(도 1c).
본 발명자들은 레오바이러스의 역유전학(Reverse Genetics) 시스템에 기반한 빠른 교환 (Quick Exchange) 기술을 이용하여 백신 플랫폼을 제조하였다. 레오바이러스 역유전학 시스템은 총 10개의 바이러스 유전자의 개별 단편(Kobayshi et al., 2007) 또는 다중 유전자 단편을 운반하는 벡터로 구성된다(Kobayashi et al., 2010). 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 레오바이러스 유래 유전자를 삽입하기 위한 벡터로 pUC19 vector를 사용하였으나, 이는 대표예일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명에 따른 레오바이러스의 시그마 1 단백질을 발현하기 위한 벡터로는 pS1Att, pS1XX, pL1, pSet2, pSet3, 및 pSet4 등이 사용될 수 있다. T7 RNA 중합효소와 동시에 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에서는 바이러스 유전자가 전사되어 궁극적으로 24 내지 72시간 이내에 복제 가능한 레오바이러스 입자가 생성된다. RP116의 S1 세그먼트 중 STOP 코돈 돌연변이 (야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 251번 아미노산 위치) 이후에(즉, 하류) 제한효소 인식부위를 설계하여 도입함으로써 251 내지 C-말단의 부위 (즉, 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 251번 내지 455번 아미노산)를 간편하게 비-레오바이러스의 항원으로 대체할 수 있다. 예를 들어, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 변이된 S1 유전자의 250번 코돈 이후에 탐지 목적의 Myc 태그 및 FLAG 태그 등을 결합할 수 있으며, 다양한 외래 에피토프를 융합할 수 있다. 또한, 보조적인 벡터, 즉 백시니아 바이러스 캡핑 효소, D1R 및 D12L의 이종이량체, 및 Reovirus의 융합 단백질인 FAST-p10 등을 co-transfection하면 재조합 레오바이러스의 생성율을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한 바이러스의 감염 전에 키모트립신 처리를 병행하면 생산용 세포주 (BHK, L929, vero 세포 등)에 대한 바이러스의 부착 및 진입을 더욱 용이하게 할 수 있다(도 1e).
본 발명의 실시예에서 사용된 변형된 레오바이러스(RP116)의 시그마 1 단백질 (2가지 서열을 나타냄) 및 이를 암호화하는 유전자 서열은 아래 표 1에 나타냈다. 또한, 본 발명의 실시예에서 사용된 에피토프의 아미노산 서열, construct 아미노산 서열, 및 코돈 최적화된 construct DNA 서열은 하기 표 2에 나타냈다.
구분 서열 서열번호
RP116 sigma-1 protein (1) MDPRLREEVVRLIIALTSDNGVSLSKGLESRVSALEKTSQIHSDTILRITQGLDDANKRIIALEQSRDDLVASVSDAQLAISRLESSIGALQTVVNGLDSSVTQLGARVGQLETGLAELRVDHDNLVARVDTAERNIGSLTTELSTLTLRVTSIQADFESRISTLERTAVTSAGAPLSIRNNRMTMGLNDGLXLSGNNLAIRLPGNTGLNIQNGGLQFRFNTDQFQIVNNNLTLKTTVFDSINSRXGAXE 1
RP116 sigma-1 protein (2) MDPRLREEVVRLIIALTSDNGASLSKGLESRVSALEKTSQIHSDTILRITQGLDDANKRIIALEQSRDDLVASVSDAQLAISRLESSIGALQTVVNGLDSSVTQLGARVGQLETGLAELRVDHDNLVARVDTAERNIGSLTTELSTLTLRVTSIQADFESRISTLERTAVTSAGAPLSIRNNRMTMGLNDGLTLSGNNLAIRLPGNTGLNIQNGGLQFRFNTDQFQVVNNNLTLKTTVFDSINSRIGATE 2
RP116 sigma-1 gene (full length) TGAACTCCGACATTTTTATTGTAGATGATTACATACATATATGTCTTCCAGCTTTTGACGGTTTCTCTATAGCTGACGGTGGAGATCTATCGTTGAACTTTGTTACCGGATTGTTACCACCGTTACTTACAGGAGACACTGAGCCCGCTTTTCATAATGACGTGGTCACATATGGAGCACAGACTGTAGCTATAGGGTTGTCGTCGGGTGGTGCGCCTCAGTATATGAGTAAGAATCTGTGGGTGGAGCAGTGGCAGGATGGAGTACTTCGGTTACGTGTTGAGGGGGGTGGCTCAATTACGCACTCAAACAGTAAGTGGCCTGCCATGACCGTTTCGTACCCGCGTAGTTTCACGTGAGGATCAGACCACCCCGCGGCACTGGGGCATTTCATC 5
Epitope Name Amino Acid Sequence Construct Amino Acid Sequence Codon Optimized Construct DNA Sequence (5'-3')
RBD NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV aatatcactaacttgtgtccgttcggcgaggtttttaatgcgaccaggtttgcttccgtgtacgcctggaacaggaaacggatctccaattgtgtcgccgattactccgtcttgtataattcagcatctttcagcacgtttaaatgttacggagtttcccccacaaaattgaatgacctttgctttacgaacgtctacgcggattcatttgtaatccggggggacgaagttaggcaaattgcgccagggcagactggcaagatagctgactataattataaattgccggatgactttacgggctgtgtgattgcttggaactcaaataatctggactcaaaggtagggggaaattataactacctttacaggctgttccggaagagtaatctgaagccattcgaaagagatataagtacagagatctaccaagctggaagcaccccctgcaatggtgttgaaggattcaattgttatttcccattgcaatcctatggttttcaaccgacgaatggggtgggataccaaccatatcgagttgtggttctcagtttcgagttgcttcatgctcctgcgacagtatgtggaccaaaaaaatctactaatctggtgaagaataaatgcgtcaatttttaa
OVA257-264 SIINFEKL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLSIINFEKLGGGGSSIINFEKLGGGGSSIINFEKLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgagtattataaacttcgagaagctgggtgggggaggaagttcaatcattaattttgaaaaacttggaggaggtggatcttccataattaattttgaaaagctggattataaggatgacgacgataagtga
OVA323-339 ISQAVHAAHAEINEAGR GGGGSGGGGSEQKLISEEDLISQAVHAAHAEINEAGRDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgatttcacaggctgtgcatgctgcacatgctgaaattaatgaggctggacgtgattataaggatgacgacgataagtga
Adpgk ASMTNMELM GGGGSGGGGSEQKLISEEDLASMTNMELMGGGGSASMTNMELMGGGGSASMTNMELMDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctggctagcatgacgaacatggagctaatgggagggggcggaagtgcttctatgactaatatggaactgatgggaggtggaggttctgcttcaatgaccaacatggaacttatggattataaggatgacgacgataagtga
Rpl18 KILTFDRL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKILTFDRLGGGGSKILTFDRLGGGGSKILTFDRLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgaagattctgacgtttgatcgtctggggggtggcggatctaagatattgacgttcgatcgactgggaggaggtggctctaagatcctaacattcgaccgtctagattataaggatgacgacgataagtga
P15E KSPWFTTL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgaagtcaccttggtttactactctcggtgggggaggaagtaaatcgccatggtttactacattgggaggaggtgggtctaagtcaccatggttcacgacattggattataaggatgacgacgataagtga
S21P2(1) PSKPSKRSFIEDLLFNKV GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgcctagtaagccttctaagcgcagcttcatagaagatttgttgttcaataaggtagattataaggatgacgacgataagtga
S21P2(2) PSKPSKRSFIEDLLFNKV GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVGGGGSPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgcctagtaagccttctaagcgcagcttcatagaagatttgttgttcaataaggtaggtgggggaggaagtccatcgaagccaagtaagcgtagtttcattgaggacctcctcttcaacaaggttgattataaggatgacgacgataagtga
실시예 2. SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 SARS-CoV-2 중화항체 생성 유도능 확인 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 일 실시예로서, RP116 레오바이러스의 σ1 단백질에 코돈-최적화된 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 (RBD)을 융합한 Reo-RBD(ReoV-RBD)를 제조하였다. 즉, Reo-RBD는 RP116의 S1 유전자의 251번 코돈 이후에 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD) 염기서열이 도입된 유전자를 가지며, 이로부터 σ1 단백질과 융합된 형태의 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인이 생성된다. 본 발명자들은 상기 재조합 레오바이러스를 BHK21 세포에서 발현시켰으며, 수득된 바이러스를 L929 세포로 감염시켰다. 상기 재조합 레오바이러스의 존재는 SARS-CoV-2 중화 항체를 통해 검출하였다.
구체적으로, 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 잘린 σ1(truncated σ1)을 가진 돌연변이 레오바이러스(ReoV+Q251*), 및 RBD 항원기를 도입한 재조합 레오바이러스(ReoV+RBD)를 각각 L929세포에 감염시키고, 96시간 후 세포 용해물에 대한 분석을 진행하였다. 본 실시예에서 양성 대조군으로 사용된 재조합 RBD는 Dr. John Bell 연구실에서 제조된 것을 사용하였으며(Azad et al., 2020), SARS-CoV-2 NeuAb(40592-MM57)는 Sino Biological(Wayne, PA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 먼저, 항-레오바이러스 항체를 처리하여 웨스턴블롯을 진행한 결과, 레오바이러스 단백질을 검출할 수 있었다(도 2a). 또한, 각각의 재조합 레오바이러스를 L929세포에 감염시킨 후, 각 세포로부터 핵산 분자들을 분리한 후, RBD 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-qPCR을 수행한 결과, 야생형 레오바이러스나 ReoV+Q251*로 감염된 세포에서는 RBD 유전자가 검출되지 않았으나, ReoV+RBD로 감염된 세포에서는 RBD 유전자가 검출되었다(도 2b). 또한, 각 바이러스로 감염된 세포의 용해물에서 도트 블롯법을 수행한 결과, 모든 그룹에서 항-레오바이러스 항체(anti-ReoV)와 반응이 확인된 반면(도 2c 하단), 항-SARS-CoV-1 중화항체(NeuAb)와의 반응은 ReoV+RBD로 감염된 세포의 용해물에서만 확인할 수 있었다(도 2c 상단). 상기 결과들은 RP116의 돌연변이 S1 유전자에 RBD 유전자가 융합된 재조합 Reo-RBD가 SARS-CoV-2에 대한 중화항체에 의해 인식가능한 구조를 가지는 것을 증명한다.
실시예 3. 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 다양한 외래 항원 발현능 확인
상기 실시예를 통해 본 발명에 따른 레오바이러스-기반 백신플랫폼이 SARS-CoV-2 RBD 항원기가 융합된 σ1 단백질을 통해 SARS-CoV-2 중화항체와 반응할 수 있음을 확인한 바, 이어서 본 실시예에서는 본 발명의 백신플랫폼이 상기 항원기 외에도 다양한 외래 에피토프를 발현할 수 있는지 검증하였다.
먼저, 다양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프(ovalbumin 단편, ADP-dependent Glucokinase(Adpgk), ribosomal protein L18(Rpl18))가 융합된 재조합 레오바이러스를 제작하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물을 분석한 결과, 각 세포에서 레오바이러스 유래 단백질이 확인되었으며(도 3a), S1 유전자의 RNA는 물론, 도입된 T 세포 에피토프 RNA 산물이 검출되었다(도 3b). 또한, B 세포 에피토프(S21P2)가 융합된 S1 유전자를 갖는 재조합 레오바이러스로 감염시킨 세포에서도, 레오바이러스 유래 단백질은 물론 도입된 B 세포 에피토프의 RNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 3c 및 3d).
상기 결과는 본 발명에 따른 레오바이러스-기반 백신플랫폼이 다양한 외래 항원의 에피토프를 발현할 수 있음을 보여주며, 따라서 본 발명의 백신플랫폼에 다양한 질병의 에피토프를 도입하여 새로운 백신 개발을 위한 스크리닝에 활용할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. Ovalbumin 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 세포 감염능 및 외래 에피토프 발현능 확인
본 실시예에서는 ovalbumin(OVA) 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스를 제조한 후, 이의 외래 항원 발현능을 확인하였다.
상기 재조합 레오바이러스의 변이된 S1 유전자에는, 각 측면에 Myc 태그 및 FLAG 태그가 결합된 OVA257-264 에피토프가 융합되어 있다. 상기 Myc 및 FLAG 태그는 면역세포화학 분석법으로 검출 가능한데, 태그 단백질들의 형광은 레오바이러스 유래 단백질의 형광 신호와 겹쳐서 존재하므로, 재조합 바이러스로 감염된 세포에서 외래 에피토프의 항원이 발현되는 것을 간접적으로 나타낸다.
구체적으로, 커버슬립에서 배양한 Vero 세포를 ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+OVA257-264(OVA257-264가 도입된 재조합 레오바이러스)로 48시간 동안 감염시켰다. 이후 세포를 3.7% PFA에 고정하고, 항-ReoV(1:1000, 토끼 혈청), 항-Myc(1:200), 및 항-FLAG(1:200)로 1시간 동안 반응시켰으며, anti-ReoV를 검출하기 위한 Alexa Fluor 488로 표지된 항-토끼 항체, 및 anti-Myc 또는 anti-FLAG를 검출할 수 있는 Alexa Fluor 594로 표지된 항체를 처리하여 45분 동안 인큐베이션 하였다. 염색을 마친 커버슬립은 핵 카운터 염색용 DAPI가 있는 Fluoromount G로 마운팅하였다. 샘플은 60X 오일 대물렌즈가 있는 올림푸스 공초점 현미경으로 촬영했다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, OVA가 도입된 레오바이러스로 감염된 세포에서는 레오바이러스 단백질의 형광신호와 함께, OVA 항원의 존재를 나타내는 태그 단백질들의 형광신호가 함께 검출되었다.
상기 결과는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼이 포유동물 세포에 대해 감염성이며, 도입된 에피토프를 효과적으로 발현할 수 있음을 시사한다.
실시예 5. 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 외래 에피토프 발현능 확인
추가로, 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 레오바이러스를 제작한 후, 상기 바이러스가 감염된 세포에서 상기 에피토프의 발현을 유도하는지 검증하였다. 구체적으로, BHK21 세포를 야생형 레오바이러스(WT); T 세포 에피토프인 p15E를 발현하는 재조합 레오바이러스(ReoV+p15E); 또는 SARS-CoV-2 에피토프인 S21P2를 발현하는 레오바이러스(ReoV+S21P2(2))로 감염시켰다. 각 에피토프는 Myc 및 FLAG로 태깅되었다. 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 Poh et al. (Nat. Comm., 2020)에서 의해 SARS-CoV-2에 대한 중화항체 생성을 유도한다는 것이 검증되었다. 감염 48시간 후에 각 세포 용해물로 웨스턴 블롯을 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 레오바이러스 단백질은 모든 샘플에서 검출되었으나, Myc 및 FLAG 태그는 p15E 또는 SARS-CoV-2 에피토프로 엔지니어링된 레오바이러스로 감염된 세포에서만 검출되었다. 또한, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S2 (Sino Biological 사)의 전체 단백질을 항원으로 하여 제작된 anti-S2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행한 결과, ReoV+S21P2(2) 레오바이러스로 감염된 샘플에서만 동일한 크기의 면역 반응성이 있는 단백질 밴드를 확인할 수 있었다(도 5에서 화살표로 표시함).
이러한 결과는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프를 보유하는 재조합 레오바이러스가 상기 에피토프들에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 6. 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 안정성 확인
본 실시예에서는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 안정성을 확인하였다. 이를 위해, S21P2 에피토프 또는 OVA257-264가 도입된 S1 단백질을 발현하는 재조합 레오바이러스를 제작하였다(도 6a). 각각의 에피토프는 N-말단과 C-말단에 각각 Myc 또는 FLAG 태그를 포함하도록 설계되었으며, 상기 에피토프들이 레오바이러스를 통해 세포 내에서 안정적으로 발현되는지 확인하였다.
구체적으로, BHK21 세포를 상기 재조합 레오바이러스로 48시간 동안 감염시킨 후 항-레오바이러스 항체(anti-ReoV) 및 항-FLAG 항체(anti-FLAG)로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 재조합 레오바이러스로 감염된 세포에서는 레오바이러스 단백질 밴드와 FLAG 밴드가 모두 검출되었다(도 6b). 상기 밴드들은 5번의 계대를 거친 세포에서 매우 높은 강도로 검출된 바, 이는 세포의 패시지(Passages)가 여러 번 지나도 본 발명의 재조합 레오바이러스에 의한 외래 에피토프의 발현이 안정적으로 일어난다는 것을 증명한다.
실시예 7. SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 SARS-CoV-2 중화항체 생성 유도능 확인
앞선 실시예를 통해 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능 및 상기 항원에 대한 중화항체 생성 유도능을 확인한 바, 본 실시예에서는 상기 백신플랫폼의 중화항체 생성 유도능을 in vivo에서 확인하였다. 재조합 레오바이러스의 대표예로서 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2가 도입된 재조합 레오바이러스를 사용하였다.
도 7a는 재조합 레오바이러스 기반 백신의 투여 용량, 경로, 및 일정을 나타낸 개략도이다. 레오바이러스 기반 백신을 경구 또는 복강내 경로로 1주 간격으로 3회 접종하였으며, 일주일 경과 후 마우스를 희생시킨 후 부검하여 혈청과 비장을 분석에 사용하였다. 실험종료 시점인 투여 21일차에 각 그룹별 체중을 비교한 결과, 유의미한 체중 차이가 관찰되지 않았다(도 7b). 아울러, 마우스로부터 수득한 혈청으로부터 중화항체를 분리한 후 SARS-CoV-2 유사 바이러스와 함께 HEK293T 세포(n=2)에 처리하여 상기 중화항체가 SARS-CoV-2 유사 바이러스의 세포 감염을 저지하는지 확인하였다. 그 결과, S21P2 에피토프-발현 레오바이러스 백신으로 접종된 마우스의 혈청에서 분리된 중화항체를 처리한 그룹은 SARS-CoV-2 유사 바이러스가 중화되어 ACE2-발현 HEK293T 세포에 대한 감염능이 대조군 대비 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 7c). 또한, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 ELISA로 분석한 결과, SARS-CoV-2 에피토프를 발현하는 레오바이로스가 투여된 마우스의 혈청에서 높은 수준의 형광이 관찰된 바, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체가 존재하는 것을 확인하였다(도 7d). 상기 결과들은 SARS-CoV-2 항원이 도입된 재조합 레오바이러스가 마우스 체내에서 SARS-CoV-2 중화항체의 생성을 효과적으로 유도할 수 있으며, 따라서 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 예방용 백신으로 활용 가능함을 보여준다.
실시예 8. 레오바이러스 기반 백신의 면역세포 활성화 기능 확인
본 실시예에서는 외래 에피토프가 도입된 레오바이러스 기반 백신이 면역세포를 활성화하는지 확인하였다. 먼저, 대표예로서 ovalbumin 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 제작하여 세포에 감염시켰으며, 상기 에피토프가 주조직 적합성 복합체-I(Major histocompatibility complex-I, MHC-I)로 제시되는지 확인하였다. 레오바이러스로 감염된 L929-H2Kb 세포를 수집하여 MHC-I에 결합된 OVA257-264를 검출할 수 있는 항체로 유세포분석을 수행한 결과, 레오바이러스에 의해 전달된 OVA257-264 에피토프가 MHC-I으로 제시된 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 이어서, 상기 레오바이러스의 면역세포 활성화 기능을 확인하기 위해 L929-H2JKB 세포를 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 에피토프가 도입되지 않은 백신플랫폼(ReoV+Q257*), 또는 OVA257-264가 도입된 레오바이러스(ReoV+OVA257-264)로 감염시킨 후 OT-I 마우스 비장세포와 공동 배양하였다. 배양을 마친 세포를 수집하여 다양한 T 세포 단백질 특이적 항체 및 세포 내 사이토카인 특이적 항체를 사용하여 유세포분석을 진행하였다. 결과는 도 8b 및 8c에 나타냈다. 도면에서 확인 가능한 바와 같이, 기타 레오바이러스로 감염된 세포에 비해, Ovalbumin 에피토프가 도입된 레오바이러스로 감염된 세포는 IFNγ 및 TNFα를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율이 증가한 바, Ovalbumin 에피토프 특이적 T 세포가 활성화된 것을 알 수 있었다. 상기 결과들은 본 발명의 레오바이러스 기반 백신은 세포를 감염시켜 에피토프의 발현 및 항원제시세포에 의한 항원제시를 유도할 수 있으며, 따라서 해당 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능 활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 9. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 암 예방 및 치료기전
본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼은 암의 예방 및 치료에도 활용 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 레오바이러스 RP116의 σ1 단백질에 종양 에피토프를 융합함으로써 종양 에피토프를 반복적으로 발현하는 재조합 레오바이러스를 제조할 수 있다(도 9a). 본 발명의 재조합 레오바이러스의 안정적인 세포 감염능 및 외래 에피토프 발현능은 여러 차례의 실험을 통해 확인된 바, 예를 들어, 다양한 재조합 레오바이러스를 L929 세포에 72시간 동안 감염시킨 후 세포 용해물의 단백질을 분석한 결과 모든 실험군에서 레오바이러스 유래 단백질이 검출되며, ovalbumin 에피토프를 동비한 레오바이러스로 감염된 세포에서는 상기 에피토프에 태깅된 태그 단백질이 검출된다(도 9b). 따라서, 종양 항원을 안정적으로 발현하는 재조합 레오바이러스의 제조도 가능하며, 상기 레오바이러스를 암의 예방을 위한 백신으로 활용 가능하다. 예를 들어, 대장암 (colorectal cancer)은 발달 초기 단계에서 진단이 어려운 암이지만, 레오바이러스가 쉽게 접근 가능한 해부학적 부위에 위치한다. 따라서, 개체에 대장암의 종양항원이 도입된 레오바이러스 백신을 투여시, 암이 발병하기도 전에 상기 백신이 체내에 종양 에피토프를 노출시켜 종양 항원에 대한 신체의 예방적 면역기능을 유도할 수 있으며, 또한 종양이 성장한 이후에도 종양의 성장을 억제하는 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼은 다양한 바이러스, 박테리아, 및 진균 등에 의한 감염성 질환은 물론, 암을 포함한 다양한 질환의 예방 및 치료용 물질로 활용 가능하다(도 9c).
실시예 10. 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과 확인
본 실시예에서는 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 in vivo에서 확인하였다. 이를 위해 야생헝 레오바이러스 또는 Ovalbumin 항원(S1OVA257-264)이 도입된 레오바이러스를 C57BL/6 마우스에 복강내 경로를 통해 일주일 간격으로 총 3회 투여하였으며, 바이러스 투여를 마친 마우스에는 B16F10 흑색종 세포 및 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 발현하는 흑색종 세포(B16F10-OVA)를 각각 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 3 × 106 개씩 피하 주사하였다(도 10a). 이후 마우스들의 종양 발생 및 성장을 모니터링하고 전자 캘리퍼스를 이용해 종양의 크기를 측정했다. 종양 부피가 >1500 mm3에 도달하거나 활력징후가 안락사기준에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양을 적출하였다. 안락사된 마우스들의 종양 크기를 비교한 결과, OVA 항원이 도입된 레오바이러스 백신(ReoV+OVA257-264)이 접종되었던 마우스는 다른 그룹과 비교하여 B16F10-OVA 종양 크기가 현저하게 감소한 바, 본 발명의 레오바이러스 백신이 종양 성장을 효과적으로 예방하였음을 확인할 수 있었다(도 10b). 정확한 검증을 위해 각 마우스로부터 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양과 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양의 크기를 측정하여 비교하였다. 그 결과, Ovalbumin 항원이 도입된 레오바이러스가 접종된 마우스는 일반적인 종양에 비해 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 종양의 크기가 현저히 감소하였으며, 대조군 및 야생형 레오바이러스가 접종된 마우스에 비해서도 Ovalbumin 항원-발현 종양의 크기가 두드러지게 감소한 바(도 10d), 본 발명의 레오바이러스 백신이 Ovalbumin 항원에 대한 면역기능 강화를 유도하여 Ovalbumin-발현 종양 성장을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다. 아울러, 대조군과 레오바이러스 백신 투여군간에 유의미한 체중 차이는 확인되지 않은 바, 본 발명의 레오바이러스 기반 백신에 독성이 없음을 확인하였다(도 10c).
실시예 11. 레오바이러스 기반 백신의 암 치료 효과 확인
앞선 실시예를 통해 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 확인한 바, 본 실시예에서는 상기 백신의 암 치료 효과를 in vivo에서 검증하였다. 먼저, C57BL/6마우스의 옆구리에 종양세포 특이적 항원인 Ovalbumin 에피토프(OVA)를 발현하는 흑색종 B16F10-OVA세포를 3 × 105 개씩 피하 주사하였다. 이후 종양의 발병 및 성장을 모니터링하고 전자 캘리퍼스를 사용해 종양의 크기를 측정하였다. 종양세포의 이식 후 4일, 11일 및 18일차 3회에 걸쳐 정맥투여 또는 경구투여를 통해 OVA 특이적 항원을 발현하는 재조합 레오바이러스 백신을 투여하였다. 또한, 대조군으로서 Vehicle 또는 OVA 에피토프를 발현하지 않는 레오바이러스(S1-Q251*)을 동량 투여하였다(도 11a). 종양 부피가 >2500 mm3에 도달하거나 활력징후가 안락사기준에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양을 적출하였다. 먼저 종양 성장을 비교한 결과, OVA 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스를 투여한 마우스의 종양 성장이 기타 그룹에 비해 눈에 띄게 지연된 바, 에피토프가 도입된 레오바이러스에 의한 종양 성장 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 11b). 또한 마우스의 비장세포에서 분리한 CD8+ T 세포를 배양한 후 Ovalbumin 펩타이드 SIINFEKL를 처리하여 T 세포의 활성화 수준을 비교하였다. 그 결과, OVA 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스에서 분리된 T 세포는 기타 그룹에 비해 항원 SIINFEKL에 의한 활성화가 더욱 높은 수준으로 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 11c 및 11d). 본 발명의 레오바이러스 기반 백신이 종양항원에 대한 항암 면역세포의 면역기능을 효과적으로 유도하였음을 알 수 있었다. 상기 결과들은 본 발명의 레오바이러스 기반 백신이 종양 에피토프를 효과적으로 체내에 노출시켜 종양항원에 대한 면역기능을 활성화하고, 종양의 성장을 현저하게 억제할 수 있음을 증명한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명은 레오바이러스 기반의 신규한 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 S1 유전자의 일부를 다양한 외인성 에피토프-코딩 유전자로 대체할 수 있으며, 이를 통해 제조된 재조합 레오바이러스는 타겟 세포를 감염시켜 에피토프의 발현을 유도할 뿐만 아니라, 상기 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화하여 해당 에피토프와 관련된 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼을 이용하면 비교적 간편한 유전자 조작 기술을 통해 다양한 에피토프가 담지된 백신을 제조할 수 있으며, 경구투여를 포함한 다양한 방식으로 투여가 가능하므로, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 포함한 여러 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료 분야에 활용 가능하다.

Claims (26)

  1. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에피토프인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 재조합 벡터.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 재조합 벡터.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로부터 발현된, 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입된 것인, 세포.
  13. 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현하는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 재조합 레오바이러스는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 세포로부터 생성된 것인, 재조합 레오바이러스.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물.
  17. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  23. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  24. 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 예방 또는 치료 방법으로서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 질환은 상기 에피토프와 연관된 것인, 질환의 예방 또는 치료방법.
  25. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 질환의 예방 또는 치료 용도로서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 질환은 상기 에피토프와 연관된 것인, 질환의 예방 또는 치료 용도.
  26. 질환의 예방 또는 치료용 제제의 제조를 위한, 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도로서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 질환은 상기 에피토프와 연관된 것인, 질환의 예방 또는 치료 용도.
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