KR102654464B1 - 레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도 - Google Patents

레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레오바이러스 기반의 신규한 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 S1 유전자의 일부를 다양한 외인성 에피토프-코딩 유전자로 대체할 수 있으며, 이를 통해 제조된 재조합 레오바이러스는 타겟 세포를 감염시켜 에피토프의 발현을 유도할 뿐만 아니라, 상기 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화하여 해당 에피토프와 관련된 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼을 이용하면 비교적 간편한 유전자 조작 기술을 통해 다양한 에피토프가 담지된 백신을 제조할 수 있으며, 경구투여를 포함한 다양한 방식으로 투여가 가능하므로, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 포함한 여러 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료 분야에 활용 가능하다.

Description

레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도{Novel vaccine platform based on Reovirus and the use thereof}
본 발명은 레오바이러스 기반 신규한 백신플랫폼 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스는 유전 물질과 단백질로 이루어진 작은 비세포성 유기체로서, 상이한 유형의 바이러스들이 존재한다. 예를 들어 바이러스는 숙주의 핵 내에서 복제하는 DNA 바이러스, 또는 세포의 세포질 내에서 복제하는 RNA 바이러스일 수 있다. 바이러스는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 더욱이 단일 가닥 RNA 바이러스는 양성(+, 센스) 가닥 또는 음성(-) 가닥일 수 있다. 이와 같은 상이한 유형의 바이러스는 다양한 바이러스성 감염을 유발한다.
오늘날 바이러스 감염에 대항하고 그 확산을 제한하기 위한 가장 중요한 보호 조치는 예방 접종이다. 현대의 백신은 원칙적으로 표면 바이러스 항원에 대한 항체 형성을 유도한다. 백신 효과는 백신에 함유된 바이러스의 항원 구조와 개체군에서 순환하는 균주 사이의 일치 정도에 직접적으로 의존적이다. 대다수 바이러스의 표면 단백질은 일정한 항원 변이(antigenic variation)(항원 소변이(drift))를 겪으며, 백신 균주 조성의 지속적인 갱신이 필요하다. 광범위한 작용의 면역 반응을 유도하는 고도의 면역원성 및 안전한 백신의 개발은 현재 효율적인 암 또는 감염성 질환 예방에서 부딪히는 주요한 문제 중 하나이다. 최근 확산한 SARS-CoV-2에 의한 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 등과 같은 전 세계적인 유행성 질병의 확산과 지속적인 감염을 막기 위해서는 백신의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 아데노바이러스(Ad), 배큘로바이러스 등과 같은 플랫폼을 사용하여 현재 전 세계적으로 많은 바이러스 기반 백신이 개발되고 있다.
바이러스, 세균, 진균 등에 의한 감염성 질환뿐만 아니라 종양을 예방하기 위한 다양한 백신이 개발되고 있으며, 특히 다양한 항원을 담지하여 체내에 약독화된 항원을 안정적으로 전달할 수 있는 전달체에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 상기 전달체로서 다양한 폴리머 기반의 나노입자, 엑소좀, 펩티드 등이 사용되어 왔으나, 체내 안정성이나 독성과 같은 문제가 있으며, 특히 안정적인 항원 전달이 불가능하다는 한계가 있다. 이에, 바이러스의 복제가능성 및 유전자 발현 유도능을 기초로 바이러스 벡터 기반의 백신을 제조하려는 시도가 있었으나, 체내에 부작용을 일으키지 않으면서 외인성 항원을 안정적으로 발현할 수 있는 바이러스 기반 벡터는 아직까지 발굴되지 않고 있다.
한편,　항암바이러스는 (oncolytic virus)는 스스로 복제가 가능하며 정상 세포가 아닌 암세포에만 선택적으로 감염, 증식 및 살상을 유도하는 바이러스로서, 향후 항암제 시장을 변화시킬 제4세대 항암제로 대두되고 있다. 항암 바이러스에 의한 종양 세포의 파괴는 주위 종양 세포들의 감염을 다시 유도하고 이 현상이 반복되어 항암효과가 증폭될 수 있다는 장점이 있다. 특히, 항암 바이러스는 직접 암세포를 공격하는 것 외에도 종양의 혈관내피세포내 감염을 통해 신생혈관 생성을 억제하는 기능도 있다.
대표적인 항암바이러스로는 레오바이러스(Reovirus)가 있다. 레오바이러스는 외피가 없는 것을 특징으로 하는 바이러스로서, 구강-대변 경로를 통해 세포를 감염시킨다. 레오바이러스의 유전체는 8개의 구조 단백질 및 3개의 비구조 단백질을 코딩하는 10개의 분할된 dsRNA를 가지며, 포유류 레오바이러스는 T1L(Lang), T2J(Jones), T3D(Dearing), T3A(Abney), 및 T4N(Ndelle)의 4가지 혈청형이 존재한다. 레오바이러스는 암세포를 효율적으로 감염시키고 용해(lysis)시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 레오바이러스의 종양 내 또는 정맥투여에 대한 임상 시험이 진행되어 높은 치료 안정성 및 항암 효능이 확인되기도 하였다.
항암 바이러스의 반복성 및 항암 효능 등을 기반으로 암은 물론 다양한 질환의 백신 플랫폼으로 활용하려는 시도가 있었으나, 항암 바이러스 면역치료제는 개발 및 생산기술의 난이도가 매우 커 진입장벽이 크다.
대한민국 공개특허공보 제10-2022-0119616호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 레오바이러스의 변이 S1 유전자가 외인성 에피토프-코딩 유전자와의 융합이 가능하며, 따라서 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 백신플랫폼으로 활용될 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 외인성 에피토프-코딩 유전자가 융합된 돌연변이 S1 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에피토프일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로부터 발현된, 상기 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 외인성 에피토프는 외부 캡시드 단백질로서 발현된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된 세포로부터 생성된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신은 감염성 질환 및/또는 암의 예방용 백신일 수 있다. 바람직하게는, 상기 감염성 질환 및/또는 암은 상기 외인성 에피토프와 연관된 질환 및/또는 암일 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 감염성 질환 및/또는 암의 예방용 백신의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 레오바이러스 기반의 신규한 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 S1 유전자의 일부를 다양한 외인성 에피토프-코딩 유전자로 대체할 수 있으며, 이를 통해 제조된 재조합 레오바이러스는 타겟 세포를 감염시켜 에피토프의 발현을 유도할 뿐만 아니라, 상기 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화하여 해당 에피토프와 관련된 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼을 이용하면 비교적 간편한 유전자 조작 기술을 통해 다양한 에피토프가 담지된 백신을 제조할 수 있으며, 경구투여를 포함한 다양한 방식으로 투여가 가능하므로, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 포함한 여러 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료 분야에 활용 가능하다.
도 1a는 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질(좌측) 및 레오바이러스 RP116의 변이된 σ1 단백질(우측)의 비교도이다.
도 1b는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 제조 원리를 도식화한 그림이다.
도 1c는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 작동 원리를 도식화한 그림이다.
도 1d는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 구조체(construct) 설계의 개략도이다.
도 1e는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신의 제조 원리를 나타낸 그림이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 백신플랫폼의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화항체 생성 유도 능력을 확인하기 위해, 음성 대조군(Mock), 야생형 레오바이러스(WT ReoV), S1 유전자의 251번 아미노산 위치에 STOP 코돈 돌연변이를 갖는 돌연변이 레오바이러스(ReoV+Q251*), 또는 돌연변이 S1 유전자에 SARS-Cov-2 수용체 결합 도메인(RBD)이 융합된 재조합 레오바이러스(ReoV+RBD)로 세포를 감염시킨 후 웨스턴 블롯으로 레오바이러스 단백질을 검출한 결과이다.
도 2b는 Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+RBD로 감염된 세포에서 RT-qPCR을 통해 RBD 유전자를 검출한 결과이다.
도 2c는 Mock, WT ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+RBD로 감염된 세포에서 SARS-CoV-2 중화항체(NeuAb; 상단) 및 항-레오바이러스 항체(하단)를 검출한 결과이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능을 확인하기 위해, T 세포 에피토프가 융합된 돌연변이 S1 유전자를 갖는 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물에 존재하는 레오바이러스 유래 단백질(도 3a) 및 외래 에피토프의 RNA 산물(도 3b)을 검출한 결과이다.
도 3c 및 3d는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능을 확인하기 위해, B 세포 에피토프가 융합된 돌연변이 S1 유전자를 갖는 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물에 존재하는 레오바이러스 유래 단백질(도 3c) 및 외래 에피토프의 RNA 산물(도 3d)을 검출한 결과이다.
도 4는 Myc 및 FLAG로 태깅된 Ovalbumin 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 포유동물 세포에 감염시킨 후, 레오바이러스 단백질 및 태그 단백질들의 형광 신호를 검출한 결과이다(스케일 바 = 50μm).
도 5는 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스(ReoV+p15E) 또는 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2(2)가 도입된 레오바이러스로 세포를 감염시킨 후, 레오바이러스 단백질, 태깅 단백질 (Myc, FLAG), 및 SARS-CoV-2 단백질을 검출한 결과이다. 검은색 화살표는 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2(2)와 재조합된 σ1 단백질에 해당하는 크기의 밴드 위치를 나타낸다.
도 6a는 Myc 및 FLAG로 태깅된 S21P2 또는 OVA257-264 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 S1 유전자의 개략도이다.
도 6b는 S21P2 또는 OVA257-264 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스로 세포를 감염시킨 후 레오바이러스 및 FLAG 태그 단백질을 검출한 결과이다.
도 7a는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신의 in vivo 효능을 확인하기 위해, 일 실시예에 따른 레오바이러스 백신(SARS-CoV-2 항원 S21P2이 도입된 레오바이러스 백신)을 마우스에 투여한 과정을 나타낸 개략도이다.
도 7b는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 체중을 비교한 그래프이다.
도 7c는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 혈청에서 분리한 중화항체에 의한 HEK293T 세포 감염 저지능을 비교한 그래프이다.
도 7d는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 면역글로불린을 검출한 결과이다.
도 8a는 다양한 재조합 레오바이러스를 세포에 감염시킨 후 유세포분석으로 MHC-I에 결합된 에피토프를 검출한 결과이다(SIINFEKL: OVA257-264 에피토프).
도 8b 및 8c는 다양한 재조합 레오바이러스를 세포에 감염시킨 후 유세포분석으로 TNFα 및/또는 INFγ를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 측정한 결과(도 8b) 및 이의 정량화 그래프(도 8c)이다.
도 9a는 종양 에피토프가 융합된 RP116 레오바이러스 σ1 단백질을 나타낸 그림이다.
도 9b는 다양한 레오바이러스를 세포에 72시간 동안 감염시킨 후 웨스턴 블롯으로 레오바이러스 단백질(좌측) 및 ovalbumin 에피토프(OVA257-267)에 태깅된 Myc 및 FLAG 단백질을 검출한 결과(우측)이다.
도 9c는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 면역반응 유도 원리를 나타낸 그림이다.
도 10a는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 마우스에 야생형 또는 외래 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 투여한 후 종양세포를 주입한 과정을 나타낸 그림이다.
도 10b는 레오바이러스 투여 후 종양세포가 주입되었던 마우스들의 종양 크기를 비교한 결과를 나타낸다. 각 개체에서, 좌측의 종양은 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양이며, 우측은 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양이다.
도 10c는 야생형 또는 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스의 체중을 비교한 그래프이다.
도 10d는 레오바이러스 투여 후 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양과 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양 크기를 정량화한 결과이다.
도 11a는 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 흑색종 치료 효과를 확인하기 위한 in vivo 실험 스케쥴 및 조건을 나타낸 그림이다.
도 11b는 흑색종 마우스 모델에 재조합 레오바이러스를 투여한 후 시간에 따른 종양 성장 정도를 비교한 결과이다(Vehicle, 미처리 대조군; S1-Q251*, 에피토프가 도입되지 않은 재조합 레오바이러스 투여군; 및 S1-OVA, Ovalbumin 항원이 도입된 재조합 레오바이러스 투여군).
도 11c 및 11d는 흑색종 마우스 모델에 재조합 레오바이러스를 투여한 후 생성된 OVA 특이적 T 세포 활성화의 수준을 관찰하고(도 11c), 정량화한 결과(도 11d)이다.
본 발명은 레오바이러스의 역유전학(Reverse genetics) 기술을 이용한 Quick Change-기반 백신플랫폼에 관한 것으로서, 레오바이러스의 Sigma 1 단백질(δ1 단백질)의 헤드 부분이 다양한 외래 펩티드로 교체될 수 있으며, 따라서 다양한 항원 에피토프를 도입하여 감염성 질환이나 암을 포함한 다양한 질환의 예방 내지 치료용 백신으로 활용될 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 즉, 본 발명자들은 역유전학 기술을 이용하여, 특정 아미노산 서열 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질에 암 또는 감염성 질환에 대한 에피토프가 융합하여 발현되도록 에피토프 염기 서열을 삽입하는 “빠른 교환” 방법을 통해, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 플랫폼을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 변이 Sigma 1 단백질은 돌연변이 레오바이러스인 RP116의 돌연변이 Sigma 1 단백질로서 야생형 Sigma 1 단백질과 비교하여 (N 말단 기준) 251번 내지 455번 아미노산이 결실된, 절단된(truncated) 단백질인 것을 특징으로 한다. 상기 절단된 Sigma 1은 종결 코돈이 도입된 돌연변이 S1 유전자에 의해 코딩되는데, 상기 돌연변이 S1 유전자는 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드 C가 T로 치환됨에 따라, 시작코돈(개시코돈)으로부터 251번째 코돈(즉, 763CAA으로서, 251Q를 코딩함)이 종결 코돈으로 치환된 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 상기 종결 코돈 이후에 외인성 펩타이드를 코딩하는 유전자를 연결하면 절단된 Sigma 1과 함께 상기 외인성 펩타이드가 융합되어 발현되는 것을 확인하였으며, 결과적으로 세포를 감염하여 외인성 펩타이드의 발현을 안정적으로 유도할 수 있는 재조합 레오바이러스를 제작할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 SARS-CoV-2 에피토프 및 종양항원을 포함한 다양한 항원 단백질들을 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 도입하여 다양한 재조합 레오바이러스를 제조하였으며, 상기 재조합 레오바이러스는 감염된 세포에서 도입된 항원의 발현을 안정적으로 유도하며 해당 항원에 대한 면역세포의 면역기능을 활성화할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 재조합 레오바이러스 기반 벡터는 도입할 수 있는 항원의 종류에 제한이 없으므로 다양한 바이러스, 세균, 진균 등에 의한 감염성 질환은 물론 암의 예방 및 치료를 위한 백신플랫폼으로 사용 가능하다. 또한, 재조합 레오바이러스는 그 자체로서는 질병을 일으키지 않는 것으로 확인된 안전한 바이러스이므로 예상치 못한 부작용의 위험이 없으며, 가혹한 환경 조건에서도 안정성을 유지할 수 있으므로 실온이나 4℃의 낮은 온도는 물론, -20℃의 저온에서도 보관이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 음료 또는 식품의 형태로 경구투여가 가능한 이점이 있다. 또한 레오바이러스는 생산성이 높으며 생산공정이 잘 확립되어 있기 때문에, 비교적 저비용으로 다량의 바이러스 기반 백신을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로를 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
레오바이러스(respiratory enteric orphan virus, REO virus)는 이중가닥의 RNA 단편을 게놈으로 갖는, 외피가 없는 (non-enveloped) 20면체의 바이러스이다. 레오바이러스는 건강한 인간의 소화기 및 호흡기에서 흔하게 분리되며, 병원성이 없는 바이롬(virome)이다. 특히, 레오바이러스는 다양한 종양세포를 감염 및 사멸시킬 수 있는 종양용해성 바이러스(oncolytic virus)로 알려져 있다. 즉, 레오바이러스는 일반적인 종양용해성 바이러스와 마찬가지로 정상세포에는 영향을 거의 미치지 않으면서 암세포만 특이적으로 감염시켜 이의 사멸을 유도할 수 있으므로 부작용의 문제가 낮은 장점이 있으며, 1차 감염된 암세포에서 증식한 후 주변 및 멀리 떨어진 암세포까지 감염시킬 수 있어 광범위한 항암효과를 일으킬 수 있다는 장점이 있다. 레오바이러스 유전체는 8개의 구조 단백질 및 3개의 비구조 단백질을 코딩하는 10개의 개별 세그먼트(segments)로 구성되어 있다: 3개의 Large 세그먼트(L1, L2, L3), 3개의 Medium 세그먼트(M1, M2, M3), 및 4개의 Small 세그먼트(S1, S2, S3, 및 S4). 레오바이러스의 외부 캡시드는 4가지 단백질로 구성된다: 시그마-1, 시그마-3, 람다-2, 및 mu-1. 시그마-1은 레오바이러스의 세포-부착 단백질로서, 타겟세포의 수용체에 결합하여 바이러스가 세포를 감염할 수 있게 한다.
상술한 바와 같이 야생형 레오바이러스는 항암 바이러스로서의 유용성을 갖는다. 그러나, 야생형 레오바이러스는 체내 주입시 중화항체 등에 의해 항암 기능이 약화될 수 있는 문제점이 있고, 암세포의 종양미세환경 등에 의해 레오바이러스의 항암 기능이 억제될 수 있는 위험이 있다. 나아가, 레오바이러스가 암세포가 아닌 정상 세포를 감염시켜 숙주에 이상을 일으킬 문제점도 여전히 존재한다. 본 발명자들은 야생형 레오바이러스의 숙주 독성 문제를 해결하기 위해 야생형 시그마 1 단백질(Sigma 1 protein) 코딩 유전자 중간에 미성숙 STOP 코돈(TAA)이 존재하여 절단된(truncated) 형태의 시그마 1 단백질(즉, 돌연변이 시그마 1 단백질)을 발현하는 약독화된 레오바이러스 (attenuated reovirus, AV)를 제조하였다. 상기 약독화된 레오바이러스는 야생형 레오바이러스와 비교해 숙주에 대한 독성이 더욱 감소된 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 야생형 레오바이러스의 캡시드 중 외부로 노출되는 부착 단백질인 시그마 1을 코딩하는 유전자(S1 유전자)에서, 단백질의 251번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)을 암호화하는, 5' 말단으로부터 763번째 C가 T로 치환됨에 따라 763CAA가 763TAA(종결 코돈)로 전환되는 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 상기 미성숙 종결 코돈 돌연변이로 인해 야생형 시그마 1 단백질의 251번째 아미노산부터 절단(결실)되어, 구형 헤드가 절단(결실)된 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 약독화된 레오바이러스는 RP116일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 시그마 1 단백질은 야생형 시그마 1 단백질과 비교하여 N 말단으로부터 251번 내지 455번 아미노산이 결실된, 절단된(truncated) 시그마 1 단백질이다. 달리 말하면, 본 발명에 따른 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스 시그마 1 단백질의 1번 내지 250번째 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 1번 내지 250번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 상기 절단된 시그마 1 단백질, 즉 변이된 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질에 비해 약독화된 것을 특징으로 한다. 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질은 S1 세그먼트(S1 segment; “S1 유전자” 등으로도 지칭됨)에 의해 암호화(코딩)된다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 돌연변이 S1 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열의 251번 내지 455번 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 종결 코돈으로의 치환은 S1 유전자의 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환되어 발생한 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다:
(a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
서열번호 4는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1번 내지 765번 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 각 gene segment의 염기서열 및 이들이 코딩하는 각 단백질의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열목록에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 특정 서열번호가 병기된 유전자(핵산 분자)는, 해당 서열번호의 염기서열(폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하거나 해당 서열번호의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 염기서열의 핵산 분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 핵산 분자는 해당 서열번호로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
마찬가지로, 특정 서열번호가 병기된 폴리펩타이드(단백질)는, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하거나 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드는 이를 구성하는 폴리펩타이드 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 결실, 치환, 또는 삽입에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩타이드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 폴리펩타이드는 해당 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상술한 돌연변이 외에는 야생형 레오바이러스와 동일한 야생형 염기 서열 및 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다만, 바이러스의 특성상 야생형 서열이라도 바이러스의 기능 및 특성이 유지되는 범위 내에서 일부 염기 또는 아미노산의 결실, 치환, 및/또는 삽입의 돌연변이가 일어날 수 있음은 자명하다. 따라서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상기 돌연변이 외에도 바이러스의 기능 (항원에 대한 중화항체 생성 유도 효과, 항암효과 등)을 헤치지 않는 야생형 서열의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스의 유전체 서열은 본 명세서의 서열목록에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 임의의 야생형 레오바이러스로부터 유래될 수 있으며, 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있는 레오바이러스과 (Reovirus family)의 구성원일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 야생형 인간 레오바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1, 인간 레오바이러스 타입 2, 및 인간 레오바이러스 타입 3, 인간 레오바이러스 타입 4에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1 균주 Lang, 인간 레오바이러스 타입 2 균주 Jones, 인간 레오바이러스 타입 3 균주 Dearing 또는 Abney 및 인간 레오바이러스 타입 4 균주 Ndelle 에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스는 타입 3 레오바이러스일 수 있다. 뿐만 아니라, 또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 인간을 제외한 영장류 (챔팬지, 고릴라, 짧은 꼬리 원숭이, 원숭이 등), 설치류 (생쥐, 쥐, 게리빌스쥐, 햄스터, 토끼, 기나아피그 등), 개, 고양이, 일반 가축 (소, 말, 돼지, 염소)을 포함하는 기타 포유류 종의 세포에 대해 향성 (tropism)을 나타내는 하나 또는 그 이상의 레오바이러스로부터 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “외인성 에피토프”란 특정 질환의 예방 또는 치료 등의 목적을 위해 레오바이러스를 통해 세포 또는 신체에 전달하고자 하는 외인성 펩타이드를 지칭한다. “에피토프(항원 결정기 또는 항원기)”란 항체, B 세포, T 세포 등이 식별하는 항원의 특정 부위를 지칭하는 것으로서, 면역계는 외래의 에피토프를 인식하여 이에 대한 면역반응을 일으킬 수 있다. 외인성 에피토프는 특정 종류나 서열의 에피토프로 한정되지 않는다는 것이 자명하며, 당업자는 목적에 따라 원하는 에피트포를 제한 없이 선택할 수 있다. 예컨대, 레오바이러스를 이용하여 특정 질환의 예방 또는 치료의 목적을 달성하고자 하는 경우, 해당 질환과 연관성이 있는 항원의 에피토프를 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프일 수 있다. 또는, 본 발명에 있어서 질환(감염성 질환, 암 등)은 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 항원에 의해 유도되거나 발생하는 질환일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 있어서 암은 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 항원(종양항원)을 발현하는 암일 수 있다. 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 본 발명에 따른 재조합 벡터 내에 하나 이상 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터가 2 이상의 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 경우, 상기 유전자는 서로 동일하거나 서로 상이한 종류일 수 있다.
본 명세서에서, “감염”은 바이러스와 같은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여 발육, 증식하는 것으로, 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식하는 것을 의미하며, 그 결과 숙주는 병리학적인 변화를 받아 질병이 발생할 수 있다.
본 발명에 있어서, “감염성 질환”이란 병원성 미생물이 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식함으로써 발생하는 질환을 의미하며, 감염 경로, 전염성 여부에 따라 여러 종류로 구분될 수 있다. 상기 감염은 바이러스성 감염, 진균 감염, 세균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 감염성 질환은 C형 간염, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유도 에이즈(AIDS), 결핵, 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증, 로타바이러스(rotavirus)에 의한 영유아장염, 및 노로바이러스(norovirus)에 의한 비세균성 급성위장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 코로나 바이러스 감염증-19일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 해당 바이러스 특유의 단백질 또는 펩티드를 외인성 펩타이드로 적용할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 바이러스의 외피 단백질(envelope proteins), 캡시드 단백질, 스파이크 단백질(spike proteins), 막 단백질(membrane proteins), 수용체 결합 도메인(receptor binding domains), 핵산 (DNA 또는 RNA), 바이러스 효소(viral enzymes), 및 헤마글루티닌(hemaglutinin) 등으로부터 선택될 수 있으나, 당업자는 예방 또는 치료를 목적하는 바이러스 감염증에 따라 적절한 바이러스 단백질을 선택할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 SARS-CoV-2 에피토프(SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인)가 도입된 재조합 레오바이러스를 제작하여 이의 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 효과를 확인하였다. 따라서, SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른, SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 패혈증, 급성 호흡기 증후군, 폐렴, 사이토카인 폭풍(cytokine storm), 사이토카인 방출 증후군, 전신 염증반응 증후군, 다발성 장기부전, 폐섬유증 등을 예방 또는 치료할 수 있다. 바람직하게는, 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 상기 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 서열번호 19 또는 22의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)”는 SARS-CoV-2가 일으키는 중증 호흡기 증후군이다. 2019년 12월에 중국에서 첫 사례가 보고되었고, 전 세계적으로 퍼져나가면서 유행병으로 자리잡았다. COVID-19의 증상은 다양하지만 발열, 기침, 두통, 피로, 호흡 곤란, 후각 및 미각 상실 등이 있다. 증상은 바이러스에 감염된지 1~14일 안에 나타난다. 특히 감염된 사람 중 3분의 1은 무증상 감염자로 눈에 띄는 증상이 나타나지 않는다. 환자로 분류될 만큼 눈에 띄는 81%의 사람들은 경증에서 중증의 증상이 발생하며, 14%의 사람들은 호흡 곤란, 저산소증 등 증상이 발생하며, 5%의 사람들은 호흡기 부전, 쇼크 등 심각한 증상이 발생한다. 고령자는 심각한 증상이 발생할 확률이 더 높으며, 일부 사람들은 회복 후 긴 시간동안 접한 COVID-19 때문에 장기 손상이 관찰되었다.
SARS-CoV-2는 30 kb의 뉴클레오티드를 가지며 4개의 중요한 구조 단백질을 가지고 있다; Nucleocapsid(N), Spike(S), Membrane(M), Envelope(E) 단백질. 그 중 S 단백질은 숙주 세포의 수용체(receptor)와 결합하는 것으로 중요한 부위이며, 세포 내로 viral nucleocaspid를 전달하며 복제(replication)가 이루어진다.
SARS-CoV-2를 combating하는 가장 간단하고 직접적인 방법은 인간 세포로 들어가는 바이러스를 중화시키는 것으로, SARS-CoV-2가 세포 내로 유입되어 복제가 일어나고 새로운 비리온(virion)이 분비되어 다른 세포를 감염시키는 메커니즘을 차단하는 것이다.
SARS-CoV-2는 인간 세포의 angiotensin converting enzyme 2(ACE2) 수용체와 결합하여 바이러스 복제가 가능한 것으로 알려졌다. 코로나 바이러스의 S 단백질 중 receptor-binding domain(RBD)는 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 영역이며, SARS-CoV-2 감염에 대한 강력한 중화 항체를 유도하는 다중 형태 의존적 에피토프(multiple conformational-dependent epitopes)를 포함하고 있기 때문에 코로나바이러스 감염증-19의 치료 및 백신 개발에 핵심 표적이 될 수 있다(J. Immunol 2005;174:4908-4915).
본 발명에 있어서 종양항원은 암세포 특이적으로 발현되거나 암세포에서 특히 발현이 높은 것이라면 제한 없이 포함되고, 구체적인 종류로 제한되는 것은 아니나, Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS 등으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 치료하고자 하는 암 종류에 따라 당업계에 공지된 적절한 종양항원을 선택하여 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 ovalbumin 항원 (OVA257-264, “OVA 항원”)이 도입된 재조합 레오바이러스를 제작하여 상기 바이러스에 의한 면역세포 활성화 기능을 확인하였으며, 상기 재조합 바이러스가 투여시 상기 항원을 발현하는 종양의 성장이 예방 및 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 종양항원을 도입하여 암의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
이외에도, 상기 에피토프는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 SARS-CoV-2 RBD, OVA257-264, OVA323-339, Adpgk, Rpl18, P15E, S21P2(1), 및 S21P2(2) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 에피토프는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 카르복시 말단에서 융합 단백질을 형성하거나 구성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 “재조합 벡터(recombinant vector)”는 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 구체적으로, 상기 벡터는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 의미하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드 (cosmid), 에피솜, 바이러스, 및 삽입 가능한 DNA 단편, 즉 동종 재조합에 의해 숙주 세포 게놈에 삽입될 수 있는 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 DNA, 헤어핀 DNA, 또는 미니서클 DNA로서 이중가닥의 DNA로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 트랜스포존 서열 및 목적 DNA를 포함하여 이를 타겟 세포 내로 전달할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 당업자는 당업계에 공지된 다양한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 인핸서 (enhancer) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있고, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우, 벡터가 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 또한, 신호 서열로 poly A signal (폴리 A 시그널) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 myc 태그를 포함할 수 있다. 상기 태그의 벡터 내 위치에는 제한이 없으나, 바람직하게는 돌연변이 S1 유전자의 하류에 위치할 수 있다. 또는, 상기 태그는 외인성 에피토프-코딩 유전자의 일측 측면 또는 양측 측면에 위치할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 다양한 기술을 통해 세포 내로 전달될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 벡터는 인산칼슘 공동 침전 (calcium phosphate coprecipitation); 전기천공법 (electroporation); 미세유체 유전자 편집 (Microfluidics gene editing); 뉴클레오펙션 (nucleofection); 세포 스퀴징 (cell squeezing); 소노포레이션 (sonoporation); 광학 형질감염 (optical transfection); 임페일펙션 (impalefection); 유전자 총 (gene gun); 마그네토펙션 (magnetofection); 바이러스 형질도입 (viral transduction); DEAE-덱스트란 트랜스펙션; 리포펙션 (lipofection); 또는 덴드리머, 리포좀, 또는 양이온성 중합체를 통한 형질감염에 의해 세포에 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에 따른 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인(align) 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 251번 코돈(즉, 종결 코돈)의 하류에 위치하여 S1 유전자의 결실된 부위를 대체할 수 있다. 예컨대, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 약독화된 레오바이러스의시그마 1 단백질을 암호화하는 염기서열의 5' 말단에서 763번째 뉴클레오티드 이후(바람직하게는, 765번째 뉴클레오티드 이후)의 위치에 치환 또는 삽입되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질을 암호화하는 S1 유전자 (예를 들어, 서열번호 4 또는 5)의 염기서열에서 5' 말단으로부터 763번 (또는 766번) 내지 1416번째 뉴클레오티드의 위치 중에서 특정 위치의 염기 서열 대신 치환되는 것일 수 있고, 특정 위치의 염기 서열 사이에 삽입되는 것일 수도 있다.
본 발명에 따른 외인성 에피토프-코딩 유전자는 10 내지 400개, 10 내지 300개, 10 내지 250개, 10 내지 220개, 50 내지 400개, 50 내지 300개, 50 내지 250개, 100 내지 400개, 100 내지 300개, 100 내지 250개, 또는 150 내지 250개 뉴클레오티드 길이일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자에 직접 연결될 수도 있으나, 태그 유전자 또는 링커 등을 매개로 돌연변이 S1 유전자에 연결될 수도 있다. 예컨대, 상기 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질에서 251-455번째 아미노산 위치에 포함되는 에피토프의 아미노산 서열의 전후로 링커(linker), Myc 단백질, FLAG 단백질, 및 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이들의 순서에는 제한이 없다. 상기 2A 펩타이드는 예컨대 P2A, T2A, E2A, 또는 F2A 등을 포함하는 2A 펩타이드 중 선택될 수 있으며, 이의 종류에 제한은 없다.
상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 세포 내로 도입시 전사 및 번역을 거쳐 변이된(절단된) 시그마 1 단백질 및 상기 외인성 에피토프가 융합된 상태의 단백질을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 야생형 시그마 1 단백질의 헤드 부분을 외인성 에피토프가 대체한 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로부터 발현된, 상기 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 제공한다. 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질의 1번 내지 250번째 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질의 250번째 아미노산 이후의 아미노산 서열은 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 상기 돌연변이 시그마 1 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
바람직하게는, 상기 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자로부터 생성되는 융합 단백질은 레오바이러스의 캡시드(capsid)로서 발현되는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 융합단백질은 기타 레오바이러스 성분과 함께 조립되어, 재조합 레오바이러스의 캡시드 단백질로서 외부에 디스플레이(display)될 수 있다. 상기 재조합 레오바이러스가 세포에 감염되고 나면, 시그마 1 단백질의 헤드 부분에 위치하는 외인성 에피토프가 세포에 노출되므로, 상기 에피토프에 대한 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 상기 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자 외에 레오바이러스의 생성에 필요한 기타 레오바이러스 유전자를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 레오바이러스의 필수 유전자를 포함할 수 있다. 상기 필수 유전자는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자로부터 발현된 재조합 단백질은 레오바이러스의 필수 유전자들로부터 발현된 기타 레오바이러스 성분과 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성할 수 있다. 또는, 상기 레오바이러스 필수 유전자들은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 별개의 벡터에 도입되어, 본 발명의 재조합 벡터와 독립적으로 발현될 수 있다. 이 때, 각 벡터로부터 생성된 발현 산물은 함께 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 융합단백질은 기타 레오바이러스 성분과 조립되어 온전한 레오바이러스를 형성하므로, 바이러스 감염 기작을 통해 세포에 노출될 수 있다. 레오바이러스의 필수 유전자들은 공지되어 있으며, 이의 서열정보는 공공 데이터베이스를 통해 확인될 수 있다. 예컨대, 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4 유전자의 서열정보는 각각 GenBank 등록번호 EF494435.1, EF494436.1, EF494437.1, EF494438.1, EF494439.1, EF494440.1, EF494441.1, EF494442.1, EF494443.1, 및 EF494444.1로 확인할 수 있으나, 이는 대표예일뿐, 상기 서열정보로 한정되는 것은 아니다. 이외에도, 레오바이러스 유전자 서열은 본 명세서의 서열목록에 구체적으로 제시되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된(즉, 형질전환, 형질감염, 또는 형질주입된) 세포를 제공한다. 상기 세포는 도입된 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자를 발현하여 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 생성할 수 있다.
궁극적으로는, 상기 세포는 상기 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질을 포함하는 재조합 레오바이러스를 생성한다. 따라서, 온전한 레오바이러스의 생성을 위해 상기 세포에는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입될 수 있다. 혹은, 상기 유전자들은 상기 세포의 유전체 내에 삽입되어 존재할 수도 있고, 혹은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 함께 삽입되어 있을 수 있다.
또한, 상기 세포에는 상기 재조합 단백질의 발현 및 재조합 레오바이러스의 생성을 보조할 수 있는 기타 성분들을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 백시니아 바이러스 캡핑 효소, D1R 및 D12L의 이종이량체, 및 Reovirus의 융합 단백질인 FAST-p10 등을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스를 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 유전체 내에 포함하는 재조합 레오바이러스를 제공한다. 따라서, 상기 재조합 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 외인성 에피토프는 변이된(절단된) 시그마 1 단백질의 헤드에 위치하여 바이러스의 외부 캡시드에 존재한다. 바람직하게는, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 생성된 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 재조합 레오바이러스는 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 돌연변이 시그마 1 및 외인성 에피토프의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, “백신 (vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증이나 암 등의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다.
백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 백신은 시그마 1 단백질이 절단되어 약독화된 레오바이러스를 기반으로 하여, 이의 절단된 부위에 여러 가지 암 또는 감염성 질환을 유발하는 에피토프가 융합된 형태로 발현되도록 제조될 수 있으며, 예컨대, 상기 약독화된 레오바이러스의 절단된 시그마 1 단백질 및 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
상기 면역증강제(adjuvant)로 사용하는 물질에는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 명반(Alum), MPL(monophosphoryl lipid A), 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 레오바이러스에는 본 명세서에 기재된 에피토프를 포함한 다양한 외인성 에피토프가 도입될 수 있으며, 상기 레오바이러스의 투여시 상기 외인성 에피토프의 안정적이고 반복적인 발현을 유도하여 상기 에피토프에 대한 면역세포 등의 면역기능을 증진시킬 수 있는 바, 다양한 질환의 예방 내지 치료를 위한 백신플랫폼을 제공한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에서 상기 질환은 본 발명에 따른 외인성 에피토프와 연관된 질환일 수 있다. 예컨대, 상기 질환은 상기 에피토프를 포함하는 항원에 의해 유발되는 질환일 수 있으며, 상기 질환이 암인 경우, 상기 암은 본 발명에 따른 외인성 에피토프를 포함하는 종양항원을 발현하는 암일 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 백신 조성물은 재조합 레오바이러스를 통해 하기와 같은 특징을 달성할 수 있다:
(a) 상기 재조합 레오바이러스로 감염된 세포에서 상기 외인성 에피토프의 발현을 유도함;
(b) 항원제시세포에 의한 상기 외인성 에피토프의 제시를 유도함;
(c) 상기 외인성 에피토프에 의한 T 세포의 사이토카인 생성을 활성화함; 및
(d) 상기 외인성 에피토프에 대한 중화항체의 생성을 유도함.
또한, 본 발명의 재조합 레오바이러스에 도입된 하나 이상의 에피토프는 T 세포 또는 B 세포가 항원을 식별하게 하여, 숙주에서 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도함으로써 면역 반응을 일으킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “중화 항체(neutralizing antibody)”란 병원체에 결합하여 세포를 감염시키거나 질환을 야기하는 병원체의 능력을 방해하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 의미한다.
본 발명에 있어서, “세포성 면역”이란 한 림프계 세포가 어떤 항원에 직접적으로 면역반응을 일으키는 면역 활동을 말한다. 백혈구 세포가 한 항원에 작용하여 그 세포를 먹는 대식작용을 하거나, 독성 세포 반응을 일으켜 항원을 제거하는 면역 활동을 말한다. 체내에서 혈청 항체에 의해 행해지는 체액성 면역과 함께 면역계를 구성하고 있으며, 대표적으로 세포 독성을 가지는 T 세포의 작용을 들 수 있다. T 세포는 B 세포와 결합하여 항체를 구성한 후 직접적으로 항원과 접촉해 항원을 파괴시킨다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 재조합 벡터로부터 발현될 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 질환은 상기 에피토프와 연관된 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 바이러스 에피토프를 도입하여 해당 바이러스에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 레오바이러스는 다양한 종양항원을 도입하여 해당 암의 예방 또는 치료 용도로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 세포는 포유동물 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바이러스 에피토프 및 종양항원은 상술하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 피부암은 편평상피세포암, 기저세포암, 및 흑색종에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 흑색종은 전이성 흑색종일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 PD-L1을 발현 또는 발현하지 않는 암일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 암 발병억제 유전자 (p53, Rb 등)의 돌연변이 또는 RAS 활성 돌연변이를 갖는 암일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 암은 야생형 레오바이러스에 대해 저항성이 있는 암일 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 재조합 벡터, 상기 세포, 또는 상기 재조합 레오바이러스의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 특히, 레오바이러스는 매우 높은 안정성을 가지므로 음료 또는 식품의 형태로 경구투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상술한 약학적 조성물에 대한 설명은 백신 조성물에도 동일하게 적용된다.
또한, 본 발명은 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 세포; 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 다양한 감염성 질환, 알러지, 또는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 돌연변이 S1 유전자는 시작 코돈으로부터 251번째 코돈에 종결 코돈을 갖는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 또는 재조합 레오바이러스를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 벡터, 세포, 또는 재조합 레오바이러스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 벡터, 세포, 또는 재조합 레오바이러스는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 감염성 질환, 알러지, 및/또는 암의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(S1) 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(S2) 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류에 외인성 에피토프-코딩 유전자를 삽입하거나, 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류 서열을 외인성 에피토프-코딩 유전자로 치환하는 단계.
상기 재조합 벡터는 역진화 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 역진화 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 S1 세그먼트 RNA를 생산할 수 있도록 제조된 바이러스 벡터를 의미할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 통해 제조될 수 있다. T7 RNA 중합효소 프로모터로부터 바이러스 RNA 세그먼트(segment)가 전사될 수 있도록 벡터를 구성하며, 3' 말단은 벡터에 있는 리보자임(ribozyme)에 의해 자연히 형성되어 벡터를 도입한 T7 중합효소 발현세포에서 바이러스 RNA가 생산되고 이를 이용하여 바이러스 단백질이 합성되게 되어 역진화 시스템(reverse genetics sytem)이라고 명명하고 있다. 이는 RNA 바이러스의 변이주를 디자인하여 만들어내는 유용한 방법이다.
상기 제조방법은 상기 단계 (S2) 이후에 (S3) 상기 (S2) 단계에서 제조된 재조합 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 세포는 바람직하게는 세포일 수 있다. 또는, 상기 세포는 BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 세포에 도입된 바이러스는 세포 내에서 바이러스 유전자를 발현하여 복제 및 증식될 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 레오바이러스 기반 백신 플랫폼의 제조 원리
σ1 단백질(시그마 1 단백질)은 야생형(WT) 레오바이러스 외부 캡시드 단백질로, 레오바이러스는 σ1 단백질을 통해 타겟 세포 표면의 단백질인 JAM-A를 인식 및 결합하여 세포 내로 진입한다. 레오바이러스 RP116은 σ1 단백질을 발현하는 S1 세그먼트(S1 유전자) 중 763번 뉴클레오티드가 C에서 T로 치환된 레오바이러스 돌연변이이다. 상기 뉴클레오티드의 치환으로 인해 RP116은 CAA(아미노산 251Q)가 763TAA(STOP 코돈)로 대체되는 독특한 돌연변이를 갖는다. 따라서, RP116은 야생형 레오바이러스가 생성하는 σ1 단백질에 비해 짧은 σ1 단백질을 생성한다. RP116은 높은 역가로 생성될 수 있으며 안정성이 높아 종양 내, 정맥 내, 및/또는 경구 투여를 통한 종양용해 면역요법으로 활용될 수 있다(도 1a).
RP116의 독특한 σ1 단백질의 생성은 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 구형 헤드가 바이러스 복제에 필수적이지 않다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 σ1 단백질의 구형 헤드를 다양한 기타 병원체 유래의 항원 단편으로 교체할 수 있으리라고 예측하였다. 이제, 본 발명자들은 RP116 유래 σ1 단백질에 200개의 아미노산 이내 혹은 그 이상의 항원부위를 추가하여 다양한 방식으로 제조 가능한 혁신적이고 안전한 레오바이러스 백신 플랫폼을 제조하고자 하였다(도 1b). 특히, 피막이 없는 레오바이러스는 가혹한 환경 조건에도 안정하며, 따라서 음료 또는 식품 등의 형태로도 투여가 가능한 이점이 있다. 경구투여시 레오바이러스는 소장의 M세포를 우선적으로 감염시키며, σ1 단백질에 재조합된 다양한 종양 특이적 항원 및 병원체등이 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다(도 1c).
본 발명자들은 레오바이러스의 역유전학(Reverse Genetics) 시스템에 기반한 빠른 교환 (Quick Exchange) 기술을 이용하여 백신 플랫폼을 제조하였다. 레오바이러스 역유전학 시스템은 총 10개의 바이러스 유전자의 개별 단편(Kobayshi et al., 2007) 또는 다중 유전자 단편을 운반하는 벡터로 구성된다(Kobayashi et al., 2010). 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 레오바이러스 유래 유전자를 삽입하기 위한 벡터로 pUC19 vector를 사용하였으나, 이는 대표예일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명에 따른 레오바이러스의 시그마 1 단백질을 발현하기 위한 벡터로는 pS1Att, pS1XX, pL1, pSet2, pSet3, 및 pSet4 등이 사용될 수 있다. T7 RNA 중합효소와 동시에 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에서는 바이러스 유전자가 전사되어 궁극적으로 24 내지 72시간 이내에 복제 가능한 레오바이러스 입자가 생성된다. RP116의 S1 세그먼트 중 STOP 코돈 돌연변이 (야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 251번 아미노산 위치) 이후에(즉, 하류) 제한효소 인식부위를 설계하여 도입함으로써 251 내지 C-말단의 부위 (즉, 야생형 레오바이러스의 σ1 단백질의 251번 내지 455번 아미노산)를 간편하게 비-레오바이러스의 항원으로 대체할 수 있다. 예를 들어, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 변이된 S1 유전자의 250번 코돈 이후에 탐지 목적의 Myc 태그 및 FLAG 태그 등을 결합할 수 있으며, 다양한 외래 에피토프를 융합할 수 있다. 또한, 보조적인 벡터, 즉 백시니아 바이러스 캡핑 효소, D1R 및 D12L의 이종이량체, 및 Reovirus의 융합 단백질인 FAST-p10 등을 co-transfection하면 재조합 레오바이러스의 생성율을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한 바이러스의 감염 전에 키모트립신 처리를 병행하면 생산용 세포주 (BHK, L929, vero 세포 등)에 대한 바이러스의 부착 및 진입을 더욱 용이하게 할 수 있다(도 1e).
본 발명의 실시예에서 사용된 변형된 레오바이러스(RP116)의 시그마 1 단백질 (2가지 서열을 나타냄) 및 이를 암호화하는 유전자 서열은 아래 표 1에 나타냈다. 또한, 본 발명의 실시예에서 사용된 에피토프의 아미노산 서열, construct 아미노산 서열, 및 코돈 최적화된 construct DNA 서열은 하기 표 2에 나타냈다.
구분 서열 서열번호
RP116 sigma-1 protein (1) MDPRLREEVVRLIIALTSDNGVSLSKGLESRVSALEKTSQIHSDTILRITQGLDDANKRIIALEQSRDDLVASVSDAQLAISRLESSIGALQTVVNGLDSSVTQLGARVGQLETGLAELRVDHDNLVARVDTAERNIGSLTTELSTLTLRVTSIQADFESRISTLERTAVTSAGAPLSIRNNRMTMGLNDGLXLSGNNLAIRLPGNTGLNIQNGGLQFRFNTDQFQIVNNNLTLKTTVFDSINSRXGAXE 1
RP116 sigma-1 protein (2) MDPRLREEVVRLIIALTSDNGASLSKGLESRVSALEKTSQIHSDTILRITQGLDDANKRIIALEQSRDDLVASVSDAQLAISRLESSIGALQTVVNGLDSSVTQLGARVGQLETGLAELRVDHDNLVARVDTAERNIGSLTTELSTLTLRVTSIQADFESRISTLERTAVTSAGAPLSIRNNRMTMGLNDGLTLSGNNLAIRLPGNTGLNIQNGGLQFRFNTDQFQVVNNNLTLKTTVFDSINSRIGATE 2
RP116 sigma-1 gene (full length) GCTATTGGTCGGATGGATCCTCGCCTACGTGAAGAAGTAGTACGGCTGATAATCGCATTAACGAGTGATAATGGAGTATCACTGTCAAAAGGGCTTGAATCAAGGGTCTCGGCGCTCGAGAAGACGTCTCAAATACACTCTGATACTATCCTCCGGATCACCCAGGGACTCGATGATGCAAACAAACGAATCATCGCTCTTGAGCAAAGTCGGGATGACTTGGTTGCATCAGTCAGTGATGCTCAACTTGCAATCTCCAGATTGGAAAGCTCTATCGGAGCCCTCCAAACAGTTGTCAATGGACTTGATTCGAGTGTTACCCAGTTGGGTGCTCGAGTGGGACAACTTGAGACAGGACTTGCAGAGCTACGCGTTGATCACGACAATCTCGTTGCGAGAGTGGATACTGCAGAACGTAACATTGGATCATTGACCACTGAGCTATCAACTCTGACGTTACGAGTAACATCCATACAAGCGGATTTCGAATCTAGGATATCCACATTAGAGCGCACGGCGGTCACTAGCGCGGGAGCTCCCCTCTCAATCCGTAATAACCGTATGACCATGGGATTAAATGATGGACTCAYGTTGTCAGGGAATAATCTCGCCATCCGATTGCCAGGAAATACGGGTCTGAATATTCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTTAATACTGATCAATTCCAGATAGTTAATAATAACTTGACTCTCAAGACGACTGTGTTTGATTCTATCAACTCAAGGABAGGCGCAAYTGAGTAAAGTKMCGTGGCGTCGGCAGTGACTCCCTTGAGATTAAACAGTAGCACGAAGGTGCTGGATATGCTAATAGACAGTTCAACACTTGAAATTAATTCTAGTGGACAGCTAACTGTTAGATCGACATCCCCGAATTTGAGGTATCCGATAGCTGATGTTAGCGGCGGTATCGGAATGAGTCCAAATTATAGGTTTAGGCAGAGCATGTGGATAGGAATTGTCTCCTATTCTGGTAGTGGGCTGAATTGGAGGGTACAGGTGAACTCCGACATTTTTATTGTAGATGATTACATACATATATGTCTTCCAGCTTTTGACGGTTTCTCTATAGCTGACGGTGGAGATCTATCGTTGAACTTTGTTACCGGATTGTTACCACCGTTACTTACAGGAGACACTGAGCCCGCTTTTCATAATGACGTGGTCACATATGGAGCACAGACTGTAGCTATAGGGTTGTCGTCGGGTGGTGCGCCTCAGTATATGAGTAAGAATCTGTGGGTGGAGCAGTGGCAGGATGGAGTACTTCGGTTACGTGTTGAGGGGGGTGGCTCAATTACGCACTCAAACAGTAAGTGGCCTGCCATGACCGTTTCGTACCCGCGTAGTTTCACGTGAGGATCAGACCACCCCGCGGCACTGGGGCATTTCATC 5
Epitope Name Amino Acid Sequence Construct Amino Acid Sequence Codon Optimized Construct DNA Sequence (5'-3')
RBD NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV aatatcactaacttgtgtccgttcggcgaggtttttaatgcgaccaggtttgcttccgtgtacgcctggaacaggaaacggatctccaattgtgtcgccgattactccgtcttgtataattcagcatctttcagcacgtttaaatgttacggagtttcccccacaaaattgaatgacctttgctttacgaacgtctacgcggattcatttgtaatccggggggacgaagttaggcaaattgcgccagggcagactggcaagatagctgactataattataaattgccggatgactttacgggctgtgtgattgcttggaactcaaataatctggactcaaaggtagggggaaattataactacctttacaggctgttccggaagagtaatctgaagccattcgaaagagatataagtacagagatctaccaagctggaagcaccccctgcaatggtgttgaaggattcaattgttatttcccattgcaatcctatggttttcaaccgacgaatggggtgggataccaaccatatcgagttgtggttctcagtttcgagttgcttcatgctcctgcgacagtatgtggaccaaaaaaatctactaatctggtgaagaataaatgcgtcaatttttaa
OVA 257-264 SIINFEKL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLSIINFEKLGGGGSSIINFEKLGGGGSSIINFEKLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgagtattataaacttcgagaagctgggtgggggaggaagttcaatcattaattttgaaaaacttggaggaggtggatcttccataattaattttgaaaagctggattataaggatgacgacgataagtga
OVA 323-339 ISQAVHAAHAEINEAGR GGGGSGGGGSEQKLISEEDLISQAVHAAHAEINEAGRDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgatttcacaggctgtgcatgctgcacatgctgaaattaatgaggctggacgtgattataaggatgacgacgataagtga
Adpgk ASMTNMELM GGGGSGGGGSEQKLISEEDLASMTNMELMGGGGSASMTNMELMGGGGSASMTNMELMDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctggctagcatgacgaacatggagctaatgggagggggcggaagtgcttctatgactaatatggaactgatgggaggtggaggttctgcttcaatgaccaacatggaacttatggattataaggatgacgacgataagtga
Rpl18 KILTFDRL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKILTFDRLGGGGSKILTFDRLGGGGSKILTFDRLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgaagattctgacgtttgatcgtctggggggtggcggatctaagatattgacgttcgatcgactgggaggaggtggctctaagatcctaacattcgaccgtctagattataaggatgacgacgataagtga
P15E KSPWFTTL GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgaagtcaccttggtttactactctcggtgggggaggaagtaaatcgccatggtttactacattgggaggaggtgggtctaagtcaccatggttcacgacattggattataaggatgacgacgataagtga
S21P2(1) PSKPSKRSFIEDLLFNKV GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgcctagtaagccttctaagcgcagcttcatagaagatttgttgttcaataaggtagattataaggatgacgacgataagtga
S21P2(2) PSKPSKRSFIEDLLFNKV GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVGGGGSPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgcctagtaagccttctaagcgcagcttcatagaagatttgttgttcaataaggtaggtgggggaggaagtccatcgaagccaagtaagcgtagtttcattgaggacctcctcttcaacaaggttgattataaggatgacgacgataagtga
실시예 2. SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 SARS-CoV-2 중화항체 생성 유도능 확인
레오바이러스 기반 백신플랫폼의 일 실시예로서, RP116 레오바이러스의 σ1 단백질에 코돈-최적화된 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 (RBD)을 융합한 Reo-RBD(ReoV-RBD)를 제조하였다. 즉, Reo-RBD는 RP116의 S1 유전자의 251번 코돈 이후에 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD) 염기서열이 도입된 유전자를 가지며, 이로부터 σ1 단백질과 융합된 형태의 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인이 생성된다. 본 발명자들은 상기 재조합 레오바이러스를 BHK21 세포에서 발현시켰으며, 수득된 바이러스를 L929 세포로 감염시켰다. 상기 재조합 레오바이러스의 존재는 SARS-CoV-2 중화 항체를 통해 검출하였다.
구체적으로, 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 잘린 σ1(truncated σ1)을 가진 돌연변이 레오바이러스(ReoV+Q251*), 및 RBD 항원기를 도입한 재조합 레오바이러스(ReoV+RBD)를 각각 L929세포에 감염시키고, 96시간 후 세포 용해물에 대한 분석을 진행하였다. 본 실시예에서 양성 대조군으로 사용된 재조합 RBD는 Dr. John Bell 연구실에서 제조된 것을 사용하였으며(Azad et al., 2020), SARS-CoV-2 NeuAb(40592-MM57)는 Sino Biological(Wayne, PA, USA)에서 구매하여 사용하였다. 먼저, 항-레오바이러스 항체를 처리하여 웨스턴블롯을 진행한 결과, 레오바이러스 단백질을 검출할 수 있었다(도 2a). 또한, 각각의 재조합 레오바이러스를 L929세포에 감염시킨 후, 각 세포로부터 핵산 분자들을 분리한 후, RBD 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-qPCR을 수행한 결과, 야생형 레오바이러스나 ReoV+Q251*로 감염된 세포에서는 RBD 유전자가 검출되지 않았으나, ReoV+RBD로 감염된 세포에서는 RBD 유전자가 검출되었다(도 2b). 또한, 각 바이러스로 감염된 세포의 용해물에서 도트 블롯법을 수행한 결과, 모든 그룹에서 항-레오바이러스 항체(anti-ReoV)와 반응이 확인된 반면(도 2c 하단), 항-SARS-CoV-1 중화항체(NeuAb)와의 반응은 ReoV+RBD로 감염된 세포의 용해물에서만 확인할 수 있었다(도 2c 상단). 상기 결과들은 RP116의 돌연변이 S1 유전자에 RBD 유전자가 융합된 재조합 Reo-RBD가 SARS-CoV-2에 대한 중화항체에 의해 인식가능한 구조를 가지는 것을 증명한다.
실시예 3. 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 다양한 외래 항원 발현능 확인
상기 실시예를 통해 본 발명에 따른 레오바이러스-기반 백신플랫폼이 SARS-CoV-2 RBD 항원기가 융합된 σ1 단백질을 통해 SARS-CoV-2 중화항체와 반응할 수 있음을 확인한 바, 이어서 본 실시예에서는 본 발명의 백신플랫폼이 상기 항원기 외에도 다양한 외래 에피토프를 발현할 수 있는지 검증하였다.
먼저, 다양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프(ovalbumin 단편, ADP-dependent Glucokinase(Adpgk), ribosomal protein L18(Rpl18))가 융합된 재조합 레오바이러스를 제작하여 세포에 감염시킨 후 세포 용해물을 분석한 결과, 각 세포에서 레오바이러스 유래 단백질이 확인되었으며(도 3a), S1 유전자의 RNA는 물론, 도입된 T 세포 에피토프 RNA 산물이 검출되었다(도 3b). 또한, B 세포 에피토프(S21P2)가 융합된 S1 유전자를 갖는 재조합 레오바이러스로 감염시킨 세포에서도, 레오바이러스 유래 단백질은 물론 도입된 B 세포 에피토프의 RNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 3c 및 3d).
상기 결과는 본 발명에 따른 레오바이러스-기반 백신플랫폼이 다양한 외래 항원의 에피토프를 발현할 수 있음을 보여주며, 따라서 본 발명의 백신플랫폼에 다양한 질병의 에피토프를 도입하여 새로운 백신 개발을 위한 스크리닝에 활용할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. Ovalbumin 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 세포 감염능 및 외래 에피토프 발현능 확인
본 실시예에서는 ovalbumin(OVA) 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스를 제조한 후, 이의 외래 항원 발현능을 확인하였다.
상기 재조합 레오바이러스의 변이된 S1 유전자에는, 각 측면에 Myc 태그 및 FLAG 태그가 결합된 OVA257-264 에피토프가 융합되어 있다. 상기 Myc 및 FLAG 태그는 면역세포화학 분석법으로 검출 가능한데, 태그 단백질들의 형광은 레오바이러스 유래 단백질의 형광 신호와 겹쳐서 존재하므로, 재조합 바이러스로 감염된 세포에서 외래 에피토프의 항원이 발현되는 것을 간접적으로 나타낸다.
구체적으로, 커버슬립에서 배양한 Vero 세포를 ReoV, ReoV+Q251*, 또는 ReoV+OVA257-264(OVA257-264가 도입된 재조합 레오바이러스)로 48시간 동안 감염시켰다. 이후 세포를 3.7% PFA에 고정하고, 항-ReoV(1:1000, 토끼 혈청), 항-Myc(1:200), 및 항-FLAG(1:200)로 1시간 동안 반응시켰으며, anti-ReoV를 검출하기 위한 Alexa Fluor 488로 표지된 항-토끼 항체, 및 anti-Myc 또는 anti-FLAG를 검출할 수 있는 Alexa Fluor 594로 표지된 항체를 처리하여 45분 동안 인큐베이션 하였다. 염색을 마친 커버슬립은 핵 카운터 염색용 DAPI가 있는 Fluoromount G로 마운팅하였다. 샘플은 60X 오일 대물렌즈가 있는 올림푸스 공초점 현미경으로 촬영했다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, OVA가 도입된 레오바이러스로 감염된 세포에서는 레오바이러스 단백질의 형광신호와 함께, OVA 항원의 존재를 나타내는 태그 단백질들의 형광신호가 함께 검출되었다.
상기 결과는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼이 포유동물 세포에 대해 감염성이며, 도입된 에피토프를 효과적으로 발현할 수 있음을 시사한다.
실시예 5. 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 외래 에피토프 발현능 확인
추가로, 암세포를 인식하는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 레오바이러스를 제작한 후, 상기 바이러스가 감염된 세포에서 상기 에피토프의 발현을 유도하는지 검증하였다. 구체적으로, BHK21 세포를 야생형 레오바이러스(WT); T 세포 에피토프인 p15E를 발현하는 재조합 레오바이러스(ReoV+p15E); 또는 SARS-CoV-2 에피토프인 S21P2를 발현하는 레오바이러스(ReoV+S21P2(2))로 감염시켰다. 각 에피토프는 Myc 및 FLAG로 태깅되었다. 상기 SARS-CoV-2 에피토프는 Poh et al. (Nat. Comm., 2020)에서 의해 SARS-CoV-2에 대한 중화항체 생성을 유도한다는 것이 검증되었다. 감염 48시간 후에 각 세포 용해물로 웨스턴 블롯을 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 레오바이러스 단백질은 모든 샘플에서 검출되었으나, Myc 및 FLAG 태그는 p15E 또는 SARS-CoV-2 에피토프로 엔지니어링된 레오바이러스로 감염된 세포에서만 검출되었다. 또한, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S2 (Sino Biological 사)의 전체 단백질을 항원으로 하여 제작된 anti-S2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행한 결과, ReoV+S21P2(2) 레오바이러스로 감염된 샘플에서만 동일한 크기의 면역 반응성이 있는 단백질 밴드를 확인할 수 있었다(도 5에서 화살표로 표시함).
이러한 결과는 T 세포 에피토프 또는 SARS-CoV-2 에피토프를 보유하는 재조합 레오바이러스가 상기 에피토프들에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 6. 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 안정성 확인
본 실시예에서는 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 안정성을 확인하였다. 이를 위해, S21P2 에피토프 또는 OVA257-264가 도입된 S1 단백질을 발현하는 재조합 레오바이러스를 제작하였다(도 6a). 각각의 에피토프는 N-말단과 C-말단에 각각 Myc 또는 FLAG 태그를 포함하도록 설계되었으며, 상기 에피토프들이 레오바이러스를 통해 세포 내에서 안정적으로 발현되는지 확인하였다.
구체적으로, BHK21 세포를 상기 재조합 레오바이러스로 48시간 동안 감염시킨 후 항-레오바이러스 항체(anti-ReoV) 및 항-FLAG 항체(anti-FLAG)로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 재조합 레오바이러스로 감염된 세포에서는 레오바이러스 단백질 밴드와 FLAG 밴드가 모두 검출되었다(도 6b). 상기 밴드들은 5번의 계대를 거친 세포에서 매우 높은 강도로 검출된 바, 이는 세포의 패시지(Passages)가 여러 번 지나도 본 발명의 재조합 레오바이러스에 의한 외래 에피토프의 발현이 안정적으로 일어난다는 것을 증명한다.
실시예 7. SARS-CoV-2 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스의 SARS-CoV-2 중화항체 생성 유도능 확인
앞선 실시예를 통해 본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 외래 항원 발현능 및 상기 항원에 대한 중화항체 생성 유도능을 확인한 바, 본 실시예에서는 상기 백신플랫폼의 중화항체 생성 유도능을 in vivo에서 확인하였다. 재조합 레오바이러스의 대표예로서 SARS-CoV-2 에피토프 S21P2가 도입된 재조합 레오바이러스를 사용하였다.
도 7a는 재조합 레오바이러스 기반 백신의 투여 용량, 경로, 및 일정을 나타낸 개략도이다. 레오바이러스 기반 백신을 경구 또는 복강내 경로로 1주 간격으로 3회 접종하였으며, 일주일 경과 후 마우스를 희생시킨 후 부검하여 혈청과 비장을 분석에 사용하였다. 실험종료 시점인 투여 21일차에 각 그룹별 체중을 비교한 결과, 유의미한 체중 차이가 관찰되지 않았다(도 7b). 아울러, 마우스로부터 수득한 혈청으로부터 중화항체를 분리한 후 SARS-CoV-2 유사 바이러스와 함께 HEK293T 세포(n=2)에 처리하여 상기 중화항체가 SARS-CoV-2 유사 바이러스의 세포 감염을 저지하는지 확인하였다. 그 결과, S21P2 에피토프-발현 레오바이러스 백신으로 접종된 마우스의 혈청에서 분리된 중화항체를 처리한 그룹은 SARS-CoV-2 유사 바이러스가 중화되어 ACE2-발현 HEK293T 세포에 대한 감염능이 대조군 대비 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 7c). 또한, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 ELISA로 분석한 결과, SARS-CoV-2 에피토프를 발현하는 레오바이로스가 투여된 마우스의 혈청에서 높은 수준의 형광이 관찰된 바, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체가 존재하는 것을 확인하였다(도 7d). 상기 결과들은 SARS-CoV-2 항원이 도입된 재조합 레오바이러스가 마우스 체내에서 SARS-CoV-2 중화항체의 생성을 효과적으로 유도할 수 있으며, 따라서 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 예방용 백신으로 활용 가능함을 보여준다.
실시예 8. 레오바이러스 기반 백신의 면역세포 활성화 기능 확인
본 실시예에서는 외래 에피토프가 도입된 레오바이러스 기반 백신이 면역세포를 활성화하는지 확인하였다. 먼저, 대표예로서 ovalbumin 에피토프(OVA257-264)가 도입된 레오바이러스를 제작하여 세포에 감염시켰으며, 상기 에피토프가 주조직 적합성 복합체-I(Major histocompatibility complex-I, MHC-I)로 제시되는지 확인하였다. 레오바이러스로 감염된 L929-H2Kb 세포를 수집하여 MHC-I에 결합된 OVA257-264를 검출할 수 있는 항체로 유세포분석을 수행한 결과, 레오바이러스에 의해 전달된 OVA257-264 에피토프가 MHC-I으로 제시된 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 이어서, 상기 레오바이러스의 면역세포 활성화 기능을 확인하기 위해 L929-H2JKB 세포를 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 에피토프가 도입되지 않은 백신플랫폼(ReoV+Q257*), 또는 OVA257-264가 도입된 레오바이러스(ReoV+OVA257-264)로 감염시킨 후 OT-I 마우스 비장세포와 공동 배양하였다. 배양을 마친 세포를 수집하여 다양한 T 세포 단백질 특이적 항체 및 세포 내 사이토카인 특이적 항체를 사용하여 유세포분석을 진행하였다. 결과는 도 8b 및 8c에 나타냈다. 도면에서 확인 가능한 바와 같이, 기타 레오바이러스로 감염된 세포에 비해, Ovalbumin 에피토프가 도입된 레오바이러스로 감염된 세포는 IFNγ 및 TNFα를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율이 증가한 바, Ovalbumin 에피토프 특이적 T 세포가 활성화된 것을 알 수 있었다. 상기 결과들은 본 발명의 레오바이러스 기반 백신은 세포를 감염시켜 에피토프의 발현 및 항원제시세포에 의한 항원제시를 유도할 수 있으며, 따라서 해당 에피토프에 대한 면역세포의 면역기능 활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 9. 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼의 암 예방 및 치료기전
본 발명에 따른 레오바이러스 기반 백신플랫폼은 암의 예방 및 치료에도 활용 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 레오바이러스 RP116의 σ1 단백질에 종양 에피토프를 융합함으로써 종양 에피토프를 반복적으로 발현하는 재조합 레오바이러스를 제조할 수 있다(도 9a). 본 발명의 재조합 레오바이러스의 안정적인 세포 감염능 및 외래 에피토프 발현능은 여러 차례의 실험을 통해 확인된 바, 예를 들어, 다양한 재조합 레오바이러스를 L929 세포에 72시간 동안 감염시킨 후 세포 용해물의 단백질을 분석한 결과 모든 실험군에서 레오바이러스 유래 단백질이 검출되며, ovalbumin 에피토프를 동비한 레오바이러스로 감염된 세포에서는 상기 에피토프에 태깅된 태그 단백질이 검출된다(도 9b). 따라서, 종양 항원을 안정적으로 발현하는 재조합 레오바이러스의 제조도 가능하며, 상기 레오바이러스를 암의 예방을 위한 백신으로 활용 가능하다. 예를 들어, 대장암 (colorectal cancer)은 발달 초기 단계에서 진단이 어려운 암이지만, 레오바이러스가 쉽게 접근 가능한 해부학적 부위에 위치한다. 따라서, 개체에 대장암의 종양항원이 도입된 레오바이러스 백신을 투여시, 암이 발병하기도 전에 상기 백신이 체내에 종양 에피토프를 노출시켜 종양 항원에 대한 신체의 예방적 면역기능을 유도할 수 있으며, 또한 종양이 성장한 이후에도 종양의 성장을 억제하는 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 레오바이러스 기반 백신플랫폼은 다양한 바이러스, 박테리아, 및 진균 등에 의한 감염성 질환은 물론, 암을 포함한 다양한 질환의 예방 및 치료용 물질로 활용 가능하다(도 9c).
실시예 10. 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과 확인
본 실시예에서는 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 in vivo에서 확인하였다. 이를 위해 야생헝 레오바이러스 또는 Ovalbumin 항원(S1OVA257-264)이 도입된 레오바이러스를 C57BL/6 마우스에 복강내 경로를 통해 일주일 간격으로 총 3회 투여하였으며, 바이러스 투여를 마친 마우스에는 B16F10 흑색종 세포 및 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 발현하는 흑색종 세포(B16F10-OVA)를 각각 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 3 × 106 개씩 피하 주사하였다(도 10a). 이후 마우스들의 종양 발생 및 성장을 모니터링하고 전자 캘리퍼스를 이용해 종양의 크기를 측정했다. 종양 부피가 >1500 mm3에 도달하거나 활력징후가 안락사기준에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양을 적출하였다. 안락사된 마우스들의 종양 크기를 비교한 결과, OVA 항원이 도입된 레오바이러스 백신(ReoV+OVA257-264)이 접종되었던 마우스는 다른 그룹과 비교하여 B16F10-OVA 종양 크기가 현저하게 감소한 바, 본 발명의 레오바이러스 백신이 종양 성장을 효과적으로 예방하였음을 확인할 수 있었다(도 10b). 정확한 검증을 위해 각 마우스로부터 일반적인 B16F10 세포로부터 발달한 종양과 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 B16F10 세포로부터 발달한 종양의 크기를 측정하여 비교하였다. 그 결과, Ovalbumin 항원이 도입된 레오바이러스가 접종된 마우스는 일반적인 종양에 비해 Ovalbumin 특이적 항원을 발현하는 종양의 크기가 현저히 감소하였으며, 대조군 및 야생형 레오바이러스가 접종된 마우스에 비해서도 Ovalbumin 항원-발현 종양의 크기가 두드러지게 감소한 바(도 10d), 본 발명의 레오바이러스 백신이 Ovalbumin 항원에 대한 면역기능 강화를 유도하여 Ovalbumin-발현 종양 성장을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다. 아울러, 대조군과 레오바이러스 백신 투여군간에 유의미한 체중 차이는 확인되지 않은 바, 본 발명의 레오바이러스 기반 백신에 독성이 없음을 확인하였다(도 10c).
실시예 11. 레오바이러스 기반 백신의 암 치료 효과 확인
앞선 실시예를 통해 본 발명의 레오바이러스 기반 백신의 암 예방 효과를 확인한 바, 본 실시예에서는 상기 백신의 암 치료 효과를 in vivo에서 검증하였다. 먼저, C57BL/6마우스의 옆구리에 종양세포 특이적 항원인 Ovalbumin 에피토프(OVA)를 발현하는 흑색종 B16F10-OVA세포를 3 × 105 개씩 피하 주사하였다. 이후 종양의 발병 및 성장을 모니터링하고 전자 캘리퍼스를 사용해 종양의 크기를 측정하였다. 종양세포의 이식 후 4일, 11일 및 18일차 3회에 걸쳐 정맥투여 또는 경구투여를 통해 OVA 특이적 항원을 발현하는 재조합 레오바이러스 백신을 투여하였다. 또한, 대조군으로서 Vehicle 또는 OVA 에피토프를 발현하지 않는 레오바이러스(S1-Q251*)을 동량 투여하였다(도 11a). 종양 부피가 >2500 mm3에 도달하거나 활력징후가 안락사기준에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양을 적출하였다. 먼저 종양 성장을 비교한 결과, OVA 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스를 투여한 마우스의 종양 성장이 기타 그룹에 비해 눈에 띄게 지연된 바, 에피토프가 도입된 레오바이러스에 의한 종양 성장 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 11b). 또한 마우스의 비장세포에서 분리한 CD8+ T 세포를 배양한 후 Ovalbumin 펩타이드 SIINFEKL를 처리하여 T 세포의 활성화 수준을 비교하였다. 그 결과, OVA 에피토프가 도입된 재조합 레오바이러스가 투여된 마우스에서 분리된 T 세포는 기타 그룹에 비해 항원 SIINFEKL에 의한 활성화가 더욱 높은 수준으로 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 11c 및 11d). 본 발명의 레오바이러스 기반 백신이 종양항원에 대한 항암 면역세포의 면역기능을 효과적으로 유도하였음을 알 수 있었다. 상기 결과들은 본 발명의 레오바이러스 기반 백신이 종양 에피토프를 효과적으로 체내에 노출시켜 종양항원에 대한 면역기능을 활성화하고, 종양의 성장을 현저하게 억제할 수 있음을 증명한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (23)

  1. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 재조합 벡터는 다음 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 20의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (b) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 23의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (c) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 26의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (d) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 29의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (e) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 32의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (f) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 35의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (g) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 38의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함; 및
    (h) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 41의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 5' 말단으로부터 763번째 뉴클레오티드가 T로 치환된, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 상기 돌연변이 S1 유전자의 하류(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 S1 유전자 및 상기 외인성 에피토프-코딩 유전자는 함께 발현되어 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 외인성 에피토프는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 알레르겐, 및 종양항원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 에피토프인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 재조합 벡터.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 재조합 벡터.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로부터 발현된, 외인성 에피토프가 융합된 돌연변이 시그마 1 단백질.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 레오바이러스의 L1, L2, L3, M1, M2, M3, S2, S3, 및 S4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터가 더 도입된 것인, 세포.
  13. 돌연변이 S1 유전자 및 외인성 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 레오바이러스로서, 상기 바이러스는 다음 중 어느 하나를 특징으로 하는 재조합 벡터가 도입된 세포로부터 생성된 것인, 재조합 레오바이러스:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 20의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (b) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 23의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (c) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 26의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (d) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 29의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (e) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 32의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (f) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 35의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (g) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 38의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함; 및
    (h) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 41의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 레오바이러스는 상기 외인성 에피토프를 발현하는 것을 특징으로 하는, 재조합 레오바이러스.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 재조합 레오바이러스는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 세포로부터 생성된 것인, 재조합 레오바이러스.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 또는 상기 세포로부터 생성된 재조합 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 백신 조성물.
  17. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 바이러스의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하고,
    상기 재조합 벡터는 다음 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 20의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (b) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 23의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (c) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 26의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (d) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 29의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (e) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 32의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (f) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 35의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (g) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 38의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함; 및
    (h) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 41의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스, 노로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 인체 유두종바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 댕기열 바이러스, 소아마비 바이러스, 거대세포바이러스, 댕기열 바이러스, 황열바이러스, 아데노바이러스, 일본뇌염 바이러스, 천연두 바이러스, 및 지카바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 레오바이러스의 돌연변이 S1 유전자, 및 종양항원의 에피토프-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하고,
    상기 재조합 벡터는 다음 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (a) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 20의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (b) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 23의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (c) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 26의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (d) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 29의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (e) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 32의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (f) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 35의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함;
    (g) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 38의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함; 및
    (h) 서열번호 4 또는 5의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 41의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 종양항원은 Ovalbumin, CD19, NY-ESO-1, EGFR, TAG72, IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3, ROR1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1), Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2), 종양바이러스 항원, TP53, 및 KRAS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 흑색종, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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