KR101598876B1 - 리슈마니아증 및 결핵에 대한 백신 개발을 위한 ｄｎａ 키메라의 작제 - Google Patents
리슈마니아증 및 결핵에 대한 백신 개발을 위한 ｄｎａ 키메라의 작제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101598876B1 KR101598876B1 KR1020107007350A KR20107007350A KR101598876B1 KR 101598876 B1 KR101598876 B1 KR 101598876B1 KR 1020107007350 A KR1020107007350 A KR 1020107007350A KR 20107007350 A KR20107007350 A KR 20107007350A KR 101598876 B1 KR101598876 B1 KR 101598876B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- esat
- gene
- dna construct
- dna
- kinesin
- Prior art date
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 60
- 238000011161 development Methods 0.000 title description 11
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 24
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 claims abstract 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 claims description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 241000222727 Leishmania donovani Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700020164 Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 Proteins 0.000 claims 1
- 208000010195 Onychomycosis Diseases 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 201000005882 tinea unguium Diseases 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 32
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IMCUVBSHZXQITN-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(4-chlorophenyl)-5-(2-methoxy-2-oxoethyl)-1,3-thiazol-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound S1C(NC(=O)CCC(O)=O)=NC(C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1CC(=O)OC IMCUVBSHZXQITN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- YNSUUAOAFCVINY-OSUNSFLBSA-N Arg-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YNSUUAOAFCVINY-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N Asn-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229960002109 tuberculosis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 100 mM Chemical compound 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000021527 ATP binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011108 ATP binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033094 ATP-binding cassette sub-family G member 4 Human genes 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N Ala-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N 0.000 description 1
- LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N Ala-Cys-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IFTVANMRTIHKML-WDSKDSINSA-N Ala-Gln-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O IFTVANMRTIHKML-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MVBWLRJESQOQTM-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MVBWLRJESQOQTM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GSHKMNKPMLXSQW-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N GSHKMNKPMLXSQW-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- XCZXVTHYGSMQGH-NAKRPEOUSA-N Ala-Ile-Met Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C([O-])=O XCZXVTHYGSMQGH-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- SUMYEVXWCAYLLJ-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SUMYEVXWCAYLLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Gln Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N Ala-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 240000005528 Arctium lappa Species 0.000 description 1
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RKRSYHCNPFGMTA-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RKRSYHCNPFGMTA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N Arg-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N Arg-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- DNUKXVMPARLPFN-XUXIUFHCSA-N Arg-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DNUKXVMPARLPFN-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- ZRNWJUAQKFUUKV-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ZRNWJUAQKFUUKV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N Asn-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N Asn-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)CN=C(N)N FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YRZIYQGXTSBRLT-AVGNSLFASA-N Asp-Phe-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YRZIYQGXTSBRLT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XMKXONRMGJXCJV-LAEOZQHASA-N Asp-Val-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XMKXONRMGJXCJV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- SFJUYBCDQBAYAJ-YDHLFZDLSA-N Asp-Val-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SFJUYBCDQBAYAJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- GZYDPEJSZYZWEF-MXAVVETBSA-N Asp-Val-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GZYDPEJSZYZWEF-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010087806 Carnosine Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000299195 Echinodera major Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710173545 Gene 63 protein Proteins 0.000 description 1
- IGNGBUVODQLMRJ-CIUDSAMLSA-N Gln-Ala-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O IGNGBUVODQLMRJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LVNILKSSFHCSJZ-IHRRRGAJSA-N Gln-Gln-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LVNILKSSFHCSJZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QFJPFPCSXOXMKI-BPUTZDHNSA-N Gln-Gln-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N QFJPFPCSXOXMKI-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N Gln-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ORYMMTRPKVTGSJ-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N Glu-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UHVIQGKBMXEVGN-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UHVIQGKBMXEVGN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ITBHUUMCJJQUSC-LAEOZQHASA-N Glu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O ITBHUUMCJJQUSC-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- WTMZXOPHTIVFCP-QEWYBTABSA-N Glu-Ile-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WTMZXOPHTIVFCP-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GUOWMVFLAJNPDY-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O GUOWMVFLAJNPDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N Gly-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N WKJKBELXHCTHIJ-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N Gly-Asn-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N Gly-Gln-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NPSWCZIRBAYNSB-JHEQGTHGSA-N Gly-Gln-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NPSWCZIRBAYNSB-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN MTBIKIMYHUWBRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- 101000867289 Glycine max Hsp70-Hsp90 organizing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N His-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FLUVGKKRRMLNPU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- YEKYGQZUBCRNGH-DCAQKATOSA-N His-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O YEKYGQZUBCRNGH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FHKZHRMERJUXRJ-DCAQKATOSA-N His-Ser-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FHKZHRMERJUXRJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000800393 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family G member 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000605625 Homo sapiens Polycystic kidney disease 2-like 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- PPSQSIDMOVPKPI-BJDJZHNGSA-N Ile-Cys-Leu Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O PPSQSIDMOVPKPI-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 241000222724 Leishmania amazonensis Species 0.000 description 1
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 1
- 102100026040 Leishmanolysin-like peptidase Human genes 0.000 description 1
- DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- NNCDAORZCMPZPX-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Ser Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N NNCDAORZCMPZPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- HAUUXTXKJNVIFY-ONGXEEELSA-N Lys-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAUUXTXKJNVIFY-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- GOVDTWNJCBRRBJ-DCAQKATOSA-N Lys-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N GOVDTWNJCBRRBJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- ULLIQRYQNMAAHC-RWMBFGLXSA-N Met-His-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N ULLIQRYQNMAAHC-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- JOYFULUKJRJCSX-IUCAKERBSA-N Met-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O JOYFULUKJRJCSX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- MIAZEQZXAFTCCG-UBHSHLNASA-N Met-Phe-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MIAZEQZXAFTCCG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- JHVNNUIQXOGAHI-KJEVXHAQSA-N Met-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O JHVNNUIQXOGAHI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000187489 Mycobacterium simiae Species 0.000 description 1
- 101001057048 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) ESAT-6-like protein EsxB Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007456 Peroxiredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- NOFBJKKOPKJDCO-KKXDTOCCSA-N Phe-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O NOFBJKKOPKJDCO-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- VUYCNYVLKACHPA-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N VUYCNYVLKACHPA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 102100038330 Polycystic kidney disease 2-like 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N Ser-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N Thr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WBCCCPZIJIJTSD-TUBUOCAGSA-N Thr-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N WBCCCPZIJIJTSD-TUBUOCAGSA-N 0.000 description 1
- WPAKPLPGQNUXGN-OSUNSFLBSA-N Thr-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WPAKPLPGQNUXGN-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KPNSNVTUVKSBFL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KPNSNVTUVKSBFL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- NDXSOKGYKCGYKT-VEVYYDQMSA-N Thr-Pro-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NDXSOKGYKCGYKT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- PXQPYPMSLBQHJJ-WFBYXXMGSA-N Trp-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N PXQPYPMSLBQHJJ-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- CSRCUZAVBSEDMB-FDARSICLSA-N Trp-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N CSRCUZAVBSEDMB-FDARSICLSA-N 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N Tyr-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N Val-Ala-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N Val-Arg-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JMCOXFSCTGKLLB-FKBYEOEOSA-N Val-Phe-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N JMCOXFSCTGKLLB-FKBYEOEOSA-N 0.000 description 1
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N Val-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N JSOXWWFKRJKTMT-WOPDTQHZSA-N 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical group ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 description 1
- 229960001050 bupivacaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015355 drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011553 hamster model Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 101150014428 mpt64 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229940022007 naked DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108030002458 peroxiredoxin Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010007375 seryl-seryl-seryl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000033596 susceptibility to 5 leprosy Diseases 0.000 description 1
- 208000032922 susceptibility to mycobacterium tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- JCQBWMAWTUBARI-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-ethenylpiperidine-1-carboxylate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCCC(C=C)C1 JCQBWMAWTUBARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108010058119 tryptophyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 영역이 DNA 백신 벡터 pVAX-1 내의 자가분열 펩티드의 양측에 함께 클로닝되어 있는 DNA 구조체의 신규한 재조합 키메라로서, 키메라 구조체가 전사 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 DNA 구조체의 신규한 재조합 키메라에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DNA 구조체의 신규한 재조합 키메라의 제조방법으로서, 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버를 이용하여 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 예측되는 단백질 서열을 분석하고, 상기 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 유전자 암호화 증폭 단계를 행하며, 키네신 esat-6 유전자 영역을 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 클로닝하고, pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝을 하여 키메라 구조체를 발생시키고, 무세포 번역 시스템을 이용한 상기 클론 유래의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 시험관내 발현 분석 및 상기 구조체를 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 포유동물의 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 자가절단 펩티드 (self-cleaving peptide)의 양측에 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)의 키네신 모터 도메인 영역 (kinesin motor domain region)이 함께 클로닝되어 있는 신규한 키메라 DNA 백신 구조체 (chimeric DNA vaccine construct)를 제공한다. 상기 구조체는 리슈마니아증 (leishmaniasis) 및 결핵 (tuberculosis)에 대한 보호를 위해 사용된다.
과거 100년에 걸쳐서, 감염원 (infectious agent)에 대한 백신의 개발 및 광범위한 사용은 의료과학의 업적들중 하나가 되어왔다. 이러한 백신의 성공에 대한 한 가지 이유는 상기 백신이 대부분의 바이러스 및 박테리아에 대한 면역 보호의 주요 성분인 항체의 생성 (체액성 면역)을 유도하는 효과가 탁월하기 때문이다. 그러나, 예를 들면 결핵균, 말라리아 기생충, 리슈마니아 기생충 및 인간면역결핍 바이러스(HIV)와 같이 의학적으로 중요한 세포내 유기체와 같은 예외들이 존재하는데, 이러한 유기체로부터의 보호는 항체의 유도 (체액성 면역)보다는 세포 매개 면역 (cell-mediated immunity)에 더욱 의존한다.
통상적인 능동 백신 (active vaccine)은 사균 또는 약독화 형태 (attenuated form)의 감염원으로 이루어진다. 또한, 감염원의 변형 생성물 (톡소이드 (toxoid)) 또는 감염원의 성분 (캡슐과 같은 것)이 사용된다. 이러한 백신은 이들이 유도하는 항체 반응에 일부 한계와 문제점을 가진다. 또한, 생존 불가능한(사균, 약독화 유기체, 톡소이드 또는 캡슐) 백신이 사용되고 얻어지는 보호 면역이 오래 지속되지 않는 경우, 다량의 백신을 반복적으로 투여할 필요가 있다. 더 나아가, 약독화 생백신 및 사백신을 제조하는 방법은 천연 단백질의 구조를 변화시킬 수 있기 때문에 백신의 항원성을 저하시킬 수 있고. 대부분의 경우 세포 매개 면역 반응이 아닌 체액성 면역 반응이 발생한다. 이러한 경우에 필요한 것은, 가능한 것은 아니지만, 사용하기 안전하고 내인성 (endogenous) 경로로 진행될 수 있어 궁극적으로 세포독성 T-임파구 (CTL)를 활성화시키는 항원이다. 이는 리슈마니아 기생충과 같은 세포내 병원체에 대해 매우 바람직하게 된다. 이러한 방식으로 발생된 활성화 CTL은 기생충 감염 세포를 파괴할 것이다.
따라서, 새로운 백신접종 방법이 광범위하게 연구되고 있는데, 이는 관련 항원에 대한 유전자를 함유하는 DNA 조각을 주사하는 것을 포함한다. 플라스모듐 (Plasmodium) 및 리슈마니아를 포함한 여러 기생충 및 인간의 마이코박테리움 (Mycobacterium spp)과 같은 여러 박테리아 종에 대한 DNA 백신으로 세포 면역 반응을 유도한다는 최근의 여러 보고들은, 이러한 면역화 방법의 임상적 적용가능성에 대한 기대를 불러일으키고 있다.
DNA 백신의 경우, 원하는 관련 항원(병원체 기원)에 대한 유전자는 포유동물의 세포에서 삽입 유전자의 발현을 증가시키도록 조작되는 박테리아 플라스미드로 클로닝된다. 동물에 주입된 후, 상기 플라스미드는 숙주 세포에 들어가고, 여기에서 숙주세포의 DNA와 통합되지 않고 핵 내에서 에피솜 (episome)으로 존재한다. 숙주세포의 대사 기구 (metabolic machinery)를 이용하여, 에피솜 내의 삽입 클론 DNA는 이것이 인코딩하는 항원의 합성을 지시한다.
세포 내에서 항원의 합성을 포함하는 방법은 외인성 (exogenous) 재조합 단백질 또는 사멸 유기체를 이용하여 면역화하는 것과 비교하여 몇 가지의 장점이 있다. 플라스미드-형질감염된 세포에 의해 생성된 단백질은 중화 항체의 생성에 유리한 천연 형상에서 접혀지기 쉽다. 더 나아가, 플라스미드 DNA의 지시하에 합성된 펩티드는 세포의 표면으로 이동할 수 있고, 세포 매개 면역을 더 유도하는 CD8+ 세포독성 T 세포의 자극에서 필수적 단계인 MHC class I 분자에 의해 발현될 수 있다. 반대로, 표준 백신 항원은 포식작용 (phagocytosis) 또는 세포내이동 (endocytosis)을 통해 세포 내로 흡수되고, 주로 항체 반응을 촉진하는 MHC class II 시스템을 통해 처리된다. 마지막으로, DNA 백신은 잔존하여 지속적인 면역반응을 촉진하는 것으로 나타났다.
적절한 면역 반응을 유도할 수 있는 것 이외에도, DNA 백신은 폴리펩티드의 적절한 접힘 (folding)을 확보하고, 장기간에 걸쳐 항원을 생성 및 방출할 수 있고 면역증강제 (adjuvant)를 필요로 하지 않는다는 장점 또한 있다. 다른 장점으로는 DNA 분자의 안정성, 긴 저장 수명, 및 엄격한 저온 유통을 필요로 하지 않는다는 점이 있다. 또한, DNA 백신은 HIV 감염 환자와 같은 면역저하 환자 (immuno compromised patient)에 사용하는데 있어서 바이러스 생백신보다 더욱 안전하다. 또한, DNA 백신은 전달 벡터에 대한 면역 반응 및 바이러스 벡터의 사용과 관련된 안전성 문제와 같은 통상의 백신과 관련된 많은 문제들을 회피한다. 이들 DNA 백신은 상이한 병원체 유래의 유전자가 동일한 플라스미드에 포함됨으로써 어린이에게 필요한 백신접종의 수가 잠재적으로 감소되는 방식으로 작제될 수 있다. 또한, 사람들이 한 종 이상의 감염으로 고생하고 있는 열대 국가에서는, 키메라 백신에 대한 중대한 필요성이 있다.
리슈마니아 및 마이코박테리움은 모두 중요한 인체 병원체인 것으로 여져진다. 세계보건기구(WHO)는 리슈마니아증을 중요한 기생충 질환들중 하나로 간주하고 있는데, 약 3억 5천만 명의 사람들이 이러한 질환에 감염될 위험에 있다. 상기 질환은 전세계적으로 분포하고 있고, 최소한 88개 국가에서 풍토병 (endemic)이다. 또한, 상기 질환은 적당한 벡터가 존재하지 않는 남극대륙을 제외한 모든 대륙에서 발생하고 있다. 다른 한편으로, 마이코박테리아 감염은 전세계적으로 치사율 및 질병율의 주요 원인이다. 해마다 결핵으로 인해 전세계적으로 2백만 명 내지 3백만 명이 사망하고 있으며, 1천 5백만 명의 새로운 환자가 발생하고 있고, 인도에서는 매일 1000명 이상이 사망하고 있다.
치료를 고려하면, 약물 내성 결핵 및 약물 내성 리슈마니아증이 주요 건강 문제가 되어왔다. 특히 중요한 것은 다중약물 내성 결핵인데, 이 경우 환자는 상이한 약물들에 반응하지 않게 된다. 또한, 오늘날 리슈마니아증의 치료는 HIV 동시 감염 및 오가 안티몬성 물질 (pentavalent antimonials; 리슈마니아증에 대한 가장 일반적인 입수가능한 약물)에 대한 내성으로 인해 어려운 도전과제가 되고 있다. 이러한 문제는 빈곤 및 영양부족, 비면역 피난민들의 이동, 불충분한 진단 도구 및 불가피하거나 입수불가능한 약물로 인해 더욱 심각하게 된다.
HIV/TB와 HIV/리슈마니아증 사이의 상관관계가 보고되어 왔지만, 중요한 임상적 관련성을 갖는 증상인 TB/리슈마니아 동시 감염은 거의 알려지지 않았다. 비록 병인 및 전염 기작이 명백하지만, VL 및 TB는 몇 가지 특징을 공유한다. 가장 중요한 것은 VL 및 TB는 자연상태에서 모두 세포 내에서 일어나고, 세포 매개 면역이 감염에 대한 보호에 중요한 역할을 한다는 것이다. 또한, 양쪽 모두에서, 감염이 일부 감염자에서는 무증상 (asymptomatic)으로 유지된다. 증상은 보통 수개월 또는 수년 후에 발생하고, 이는 임상적 질환으로 진행한다. 매우 긴 잠복기 (잠복감염 (latent infection))는 나중에 발생하는 면역 억제와 관련이 있을 수 있는데, 이러한 면역 억제는 명백히 잠복감염을 활동성 질환으로 전환시킨다.
결핵 (TB)은 IFN-γ 반응성 유전자의 전사를 억제하여 IFN-γ에 대한 대식세포의 반응을 차단함으로써 면역억제를 유발하여, 잠복 리슈마니아 감염의 임상 증상으로 진행되는 것을 초래할 수 있다. 또한, 마이코박테리움은 CDl+ APCs의 세포 표면 유래의 Ag-제시 분자 CD1의 하향 조절에 관여한다. 세포 표면으로부터 CD1의 상실은 병원체 유래 당지질의 CDl-매개 제시를 통해 항균 반응을 개시할 수 있는 CD1-제한 수지상 세포에 Ag를 제시하기 위한 감염 세포의 완전한 억제 능력과 관련이 있다.
마찬가지로, VL은 잠복 마이코박테리아 감염을 다시 활성화할 수 있다. 리슈마니아는 유도가능한 산화질소 합성효소 (iNOS) 활성의 감소와 관련이 있는 산화질소 생성을 하향조절한다. 마이코박테리아와 같은 리슈마니아는 CDl의 발현을 억제하고 수지상 세포에 의한 CDl-제한 T 세포의 활성화를 억제한다. CDl에 의한 제시의 회피는 많은 기생충 당지질의 인식을 회피하기 위한 리슈마니아 생존 전략을 나타낼 수 있다. 또한, 리슈마니아 감염 대식세포는 T-세포의 활성화 및 IFN-γ 생성에 필요한 지속적인 TCR 신호전달을 촉진하는데 덜 효과적인 것으로 관찰되어 왔다.
현재의 상황에서, 동시감염 사례를 제어하는 것이 필수적이게 되었는데, 리슈마니아증과 결핵이 동시에 발생하는 지역에서는 특히 그러하다. 키메라 백신의 개발은 리슈마니아증 및 마이코박테리아 감염을 제어하고 필요한 백신접종의 수를 더욱 감소시키는데 있어서 효과적인 방법을 제공할 것이다. 또한, 백신접종은 약물 내성과 관련이 있는 문제를 회피하는 추가적인 이점을 가진다.
여러가지 특정 백신들의 개발이 리슈마니아증에 대해 고려되는 한, 시험관내 (in vitro) 및 마우스 모델을 이용하여 다수의 항원이 가변적인 성공률로 시험되어 왔다. 현재까지 개발된 여러 백신들 중에서, 열사균 백신 (heat killed vaccine)이 가장 보편적인 것이다. 첫 번째 연구는 메르티올레이트-사균된 다섯 균주들의 리슈마니아 메이저 (L. major)의 풀 (pool)이 백신으로 사용된 이중맹검 무작위 시험 (double blind randomized trial)이었다. 그 결과, 피부 리슈마니아증에 대한 보호는 플라시보 (placebo) 및 백신에서 각각 23%와 60%인 것으로 나타났다. 유사한 방법이 인도의 CDRI Lueknow에서도 사용되었는데, 열사균 (자동분열) 리슈마니아 도노바니와 함께 마이코박테리움 하바나 (Mycobacterium habana) 및 리슈마니아 메이저와 함께 BCG가 내장 및 피부 리슈마니아증에 대한 백신으로 사용되었다. 상기 백신은 양호한 보호 효능을 나타내지만, 항원이 미미한 정도의 보호만을 제공하고, 면역증강제로서 BCG를 필요로 하며, 접종 부위에서 국소적인 알레르기 반응을 일으킨다는 주요한 문제점이 있다. 비록 백신의 단회 투여 (single dose)가 원숭이에서 보호를 제공했지만, 모든 동물들은 접종 후 90일째에도 간헐적인 기생충을 가졌다.
이란에서는, 혼합 BCG-L. 메이저 사균 백신이 안전성 및 효능에 대한 임상 시험 또한 받았다. 비록 이는 안전한 것으로 증명되었지만, 효능은 겨우 35 %이었다.
사균 백신에 비해 약독화 생백신의 상대적인 이점은 많은 항균 및 바이러스 백신에 관한 논쟁의 지속적인 주제가 되어왔다. 가장 주목할만한 논쟁은 면역원성 (immunogenicity), 효능, 안전성, 제조 및 유통의 용이성, 및 안정성에 관한 것들이었다. 무독성으로 표지될 수 있는 임의의 리슈마니아 균주의 명확한 유전적 프로파일이 없어서, 약독화 생백신의 사용 가능성은 중지되어왔다. 그러나, 유전자를 도입 또는 제거함으로써 리슈마니아 게놈을 조작하는 최근의 진전은 약독화 생백신을 발생시키기 위한 방안 및 가능성을 열었다. 예를 들어, 효소인 디히드로폴레이트-리덕타아제-티미딜레이트 합성효소 (DHFR-TS)를 인코딩하는 유전자를 결실시킴으로써, 포유동물의 숙주에서 장기 생존에 필요한 유전자가 결실된 기생충을 발생시키는 것이 가능하게 되었다. 마우스 모델에서, DHFR-TS가 결실된 리슈마니아 메이저 기생충은, 리슈마니아 메이저 및 리슈마니아 아마조네시스 (L.amazonensis)의 감염에 대해 보호를 유도한다. 그러나, 이러한 백신은 실지로 대규모 제조 및 유통에서 단점이 있다. 또한, 리슈마니아 도노바니에 대한 백신의 보호 효능을 평가하기 위한 연구는 수행되지 않았다.
고려중인 더욱 새로운 백신은 재조합 DNA-유래 항원 및 펩티드를 포함한다. 표적 항원들 중 일부는 종 특이적이고 수명 주기 단계에 특이적인 반면, 다른 것들은 전편모형 (promastigote)과 무편모형 (amastigote)으로 나뉜다. 일부는 리슈마니아 종들 가운데 보존되는 반면에, 다른 것들은 그렇지 않다. 또한, 이러한 백신이 가지는 가장 큰 또 다른 장점은 정제된 면역원으로 전달될 수 있다는 것인데, 이는 네이키드 DNA (naked DNA)가 이들을 인코딩하기 때문이다. 또한, 유전자 조작으로 이들 항원을 특정 위치. 또는 1차 T 세포 반응의 개시에 필수적인 것으로 여겨지는 수지상 세포 또는 랑게르한스 (Langerhans) 세포와 같은 특정 항원-제시 세포를 표적할 수 있다.
리슈마니아증에 대한 백신으로 사용된 최초의 재조합 항원은 리슈마니오리신 (leishmaniolysin) 또는 gp63 이었다. 이것은 모든 종들의 전편모형에 존재하는 막 엑토-메탈로프로테아제 (membrane ecto-metalloprotease)이다. gp63은 또한 숙주 대식세포에 대한 기생충 수용체들 중 하나이고, 이 단백질이 결실된 기생충 돌연변이체들은 독성이 없는 것으로 보고되었다. Gp63은 전편모형이 보체-매개 세포용해 (cytolysis)에 대한 내성을 갖도록 함으로써 전편모형을 조력하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 (아마도 LPC와 함께 작용하여), 수용체-매개 세포내이입 (endocytosis)을 통한 전편모형에 의해 대식세포를 감염시키는 것으로 보인다. 그러나, 그 효능은 겨우 50 %에 불과하고 더 높은 농도에서도 마찬가지인 것으로 확인되었다. 이는 몇 가지 인자들 때문일 수 있다. 상기 항원은 처리를 위해 천연 형태에 있어야 할 필요가 있고, 대장균 (Escherichia coli)-유래 재조합 단백질들은 이러한 요건을 충족시킬 수 없을 것이다. 상기 낮은 성공률의 또 다른 이유는 일부 펩티드가 중요치않은 면역원에 불과하기 때문일 수 있었다.
gp63 이외에도, LACK 및 A2와 같은 다른 항원들 또한 시험되었지만, 그 결과는 만족스럽지 못하다. 이러한 단일 항원 백신의 실패로 인해, 복합 폴리펩티드 백신이 개발되기에 이르렀다. 한 가지 후보물질은 리슈마니아 항원의 티올-특이적 항산화제, 리슈마니아 메이저 스트레스-유발성 단백질 1 (LmST1l), 및 인체용으로 적당한 모노포스포릴 지질 A-스쿠알렌 (MPL-SE)을 이용하여 전달되는 리슈마니아 연장 개시 인자 (LeIF)의 직렬 융합체 (tandem fusion)를 포함하는 재조합 폴리단백질이다. 이러한 백신 후보물질은 인체 임상 시험에서 피부 리슈마니아에 대한 최초의 백신으로서, 정상의 건강한 사람을 대상으로 1 단계 및 2 단계 안전성 및 면역원성 시험을 완료하였다. 또한, 상기 백신 후보물질은 햄스터 모델에서 내장 리슈마니아증에 대한 양호한 보호 효능을 나타낸다.
네이키드 DNA 백신은 최근에 보편화되었고, 감염성 질환, 특히 바이러스 및 박테리아에 대한 예방 및 치료방법에 혁신을 일으켰다. 그러나, DNA 백신은 말라리아를 제외하고는, 기생충학 분야를 많이 침식하지 못하였다. 인도에서는 리슈마니아 도노바니에 대한 DNA 백신에 대한 연구가 진행중이다. ORPF 유전자를 백신접종하자, ORPF에 대한 체액성 및 세포면역반응이 유도되어, 마우스 모델에서 리슈마니아 도노바니를 이용한 공격접종에 대해 유의적 수준의 보호를 제공하였다. 그러나, 영장류 모델이나 페이즈 트레일 (phase trail)에서의 효능 연구를 포함하여, 인간에게 적용하기 위한 더 이상의 연구는 수행되지 않았다.
마이코박테리움에 대한 백신을 개발하기 위하여, 면역화 연구는 결핵 및 나병에 대한 부분적이지만 가변적 보호를 제공하는 마이코박테리움 보비스 (M. bovis)의 백신 균주 [Bacilli Calmette-Guerin (BCG)]에 대하여 주로 수행되고 있다. BCG는 마이코박테리움 보비스의 분리된 균주의 약독화에 기인한다. 이는 1921년에 인간용 결핵 백신으로 소개되었고 낮은 부작용 발생률로, 비교적 안전하게 이용되어 왔다. 일부 연구에서 BCC 백신접종은 1차 감염에 대한 면역 반응을 효과적으로 강화시키지만 차후의 비활동 및 재활성화 단계에서 제한된 효과를 가지는 것으로 나타났다. 10 내지 15년 후에는 보호 효과가 거의 나타나지 않기 때문에, 어린 시절의 백신접종이 성인이 되어서도 재감염을 예방하지 않음을 알 수 있다.
BCG 백신의 안전성은 HIV 전염병 다음으로 중요해지고 있는 고려사항이다. 면역약화된 개체에서 BCG의 가능한 부작용을 회피하기 위하여, 전술한 방법을 이용하여 BCG 영양요구균 (auxotroph)이 개발되어 왔다. 영양요구균은 야생형이 필요로하지 않는 특정 영양물 또는 대사산물을 필요로하는 돌연변이체이다. 따라서, 이러한 돌연변이체들는 숙주가 특정의 영양물을 상실하는 경우 숙주내에서 단기간 동안만 생존할 수 있다. 이러한 다섯 균주들은 중증 복합 면역결핍증(SCID)을 갖는 마우스에 대해서는 안전성이, 그리고 마우스의 민감성 균주에 대해서는 보호 효과가 시험되었다. 그 결과, 이들 균주들은 SCID 마우스에서 안전하였고, 민감성 마우스에서는 정상 BCG와 동일한 양의 보호 면역을 나타냄으로써 더욱 안전한 백신접종 방법이라는 것이 확인되었다.
BCG 대체물에 대한 연구에서 오늘날 이용되는 혁신적인 백신은 단백질 또는 DNA 백신이다. 이는 결핵균에 의한 실험적 감염에 대하여 부분적인 보호를 유도할 수 있는 단일 마이코박테리아 항원을 발현하는 다수의 단백질 및 DNA 분자를 포함한다. 이러한 항원들 중 일부는 대식세포에 체류하는 동안 마이코박테리움에 의해 분비되는 것들인데, 이의 예로는 i) 단백질의 항원 85 복합체 (85A, 85B, 85C), ii) 조기 분비된 항원 표적 (ESAT-6)으로 명명되는 6 kDa 단백질, iii) PhoS와 상동성을 갖는 38 kDa 지질단백질, iv) 65 kDa 열충격 단백질 (Hsp 65), v) 프롤린 및 트레오닌이 풍부한 55 kDa 단백질, 및 vi) 19 kDa 지질단백질이 있다.
또한, 본 출원인은 광범위한 연구를 수행한 결과, 내장 리슈마니아증 및 결핵에 대한 여러 백신 후보물질들이 개발되었지만, 이들 중 어느 것도 SEQ. ID No.1 및 SEQ ID No.2를 갖는 리슈마니아증 및 결핵균의 키메라로서 개발되지 않았음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 주제와 관련이 있는 키메라 구조체, DNA 및 재조합 폴리펩티드 백신 구조체에 관한 몇 개의 미국 특허 및 본 출원의 구조체의 독창성을 설명하기로 한다.
2007년 3월 13일에 공표된 Bedate 등의 미국 특허 제7,189,399호는 개과동물 리슈마니아증의 혈청학적 진단에 유용한 것으로, 리슈마니아 인판툼 (L. infantum)의 네 개 단백질의 항원 결정기를 인코딩하는 DNA 서열로 형성되어 있는 키메라 유전자 및 그로부터 얻은 단백질에 관하여 기재하고 있다. 기재된 화합물은 키메라 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 키메라 폴리펩티드는 내장 리슈마니아증을 갖는 개의 혈청에 의해 인식되고 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 리슈마니아 인판툼 유래의 LiP2a, LiP2b, LiH2a, 및 LiPO 단백질 각각으로부터 유래하는 적어도 하나의 항원 결정기를 함유한다. 상기 화합물은 개과동물 리슈마니아증의 혈청학적 진단에 유용하다.
리슈마니아 인펀텀 유래의 폴리펩티드의 키메라가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명은 폴리뉴클레오티드의 키메라이다.
2005년 11월 14일에 발행된 Zhongming의 국제특허 제WO/2006/053485호는 키메라 결핵균 유전자 백신 및 이의 제조방법에 관하여 기재하고 있다. 키메라 결핵균 유전자 백신이 제공된다. 상기 백신은 결핵균의 구조적 단백질을 인코딩하는 Ag85a 유전자 및 결핵균의 ESAT6 유전자를 포함하는데, 상기 ESAT6 유전자는 Ag85a 유전자의 서열에 삽입되고, 상기 Ag85a 유전자는 진핵세포 발현 벡터 pVAXI에 삽입된다. 상기 발명의 조성물은 마우스 및 원숭이에서 면역계를 유도하기에 유용하다.
상기 국제 특허는 결핵만을 제어하기 위한 키메라 백신을 개시하였다. 또한, 키메라 구조체가 발현하는 항원은 복합 키메라 항원이었다. 그러나, 본 발명은 리슈마니아증 및 결핵 모두를 제어하는데 유용한 키네신 모터 도메인 및 esat-6 유전자의 키메라를 제공한다. 또한, 상기 구조체는 키메라 펩티드의 발생 대신에 키메라 구조체로부터 두 유전자의 개별적 발현이 가능하도록 디자인된다.
2003년 1월 29일에 공표된 Soto 등의 유럽특허 제EP1279679호는 면역화된 개체 또는 세포군에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 조성물 및 방법에 관하여 개시하고 있다. 상기 조성물은 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열로 이루어진 Lip2a 리슈마니아로 명명되는 단백질을 포함한다. 상기 발명의 조성물은 상기 조성물이 접종된 개체에서 체액성 또는 세포성 반응을 촉진하는데 유용하다. 또한, 상기 발명은 키메라 분자 또는 SEQ ID No.1 및 SEQ IO No.2를 다루고 있지 않다.
1997년 10월 7일에 공표된 Olafson의 미국 특허 제5,674,503호는 리슈마니아증에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드 및 이의 사용방법에 관하여 개시하고 있다. 상기 발명은 펩티드 또는 면역원을 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그러나, 본 발명은 펩티드를 다루고 있지 않다.
1998년 4월 7일에 공표된 Content 등의 미국 특허 제 5,736,524호는 폴리뉴클레오티드 결핵 백신에 대하여 개시하고 있다. 상기 발명은 인간과 같은 포유동물을 포함하여, 생채내 (in vivo)에서 척추동물에게 직접 도입되는 경우, 상기 동물 내에서 인코딩된 단백질의 발현을 유도하는 DNA 구조체를 제공한다. 그 결과, 상기 발명의 설명에 나타난 바와 같이, 결핵균 감염에 대한 보호 면역 반응을 발생시키기 위한 목적으로 결핵균 폴리뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 유도한다.
상기 특허는 DNA 백신을 개시하였지만 키메라를 다루고 있지 않다. 또한, 상기 DNA 백신은 결핵을 제어하는 데에만 유용하다.
발명의 목적
본 발명의 주목적은 인도 풍토병으로서, 두 가지의 중요한 세포내 병원체인 결핵 및 리슈마니아증에 대한 예방 및 치료에 사용될 수 있는 키메라 DNA 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 리슈마니아 도모바니 균주 MHOM/IN/KE-16/1998의 인도 분리주 (Indian isolate) 유래의 키네신 유전자의 모터 도메인 영역 및 결핵균 Rv 균주의 esat-6 영역을 이용함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 SEQ ID. No.l 및 SEQ ID. No.2로 나타낸 유전자들을 SEQ ID No.3으로 나타낸 자가분열 펩티드를 코딩하는 유전자의 양측에 라이게이션 (ligation)시킴으로써 키메라 분자를 발생시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포 기관 (리보솜, tRNAs, 및 기타 번역 인자들)에 의해 번역할 수 있는 DNA 백신 벡터 pVAX-I (Invitrogen)에 상기 키메라 분자를 클로닝하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 구조체의 시험관내 (in vitro) 발현을 연구하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 BALB/c 마우스 모델, 고등동물 및 최종적으로 인간에서 SEQ ID NO:1 및 SEQ IO NO:2로 구성되는 DNA 키메라 백신 구조체의 면역원성을 연구하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 투여시 포유동물 및 인간을 마이코박테리움 (Mycobacterium spp) 및 리슈마니아 (Leishmania spp)로부터 보호하는 DNA 백신 후보물질로서, 전사조절요소에 작동가능하게 연결된 상기 구조체로 구성되는 DNA 백신 후보물질을 제공하는 것이다.
발명의 설명
본 발명에 따르면, 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 영역이 DNA 백신 벡터 pVAK-1에서 자가절단 펩티드(self-cleaving peptide)의 양측에 함께 클로닝되어 있는 신규한 재조합 키메라 DNA 구조체로서, 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 재조합 키메라 DNA 구조체가 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, 신규한 재조합 키메라 DNA 구조체의 제조방법으로서,
a) 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용하여 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 예측되는 단백질 서열을 분석하는 단계,
b) 상기 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 유전자 코딩 증폭 단계를 행하는 단계,
c) 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 키네신 esat-6-유전자 영역을 클로닝하는 단계,
d) pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝 (directional cloning)에 의해 키메라 구조체를 발생시키는 단계,
e) 무세포 번역 시스템을 이용한 상기 클론 유래의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 시험관내 발현 분석 단계 및 상기 구조체를 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는 제조방법이 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1: (A) 무작위 MHC Class-1 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용한 키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 예측되는 단백질 서열 분석을 나타낸다.
도 2: (A) 키네신 모터 도메인의 증폭 결과, B) east-6 영역의 증폭을 나타낸다.
도 3: 리슈마니아 도노바니의 키네신 유전자 모터 도메인 영역 및 결핵균의 esat-6 영역이 서열분석 및 확인을 위해 pGEM-T® 벡터에 각기 클로닝되어 있는 클론의 제한 (restriction) 분석을 나타낸다. 레인 M: lOObp 분자량 마커 (MBI Fermentas); 레인 1 및 4: 삽입물로서 키네신 모터 도메인을 갖는 클론; 레인 5: 삽입물로서 esat-6 (RV-3875) 유전자를 갖는 클론; 레인 2, 3 및 6: 빈 (empty) 플라스미드.
도 4: 키메라 분자 키메라 구조체의 발생 및 이들의 특이적 제한 부위를 나타낸다.
도 5: 키메라 구조체를 갖는 pVAX-1-LOMT 벡터의 지도 (map)를 나타낸다.
도 6: 키네신 모터 도메인 영역 및 esat-6 영역이 자가절단 (self-cleaving) FMDV-2A 펩티드의 양측에 함께 클로닝되어 있는 키메라 pVAX-l® 클론의 제한 분석을 나타낸다. 레인 1, 2 및 5: 키네신을 갖는 키메라 (BstX1 및 Apa1); 레인 3: 키네신 및 FMDV를 갖는 키메라 (BamH1 및 Apa1); 레인 4, 6 및 7: esat-6를 갖는 키메라 (HindⅢ 및 BamH1); 레인 8: 100 bp 마커 (MBI®).
도 7A 및 도 7B: 키네신 모터 도메인 영역 및 esat-6 영역이 클로닝되어 있는 개개의 pVAX-1® 클론의 제한 분석을 나타낸다. 도 7A에서, 레인 1: 100 bp 마커 (MBI®); 레인 2 및 3: 키네신을 갖는 pVAXl; 레인 4 및 5: 빈 플라스미드; 도 7B에서, 레인 1: 100 bp 마커 (MBI®); 레인 2 및 3: 빈 플라스미드; 레인 4 및 5: esat-6을 갖는 pVAXl.
도 8: 무세포 번역 시스템을 이용한 클론의 시험관내 (in - vitro) 발현 분석을 나타낸다.
(A) 키네신 모터 도메인의 시험관내 발현의 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석을 나타낸다. 레인 M: 사전염색된 분자량 마커 (MBI®); 레인 1 및 2: 키메라 구조체로부터 키네신의 시험관내 발현; 레인 3: 개개의 키네신-pVAXl 구조체의 시험관내 발현; 레인 4: VL 양성 환자의 혈청으로 프로브 (probe)된 정제 rLvacc.
(B) ESAT-6 도메인의 시험관내 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 M: 사전염색된 분자량 마커 (NEB®); 레인 1 및 2; 키메라 구조체로부터 ESAT-6의 시험관내 발현; 레인 3: 개개의 ESAT-6-pVAXl 구조체로부터 ESAT-6의 시험관내 발현; 레인 4: TB 양성 환자의 혈청으로 프로브된 정제 ESAT-6.
도 9: 비장세포 (splenocyte) 증식 어세이 (assay)를 나타낸다.
도 10: 백신접종에 대한 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 반응을 나타낸다.
도 11: 키메라 백신 구조체가 주사된 마우스 군에서 키네틴 모터 도메인 및 ESAT-6에 대한 DTH 반응을 나타낸다.
서열 목록에 있는 서열의 간단한 설명
SEQ ID NO : 1은 리슈마니아 도노바니 균주 MHOM/IN/KE-16/1998의 인도 분리주 유래의 키네신 모터 도메인 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 2는 결핵균 Rv 균주 유래의 esat-6 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 3은 구제역 바이러스 (FMDV) 유래의 2A 펩티드 유전자 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 키네신 모터 도메인 유전자, esat-6 유전자 및 FMDV 2A 펩티드 유전자를 포함하는 전장 (full length) 키메라 구조체의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 키메라 구조체의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO : 6은 합성 올리고뉴클레오티드 LF의 서열이고, SEQ ID NO : 7은 합성 뉴클레오티드 LR의 서열이고, SEQ ID NO : 8은 합성 뉴클레오티드 ESAT-P의 서열이고, SEQ ID NO : 9는 합성 뉴클레오티드 ESAT-R의 서열이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 류시마니아증 및 결핵의 제어를 위한 단일 백신 후보물질을 제공한다. 또한, 본 발명은 인간과 같은 포유동물을 포함하여 척추동물의 생체내로 직접도입되는 경우 상기 동물내에서 두 개의 인코딩된 단백질의 발현을 동시에 유도하는 플라즈마 구조체 분자를 제공한다. 본 발명의 구현예는 SEQ ID NO. 3의 양 측에 접합되고 포유동물 발현벡터 pVAX-1에서 클로닝되는, SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 2의 구조체를 포함한다. 상기 플라스미드는 진핵세포 기관(리보솜, tRNAs, 및 기타 번역 인자)에 의해 번역될 수 있는 경우, 세포에 흡수되어 핵내로 이동된다. 플라스미드 DNA의 흡수 효율 및 발현은 낮을 수 있지만, T 세포 및 B 세포 모두에서 면역 반응을 일으키기에 충분하다는 많은 증거들이 있다.
유전자 생성물이 아닌 유전자로 면역화하는 경우 몇 가지 장점들이 있다. 첫째는 천연 또는 거의 천연의 항원이 비교적 간단하게 면역계에 제시될 수 있다는 점이다. 박테리아, 효모, 또는 표유동물의 세포에서 재조합적으로 발현된 포유동물의 단백질은 흔히 적절한 면역원성을 확보하기 위해 광범위한 처리를 필요로 한다. DNA 면역화의 두 번째 이점은 면역원이 MHC class I 경로에 들어가서 세포독성 T 세포 반응을 일으킬 수 있다는 점이다.
임의의 백신의 개발을 위한 첫 번째 단계는, 백신 개발을 위한 특정 후보물질을 선택하는 것이다. 이전의 연구 및 SEQ ID No. 5에서 나타낸 아미노산의 인-실리코 분석 (in-silico analysis)에 기초하여, 본 발명자들은 여러가지 HLA 타입에 대한 에피토프 (epotope)를 예측하는 MHC-1 예측 소프트웨어를 이용하여 키메라 DNA 백신의 후보물질로서 키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인을 선택하였다 (도 1).
우선, Kala-azar 환자의 임상 시료로부터 NNN 배지의 전편모형으로서 기생충을 분리하고, 그 다음 10 % 열 불활성화 FCS를 함유하는 배지 199에서 25 ℃로 성장을 위해 적응시켰다. 일상유지를 위해, 기생충을 함유하는 접종원의 시료를 10% FCS가 첨가된 4 ml의 배지 199와 함께 배양 튜브내로 무균적으로 도입하였다. 상기 튜브를 25 ℃의 BOD 배양기에 위치시키고, 정기적 간격으로 현미경을 이용하여 성장을 모니터하였다.
기생충의 대량 배양을 위해, 기생충 함유 접종물의 시료를 500 ml 조직 배양 플라스크내의 10 % FCS를 함유하는 20 ml의 M199에 무균적으로 도입하고, 25 ℃의 냉각된 배양기에서 중간 대수기 (mid log phase)(7 - 10일)까지 배양하였다. 그 다음, 그 기생충을 수확하고 핵 DNA 분리에 사용하였다.
중간 대수기의 기생충을 냉동 원심분리기에서 5000 rpm의 원심분리에 의해 수확하였다. 기생충 핵 DNA를 약간 변형된 표준 프로토콜에 따라 분리하였다. 대략 1-5 × 109 개의 전편모형을 10배 체적의 용해 완충액 (NaCl,100 mM, Tris-HCl, 1O mM (pH 8.0), EDTA 1O mM, 프로테이나제 K/ml 100 pg, 사코실 1.5 %)에서 60 ℃로 3시간 동안 용해시켰다.
운동핵 DNA 네트워크를 27,000×g에서 1시간 동안 원심분리에 의해 침전시켰고, TE 완충액 (Tris-HCl (pH 8.0) 1O mM, EDTA (pH 8.0) 1 mM)에서 다시 현탁되었다. kDNA의 침전 후에 남아있는 상청액으로부터 핵 DNA를 분리하였다. 단백질을 더 절단하기 위해 그 상청액을 65 ℃에서 밤새 배양하였다. 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가하고 완전히 혼합한 다음, 5000 rpm에서 15분간 원심분리로 침전시킴으로써, 핵 DNA를 페놀/클로로포름으로 몇 회 추출하였다. 1/10th 체적의 3M-아세트산나트륨 및 2배 체적의 100 % 에탄올을 첨가하고 잘 혼합함으로써 상기 핵 DNA를 침전시키고, -20 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 30분간 5000 rpm으로 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70 % 에탄올로 세척하고, 건조시켰으며, TE 완충액에 다시 현탁시켰다. 상기 DNA의 농도 및 순도는 260/280 nm에서 OD를 분석함으로써 측정하였다. 상기 DNA를 사용시까지 70 ℃에서 저장하였다.
마찬가지로, 결핵균의 Rv 균주를 LJ 배지상에서 유지시켰다. DNA 분리를 위해, 몇 개의 분리된 콜로니들을 LJ 배지로부터 선택하고, TE 완충액에서 다시 현탁시켰다. 표준 프로토콜에 따라 DNA 분리를 수행하였다. 100 μl의 펠릿 배양균을 400 μl의 TE 완충액에 현탁시키고 DNA 분리를 진행하였다. 그 다음, 그 시료를 100 ℃에서 비등하였고, 그 다음, 라이소자임, SDS 및 프로테이나제 K로 처리하였다. 그 다음, 상기 시료를 볼텍싱하고 CTAB와 함께 배양하였다. 그 핵 DNA를, 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가하고, 완전히 혼합한 다음, 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 페놀/클로로포름으로 몇 번 추출하였다. 그 핵 DNA를 이소프로판올을 이용하여 침전시켰다. 그 혼합물을 4 ℃에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70% 에탄올로 세척하였고, 건조시킨 후, TE 완충액에 다시 현탁하였다.
50 ng의 분리된 핵 DNA를 이용하여 키네신 및 esat-6 유전자의 증폭을 위한 PCR을 하기와 같이 실시하였다. 키네신 유전자의 경우, 프라이머는 키네신 유전자 (가입번호: AY615866)에 대한 유전자 은행 (GenBank)의 서열 데이터에 기초하여 디자인하였다. 리슈마니아 도노바니 KE-16 균주로부터 이용가능한 키네신 유전자 서열은 길이가 2967 bp이고, 추정 (putative) ATG 출발 코돈과 함께 위치 361로부터 ORF를 갖고 위치 2967의 최종 염기까지 연장된다. SEQ ID No. 6 및 SEQ ID No. 7의 프라이머는 키네신 모터 도메인 영역을 증폭시키기 위해 디자인하였다. esat-6 영역의 증폭을 위해, 국제 특허 공개 제WO/2005/061730호에 기재된 것으로 SEQ ID No. 8 및 9에서 나타낸 프라이머를 약간 변형하여 사용하였다.
에어로졸이 없는 피펫 팁을 이용하고 전-PCR 및 후-PCR 생성물을 각기 유지시킴으로써, 앰플리콘의 오염을 회피하였다. 모든 PCR 반응은 음성 대조군 세트와 함께 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다.
키네신 모터 도메인의 증폭을 위한 칵테일은 10×Taq 완충액 5.00 μl, 1.2 mM dNTPs 8,00 μl, 정방향 프라이머 (25 μM) 1.00 μl, 역방향 프라이머 (25μM) l.OOμl, O.5 μl Taq DNA 폴리머라아제 (5U/μl), 템플릿 (template) DNA 3.00 μl, 멸균수 (체적을 50.00 μl로 만들기 위함)을 포함한다. 그 튜브를 열 사이클러 (MJ Research, USA)에 위치시킨 다음, 30 사이클을 증폭시켰다.
마찬가지로, esat-6 영역의 증폭은 10×Taq 완충액 2,5 μl, 1.25 mM dNTPs 4.00 μl, 정방향 프라이머 (2nM) 0.5 μl, 역방향 프라이머 (2nM) 0.5 μl, 0.5 μl Taq DNA 폴리머라아제 (5U/μl), 템플릿 DNA 5.OOμl, 멸균수 (체적을 25.00 μl로 만들기 위함)을 이용하여 수행하였다. 그 튜브를 열 사이클러 (MJ Research, USA)에 위치시킨 다음, 30 사이클을 증폭시켰다.
증폭된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분해하였다. 상기 겔을 자외선 투영기 (UVP)를 이용하여 시각화하였다 (도 2A 및 2B).
PCR 증폭 후 키네신 및 esat-6 유전자를 TA 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 상기 PCR 증폭 DNA를 아가로스 겔 상에서 분해하고, 관련 밴드를 함유하는 부분을 무균 매스(scalpel)를 이용하여 절개하였다. 그 DNA를 겔 용출 키트 (gel elute kit) (Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기 겔로부터 용출시켰다. 용출된 DNA의 농도를 분광계를 이용하여 260 nm의 흡광도에서 측정하였다.
관련 겔 정제 PCR 생성물을 pGEMT-Easy 벡터에 직접 라이게이션하였다. 0.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에서, 하기의 성분들을 첨가하였다 : 2×급속 라이게이션 완충액 5μl, pCEM-T Easy 벡터 (50 ng), 2.00 μl DNA (200 ng), 1.00 μl T4 DNA 리가아제 (3U/μl), 물 (체적을 10.00 μl까지 만들기 위함). 부드럽게 혼합한 후, 상기 튜브를 4 ℃에서 밤새 배양하고 70 ℃에서 10분간 가열하였다. 상기 시료를 형질전환에 앞서 -20 ℃에서 보관하였다.
그 다음, 상기 라이게이션된 혼합물을 열 충격 처리에 의해 형질전환시켰다. 염화칼슘 방법을 이용하여 컴피턴트 (competent) 세포 JM-109를 제조하였다. 대략 5 μl의 라이게이션 혼합물을 컴피턴트 세포(200 μl)와 함께 부드럽게 혼합하고, 얼음에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 그 세포를 42 ℃로 설정된 42 ℃의 워터배쓰 세트에 90초간 두었고 (열 충격), 즉시 얼음으로 옮겼다.
800 μl의 LB 배지를 상기 세포에 첨가하고, 교반하면서 (150 rpm) 37 ℃에서 90분간 유지시켰다. 그 세포를 100 μg/ml의 암피실린 (ampocillin)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 16 μl의 X-gal 및 lO μl의 1M IPTG로 염색하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 배양하였다. 백색 콜로니를 선택하여 삽입 (insert)을 검사하였다.
스크리닝을 위해, 알칼리성 용해 방법을 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 이를 위해, 멸균 이쑤시개로 콜로니를 채집하고, 5 ml의 새로운 배지에 접종하였다. 밤새 성장시킨 배양균을 펠릿화하고, 그 세포를 50 mM 글루코스, 25mM tris-Cl, 1OmM EDTA (pH-8.0)에 다시 현탁시켰으며, 상기 펠릿을 현탁한 후, 그 세포를 NaOH 및 1% SDS로 용해시키고, 그 용액을 포타슘 아세테이트 및 빙초산의 첨가에 의해 중화시켰다. 그 세포 용해물을 12000 RPM으로 5분간 원심분리하여 펠릿을 침전시켰다. 그 다음, 그 상청액을, 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가함으로써 페놀/클로로포름으로 수 회 추출하였다. 마지막으로, 그 플라스미드 DNA를 이소프로판올로 침전시켰다. 그 혼합물을 4 ℃에서 5 분간 10,000 rpm으로 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70 % 에탄올로 세척하고, 건조시켰으며, TE 완충액에 다시 현탁하였다.
벡터의 다중 클로닝 부위에 접하는 적절한 제한효소 부위를 이용하여 상기 재조합 플라스미드의 제한효소 분석을 실시하였다. 상기 반응은 다음과 같이 실행하였다: 플라스미드 DNA 16.00 μl (2μg), 1O×반응 완충액 4.00 μl, 제한효소 O.5 μL (2 units), 멸균수 (체적을 40.00μl까지 만들기 위함). 상기 반응을 37 ℃에서 6 내지 8 시간 동안 배양하고, 그 생성물을 표준 분자량 마커와 함께 1.5 % 아가로스 겔 상에서 분석하였다 (도 3). 제한 절단에 의해 검출되는 바와 같이 삽입물을 함유하는 양성 클론을 서열분석에 이용하고 글리세롤 스톡으로 보존하였다.
모든 서열분석은 자동화 DNA 서열분석장치 (ABI Prism version 7.0)에서 사슬 종결 방법 (chain termination method)에 따라 실시하였다. 상기 서열은 Clustal W (multile alignment of various sequence files), MHC 예측 소프트웨어와 같은 여러가지 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이와 더불어, 여러 웹사이트로부터 BLAST 옵션을 이용하여 서열 상동성을 조사하였다.
서열 변이에 따라, 그 다음 수행한 것은 키메라 분자를 발생시키는 것이었다 (도 4 및 도 5). 이를 위해, SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2에 나타낸 클로닝된 단편을 적절한 제한효소로 절단하여 잘라내었다. 또한, SEQ ID No. 3에서 나타낸 FMDV 2A 단편을 절단하고, SEQ ID No. 1 및 2와 함께 라이게이션하였다 (도 4). 상기 반응은 다음과 같이 실행하였다: 10×완충액 - 2.5 μl, 키네신 모터 도메인 - 8 μl (lμg), esat-6 유전자 - 6 μl (lμg), FMDV 2A 영역 - 3 μl (1μg), T4 DNA 리가아제 - 1.5 μl (6 units), 및 멸균수 (25 μl의 체적을 만들기 위함). 상기 라이게이션 반응은 4 ℃에서 밤새 진행하였다.
발생한 키메라 분자를 정제하고, pVAXl 벡터 (pVAXl-LDMT)와 함께 라이게이션하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: 1O×완충액 - 2.0 μl, 키메라 분자 - 15 μl (6 μg), pVAX-l 벡터 - 2 μl (2 μg), T4 DNA 리가아제 - 1.0 μl (5 Units), 및 멸균수 (20 μl의 체적을 만드는 양) (도 5). 라이게이션 이후, 재조합 결핍 및 엔도뉴클레아제 (endonuclease) 결핍 DH5 α-E. coli 균주를 전술한 프로토콜에 따라 pVAXl-LDMT를 이용하여 형질전환하였다. 그 클론을 카나마이신 플레이트상에서 선별하고 플라스미드 DNA를 분리했으며, BstXl 및 Apal (키네신 모터 도메인), BamH1 및 Apa1 (키네신 및 FMDV 영역), BamH1 및 HindⅢ (esat-6 유전자)로 절단하여 삽입물을 확인하였다 (도 6). 또한, 서열분석을 이용하여 확인하였다. 상기 키메라 구조체의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4에 나타내었다. SEQ ID No. 4로부터 해독된 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5에 나타내었다.
키메라 구조체 이외에도, 전술한 프로토콜을 이용하여 pVAX-1 벡터에 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2를 삽입함으로써 개개의 구조체를 발생시켰다. 상기 개개의 구조체는 키메라 백신의 효능을 개개의 백신 후보물질의 효능과 비교하기 위한 것이었다 (도 7A 및 도 7B).
서열이 적당히 라이게이션 및 발현되었는지를 확인하기 위하여, TNT 결합 전사/번역 시스템 (Promega)을 이용하여 시험관내 발현 분석을 수행하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: TNT 급속 마스터 믹스 (quick master mix) 40 μl, 정제된 키메라 - pVAX1 구조체 (pVAXl-LDMT) - 5μl, 뉴클레아제가 없는 물 (50 μl의 체적을 만드는 양).
키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 발현을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질의 시험관내 반응 혼합물을 16 % 트리신 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 반-건조 블롯팅 장치 (Bio-Rad®, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 니트로셀룰로스 막 (Millipore)으로 옮겼다. 상기 막을 5 % 탈지유로 블로킹하고, PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)으로 각각 10분간 세 번 세척한 다음, 실온에서 환자 혈청 및 토끼 혈청의 1:50 희석액 (PBS에서, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 1 시간 동안 배양하였다. 상기 막을 PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 세 번 세척한 다음, 비오틴-결합 항-인간 IgG의 1:1000 희석액 (PBS에서, pH 7.0, 1% BSA)과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체와 함께 배양한 후, 상기 막을 세척한 다음, 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase)에 결합된 1차 기질 아비딘 (avidine)과 반응시켰다. PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 각각 10분간 세 번 세척한 후, 그 블롯을 기질로서 DAB (Amresco) 및 0.1 % H2O2를 이용하여 발색시키고, 밴드를 막 상에서 직접 시각화하였다 (도 8A 및 도 8B).
동물 윤리 위원회로부터 윤리적 승인을 받은 후, 동종번식 BALB/c 마우스 모델에서 상기 키메라 백신에 대한 면역원성 연구를 수행하였다. 이 연구에서 6 내지 8주령의 BALB/c 마우스를 사용하였다. DNA 접종 2일 전에, 대퇴사두근에 0.25% 부피바카인 히드로클로라이드 (bupivacaine hydrochloride)를 함유하는 100 μl의 용액을 주사하여, 차후의 DNA 흡수를 강화하였다. 각각 6 마리씩 4 개의 군을 백신접종 연구, 세포 증식, 사이토카인 생성 및 항체 반응에 사용하였다. 제1군의 마우스에는 키메라 구조체를 주사하였다. 제2군 및 제3군에는 개개의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 구조체를 각각 주사하였다. 빈 플라스미드 (empty plasmid)를 주사한 마우스는 대조군으로 이용하였다. DNA 접종을 위하여, PBS 내의 100 μg의 DNA 구조체를 상기 부피바카인을 주사한 부위와 동일한 근육 부위에 주사하였다. 면역화 2주 후에, 동물에게 추가 접종 (booster dose)을 실시하였다. 마지막 주사후 2주째에, 마우스를 희생시키고 각 군의 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다.
비장은 RPMI 1640 배지를 함유하는 멸균 접시 상에서 무균 조건하에 마우스로부터 제거하였다. 상기 비장을 10 ml 주사기의 플런저 (plunger)의 원반형 바닥을 이용하여 분쇄함으로써 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 5 - 10 ml의 RPMI-1640 배지를 현탁액에 첨가하고 균질하게 혼합하였다. 상기 접시를 2분간 건드리지 않는 상태로 유지시키고, 그 투명한 상청액을 서서히 피펫으로 제거하였다. 세포를 250xg으로 4 ℃에서 10분간 원심분리 (Sigma Centrifuge)하여 펠릿을 얻었다. 적혈구 및 비장세포를 함유하는 상기 펠릿을 모았다. 상기 펠릿을 0.9 % 염화암모늄으로 1회 세척하여 적혈구를 용해하였다. 남아있는 비장세포를 10 % FCS 및 0.05 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 2.5×lO6 cells/ml의 밀도로 다시 현탁하였다. 이로부터 5×1O5 세포를 96-웰 플레이트에서 10 % FCS를 갖는 200 μl의 RPMI 1640에 첨가하였다. 상기 세포를 1 μg/well의 미토겐 (콘카발린 A (Concavalin A), 키네신 및 ESAT-6 항원을 이용하여 자극하였다. 그 다음, 상기 세포를 5 % CO2 및 95 % 습도를 함유하는 분위기에서 37 ℃로 48 시간 동안 배양하였다. MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (Sigma Aldrich, St, Louis, MO, USA)] 분석방법을 약간 변형한 방법 [57]을 이용하여 증식을 측정하였다. 간략하게, MTT 용액 (10 μl, 5 mg/ml)을 200 μl의 배지에 첨가하고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 그 배양 배지를 제거하고, 암청색 포마잔 (formazan) 결정을 산성 이소프로판올 (이소프로판올 내의 100 μl의 0.04 N HCl)에 용해시켰다. ELISA 플레이트 리더 (Biotek Instruments, USA)를 이용하여, 색의 형성을 570 nm에서 측정하였다. 콘카발린 A를 이용한 웰은 양성 대조군으로 이용하였고, 어떠한 자극제도 없는 웰은 음성 대조군으로 이용하였다 (도 9).
또한, 엔도젠 (Endogen) 마우스 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 ELISA 키트 (Pierce Biotechnology, Inc. USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 배양 상청액내의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4의 수준을 측정하였다 (도 10).
상기의 실험 결과로, 키메라 DNA 백신 접종이 발현된 단백질에 대하여 세포 면역 반응을 발생시켜, 유의적으로 높은 수준의 lFN-γ 및 IL-2 (TH-1) 및 낮은 수준의 IL-4 (TH-2)를 생성한다는 것을 밝혀냈다. 또한, 관찰 결과, 키메라 DNA를 이용한 백신접종은 ESAT-6 또는 키네신 모터 단백질을 인코딩하는 개개의 백신 분자보다 더 우수한 세포 면역을 발생시켰다 (도 9 및 도 10).
본 명세서에 기재된 관찰 결과는 상기 키메라 백신이 리슈마니아 도노바니 및 결핵균 동시감염 (co-infection)에 대해 효과적인 백신 방법을 나타낼 수 있음을 알려준다. 또한, 두 개의 유전자를 동시 발현시키면, 강한 세포 면역이 발생함으로써, 두 개의 단백질이 서로에 대하여 면역증강 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 상기의 관찰 결과를 확증하기 위해 보호 연구가 필요하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 참조하여 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이러한 실시예로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 키메라 구조체의 개발을 위한 유전자의 선택
키메라 백신 구조체의 개발 과정에서 첫 번째 단계는 유전자의 분리를 포함한다. 이러한 구조체의 제조를 위해 세 개의 유전자 영역을 선택하였다. 이는 결핵균의 esat-6 유전자, 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역, 및 구제역 바이러스 2A 펩티드 유전자 서열을 포함한다.
esat-6 유전자에 의해 코딩되는 ESAT-6 항원은 결핵균 배양 여과액에서 발견되는 주요 분비 단백질들 중 하나이고, 결핵 환자 및 각종 동물 모델에서 감염 초기 단계에서 세포 매개 면역의 주요한 표적이다. 결핵균의 esat-6 유전자는 esat-6 다중유전자 과 (family)에 속하고, esat-6 부위의 클러스터 (cluster)의 5개의 카피 (copy)를 갖는다. 이러한 클러스터들은 CFP-10 (Ihp) 및 ESAT-6 (esat -6) 유전자 과 (분비된 T-세포 항원을 인코딩함)의 유전자뿐만 아니라, 분비되는 세포벽-관련 서브틸리신 (subtilisin)-유사 세린 프로테아제, 추정적 ABC 트랜스포터, ATP-결합 단백질 및 기타 막-관련 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유한다. 이러한 막과 관련되고 에너지를 제공하는 단백질은 ESAT-6 및 CFP-1O 단백질 과의 구성원들을 분비하는 기능을 하고, 상기 프로테아제는 분비된 펩티드의 처리에 관여할 수 있다. 또한 이러한 유전자 클러스터는 마이코박테리움의 다른 종들 사이에서 보존되었다. 따라서, esat-6 유전자 부위에 기초한 재조합 백신을 개발하는 것은 마이코박테리움의 다른 병원성 균주에 대한 보호 반응 또한 제공할 수 있다.
백신 개발에 적절한 후보물질로서 ESAT-6의 효능을 확인하기 위한 많은 연구들이 이미 수행되어 왔다. ESAT-6에 기초하여 현재까지 개발된 백신 중에는 esat-6 유전자가 삽입된 재조합 BCG, esat-6 서브유닛 (subunit) 백신, 및 후보물질로서 결핵균 유전자 MPT64, AG85B 및 ESAT-6를 갖는 복합 DNA 백신이 있다. 이와 같이 개발된 백신은 모두 양호한 효능을 나타냈으며, 향후 결핵균에 대한 백신접종의 후보물질 중 하나일 수 있다.
후보물질로 선택된 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역은 마우스 모델에서 Th-1 특이적 반응을 유도하는 것으로 이미 알려져 있다. 이 외에도, 이전의 인-실리코 분석 결과, 상기 키네신 모터 도메인 영역은 그의 펩티드 서열 [4]에서 MHC-I & II 결합 에피토프 (epitope) 클러스터를 갖는 것으로 확인되었다. 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인을 코딩하는 유전자는 카네신 단백질 상과 (superfamily)의 구성원이다. 리슈마니아 도노바니에서 상기 키네신 모터 도메인은 소낭, 소기관, 거대 단백질 복합체, 및 세포골격 단편과 같은 여러가지 카고 (cargo)의 세포내 운반 및 세포 분열에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 수준 모두 천연에서 고도로 보존되었기 때문에, 다른 리슈마니아 종과의 80-90 %의 동일성, 트리파노소마 (trypanosome), 마우스 및 인간과 같은 유기체에서는 35-45 % 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 이의 전형적인 역할 외에도, 최근 본 발명자들은 키네신 유전자의 면역우성 반복 영역이 리슈마니아증의 진단에 고도로 민감하고 특이적이며, Ld-rkEl6으로 명명되었음을 확인하였다. Ld-rKE16은 대조 혈청에서 위양성 (false positive) 반응 없이 매우 (100%) 특이적인 것으로 확인되었다. 인도, 파키스탄 및 터키의 VL 및 PKDL 확진 환자 유래의 혈청을 이용하여 ELISA 방법으로 Ld-rKE16 항원을 분석한 결과 100 % 민감성을 나타내었다.
이전의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 두 개의 무작위 MHC Class-I 결합 펩티드 예측 서버를 이용하여 키네신의 인-실리코 분석을 수행하였다. 상기 서버는 신경 네트워크를 이용하고, 에피토프의 생리화학적 특성에 기초하여 특이적 에피토프를 예측한다. 연구 결과, 키네신 모터 도메인 영역에서 세포독성 T-세포에 대해 높은 친화력을 갖는 MHC-I 결합 에피토프의 클러스터를 확인하였다 (도 1). 상기 실험으로 키네신이 유망한 리슈마니아 백신 후보물질이라는 것을 알 수 있었다.
구제역 바이러스의 2A 펩티드는 키네신과 esat-6 유전자 사이의 링커 (linker) 단백질로서 작용한다. 이러한 유전자를 선택한 이유는 이러한 서열에 의해 코딩되는 펩티드가 자동단백질가수분해 (autoproteolytic) 요소로 작용하여 esat-6 유전자 및 키네신 유전자 모두의 개개의 발현을 가능하게 하기 때문이다. 이의 고유한 특성은 상이한 유전자들의 키메라 발현에 유용하다는 것이다.
실시예
2:
키네신
모터 도메인 및
esat
-6 유전자의 분리를 위한
프라이머
디자인
키네신 모터 도메인 및 esat-6 유전자의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 개발하였다. 상기 프라이머는 특정 벡터에 효율적인 클로닝을 위해 제한 부위를 포함하도록 디자인된다. 키네신 모터 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열은 SEQ ID No. 6 및 7에 표시된다. 마찬가지로, esat-6 영역의 증폭을 위한 프라이머 서열은 SEQ ID No. 8 및 9에서 표시된다.
Pfu DNA 폴리머라아제를 이용하여 증폭시킨 후, pGEM-T 벡터에 클로닝시키고, 정제하였으며, 자동화 서열분석장치를 이용하여 분석하였다 (도 3). 마지막으로, 제한 부위가 있는 특정 어뎁터 서열을 이용하여 자가분열 펩티드 (FMDV의 2A 펩티드)의 양측에 함께 접합시키자, 키메라 분자로부터 두 유전자의 개개의 발현이 가능하게 되었다. FMDV 2A 펩티드의 합성에 관한 상세한 것은 아래에서 언급하기로 한다.
실시예
3:
FMDV
2A 펩티드의 합성
전술한 목적을 위하여, 90 % 이상의 분열 활성을 갖는 FMDV 서열을 데이터베이스 검색에 기초하여 선택하였다. 마지막으로, 벡터에 클로닝하기 위한 길이 및 제한 지도에 기초하여, 97 % 분열 활성을 갖는 58 bp 서열을 스위스의 microsynth로부터 인공적으로 합성하였다. 상기 유전자의 서열은 SEQ ID No.3에 나타내었다.
실시예
4:
키메라
분자의 발생
SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2에서 나타낸 클로닝된 단편을 제한효소로 절단하여 잘라내었다. 또한, SEQ ID No. 3으로 디자인한 FMDV 2A 단편을 절단하고, SEQ ID No, 1 및 2와 함께 라이게이션하였다 (도 4). 상기 라이게이션 반응은 다음과 같이 수행하였다: 10×완충액 - 2.5 μl, 키네신 모터 도메인 - 8 μl (1 μg), esat-6 유전자 - 6 μl (1g), FMDV 2A 영역 - 3μ(1 μg), T4 DNA 리가아제 - l.5μl (6 units), 및 멸균수 (25 μl의 체적을 만드는 양). 상기 라이게이션 반응을 4 ℃에서 밤새 진행시켰다.
실시예
5: 벡터의 선택 및
pVAX
-1® 벡터 내에
키메라
유전자 및 개개의 유전자의
클로닝
강한 포로모터 하에서 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역을 포유동물의 발현 벡터 내로 도입하여 유전자의 발현을 유도함으로써, 결핵균 및 리슈마니아 도노바니의 단백질을 발현하는 DNA 백신을 제조하였다. 상기 선택한 벡터는 Invitrogen사의 pVAX-1®로서, 일부 박테리아 균주 (바람직하게는 대장균)을 이용하여 쉽게 스크리닝될 수 있는 셔틀 벡터 (shuttle vector)이다. 이러한 용도에 적합한 벡터의 또 다른 특징은, 광범위한 포유동물 세포에서 높은 수준의 발현을 위한 CMV 프로모터, 효율적인 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화 (polyadenylation)를 위한 BGH 폴리아데닐화 시그날 (signal), 카나마이신 저항성 유전자를 가짐으로써, 알레르기 반응을 최소화한다는 것이며, 마지막으로 가장 중요한 특징으로 감염성 질환의 예방을 위한 DNA 백신으로서의 적용은 FDA에 의해 규정되었다.
pVAX-1 내에 키메라 분자를 클로닝하는 것은 기본적인 클로닝 방법을 이용하여 수행하였다. 키메라 분자 및 pVAXl 벡터는 모두 제한 절단을 통해 선형화하였다. 상기 분자들을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: 1O×완충액 - 2.0 μl, 키메라 분자 - 15 μl (6 μg), pVAX-1 벡터 - 2 μl (2μg), T4 DNA 리가아제 - 1.0 μl ( 5 Units), 및 멸균수 (20 μl의 체적을 만드는 양) (도 5). 라이게이션 이후, 재조합 결핍 및 엔도뉴클라아제 결핍 DH5 α-E.coli 균주를 전술한 프로토콜에 따라 pVAXl- LDMT를 이용하여 형질전환하였다.
키메라 구조체 이외에도, 전술한 바와 같이 프로토콜을 이용하여 esat-6 및 및 키네신 모터 도메인 유전자를 pVAX-1 내에 클로닝하여 개개의 구조체들을 발생시켰다. 발생한 모든 재조합 분자들은 항생제 압력 선별을 이용하여 스크리닝하였다. 마지막으로, 상기 재조합 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 상기 방법은 알칼리성 용해, RNase 처리, 이소프로판올 침전 및 끝으로 적절한 정제 키트를 이용한 정제를 포함한다.
상기 정제된 플라스미드 분자의 추가적인 분석은 제한 절단 (도 6 및 7) 및 서열분석을 이용하여 수행하였다.
실시예
6: 클론의
시험관내
(
In
-
Vitro
) 발현 분석
ESAT-6 및 키네신 모터 도메인을 발현시키기 위한 재조합 키메라 구조체의 능력을, TNT 결합 전사/번역 시스템 (Promega)을 이용히여 제조사의 지시에 따라 연구하였다. TNT는 시험관내 단백질 합성을 위해 결합 전사/번역 반응을 이용한다. 전사 및 번역은 반응에서 동시에 일어나며, RNA 폴리머라아제가 템플릿 유전자를 전사하는 때에, TNT에 의해 제공된 리보솜은 초기 mRNA의 5'- 말단을 번역하기 시작한다.
키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 발현을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질의 시험관내 반응 혼합물을 16 % 트리신 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 반-건조 블롯팅 장치 (Bio-Rad®, USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 니트로셀룰로스 막 (Millipore)으로 옮겼다. 상기 막을 5 % 탈지유로 블로킹하고, PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 각각 10 분씩 세 번 세척한 다음, 실온에서 환자 혈청 및 토끼 혈청의 1:50 희석액 (PBS, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 1 시간 동안 배양하였다. 상기 막을 PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)으로 세 번 세척한 다음, 비오틴-결합 항-인간 IgG 1:1000 희석액 (PBS, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체와 함께 배양한 후, 상기 막을 세척한 다음 겨자무과산화효소에 결합된 1차 기질 아비딘과 반응시켰다. PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)를 이용하여 각 10분씩 2번 씻은 후, 그 블롯을 기질로서 DAB (Amresco) 및 0.1 % H2O2를 이용하여 발색시키고, 그 밴드를 막 상에서 직접 시각화하였다 (도 8A 및 도 8B).
실시예 7: 키메라 및 개개의 구조체의 면역원성
BALB/c 마우스 모델을 이용한 키메라 구조체의 면역원성에 관한 연구는 진행중에 있다. 이 연구는 BALB/c 마우스를 백신접종한 다음, IFN-γ, IL-2 및 IL-4 반응을 측정하는 것을 포함한다. 비장은 RPMI 1640 배지를 함유하는 멸균 접시 상에서 무균 조건하에 백신접종된 마우스로부터 제거하였다. 상기 비장을 10 ml 주사기 플런저의 원반형 바닥으로 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 5 내지 10 ml의 RPMI-1640 배지를 여기에 첨가하고 균질해지도록 혼합하였다. 상기 접시를 2분간 건드리지 않은 상태로 유지시키고, 그 투명한 상청액을 서서히 피페팅하여 제거하였다. 세포를 250 xg로 4 ℃에서 10분간 원심분리 (Sigma Centrifuge)하여 펠릿을 얻었다. 적혈구 및 비장세포를 함유하는 상기 펠릿을 수집하고, 0.9 % 염화암모늄으로 세척하여 적혈구를 용해시켰다. 남아있는 세포를 10 % FCS 및 0.05 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 2.5×lO6 cells/ml의 밀도로 다시 현탁시키고, 96-웰플레이트 내의 200 μl 부분 표본 (alizuots) (5×1O5 세포)으로 나누었다. 미토켄 (콘카발린 A) 및 키네신을 첨가하고, 콘카발린 A의 웰 농도 당 1, 5 & 10 μg로 및 키네신 및 ESAT-6의 웰 농도 당 5 및 10 μg의 ESAT-6 항원을 각 웰에 첨가한 후, 상기 세포를 5 % CO2 및 95 % 습도를 함유하는 분위기에서 37 ℃로 3일간 배양하였다. 테트라졸륨 (MTT) 어세이를 이용하여 증식을 측정하였다 (도 9).
실시예
8: 백신접종에 따른 마우스의
비장세포
배양액에서
IFN
-γ,
IL
-2 및 IL-4의 검출
마우스로부터 분리한 비장세포 배양액을 96-웰 배양 플레이트에 놓고, 웰당 5×105 세포를 넣었으며, 항원/미토겐을 삼중 웰에 첨가하였다. 48 시간 후, 사이토카인 결정 (determination)을 위해 각 웰로부터 상청액을 조심스럽게 수확하였다. 엔도겐 마우스 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 효소-결합 면역흡착제 어세이 키트 (Pierce Biotechnology, Inc. USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여, 상청액 내의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4를 결정하였다. 상기 어세이는 20-3000 pg/ml의 범위 내에서 IFN-γ을 검출하기 위해 보정하였다 (도 10).
실시예
9: 지연형 과민 (
Delayed
Type
Hypersensitivity
:
DTH
) 반응
DTH 반응을 위해, 천연 BALB/c 마우스 또는 키메라 백신 구조체가 주사된 마우스에서 족저 종창 (footpad swelling)을 측정하였다. 추가 접종 2개월 후, 각 동물의 후족저 (hind footpad)에, 20 μl의 PBS 내의 리슈마니아 도노바니 및 결핵균의 전체 가용성 단백질 20 μg을 주사하였다. 족저 종창은 여러 시기에 다이얼 캘리퍼 (dial caliper)로 측정하였으며, 그 결과를 항원이 접종된 족저의 두께와 20 μl의 PBS가 접종된 족저의 두께 사이의 차이로 나타내었다 (도 11).
SEQ
ID
No
. 1-
키네신
모터 도메인 뉴클레오티드 영역-
5'ATGCACCCTTCCACTGTGCGGCGTGAGGCGGAGCGGGTGAAGGTGTCGGTGCGCGTGCGCCCCCTAAACGAACGTGAAAACAATGCCCCGGAAGGGACGAAAGTGACCGTTGCGGCGAAACAGGCGGCCGCCGTGGTGACGGTCAAGGTCCTGGGAGGCAGCAACAACAGCGGCGCCGCCGAGTCGATGGGGACTGCAAGGCGGGTAGCGCAGGACTTTCAGTTCGACCACGTGTTCTGGTCTGTGGAGACGCCGGACGCGTGCGGCGCGACCCCCGCGACGCAGGCAGACGTGTTCCGGACGATCGGGTACCCGCTGGTGCAGCACGCGTTCGACGGGTTCAACTCGTGCTTGTTTGCGTACGGGCAGACAGGGAGCGGGAAGATGTACACGATGATGGGCGCGGACGTGAGCGCGCTTAGTGGTGAGGGCAACGGCGTGACGCCGCGGATCTGCCTGGAGATCTTTGCGCGGAAGGCGAGCGTGGAGGCGCAGGGGCACTCGCGGTGGATCGTGGAGCTGGGGTACGTGGAGGTGTACAACGAGCGCGTGTCGGACCTGCTTGGGAAGCGGAAGAAGGGTGTGAAGGGCGGCGGCGAGGAGGTGTACGTGGACGTGCGCGAGCACCCGAGCCGCGGCGTGTTCCTGGAGGGGCAGCGGCTGGTGGAGGTTGGGAGCCTGGACGATGTTGTGCGGCTGATCGAGATCGGCAACGGCGTGCGGCACACCGCTTCAACGAAGATGAACGACCGGAGCAGCCGGAGCCACGCGATCATCATGCTGCTGCTGCGCGAGGAGCGGACGATGACGACGAAGAGCGGGGAGACGATCCGTACTGCCGGCAAGAGCAGCCGCATGAACCTTGTGGACCTTGCGGGGTCTAAGCGCGTGGCGCAGTCGCAGGTGGAGGGGCAGCAGTTCAAGGAGGCGACGCACATCAACCTGTCGCTGACGACGCTCGGGCGCGTGATCGAC 3'
SEQ
ID
No
. 2-
esat
-6
뉴클레오티드 영역
5'TGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTCCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCA 3'
SEQ
ID
No
. 3
FMDV
2A 영역-
SEQ
ID
No
. 4
키메라 구조체의 완전한 뉴클레오티드 서열
SEQ
ID
No
. 5
키메라 구조체의 완전한 아미노산 서열
ESAT
-6 도메인
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
FMDV
2A 도메인
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
키네신
모터 도메인
MHPSTVRREAERVKVSVRVRPLNERENNAPEGTKVTVAAKQAAAVVTVKVLGGSNNSGAAESMGTARRVAQDFQFDHVFWSVETPDACGATPATQADVFRTIGYPLVQHAFDGFNSCLFAYGQTGSGKMYTMMGADVSALSGEGNGVTPRICLEIFARKASVEAQGHSRWIVELGYVEVYNERVSDLLGKRKKGVKGGGEEVYVDVREHPSRGVFLEGQRLVEVGSLDDVVRLIEIGNGVRHTASTKMNDRSSRSHAIIMLLLREERTMTTKSGETIRTAGKSSRMNLVDLAGSKRVAQSQVEGQQFKEATHINLSLTTLGRVID
SEQ
ID
No
. 6 & 7
키네신
모터 도메인 영역의 증폭을 위한
LF
및
LR
의 합성 올리고뉴클레오티드-
(유전자 은행에 제출된 가입번호 AY615886인 레슈마니아 도노바니 KE-16 균주의 키네신 유전자 서열로부터 선택된 프라이머로서, 361-1335 bp를 증폭시킴)
SEQ
ID
No
. 8
and
9
esat
-6
유전자의 증폭을 위한 합성
올리고튜클레오티드
ESAT
-F 및
ESAT
-R-
(유전자 은행에 제출된 가입번호 AF420491의 결핵균 균주의 ESAT-6 유전자 서열로부터 선택된 프라이머로서, 14-301 bp를 증폭시킴).
<110> DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
ALL INDIA INSTITUTE OF MEDICAL SCIENCE
<120> CONSTRUCTING A DNA CHIMERA FOR VACCINE DEVELOPMENT AGAINST
LEISHMANIASIS AND TUBERCULOSIS
<150> 1751/DEL/08
<151> 2008-07-25
<160> 13
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> Leishmania donovani
<400> 1
atgcaccctt ccactgtgcg gcgtgaggcg gagcgggtga aggtgtcggt gcgcgtgcgc 60
cccctaaacg aacgtgaaaa caatgccccg gaagggacga aagtgaccgt tgcggcgaaa 120
caggcggccg ccgtggtgac ggtcaaggtc ctgggaggca gcaacaacag cggcgccgcc 180
gagtcgatgg ggactgcaag gcgggtagcg caggactttc agttcgacca cgtgttctgg 240
tctgtggaga cgccggacgc gtgcggcgcg acccccgcga cgcaggcaga cgtgttccgg 300
acgatcgggt acccgctggt gcagcacgcg ttcgacgggt tcaactcgtg cttgtttgcg 360
tacgggcaga cagggagcgg gaagatgtac acgatgatgg gcgcggacgt gagcgcgctt 420
agtggtgagg gcaacggcgt gacgccgcgg atctgcctgg agatctttgc gcggaaggcg 480
agcgtggagg cgcaggggca ctcgcggtgg atcgtggagc tggggtacgt ggaggtgtac 540
aacgagcgcg tgtcggacct gcttgggaag cggaagaagg gtgtgaaggg cggcggcgag 600
gaggtgtacg tggacgtgcg cgagcacccg agccgcggcg tgttcctgga ggggcagcgg 660
ctggtggagg ttgggagcct ggacgatgtt gtgcggctga tcgagatcgg caacggcgtg 720
cggcacaccg cttcaacgaa gatgaacgac cggagcagcc ggagccacgc gatcatcatg 780
ctgctgctgc gcgaggagcg gacgatgacg acgaagagcg gggagacgat ccgtactgcc 840
ggcaagagca gccgcatgaa ccttgtggac cttgcggggt ctaagcgcgt ggcgcagtcg 900
caggtggagg ggcagcagtt caaggaggcg acgcacatca acctgtcgct gacgacgctc 960
gggcgcgtga tcgac 975
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60
aatgtcacgt ccatattccc tccttgacga ggggaagcag tccctgacca agctcgcagc 120
ggcctggggc ggtagcggtt cggaggcgtc cagggtgtcc agcaaaaatg ggacgccacg 180
gctaccgagc tgaacaacgc gctgcagaac ctggcgcgga cgatcagcga agccggtcag 240
gcaatggctt cgaccgaagg caacgtcact gggatgttcg ca 282
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Foot-and-mouth disease virus
<400> 3
gcggatccag agccgagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg gaggaaaatc 60
ccccaatgca ttggatgcat 80
<210> 4
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-esat-6
<400> 4
cccaagctta tgacagagca gcagtggaat ttcgcgggta tcgaggccgc ggcaagcgca 60
atccagggaa atgtcacgtc catattccct ccttgacgag gggaagcagt ccctgaccaa 120
gctcgcagcg gcctggggcg gtagcggttc ggaggcgtcc agggtgtcca gcaaaaatgg 180
gacgccacgg ctaccgagct gaacaacgcg ctgcagaacc tggcgcggac gatcagcgaa 240
gccggtcagg caatggcttc gaccgaaggc aacgtcactg ggatgttcgc aggatccgc 299
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-FMDV
<400> 5
gcggatccag agccgagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg gaggaaaatc 60
ccccaatgca ttggatgcat 80
<210> 6
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct_kinesin
<400> 6
ccaatgcatt ggatgcaccc ttccactgtg cggcgtgagg cggagcgggt gaaggtgtcg 60
gtgcgcgtgc gccccctaaa cgaacgtgaa aacaatgccc cggaagggac gaaagtgacc 120
gttgcggcga aacaggcggc cgccgtggtg acggtcaagg tcctgggagg cagcaacaac 180
agcggcgccg ccgagtcgat ggggactgca aggcgggtag cgcaggactt tcagttcgac 240
cacgtgttct ggtctgtgga gacgccggac gcgtgcggcg cgacccccgc gacgcaggca 300
gacgtgttcc ggacgatcgg gtacccgctg gtgcagcacg cgttcgacgg gttcaactcg 360
tgcttgtttg cgtacgggca gacagggagc gggaagatgt acacgatgat gggcgcggac 420
gtgagcgcgc ttagtggtga gggcaacggc gtgacgccgc ggatctgcct ggagatcttt 480
gcgcggaagg cgagcgtgga ggcgcagggg cactcgcggt ggatcgtgga gctggggtac 540
gtggaggtgt acaacgagcg cgtgtcggac ctgcttggga agcggaagaa gggtgtgaag 600
ggcggcggcg aggaggtgta cgtggacgtg cgcgagcacc cgagccgcgg cgtgttcctg 660
gaggggcagc ggctggtgga ggttgggagc ctggacgatg ttgtgcggct gatcgagatc 720
ggcaacggcg tgcggcacac cgcttcaacg aagatgaacg accggagcag ccggagccac 780
gcgatcatca tgctgctgct gcgcgaggag cggacgatga cgacgaagag cggggagacg 840
atccgtactg ccggcaagag cagccgcatg aaccttgtgg accttgcggg gtctaagcgc 900
gtggcgcagt cgcaggtgga ggggcagcag ttcaaggagg cgacgcacat caacctgtcg 960
ctgacgacgc tcgggcgcgt gatcgacggg ccc 993
<210> 7
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-ESAT-6 Domain
<400> 7
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-FMDV 2A Domain
<400> 8
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-Kinesin Motor Domain
<400> 9
Met His Pro Ser Thr Val Arg Arg Glu Ala Glu Arg Val Lys Val Ser
1 5 10 15
Val Arg Val Arg Pro Leu Asn Glu Arg Glu Asn Asn Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Thr Lys Val Thr Val Ala Ala Lys Gln Ala Ala Ala Val Val Thr Val
35 40 45
Lys Val Leu Gly Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ala Glu Ser Met Gly
50 55 60
Thr Ala Arg Arg Val Ala Gln Asp Phe Gln Phe Asp His Val Phe Trp
65 70 75 80
Ser Val Glu Thr Pro Asp Ala Cys Gly Ala Thr Pro Ala Thr Gln Ala
85 90 95
Asp Val Phe Arg Thr Ile Gly Tyr Pro Leu Val Gln His Ala Phe Asp
100 105 110
Gly Phe Asn Ser Cys Leu Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Met Tyr Thr Met Met Gly Ala Asp Val Ser Ala Leu Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Asn Gly Val Thr Pro Arg Ile Cys Leu Glu Ile Phe Ala Arg Lys Ala
145 150 155 160
Ser Val Glu Ala Gln Gly His Ser Arg Trp Ile Val Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Val Glu Val Tyr Asn Glu Arg Val Ser Asp Leu Leu Gly Lys Arg Lys
180 185 190
Lys Gly Val Lys Gly Gly Gly Glu Glu Val Tyr Val Asp Val Arg Glu
195 200 205
His Pro Ser Arg Gly Val Phe Leu Glu Gly Gln Arg Leu Val Glu Val
210 215 220
Gly Ser Leu Asp Asp Val Val Arg Leu Ile Glu Ile Gly Asn Gly Val
225 230 235 240
Arg His Thr Ala Ser Thr Lys Met Asn Asp Arg Ser Ser Arg Ser His
245 250 255
Ala Ile Ile Met Leu Leu Leu Arg Glu Glu Arg Thr Met Thr Thr Lys
260 265 270
Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr Ala Gly Lys Ser Ser Arg Met Asn Leu
275 280 285
Val Asp Leu Ala Gly Ser Lys Arg Val Ala Gln Ser Gln Val Glu Gly
290 295 300
Gln Gln Phe Lys Glu Ala Thr His Ile Asn Leu Ser Leu Thr Thr Leu
305 310 315 320
Gly Arg Val Ile Asp
325
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide LF for amplification of Kinesin Motor
Domain Region
<400> 10
ccaatgcatt ggatgcaccc ttccactgtg cgg 33
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonuclotide LR for amplification of Kinesin Motor
Domain Region
<400> 11
gggcccgtcg atcacgcgcc cgagcgtcgt 30
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide-ESAT-F for amplification of esat-6 gene
<400> 12
cccaagctta tgacagagca gcagtgga 28
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide-ESAT-R amplification of esat-6 gene
<400> 13
gcggatcctg cgaacatccc agtgacg 27
Claims (6)
- 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 esat-6 유전자 및 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)의 키네신 모터 도메인 영역 유전자를 포함하는 재조합 키메라 DNA 구조체로서, 상기 유전자들이 DNA 백신 벡터 pVAX-1 내의 자가절단 펩티드의 양측에 함께 클로닝(cloning) 되어 있으며, 상기 재조합 키메라 DNA 구조체가 전사 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 것인, 재조합 키메라 DNA 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 재조합 키메라 DNA 구조체가 리슈마니아 도노바니 유래의 키네신 모터 도메인 영역 유전자의 DNA 서열 및 결핵균 유래의 esat-6 유전자의 DNA 서열을 포함하는 약학적으로 허용가능한 면역자극제제를 제공하는 것인,
재조합 키메라 DNA 구조체. - 제 1 항에 있어서,
상기 재조합 키메라 DNA 구조체가 약학적 조성물로서 유효량으로 경피 투여되는 경우 온혈 동물에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하는 것인,
재조합 키메라 DNA 구조체. - 제 1 항에 있어서,
상기 재조합 키메라 DNA 구조체가 상기 유전자들에 대해 TH-1형 면역 반응을 발생시키는 것인,
재조합 키메라 DNA 구조체. - 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 키메라 DNA 구조체가 내장 리슈마니아증 및 결핵을 동시에 치료 및 예방하는 백신 후보물질로 사용될 수 있는 것인,
재조합 키메라 DNA 구조체. - a) 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용하여 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)의 키네신 모터 도메인 영역 유전자 및 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 esat-6 유전자의 예측되는 단백질 서열을 분석하는 단계,
b) 상기 키네신 모터 도메인 영역 유전자 및 esat-6 유전자의 코딩 증폭 단계를 행하는 단계,
c) 상기 키네신 모터 도메인 영역 유전자 및 esat-6 유전자를 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 클로닝하는 단계,
d) pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝 (directional cloning)에 의해 키메라 DNA 구조체를 제조하는 단계, 및
e) 무세포 번역 시스템을 이용한 클론 유래의 키네신 모터 도메인 영역 유전자 및 esat-6 유전자의 시험관내 발현 분석 단계 및 상기 키메라 DNA 구조체를 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는,
재조합 키메라 DNA 구조체의 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN1751DE2008 | 2008-07-25 | ||
| IN1751/DEL/08 | 2008-07-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110060865A KR20110060865A (ko) | 2011-06-08 |
| KR101598876B1 true KR101598876B1 (ko) | 2016-03-02 |
Family
ID=41570072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020107007350A KR101598876B1 (ko) | 2008-07-25 | 2009-02-10 | 리슈마니아증 및 결핵에 대한 백신 개발을 위한 ｄｎａ 키메라의 작제 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8299232B2 (ko) |
| EP (1) | EP2303316B1 (ko) |
| KR (1) | KR101598876B1 (ko) |
| CN (1) | CN101896196A (ko) |
| AU (1) | AU2009273128A1 (ko) |
| BR (1) | BRPI0904621A2 (ko) |
| MY (1) | MY184182A (ko) |
| WO (1) | WO2010010577A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA201000685B (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2397852B1 (en) * | 2006-03-14 | 2013-12-04 | Oregon Health and Science University | Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection |
| RU2539035C2 (ru) * | 2011-01-13 | 2015-01-10 | Амир Закиевич Максютов | Профилактическая или терапевтическая полиэпитопная противотуберкулезная вакцинная конструкция, обеспечивающая индукцию клеточного иммунного ответа cd4+ или cd8+ т-лимфоцитов |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072792A2 (en) | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Corixa Corporation | Heterologous fusion protein constructs comprising a leishmania antigen |
| WO2006053485A1 (fr) | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Zhongming Li | Vaccin genique contre le bacille mycobacterium tuberculosis obtenu a partir d’un gene chimere et procede de preparation dudit vaccin |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674503A (en) | 1990-07-24 | 1997-10-07 | University Of Victoria | Peptides capable of eliciting an immune response to leishmaniasis and methods of using the same |
| US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
| US6525186B2 (en) | 1998-12-23 | 2003-02-25 | C.B.F. Leti S.A. | Chimeric gene formed of the DNA sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of L. infantum, useful of serologic diagnosis of canine leishmaniosis and protein obtained |
| ES2169995B1 (es) | 2000-04-17 | 2003-12-01 | Leti Lab | Composicion a base de la proteina lip2a y su uso en la preparacion de un medicamento para suscitar una respuesta inmune contra un antigeno. |
| WO2005061730A1 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-07 | All India Institute Of Medical Sciences | Methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| EP1711520B1 (en) | 2003-12-26 | 2010-02-10 | All India Institute of Medical Sciences | Polypeptides for the diagnosis and therapy of leishmaniasis |
-
2009
- 2009-02-10 CN CN2009801003521A patent/CN101896196A/zh active Pending
- 2009-02-10 MY MYPI2010001008A patent/MY184182A/en unknown
- 2009-02-10 EP EP09800156.3A patent/EP2303316B1/en not_active Not-in-force
- 2009-02-10 AU AU2009273128A patent/AU2009273128A1/en not_active Abandoned
- 2009-02-10 BR BRPI0904621-6A patent/BRPI0904621A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-02-10 WO PCT/IN2009/000093 patent/WO2010010577A1/en active Application Filing
- 2009-02-10 KR KR1020107007350A patent/KR101598876B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2009-02-10 US US12/995,841 patent/US8299232B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-01-29 ZA ZA2010/00685A patent/ZA201000685B/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072792A2 (en) | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Corixa Corporation | Heterologous fusion protein constructs comprising a leishmania antigen |
| WO2006053485A1 (fr) | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Zhongming Li | Vaccin genique contre le bacille mycobacterium tuberculosis obtenu a partir d’un gene chimere et procede de preparation dudit vaccin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2009273128A1 (en) | 2010-03-11 |
| EP2303316B1 (en) | 2013-04-24 |
| KR20110060865A (ko) | 2011-06-08 |
| ZA201000685B (en) | 2011-06-29 |
| US20110150932A1 (en) | 2011-06-23 |
| CN101896196A (zh) | 2010-11-24 |
| WO2010010577A1 (en) | 2010-01-28 |
| BRPI0904621A2 (pt) | 2015-06-30 |
| US8299232B2 (en) | 2012-10-30 |
| MY184182A (en) | 2021-03-24 |
| EP2303316A4 (en) | 2011-12-14 |
| EP2303316A1 (en) | 2011-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8916168B2 (en) | Leishmania sterol 24-c-methyltransferase compositions for the prevention, treatment and diagnosis of leishmaniasis | |
| CZ289383B6 (cs) | Polynukleotid a polynukleotidová vakcína proti tuberkulóze | |
| KR101101263B1 (ko) | 개선된 효능을 갖는 결핵 백신 | |
| KR20120083899A (ko) | 마이코박테리아 백신들 | |
| US20020142002A1 (en) | Methods for protecting against lethal infection with bacillus anthracis | |
| DK1802340T3 (en) | A combination of recombinant mycobacteria and a biologically active agent as a vaccine | |
| JP4573773B2 (ja) | マラリア・ワクチン | |
| CA2598060A1 (en) | Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer | |
| JP4653934B2 (ja) | バクテリオファージによって仲介される免疫化方法 | |
| JPH11506320A (ja) | 豊富な細胞外産物、ならびにそれらを産生および使用するための方法 | |
| KR101598876B1 (ko) | 리슈마니아증 및 결핵에 대한 백신 개발을 위한 ｄｎａ 키메라의 작제 | |
| AU759316B2 (en) | Chimeric gene encoding the antigenic determinants of four proteins of L. infantum | |
| KR100768051B1 (ko) | 간염 바이러스 ｏｒｆ2의 ｎ-말단 영역으로부터 유래한프로세싱 성분 및 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산구성물 | |
| KR20220086521A (ko) | 신규 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물 | |
| Nurul et al. | Plasmodium falciparum 19 kDa of merozoite surface protein-1 (MSP-119) expressed in Mycobacterium bovis bacille Calmette Guerin (BCG) is reactive with an inhibitory but not a blocking monoclonal antibody. | |
| US6458359B1 (en) | Chimeric gene formed by the dna sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of l. infantum and protein encoded by said gene, and pharmacuetical composition useful for preventing and/or treating leishmaniosis in animals or humans | |
| Khairkhah et al. | Comparison of adjuvant effects of Montanide ISA-720 and heat shock protein 27 in increasing immunostimulatory properties of HIV-1 Nef-Vif fusion protein construct | |
| JP2002501369A (ja) | Ｆｉｖワクチン | |
| Dey et al. | Immunogenicity of candidate chimeric DNA vaccine against tuberculosis and leishmaniasis | |
| AU2001243941B2 (en) | A nucleic acid construct encoding a processing component derived from the n-terminal region of the hepatitis virus ORF2, and an antigenic polypeptide | |
| JP2002114708A (ja) | Ｄｎａワチンに対するアジュバント剤 | |
| MX2007011501A (es) | Composicion que comprende la region n-terminal de la histona h2b de leishmania- uso para usar una respuesta inmunitaria. | |
| AU2001243941A1 (en) | A nucleic acid construct encoding a processing component derived from the n-terminal region of the hepatitis virus ORF2, and an antigenic polypeptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |