WO2022169339A1 - 신규 핵산 분자 - Google Patents

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WO2022169339A1
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cancer
acid molecule
protein
antigen
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김경진
양주성
최강현
이윤채
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에스티팜 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule for preventing or treating a viral infection or cancer, comprising a nucleic acid encoding a signal peptide and a nucleic acid encoding an antigen.
  • the present invention relates to a vaccine composition for preventing or treating a viral infection or cancer comprising the nucleic acid molecule.
  • Vaccines are currently being developed and manufactured in various ways, and specific types are attenuated/live vaccines, which inject pathogens in an attenuated state, There are toxoid vaccines, subunit vaccines prepared by extracting only the antigenic determinants recognized as antigens, and recombinant vaccines prepared by separately producing only epitopes using genetic information. have.
  • the recombinant vaccine has the advantage of high safety because it does not contain components other than the epitope.
  • the nucleic acid vaccine made of mRNA has a high production rate and low cost, and has cell-mediated immunity and body fluids. There are many advantages in that it can induce an immune response against both humoral immunity.
  • the composition of the vaccine can be designed in various ways, such as by selecting and using only a specific epitope that induces an immune response among various components of the antigen, which is useful for the prevention or treatment of various diseases such as viral infection and cancer. .
  • viral infections range from relatively mild symptoms such as colds, influenza, chickenpox, and herpes labialis, rabies, Ebola, Marburg, Crimean Congo hemorrhagic fever virus disease, AIDS, avian influenza, SARS, COVID-19, cancer, etc.
  • rabies rabies
  • Ebola Marburg
  • Crimean Congo hemorrhagic fever virus disease AIDS
  • avian influenza SARS, COVID-19, cancer, etc.
  • vaccines for preventing viral infections are being actively developed.
  • cancer vaccines are being researched and developed for the purpose of preventing and treating cancers caused by mutations in cells as well as cancers caused by viral infection.
  • Cancer cells have tumor-specific antigens that are not present in normal cells, and cancer vaccines kill cancer cells before they proliferate excessively by inducing a cancer cell-specific immune response through these tumor-specific antigens.
  • Some cancer vaccines are also made customized for the patient. By analyzing the patient's cancer cell gene, the cancer-causing mutant gene is found, and mRNA converted into the neoantigen epitope encoded by it is prepared and administered as a vaccine. In this case, a strong immune response can be induced only in the patient, so it has the advantage that it can be developed as a customized precision medicine.
  • nucleic acid vaccines such as mRNA vaccines
  • protein expression efficiency is very important due to the nature of the mechanism of action, and the efficacy of the vaccine is determined according to the protein expression level.
  • the development of materials is required.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule for the prevention or treatment of viral infection or cancer comprising a nucleic acid encoding a signal peptide and a nucleic acid encoding an antigen, and a vaccine composition comprising the nucleic acid molecule.
  • One aspect of the present invention provides a nucleic acid molecule for the prevention or treatment of viral infection or cancer, comprising a nucleic acid encoding a signal peptide and a nucleic acid encoding an antigen.
  • signal peptide refers to a peptide present at the N-terminus of a protein at the beginning of protein synthesis, and a signal sequence, a targeting sequence, a localization signal, a localization sequence ( It is also called a localization sequence, a leader sequence, or a leader peptide.
  • the signal peptide according to the present invention may serve to increase protein expression and secretion of nucleic acid molecules.
  • the 'protein expression' or 'protein expression rate' may be used interchangeably with the same meaning as 'protein translation', 'protein translation rate', 'antigen expression', 'antigen expression rate', and the like.
  • the signal peptide is a group consisting of IgE (Immunoglobulin E), albumin, interferon gamma (IFN- ⁇ ), factor IX and mucin-like protein 1 (MLP1). It may be derived from one or more selected from, but is not limited thereto.
  • the signal peptide is SEQ ID NO: 1 derived from IgE, SEQ ID NO: 5 derived from albumin, SEQ ID NO: 9 derived from IFN- ⁇ , SEQ ID NO: 13 derived from factor IX, and SEQ ID NO: 17 derived from MLP1 It may be one or more selected from the group consisting of the indicated peptides, but is not limited thereto.
  • nucleic acid encoding the signal peptide may be one or more selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 4, 6 to 8, 10 to 12, 14 to 16, and 18 to 20, but is not limited thereto.
  • antigen refers to a protein that induces an immune response such as specific antibody production and cytokine secretion
  • the antigen is a coronavirus, oncovirus, tumor-specific antigen, It may be derived from one or more selected from the group consisting of a tumor-associated antigen and a neoantigen epitope.
  • coronavirus alpha coronavirus genus ( ⁇ -CoV, alphaCoV, alphacoronavirus), beta coronavirus genus ( ⁇ -CoV, betaCoV, betacoronavirus), gamma coronavirus genus ( ⁇ -CoV, gammaCoV, gammacoronavirus) or delta It may belong to the corona virus genus ( ⁇ -CoV, deltaCoV, deltacoronavirus), and more specifically, HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like (SL)-ZC45, Bat-SL ZXC21, SARS-CoV, MERS -CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59, or may be SARS-CoV-2, but is not limited thereto.
  • the antigen may be one or more selected from the group consisting of a spike protein and a membrane protein derived from coronavirus.
  • the antigen may be one or more selected from the group consisting of a spike protein and a membrane protein derived from coronavirus.
  • the spike protein of the coronavirus according to the present invention can serve to induce an immune response and increase the ability to produce neutralizing antibodies, and the membrane protein induces an immune response, such as improving the function of CD4+ Th cells, thereby inducing a virus-infected It can play a role in killing cells.
  • the oncovirus refers to a virus that causes tumors (cancer), and specifically, HBV (Hepatitis B virus), HCV (Hepatitis C virus), HTLV (Human T-lymphotropic virus), HPV (Human papillomaviruses), HHV -8 (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus), MCV (Merkel cell polyomavirus), or EBV (Epstein-Barr virus), but is not limited thereto.
  • HBV Hepatitis B virus
  • HCV Hepatitis C virus
  • HTLV Human T-lymphotropic virus
  • HPV Human papillomaviruses
  • HHV -8 Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus
  • MCV Middle cell polyomavirus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • the 'tumor-specific antigen', 'tumor-associated antigen', and 'new antigen epitope' refer to antigens or epitopes that are not present in normal cells and are specifically present only in cancer cells.
  • a mutant gene caused by cancer cell-specific mutations such as mutational frameshift, splice variant, gene fusion, and endogenous retroelement, or from the mutant gene It may be expressed mRNA or protein.
  • the antigen may be one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 and 26;
  • the nucleic acid encoding the antigen may be one or more nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22 to 25, and 27 to 30, but is not limited thereto.
  • a nucleic acid molecule according to the invention may comprise a nucleic acid encoding a Th cell epitope.
  • Th cell epitope refers to a peptide that is recognized by Th cells and induces an immune response by Th cells
  • the 'Th cells (T helper cell)' are CD4+ cells, CD4+ T cells, helper T lymphocytes, It refers to immune cells, also called helper T cells, etc.
  • the Th cell epitope according to the present invention may serve to increase the ability to produce neutralizing antibodies by inducing an immune response by Th cells, specifically IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-2, IL-10, IL- 4, secretes various cytokines such as IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, and IL-13 , and promotes the antibacterial activity of phagocytes including macrophages.
  • the Th cell epitope may be a peptide derived from one or more selected from the group consisting of tetanus toxoid, diphtheria toxoid, and pertussis toxoid.
  • the toxoid refers to a substance in which toxicity is removed but immunogenicity inducing an immune response remains, and 'tetanus toxoid' is tetanose, a neurotoxin produced by the tetanus bacteria Clostridium tetani .
  • Th cell epitope is an epitope composed of a peptide sequence that is presented by MHC Class II of antigen-presenting cells such as macrophages or dendritic cells and sensed by T cell receptor of Th cells and transmits a stimulation signal.
  • the Th cell epitope may further include a nucleic acid encoding a cleavage site, and may further include a nucleic acid sequence encoding a cleavage site between the antigen and the Th cell epitope.
  • the term 'cleavage site' refers to a peptide that is cleaved by a proteolytic enzyme.
  • the protein expressed from the nucleic acid molecule serves to allow the site recognized by the enzyme to be cleaved, and through this, each signal peptide, antigen and/or Th cell epitope linked to the nucleic acid molecule is enable it to perform its role.
  • the cleavage site may be cleaved by an endogenous enzyme present in a cell, and specifically may be cleaved by a furine protease or a foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A self-cleavage site, but is not limited thereto.
  • FMDV foot-and-mouth disease virus
  • Th cell epitope may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
  • the nucleic acid encoding the Th cell epitope may be one or more nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 45 and 46, but is not limited thereto.
  • viral infection refers to a disease resulting from the proliferation of a virus in an organ or tissue of a human body.
  • the viral infection may be a coronavirus infection.
  • coronavirus infection Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), Middle East Respiratory Syndrome (MERS), and Coronavirus disease-2019 (COVID-19) consisting of It may be one or more selected from the group, but as long as it is a disease caused by a coronavirus infection, it is not limited thereto.
  • the viral infection may be cancer.
  • the cancer may be at least one selected from the group consisting of solid carcinoma and hematological carcinoma, and the solid carcinoma includes hepatocarcinoma, cervical cancer, anal cancer, and penis cancer. ), vulva cancer, vaginal cancer, oropharyngeal cancer, Kaposi's sarcoma, nasopharyngeal carcinoma, stomach cancer, multicentric Castleman's disease , primary effusion lymphoma or Merkel cell carcinoma, etc., and the hematological carcinoma includes T-cell leukemia, primary effusion lymphoma, Burkitt's lymphoma, etc. lymphoma), Hodgkin's lymphoma, or post-transplant lymphoproliferative disease, but as long as it is caused by oncovirus infection, it is not limited thereto.
  • cancers that can be prevented by the nucleic acid molecule according to the present invention may be one or more selected from the group consisting of solid carcinomas and hematological carcinomas, and the solid carcinomas include gastric cancer, lung cancer, liver cancer, colorectal cancer, colon cancer, and kidney cancer.
  • small intestine cancer pancreatic cancer, brain tumor, bone cancer, skin cancer, epidermal carcinoma, squamous cell carcinoma, breast cancer, sclerosing adenopathy, head and neck cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, neuroblastoma, melanoma, sarcoma, prostate cancer, uterine cancer, It may be cervical cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, urethral cancer, bladder cancer, penile cancer, testicular cancer, fibroadenoma, or metastases thereof, and the hematological carcinoma includes hematological cancer, angiosarcoma, leukemia, lymphoma, or their It may be metastatic cancer, but is not limited thereto.
  • nucleic acid molecule according to the present invention may be a nucleic acid molecule for the preparation of a vaccine, or a nucleic acid molecule for the preparation of a vaccine for the prevention or treatment of viral infection or cancer.
  • prevention refers to any action in which a viral infection or cancer is inhibited or delayed by the nucleic acid molecule according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms of viral infection or cancer are improved or cured by the nucleic acid molecule according to the present invention.
  • nucleic acid molecule has a meaning comprehensively encompassing DNA and RNA molecules, and the nucleotide, which is the basic structural unit in the nucleic acid molecule, includes not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base sites are modified. .
  • sequence of the nucleic acid molecule of the present invention may be mutated, said mutation comprising addition, deletion, non-conservative substitution or modification of one or more nucleotides.
  • sequences used in the present invention are construed to include sequences exhibiting substantial identity to the sequences described in the sequence listing, given that mutations with biologically equivalent activity are considered.
  • the term, 'substantial identity' refers to aligning the sequence of the present invention and any other sequences as much as possible, and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art. 60% homology, more specifically 70% homology, even more specifically 80% homology, most specifically 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% homology. , means a sequence showing 98% or 99% homology.
  • sequence having high homology with the sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 59 of the present invention for example, having a high homology of 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more Sequences should also be construed to be included within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid molecule may contain the signal peptide, antigen and/or Th cell epitope according to the present invention in the following structure: 5'-[signal peptide]-[antigen]-3' or 5'-[signal peptide ]-[antigen]-[Th cell epitope]-3'.
  • the signal peptide, antigen and/or Th cell epitope is not limited to the above-described order, and the order is not limited as long as it can perform the role according to the present invention.
  • the signal peptide, antigen and/or Th cell epitope may be included in the nucleic acid molecule singly or in plurality, and the number is not limited as long as the expression rate of the protein is not reduced.
  • nucleic acid molecule is a general nucleic acid sequence for expression as a protein, in addition to the signal peptide, antigen and/or Th cell epitope, specifically, 5'-CAP including 7-methylguanosine, a Kozak sequence, a start codon, a stop codon, a 3'-Poly A tail including adenosine, and the like.
  • Another aspect of the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating viral infection or cancer, comprising the nucleic acid molecule.
  • prevention refers to any action in which viral infection or cancer is suppressed or delayed by administration of the vaccine composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms of viral infection or cancer are improved or cured by administration of the vaccine composition according to the present invention.
  • the term “vaccine” refers to an immunogen or antigenic substance that generates immunity in a living body of a subject by injecting or orally administering to the subject for the prevention of infection as a biological preparation containing an antigen that gives immunity to the subject.
  • the vaccine may be an RNA vaccine, specifically, an mRNA vaccine.
  • mRNA vaccine refers to a vaccine that induces an immune response by artificially replicating some of the genes of an antigen and then administering it. These mRNA vaccines have various advantages compared to the existing protein vaccines. First of all, there is no need to directly handle dangerous pathogens because they can be synthesized only with the genetic information of the pure target antigen. Even if it does, there is no concern that it will show any particular toxicity, and it has various advantages such as being able to rapidly develop vaccines against suddenly occurring infectious diseases or various mutations due to the simplicity of its composition only with mRNA.
  • the vaccine composition for preventing or treating a viral infection or cancer according to the present invention may be used for the prevention or treatment of a coronavirus infection and/or cancer, and may include a coronavirus, a tumor virus, a tumor-specific antigen, a tumor- It may have immunity to the associated antigen and/or the new antigen epitope.
  • coronavirus examples include alpha-coronavirus , beta-coronavirus, gamma-coronavirus or delta-coronavirus, more specifically HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like (SL)-ZC45, Bat- It may be SL ZXC21, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59 or SARS-CoV-2, and specific examples of the oncovirus include HBV, HCV, HTLV, HPV, HHV-8, It may be MCV or EBV, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid molecule included in the vaccine composition may be supported or linked to a carrier, and the carrier may be at least one selected from the group consisting of a liposome-based carrier, a lipid-based carrier, a polymer-based carrier, and a lipid-polymer hybrid nanoparticle.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the carrier include liposomes, phytosomes, ethosomes, lipid nanoparticles, lipid-like nanoparticles, lipid emulsions, a liposome-based delivery system or a lipid-based delivery system such as lipoplex and lipid micelles; polymer-based carriers such as polymersomes, polymeric nanoparticles, dendrimers, nanospheres, polyplexes, and polymeric micelles; Or lipid-polymer hybrid nanoparticles, cationic nanoemulsion, anionic nanoemulsion, lipopolyplex, such as lipid-polymer hybrid nanoparticles, but may be , but is not limited thereto.
  • the vaccine composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coatings, adjuvants, stabilizers, excipients, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, adsorption delaying agents, and the like.
  • the carrier include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, glycerin, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the vaccine composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms and sterile injection solutions such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, respectively, according to conventional methods.
  • sterile injection solutions such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, respectively, according to conventional methods.
  • it can be prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the vaccine composition may be administered to a subject in various forms.
  • the "administration" may be performed by subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, nasal administration, transdermal administration, parenteral administration and oral administration, but is not limited thereto.
  • the vaccine composition may include one or more adjuvants and the like to improve or enhance an immune response.
  • Suitable adjuvants include synthetic analogs of double-stranded RNA (dsRNA), oligonucleic acids of the unmethylated cytidine-guanidine type, peptides, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum oxide and mineral or vegetable oils such as Marcol 52, and compositions comprising one or more emulsifiers or surface active substances such as risorcecithin, polyvalent cations, polyanions, and the like.
  • Another aspect of the present invention provides a method for generating an immune response against a viral infection or cancer in an individual, comprising administering the vaccine composition to an individual in need thereof.
  • the term, "individual” includes both an individual likely to be infected with a virus or an infected individual, or an individual likely to or has developed cancer, and may include, without limitation, humans, any non-human animals, fish or plants, and the like.
  • the non-human animal may be a vertebrate, such as a primate, dog, cow, horse, pig, rodent, such as mouse, rat, hamster, guinea pig, and the like.
  • the term “subject” may be used interchangeably with “subject” or “patient”.
  • immune response means that an individual's immune system is activated in response to the introduction of an antigen.
  • the immune response may be in the form of cell-mediated immunity, humoral immunity, or both.
  • the vaccine composition of the present invention may contain an effective amount of an active ingredient, that is, a nucleic acid molecule according to the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier and adjuvant.
  • an effective amount means an amount sufficient to induce a specific immune response against a viral infection or cancer in an individual to which the vaccine composition is administered.
  • the effective amount can be readily determined by one of ordinary skill in the art, for example, can be determined through routine experimentation in animals.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating a viral infection or cancer in an individual, comprising administering the vaccine composition to an individual in need thereof.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention has excellent intracellular protein expression rate and excellent ability to secrete protein to the outside of the cell.
  • it when administered in vivo, it allows the individual to acquire humoral immunity, such as induction of antigen-specific neutralizing antibody, and to acquire cellular immunity, such as increasing the amount of immune cells directly involved in virus killing, It can be usefully utilized as a vaccine for the prevention and treatment of viral infections or cancer.
  • ssRNA ladder is a size marker for measuring the size of mRNA
  • No SP is a result of a nucleic acid molecule containing only a spike protein without a signal peptide
  • Albumin SP is an albumin-derived signal peptide and a spike protein Results relating to nucleic acid molecules containing this result
  • IFN- ⁇ SP refers to results relating to nucleic acid molecules containing IFN- ⁇ -derived signal peptide and spike protein
  • Factor IX SP refers to Factor IX-derived signal peptide and spike protein.
  • Mucin like protein SP is a result relating to a nucleic acid molecule containing an MLP1-derived signal
  • ssRNA ladder is a size marker for measuring the size of mRNA
  • No SP is a nucleic acid molecule that does not contain a signal peptide but contains only a membrane protein
  • Albumin is an albumin-derived signal peptide and a membrane protein
  • IFN- ⁇ refers to a nucleic acid molecule containing IFN- ⁇ -derived signal peptide and membrane protein
  • Factor IX refers to a nucleic acid molecule containing a factor IX-derived signal peptide and membrane protein.
  • MLP is a result relating to a nucleic acid molecule containing an MLP1-derived signal peptide and a membrane protein.
  • Wild SP is a result of optimizing each signal peptide with a wild-type codon
  • Yeast opti. SP is a result of optimizing each signal peptide with a yeast codon.
  • FIG. 3 is an image showing the electrophoresis results of mRNA nucleic acid molecules in which SARS-CoV-2 virus spike protein (hereinafter referred to as 'spike protein') and Th cell epitope are fused as each signal peptide and antigen protein.
  • SARS-CoV-2 virus spike protein hereinafter referred to as 'spike protein'
  • Th cell epitope are fused as each signal peptide and antigen protein.
  • ssRNA ladder is a size marker for measuring the size of mRNA
  • No SP is a result of a nucleic acid molecule containing only a spike protein without a signal peptide
  • Albumin SP is an albumin-derived signal peptide and a spike protein Results relating to nucleic acid molecules containing this result
  • IFN- ⁇ SP refers to results relating to nucleic acid molecules containing IFN- ⁇ -derived signal peptide and spike protein
  • Factor IX SP refers to Factor IX-derived signal peptide and spike protein.
  • Mucin like protein SP is a result relating to a nucleic acid molecule containing an MLP1-derived signal peptide and a spike protein.
  • Figure 4 is an image showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein (hereinafter referred to as 'spike protein') expressed in cells, the amount of protein contained in the cell lysate transfected with each nucleic acid molecule it's about "Negative control” refers to the result of cells not transfected with the nucleic acid molecule (negative control), "No SP” refers to the result regarding the nucleic acid molecule containing only the spike protein without the signal peptide, and “IgE” refers to the IgE-derived signal Results regarding nucleic acid molecules containing peptides and spike proteins, “Albumin SP” results about nucleic acid molecules containing albumin-derived signal peptides and spike proteins, “IFN- ⁇ SP” results regarding IFN- ⁇ -derived signal peptides and spike proteins As a result of nucleic acid molecules containing this, “Factor IX SP” results on a nucleic acid molecule containing a signal peptide and spike protein derived from
  • 5a is It is an image showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein (hereinafter referred to as 'spike protein') expressed in cells.
  • media relates to the amount of protein contained in the cell culture medium transfected with each nucleic acid molecule
  • lysate relates to the amount of protein contained in the cell lysate transfected with each nucleic acid molecule.
  • “Negative control” refers to the result of cells not transfected with the nucleic acid molecule (negative control)
  • “No SP” refers to the result regarding the nucleic acid molecule containing only the spike protein without the signal peptide
  • “Albumin SP” refers to the result of albumin-derived Results regarding nucleic acid molecules containing signal peptides and spike proteins
  • “IFN- ⁇ SP” results regarding nucleic acid molecules containing IFN- ⁇ -derived signal peptides and spike proteins
  • “Factor IX SP” indicates signal peptides derived from Factor IX and a result regarding a nucleic acid molecule containing a spike protein
  • “Mucin like protein SP” is a result regarding a nucleic acid molecule containing an MLP1-derived signal peptide and a spike protein.
  • 5B is an image showing the amount of ⁇ / ⁇ -tubulin protein expressed in the cells according to FIG. 5A and used as a loading control.
  • 5c is It is an image showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein (hereinafter referred to as 'spike protein') expressed in cells.
  • media relates to the amount of protein contained in the cell culture medium transfected with each nucleic acid molecule
  • lysate relates to the amount of protein contained in the cell lysate transfected with each nucleic acid molecule.
  • “Negative control” refers to the results for cells not transfected with the nucleic acid molecule (negative control)
  • “No SP” refers to the results for the nucleic acid molecule containing only the spike protein and Th cell epitope without the signal peptide
  • "Albumin SP” “Results related to nucleic acid molecules containing albumin-derived signal peptides, spike proteins and Th cell epitopes
  • “IFN- ⁇ SP” results related to nucleic acid molecules containing IFN- ⁇ -derived signal peptides, spike proteins and Th cell epitopes
  • “Factor IX SP” refers to a nucleic acid molecule containing a signal peptide, spike protein and Th cell epitope derived from Factor IX
  • “Mucin like protein SP” refers to a signal peptide derived from MLP1, a spike protein and a nucleic acid containing a Th cell epitope It is a molecular result.
  • FIG. 5d is an image showing the amount of ⁇ / ⁇ -tubulin protein expressed in the cells according to FIG. 5c and used as a loading control.
  • Figure 6a An image showing the amount of SARS-CoV-2 viral spike protein expressed in cells, including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 viral spike protein. Results for cells transfected with nucleic acid molecules (“STP2104”). “S0” refers to the SARS-CoV-2 viral spike protein total, and “S1” refers to subunit 1 of the SARS-CoV-2 viral spike protein. “ ⁇ / ⁇ -tubulin” was used as a loading control.
  • 6b is As a graph showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein detected in the cell culture medium, it contains IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 viral spike protein. Results for cells transfected with nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid molecule was used at a concentration of 0.1 or 0.05 g/L.
  • Ag1+LNP1 is an IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike total protein.
  • Ag2+LNP1 is an MLP1-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike total protein.
  • Ag3+LNP1 is an IgE-derived signal peptide, SARS-CoV-2 virus spike total protein and Th cell epitope.
  • results are related to nucleic acid molecules.
  • RBD specific total IgG is a result regarding the amount of antibody specific to the RBD (receptor binding domain) domain among SARS-CoV-2 virus spike proteins
  • S1 specific total IgG is a SARS-CoV-2 virus spike protein. Results regarding the amount of antibody specific for subunit 1 (S1) in the protein.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein-specific neutralizing antibody formed in mice, and converted into a log value of a Plaque reduction neutralization test (PRNT) 50 value.
  • Ag1+LNP1 is an IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike total protein.
  • Ag2+LNP1 is an MLP1-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike total protein.
  • Ag3+LNP1 is an IgE-derived signal peptide, SARS-CoV-2 virus spike total protein and Th cell epitope.
  • Results for nucleic acid molecules, "Mock” are results for Phosphate Buffered saline (PBS).
  • FIG. 9a is a graph showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein-specific binding antibodies (IgG1 and IgG2a isotype) formed in mice, including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 viral spike protein. Results for mice administered 1, 5 or 10 ⁇ g of the nucleic acid molecule. As a result of measurement at 4 weeks after the first (prime) inoculation, the amount of each antibody was expressed as optical density (OD).
  • OD optical density
  • “RBD protein” means that the amount of IgG1 and IgG2a antibodies specific for the receptor binding domain (RBD) domain among SARS-CoV-2 virus spike proteins increases with the amount of immunization.
  • S protein is SARS-CoV- 2
  • Figure 9b is a graph showing the amount of SARS-CoV-2 virus spike protein-specific binding antibody (IgG1 and IgG2a isotype) formed in mice, including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike protein Results for mice administered 1, 5 or 10 ⁇ g of the nucleic acid molecule.
  • the amount of each antibody was expressed as optical density (OD).
  • OD optical density
  • RBD protein means that the amount of IgG1 and IgG2a antibodies specific for the receptor binding domain (RBD) domain among SARS-CoV-2 virus spike proteins increases with the amount of immunization.
  • S protein is SARS-CoV- 2
  • GC 10 is a graph showing the amount of germinal center (GC) B cells formed in mice, including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike total protein. Results for mice administered 1, 5 or 10 ⁇ g of the nucleic acid molecule.
  • the humoral immune response involves the interaction between a special population of B cells and CD4+ T cells (follicular helper T cells (T FH cells)) in the germinal center (GC) to generate memory B cells and long-lived plasma cells.
  • T FH cells follicular helper T cells
  • FIG. 11 is a graph showing the amount of CD4 + central memory T cells (CD44 high+ and CD62L + cells among CD4 + cells) formed in mice.
  • Including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike whole protein Splenocytes were isolated from mice administered with 1, 5, or 10 ⁇ g of nucleic acid molecules, and 15 mer-long peptides were synthesized with 9 mer overlaps with respect to the entire amino acid sequence of the spike, and then a peptide pool was constructed into five groups (peptide 1). to 5) among them, the results of flow cytometry analysis in which splenocytes were stimulated with peptide pool 2 in vitro.
  • FIG. 12 is a graph showing the amount of CD8 + central memory T cells (CD44 high+ and CD62L + cells among CD8 + cells) formed in mice.
  • CD8 + central memory T cells CD44 high+ and CD62L + cells among CD8 + cells.
  • IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike whole protein are the results obtained by isolating splenocytes from mice administered with 1, 5 or 10 ⁇ g of nucleic acid molecules and stimulating them with the SARS-CoV-2 virus spike protein-derived peptide pool 2 as described above.
  • FIG. 13 is a graph showing the amount of CD8 + effector memory T cells (CD44 high+ and CD62L ⁇ cells among CD8 + cells) formed in mice.
  • IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike whole protein are the results obtained by isolating splenocytes from mice administered with 1, 5 or 10 ⁇ g of nucleic acid molecules and stimulating them with the SARS-CoV-2 virus spike protein-derived peptide pool 2 as described above.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of analyzing the number of IFN- ⁇ secreting cells formed in mice by ELISpot. Including IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike whole protein Results regarding the number of cells secreting IFN- ⁇ in splenocytes isolated from mouse spleens administered at 1, 5 or 10 ⁇ g of nucleic acid molecules. "NC” is a result obtained without stimulation with peptide as a negative control, and "PP2" is a result obtained by stimulation with peptide pool 2 derived from SARS-CoV-2 virus spike protein as described above.
  • IFN- ⁇ staining activity of IFN- ⁇ secreting cells formed in mice.
  • IgE-derived signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike whole protein are the results obtained by isolating splenocytes from mice administered with 1, 5 or 10 ⁇ g of nucleic acid molecules and stimulating them with the SARS-CoV-2 virus spike protein-derived peptide pool 2 as described above.
  • nucleic acid molecules having excellent cell immunogenicity and ability to induce neutralizing antibody production, in particular, significantly increased protein expression were prepared.
  • the expression rate of the antigen protein is increased to increase the cellular immunogenicity that causes an immune response, and accordingly, the neutralizing antibody in the human body is produced in a large amount within a short time. Furthermore, the immune response by Th cells is efficiently induced and cytokine secretion is increased, thereby showing the maximized preventive and/or therapeutic efficacy against viral infection or cancer.
  • the nucleic acid molecule included a signal peptide, a Th cell epitope, and the like, and a specific antigen for the purpose of inducing prophylactic and/or therapeutic efficacy.
  • the nucleotide sequences and amino acid sequences of the peptides and proteins were obtained from GenBank, and nucleic acid molecules with enhanced antigen protein expression efficiency were prepared by performing optimization with human or yeast codons for the wild-type sequence obtained from GenBank. Codon optimization optimizes by changing the codon preferred by each individual so that the gene encoding the protein can be expressed well.
  • the amount of protein expression was predicted by calculating the GC content of the nucleic acid molecule and the free energy of the secondary mRNA structure. As the recognition efficiency by the ribosome increases, the protein expression rate may be increased.
  • the signal peptide, antigen, Th cell epitope, etc. were constructed as follows to design a nucleic acid molecule: 5'-[signal peptide]-[antigen]-3' or 5'-[signal peptide]-[antigen] -[Th cell epitope]-3'.
  • a signal peptide (SP) was first prepared.
  • human-derived IgE immunoglobulin E
  • albumin interferon gamma
  • factor IX factor IX, F IX
  • MLP1 mucin-like protein 1
  • SEQ ID NO: 3 the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 is a form of codon-optimized IgE-derived signal peptide for humans.
  • SP type SP codon order SEQ ID NO: IgE wild type (amino acid) MDWTWILFLV AAATRVHS SEQ ID NO: 1 wild type (nucleic acid) ATGGACTGGACCTGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACGCGAGTCCACTCC SEQ ID NO: 2 human ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCCGCTACAAGAGTGCACAGC SEQ ID NO: 3 leaven ATGGACTGGACTTGGATCTTGTTCTTGGTTGCTGCTGCCACCAGAGTCCACTCT SEQ ID NO: 4 albumin wild type (amino acid) MKWVTFISLL FLFSSAYS SEQ ID NO: 5 wild type (nucleic acid) ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCC SEQ ID NO: 6 human ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGC SEQ ID NO: 7 leaven ATGAAGTGGGTT
  • Example 1-2-1 Production of 'SARS-CoV-2' spike protein
  • the antigen of 'SARS-CoV-2' a virus that causes COVID-19, was used as an example.
  • the spike protein (S) which is known to play a central role in infection and pathogenicity, such as receptor recognition of host cells, cell membrane fusion, and neutralizing antibody induction, was used. Then, codon optimization was performed by the method according to Example 1-1, and the results are shown in Table 2 below.
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23 is a form in which the spike protein antigen of SARS-CoV-2 is codon-optimized for humans
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25 is the spike protein antigen of SARS-CoV-2 for humans. It is a form with both codon-optimized and codon-optimized for yeast.
  • SARS-CoV-2 spike protein wild type (amino acid) SEQ ID NO: 21 wild type (nucleic acid)
  • SEQ ID NO: 22 human SEQ ID NO: 23 leaven SEQ ID NO: 24 Codon 250nt in yeast and codon 3569nt in humans
  • SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 25
  • nucleic acid of SEQ ID NO: 25 having both yeast codons and human codons was used as an antigen to be used in the production of nucleic acid molecules for subsequent vaccines.
  • Example 1-2-2 Production of 'SARS-CoV-2' membrane protein
  • the antigen of 'SARS-CoV-2' a virus that causes COVID-19, was used as an example.
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 28 is a form in which the membrane protein antigen of SARS-CoV-2 is codon-optimized for humans
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 30 is the membrane protein antigen of SARS-CoV-2 for humans. It is a form with both codon-optimized and codon-optimized for yeast.
  • nucleic acid of SEQ ID NO: 30 having both yeast codons and human codons was used as an antigen to be used in the production of nucleic acid molecules for subsequent vaccines.
  • Example 1-3-1 Using 'SARS-CoV-2' spike protein as antigen
  • nucleic acid molecule with increased protein expression efficiency In order to prepare a nucleic acid molecule with increased protein expression efficiency, first, five signal peptides obtained in Example 1-1 and SARS-CoV-2 virus spikes obtained in Example 1-2-1 A nucleic acid molecule to which a protein was fused was prepared.
  • the spike protein was used in a form having both yeast codons and human codons, which are summarized in Table 4 below.
  • SP type SP codon SARS-CoV-2 spike protein SEQ ID NO: IgE leaven Codon 250nt in yeast and codon 3569nt in humans SEQ ID NO: 31 albumin leaven SEQ ID NO: 32 IFN- ⁇ leaven SEQ ID NO: 33 F IX leaven SEQ ID NO: 34 MLP1 leaven SEQ ID NO: 35
  • the transcription reaction mixture was incubated at 37° C. for 2 hours. Whether or not mRNA was synthesized was confirmed by electrophoresis using a 1% agarose gel containing Lonza GelStarTM Nucleic Acid gel Stain (catalog #5 0535). Meanwhile, the synthesized mRNA was purified using an Oligo (dT) column (via separation, catalog # 311.1219-2) in AKTA (Cytiva, AKTA york), and used for subsequent in vitro or in vivo experiments.
  • Example 1-3-2 Using 'SARS-CoV-2' membrane protein as antigen
  • nucleic acid molecule with increased protein expression efficiency In order to prepare a nucleic acid molecule with increased protein expression efficiency, first, the four signal peptides obtained in Example 1-1 and the SARS-CoV-2 virus membrane obtained in Example 1-2-2 Nucleic acid molecules fused with proteins were prepared, which are summarized in Table 5 below.
  • SP type SP codon SARS-CoV-2 membrane protein SEQ ID NO: albumin wild type Codon 250nt in yeast and codon 419nt in humans SEQ ID NO: 36 leaven SEQ ID NO: 37 IFN- ⁇ wild type SEQ ID NO: 38 leaven SEQ ID NO: 39 F IX wild type SEQ ID NO: 40 leaven SEQ ID NO: 41 MLP1 wild type SEQ ID NO: 42 leaven SEQ ID NO: 43
  • Example 1-3-1 After synthesizing the nucleic acid molecule into mRNA, its synthesis was confirmed, and the synthesized mRNA was also purified.
  • a Th cell epitope was first prepared.
  • Th cell epitope As an example, a Th cell epitope derived from tetanus toxoid (Tetanus Toxoid Th cell epitope, TTTh) was used. In addition, the TTTh was connected to a cleavage site (CS) having different sequences. The Th cell epitope containing the cleavage site was constructed to be located at the C-terminus of the ORF by including a stop codon as follows: 5'-[CS1]-[TTTh1]-[CS2]-[TTTh2]- [Stop codon]-3'.
  • the specific amino acid sequence corresponding to the above configuration is as follows: 5'-[RQKR]-[IDKISDVSTIVPYIGPALNI]-[PKKR]-[NNFTVSFWLRVPKVSASHLE]-5'. Then, codon optimization was performed by the method according to Example 1-1, which is summarized in Table 6 below.
  • the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 46 is a codon-optimized form of TTTh for humans.
  • Th cells epitope Th cells epitope codon order SEQ ID NO: wild type (amino acid) RQKRIDKISD VSTIVPYIGP ALNIPKKRNN FTVSFWLRVP KVSASHLE SEQ ID NO: 44 wild type (nucleic acid) CGCCAGAAACGCATTGATAAAATTAGCGATGATGAGCACCATTGTGCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTCCGAAAAAACGCAACAACTTTACCGTGAGCTTTTGGCTGCGCGTGCCGAAAGTGAGCGCGAGCCATCTGGAATGA SEQ ID NO: 45 human AGACAGAAAAGAATCGATAAGATCAGCGACGTGTCTACAATCGTGCCATACATCGGCCCTGCCCTGAATATCCCCAAGAAGCGGAACAACTTCACCGTCAGCTTCTGGCTGAGAGTGCCTAAGGTGTCCGCCAGCCACCTGGAGTGA SEQ ID NO: 46
  • the form having a human codon has a high Th cell epitope expression rate in human cells, and also exhibits a desired vaccine effect to an excellent degree.
  • Example 1-5-1 Using 'SARS-CoV-2' spike protein as antigen
  • the signal peptide proven to have a high protein expression rate was a form having a yeast codon
  • the antigen 'SARS-CoV-2' spike protein demonstrated to have a high protein expression rate was It was confirmed that the form has both yeast and human codons.
  • a nucleic acid molecule was prepared by fusing a Th cell epitope sequence to the signal peptide sequence and antigen sequence identified as described above. The sequence is summarized in Table 7 below.
  • SP type SP codon antigen Th cells epitope SEQ ID NO: IgE yeast codon SARS-CoV-2 spike protein (250nt codon in yeast and 3569nt codon in human) human codon SEQ ID NO: 47 albumin SEQ ID NO: 48 IFN- ⁇ SEQ ID NO: 49 F IX SEQ ID NO: 50 MLP1 SEQ ID NO: 51
  • the nucleic acid molecule was synthesized into mRNA, and whether or not the mRNA was synthesized was checked, and the synthesized mRNA was also purified.
  • Example 1-5-2 Using 'SARS-CoV-2' membrane protein as antigen
  • the signal peptide demonstrated to have a high protein expression rate had a wild-type codon or a yeast codon, and the antigen 'SARS-CoV' demonstrated high protein expression rate It was confirmed that the -2' membrane protein has both yeast and human codons.
  • a nucleic acid molecule was prepared by fusing a Th cell epitope sequence to the signal peptide sequence and antigen sequence identified as described above. The sequence is summarized in Table 8 below.
  • SP type SP codon antigen Th cells epitope SEQ ID NO: albumin wild type SARS-CoV-2 membrane protein (codon 250 nt in yeast and codon 419 nt in human) human codon SEQ ID NO: 52 leaven SEQ ID NO: 53 IFN- ⁇ wild type SEQ ID NO: 54 leaven SEQ ID NO: 55 F IX wild type SEQ ID NO: 56 leaven SEQ ID NO: 57 MLP1 wild type SEQ ID NO: 58 leaven SEQ ID NO: 59
  • Example 2-1 Analysis of protein expression level of nucleic acid molecules for vaccines
  • the protein expression rate was analyzed in vitro. In general, when exhibiting high expression characteristics in vitro, it is known that high immunogenicity is exhibited in vivo, thereby increasing the efficacy of vaccines.
  • the effect on the nucleic acid molecules prepared in Examples 1-3-1 or 1-5-1 was confirmed.
  • SARS-CoV-2 virus spike total protein (SEQ ID NO: 21) having both yeast codon and human codon was used, and as the signal peptide, all optimized with yeast codon, derived from IgE (SEQ ID NO: 4) , albumin-derived (SEQ ID NO: 8), interferon gamma-derived (SEQ ID NO: 12), factor IX-derived (SEQ ID NO: 16) or MLP1-derived (SEQ ID NO: 20) were used, and the Th cell epitope was optimized with human codons. (SEQ ID NO: 46).
  • HEK-293T (ATCC, catalog number CRL-1586) cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS and 1% Pen/Strep, and 4 ⁇ 10 5 cells/well of HEK-293T cells were subjected to the above procedure.
  • Nucleic acid molecules prepared according to the example were transfected at a concentration of about 0.1 or 0.05 g/L.
  • the nucleic acid molecule was formulated into mRNA-LNP, which was supported on lipid nanoparticles (LNP) as a carrier, and used.
  • LNP lipid nanoparticles
  • a SARS-CoV-2 spike RBD polyclonal antibody (E-AB-V1006, Elabscience) was used as a primary antibody against the lysate of the transfected cells, and HRP-conjugated as a secondary antibody. This was performed using a secondary antibody (goat anti-rabbit IgG; ABclonal).
  • ELISA was performed using the SARS-CoV-2 Spike S1 protein ELISA kit (RK04154, ABclonal) for the culture medium of the transfected cells.
  • the spike protein of SARS-CoV-2 used as an antigen is composed of subunit 1 (S1) and subunit 2 (S2), and RBD (receptor binding domain), which is known to play a major role in cell infection, is located in S1.
  • S1 subunit 1
  • S2 subunit 2
  • RBD receptor binding domain
  • the nucleic acid molecule containing the SARS-CoV-2 virus spike protein according to the present invention and the signal peptide derived from IgE, albumin, IFN- ⁇ , factor IX or MLP1-derived in the cell. It was confirmed that the protein was well expressed.
  • the nucleic acid molecule containing the SARS-CoV-2 virus spike protein according to the present invention and the signal peptide derived from albumin, IFN- ⁇ , factor IX or MLP1 is a protein in the cell. It was confirmed that the expression was well achieved, and the protein expressed in the cell was smoothly secreted out of the cell.
  • the SARS-CoV-2 virus spike protein according to the present invention albumin, IFN- ⁇ , factor IX, or MLP1-derived signal peptide, and Th cell epitope are included. It was confirmed that the nucleic acid molecule was well expressed as a protein in the cell, and it was confirmed that the protein expressed in the cell was smoothly secreted out of the cell.
  • the amount of protein contained in the culture medium was greater than the amount of protein contained in the cell lysate.
  • the protein amount of the nucleic acid molecule containing the signal peptide was higher in the culture medium, and the signal peptide was added in the cell lysate. It was confirmed that the protein amount of the nucleic acid molecule not containing it was higher. Through this, it was confirmed that the extracellular secretion of the spike protein can be promoted by the signal peptide.
  • nucleic acid molecule including the SARS-CoV-2 virus spike protein and IgE-derived signal peptide according to the present invention was well expressed in cells.
  • the nucleic acid molecule containing the SARS-CoV-2 virus spike protein according to the present invention is well expressed in cells, so that a significant amount of the protein is secreted out of the cell by spike protein ELISA. confirmed through.
  • spike protein ELISA spike protein ELISA
  • the nucleic acid molecule according to the present invention which is composed of mRNA-LNP preparation and includes each signal peptide and SARS-CoV-2 virus spike protein as antigens, is expressed as a protein with high efficiency in cells, in particular, the expressed Since the protein can be secreted out of the cell, this shows that the secreted antigen protein can induce a cellular or humoral immune response by stimulating other immune cells existing in the body. Accordingly, the nucleic acid molecule according to the present invention can exhibit a desired vaccine function when administered in vivo.
  • Example 2-2 Humoral immunity enhancing effect of nucleic acid molecules for vaccines
  • nucleic acid molecule prepared in Example 1 In order to confirm the immunological efficacy of the nucleic acid molecule prepared in Example 1, it was confirmed whether the nucleic acid molecule exhibits an actual preventive effect on viral infection by inducing a humoral immune response to the antigen when administered in vivo. Among the nucleic acid molecules prepared in Example 1, the effect on the nucleic acid molecules prepared in Example 1-3-1 or Example 1-5-1 was confirmed.
  • SARS-CoV-2 virus spike whole protein (SEQ ID NO: 21) having both yeast codon and human codon was used, and as the signal peptide, optimized with yeast codon, IgE-derived (SEQ ID NO: 4) or MLP1-derived (SEQ ID NO: 20) was used, and a Th cell epitope was prepared using a human codon-optimized one (SEQ ID NO: 46).
  • the nucleic acid molecule It was formulated with mRNA-LNP, which was intramuscularly injected into the upper thigh at 4-week intervals in 6-week-old female BALB/c mice (6 mice) twice (1st: prime, 2nd: boost) and sacrificed at 3 weeks. did it At this time, the nucleic acid molecule was injected at a concentration of 1, 5 or 10 ⁇ g/individual. As a control group, PBS was injected.
  • the level of a specific binding antibody or neutralizing antibody to the SARS-CoV-2 virus spike protein as an antigen in the serum of the immunized mouse was measured through ELISA or PRNT (Plaque Reduction Neutralizing Test) assay.
  • ELISA ELISA Reduction Neutralizing Test
  • PRNT Plaque Reduction Neutralizing Test
  • an anti-mouse IgG1- (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) antibody or an anti-mouse IgG2a- (Novus, Centennial, CO, USA) antibody was used.
  • splenocytes were isolated from the immunized mice, and the splenocytes were treated with a peptide derived from SARS-CoV-2 virus spike protein at a concentration of 2 mg/ml and cultured for 24 hours. After the culture was completed, immunostaining with each specific antibody was performed and flow cytometry was performed.
  • FIGS. 7 to 9B it was confirmed that, after inoculation of the nucleic acid molecule, a high level of antibody binding to RBD or Spike total protein was produced in mice.
  • the amount of the produced binding antibody and the neutralizing antibody increased in a concentration-dependent manner with respect to the nucleic acid molecule ( FIGS. 7 to 9b ), and the amount of the neutralizing antibody produced after the second inoculation compared to the first inoculation was about twice or more. It was confirmed that the increase (FIGS. 9a and 9b).
  • the nucleic acid molecule composed of the mRNA-LNP preparation can efficiently induce a humoral immune response to the SARS-CoV-2 virus spike protein, thereby preventing and improving SARS-CoV-2 virus infection. Or it suggests that it may be usefully used for treatment.
  • the nucleic acid molecule prepared in Example 1 In order to confirm the immunological efficacy of the nucleic acid molecule prepared in Example 1, it was confirmed whether the nucleic acid molecule exhibits a preventive effect against an actual viral infection by inducing a cellular immune response to the antigen when administered in vivo. As a type of cellular immune response, it was confirmed whether the production of T cells, such as effector memory T cells and central memory T cells, could be increased. Effector memory T cells provide an immediate but not lasting defense at the site of pathogen entry, and central memory T cells maintain the immune response by proliferating in secondary lymphoid organs to generate new effector cells.
  • T cells such as effector memory T cells and central memory T cells
  • a nucleic acid molecule according to the present invention comprising an mRNA-LNP preparation was injected into mice, and splenocytes were isolated from the immunized mice, followed by SARS-CoV -2 After treating the peptide (peptide pool 2) derived from the viral spike protein at a concentration of 2 mg/ml, flow cytometry was performed.
  • CD4 + central memory T cells CD44 high+ and CD62L + cells in CD4 + cells
  • CD8 + central memory T cells CD44 high+ and CD62L + cells in CD8 + cells
  • CD8 + effector memory T cells CD8 + The proportion of CD44 high+ and CD62L ⁇ cells in the cells) was analyzed.
  • the nucleic acid molecule composed of the mRNA-LNP preparation can efficiently induce a cellular immune response to the SARS-CoV-2 virus spike protein, thereby preventing and improving SARS-CoV-2 virus infection. Or it suggests that it may be usefully used for treatment.
  • IFN- ⁇ secreting cells As a type of cellular immune response.
  • IFN- ⁇ is an important component responsible for the innate antiviral response and is mainly produced by NK cells or innate lymphocyte type 1 cells. When IFN- ⁇ production by these immune cells is not made, virus replication in vivo increases.
  • Example 1 the effect on the nucleic acid molecules prepared in Example 1-3-1 or Example 1-5-1 was confirmed.
  • SARS-CoV-2 virus spike whole protein SEQ ID NO: 21
  • yeast codon SEQ ID NO: 4
  • MLP1-derived SEQ ID NO: 20
  • splenocytes were isolated from mice immunized according to Example 2-2, and the splenocytes were treated with a SARS-CoV-2 virus spike protein-derived peptide (peptide pool 2) at a concentration of 2 mg/ml. Incubated for 48 hours. After completion of the culture, IFN- ⁇ secreting cells were detected using an ELISpot basic kit (Mabtech, Nacka Strand, Sweden).
  • FIGS. 14 and 15 when the nucleic acid molecule was inoculated into a mouse, it was confirmed that the number of IFN- ⁇ secreting cells was significantly increased compared to that of a non-inoculated mouse ( FIG. 14 ). In addition, it was confirmed that the activity of IFN- ⁇ by the cells also significantly increased by about 3000 or more ( FIG. 15 ).
  • the nucleic acid molecule composed of the mRNA-LNP preparation can efficiently induce a cellular immune response to the SARS-CoV-2 virus spike protein, thereby preventing and improving SARS-CoV-2 virus infection. Or it suggests that it may be usefully used for treatment.
  • the plaque reduction neutralizing titer (PRNT) assay is a widely accepted approach for measuring virus neutralizing and protective antibodies to viruses and for assessing the immunogenicity of vaccines.
  • SARS-CoV-2 virus (NCCP 43326, S-type) was added to the serum isolated from mice immunized according to Example 2-2 at a concentration of 4.5x10 2 PFU/ml and cultured for 1 hour. . Then, the serum-virus culture was added to Vero E6 cells (ATCC, catalog number CRL-1586) and incubated for 1 hour to infect the cells with the virus, and the PRNT was assayed according to a method known in the art. carried out.
  • nucleic acid molecule composed of the mRNA-LNP preparation can efficiently generate neutralizing antibodies to the SARS-CoV-2 virus spike protein, thereby preventing, improving or treating SARS-CoV-2 virus infection. suggest that it can be useful for

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Abstract

본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내 단백질 발현율 및 세포 외부로의 단백질 분비능이 우수하다. 또한, 생체 내 투여되는 경우, 개체에서 항원 특이적 중화 항체 유도 등의 체액성 면역력을 획득하게 하고, 바이러스의 사멸에 직접 관여하는 면역 세포의 양을 증가시키는 등의 세포성 면역력을 획득하게 하므로, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 및 치료를 위한 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규 핵산 분자
본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
현재 백신은 다양한 방법으로 개발되어 제조되고 있으며, 구체적인 종류로는 병원체를 약독화된 상태로 주입하는 약독화/생백신(attenuated vaccine), 병원체 자체가 아니라 질병을 일으키는 원인 물질(독소)을 비활성화시켜서 만든 톡소이드 백신(toxoid vaccine), 항원으로 인식되는 항원결정부위에 해당하는 부분만을 따로 추출해서 만든 아단위 백신(subunit vaccine), 유전자 정보를 이용하여 에피토프만을 따로 생산하여 만든 재조합 백신(recombinant vaccine) 등이 있다.
상술한 백신 중에서도, 재조합 백신은 에피토프 외에 다른 성분은 포함되지 않으므로 안전성이 높다는 장점이 있으며, 특히 mRNA로 이루어진 핵산 백신은 생산 속도가 빠르고 비용이 적게 들며, 세포 매개 면역(cell-mediated immunity) 및 체액 면역(humoral immunity) 모두에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다는 점에서 많은 이점이 있다. 또한, 항원의 다양한 구성성분 중 면역 반응을 유도하는 특정 에피토프만을 선별하여 사용하는 등 백신의 구성을 다양하게 디자인할 수 있는바, 바이러스 감염증, 암 등 다양한 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 활용되고 있다.
일 예로, 바이러스 감염증으로는 감기, 인플루엔자, 수두, 구순 포진 등 비교적 가벼운 증세를 보이는 것부터, 광견병, 에볼라, 마버그, 크리미안콩고출혈열 바이러스병, AIDS, 조류 인플루엔자, SARS, COVID-19, 암 등 심각한 부작용 및 후유증을 야기하는 중증질환을 들 수 있다. 이에, 감염 후 발현된 증상을 완화시키고 치료하는 것보다 증상의 발현을 예방하는 것이 주요 이슈임에 따라, 바이러스 감염증을 예방하기 위한 백신의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
또한, 암 백신과 관련해서는, 바이러스 감염으로 인해 발병하는 암 뿐만 아니라, 세포의 돌연변이로 인해 발병하는 암에 대해서도 예방, 치료 등의 용도로써 암 백신이 연구 및 개발되고 있다. 암세포는 정상세포에는 존재하지 않는 종양-특이적 항원이 존재하는데, 암 백신은 이러한 종양-특이적 항원을 통해 암세포 특이적 면역반응을 유도함으로써 암세포가 과다 증식되기 전에 사멸시킨다. 일부 암 백신은 환자 맞춤형으로 제작되기도 하는데, 환자의 암세포 유전자를 분석함으로써 암을 유발한 돌연변이 유전자를 찾아내고 이에 의해 코딩되는 신항원 에피토프(neoantigen epitope)들로 변역되는 mRNA를 백신으로 제조하여 투여하는 경우, 해당 환자에서만 강력한 면역반응을 유도할 수 있어 맞춤형 정밀의약으로 개발이 가능하다는 장점이 있다.
다만, mRNA 백신 등의 핵산 백신은 작용 기전의 특성상 단백질로의 발현 효율이 매우 중요하며, 단백질의 발현 정도에 따라 백신의 효능이 결정되는바, 다양한 질병을 타겟으로 할 뿐만 아니라 단백질 발현능 또한 향상된 물질의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자를 제공한다.
용어, "시그널 펩타이드"는 단백질 합성 초기에 단백질의 N-말단에 존재하는 펩타이드를 의미하며, 신호 서열(signal sequence), 타겟팅 서열(targeting signal), 위치화 신호(localization signal), 위치화 서열(localization sequence), 리더 서열(leader sequence) 또는 리더 펩타이드(leader peptide) 등으로도 불린다. 본 발명에 따른 시그널 펩타이드는 핵산 분자의 단백질 발현 및 분비를 증가시키는 역할을 수행할 수 있다. 이때, 본 명세서에서 상기 '단백질 발현' 또는 '단백질 발현율'은 '단백질 번역', '단백질 번역율', '항원 발현', '항원 발현율' 등과 동일한 의미로 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 시그널 펩타이드는 IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX) 및 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1, MLP1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 시그널 펩타이드는 IgE로부터 유래된 서열번호 1, 알부민으로부터 유래된 서열번호 5, IFN-γ로부터 유래된 서열번호 9, 인자 IX로부터 유래된 서열번호 13, 및 MLP1으로부터 유래된 서열번호 17로 표시되는 펩타이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 서열번호 2 내지 4, 6 내지 8, 10 내지 12, 14 내지 16, 및 18 내지 20으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "항원"은 특이적 항체 생산, 사이토카인 분비 등의 면역 반응을 유발하는 단백질을 의미하며, 상기 항원은 코로나바이러스, 종양바이러스(oncovirus), 종양-특이적 항원(tumor-specific antigen), 종양-연관 항원(tumor-associated antigen) 및 신항원 에피토프(neoantigen epitope)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 코로나바이러스의 구체적인 예로, 알파코로나바이러스속(α-CoV, alphaCoV, alphacoronavirus), 베타코로나바이러스속(β-CoV, betaCoV, betacoronavirus), 감마코로나바이러스속(γ-CoV, gammaCoV, gammacoronavirus) 또는 델타코로나바이러스속(δ-CoV, deltaCoV, deltacoronavirus)에 속하는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like(SL)-ZC45, Bat-SL ZXC21, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59 또는 SARS-CoV-2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질(spike protein) 및 막 단백질(membrane protein)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질(spike protein) 및 막 단백질(membrane protein)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 면역 반응을 유도하며 중화 항체 생성능을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 상기 막 단백질은 CD4+ Th 세포의 기능을 향상시키는 등의 면역 반응을 유도하여 바이러스에 감염된 세포를 사멸시키는 역할을 수행할 수 있다.
상기 종양바이러스는 종양(암)의 원인이 되는 바이러스를 의미하며, 구체적인 예로, HBV(Hepatitis B virus), HCV(Hepatitis C virus), HTLV(Human T-lymphotropic virus), HPV(Human papillomaviruses), HHV-8(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus), MCV(Merkel cell polyomavirus) 또는 EBV(Epstein-Barr virus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 '종양-특이적 항원', '종양-연관 항원' 및 '신항원 에피토프'는 정상세포에는 존재하지 않고, 암세포에만 특이적으로 존재하는 항원 또는 에피토프를 의미한다. 구체적인 예로, 해독틀 변이(mutational frameshift), 스플라이스 변이(splice variant), 유전자 융합(gene fusion), 내인성 레트로엘리먼트(endogenous retroelement) 등 암세포 특이적인 돌연변이에 의해 유발된 돌연변이 유전자, 또는 상기 돌연변이 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질일 수 있다.
또한, 상기 항원은 서열번호 21 및 26로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열일 수 있고; 상기 항원을 인코딩하는 핵산은 서열번호 22 내지 25, 및 27 내지 30으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
용어, "Th 세포 에피토프"는 Th 세포에 의해 인식되어 Th 세포에 의한 면역 반응을 유도하는 펩타이드를 의미하며, 상기 'Th 세포(T helper cell)'는 CD4+ 세포, CD4+ T 세포, 보조 T 림프구, 도움 T 세포 등으로도 불리는 면역세포를 의미한다. 본 발명에 따른 Th 세포 에피토프는 Th 세포에 의한 면역 반응을 유도하여 중화 항체 생성능을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 구체적으로 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 등의 다양한 사이토카인을 분비하고, 이에 따라 B 세포의 항체 생성, 세포독성 T 세포의 활성화, 기억 T 세포의 활성화, 대식세포를 비롯한 식세포의 항박테리아 활동 촉진 등의 면역 반응을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(DTH toxoid) 및 백일해 톡소이드(Purtussis toxoid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 펩타이드일 수 있다. 상기 톡소이드는 독성은 제거되었으나 면역 반응을 유도하는 면역원성이 남아있는 물질을 의미하며, '파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid)'는 파상풍균인 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)가 생산하는 신경 독소인 테타노스파즈민(tetanospasmin)에서 유래된 것, '디프테리아 톡소이드(DTH Toxoid)'는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)가 생산하는 외독소에서 유래된 것, '백일해 톡소이드(Pertussis toxoid)'는 백일해균인 보더텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)가 생산하는 펩티도글리칸 조각에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 Th 세포 에피토프는 대식세포 혹은 수지상세포와 같은 항원제시세포의 MHC Class II에 의해 제시되고 Th 세포의 T 세포 수용체(T cell receptor)에 의해 감지되어 자극 시그널을 전달하는 펩타이드 서열로 구성된 에피토프를 포함할 수 있다.
또한, 상기 Th 세포 에피토프는 절단 부위(cleavage site)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있고, 또한 상기 항원과 Th 세포 에피토프 사이에 절단 부위를 인코딩하는 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용어, '절단 부위(cleavage site)'는 단백질 분해효소에 의해 절단되는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서는 상기 핵산 분자로부터 발현된 단백질이 효소에 의해 인식된 부위가 절단될 수 있도록 하는 역할을 수행하며, 이를 통해 핵산 분자에 연결된 각 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프가 본 발명에 따른 역할을 수행할 수 있게 한다. 상기 절단 부위는 세포 내 존재하는 내인성 효소에 의해 절단될 수 있고, 구체적으로 퓨린 프로테아제(furine protease) 또는 구제역바이러스(FMDV) 2A 자가 절단부위에 의해 절단될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 44의 아미노산 서열일 수 있고; 상기 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산은 서열번호 45 및 46으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "바이러스 감염증"(viral infection)은 바이러스가 인체의 기관이나 조직에서 증식한 결과로 생기는 질병을 의미한다.
구체적으로, 상기 바이러스 감염증은 코로나바이러스 감염증일 수 있다. 상기 코로나바이러스 감염증의 구체적인 예로, 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS) 및 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease-2019, COVID-19)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 코로나바이러스 감염에 의한 질병인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 바이러스 감염증은 암일 수 있다. 상기 암의 구체적인 예로, 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 고형암종으로는 간암(Hepatocarcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 외음암(vulva cancer), 질암(vaginal cancer), 구인두암(oropharyngeal cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 비인두암(nasopharyngeal carcinoma), 위암(stomach cancer), 다발성 캐슬만병(multicentric Castleman's disease), 원발성 삼출액 림프종(primary effusion lymphoma) 또는 머켈세포암(Merkel cell carcinoma) 등일 수 있고, 상기 혈액암종으로는 T 세포 백혈병(T-cell leukemia), 원발성 삼출액 림프종(primary effusion lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 또는 이식 후 림프증식성 질환(post-transplant lymphoproliferative disease) 등 일 수 있으나, 종양바이러스 감염에 의한 것인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자가 예방할 수 있는 암에는 구체적인 예로, 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 고형암종으로는 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 신장암, 소장암, 췌장암, 뇌종양, 골암, 피부암, 표피암종, 편평세포암종, 유방암, 경화성선증, 두경부암, 식도암, 인두암, 갑상선암, 부갑상선암, 신경 모세포종, 흑색종, 육종, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음암, 요도암, 방광암, 음경암, 고환암, 섬유선종 또는 이들의 전이암 등일 수 있고, 상기 혈액암종으로는 혈액암, 혈관육종, 백혈병, 림프종, 또는 이들의 전이암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 백신 제조용 핵산 분자일 수 있으며, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신의 제조용 핵산 분자일 수 있다.
용어, "예방"은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 바이러스 감염증 또는 암이 억제 또는 지연되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "치료"는 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 바이러스 감염증 또는 암의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "핵산 분자"는 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 상기 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 핵산 분자의 서열은 변이될 수 있으며, 상기 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 비보존적 치환 또는 변형을 포함한다.
또한, 핵산 서열 및 아미노산 서열을 포함한, 본 발명에서 이용되는 모든 서열은 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 59로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
상기 핵산 분자는 본 발명에 따른 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프를 다음과 같은 구조로 포함할 수 있다: 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-3' 또는 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-[Th 세포 에피토프]-3'.
이때, 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프는 상술한 순서에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 역할을 수행할 수 있는 한, 그 순서에는 제한이 없다.
또한, 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프는 상기 핵산 분자에 단수 또는 복수로 포함될 수 있으며, 단백질의 발현율이 감소되지 않는 한, 그 수에는 제한이 없다.
또한, 상기 핵산 분자는 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프 이외에, 단백질로의 발현을 위한 일반적인 핵산 서열, 구체적인 예로, 7-메틸구아노신(7-methylguanosine)을 포함하는 5'-CAP, Kozak 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 아데노신(adenosine)을 포함하는 3'-폴리 A 테일(3'-Poly A tail) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "핵산 분자", "바이러스 감염증" 및 "암"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
용어, "예방"은 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염증 또는 암이 억제 또는 지연되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "치료"는 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염증 또는 암의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "백신"은 개체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 개체에 주사하거나 경구 투여함으로써 개체의 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 상기 백신은 RNA 백신일 수 있고, 구체적으로 mRNA 백신일 수 있다. 용어 "mRNA 백신"은 항원의 유전자 중 일부를 인공적으로 복제한 후 이를 투여함으로써 면역 반응을 야기하는 백신을 의미한다. 이러한 mRNA 백신은 기존 단백질 백신에 비해서 다양한 장점을 갖는데, 우선 순수한 표적 항원의 유전정보만으로 합성 제작이 가능하기 때문에 위험한 병원체를 직접 취급할 필요가 없으며, 독성 유발에 필요한 유전자들 중 일부만을 사용하므로 투여되더라도 별다른 독성을 나타낼 염려가 없고, mRNA만으로 구성되는 단순함 때문에 갑자기 발생하는 감염병 또는 다양한 돌연변이에 대한 백신을 신속하게 개발할 수 있다는 등의 다양한 장점들을 가지고 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 코로나바이러스 감염증 및/또는 암의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있고, 코로나바이러스, 종양바이러스, 종양-특이적 항원, 종양-연관 항원 및/또는 신항원 에피토프에 대한 면역능을 갖는 것일 수 있다. 상기 코로나바이러스의 구체적인 예로 알파코로나바이러스속, 베타코로나바이러스속, 감마코로나바이러스속 또는 델타코로나바이러스속, 더욱 구체적인 예로 HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like(SL)-ZC45, Bat-SL ZXC21, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59 또는 SARS-CoV-2 등일 수 있으며, 상기 종양바이러스의 구체적인 예로 HBV, HCV, HTLV, HPV, HHV-8, MCV 또는 EBV 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 백신 조성물에 포함되는 상기 핵산 분자는 전달체에 담지되거나 연결된 것일 수 있고, 상기 전달체는 리포좀 기반 전달체, 지질 기반 전달체, 폴리머 기반 전달체 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전달체의 구체적인 예로, 리포좀(liposome), 파이토좀(phytosome), 에토좀(ethosome), 지질 나노입자(lipid nanoparticle), 지질-유사 나노입자(lipid-like nanoparticle), 지질 에멀젼(lipid emulsion), 리포플렉스(lipoplex), 지질 미셸(lipid micelle) 등의 리포좀 기반 전달체 또는 지질 기반 전달체; 폴리머좀(polymersome), 폴리머성 나노입자(polymeric nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 나노스피어(nanophere), 폴리플렉스(polyplex), 폴리머성 미셸(polymeric micelle) 등의 폴리머 기반 전달체; 또는 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(lipid-polymer hybrid nanoparticle), 양이온성 나노에멀젼(cationic nanoemulsion), 음이온성 나노에멀젼(anionic nanoemulsion), 리포폴리플렉스(lipopolyplex) 등의 지질-폴리머 하이브리드 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 용어, '약학적으로 허용 가능한 담체'는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 부형제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 상기 담체의 구체적인 예로 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 투여될 수 있다. 상기 "투여"는 피하투여, 근육내투여, 피내투여, 복막내투여, 정맥투여, 비강투여, 경피투여, 비경구투여 및 경구투여 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 면역 반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 합성 유사체, 비메칠화된 시티딘- 구아니딘형의 올리고핵산, 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일, 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 바이러스 감염증 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 "백신 조성물", "바이러스 감염증", "암" 및 "투여"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
용어, "개체"는 바이러스에 감염될 가능성이 있거나 감염된 개체, 또는 암이 발병될 가능성이 있거나 발병된 개체를 모두 포함하며, 인간, 임의의 비인간 동물, 어류 또는 식물류 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 비인간 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어, "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응으로의 개체 면역계가 활성화되는 것을 의미한다. 이때, 상기 면역 반응은 세포 매개 면역(cell-mediated immunity) 또는 체액 면역(humoral immunity), 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.
상기 면역 반응 생성 방법에서, 본 발명의 백신 조성물은 유효량의 유효 성분, 즉 본 발명에 따른 핵산 분자를 약학적으로 허용가능한 담체 및 보조제와 함께 포함할 수 있다. 용어, "유효량"은 상기 백신 조성물이 투여되는 개체에서 바이러스 감염증 또는 암에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 상기 유효량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 바이러스 감염증 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 "백신 조성물", "바이러스 감염증", "암", "개체", "투여", "예방" 및 "치료"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내 단백질 발현율 및 세포 외부로의 단백질 분비능이 우수하다. 또한, 생체 내 투여되는 경우, 개체에서 항원 특이적 중화 항체 유도 등의 체액성 면역력을 획득하게 하고, 바이러스의 사멸에 직접 관여하는 면역 세포의 양을 증가시키는 등의 세포성 면역력을 획득하게 하므로, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 및 치료를 위한 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)이 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 2는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 막 단백질(이하, '막 단백질'로 명명함)이 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 막 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin"은 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "MLP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다. 또한, "Wild SP"는 각 시그널 펩타이드를 야생형 코돈으로 최적화한 결과, "Yeast opti. SP"는 각 시그널 펩타이드를 효모 코돈으로 최적화한 결과이다.
도 3은 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함), Th 세포 에피토프가 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 4는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지로서, 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IgE"는 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5a는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지이다. "media"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이고, "lysate"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5b는 상기 도 5a에 따른 세포에서 발현되는, 로딩컨트롤로 사용된 α/β-tubulin 단백질의 양을 보여주는 이미지이다.
도 5c는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지이다. "media"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이고, "lysate"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5d는 상기 도 5c에 따른 세포에서 발현되는, 로딩컨트롤로 사용된 α/β-tubulin 단백질의 양을 보여주는 이미지이다.
도 6a는 세포 내에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 양을 보여주는 이미지로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자로 형질감염된 세포에 대한 결과이다("STP2104"). "S0"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 의미하고, "S1"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 서브유닛1을 의미한다. "α/β-tubulin"은 로딩 컨트롤로 사용하였다.
도 6b는 세포의 배양액에서 검출되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자로 형질감염된 세포에 대한 결과이다. 상기 핵산 분자는 0.1 또는 0.05 g/L의 농도로 사용하였다.
도 7은 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체의 양을 보여주는 그래프로서, 2차(부스트) 접종한 후 3주차에 측정한 결과이다. 각 항체의 양은 종말점 역가(endpoint titer)로 나타내었다. "Ag1+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag2+LNP1"은 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag3+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드, SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질 및 Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자에 관한 결과이다. 또한, "RBD specific total IgG"는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 항체의 양에 관한 결과이고, "S1 specific total IgG"는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 서브유닛1(S1)에 특이적인 항체의 양에 관한 결과이다.
도 8은 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 중화항체의 양을 보여주는 그래프로서, PRNT (Plaque reduction neutralization test) 50 값을 Log 값으로 변환하여 나타내었다. "Ag1+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag2+LNP1"은 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag3+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드, SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질 및 Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Mock"은 PBS (Phosphate Buffered saline)에 관한 결과이다.
도 9a는 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체(IgG1 및 IgG2a isotype)의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 1차(프라임) 접종한 후 4주차에 측정한 결과로서, 각 항체의 양은 광학 밀도(O.D.)로 나타내었다. "RBD protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과, "S protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과이다. 본 mRNA 백신의 면역주사에 의한 생체 내 IgG1/IgG2a 항체 비율의 증가는 Th2 type 체액성 면역반응이 우세하게 유도됨을 의미한다.
도 9b는 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체(IgG1 및 IgG2a isotype)의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 2차(부스트) 접종한 후 3주차에 측정한 결과로서, 각 항체의 양은 광학 밀도(O.D.)로 나타내었다. "RBD protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과, "S protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과이다. 본 mRNA 백신의 면역주사에 의한 생체 내 IgG1/IgG2a 항체 비율의 증가는 Th2 type 체액성 면역반응이 우세하게 유도됨을 의미한다.
도 10은 마우스에서 형성된 배 중심(Germinal Center; GC) B 세포의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 체액성면역반응은 기억 B 세포와 수명이 긴 형질 세포를 생성하기 위해 배 중심(GC)에서 B 세포와 CD4+ T 세포(여포 보조 T 세포(follicular helper T cells; TFH 세포)의 특수 집단 간의 상호작용을 필요로 한다. GC B 세포와 TFH 세포 사이의 분자 누화(crosstalk)는 각 세포 유형의 생존, 증식 및 분화에 영향을 미친다.
도 11은 마우스에서 형성된 CD4+ 중추 기억 T 세포(CD4+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 스파이크 전체 아미노산 서열에 대해 15 mer 길이의 펩타이드를 9 mer 중복되도록 합성한 후 5개의 그룹으로 peptide pool을 구성하고(peptide 1 내지 5) 그 중에서 peptide pool 2로 비장세포를 시험관에서 자극한 flow cytometry 분석에 관한 결과이다.
도 12는 마우스에서 형성된 CD8+ 중추 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 13은 마우스에서 형성된 CD8+ 효과(effector) 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L- 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 14는 마우스에서 형성된 IFN-γ 분비 세포의 수를 ELISpot으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스 비장으로부터 분리된 비장세포에서 IFN-γ를 분비하는 세포의 수에 관한 결과이다. "NC"는 음성대조군(Negative Control)으로 펩타이드로 자극하지 않고 얻은 결과, "PP2"는 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 15는 마우스에서 형성된 IFN-γ 분비 세포의 IFN-γ 염색 정도를 활성도로 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
본 발명에 대해서는 하기의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.
실시예 1. 백신용 핵산 분자의 제조
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 세포면역원성 및 중화항체 생성 유도능이 우수하고, 특히 단백질로의 발현율이 유의적으로 증가된 핵산 분자를 제조하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 생체 내로 투여되는 경우, 항원 단백질로의 발현율이 증가되어 면역 반응을 야기하는 세포면역원성이 증가되고, 이에 따라 인체 내 중화항체가 짧은 시간 내에 많은 양으로 생성될 수 있으며, 나아가 Th 세포에 의한 면역 반응이 효율적으로 유도되어 사이토카인 분비능이 증가됨으로써, 바이러스 감염증 또는 암에 대해 극대화된 예방 및/또는 치료 효능을 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 핵산 분자에는 시그널 펩타이드(signal peptide), Th 세포 에피토프(T helper cell epitope) 등을 포함시켰고, 예방 및/또는 치료 효능 유도를 목적으로 하는 특정 항원을 포함시켰다. 상기 펩타이드, 단백질 등의 염기 서열 및 아미노산 서열은 GenBank에서 확보하였고, 상기 GenBank에서 확보한 야생형 서열에 대하여 인간 또는 효모의 코돈으로 최적화를 수행함으로써 항원 단백질 발현 효율이 증진된 핵산 분자를 제조하였다. 코돈 최적화는 단백질을 코딩하는 유전자가 잘 발현될 수 있도록 각 개체가 선호하는 코돈이 되도록 변경하여 최적화를 시켜주는 것으로, GC 함량, 반복된 염기서열, 전사 효율, 발현량, 단백질 접힘, mRNA 이차 구조 등 다수의 요인들을 고려하여 수행된다. 상기 요인들 간의 상호 연관성이 코돈 최적화 결과에 있어서 다양하게 영향을 미치므로, 목적하는 수준의 발현량을 나타낼 수 있는 mRNA 서열을 제작하는 것은 경우의 수가 많고 매우 어렵다.
또한, 상기 핵산 분자의 GC 함량과 mRNA 2차 구조의 자유 에너지를 계산하여 단백질 발현량 등을 예측하였는데, 상기 mRNA 2차 구조의 자유 에너지가 증가하면 구조의 안정성이 낮아져 구조가 쉽게 붕괴되는바, 리보솜에 의한 인식 효율이 증가됨에 따라 단백질 발현율이 증가될 수 있다.
이때, 상기 시그널 펩타이드, 항원, Th 세포 에피토프 등은 다음과 같이 구성하여 핵산 분자를 디자인하였다: 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-3' 또는 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-[Th 세포 에피토프]-3'.
실시예 1-1. 시그널 펩타이드 제작
단백질 발현율이 우수한 백신용 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 시그널 펩타이드(signal peptide, SP)를 제작하였다.
구체적으로, 인간 유래의 IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX, F IX), 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1, MLP1) 등 서로 다른 5종류의 단백질에서 유래한 시그널 펩타이드를 확보하였다. 이들 시그널 펩타이드의 서열을 다양하게 변이시켰으며, 그 중에서 항원 단백질의 발현율이 우수한 서열을 선별하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 3의 핵산 서열은 IgE 유래의 시그널 펩타이드를 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이다.
SP
종류		 SP
코돈		 서열 서열번호
IgE 야생형
(아미노산)		 MDWTWILFLV AAATRVHS 서열번호 1
야생형
(핵산)		 ATGGACTGGACCTGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACGCGAGTCCACTCC 서열번호 2
인간 ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCCGCTACAAGAGTGCACAGC 서열번호 3
효모 ATGGACTGGACTTGGATCTTGTTCTTGGTTGCTGCTGCCACCAGAGTCCACTCT 서열번호 4
알부민 야생형
(아미노산)		 MKWVTFISLL FLFSSAYS 서열번호 5
야생형
(핵산)		 ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCC 서열번호 6
인간 ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGC 서열번호 7
효모 ATGAAGTGGGTTACTTTCATCTCTTTGTTGTTTTTATTCTCCTCTGCTTACTCC 서열번호 8
IFN-γ 야생형
(아미노산)		 MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYC 서열번호 9
야생형
(핵산)		 ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGC 서열번호 10
인간 ATGAAGTACACCAGCTACATCCTGGCCTTCCAGCTGTGCATCGTGCTGGGCTCTCTGGGCTGTTACTGC 서열번호 11
효모 ATGAAGTACACTTCTTACATTTTGGCTTTCCAATTGTGTATCGTTTTGGGTTCCTTAGGTTGTTACTGT 서열번호 12
F IX 야생형
(아미노산)		 MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAEC 서열번호 13
야생형
(핵산)		 ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGT 서열번호 14
인간 ATGCAGAGAGTGAACATGATCATGGCCGAGTCTCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGAGCGCCGAATGT 서열번호 15
효모 ATGCAAAGAGTTAACATGATTATGGCTGAATCTCCAGGTTTGATCACTATCTGTTTGTTGGGTTACTTGTTATCCGCCGAATGT 서열번호 16
MLP1 야생형
(아미노산)		 MVYKTLFALC ILTAGWRVQS 서열번호 17
야생형
(핵산)		 ATGGTCTACAAGACTCTCTTCGCTCTTTGCATCTTAACTGCAGGATGGAGGGTACAGAGT 서열번호 18
인간 ATGGTGTACAAGACCCTGTTCGCCCTGTGCATCCTGACCGCCGGCTGGAGGGTGCAGAGC 서열번호 19
효모 ATGGTATATAAAACTTTATTTGCTTTATGTATTTTAACTGCTGGTTGGCGTGTACAATCT 서열번호 20
실시예 1-2. 항원 제작
실시예 1-2-1. 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 제작
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 하나의 예시로 COVID-19를 야기하는 바이러스인 'SARS-CoV-2'의 항원을 사용하였다.
구체적으로, 숙주 세포의 수용체 인식, 세포막 융합, 중화항체 유도 등 감염 및 병원성에 중심적인 역할을 수행한다고 알려져 있는 스파이크 단백질(Spike protein, S)을 사용하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 23의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이고, 서열번호 25의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 것과 효모에 대해 코돈 최적화시킨 것을 모두 갖는 형태이다.
항원 종류 항원 코돈 서열번호
SARS-CoV-2
스파이크 단백질		 야생형 (아미노산) 서열번호 21
야생형 (핵산) 서열번호 22
인간 서열번호 23
효모 서열번호 24
효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 3569nt 서열번호 25
결과적으로, 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태가 인간 세포에서 바이러스 항원의 발현율이 높고, 목적하는 감염증 예방 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
따라서, 이후의 백신용 핵산 분자의 제조에 사용할 항원으로는 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태인 서열번호 25의 핵산을 사용하였다.
실시예 1-2-2. 'SARS-CoV-2' 막 단백질 제작
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 하나의 예시로 COVID-19를 야기하는 바이러스인 'SARS-CoV-2'의 항원을 사용하였다.
구체적으로, 코로나바이러스의 다양한 변이체 간에 유전자를 비교하였을 때 잘 보존된(conserved) 유전자인 막 단백질(Membrane protein, M)을 사용하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 28의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 막 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이고, 서열번호 30의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 막 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 것과 효모에 대해 코돈 최적화시킨 것을 모두 갖는 형태이다.
항원 종류 항원 코돈 서열번호
SARS-CoV-2
막 단백질		 야생형 (아미노산) 서열번호 26
야생형 (핵산) 서열번호 27
인간 서열번호 28
효모 서열번호 29
효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt 서열번호 30
결과적으로, 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태가 인간 세포에서 항원의 발현율이 높고, 목적하는 감염증 예방 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
따라서, 이후의 백신용 핵산 분자의 제조에 사용할 항원으로는 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태인 서열번호 30의 핵산을 사용하였다.
실시예 1-3. 시그널 펩타이드 및 항원의 융합
실시예 1-3-1. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 이용
단백질 발현 효율이 증가된 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 실시예1-1을 통해 확보한 5종의 시그널 펩타이드와 상기 실시예 1-2-1을 통해 확보한 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질을 융합시킨 핵산 분자를 제조하였다.
구체적으로, 상기 스파이크 단백질은 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 형태를 사용하였고, 이는 하기 표 4에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 서열번호
IgE 효모 효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 3569nt 서열번호 31
알부민 효모 서열번호 32
IFN-γ 효모 서열번호 33
F IX 효모 서열번호 34
MLP1 효모 서열번호 35
이후, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성하기 위하여, 10X T7 RNA polymerase buffer(다인바이오, 카탈로그 # DYP1647), 2 mM ATP, 2 mM UTP, 2 mM CTP, 2 mM GTP, 3.2 mM Cleancap AG(트라이링크, 카탈로그 # N-7113-10), 5% DMSO(시그마 알드리치 카탈로그 # 472301-500ML), 10 mg/L 항원 (SARS-CoV-2 스파이크 단백질) DNA 전사 주형, 800 U/mL 재조합 RNase 저해 단백질(타카라 카탈로그 # 2316A), 2 U/mL 이스트 무기 피로포스파타아제(써모 싸이언티픽 카탈로그 # EF0221), 2500 U/mL T7 RNA 폴리머라제(다인바이오 카탈로그 # dy1670)을 혼합하였다. 상기 전사반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. mRNA의 합성 여부는 론자 GelStarTM Nucleic Acid gel Stain(카탈로그 #5 0535)을 첨가한 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 진행하여 확인하였다. 한편, 합성한 상기 mRNA를 AKTA(싸이티바, AKTA avant)에서 Oligo(dT) 컬럼(비아 세퍼레이션, 카탈로그 # 311.1219-2)을 사용하여 정제하였고, 이후의 in vitro 또는 in vivo 실험에 사용하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 4,119 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질을 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-3-2. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 막 단백질 이용
단백질 발현 효율이 증가된 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-1을 통해 확보한 4종의 시그널 펩타이드와 상기 실시예 1-2-2를 통해 확보한 SARS-CoV-2 바이러스의 막 단백질을 융합시킨 핵산 분자를 제조하였고, 이는 하기 표 5에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 SARS-CoV-2 막 단백질 서열번호
알부민 야생형 효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt 서열번호 36
효모 서열번호 37
IFN-γ 야생형 서열번호 38
효모 서열번호 39
F IX 야생형 서열번호 40
효모 서열번호 41
MLP1 야생형 서열번호 42
효모 서열번호 43
이후, 상기 실시예 1-3-1에 따른 방법으로, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성한 후 이의 합성 여부를 확인하였으며, 또한 합성된 mRNA를 정제하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 1,107 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질을 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-4. Th 세포 에피토프 제작
세포면역원성 및 이에 따른 면역반응 유도능이 증가된 백신용 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 Th 세포 에피토프를 제작하였다.
구체적으로, Th 세포 에피토프는 하나의 예시로 파상풍 톡소이드에서 유래된 Th 세포 에피토프(Tetanus Toxoid Th cell epitope, TTTh)를 사용하였다. 또한, 상기 TTTh는 서로 다른 서열을 갖는 절단 부위(Cleavage site, CS)로 연결되도록 하였다. 상기 절단 부위를 포함하는 Th 세포 에피토프는 종결코돈을 포함시켜 다음과 같이 디자인하여 ORF의 C-말단에 위치하도록 구성하였다: 5'-[CS1]-[TTTh1]-[CS2]-[TTTh2]-[종결 코돈]-3'. 상기 구성에 대응되는 구체적인 아미노산 서열은 다음과 같다: 5'-[RQKR]-[IDKISDVSTIVPYIGPALNI]-[PKKR]-[NNFTVSFWLRVPKVSASHLE]-5'. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 이는 하기 표 6에 정리하였다. 예를 들어, 서열번호 46의 핵산 서열은 TTTh를 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이다.
Th 세포
에피토프		 Th 세포
에피토프 코돈		 서열 서열번호
야생형
(아미노산)		 RQKRIDKISD VSTIVPYIGP ALNIPKKRNN FTVSFWLRVP KVSASHLE 서열번호 44
야생형
(핵산)		 CGCCAGAAACGCATTGATAAAATTAGCGATGTGAGCACCATTGTGCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTCCGAAAAAACGCAACAACTTTACCGTGAGCTTTTGGCTGCGCGTGCCGAAAGTGAGCGCGAGCCATCTGGAATGA 서열번호 45
인간 AGACAGAAAAGAATCGATAAGATCAGCGACGTGTCTACAATCGTGCCATACATCGGCCCTGCCCTGAATATCCCCAAGAAGCGGAACAACTTCACCGTCAGCTTCTGGCTGAGAGTGCCTAAGGTGTCCGCCAGCCACCTGGAGTGA 서열번호 46
결과적으로, 인간의 코돈을 갖는 형태가 인간 세포에서 Th 세포 에피토프 발현율이 높고, 목적하는 백신 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-5. 시그널 펩타이드, 항원 및 Th 세포 에피토프의 융합
실시예 1-5-1. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 이용
상기 실시예 1-1 내지 1-3 등을 통해, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 시그널 펩타이드는 효모의 코돈을 갖는 형태였으며, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 항원 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질은 효모 및 인간의 코돈을 모두 갖는 형태임을 확인하였다. 이와 같이 확인된 시그널 펩타이드 서열 및 항원 서열에 Th 세포 에피토프 서열을 융합하여 핵산 분자를 제조하였다. 그 서열은 하기 표 7에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 항원 Th 세포
에피토프		 서열번호
IgE 효모 코돈 SARS-CoV-2 스파이크 단백질
(효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 3569nt)		 인간 코돈 서열번호 47
알부민 서열번호 48
IFN-γ 서열번호 49
F IX 서열번호 50
MLP1 서열번호 51
이후, 상기 실시예 1-3-1에 따른 방법으로, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성하고, mRNA의 합성 여부를 확인하고, 또한 합성된 mRNA를 정제하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 4,119 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드, 항원 단백질 및 Th 세포 에피토프를 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-5-2. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 막 단백질 이용
상기 실시예 1-1 내지 1-3 등을 통해, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 시그널 펩타이드는 야생형의 코돈을 갖거나 효모의 코돈을 갖는 형태였으며, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 항원 'SARS-CoV-2' 막 단백질은 효모 및 인간의 코돈을 모두 갖는 형태임을 확인하였다. 이와 같이 확인된 시그널 펩타이드 서열 및 항원 서열에 Th 세포 에피토프 서열을 융합하여 핵산 분자를 제조하였다. 그 서열은 하기 표 8에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 항원 Th 세포
에피토프		 서열번호
알부민 야생형 SARS-CoV-2 막 단백질 (효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt) 인간 코돈 서열번호 52
효모 서열번호 53
IFN-γ 야생형 서열번호 54
효모 서열번호 55
F IX 야생형 서열번호 56
효모 서열번호 57
MLP1 야생형 서열번호 58
효모 서열번호 59
실시예 2. 시그널 펩타이드를 포함하는 백신용 핵산 분자의 효과
실시예 2-1. 백신용 핵산 분자의 단백질 발현량 분석
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, in vitro에서 단백질 발현율을 분석하였다. 통상적으로 in vitro에서 고발현 특성을 나타내는 경우, in vivo에서 고면역원성을 나타내며, 이에 따라 백신의 효능이 증가된다고 알려져 있다. 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 모두 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4), 알부민 유래(서열번호 8), 인터페론 감마 유래(서열번호 12), 인자 IX 유래(서열번호 16) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, HEK-293T (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586) 세포를 10% FBS 및 1% Pen/Strep이 포함된 DMEM 배지로 배양하였고, 4 × 105 세포/웰의 HEK-293T 세포에 상기 실시예에 따라 제조한 핵산 분자를 약 0.1 또는 0.05 g/L의 농도로 형질감염시켰다. 이때, 상기 핵산 분자는 전달체로서 지질 나노입자(LNP)에 담지한 형태인 mRNA-LNP로 제제화하여 사용하였다. 형질감염이 완료된 후, 상기 핵산 분자의 세포 내 단백질 발현 및 이에 따른 세포 밖으로의 단백질 분비 정도를 당업계에 알려진 방법에 따라 웨스턴블롯 및 ELISA를 통해 분석하였다. 웨스턴블롯은 상기 형질감염된 세포의 용해물(lysate)에 대하여 1차 항체로서 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 다클론항체(E-AB-V1006, Elabscience)를 사용하고, 2차 항체로는 HRP-접합 이차 항체(goat anti-rabbit IgG; ABclonal)를 사용하여 수행하였다. ELISA는 상기 형질감염된 세포의 배양 배지(media)에 대하여 SARS-CoV-2 스파이크 S1 단백질 ELISA 키트(RK04154, ABclonal)를 사용하여 수행하였다.
한편, 항원으로 사용한 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 서브유닛1(S1) 및 서브유닛 2(S2)로 구성되어 있으며, 세포 감염에 주요 역할을 수행한다고 알려진 RBD (receptor binding domain)는 S1에 위치하고 있다. 웨스턴블롯에 사용한 1차 항체가 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 타겟하는 것인바, 스파이크 전체 단백질(S0, 190 kDa)이 탐지되거나, 또는 스파이크 단백질 중에서도 RBD 도메인이 위치한 서브유닛1(S1, 120 kDa)이 탐지되는지를 확인함으로써 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 발현 및 분비량을 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, IgE, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어짐을 확인하였다.
또한, 도 5a 및 5b에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어지며, 세포 내에서 발현된 단백질이 세포 밖으로 원활히 분비됨을 확인하였다.
또한, 도 5c 및 5d에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하며, Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어짐을 확인하였고, 세포 내에서 발현된 단백질이 세포 밖으로 원활히 분비됨을 확인하였다.
특히, 상기 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자의 경우, 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양이 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질 양보다 많음을 확인하였다. 또한, 상기 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자와 이를 포함하지 않는 핵산 분자와의 단백질 발현양을 비교할 때, 배양 배지에서는 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자의 단백질 양이 더 많았고, 세포 용해물에서는 시그널 펩타이드를 포함하지 않는 핵산 분자의 단백질 양이 더 많음을 확인하였다. 이를 통해 상기 시그널 펩타이드에 의해 스파이크 단백질의 세포 외 분비가 촉진될 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 6a에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 및 IgE 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서도 발현이 잘 이루어짐을 확인하였다.
또한, 도 6b에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 발현이 잘 이루어짐에 따라, 상당한 양의 단백질이 세포 밖으로 분비됨을 스파이크 단백질 ELISA를 통해 확인하였다. 서로 다른 농도의 mRNA-LNP stock 시료에 대하여, 0.1 g/L 시료로 형질감염된 세포에서는 약 6.32 ng/mL의 단백질이 발현 및 분비되었고, 0.05 g/L 시료로 형질감염된 세포에서는 약 7.71 ng/mL의 단백질이 발현 및 분비됨으로써 유사한 양의 스파이크 항원 단백질 양임을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성되고, 각 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 항원으로 포함하는 본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내에서 높은 효율로 단백질로 발현되며, 특히 발현된 단백질이 세포 밖으로 분비될 수 있으므로, 이와 같이 분비된 항원 단백질은 생체 내 존재하는 다른 면역 세포를 자극하여 세포성 또는 체액성 면역반응을 유도할 수 있다는 점을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 생체 내 투여 시 목적하는 백신 기능을 발휘할 수 있다.
실시예 2-2. 백신용 핵산 분자의 체액성 면역 증강 효과
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 면역효능을 확인하기 위하여, 상기 핵산 분자가 생체 내 투여되는 경우에 항원에 대한 체액성 면역 반응을 야기하여 실제 바이러스 감염증에 대한 예방 효과를 나타내는지 확인하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 실시예 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, 상기 핵산 분자를 mRNA-LNP로 제제화하였고, 이를 6주령 암컷 BALB/c 마우스(6마리)에 4주 간격으로 2회(1차: 프라임, 2차: 부스트)에 걸쳐 허벅지 상부에 근육 주사한 후 3주차에 희생시켰다. 이때, 상기 핵산 분자는 1, 5 또는 10 ㎍/개체의 농도로 주사하였다. 대조군으로는 PBS를 주사하였다.
이후, 상기 면역화된 마우스의 혈청에서 항원으로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 특이적 결합항체 또는 중화항체의 수준을 ELISA 또는 PRNT (Plaque Reduction Neutralizing Test) 어세이를 통해 측정하였다. ELISA를 위한 1차 항체로는 항-마우스 IgG1-(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 항체 또는 항-마우스 IgG2a-(Novus, Centennial, CO, USA) 항체를 사용하였다.
또한, 상기 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리하였고, 상기 비장세포에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드를 2 mg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 각 특이적 항체로 면역염색하여 유세포분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7 내지 9b에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자의 접종 후에는 마우스에서 RBD 또는 스파이크 전체 단백질에 대한 결합항체가 높은 수준으로 생성됨을 확인하였다. 또한, 생성되는 결합항체 및 중화항체의 양은 상기 핵산 분자에 대하여 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고(도 7 내지 9b), 1차 접종에 비하여 2차 접종 후 생성되는 중화항체의 양은 약 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 9a 및 도 9b).
또한, 도 10에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 10 ㎍/개체의 농도로 마우스에 접종되는 경우, 배중심(germinal center, GC)에 존재하는 B 세포(GC B 세포, GL7+ CD19+ 세포)의 수가 접종되지 않은 마우스에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였다. 배중심 (GC)에서는 기억 B 세포 및 수명이 긴 형질 세포(plasma cell)를 생성하기 위하여, 여포 보조 T 세포(TFH 세포)라고 불리는 CD4+ T 세포와 B 세포가 상호작용한다. 이러한 GC B 세포와 TFH 세포 사이의 상호작용은 각 세포 유형의 생존, 증식 및 분화에 영향을 미친다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3. 백신용 핵산 분자의 세포성 면역 증강 효과
실시예 2-3-1. T 세포 증가
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 면역효능을 확인하기 위하여, 상기 핵산 분자가 생체 내 투여되는 경우에 항원에 대한 세포성 면역 반응을 야기하여 실제 바이러스 감염증에 대한 예방 효과를 나타내는지 확인하였다. 세포성 면역반응의 일종으로서, 효과 기억 T 세포 및 중추 기억 T 세포 등의 T 세포의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 효과기 기억 T 세포는 병원체 진입 부위에서 즉각적이지만 지속되지는 않는 방어를 제공하며, 중추 기억 T 세포는 2차 림프 기관에서 증식하여 새로운 효과기 세포를 생성함으로써 면역 반응을 유지한다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4)의 것을 사용하여 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2 및 2-3에 따른 방법으로, mRNA-LNP 제제로 구성된 본 발명에 따른 핵산 분자를 마우스에 주사하였고, 상기 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리한 후 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드(peptide pool 2)를 2 mg/ml의 농도로 처리한 후 유세포분석을 수행하였다. CD4+ 중추 기억 T 세포(CD4+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포), CD8+ 중추 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포), CD8+ 효과기(effector) 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L- 세포)의 비율을 분석하였다.
그 결과, 도 11 내지 13에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 및 CD8+ 작용 기억 T 세포 등의 세포성 면역에 기여하는 세포 집단의 비율이 접종되지 않은 마우스에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3-2. IFN-γ 분비 세포 증가
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, 세포성 면역반응의 일종으로서, IFN-γ 분비 세포의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. IFN-γ는 선천성 항바이러스 반응을 담당하는 중요한 구성요소이며, 주로 NK 세포 또는 선천성 림프구 타입 1 세포에 의해 생성된다. 이러한 면역세포에 의한 IFN-γ 생성이 이루어지지 않는 경우, 생체 내에서 바이러스 복제가 증가하게 된다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 실시예 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2에 따라 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리하였고, 상기 비장세포에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드(peptide pool 2)를 2 mg/ml의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 IFN-γ 분비 세포를 ELISpot basic 키트(Mabtech, Nacka Strand, Sweden)를 사용하여 검출하였다.
그 결과, 도 14 및 15에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, IFN-γ 분비 세포의 수는 접종되지 않은 마우스에 비하여 현저히 증가함을 확인하였다(도 14). 또한, 상기 세포에 의한 IFN-γ의 활성도 약 3000배 이상 현저히 증가함을 확인하였다(도 15).
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3-3. 플라크 감소 중화 역가(PRNT) 분석
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, 세포성 면역반응의 일종으로서, 기억 T세포에 의한 중화 항체의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 플라크 감소 중화 역가(PRNT) 분석은 바이러스에 대한 바이러스 중화 및 보호 항체를 측정하고, 백신의 면역원성을 평가하는데 있어 널리 인정되는 접근 방식이다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4)의 것을 사용하여 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2에 따라 면역화된 마우스에서 분리한 혈청에 SARS-CoV-2 바이러스 (NCCP 43326, S-type)를 4.5x102 PFU/ml의 농도로 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 혈청-바이러스 배양물을 Vero E6 세포(ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586)에 첨가하여 1시간 동안 배양함으로써 상기 세포를 바이러스에 감염시켰고, 당업계에 알려진 방법에 따라 PRNT를 분석 어세이를 수행하였다. PRNT 역가는 Karber 방법을 사용하여 계산하였고, 중화 용량 ND50으로 표시하였다(log10ND50 = m - Δ(∑- 0.5), 여기서 m은 최고 희석의 log10을 나타내고, Δ는 희석 계수의 log10을 나타내고, ∑는 바이러스-혈청 접종물/바이러스 통제에 의해 생성된 플라크의 평균 수를 나타냄).
Figure PCTKR2022001874-appb-T000001
그 결과, 상기 표 9에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, 1차 접종 후에는 중화 항체의 생성양이 대조군과 유사한 수준이었으나, 2차 접종 후에는 중화 항체 생성양이 현저하게 증가함을 확인하였다. 이러한 효과는 개체 당 5 또는 10 ㎍이 투여된 경우 특히 우수함을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.

Claims (16)

  1. IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX) 및 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산; 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 서열번호 2 내지 4, 6 내지 8, 10 내지 12, 14 내지 16, 및 18 내지 20으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항원은 코로나바이러스, 종양바이러스(oncovirus), 종양-특이적 항원(cancer tumor-specific antigen), 종양-연관 항원(tumor-associated antigen) 및 신항원 에피토프(neoantigen epitope)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질 및 막 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항원을 인코딩하는 핵산은 서열번호 22 내지 25, 및 27 내지 30으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(DTH toxoid) 및 백일해 톡소이드(Purtussis toxoid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산은 서열번호 45 및 46으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 감염증은 코로나바이러스 감염증인, 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 코로나바이러스 감염증은 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS) 및 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease-2019, COVID-19)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 암은 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 신장암, 소장암, 췌장암, 뇌종양, 골암, 피부암, 표피암종, 편평세포암종, 유방암, 경화성선증, 두경부암, 식도암, 인두암, 갑상선암, 부갑상선암, 신경 모세포종, 흑색종, 육종, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음암, 요도암, 방광암, 음경암, 고환암, 혈액암, 혈관육종, 백혈병, 림프종, 섬유선종, 및 이들의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 핵산 분자.
  13. 제1항의 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 전달체에 담지 또는 연결된 것인, 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 전달체는 리포좀 기반 전달체, 지질 기반 전달체, 폴리머 기반 전달체 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 전달체는 리포좀(liposome), 파이토좀(phytosome), 에토좀(ethosome), 지질 나노입자(lipid nanoparticle), 지질-유사 나노입자(lipid-like nanoparticle), 지질 에멀젼(lipid emulsion), 리포플렉스(lipoplex), 지질 미셸(lipid micelle), 폴리머좀(polymersome), 폴리머성 나노입자(polymeric nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 나노스피어(nanophere), 폴리플렉스(polyplex), 폴리머성 미셸(polymeric micelle), 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(lipid-polymer hybrid nanoparticle), 양이온성 나노에멀젼(cationic nanoemulsion), 음이온성 나노에멀젼(anionic nanoemulsion) 및 리포폴리플렉스(lipopolyplex)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 백신 조성물.
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