KR20220113641A - 신규 핵산 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내 단백질 발현율 및 세포 외부로의 단백질 분비능이 우수하다. 또한, 생체 내 투여되는 경우, 개체에서 항원 특이적 중화 항체 유도 등의 체액성 면역력을 획득하게 하고, 바이러스의 사멸에 직접 관여하는 면역 세포의 양을 증가시키는 등의 세포성 면역력을 획득하게 하므로, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 및 치료를 위한 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규 핵산 분자{NOVEL NUCLEIC ACID MOLECULE}
본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
현재 백신은 다양한 방법으로 개발되어 제조되고 있으며, 구체적인 종류로는 병원체를 약독화된 상태로 주입하는 약독화/생백신(attenuated vaccine), 병원체 자체가 아니라 질병을 일으키는 원인 물질(독소)을 비활성화시켜서 만든 톡소이드 백신(toxoid vaccine), 항원으로 인식되는 항원결정부위에 해당하는 부분만을 따로 추출해서 만든 아단위 백신(subunit vaccine), 유전자 정보를 이용하여 에피토프만을 따로 생산하여 만든 재조합 백신(recombinant vaccine) 등이 있다.
상술한 백신 중에서도, 재조합 백신은 에피토프 외에 다른 성분은 포함되지 않으므로 안전성이 높다는 장점이 있으며, 특히 mRNA로 이루어진 핵산 백신은 생산 속도가 빠르고 비용이 적게 들며, 세포 매개 면역(cell-mediated immunity) 및 체액 면역(humoral immunity) 모두에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다는 점에서 많은 이점이 있다. 또한, 항원의 다양한 구성성분 중 면역 반응을 유도하는 특정 에피토프만을 선별하여 사용하는 등 백신의 구성을 다양하게 디자인할 수 있는바, 바이러스 감염증, 암 등 다양한 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 활용되고 있다.
일 예로, 바이러스 감염증으로는 감기, 인플루엔자, 수두, 구순 포진 등 비교적 가벼운 증세를 보이는 것부터, 광견병, 에볼라, 마버그, 크리미안콩고출혈열 바이러스병, AIDS, 조류 인플루엔자, SARS, COVID-19, 암 등 심각한 부작용 및 후유증을 야기하는 중증질환을 들 수 있다. 이에, 감염 후 발현된 증상을 완화시키고 치료하는 것보다 증상의 발현을 예방하는 것이 주요 이슈임에 따라, 바이러스 감염증을 예방하기 위한 백신의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
또한, 암 백신과 관련해서는, 바이러스 감염으로 인해 발병하는 암 뿐만 아니라, 세포의 돌연변이로 인해 발병하는 암에 대해서도 예방, 치료 등의 용도로써 암 백신이 연구 및 개발되고 있다. 암세포는 정상세포에는 존재하지 않는 종양-특이적 항원이 존재하는데, 암 백신은 이러한 종양-특이적 항원을 통해 암세포 특이적 면역반응을 유도함으로써 암세포가 과다 증식되기 전에 사멸시킨다. 일부 암 백신은 환자 맞춤형으로 제작되기도 하는데, 환자의 암세포 유전자를 분석함으로써 암을 유발한 돌연변이 유전자를 찾아내고 이에 의해 코딩되는 신항원 에피토프(neoantigen epitope)들로 변역되는 mRNA를 백신으로 제조하여 투여하는 경우, 해당 환자에서만 강력한 면역반응을 유도할 수 있어 맞춤형 정밀의약으로 개발이 가능하다는 장점이 있다.
다만, mRNA 백신 등의 핵산 백신은 작용 기전의 특성상 단백질로의 발현 효율이 매우 중요하며, 단백질의 발현 정도에 따라 백신의 효능이 결정되는바, 다양한 질병을 타겟으로 할 뿐만 아니라 단백질 발현능 또한 향상된 물질의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자를 제공한다.
용어, "시그널 펩타이드"는 단백질 합성 초기에 단백질의 N-말단에 존재하는 펩타이드를 의미하며, 신호 서열(signal sequence), 타겟팅 서열(targeting signal), 위치화 신호(localization signal), 위치화 서열(localization sequence), 리더 서열(leader sequence) 또는 리더 펩타이드(leader peptide) 등으로도 불린다. 본 발명에 따른 시그널 펩타이드는 핵산 분자의 단백질 발현 및 분비를 증가시키는 역할을 수행할 수 있다. 이때, 본 명세서에서 상기 '단백질 발현' 또는 '단백질 발현율'은 '단백질 번역', '단백질 번역율', '항원 발현', '항원 발현율' 등과 동일한 의미로 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 시그널 펩타이드는 IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX) 및 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1, MLP1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 시그널 펩타이드는 IgE로부터 유래된 서열번호 1, 알부민으로부터 유래된 서열번호 5, IFN-γ로부터 유래된 서열번호 9, 인자 IX로부터 유래된 서열번호 13, 및 MLP1으로부터 유래된 서열번호 17로 표시되는 펩타이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 서열번호 2 내지 4, 6 내지 8, 10 내지 12, 14 내지 16, 및 18 내지 20으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "항원"은 특이적 항체 생산, 사이토카인 분비 등의 면역 반응을 유발하는 단백질을 의미하며, 상기 항원은 코로나바이러스, 종양바이러스(oncovirus), 종양-특이적 항원(tumor-specific antigen), 종양-연관 항원(tumor-associated antigen) 및 신항원 에피토프(neoantigen epitope)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 코로나바이러스의 구체적인 예로, 알파코로나바이러스속(α-CoV, alphaCoV, alphacoronavirus), 베타코로나바이러스속(β-CoV, betaCoV, betacoronavirus), 감마코로나바이러스속(γ-CoV, gammaCoV, gammacoronavirus) 또는 델타코로나바이러스속(δ-CoV, deltaCoV, deltacoronavirus)에 속하는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like(SL)-ZC45, Bat-SL ZXC21, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59 또는 SARS-CoV-2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질(spike protein) 및 막 단백질(membrane protein)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질(spike protein) 및 막 단백질(membrane protein)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 면역 반응을 유도하며 중화 항체 생성능을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 상기 막 단백질은 CD4+ Th 세포의 기능을 향상시키는 등의 면역 반응을 유도하여 바이러스에 감염된 세포를 사멸시키는 역할을 수행할 수 있다.
상기 종양바이러스는 종양(암)의 원인이 되는 바이러스를 의미하며, 구체적인 예로, HBV(Hepatitis B virus), HCV(Hepatitis C virus), HTLV(Human T-lymphotropic virus), HPV(Human papillomaviruses), HHV-8(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus), MCV(Merkel cell polyomavirus) 또는 EBV(Epstein-Barr virus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 '종양-특이적 항원', '종양-연관 항원' 및 '신항원 에피토프'는 정상세포에는 존재하지 않고, 암세포에만 특이적으로 존재하는 항원 또는 에피토프를 의미한다. 구체적인 예로, 해독틀 변이(mutational frameshift), 스플라이스 변이(splice variant), 유전자 융합(gene fusion), 내인성 레트로엘리먼트(endogenous retroelement) 등 암세포 특이적인 돌연변이에 의해 유발된 돌연변이 유전자, 또는 상기 돌연변이 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질일 수 있다.
또한, 상기 항원은 서열번호 21 및 26로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열일 수 있고; 상기 항원을 인코딩하는 핵산은 서열번호 22 내지 25, 및 27 내지 30으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
용어, "Th 세포 에피토프"는 Th 세포에 의해 인식되어 Th 세포에 의한 면역 반응을 유도하는 펩타이드를 의미하며, 상기 'Th 세포(T helper cell)'는 CD4+ 세포, CD4+ T 세포, 보조 T 림프구, 도움 T 세포 등으로도 불리는 면역세포를 의미한다. 본 발명에 따른 Th 세포 에피토프는 Th 세포에 의한 면역 반응을 유도하여 중화 항체 생성능을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으며, 구체적으로 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 등의 다양한 사이토카인을 분비하고, 이에 따라 B 세포의 항체 생성, 세포독성 T 세포의 활성화, 기억 T 세포의 활성화, 대식세포를 비롯한 식세포의 항박테리아 활동 촉진 등의 면역 반응을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(DTH toxoid) 및 백일해 톡소이드(Purtussis toxoid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 펩타이드일 수 있다. 상기 톡소이드는 독성은 제거되었으나 면역 반응을 유도하는 면역원성이 남아있는 물질을 의미하며, '파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid)'는 파상풍균인 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)가 생산하는 신경 독소인 테타노스파즈민(tetanospasmin)에서 유래된 것, '디프테리아 톡소이드(DTH Toxoid)'는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)가 생산하는 외독소에서 유래된 것, '백일해 톡소이드(Pertussis toxoid)'는 백일해균인 보더텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)가 생산하는 펩티도글리칸 조각에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 Th 세포 에피토프는 대식세포 혹은 수지상세포와 같은 항원제시세포의 MHC Class II에 의해 제시되고 Th 세포의 T 세포 수용체(T cell receptor)에 의해 감지되어 자극 시그널을 전달하는 펩타이드 서열로 구성된 에피토프를 포함할 수 있다.
또한, 상기 Th 세포 에피토프는 절단 부위(cleavage site)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있고, 또한 상기 항원과 Th 세포 에피토프 사이에 절단 부위를 인코딩하는 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용어, '절단 부위(cleavage site)'는 단백질 분해효소에 의해 절단되는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서는 상기 핵산 분자로부터 발현된 단백질이 효소에 의해 인식된 부위가 절단될 수 있도록 하는 역할을 수행하며, 이를 통해 핵산 분자에 연결된 각 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프가 본 발명에 따른 역할을 수행할 수 있게 한다. 상기 절단 부위는 세포 내 존재하는 내인성 효소에 의해 절단될 수 있고, 구체적으로 퓨린 프로테아제(furine protease) 또는 구제역바이러스(FMDV) 2A 자가 절단부위에 의해 절단될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 44의 아미노산 서열일 수 있고; 상기 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산은 서열번호 45 및 46으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "바이러스 감염증"(viral infection)은 바이러스가 인체의 기관이나 조직에서 증식한 결과로 생기는 질병을 의미한다.
구체적으로, 상기 바이러스 감염증은 코로나바이러스 감염증일 수 있다. 상기 코로나바이러스 감염증의 구체적인 예로, 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS) 및 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease-2019, COVID-19)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 코로나바이러스 감염에 의한 질병인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 바이러스 감염증은 암일 수 있다. 상기 암의 구체적인 예로, 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 고형암종으로는 간암(Hepatocarcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 외음암(vulva cancer), 질암(vaginal cancer), 구인두암(oropharyngeal cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 비인두암(nasopharyngeal carcinoma), 위암(stomach cancer), 다발성 캐슬만병(multicentric Castleman's disease), 원발성 삼출액 림프종(primary effusion lymphoma) 또는 머켈세포암(Merkel cell carcinoma) 등일 수 있고, 상기 혈액암종으로는 T 세포 백혈병(T-cell leukemia), 원발성 삼출액 림프종(primary effusion lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 또는 이식 후 림프증식성 질환(post-transplant lymphoproliferative disease) 등 일 수 있으나, 종양바이러스 감염에 의한 것인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자가 예방할 수 있는 암에는 구체적인 예로, 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 고형암종으로는 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 신장암, 소장암, 췌장암, 뇌종양, 골암, 피부암, 표피암종, 편평세포암종, 유방암, 경화성선증, 두경부암, 식도암, 인두암, 갑상선암, 부갑상선암, 신경 모세포종, 흑색종, 육종, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음암, 요도암, 방광암, 음경암, 고환암, 섬유선종 또는 이들의 전이암 등일 수 있고, 상기 혈액암종으로는 혈액암, 혈관육종, 백혈병, 림프종, 또는 이들의 전이암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 백신 제조용 핵산 분자일 수 있으며, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신의 제조용 핵산 분자일 수 있다.
용어, "예방"은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 바이러스 감염증 또는 암이 억제 또는 지연되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "치료"는 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 바이러스 감염증 또는 암의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "핵산 분자"는 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 상기 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 핵산 분자의 서열은 변이될 수 있으며, 상기 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 비보존적 치환 또는 변형을 포함한다.
또한, 핵산 서열 및 아미노산 서열을 포함한, 본 발명에서 이용되는 모든 서열은 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 59로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
상기 핵산 분자는 본 발명에 따른 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프를 다음과 같은 구조로 포함할 수 있다: 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-3' 또는 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-[Th 세포 에피토프]-3'.
이때, 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프는 상술한 순서에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 역할을 수행할 수 있는 한, 그 순서에는 제한이 없다.
또한, 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프는 상기 핵산 분자에 단수 또는 복수로 포함될 수 있으며, 단백질의 발현율이 감소되지 않는 한, 그 수에는 제한이 없다.
또한, 상기 핵산 분자는 상기 시그널 펩타이드, 항원 및/또는 Th 세포 에피토프 이외에, 단백질로의 발현을 위한 일반적인 핵산 서열, 구체적인 예로, 7-메틸구아노신(7-methylguanosine)을 포함하는 5'-CAP, Kozak 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 아데노신(adenosine)을 포함하는 3'-폴리 A 테일(3'-Poly A tail) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "핵산 분자", "바이러스 감염증" 및 "암"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
용어, "예방"은 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염증 또는 암이 억제 또는 지연되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "치료"는 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염증 또는 암의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
용어, "백신"은 개체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 개체에 주사하거나 경구 투여함으로써 개체의 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 상기 백신은 RNA 백신일 수 있고, 구체적으로 mRNA 백신일 수 있다. 용어 "mRNA 백신"은 항원의 유전자 중 일부를 인공적으로 복제한 후 이를 투여함으로써 면역 반응을 야기하는 백신을 의미한다. 이러한 mRNA 백신은 기존 단백질 백신에 비해서 다양한 장점을 갖는데, 우선 순수한 표적 항원의 유전정보만으로 합성 제작이 가능하기 때문에 위험한 병원체를 직접 취급할 필요가 없으며, 독성 유발에 필요한 유전자들 중 일부만을 사용하므로 투여되더라도 별다른 독성을 나타낼 염려가 없고, mRNA만으로 구성되는 단순함 때문에 갑자기 발생하는 감염병 또는 다양한 돌연변이에 대한 백신을 신속하게 개발할 수 있다는 등의 다양한 장점들을 가지고 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 코로나바이러스 감염증 및/또는 암의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있고, 코로나바이러스, 종양바이러스, 종양-특이적 항원, 종양-연관 항원 및/또는 신항원 에피토프에 대한 면역능을 갖는 것일 수 있다. 상기 코로나바이러스의 구체적인 예로 알파코로나바이러스속, 베타코로나바이러스속, 감마코로나바이러스속 또는 델타코로나바이러스속, 더욱 구체적인 예로 HCoV-229E, HCoV-NL63, Bat-SARS-like(SL)-ZC45, Bat-SL ZXC21, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HKU-1, MHV-A59 또는 SARS-CoV-2 등일 수 있으며, 상기 종양바이러스의 구체적인 예로 HBV, HCV, HTLV, HPV, HHV-8, MCV 또는 EBV 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 백신 조성물에 포함되는 상기 핵산 분자는 전달체에 담지되거나 연결된 것일 수 있고, 상기 전달체는 리포좀 기반 전달체, 지질 기반 전달체, 폴리머 기반 전달체 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전달체의 구체적인 예로, 리포좀(liposome), 파이토좀(phytosome), 에토좀(ethosome), 지질 나노입자(lipid nanoparticle), 지질-유사 나노입자(lipid-like nanoparticle), 지질 에멀젼(lipid emulsion), 리포플렉스(lipoplex), 지질 미셸(lipid micelle) 등의 리포좀 기반 전달체 또는 지질 기반 전달체; 폴리머좀(polymersome), 폴리머성 나노입자(polymeric nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 나노스피어(nanophere), 폴리플렉스(polyplex), 폴리머성 미셸(polymeric micelle) 등의 폴리머 기반 전달체; 또는 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(lipid-polymer hybrid nanoparticle), 양이온성 나노에멀젼(cationic nanoemulsion), 음이온성 나노에멀젼(anionic nanoemulsion), 리포폴리플렉스(lipopolyplex) 등의 지질-폴리머 하이브리드 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 용어, '약학적으로 허용 가능한 담체'는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 부형제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 상기 담체의 구체적인 예로 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 투여될 수 있다. 상기 "투여"는 피하투여, 근육내투여, 피내투여, 복막내투여, 정맥투여, 비강투여, 경피투여, 비경구투여 및 경구투여 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 면역 반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 합성 유사체, 비메칠화된 시티딘- 구아니딘형의 올리고핵산, 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일, 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 바이러스 감염증 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 "백신 조성물", "바이러스 감염증", "암" 및 "투여"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
용어, "개체"는 바이러스에 감염될 가능성이 있거나 감염된 개체, 또는 암이 발병될 가능성이 있거나 발병된 개체를 모두 포함하며, 인간, 임의의 비인간 동물, 어류 또는 식물류 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 비인간 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어, "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응으로의 개체 면역계가 활성화되는 것을 의미한다. 이때, 상기 면역 반응은 세포 매개 면역(cell-mediated immunity) 또는 체액 면역(humoral immunity), 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.
상기 면역 반응 생성 방법에서, 본 발명의 백신 조성물은 유효량의 유효 성분, 즉 본 발명에 따른 핵산 분자를 약학적으로 허용가능한 담체 및 보조제와 함께 포함할 수 있다. 용어, "유효량"은 상기 백신 조성물이 투여되는 개체에서 바이러스 감염증 또는 암에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 상기 유효량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 바이러스 감염증 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 "백신 조성물", "바이러스 감염증", "암", "개체", "투여", "예방" 및 "치료"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내 단백질 발현율 및 세포 외부로의 단백질 분비능이 우수하다. 또한, 생체 내 투여되는 경우, 개체에서 항원 특이적 중화 항체 유도 등의 체액성 면역력을 획득하게 하고, 바이러스의 사멸에 직접 관여하는 면역 세포의 양을 증가시키는 등의 세포성 면역력을 획득하게 하므로, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 및 치료를 위한 백신으로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)이 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 2는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 막 단백질(이하, '막 단백질'로 명명함)이 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 막 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin"은 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "MLP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 막 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다. 또한, "Wild SP"는 각 시그널 펩타이드를 야생형 코돈으로 최적화한 결과, "Yeast opti. SP"는 각 시그널 펩타이드를 효모 코돈으로 최적화한 결과이다.
도 3은 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함), Th 세포 에피토프가 융합된, mRNA 핵산 분자의 전기영동 결과를 보여주는 이미지이다. "ssRNA ladder"는 mRNA의 크기를 측정하기 위한 사이즈 마커이고, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 4는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지로서, 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IgE"는 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5a는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지이다. "media"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이고, "lysate"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 스파이크 단백질이 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5b는 상기 도 5a에 따른 세포에서 발현되는, 로딩컨트롤로 사용된 α/β-tubulin 단백질의 양을 보여주는 이미지이다.
도 5c는 세포에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질(이하, '스파이크 단백질'로 명명함)의 양을 보여주는 이미지이다. "media"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이고, "lysate"는 각 핵산 분자로 형질감염된 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질의 양에 관한 것이다. "Negative control"은 핵산 분자로 형질감염되지 않은 세포(음성 대조군)에 관한 결과, "No SP"는 시그널 펩타이드가 포함되지 않고 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프만 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Albumin SP"는 알부민 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "IFN-γ SP"는 IFN-γ 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Factor IX SP"는 Factor IX 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과, "Mucin like protein SP"는 MLP1 유래 시그널 펩타이드, 스파이크 단백질 및 Th 세포 에피토프가 포함된 핵산 분자에 관한 결과이다.
도 5d는 상기 도 5c에 따른 세포에서 발현되는, 로딩컨트롤로 사용된 α/β-tubulin 단백질의 양을 보여주는 이미지이다.
도 6a는 세포 내에서 발현되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 양을 보여주는 이미지로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자로 형질감염된 세포에 대한 결과이다("STP2104"). "S0"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 의미하고, "S1"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 서브유닛1을 의미한다. "α/β-tubulin"은 로딩 컨트롤로 사용하였다.
도 6b는 세포의 배양액에서 검출되는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자로 형질감염된 세포에 대한 결과이다. 상기 핵산 분자는 0.1 또는 0.05 g/L의 농도로 사용하였다.
도 7은 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체의 양을 보여주는 그래프로서, 2차(부스트) 접종한 후 3주차에 측정한 결과이다. 각 항체의 양은 종말점 역가(endpoint titer)로 나타내었다. "Ag1+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag2+LNP1"은 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag3+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드, SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질 및 Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자에 관한 결과이다. 또한, "RBD specific total IgG"는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 항체의 양에 관한 결과이고, "S1 specific total IgG"는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 서브유닛1(S1)에 특이적인 항체의 양에 관한 결과이다.
도 8은 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 중화항체의 양을 보여주는 그래프로서, PRNT (Plaque reduction neutralization test) 50 값을 Log 값으로 변환하여 나타내었다. "Ag1+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag2+LNP1"은 MLP1 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Ag3+LNP1"은 IgE 유래 시그널 펩타이드, SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질 및 Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자에 관한 결과, "Mock"은 PBS (Phosphate Buffered saline)에 관한 결과이다.
도 9a는 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체(IgG1 및 IgG2a isotype)의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 1차(프라임) 접종한 후 4주차에 측정한 결과로서, 각 항체의 양은 광학 밀도(O.D.)로 나타내었다. "RBD protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과, "S protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과이다. 본 mRNA 백신의 면역주사에 의한 생체 내 IgG1/IgG2a 항체 비율의 증가는 Th2 type 체액성 면역반응이 우세하게 유도됨을 의미한다.
도 9b는 마우스에서 형성된 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합항체(IgG1 및 IgG2a isotype)의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 2차(부스트) 접종한 후 3주차에 측정한 결과로서, 각 항체의 양은 광학 밀도(O.D.)로 나타내었다. "RBD protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 중 RBD (receptor binding domain) 도메인에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과, "S protein"은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질에 특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체의 양은 면역 접종량에 따라서 증가함을 시사하는 결과이다. 본 mRNA 백신의 면역주사에 의한 생체 내 IgG1/IgG2a 항체 비율의 증가는 Th2 type 체액성 면역반응이 우세하게 유도됨을 의미한다.
도 10은 마우스에서 형성된 배 중심(Germinal Center; GC) B 세포의 양을 보여주는 그래프로서, IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스에 관한 결과이다. 체액성면역반응은 기억 B 세포와 수명이 긴 형질 세포를 생성하기 위해 배 중심(GC)에서 B 세포와 CD4+ T 세포(여포 보조 T 세포(follicular helper T cells; TFH 세포)의 특수 집단 간의 상호작용을 필요로 한다. GC B 세포와 TFH 세포 사이의 분자 누화(crosstalk)는 각 세포 유형의 생존, 증식 및 분화에 영향을 미친다.
도 11은 마우스에서 형성된 CD4+ 중추 기억 T 세포(CD4+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 스파이크 전체 아미노산 서열에 대해 15 mer 길이의 펩타이드를 9 mer 중복되도록 합성한 후 5개의 그룹으로 peptide pool을 구성하고(peptide 1 내지 5) 그 중에서 peptide pool 2로 비장세포를 시험관에서 자극한 flow cytometry 분석에 관한 결과이다.
도 12는 마우스에서 형성된 CD8+ 중추 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 13은 마우스에서 형성된 CD8+ 효과(effector) 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L- 세포)의 양을 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 14는 마우스에서 형성된 IFN-γ 분비 세포의 수를 ELISpot으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스 비장으로부터 분리된 비장세포에서 IFN-γ를 분비하는 세포의 수에 관한 결과이다. "NC"는 음성대조군(Negative Control)으로 펩타이드로 자극하지 않고 얻은 결과, "PP2"는 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
도 15는 마우스에서 형성된 IFN-γ 분비 세포의 IFN-γ 염색 정도를 활성도로 보여주는 그래프이다. IgE 유래 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질을 포함하는 핵산 분자가 1, 5 또는 10 ㎍으로 투여된 마우스로부터 비장세포를 분리하여 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 peptide pool 2로 자극하여 얻은 결과이다.
본 발명에 대해서는 하기의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.
실시예 1. 백신용 핵산 분자의 제조
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 세포면역원성 및 중화항체 생성 유도능이 우수하고, 특히 단백질로의 발현율이 유의적으로 증가된 핵산 분자를 제조하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 생체 내로 투여되는 경우, 항원 단백질로의 발현율이 증가되어 면역 반응을 야기하는 세포면역원성이 증가되고, 이에 따라 인체 내 중화항체가 짧은 시간 내에 많은 양으로 생성될 수 있으며, 나아가 Th 세포에 의한 면역 반응이 효율적으로 유도되어 사이토카인 분비능이 증가됨으로써, 바이러스 감염증 또는 암에 대해 극대화된 예방 및/또는 치료 효능을 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 핵산 분자에는 시그널 펩타이드(signal peptide), Th 세포 에피토프(T helper cell epitope) 등을 포함시켰고, 예방 및/또는 치료 효능 유도를 목적으로 하는 특정 항원을 포함시켰다. 상기 펩타이드, 단백질 등의 염기 서열 및 아미노산 서열은 GenBank에서 확보하였고, 상기 GenBank에서 확보한 야생형 서열에 대하여 인간 또는 효모의 코돈으로 최적화를 수행함으로써 항원 단백질 발현 효율이 증진된 핵산 분자를 제조하였다. 코돈 최적화는 단백질을 코딩하는 유전자가 잘 발현될 수 있도록 각 개체가 선호하는 코돈이 되도록 변경하여 최적화를 시켜주는 것으로, GC 함량, 반복된 염기서열, 전사 효율, 발현량, 단백질 접힘, mRNA 이차 구조 등 다수의 요인들을 고려하여 수행된다. 상기 요인들 간의 상호 연관성이 코돈 최적화 결과에 있어서 다양하게 영향을 미치므로, 목적하는 수준의 발현량을 나타낼 수 있는 mRNA 서열을 제작하는 것은 경우의 수가 많고 매우 어렵다.
또한, 상기 핵산 분자의 GC 함량과 mRNA 2차 구조의 자유 에너지를 계산하여 단백질 발현량 등을 예측하였는데, 상기 mRNA 2차 구조의 자유 에너지가 증가하면 구조의 안정성이 낮아져 구조가 쉽게 붕괴되는바, 리보솜에 의한 인식 효율이 증가됨에 따라 단백질 발현율이 증가될 수 있다.
이때, 상기 시그널 펩타이드, 항원, Th 세포 에피토프 등은 다음과 같이 구성하여 핵산 분자를 디자인하였다: 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-3' 또는 5'-[시그널 펩타이드]-[항원]-[Th 세포 에피토프]-3'.
실시예 1-1. 시그널 펩타이드 제작
단백질 발현율이 우수한 백신용 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 시그널 펩타이드(signal peptide, SP)를 제작하였다.
구체적으로, 인간 유래의 IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX, F IX), 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1, MLP1) 등 서로 다른 5종류의 단백질에서 유래한 시그널 펩타이드를 확보하였다. 이들 시그널 펩타이드의 서열을 다양하게 변이시켰으며, 그 중에서 항원 단백질의 발현율이 우수한 서열을 선별하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 3의 핵산 서열은 IgE 유래의 시그널 펩타이드를 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이다.
SP
종류		 SP
코돈		 서열 서열번호
IgE 야생형
(아미노산)		 MDWTWILFLV AAATRVHS 서열번호 1
야생형
(핵산)		 ATGGACTGGACCTGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACGCGAGTCCACTCC 서열번호 2
인간 ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCCGCTACAAGAGTGCACAGC 서열번호 3
효모 ATGGACTGGACTTGGATCTTGTTCTTGGTTGCTGCTGCCACCAGAGTCCACTCT 서열번호 4
알부민 야생형
(아미노산)		 MKWVTFISLL FLFSSAYS 서열번호 5
야생형
(핵산)		 ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCC 서열번호 6
인간 ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGC 서열번호 7
효모 ATGAAGTGGGTTACTTTCATCTCTTTGTTGTTTTTATTCTCCTCTGCTTACTCC 서열번호 8
IFN-γ 야생형
(아미노산)		 MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYC 서열번호 9
야생형
(핵산)		 ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGC 서열번호 10
인간 ATGAAGTACACCAGCTACATCCTGGCCTTCCAGCTGTGCATCGTGCTGGGCTCTCTGGGCTGTTACTGC 서열번호 11
효모 ATGAAGTACACTTCTTACATTTTGGCTTTCCAATTGTGTATCGTTTTGGGTTCCTTAGGTTGTTACTGT 서열번호 12
F IX 야생형
(아미노산)		 MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAEC 서열번호 13
야생형
(핵산)		 ATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGT 서열번호 14
인간 ATGCAGAGAGTGAACATGATCATGGCCGAGTCTCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGAGCGCCGAATGT 서열번호 15
효모 ATGCAAAGAGTTAACATGATTATGGCTGAATCTCCAGGTTTGATCACTATCTGTTTGTTGGGTTACTTGTTATCCGCCGAATGT 서열번호 16
MLP1 야생형
(아미노산)		 MVYKTLFALC ILTAGWRVQS 서열번호 17
야생형
(핵산)		 ATGGTCTACAAGACTCTCTTCGCTCTTTGCATCTTAACTGCAGGATGGAGGGTACAGAGT 서열번호 18
인간 ATGGTGTACAAGACCCTGTTCGCCCTGTGCATCCTGACCGCCGGCTGGAGGGTGCAGAGC 서열번호 19
효모 ATGGTATATAAAACTTTATTTGCTTTATGTATTTTAACTGCTGGTTGGCGTGTACAATCT 서열번호 20
실시예 1-2. 항원 제작
실시예 1-2-1. 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 제작
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 하나의 예시로 COVID-19를 야기하는 바이러스인 'SARS-CoV-2'의 항원을 사용하였다.
구체적으로, 숙주 세포의 수용체 인식, 세포막 융합, 중화항체 유도 등 감염 및 병원성에 중심적인 역할을 수행한다고 알려져 있는 스파이크 단백질(Spike protein, S)을 사용하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 23의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이고, 서열번호 25의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 것과 효모에 대해 코돈 최적화시킨 것을 모두 갖는 형태이다.
항원 종류 항원 코돈 서열번호
SARS-CoV-2
스파이크단백질		 야생형 (아미노산) 서열번호 21
야생형 (핵산) 서열번호 22
인간 서열번호 23
효모 서열번호 24
효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 3569nt 서열번호 25
결과적으로, 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태가 인간 세포에서 바이러스 항원의 발현율이 높고, 목적하는 감염증 예방 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
따라서, 이후의 백신용 핵산 분자의 제조에 사용할 항원으로는 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태인 서열번호 25의 핵산을 사용하였다.
실시예 1-2-2. 'SARS-CoV-2' 막 단백질 제작
바이러스 감염증 또는 암의 예방에 사용될 수 있는 백신 후보물질을 개발하기 위하여, 하나의 예시로 COVID-19를 야기하는 바이러스인 'SARS-CoV-2'의 항원을 사용하였다.
구체적으로, 코로나바이러스의 다양한 변이체 간에 유전자를 비교하였을 때 잘 보존된(conserved) 유전자인 막 단백질(Membrane protein, M)을 사용하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 예를 들어, 서열번호 28의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 막 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이고, 서열번호 30의 핵산 서열은 SARS-CoV-2의 막 단백질 항원을 인간에 대해 코돈 최적화시킨 것과 효모에 대해 코돈 최적화시킨 것을 모두 갖는 형태이다.
항원 종류 항원 코돈 서열번호
SARS-CoV-2
막 단백질		 야생형 (아미노산) 서열번호 26
야생형 (핵산) 서열번호 27
인간 서열번호 28
효모 서열번호 29
효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt 서열번호 30
결과적으로, 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태가 인간 세포에서 항원의 발현율이 높고, 목적하는 감염증 예방 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
따라서, 이후의 백신용 핵산 분자의 제조에 사용할 항원으로는 효모 코돈과 인간 코돈을 모두 갖는 형태인 서열번호 30의 핵산을 사용하였다.
실시예 1-3. 시그널 펩타이드 및 항원의 융합
실시예 1-3-1. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 이용
단백질 발현 효율이 증가된 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 실시예1-1을 통해 확보한 5종의 시그널 펩타이드와 상기 실시예 1-2-1을 통해 확보한 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질을 융합시킨 핵산 분자를 제조하였다.
구체적으로, 상기 스파이크 단백질은 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 형태를 사용하였고, 이는 하기 표 4에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 서열번호
IgE 효모 효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈
3569nt		 서열번호 31
알부민 효모 서열번호 32
IFN-γ 효모 서열번호 33
F IX 효모 서열번호 34
MLP1 효모 서열번호 35
이후, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성하기 위하여, 10X T7 RNA polymerase buffer(다인바이오, 카탈로그 # DYP1647), 2 mM ATP, 2 mM UTP, 2 mM CTP, 2 mM GTP, 3.2 mM Cleancap AG(트라이링크, 카탈로그 # N-7113-10), 5% DMSO(시그마 알드리치 카탈로그 # 472301-500ML), 10 mg/L 항원 (SARS-CoV-2 스파이크 단백질) DNA 전사 주형, 800 U/mL 재조합 RNase 저해 단백질(타카라 카탈로그 # 2316A), 2 U/mL 이스트 무기 피로포스파타아제(써모 싸이언티픽 카탈로그 # EF0221), 2500 U/mL T7 RNA 폴리머라제(다인바이오 카탈로그 # dy1670)을 혼합하였다. 상기 전사반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. mRNA의 합성 여부는 론자 GelStarTM Nucleic Acid gel Stain(카탈로그 #5 0535)을 첨가한 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 진행하여 확인하였다. 한편, 합성한 상기 mRNA를 AKTA(싸이티바, AKTA avant)에서 Oligo(dT) 컬럼(비아 세퍼레이션, 카탈로그 # 311.1219-2)을 사용하여 정제하였고, 이후의 in vitro 또는 in vivo 실험에 사용하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 4,119 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질을 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-3-2. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 막 단백질 이용
단백질 발현 효율이 증가된 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-1을 통해 확보한 4종의 시그널 펩타이드와 상기 실시예 1-2-2를 통해 확보한 SARS-CoV-2 바이러스의 막 단백질을 융합시킨 핵산 분자를 제조하였고, 이는 하기 표 5에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 SARS-CoV-2 막 단백질 서열번호
알부민 야생형 효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt 서열번호 36
효모 서열번호 37
IFN-γ 야생형 서열번호 38
효모 서열번호 39
F IX 야생형 서열번호 40
효모 서열번호 41
MLP1 야생형 서열번호 42
효모 서열번호 43
이후, 상기 실시예 1-3-1에 따른 방법으로, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성한 후 이의 합성 여부를 확인하였으며, 또한 합성된 mRNA를 정제하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 1,107 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질을 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-4. Th 세포 에피토프 제작
세포면역원성 및 이에 따른 면역반응 유도능이 증가된 백신용 핵산 분자를 제조하기 위하여, 먼저 Th 세포 에피토프를 제작하였다.
구체적으로, Th 세포 에피토프는 하나의 예시로 파상풍 톡소이드에서 유래된 Th 세포 에피토프(Tetanus Toxoid Th cell epitope, TTTh)를 사용하였다. 또한, 상기 TTTh는 서로 다른 서열을 갖는 절단 부위(Cleavage site, CS)로 연결되도록 하였다. 상기 절단 부위를 포함하는 Th 세포 에피토프는 종결코돈을 포함시켜 다음과 같이 디자인하여 ORF의 C-말단에 위치하도록 구성하였다: 5'-[CS1]-[TTTh1]-[CS2]-[TTTh2]-[종결 코돈]-3'. 상기 구성에 대응되는 구체적인 아미노산 서열은 다음과 같다: 5'-[RQKR]-[IDKISDVSTIVPYIGPALNI]-[PKKR]-[NNFTVSFWLRVPKVSASHLE]-5'. 이후, 상기 실시예 1-1에 따른 방법으로 코돈 최적화를 수행하였고, 이는 하기 표 6에 정리하였다. 예를 들어, 서열번호 46의 핵산 서열은 TTTh를 인간에 대해 코돈 최적화시킨 형태이다.
Th 세포
에피토프		 Th 세포
에피토프 코돈		 서열 서열번호
야생형
(아미노산)		 RQKRIDKISD VSTIVPYIGP ALNIPKKRNN FTVSFWLRVP KVSASHLE 서열번호 44
야생형
(핵산)		 CGCCAGAAACGCATTGATAAAATTAGCGATGTGAGCACCATTGTGCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTCCGAAAAAACGCAACAACTTTACCGTGAGCTTTTGGCTGCGCGTGCCGAAAGTGAGCGCGAGCCATCTGGAATGA 서열번호 45
인간 AGACAGAAAAGAATCGATAAGATCAGCGACGTGTCTACAATCGTGCCATACATCGGCCCTGCCCTGAATATCCCCAAGAAGCGGAACAACTTCACCGTCAGCTTCTGGCTGAGAGTGCCTAAGGTGTCCGCCAGCCACCTGGAGTGA 서열번호 46
결과적으로, 인간의 코돈을 갖는 형태가 인간 세포에서 Th 세포 에피토프 발현율이 높고, 목적하는 백신 효과 또한 우수한 정도로 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-5. 시그널 펩타이드, 항원 및 Th 세포 에피토프의 융합
실시예 1-5-1. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질 이용
상기 실시예 1-1 내지 1-3 등을 통해, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 시그널 펩타이드는 효모의 코돈을 갖는 형태였으며, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 항원 'SARS-CoV-2' 스파이크 단백질은 효모 및 인간의 코돈을 모두 갖는 형태임을 확인하였다. 이와 같이 확인된 시그널 펩타이드 서열 및 항원 서열에 Th 세포 에피토프 서열을 융합하여 핵산 분자를 제조하였다. 그 서열은 하기 표 7에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 항원 Th 세포
에피토프		 서열번호
IgE 효모 코돈 SARS-CoV-2 스파이크 단백질
(효모의 코돈 250nt 및 인간
의 코돈 3569nt)		 인간 코돈 서열번호 47
알부민 서열번호 48
IFN-γ 서열번호 49
F IX 서열번호 50
MLP1 서열번호 51
이후, 상기 실시예 1-3-1에 따른 방법으로, 상기 핵산 분자를 mRNA로 합성하고, mRNA의 합성 여부를 확인하고, 또한 합성된 mRNA를 정제하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 각 시그널 펩타이드와 항원 단백질이 융합된 핵산 분자 모두는 약 4,119 nt의 크기에서 밴드를 나타냄을 확인하였다. 이는 각 시그널 펩타이드, 항원 단백질 및 Th 세포 에피토프를 모두 포함하는 크기이므로, 본 실시예에서 합성한 백신용 mRNA 핵산 분자는 잘 제조되었으며, 무결성(integrity)이 확보되었음을 확인하였다.
실시예 1-5-2. 항원으로서 'SARS-CoV-2' 막 단백질 이용
상기 실시예 1-1 내지 1-3 등을 통해, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 시그널 펩타이드는 야생형의 코돈을 갖거나 효모의 코돈을 갖는 형태였으며, 단백질 발현율이 높은 것으로 입증된 항원 'SARS-CoV-2' 막 단백질은 효모 및 인간의 코돈을 모두 갖는 형태임을 확인하였다. 이와 같이 확인된 시그널 펩타이드 서열 및 항원 서열에 Th 세포 에피토프 서열을 융합하여 핵산 분자를 제조하였다. 그 서열은 하기 표 8에 정리하였다.
SP 종류 SP 코돈 항원 Th 세포
에피토프		 서열번호
알부민 야생형 SARS-CoV-2 막 단백질 (효모의 코돈 250nt 및 인간의 코돈 419nt) 인간 코돈 서열번호 52
효모 서열번호 53
IFN-γ 야생형 서열번호 54
효모 서열번호 55
F IX 야생형 서열번호 56
효모 서열번호 57
MLP1 야생형 서열번호 58
효모 서열번호 59
실시예 2. 시그널 펩타이드를 포함하는 백신용 핵산 분자의 효과
실시예 2-1. 백신용 핵산 분자의 단백질 발현량 분석
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, in vitro에서 단백질 발현율을 분석하였다. 통상적으로 in vitro에서 고발현 특성을 나타내는 경우, in vivo에서 고면역원성을 나타내며, 이에 따라 백신의 효능이 증가된다고 알려져 있다. 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 모두 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4), 알부민 유래(서열번호 8), 인터페론 감마 유래(서열번호 12), 인자 IX 유래(서열번호 16) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, HEK-293T (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586) 세포를 10% FBS 및 1% Pen/Strep이 포함된 DMEM 배지로 배양하였고, 4 × 105 세포/웰의 HEK-293T 세포에 상기 실시예에 따라 제조한 핵산 분자를 약 0.1 또는 0.05 g/L의 농도로 형질감염시켰다. 이때, 상기 핵산 분자는 전달체로서 지질 나노입자(LNP)에 담지한 형태인 mRNA-LNP로 제제화하여 사용하였다. 형질감염이 완료된 후, 상기 핵산 분자의 세포 내 단백질 발현 및 이에 따른 세포 밖으로의 단백질 분비 정도를 당업계에 알려진 방법에 따라 웨스턴블롯 및 ELISA를 통해 분석하였다. 웨스턴블롯은 상기 형질감염된 세포의 용해물(lysate)에 대하여 1차 항체로서 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 다클론항체(E-AB-V1006, Elabscience)를 사용하고, 2차 항체로는 HRP-접합 이차 항체(goat anti-rabbit IgG; ABclonal)를 사용하여 수행하였다. ELISA는 상기 형질감염된 세포의 배양 배지(media)에 대하여 SARS-CoV-2 스파이크 S1 단백질 ELISA 키트(RK04154, ABclonal)를 사용하여 수행하였다.
한편, 항원으로 사용한 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 서브유닛1(S1) 및 서브유닛 2(S2)로 구성되어 있으며, 세포 감염에 주요 역할을 수행한다고 알려진 RBD (receptor binding domain)는 S1에 위치하고 있다. 웨스턴블롯에 사용한 1차 항체가 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 타겟하는 것인바, 스파이크 전체 단백질(S0, 190 kDa)이 탐지되거나, 또는 스파이크 단백질 중에서도 RBD 도메인이 위치한 서브유닛1(S1, 120 kDa)이 탐지되는지를 확인함으로써 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 발현 및 분비량을 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, IgE, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어짐을 확인하였다.
또한, 도 5a 및 5b에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어지며, 세포 내에서 발현된 단백질이 세포 밖으로 원활히 분비됨을 확인하였다.
또한, 도 5c 및 5d에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하고, 알부민, IFN-γ, 인자 IX 또는 MLP1 유래 시그널 펩타이드를 포함하며, Th 세포 에피토프를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 단백질로의 발현이 잘 이루어짐을 확인하였고, 세포 내에서 발현된 단백질이 세포 밖으로 원활히 분비됨을 확인하였다.
특히, 상기 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자의 경우, 배양 배지에 포함되어 있는 단백질의 양이 세포 용해물에 포함되어 있는 단백질 양보다 많음을 확인하였다. 또한, 상기 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자와 이를 포함하지 않는 핵산 분자와의 단백질 발현양을 비교할 때, 배양 배지에서는 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자의 단백질 양이 더 많았고, 세포 용해물에서는 시그널 펩타이드를 포함하지 않는 핵산 분자의 단백질 양이 더 많음을 확인하였다. 이를 통해 상기 시그널 펩타이드에 의해 스파이크 단백질의 세포 외 분비가 촉진될 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 6a에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 및 IgE 유래 시그널 펩타이드를 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서도 발현이 잘 이루어짐을 확인하였다.
또한, 도 6b에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 핵산 분자는 세포 내에서 발현이 잘 이루어짐에 따라, 상당한 양의 단백질이 세포 밖으로 분비됨을 스파이크 단백질 ELISA를 통해 확인하였다. 서로 다른 농도의 mRNA-LNP stock 시료에 대하여, 0.1 g/L 시료로 형질감염된 세포에서는 약 6.32 ng/mL의 단백질이 발현 및 분비되었고, 0.05 g/L 시료로 형질감염된 세포에서는 약 7.71 ng/mL의 단백질이 발현 및 분비됨으로써 유사한 양의 스파이크 항원 단백질 양임을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성되고, 각 시그널 펩타이드 및 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질을 항원으로 포함하는 본 발명에 따른 핵산 분자는 세포 내에서 높은 효율로 단백질로 발현되며, 특히 발현된 단백질이 세포 밖으로 분비될 수 있으므로, 이와 같이 분비된 항원 단백질은 생체 내 존재하는 다른 면역 세포를 자극하여 세포성 또는 체액성 면역반응을 유도할 수 있다는 점을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 생체 내 투여 시 목적하는 백신 기능을 발휘할 수 있다.
실시예 2-2. 백신용 핵산 분자의 체액성 면역 증강 효과
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 면역효능을 확인하기 위하여, 상기 핵산 분자가 생체 내 투여되는 경우에 항원에 대한 체액성 면역 반응을 야기하여 실제 바이러스 감염증에 대한 예방 효과를 나타내는지 확인하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 실시예 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, 상기 핵산 분자를 mRNA-LNP로 제제화하였고, 이를 6주령 암컷 BALB/c 마우스(6마리)에 4주 간격으로 2회(1차: 프라임, 2차: 부스트)에 걸쳐 허벅지 상부에 근육 주사한 후 3주차에 희생시켰다. 이때, 상기 핵산 분자는 1, 5 또는 10 ㎍/개체의 농도로 주사하였다. 대조군으로는 PBS를 주사하였다.
이후, 상기 면역화된 마우스의 혈청에서 항원으로서 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 특이적 결합항체 또는 중화항체의 수준을 ELISA 또는 PRNT (Plaque Reduction Neutralizing Test) 어세이를 통해 측정하였다. ELISA를 위한 1차 항체로는 항-마우스 IgG1-(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 항체 또는 항-마우스 IgG2a-(Novus, Centennial, CO, USA) 항체를 사용하였다.
또한, 상기 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리하였고, 상기 비장세포에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드를 2 mg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 각 특이적 항체로 면역염색하여 유세포분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7 내지 9b에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자의 접종 후에는 마우스에서 RBD 또는 스파이크 전체 단백질에 대한 결합항체가 높은 수준으로 생성됨을 확인하였다. 또한, 생성되는 결합항체 및 중화항체의 양은 상기 핵산 분자에 대하여 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고(도 7 내지 9b), 1차 접종에 비하여 2차 접종 후 생성되는 중화항체의 양은 약 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 9a 및 도 9b).
또한, 도 10에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 10 ㎍/개체의 농도로 마우스에 접종되는 경우, 배중심(germinal center, GC)에 존재하는 B 세포(GC B 세포, GL7+ CD19+ 세포)의 수가 접종되지 않은 마우스에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였다. 배중심 (GC)에서는 기억 B 세포 및 수명이 긴 형질 세포(plasma cell)를 생성하기 위하여, 여포 보조 T 세포(TFH 세포)라고 불리는 CD4+ T 세포와 B 세포가 상호작용한다. 이러한 GC B 세포와 TFH 세포 사이의 상호작용은 각 세포 유형의 생존, 증식 및 분화에 영향을 미친다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3. 백신용 핵산 분자의 세포성 면역 증강 효과
실시예 2-3-1. T 세포 증가
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 면역효능을 확인하기 위하여, 상기 핵산 분자가 생체 내 투여되는 경우에 항원에 대한 세포성 면역 반응을 야기하여 실제 바이러스 감염증에 대한 예방 효과를 나타내는지 확인하였다. 세포성 면역반응의 일종으로서, 효과 기억 T 세포 및 중추 기억 T 세포 등의 T 세포의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 효과기 기억 T 세포는 병원체 진입 부위에서 즉각적이지만 지속되지는 않는 방어를 제공하며, 중추 기억 T 세포는 2차 림프 기관에서 증식하여 새로운 효과기 세포를 생성함으로써 면역 반응을 유지한다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4)의 것을 사용하여 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2 및 2-3에 따른 방법으로, mRNA-LNP 제제로 구성된 본 발명에 따른 핵산 분자를 마우스에 주사하였고, 상기 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리한 후 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드(peptide pool 2)를 2 mg/ml의 농도로 처리한 후 유세포분석을 수행하였다. CD4+ 중추 기억 T 세포(CD4+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포), CD8+ 중추 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L+ 세포), CD8+ 효과기(effector) 기억 T 세포(CD8+ 세포 중 CD44high+ 및 CD62L- 세포)의 비율을 분석하였다.
그 결과, 도 11 내지 13에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 및 CD8+ 작용 기억 T 세포 등의 세포성 면역에 기여하는 세포 집단의 비율이 접종되지 않은 마우스에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3-2. IFN-γ 분비 세포 증가
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, 세포성 면역반응의 일종으로서, IFN-γ 분비 세포의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. IFN-γ는 선천성 항바이러스 반응을 담당하는 중요한 구성요소이며, 주로 NK 세포 또는 선천성 림프구 타입 1 세포에 의해 생성된다. 이러한 면역세포에 의한 IFN-γ 생성이 이루어지지 않는 경우, 생체 내에서 바이러스 복제가 증가하게 된다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1 또는 실시예 1-5-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4) 또는 MLP1 유래(서열번호 20)의 것을 사용하였고, Th 세포 에피토프로는 인간 코돈으로 최적화된 것(서열번호 46)을 사용하여 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2에 따라 면역화된 마우스에서 비장세포를 분리하였고, 상기 비장세포에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질 유래 펩타이드(peptide pool 2)를 2 mg/ml의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 IFN-γ 분비 세포를 ELISpot basic 키트(Mabtech, Nacka Strand, Sweden)를 사용하여 검출하였다.
그 결과, 도 14 및 15에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, IFN-γ 분비 세포의 수는 접종되지 않은 마우스에 비하여 현저히 증가함을 확인하였다(도 14). 또한, 상기 세포에 의한 IFN-γ의 활성도 약 3000배 이상 현저히 증가함을 확인하였다(도 15).
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3-3. 플라크 감소 중화 역가(PRNT) 분석
상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자의 효능을 확인하기 위하여, 세포성 면역반응의 일종으로서, 기억 T세포에 의한 중화 항체의 생성을 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 플라크 감소 중화 역가(PRNT) 분석은 바이러스에 대한 바이러스 중화 및 보호 항체를 측정하고, 백신의 면역원성을 평가하는데 있어 널리 인정되는 접근 방식이다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 핵산 분자 중에서도, 실시예 1-3-1에서 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 항원으로는 효모 코돈 및 인간 코돈을 모두 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 전체 단백질(서열번호 21)을 사용하였고, 시그널 펩타이드로는 효모 코돈으로 최적화된 것으로서, IgE 유래(서열번호 4)의 것을 사용하여 제조한 핵산 분자에 대한 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2에 따라 면역화된 마우스에서 분리한 혈청에 SARS-CoV-2 바이러스 (NCCP 43326, S-type)를 4.5x102 PFU/ml의 농도로 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 혈청-바이러스 배양물을 Vero E6 세포(ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1586)에 첨가하여 1시간 동안 배양함으로써 상기 세포를 바이러스에 감염시켰고, 당업계에 알려진 방법에 따라 PRNT를 분석 어세이를 수행하였다. PRNT 역가는 Karber 방법을 사용하여 계산하였고, 중화 용량 ND50으로 표시하였다(log10ND50 = m - Δ(∑- 0.5), 여기서 m은 최고 희석의 log10을 나타내고, Δ는 희석 계수의 log10을 나타내고, ∑는 바이러스-혈청 접종물/바이러스 통제에 의해 생성된 플라크의 평균 수를 나타냄).
Figure pat00001
그 결과, 상기 표 9에서 볼 수 있듯이, 상기 핵산 분자가 마우스에 접종되는 경우, 1차 접종 후에는 중화 항체의 생성양이 대조군과 유사한 수준이었으나, 2차 접종 후에는 중화 항체 생성양이 현저하게 증가함을 확인하였다. 이러한 효과는 개체 당 5 또는 10 ㎍이 투여된 경우 특히 우수함을 확인하였다.
상기 결과는, mRNA-LNP 제제로 구성된 상기 핵산 분자는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이에 따라 SARS-CoV-2 바이러스 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.
<110> ST Pharm Co., Ltd. <120> NOVEL NUCLEIC ACID MOLECULE <130> DP22240KR <150> KR 10-2021-0017115 <151> 2021-02-05 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 2 <211> 54 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggactgga cctggatcct cttcttggtg gcagcagcca cgcgagtcca ctcc 54 <210> 3 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE SP <400> 3 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgccgcta caagagtgca cagc 54 <210> 4 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE SP <400> 4 atggactgga cttggatctt gttcttggtt gctgctgcca ccagagtcca ctct 54 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 6 <211> 54 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcc 54 <210> 7 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S <400> 23 atgttcgtgt tcttggtgct gctgcctctg gtctccagcc agtgcgtgaa tctgaccacc 60 agaacccaac tgcctcctgc ctacaccaac agcttcacaa gaggcgtgta ctaccccgac 120 aaggtgttcc ggagtagcgt gctgcacagc acgcaggacc tgttcctgcc atttttctct 180 aatgtgacct ggtttcacgc catccacgtg tccggcacaa acggcacaaa gcggttcgac 240 aaccccgtgc tgccattcaa cgatggcgtg tacttcgcct ctacagaaaa gtccaatatc 300 attaggggct ggatcttcgg aacaacgctg gactcaaaga cccagagcct gctgatcgtc 360 aataacgcca caaatgtggt cattaaagtg tgcgaattcc agttctgcaa cgaccccttc 420 ctgggcgtct actatcataa gaacaacaag tcttggatgg aaagcgagtt ccgggtgtac 480 agcagcgcta acaactgcac cttcgagtac gtttcccaac ctttcctgat ggacctggaa 540 ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgaga gaattcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600 ttcaagatct acagcaagca cacccccatc aacctggtac gagatctgcc ccagggcttc 660 tctgccctcg agcccctcgt ggacctgccc attggaatca acatcacgcg gttccagacc 720 ctgctcgccc tgcatagaag ctacctcact cccggcgatt ctagcagcgg ctggacagcc 780 ggcgctgccg cttactacgt gggctacctg 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Claims (16)

  1. IgE(Immunoglobulin E), 알부민(albumin), 인터페론 감마(IFN-γ), 인자 IX(factor IX) 및 뮤신-유사 단백질 1(mucin-like protein 1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산; 및 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시그널 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 서열번호 2 내지 4, 6 내지 8, 10 내지 12, 14 내지 16, 및 18 내지 20으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항원은 코로나바이러스, 종양바이러스(oncovirus), 종양-특이적 항원(cancer tumor-specific antigen), 종양-연관 항원(tumor-associated antigen) 및 신항원 에피토프(neoantigen epitope)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항원은 코로나바이러스 유래의 스파이크 단백질 및 막 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항원을 인코딩하는 핵산은 서열번호 22 내지 25, 및 27 내지 30으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid), 디프테리아 톡소이드(DTH toxoid) 및 백일해 톡소이드(Purtussis toxoid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프를 인코딩하는 핵산은 서열번호 45 및 46으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 감염증은 코로나바이러스 감염증인, 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 코로나바이러스 감염증은 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS) 및 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease-2019, COVID-19)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 암은 고형암종 및 혈액암종으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 신장암, 소장암, 췌장암, 뇌종양, 골암, 피부암, 표피암종, 편평세포암종, 유방암, 경화성선증, 두경부암, 식도암, 인두암, 갑상선암, 부갑상선암, 신경 모세포종, 흑색종, 육종, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음암, 요도암, 방광암, 음경암, 고환암, 혈액암, 혈관육종, 백혈병, 림프종, 섬유선종, 및 이들의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 핵산 분자.
  13. 제1항의 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 감염증 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 전달체에 담지 또는 연결된 것인, 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 전달체는 리포좀 기반 전달체, 지질 기반 전달체, 폴리머 기반 전달체 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 전달체는 리포좀(liposome), 파이토좀(phytosome), 에토좀(ethosome), 지질 나노입자(lipid nanoparticle), 지질-유사 나노입자(lipid-like nanoparticle), 지질 에멀젼(lipid emulsion), 리포플렉스(lipoplex), 지질 미셸(lipid micelle), 폴리머좀(polymersome), 폴리머성 나노입자(polymeric nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 나노스피어(nanophere), 폴리플렉스(polyplex), 폴리머성 미셸(polymeric micelle), 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(lipid-polymer hybrid nanoparticle), 양이온성 나노에멀젼(cationic nanoemulsion), 음이온성 나노에멀젼(anionic nanoemulsion) 및 리포폴리플렉스(lipopolyplex)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 백신 조성물.
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