KR100768051B1 - 간염 바이러스 ｏｒｆ2의 ｎ-말단 영역으로부터 유래한프로세싱 성분 및 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산구성물 - Google Patents

간염 바이러스 ｏｒｆ2의 ｎ-말단 영역으로부터 유래한프로세싱 성분 및 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산구성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 백신에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 동물에게 프로세싱 성분과 소정의 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 폴리펩티드의 불균질 프로세싱을 제공하고, 결과적으로 면역 반응이 증강된다. 상기 프로세싱 성분은 E형 간염 바이러스의 PORF2의 N-말단 부분으로부터 유래한 것이다.

Description

간염 바이러스 ＯＲＦ2의 Ｎ-말단 영역으로부터 유래한 프로세싱 성분 및 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 구성물{A NUCLEIC ACID CONSTRUCT ENCODING A PROCESSING COMPONENT DERIVED FROM THE N-TERMINAL REGION OF THE HEPATITIS VIRUS ORF2, AND AN ANTIGENIC POLYPEPTIDE}
본 발명은 일반적으로 핵산 백신에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 소정의 항원성 폴리펩티드 및 항체 및/또는 상기 소정의 항원성 폴리펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 증강시키는 프로세싱 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 핵산 구성물에 관한 것이다. 본 발명은 항원에 대한 면역 반응의 조절을 위한 광범위한 방법, 구성물 및 벡터의 디자인과 개발 및 암, 자가면역질환 또는 인간을 포함하는 동물과 다른 포유동물, 어류와 조류에서 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 기생충 감염(이로 제한되는 것은 아님)의 진단, 치료 및/또는 예방에 특히 유용하다.
일반 사항
당업자는 본원에 기술된 발명을 변경하거나 변형하여 실시할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 발명은 이러한 모든 변형 실시 및 변경 실시를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 개시한 것 또는 개시한 것 과 관련이 있는 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 총체적으로 포함하며, 이러한 단계 또는 특징중 임의의 2가지 이상의 임의 조합 및 모든 조합을 포함한다.
본원 명세서 전체를 통해 문맥상 특별이 언급하지 않으면 용어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변형어, 예를 들어 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들로 이루어진 군을 포함하는 의미이나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들로 이루어진 군을 배제하는 의미는 아니다. 본 발명은 본원에 개시된 특정 구체예로 한정되는 것은 아니며, 본원의 개시는 단지 예시를 목적으로 한 것임을 밝혀둔다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기술한 바와 같이 본 발명의 범위내에 포함되는 것이 명백하다.
본 명세서에 저자에 의해 언급된 문헌들의 서지적 사항들은 본 명세서의 말미에 일괄하여 제시하였다. 임의의 하나 이상의 종래 문헌을 포함하는 종래 기술에 대한 참고 문헌은 지식이나 제안으로서 고려한 것은 아니고, 상기 종래 기술은 통상적인 일반 지식 또는 통상적인 일반 지식의 일부를 구성하는 것일 뿐이다.
본원에 사용한 용어 "∼로부터 유래한(derived from)"은 특정 정수 또는 정수들로 이루어진 군이 특정 종으로부터 기원한 것을 의미하는 것이나, 기술된 특정 종으로부터 필요적으로 직접 유래하여야 한다는 의미까지 내포하고 있는 것은 아니다.
본 명세서는 청구의 범위 말미에 첨부한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정 보를 포함하고 있는데, 이는 PatentIn 3.0으로 작성한 것이다. 각각의 서열은 서열 목록에서 숫자 기호 <210> 뒤의 서열 번호[예를 들어, <210>1, <210>2 등]를 통해 확인할 수 있다. 각 서열의 길이, 형태[DNA, 단백질(PRT) 등] 및 기원하는 생물명은 각각 <211>, <212> 및 <213> 부분에 기재하였다. 본 명세서에 언급한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 "서열 번호"라는 항목 뒤의 숫자로 표시[예를 들어, 서열 번호 1: 서열 목록에서는 <400>1로 표시됨]된 항목에 기재하였다.
본원에 언급한 뉴클레오티드 잔기의 명칭은 IUPAC-ICB 생화학적 명명 위원회의 추천에 따라 명명하였으며, 이때 A는 아데닌, C는 시토신, G 구아닌, T는 티미딘, Y는 피리미딘 잔기, R은 퓨린 잔기, M은 아데닌 또는 시토신, K는 구아닌 또는 티미딘, S는 구아닌 또는 시토신, W는 아데닌 또는 티미딘, H는 구아닌 이외의 뉴클레오티드, B는 아데닌 이외의 뉴클레오티드, V는 티미딘 이외의 뉴클레오티드, D는 시토신 이외의 뉴클레오티드 및 N은 임의의 뉴클레오티드 잔기를 의미한다.
발명의 배경
"핵산 백신"은 DNA(플라스미드) 또는 자가복제성 서브게놈 바이러스 핵산(바이러스성 리플리콘)중 어느 하나를 투여함으로써 수용체의 세포 내에서 표적(백신) 단백질의 합성을 유도하는데 사용하는 기법을 반영하는 일반적인 용어이다.
핵산 백신 및 구체적으로 단백질 자체 보다 오히려 단백질 항원을 암호화하는 플라스미드 DNA가 투여되는 경우의 DNA 백신에 대해 전세계적으로 연구가 집중되었는데, 그 이유는 나(裸) DNA가 생체 내에서 항원 합성을 유도할 수 있어, 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다(Wolff 등, 1990). 핵산 백신의 사용에 따른 두가지 매우 중요한 잇점은 (a) 수용체 세포 내에서 단백질의 발현 이후, 면역 시스템에 천연 에피토프가 제시된다는 것과 (b) 종래 백신에서 필요로 하였던 저온 유통 체계(cold c프레임in)의 부재 하에서 이용할 수 있고, 연합 백신을 위해 특히 유용할 것으로 생각되는 화학적 균질성, 제조의 용이성 및 핵산의 안정성을 들 수 있다.
대다수의 효과적인 "전통적인" 백신은 자기제한적인 급성 감염에서 유도되며, 상응하는 감염으로부터 회복된 것 및 상응하는 감염에 대한 면역성을 의태하는 면역 반응을 유발한다. 즉, 이들은 천연 형태(들)로 제시된 감염성 제제로부터의 항원에 대한 정상적인 면역 반응에 의존한다. 핵산 백신은 이러한 시스템에서 전략적인 잇점을 보유한다. 과거에, 이는 일반적으로 (i) 살아있는 약독화된 백신 유기체(예를 들어, 사빈 폴리오 백신); (ii) 후속적으로 불활성화되는 야생형 유기체(또는 박테리아 독소)(예를 들어, 솔크 폴리오 백신), 또는 (iii) 재조합 DNA 기법을 이용한 천연 항원의 제조(예를 들어, 서브유닛 B형 간염 백신))중 하나를 이용하여 획득하여 왔다. 본 명세서에서, DNA 백신은 큰 장점을 보유하고 있는데, 이는 표적 항원이 수용체 세포 내에서 천연 형태로 합성된다는 것이다. 또한, 실제로 이는 바이러스성 리플리콘계 전달 시스템이다(예를 들어, 쿤진(Kunjin) 리플리콘 시스템(Khromykh 등, 1997; Varnavski 등, 1999; Varnavski 등, 2000). 그러나, 항원을 암호화하는 DNA 백신에 대한 항체는 너무 적거나 검출할 수 없는 상황이 자주 발생한다.
정상적인 면역 반응이 감염을 해소하지 못하는 감염에 대한 예방적 백신 및 치료적 백신의 개발에 대해서는 거의 진보가 이루어지지 않았다. 감염을 해소하지 못하는 HCV 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 제제에 있어서, 감염이 정상적인 경우, 관련 항원에 대해 정상적인 면역 반응을 유도할 수 있는 백신은 거의 유용성이 없다. 또한, 실제로 종양-특이성 항원은 보통 "자기"로 인식되며, 따라서 정상적인 면역 반응은 관용의 하나이다. 그들의 많은 잠재적인 잇점에도 불구하고, 표준 DNA 또는 리플리콘 백신은 이러한 경우에는 비효과적인데, 그들이 천연 형태의 항원을 암호화하기 때문이라는 것이 정확한 이유이다.
여러가지 방법을 사용하여 DNA 백신에 대한 면역 반응을 조절하여 왔는데, 사용된 방법의 예로는 (i) 시토킨 또는 시토킨-암호화 플라스미드의 동시 전달; (ii) 박테리아(및 플라스미드) DNA에서 통상 발견되는 CpG 디뉴클레오티드의 면역자극성 역할(Hemmi 등, 2000); 및 (iii) 폭스바이러스 벡터와 함께 DNA 백신을 이용하는 프라임-부스트 프로토콜(prime-boost protocol)을 들 수 있다.
항원 표적화를 위한 기존의 방법으로는 (a) 폴리유비퀴틴화, 프로테아좀 내에서의 급속 세포내 분해 및 효율적인 MHC-I 제시를 위한 단백질을 표적화하기 위한 유비퀴틴 융합(유비퀴틴-A76 또는 유비퀴틴-G76-K); (b) MHC-II 경로를 표적화하기 위한 라이소좀 결합된 막 단백질 1(LAMP-1)에 대한 융합; (c) 소포체(ER)에 에피토프를 표적화하기 위한 아데노바이러스 E3 리더 서열에 대한 융합; (d) 분비용 에피토프를 표적화하고, 프로 항원 제시 세포(APC)에 의해 흡수하기 위한 CTLA4에 대한 융합을 들 수 있다.
그러나, 다수의 DNA 백신의 효능은 불량하였으며(Gurunat프레임n S 등, 2000), 회복 또는 보호를 유발하는 DNA 백신에 의해 발현된 단백질에 대한 면역 반응을 조절하는 개선된 기법 및 분자의 개발에 대한 요구가 존재하고 있다.
발명의 개요
본 발명을 완성하기 위한 작업중에, 본 발명자들은 E형 간염 바이러스(HEV)의 전장 캡시드 단백질 PORF2가 포유류 세포 내에서 발현되는 경우, 새롭게 합성된 단백질의 약 80%가 소포체에 전위되고, 급속하게 분해되는 반면, 나머지 20%는 세포질(4) 내에서 손상되지 않은 형태로 축적되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따라, 본 발명자들은 불균질 폴리펩티드 프로세싱을 허용하는 HEV의 PROF2의 N-말단 펩티드 서열("프로세싱 펩티드" 또는 "프로세싱 성분")을 동정하였으며, 이러한 프로세싱 펩티드 서열을 이용하여 소정의 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 개발하였다.
본 발명자들은 동물 세포 내에서 HEV의 PORF2.1 항원성 폴리펩티드 단편을 발현하였는데, 융합 단백질(ORF2.1) 또는 HEV의 PORF2의 N-말단에서 유래한 서열과의 융합 단백질; PORF2의 아미노산 1 내지 22를 보유하는 sig1-PORF2.1, PORF2의 아미노산 1 내지 36을 보유하는 Sig2-PORF2.1 또는 PORF2의 아미노산 1 내지 50을 보유하는 Sig3-PORF2.1 없이, ORF2.1 단편을 암호화하는 일련의 발현 벡터를 이용하였다. 본 발명자들은 ORF2.1 단백질이 가용성 세포질 분획 내에서 거의 배타적으로 확인되는 반면, Sig1 펩티드는 막 분획에 대해 거의 배타적으로 유도되는 한편, Sig2 및 Sig3 펩티드는 분균질 국소화를 부여하는 것을 확인하였다. 또한, Sig2-ORF2.1 및 Sig3-ORF2.1 폴레펩티드의 경우, 세포질 결합 단백질은 안정한 것으로 확인된 반면, 막 결합 단백질은 혼합 면역 반응(각각 항체와 CTL 반응)의 생성에 부합하여 분해되었다.
이러한 발견에 대한 광범위한 일반성은 ORF2의 N-말단 서열(Sig1, Sig2 및 Sig3)이 글루타치온-S-트랜스퍼라제에 융합되는 경우에 확인되었으며, 동일한 방식으로 불균질하게 프로세싱되는 것으로 확인되었다(즉, 국소화 및 프로세싱).
개질되지 않은 단백질과 비교하여 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 프로세싱 펩티드의 능력은 PORF2.1에 대한 항체 반응을 측정할 수 있는 래트 모델에서 테스트하였다. Sig1-ORF2.1 및 Sig3-ORF2.1은 증강된 항체 반응을 유도하였으며, Sig3-ORF2.1의 경우, MHC-I 경로 제시 및 세포성 면역 반응의 유도를 선호하는 전위된 분획의 대부분은 급속히 분해되었다.
따라서, 본 발명의 한 관점은, 동물에서 소정의 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에게 프로세싱 성분 및 상기 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구성물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 프로세싱 성분은, 상기 핵산 구성물이 숙주 내에서 발현되는 경우, 상기 항원성 폴리펩티드의 불균질 프로세싱을 제공하여, 결과적으로 상기 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시킨다.
본 발명의 다른 관점은, 분리된 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우, 숙주 내에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 조절할 수 있는 프로세싱 펩티드를 암화화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 관점은, 분리된 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우, 소정의 항원성 폴리펩티드의 불균질 프로세싱을 제공하는 프로세싱 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 분리된 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우, 숙주 내에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 프로세싱 펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하는데, 이때 상기 프로세싱 펩티드는 E형 간염 바이러스의 ORF2 뉴클레오티드 서열의 N-말단 영역의 인접하는 뉴클레오티드의 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체에 의해 암호화된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 분리된 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우, 숙주 내에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 조절할 수 있는 프로세싱 펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하는데, 이때 상기 프로세싱 펩티드는 E형 간염 바이러스의 PORF2 단백질의 N-말단 영역으로부터 선택된 약 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 실질적으로 서열 번호 4 또는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 E형 간염 바이러스의 PORF2 단백질의 N-말단 영역으로부터 선택된 약 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
본원에 기술한 분리된 폴리펩티드는 실질적으로 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 보유하는 것이 바람직하다.
추가의 관점에서, 본 발명은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 프로세싱 성분은, 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 항원성 성분의 불균질 프로세싱을 제공하고, 결과적으로 숙주 내에서 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 증강시킨다.
다른 관련된 관점에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 숙주 내에서 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있으며, 신호 서열, 및 필요에 따라 불균질 세포내 프로세싱을 수행할 수 있는 단백질의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중간체 펩티드를 포함한다.
본원에 기술한 바와 같은 상기 프로세싱 성분은 신호 서열, 및 불균질 세포내 프로세싱을 수행할 수 있는 단백질의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중간체 펩티드 둘 다를 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있으며, 상기 프로세싱 성분은 신호 서열, 및 필요에 따라 E형 간염 바이러스의 주 구조 단백질(PORF2)의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 중간체 펩티드를 포함한다.
본원에 기술한 바와 같은 프로세싱 성분은 신호 서열, 및 E형 간염 바이러스의 주 구조 단백질(PORF2)의 N-말단 영역으로부터 유래한 중간체 펩티드 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체 둘 다를 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 숙주 내에서 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절할 수 있고, E형 간염 바이러스의 주 구조 단백질(PORF2)의 N-말단 영역으로부터 선택된 약 5 내지 100개의 인접하는 아미노산의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 관점에서, 상기 융합 단백질의 프로세싱 성분은 실질적으로 PORF2의 N-말단 영역의 아미노산 1 내지 22, 1 내지 36 또는 1 내지 50에 각각 상응하는 실질적으로 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 E형 간염 바이러스의 ORF2 유전자의 5' 영역에 의해 암호화된 프로세싱 성분 및 항원성 성분을 포함하며, 이때 상기 프로세싱 성분은, 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 숙주 내에서 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물, 예를 들어 바이러스성 리플리콘 또는 DNA 분자를 포함하는 백신을 제공한다.
관련된 관점에서, 본 발명은 세포, 예를 들어 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물로 형질감염된 항원 제시 세포를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 동물에서 면역 반응을 증강시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 동물에서 소정의 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에게 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물, 또는 백신 또는 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물을 암호화하거나 포함하는 세포의 유효량을, 상기 항원에 대한 면역 반응을 조절하기에 충분한 시간과 조건 하에서 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 인간 및 다른 포유류, 어류 또는 조류를 포함하는 동물에서 암 또는 예비 암적 질환, 자가면역질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염 또는 기생충 감염(이로 제한되는 것은 아님)을 포함하는 질환 또는 감염의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의, 본원에 기술한 바와 같은 핵산 분자 또는 구성물의 용도에 까지 확장된다.
도 1은 E형 간염 바이러스의 전장 PORF2 단백질에 대한 sig1, sig2 및 sig3펩티드의 지도 및 관련 단백질의 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 도면으로부터 명백히 확인할 수 있는 바와 같이, 이들 예에서 중간 크기의 단백질은 유사한 유용성을 보유하고 있는 것으로 생각된다.
도 2는 세포의 세포질-결합(c) 또는 막-결합(m) 분획으로의 암호화된 단백질의 차등 국소화를 나타내는 방사능 표지된 ORF2.1 및 sig1-2.1, sig2-2.1 및 sig3-2.1의 면역침전 및 PAGE 분석 결과를 나타내는 도면이다. 주목할 것은 ORF2.1 및 sig1-2.1은 균질한 국소화를 나타내는 반면, sig2-2.1 및 sig3-2.1은 불균질 국소화를 나타낸다는 것이다. 또 주목해야 하는 것은 이동 속도가 상이한 다수의 밴드는 막 분획에 전이되는 이들 단백질의 부분 글리코실화에 기인한다는 것이다.
도 3은 (도 2에 나타낸 바와 같은) 세포의 세포질-결합(c) 또는 막-결합(m) 분획으로의 암호화된 단백질의 차등 국소화를 나타내는 방사능 표지된 ORF2.1 및 sig1-2.1, sig2-2.1 및 sig3-2.1의 면역침전 및 PAGE 분석 결과를 나타내는 도면이며, 아울러 표지시킨 후 0시간, 1시간 또는 4시간에서 각각의 단백질 종의 차등 안정성도 나타내고 있다. 주목해야 할 점은 ORF2.1 및 sig1-2.1은 균질한 프로세싱을 나타내는 반면(각각, 4시간 후에 분해되거나 안정함), sig2-2.1 및 sig3-2.1은 불균질 프로세싱(안정하고 분해됨)을 나타낸다는 것인데, 이는 그들의 불균질 국소화(각각, cyto 및 memb)에 부합되는 것이다.
도 4는 세포의 세포질(c) 또는 막-결합(m) 분획으로의 암호화된 단백질의 차등 국소화를 나타내는 방사능 표지된 sig1-GST, sig2-GST 및 sig3-GST의 면역침전 및 PAGE 분석 결과를 나타내는 도면이며, 아울러 표지시킨 후 0시간 또는 3시간에서 각각의 단백질 종의 차등 안정성도 나타내고 있다. 주목해야 할 점은 sig1-GST는 불균질 국소화(cyto+memb), 그러나 균질 프로세싱(안정함)을 나타내는 반면, sig2-GST 및 sig3-GST는 불균질 국소화(cyto+memb), 그러나 불균질 프로세싱(안정하고 분해됨)을 나타낸다는 점이다.
도 5는 동물 또는 사람에서 핵산 또는 바이러스 벡터계 백신에 대한 면역 반응을 모식적으로 나타낸 도면이다. (A) 항원성 단백질에 대한 면역 반응의 일반적인 패턴은 세포내 프로세싱 및 국소화에 의존한다. 주목해야 할 것은 대부분의 개개의 단백질 종은 도시한 4가지 경로중 하나의 경로를 따를 것이라는 점이다. (B) 면역 반응 패턴의 조절은 소정의 항원에 대해 융합된 sig 펩티드의 용도로부터 예측하였다. 사용된 예에서, HEV의 ORF2.1 항원은 표적 항원이며, 선형 B-세포 에피토프 및 형태적 B-세포 에피토프를 포함할 뿐만 아니라 T-세포 에피토프도 포함하는 것으로 생각되며, 백신은 ORF2.1, sig1-2.1 또는 sig3-2.1, 또는 유비퀴틴-2.1 을 암호화하는 플라스미드계 DNA 백신이어서 급속 분해된 생성물(참고문헌 8 및 9)을 산출한다. 예상된 면역 반응 경로는 상이한 백신을 수용하는 동물에서도 확인되었다. 주목해야 할 것은 sig3-2.1의 불균질 국소화 및 프로세싱은 체액성(항체) 및 세포성 면역 반응 둘다를 활성화시키는 데 독특한 것이며, 면역 반응의 2개의 축 사이에서 양성 피드백이 일어날 가능성을 높여준다는 점이다. 약어; Ab, linear: 선형 펩티드 에피토프에 대한 항체. Ab, conform.: 형태적 펩티드 에피토프에 대한 항체. CTL: 세포성 면역 반응.
도 6은 여러가지 DNA 백신 구성물(vec; 벡터 단독; ORF2.1 단독, Ub.2.1; 유비퀴틴-A76-ORF2.1, sig1.2.1; Sig1-ORF2.1, sig3.2.1; Sig3-ORF2.1)로 면역화한 래트에서 HEV ORF2.1에 대한 항체의 발생을 나타내는 그래프이다. 0주, 4주 및 8주에서 염수중의 100 ㎍ DNA를 근육내 주사하여 1군당 2마리의 래트를 면역화하였으며, 제시된 시간에서의 항체 반응은 ORF2.1 ELISA를 이용하여 측정하였다(Anderson 등, 1999).
도 7은 DNA 백신 구성물로 면역화한 래트에서 HEV ORF2.1에 대한 항체의 발생을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타내는 도면이다. Sig1-ORF2.1 또는 Sig3-ORF2.1로 면역화한 래트로부터 얻은 항체는 문헌[참조: Riddel 등(2000)]에 기술된 바와 같이 전장 ORF2 단백질의 여러 가지 단편에 대한 웨스턴 면역 블로팅에 의해 테스트하였다. 주목해야 할 점은 Sig1-ORF2.1 DNA 백신은 형태적 ORF2.1 에피토프에 대해 항체를 유도한 반면, Sig3-ORF2.1 DNA 백신은 형태적 ORF2.1 에피토프 뿐만 아니라 선형 에피토프에 대해서도 고 수준으로 항체를 유도한 것이었는데, 이는 NHC-II 경 로를 통해 손상되지 않은 항원과 분해되지 않은 항원 둘 다의 제시에 부합되는 것이다.
서열 서열 번호
HEV의 PORF2의 아미노산 서열 Sig1 1
HEV의 PORF2의 아미노산 서열 Sig2 2
HEV의 PORF2의 아미노산 서열 Sig3 3
HEV의 ORF2의 핵산 서열 Sig1 4
HEV의 ORF2의 핵산 서열 Sig2 5
HEV의 ORF2의 핵산 서열 Sig3 6

바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로 E형 간염 바이러스의 PROF2 캡시드 단백질의 N-말단 펩티드의 동정에 기초하는데, 상기 단백질은 불균질 단백질에 융합된 이들 펩티드중 하나를 포함하는 융합 단백질에 특이 패턴의 세포내 단백질 프로세싱을 부여한다. 안정한 발현 벡터를 생성하고, 클로닝 전략을 수립하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이 방식으로, DNA 백신-암호화된 항원은 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응 둘 다의 자극을 위해 동시에 프로세싱될 수 있다.
임의의 항원성 펩티드 또는 소정의 폴레펩티드에 융합된 본 발명의 프로세싱 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 구성물은, 이 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 소정의 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 조절할 것으로 생각된다.
핵산 백신에 대한 최근의 연구 결과, 세포성 면역 반응은 유비퀴틴에 대한 융합에 의해 획득된, 프로테오좀 경로를 통한 단백질의 급속 분해에 의해 증강되는 반면, 이러한 분해는 동일한 단백질에 대한 항체(체액성) 면역 반응을 대부분 폐기한다(8 및 9). 유사하게, 상이한 면역 반응은 세포 결합을 유지하기 위해 표적화되거나 세포로부터 분비된 동일한 항원성 단백질의 발현에 의해 유발된다. 따라서, 핵산 백신에 대한 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응은 항원의 세포내 단백질 프로세싱 패턴에 민감하다. 대부분의 경우, 면역 경로의 2가지 축은 모두 백신의 보호적 효능을 필요로 하며, 균형을 이룬 반응은 특정 항원 단백질의 차등 프로세싱을 필요로할 수 있다.
단백질 항원이 세포 내에서 발현되는 경우, 그들의 세포내 프로세싱은 일반적으로 균질하다. 즉, 단백질의 모든 사본은 동일한 방식으로, 예를 들어 소포체 내로의 전위, 이어서 세포 표면 발현 또는 분비, 또는 세포질 내에서의 체류 또는 대안으로 프로테아좀 내에서 분해를 위한 표적화 또는 기타 분해 경로에 의해 본질적으로 동일하게 프로세싱될 것이다. 그 결과, 핵산 백신의 투여후 단백질의 발현은 특정 단백질의 프로세싱 경로에 따라 세포성 경로 또는 체액성 경로 어느 한 쪽으로 면역 반응이 편향된다.
다수의 질병에서, 체액성 면역성 또는 세포성 면역성 중 어느 것이 질병의 보호 또는 치료 효과를 더 제공할 것인지는 공지된 바 없으며, 최적의 보호 효과 또는 치료 효과를 위해 면역 반응의 양 축이 종종 요구될 것이다. 또한, 병을 앓고 있는 개체, 예를 들어 암 환자 및 C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)와 같은 만성 바이러스에 감염된 개체에서 보호 효과 또는 치료 효과의 결핍을 특징으로 하는 다수의 질병이 존재한다. 이들 질병에서, 질병과 관련된 단백질 항원을 위한 단백질 프로세싱의 정상적인 패턴은 회복 또는 보호를 유발할 수 있는 면역 반응을 일으키지 않는다.
따라서, 본 발명의 한 관점은, 동물에서 소정의 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에게 프로세싱 성분 및 상기 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구성물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 이때 상기 프로세싱 성분은, 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 상기 항원성 폴리펩티드의 불균질 프로세싱을 제공하여, 결과적으로 상기 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시킨다.
한 구체예에서, 프로세싱 성분을 암호화하는 상기 핵산 구성물은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 프로세싱 성분을 암호화한다.
본원에 사용한 용어 "면역 반응을 증강시키는" 또는 "면역 반응을 조절하는"은 하나 이상의 면역 반응의 축을 상향 조절 및 하향 조절하는 것을 의미하며, 세포성 및/또는 체액(항체) 면역 반응의 최적 자극을 포함하며, 또한 두가지 면역 반응의 축 사이에서의 이로운 피드백 메카니즘을 포함할 수 있다. 또한, 세포성 면역 반응 이외에 체액성 면역 반응의 활성화는 염증 반응을 조절하는 추가의 잇점, 구체적으로 TH1-형 면역 세포를 보유할 수 있다. 바람직한 구체예에 따라, 항원성 폴리펩티드의 불균질 프로세싱은 증강되고 혼합된 면역 반응, 즉 항체 반응 및 세포성 반응을 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 융합 단백질의 "프로세싱 성분" 또는 "프로세싱 펩티드"는 특히 융합 단백질의 세포내 국소화 및/또는 예방적 프로세싱에 영향을 미치는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 상기 프로세싱 성분은 항원성 성분의 불균질한 세포내 국소화를 가능하게 하는 것이 바람직하다. 상기 프로세싱 성분은 HEV로부터 유래할 수 있거나, 임의의 다른 기원으로부터 유래할 수도 있다. 상기 프로세싱 펩티드는 항원성 폴리펩티드에 대해 5'에 위치할 수 있다. 또는, 상기 프로세싱 폴리펩티드는 항원성 폴리펩티드에 대해 3'에 위치할 수 있다. 추가로, 상기 프로세싱 성분은 융합 단백질내 네스트된 위치로부터 작용할 수 있다. 명백한 것은, 본원 발명자들에 의해 고려된 상기 융합 단백질은 자연 발생하는 분자에까지는 확장되지 않는다. 당업자는 본원에 기술한 방법을 이용하여 이들을 함유하는 융합 단백질의 불균질 프로세싱을 허용하는 추가의 프로세싱 펩티드를 동정할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 관점은, 분리된 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우, 숙주 내에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 조절할 수 있는 프로세싱 펩티드를 암호호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은, E형 간염 바이러스의 ORF2 유전자의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 본원에 기술한 바와 같은 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은, E형 간염 바이러스의 PORF2 단백질의 N-말단 영역으로부터 선택된 약 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 프로세싱 펩티드를 암호화하는 본원에 기술한 바와 같은 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기한 특정 관점에 따라, 아미노산 1은 가장 N-말단의 아미노산이다. N-말단 영역은 아미노산을 약 100개까지 포함할 수 있다.
목적 펩티드는 PORF2의 N-말단 영역의 아미노산 1 내지 22 또는 1 내지 36을 포함하는 것이 바람직하고, 목적 펩티드는 PROF2의 N-말단 영역의 아미노산 1 내지 50 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 것이 더 바람직하다.
본원의 상기 관점에 따르면, "기능적"이라는 용어는 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 면역 반응을 조절할 수 있는 폴리펩티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의미이다.
본 발명의 한 관점은, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분의 5'에 위치하고 있고, 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 숙주 내에서 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA와 같은 임의 형태의 핵산 분자일 수 있다.
상기 관점의 본 발명의 하나의 특정 구체예에서, 상기 프로세싱 성분은 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 막 및 세포질 국소화로 유도하는 신호 서열을 포함하는데, 이때 융합 단백질은 전기간에 걸쳐 안정하며, 항원성 성분에 대한 항체 반응을 증강시키는데 효과적이다.
본 발명의 바람직한 관점에서, 상기 프로세싱 성분은 불균질 세포내 국소화(즉, 세포질 및 막 구획으로) 및/또는 혼합된 세포내 예방적 프로세싱(안정 및 분해) 특성을 부여한다. 본 발명의 프로세싱 성분은 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응 둘 다의 최적 자극을 위해 융합 단백질을 동시에 표적화한다고 생각되는데, 이러한 견해가 특정 이론이나 실시에 제한되기를 원하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 다른 관점은, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분의 5'에 위치하며, 숙주 내에서 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절할 수 있으며, 상기 프로세싱 성분은 신호 서열 및 필요에 따라 불균질한 세포내 번역후 프로세싱을 할 수 있는 단백질의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중간체 펩티드를 포함한다.
본원에 기술한 바와 같은 상기 프로세싱 성분은 신호 서열 및 불균질 세포내 번역후 프로세싱을 수행할 수 있는 단백질의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중간체 펩티드 둘 다를 포함하는 것이 바람직하다.
본원에 사용한 용어 "신호 서열"은 일반적으로 펩티드를 의미하는 것으로 이해되어야 하나, 반드시 새롭게 합성된 폴리펩티드에 위치해야하는 것은 아니다. 상기 신호 서열은 기관에 의한 번역후 흡수를 유도할 수 있으며, 절단되어 성숙 단백질을 형성할 수 있다. 이는 그의 천연적으로 발생하는 형태로 소정의 항원 단백질과 결합할 수 있는 임의의 진핵 신호 서열 또는 원핵 신호 서열을 포함할 수 있고, 임의의 다른 유용한 기원으로부터 유래할 수도 있다. 본 발명에 따라, 상기 신호 서열은 완전히 기능적이고 완전히 절단되거나 또는 교대로 절단되고/되거나 신호 서열 기능은 불충분할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 폴리펩티드의 신호 서열은 여러가지 공지된 알고리즘을 이용하여 예측할 수 있다(G. von Heijne 등, 1989).
본 발명의 다른 관점은, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 숙주 내에서 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분의 5'에 위치하며 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절할 수 있으며, 상기 프로세싱 성분은 신호 서열, 및 필요에 따라 E형 간염 바이러스(PORF2)의 주 구조 단백질의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 펩티드 중간체를 포함한다.
본원에 기술한 바와 같은 프로세싱 성분은 신호 서열 및 E형 간염 바이러스의 주 구조 단백질(PORF2)의 N-말단 영역에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 중간체 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 본원에 사용한 용어 "중간체 펩티드 서열"은 상기 신호 서열의 3'에 위치한 서열을 포함하는 의미로 이해되어야하며, 3' 서열은 융합 단백질에 대해 프로세싱 성분에 의해 부여된 프로세싱 특성을 변경시킨다. 신호 서열과 마찬가지로 중간체 펩티드 서열은 E형 간염 바이러스의 N-말단 영역을 포함하는 임의의 기원으로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하며, 상기 프로세싱 성분은 상기 항원성 성분의 5'에 위치하며 상기 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절할 수 있으며, 상기 프로세싱 성분은 신호 서열과 E형 간염 바이러스의 주 구조 단백질(PORF2)의 N-말단 영역으로부터 선택된 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 프로세싱 성분은 PORF2의 N-말단 영역으로부터 선택된 약 5 내지 100개의 아미노산, 더 바람직하게는 30 내지 90개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 20 내지 60개의 아미노산 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함한다.
상기 프로세싱 성분은 각각 PORF2 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 1 내지 22, 1 내지 36 또는 1 내지 50에 상응하는 실질적으로 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 관점에 사용한 용어 "유도체"는 단편, 부분(parts), 부분(portions), 등가물, 유사체, 돌연변이체, 모의체 또는 상동체를 포함하는 의미이다. 폴리펩티등 유도체는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 유도체는 단일 또는 다중 핵산 치환, 결실 및/또는 첨가(다른 핵산 분자와의 융합을 포함함)로부터 유도될 수 있다. 등가물은 기능적 유사체 또는 작동물질로 작용할 수 있는 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 등가물은 예를 들어 천연 생성물 스크리닝을 이용하여 검출할 수 있다. 본원에 사용한 용어 "변이체"는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상 또는 65% 내지 80%, 가장 바람직하게는 90% 이상의 유사성을 보유하는 분자를 의미한다. 기능적 변이체는 돌연변이유발법 또는 이상적인 디자인을 통해 확립할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 변이체는 중간 정도의 엄한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 관련된 관점에서, 융합 단백질의 프로세싱 성분은 HEV의 ORF2 유전자의 N-말단 영역의 인접하는 뉴클레오티드에 실질적으로 상응하는 1 내지 300개의 뉴클레오티드에 의해 암호화된 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 프로세싱 성분은 실질적으로 서열 번호 4 또는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 기술된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 유도체, 변이체, 부분 또는 상동체에 의해 암호화되는 펩티드를 포함한다.
본 발명의 추가의 관점은, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물을 제공하는데, 이때 상기 융합 단백질은 E형 간염 바이러스의 ORF2의 5' 영역에 의해 암호화된 프로세싱 성분 및 항원성 성분을 포함하며, 이때 상기 프로세싱 성분은, 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 숙주 내의 항원성 성분에 대한 면역 반응을 조절한다.
본 발명의 또 다른 추가의 관점은, 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물을 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명의 추가의 관련된 관점은, 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물로 형질감염된 세포를 제공한다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 세포는 면역 세포 및/또는 제시 세포일 수 있는데, 이들은 항원성 성분에 대한 면역 반응을 최적화하기 위해 숙주 유기체 내에서 융합 단백질을 표적화 또는 유도할 수 있다. 상기 관점에 따르면, 상기 세포는 시험관내 또는 생체내에서 형질감염될 수 있다. 특히 바람직한 세포 유형은 수지상 돌기 세포이다.
본 발명의 또 다른 관점은, 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물과 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공하는 것인데, 이 조성물은 동물에서 면역 반응을 조절하는데 사용하기 위한 것이다.
본원에 사용한 용어 "동물"은 광의로 포유동물, 조류, 어류 및 파충류를 의미하며, 인간, 영장류, 가축(예를 들어, 양, 돼지, 소, 말), 애완 동물(예를 들어, 개, 고양이), 실험실 시험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 래빗, 기니 피그, 햄스터), 포획 야생 동물(예를 들어, 여우, 사슴), 우리에 갖힌 새(예를 들어, 앵무새) 및 가금류(예를 들어, 닭, 오리)(이들로 제한되는 것은 아님)와 같은 동물로 확장된다. 바람직한 목적 동물은 인간 또는 영장류이며, 가장 바람직한 목적 동물은 인간이다.
주사용으로 사용할 수 있는 약학적 형태로는 멸균 수용액(수용성인 경우) 및 멸균 주사용수 또는 분산액의 즉석 제제를 위한 멸균 산제를 들 수 있다. 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 용이하게 주사할 수 있도록 유동화되어야 한다. 이들은 제조 또는 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 담체는 용매 또는 분산매일 수 있는데, 그 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물유를 들 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 이용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제를 이용함으로써 유지할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 여러가지 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤스, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티르메로살 등을 이용하여 수행할 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 지연 흡수제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 이용하여 수행할 수 있다.
활성 성분이 적절하게 보호되는 경우, 이들은 경구 투여할 수 있는데, 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 내에 포함시켜 캡슐제로 제조하거나, 정제로 타정하거나, 식품내에 직접 혼입시킬 수 있다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입시킬 수 있으며, 섭취 가능한 정제, 설하 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 와퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 1 중량% 이상의 활성 화합물을 함유하여야 한다. 상기 조성물 및 제제의 퍼센티지는 물론 변경될 수 있으며, 단위 중량의 약 5 내지 약 80%를 구성할 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물내 활성 화합물의 양은 적합한 투여량을 획득하려는 것이다. 본 발명의 바람직한 조성물 또는 제제는 경구 단위 제형이 약 0.1 ㎍ 내지 2000 mg의 활성 화합물을 함유하도록 제조한다.
또한, 정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 다음과 같은 물질들을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어 트라가칸스 검, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 인산 2칼슘; 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예를 들어 수크로즈, 락토즈 또는 사카린, 또는 향료, 예를 들어 페파민트, 노루발풀 오일 또는 체리향. 단위 투여 제형이 캡슐인 경우, 이는 상기한 유형의 물질 이외에 액상 담체를 함유할 수 있다. 여러가지 기타 물질이 코팅 또는 상기 단위 투여 제형의 물리적 형태를 개질하기 위한 물질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 이들 둘 다로 코팅할 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로즈, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤스, 염료 및 체리향과 오렌지향과 같은 향료를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 제형에 사용된 임의의 물질은 약학적으로 순수해야하며, 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 배합물 내에 혼입될 수도 있다.
약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제로는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제, 항진균제, 등장제, 흡수 촉진제, 흡수 지연제 등을 들 수 있다. 활성 물질을 위해 이러한 매질 또는 제제의 사용은 당업계에 널리 알려져 있다. 활성 성분 또는 세포와 비상용성인 임의의 통상적인 매체 또는 제제를 제외하고, 이의 치료 조성물에의 사용을 고려한다. 또한, 보충 활성 성분을 상기 조성물에 혼입할 수도 있다.
투여의 용이성과 투여량의 균질성을 담보하기 위해 단위 투여 제형의 비경구 조성을 제조하는 것이 특이 유익하다. 본원에 기술한 단위 투여 제형은 치료하려는 포유동물을 위한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 구분된 유니트를 의미하며; 각각의 유니트는 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 계산된 활성 물질의 기설정된 양과 함께 필요한 약학적 담체를 함유한다. 본 발명의 신규한 단위 투여 제형을 위한 세부사항은 (a) 활성 물질의 독특한 특성 및 획득하려는 특정 치료 효과, (b) 본원에 상세히 기술한 바와 같이 신체적 건강 상태에 장애가 있는 질병을 앓고 있는 살아있는 개체의 질병 치료를 위해 이러한 활성 물질을 합성하는 분야의 내재적 한계에 의해 기술되며, 직접적으로 의존한다.
주 활성 성분은 유효량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 본원에 기술된 바와 같은 단위 투여 제형으로 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 합성된다. 예를 들어, 단위 투여 제형은 주 활성 화합물을 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg의 범위로 함유한다. 비율로 표현하면, 상기 활성 화합물은 일반적으로 담체 1 ml 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg 범위로 존재한다. 보충적인 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 활성 성분의 통상적인 투여량과 투여 방식을 참조하여 결정한다.
조성물 형태의 핵산 구성물 또는 백신의 투여는 임의의 통상적인 수단, 예를 들어 유전자 총(gene gun), 리포좀 또는 중합성 미소구 전달 또는 바이러스계 벡터에 의한 전달에 의한 직접 투여(이로 제한되는 것은 아님)에 의해 수행할 수 있다. 약학 조성물 제제는 구체적인 경우에 따른 투여량으로 치료적 활성 또는 예방적 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 예를 들어, 동물, 투여 경로 및 필요한 치료에 따라 변경할 수 있다. 넓은 범위의 투여량을 적용할 수도 있다. 예를 들어, 환자를 고려하여 약 0.1 ㎍ 내지 약 1 mg의 핵산 구성물을 체중 1 kg을 기준으로 투여할 수도 있다. 투여량을 조절하여 최적 치료 반응을 제공할 수 있다. 상기 제제는 임의의 종래의 투여 수단, 예를 들어 경구 투여, 정맥내 투여(수용성인 경우), 비내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 좌약 투여 또는 이식(예를 들어, 서방 물질을 이용하는 경우)에 의한 방법으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, 동물에서 소정의 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 항원에 대한 면역 반응을 조절하기에 충분한 시간과 조건에서 본원에 기술한 바와 같은 핵산 또는 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물을 암호화하거나 포함하는 백신 또는 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 실험실 동물 또는 시험관내 또는 생체내에서 모노클로날 항체 새성을 포함하는 항체 생성을 위해 특히 유용한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 또는 예비 암적 상태, 자가면역질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염 또는 기생충 감염(이로 제한되는 것은 아님)을 포함하는 질환 또는 감 염의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 본원에 기술한 바와 같은 핵산 구성물의 용도에까지 확장된다.
본 발명의 추가 특징은 후술하는 비제한적인 실시예를 통해 충분히 기술될 것이다.
실시예 1
세포의 세포질 결합 분획 또는 막 결합 분획에 대한 HEV 융합 단백질의 차등 국소화
HEV-암호화된 항원성 단백질 ORF2.1는 융합 단백질(ORF2.1)없이 sig1(sig1-2.1), sig2(sig2-2.1) 또는 sig3(sig3-2.1)의 N-말단 융합 단백질을 이용하여 ORF2.1를 암호화하는 일련의 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포 내에서 발현하였다(도 1). 세포는 방사능 메티오닌 및 시스테인의 존재 하에서 항온처리하여 새롭게 합성된 단백질을 표지하고, 세포는 가용성 세포질 분획(c) 및 막 분획(m)으로 분획화하고, ORF2.1 서열을 포함하는 단백질은 특이성 ORF2.1 폴리클로날 항체를 이용하는 면역침전을 이용하여 검출하고, SDS-PAGE 및 방사능사진법으로 검출하였다. 실험 결과로 확인할 수 있는 바와 같이, ORF2.1는 가용성 세포질 분획 내에서 거의 배타적으로 확인되었고, sig1-2.1은 막 분획에서 거의 배타적으로 확인되었지만, sig2-2.1 및 sig3-2.1은 양 분획 내에서 유사한 비율로 확인되었다. 주목해야할 것은 이동 속도가 상이한 다수의 밴드는 막 분획에 전위된 이들 단백질의 부분 글리코실화에 기인한다는 것인데, 왜냐하면 세포를 투니카마이신으로 처리하여 N-글리코실화를 예방하는 경우(도시하지 않음), 이들은 폐기되기 때문이다. 상기 도면으로부터 각각의 sig 단백질이 세포 내에서 단백질 국소화에 부여하는 독특한 효과를 확인할 수 있었으며, 특히 불균질 국소화를 부여하는 sig2 및 sig3과 관련된 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 2
HEV 융합 단백질의 차등 안정성
각각의 단백질을 발현하는 세포는 도 2에서와 같이 방사능 아미노산의 존재 하에서 항온처리하였으나, 분획화하고 분석하기 이전에 다양한 시간 동안 과량의 비방사능 아미노산의 존재 하에서 추가로 항온처리하였다. 이렇게 함으로써 본 발명자들은 각각의 단백질에 대한 프로세싱 패턴을 확인할 수 있었는데, 이는 방사능 표지화의 말미(0시간)에 각각의 방사능 단백질의 양과 세포에서 추가 배양하는 1시간 또는 4시간에서의 양을 비교함으로써 확인하였다. 도 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질 ORF2.1는 세포질(cyto)에서 우세하게 확인되었으며, 합성후 1시간에서 안정한 반면, 단백질 sig1-2.1은 막 분획(memb)에서 우세하게 확인되었으며, 합성후 4시간에서 안정하였다. 대조적으로, sig2-2.1 및 sig3-2.1은 각각 세포질 분획 및 막 분획 둘 다에서 확인되었는데, 세포질 결합 단백질은 4시간 후에 안정한 반면, 막 결합 단백질은 4시간 이후에 거의 완전히 분해되었다. 따라서, 이들 샘플 내에서 sig2-2.1 및 sig3-2.1은 그들의 불균질 프로세싱 및 국소화에 기인하여 ORF2.1 단백질에 대해 혼합 면역 반응을 나타내는 반면, ORF2.1 및 sig1-2.1은 각각 그들의 균질 프로세싱 및 국소화에 기인하여 단일 패턴의 면역 반응을 나타냈다.
실시예 3
SIG.GST 융합 단백질의 차등 국소화 및 안정성
실시예 2에서와 같이 포유류 세포 내에서의 발현을 위해 sig1, sig2 또는 sig3은 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)에 융합하였다. 본 실시예에서, sig1-GST는 세포질 분획 및 막 분획에서 균등한 비율로 불균질 국소화를 나타냈으나, 4시간후 양 분획에서의 균질한 프로세싱은 안정한 것으로 확인할 수 있었다. 대조적으로, sig2-GST 및 sig3-GST는 0시간에서 세포질 분획 및 막 분획 둘 다에서 균등한 비율로 불균질 국소화를 나타냈으나, 또한 세포질 분획에서의 불균질 프로세싱은 3 시간 후에 안정한 반면, 막 분획은 3시간 후에 거의 완전하게 분해되었다. 따라서, 3가지 sig1, sig2 또는 sig3 융합 단백질의 이용은 일례로서 GST를 보유하는 표적 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 것으로 생각된다.
실시예 4
Sig1, Sig2 및 Sig3의 핵산 서열
하기 서열은 프라이머내에 제한 위치를 부가하면서 전장 ORF2 서열로부터 유래한 적합한 단편의 PCR 증폭에 의해 유도된 것이다
Sig 서열 번호 4
ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCC
Sig 서열 번호 5
ATGCGCCCCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAG CCGTCTGGCCGCCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGT
Sig 서열 번호 6
ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCC
발현에 사용한 포유동물 발현 벡터 pCi-neo(프로메가)이며, CMV 직초기 프로모터, SV40 폴리아데닐화 및 키메라 스플라이스 시그날을 보유한다.
실시예 5
플라스미드 구성물을 이용하는 Balb/C 마우스의 면역화
sig1, sig2 및 sig3 펩티드의 활성은 플라스미드 구성물 ORF2.1, sig1-2.1, sig2-2.1 및 sig3-2.1, 및 GST, sig1-GST, sig2-GST 및 sig3-GST중 어느 하나를 이용하고, 유전자 총 또는 근육내 주입과 같은 표준 방법에 의해 Balb/C 마우스를 접종합으로써 입증할 수 있으며, 각각의 백신을 주입한 동물내에서의 면역 반응은 특이 항체 이소타입 프로필, T-세포 증식 반응 및 세포질분해성 T-세포 반응과 같은 방법에 의해 비교하였다. 본 실시예에서 세포 배양물 내에서 관찰된 상이한 패턴의 세포내 프로세싱은 DNA 백신을 접종한 마우스의 세포 내에서 발생할 것이며, 개개의 구성물의 단백질 프로세싱에 따라 조절된 면역 반응을 일으킬 것이라는 것을 예상할 수 있을 것이다. 이는 소정의 다른 항원에 각각의 sig 펩티드를 융합시킴으로써 추가로 테스트할 수 있는데, 사용할 수 있는 다른 항원으로는 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(NP) 및 해마글루티닌(프레임), C형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스의 협막 단백질과 코어 단백질, 인간 면역결핍 바이러스의 협막 단백질과 gag 단백질 및 인간과 동물의 다른 바이러스, 박테리아, 균류 및 기생충 병원체로부터 유래한 항원 및 암-관련 항원을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 각각의 백신 구성물로부터 예상되는 상이한 면역 반응은 도 5에 다이아그램으로 나타냈다.
결론적으로, 핵산 백신에 의해 암호화되는 경우, HEV PORF2로부터 유래한 sig1, sig2 및 sig3 및 관련 펩티드는 항원 단독 또는 균질한 패턴의 세포내 프로세싱 및 국소화를 보유한 펩티드-항원 융합 단백질(예를 들어, 유비퀴틴-항원 융합 단백질)과 비교하여, 불균질 패턴의 세포내 프로세싱 및 국소화에 의해 융합 단백질 항원에 대한 면역 반응을 조절 및 증강시키는데 유용성을 보유할 것이다.
실시예 6
불균질 단백질에 융합된 HEV 시그날 펩티드에 대한 면역 반응
플라스미드 구성물의 ORF2.1 시리즈는 0주, 4주 및 8주에 염수 중의 DNA 100 ㎍을 IM 주입함으로써 래트에 투여하였으며, 항체 반응은 ORF2.1 ELISA를 이용하여 측정하였다(Anderson 등, 1999)(표 1, 도 6 및 도 7). ORF2.1 단독 또는 유비퀴틴-A76과 융합된 ORF2.1은 임의의 검출가능한 항체를 유발하지 못한 반면, Sig1-ORF2.1은 2/2 래트에서 강한 항체 반응을 유도하였다. 또한, 대부분의 단백질(전위된 분획)은 4시간 내에 분해되었는데, 이는 MHC-I 경로 및 CTL 반응의 유도에 의한 제시가 선호됨을 나타내는 것일 수 있다.
또한, 래트에서의 항체 반응은 ORF2 단백질의 상이한 단편에 대한 웨스턴 면역블로팅에 의해 조사하였는데(Li 등, 1997; Ridell 등, 2000), 이는 선형 및 형태적 에피토프에 대한 반응성을 나타낼 수 있다(도 7). 현저하게, Sig1-ORF2.1 및 Sig3-ORF2.1 둘 다는 HEV의 형태적 ORF2.1 에피토프에 대한 항체를 유도하였으며(Riddel 등, 2000), 이는 DNA 백신의 광범위한 효능을 위해 중요한 특성인 것으로 생각되었다. 또한, SIG3-ORF2.1은 웨스턴 면역블로팅에서 SIG1-ORF2.1 보다 더 높은 수준의 항체 반응성을 나타냈는데, 이는 아마도 손상되지 않은(형태적) 및 분해된(선형) 항원의 혼합물이 B 세포에 대해 제시되었기 때문일 것이다.
삭제
따라서, 이들 실험으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, Sig1 및 Sig3 융합은 DNA 백신에 의해 암호화된 개질되지 않은 단백질에 비해 증강된 항체 반응을 촉진시키며, Sig3과의 융합 단백질의 분율의 신속한 분해와 연계하는데, 이는 CTL 반응과 항체 반응 양자의 균형을 유발하며, 차례로 예를 들어 감염성 제제 또는 종양의 유효성과 같은, 항원을 암호화하는 DNA 백신의 유효성을 개선시킨다.
실시예 7
HEV 시그날 펩티드 표적화 시스템의 광범위한 용도
DNA 백신 구성물은 후술하는 항원과 함께 Sig1 및 Sig3의 융합물을 암호화하도록 pCI-neo 내에서 제조하였다: (i) HCV 코어/E1/E2; (ii) HCV 코어; (iii) HCV E1/E2; (iv) B 형 간염 표면 항원(HBsAg); (v) 인플루엔자 핵단백질(NP); (vi) 인플루엔자 해마글루티닌(HA). 각각의 단백질에 대한 암호 서열은 PCR에 의해 기존의 플라스미드로부터 증폭하였으며, 또한 각각의 경우에 상응하는 전장(천연) 단백질 및 유비퀴틴-A76에 융합된 전장 단백질(대조용, MHC-I 표적화)을 발현하는 플라스미드도 구성하였다. Cos 세포는 각각의 플라스미드로 형질전환하였고, 표적 단백질의 운명은 펄스-체이스 방사능표지, 세포 분획화, 웨스턴 면역블로팅 및 면역침전으로 분석하여 HEV Sig1 및 Sig3의 표적화 효과가 매우 다양한 범위의 표적 항원에 대해 부여될 수 있는지 여부를 확인하였다.
각각 6마리의 마우스로 구성된 군은 0주 및 4주에 벡터(pCI-neo 플라스미드, 음성 대조용), 또는 표적 항원 GST, ORF2.1, HBsAg, NP 및 HA중 하나를 (a) 전장 단백질(대조용); (b) Ub-A76-단백질(대조용); (c) Sig1-단백질; (d) Sig3-단백질의 형태로 암호화하는 벡터 100 ㎍을 IM 주사하여 면역화하였다. 상응하는 단백질 백신은 추가의 대조용으로 작용하였다.
혈액은 0주, 4주, 8주 및 12주에 수집하였으며, 조직(림프 결절, 비장)은 12주에 수집하였다. 전체 및 아이소토프 특이성 IgG 반응은 ELISA를 이용하여 결정하였으며, 각각 체액성 면역 반응의 크기 및 반응의 Th1/Th2 편향을 위한 대용 마커의 지표를 제공하였다. HA 및 NP에 있어서, 상기 분석은 (a) CTL 활성 및 (b) ELISPOT 및/또는 세포내 시토킨 염색을 포함하였는데, 이는 특이성 T-세포의 빈도 및 Th1/Th2 편향을 결정하기 위한 것이다.
HEV Sig1 또는 Sig3에 의해 제공되는 효능에 대한 더 엄정한 테스트를 제공하기 위해, HA 및 NP DNA 백신 구성물은 마우스에서 거의 치사에 가까운 인플루엔자 모델을 이용하여 조사하였다. 동물은 이미 기술한 바와 같이 면역화하였으며, 12주에 모든 동물은 치사량에 가까운 투여량으로 인플루엔자 바이러스 연성 균주를 비내 접종하여 항원재투여하였다. 5일후에, 마우스는 안락사시키고, 폐 조직은 수집하여 플라크 분석에 의해 바이러스 로딩양을 측정하였다. 이들 연구는 HEV Sig 서열에 의한 혼합 표적화가 증강된 면역 반응을 유발함을 확인할 수 있었다.
참조문헌
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13. Wolff, J. A. et. al. (1990) Science 247: 1465-8
DNA 플라스미드 상에서 암호화된 HEV 시그날 펩티드 융합 단백질의 세포내 프로세싱 및 면역원성의 요약
구성물 ER 전위 급속 분해a 분비 항체 유도b
OEF2.1 - + - -
Sig1-ORF2.1 ++ - - ++++
Sig2-ORF2.1 + + - nt
Sig3-ORF2.1 + + - ++
UbA76-ORF2.1 - + - -
GST - - - nt
Sig1-GST + - + nt
Sig2-GST + + + nt
Sig3-GST + + + nt
UbA76-GST - + nt nt
a 4시간후(즉, t1/2<2시간) 표적 단백질의 75% 이상의 분해. Sig 2- 및 Sig 3-단백질에서만, 전위된 분획이 분해됨. b 0주, 4주 및 8주에 100 ㎍ DNA IM, 1군당 2마리의 래트, ORF2.1-특이성 Ab는 12주에 측정함.
SEQUENCE LISTING <212> PRT <213> Hepatitis E Virus <400> 1 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro 20 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Hepatitis E Virus <400> 2 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly 35 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Hepatitis E Virus <400> 3 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 Gln Pro 50 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Hepatitis E Virus <400> 4 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgccc 66 <210> 5 <211> 108 <212> DNA <213> Hepatitis E Virus <400> 5 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggt 108 <210> 6 <211> 150 <212> DNA <213> Hepatitis E Virus <400> 6 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt 120 ttctggggtg accgggttga ttctcagccc 150

Claims (26)

  1. 프로세싱 성분과 하나 이상의 항원성 성분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구성물을 포함하는, 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 약학 조성물로서, 상기 프로세싱 성분은 E형 간염 바이러스의 단백질 오픈 리딩 프레임 2(PORF2) 단백질의 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 유래하며 상기 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 선택된 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로세싱 성분은, 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우 항원성 폴리펩티드의 막 및 세포질 분획으로의 불균질한 세포내 국소화를 제공하여 그 결과 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 구성물이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 프로세싱 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원성 폴리펩티드가 바이러스 폴리펩티드인 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이러스 폴리펩티드가 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(NP)과 해마글루티닌(HA), C형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스의 협막 단백질과 코어 단백질, 또는 인간 면역결핍 바이러스의 협막 단백질과 gag 단백질 중에서 선택되는 것인 조성물.
  8. 숙주 세포 내에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키거나, 또는 상기 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 프로세싱 펩티드와 항원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 경우 항원성 폴리펩티드의 불균질한 세포내 국소화를 제공하는 프로세싱 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 분리된 핵산 분자로서, 상기 프로세싱 성분은 E형 간염 바이러스의 단백질 오픈 리딩 프레임 2(PORF2) 단백질의 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 유래하며 상기 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 선택된 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 구성물이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 프로세싱 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  10. 제8항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 분리된 핵산 분자.
  11. 제8항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  12. 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 구성물로서, 상기 프로세싱 성분은 E형 간염 바이러스의 단백질 오픈 리딩 프레임 2(PORF2) 단백질의 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 유래하며 상기 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 선택된 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 프로세싱 성분은 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우 항원성 폴리펩티드 성분의 불균질한 세포내 국소화를 제공하여 그 결과 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증가시키는 것인 분리된 핵산 구성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산 구성물이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 프로세싱 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 구성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 분리된 핵산 구성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 구성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 항원성 폴리펩티드가 바이러스 폴리펩티드인 것인 분리된 핵산 구성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 폴리펩티드가 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(NP)과 해마글루티닌(HA), C형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스의 협막 단백질과 코어 단백질, 또는 인간 면역결핍 바이러스의 협막 단백질과 gag 단백질 중에서 선택되는 것인 분리된 핵산 구성물.
  18. 제8항의 핵산 분자 또는 제12항의 구성물로 형질감염된 분리된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포가 항원 제시 세포인 것인 분리된 세포.
  20. 제8항의 핵산 분자 또는 제12항의 구성물을 포함하는 핵산 백신.
  21. 제20항에 있어서, 상기 핵산 백신이 바이러스성 리플리콘을 포함하는 것인 핵산 백신.
  22. 프로세싱 성분 및 하나 이상의 항원성 성분을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구성물을 포함하는 조성물의 유효량을 인간이 아닌 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인간이 아닌 동물에서 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 상기 프로세싱 성분은 E형 간염 바이러스의 단백질 오픈 리딩 프레임 2(PORF2) 단백질의 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 유래하며 상기 N-말단 아미노산 1번 내지 100번에서 선택된 5 내지 100개의 인접하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 프로세싱 성분은 상기 핵산 구성물이 숙주 세포 내에서 발현되는 경우 항원성 폴리펩티드의 막 및 세포질 분획으로의 불균질한 세포내 국소화를 제공하여 그 결과 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시키는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 구성물이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 프로세싱 성분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 프로세싱 성분이 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 항원성 폴리펩티드가 바이러스 폴리펩티드인 것인 방법.
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