MX2007011501A - Composicion que comprende la region n-terminal de la histona h2b de leishmania- uso para usar una respuesta inmunitaria. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion inmunogenica que comprende: i) un polipeptido antigenico que consiste de un fragmento de la proteina histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la region N-terminal de dicha proteina histona H2B, y ii) un adyuvante estimulante de la respuesta inmunitaria.

Description

COMPOSICIÓN QU E COMPREN DE LA REGIÓN N-TERM INAL DE LA H ISTONA H2B DE LEISH MAN IA - USO PARA IN DUCIR U NA RESPUESTA 1N M U NITARIA La presente invención se refiere a una invención inmunogénica que comprende: i ) un polipéptido antigénico que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o una parte de la región N-term¡nal de dicha proteína histona H2B, y ii) un adyuvante estimulante de la respuesta inmunitaria . La presente invención también se refiere a un polipéptido que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o parte de la región N-terminal de la histona H2B , un polipéptido variante que conserva cuando menos el 50% de identidad , de preferencia cuando menos el 80% de identidad con dicho polipéptido, y una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido o el polipéptido variante. La invención también se refiere a una vacuna que permite obtener una protección contra una infección por Leishmania, cuyo principio activo comprende el polipéptido, el polipéptido variante o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la presente invención, y un vector de expresión capaz de expresar el polipéptido o el polipéptido variante, que comprende la molécula de ácido nucleico. La leishmaniasis constituye un grupo heterogéneo de patologías que afectan a varios millones de individuos y se deben a la infección del animal huésped o ser humano por un parásito protozoario del género Leishmania (Desjeux et al , 1996). La expresión cl ínica de la infección está caracterizada por un gran polimorfismo, incluyendo infecciones asintomáticas, formas cutáneas simples o recurrentes, formas cutáneas difusas o alérgicas, formas cutaneo-mucosas y formas viscerales mortales en ausencia de tratamiento específico. (WHO Expert Committee, 1 990). Durante su ciclo, el parásito alterna entre dos estados: el estado promastigote flagelado, que se encuentra en el tubo digestivo del insecto vector, y el estado amastigote dentro de los macrófagos del mamífero huésped . La preparación de una vacuna contra leishmaniasis se puede considerar ya que se ha demostrado claramente, en seres humanos, que la infección por Leishmania confiere una inmunidad protectora a la reinfección (Guirges et al , 1 971 ; Davies et al , 1 995). Esta protección está asociada con el desarrollo de una respuesta inmune celular específica para el parásito. Varios candidatos de vacuna se han evaluado contra la infección por Leishmania, tanto en modelos murinos, como en seres humanos. En la actualidad, ninguna vacuna de uso humano o veterinario ha demostrado una eficacia significativa en la protección contra la leishmaniasis (Sharifi et al , 1998; Khalil et al , 2000; De Luca et al , 2001 ; Armijos et al , 2004).

Estas vacunas se pueden dividir en tres grupos: las vacunas de primera generación, están constituidas por promastigotes inactivados por calor o irradiación , a pesar de su inocuidad , la eficacia de estas vacunas no se ha comprobado (Sharifi et al , 1 998; Khalil et al , 2000; De Luca et al, 2001 ; Armijos et al, 2004). Las vacunas de segunda generación están constituidas por proteínas nativas obtenidas por la purificación bioquímica de proteínas recombinantes y péptidos sintéticos obtenidos por ingeniería genética. Se han descrito varias proteínas en la literatura científica, las cuales inducen una protección significativa en modelos experimentales murinos. Las más importantes están representadas por la poliproteína Leish-1 1 1 f, compuesta de 3 proteínas fuertemente inmunogénicas colocadas en tándem, que son la Lel F (factor de inicio de alargamiento de Leishmania), la proteína LmSTM (proteína inducible por estrés de L. major) y la proteína TSA (antioxidante tiol-específicas). Varias investigaciones han permitido demostrar que cada una de estas proteínas probadas individualmente o en asociación con I L-12 es capaz de inducir un enlenteci miento muy significativo de la evolución de la enfermedad en ratones BALB/c infectados por L. major (Skeiky et al , 1 998; Coler et al , 2002; Seiky et al, 2002; Campos-Neto et al, 2002). La proteína LACK (homólogo de Leishmania del receptor de c-cinasa activada) en presencia de I L-12, es igualmente capaz de conferir una protección en ratones BALB/c contra un desafío con L. major (Gurunathan et al, 1 997) virulenta. Finalmente, el antígeno PSA-2 purificado a partir de Leishmania, le confiere a ratones una buena protección (Handman , 1 995). Las vacunas de tercera generación comprenden las vacunas basadas en ADN que contiene uno o una pluralidad de genes que codifican para los antígenos de Leishmania ( Iborra et al , 2003; Campbell et al , 2003; Ramiro et al , 2003; Dumonteil et al , 2003). Las vacunas de tercera generación también comprenden leishmanias cuyo poder patogénico ha sido atenuado genéticamente, mediante la deleción de genes de virulencia. Se puede mencionar el caso de leishmanias a las que se les eliminó el gen que codifica para la enzima dihidrofolato reductasa-timidilato sintetasa (dhfr-ts"). Varios estudios han demostrado, en modelos murinos, que la vacunación de ratones con estos parásitos dhfr-ts" puede inducir una protección parcial contra la infección por Leishmania (Brodskyn et al , 2000; Streit et al , 2001 ). Es igualmente posible incluir en las vacunas de tercera generación, a las vacunas basadas en péptidos sintéticos. Se han realizado varios ensayos de vacunación con diferentes péptidos, incluyendo generalmente los epítopos T. El ejemplo más conocido es del péptido PT3, que corresponde a la "región de unión de histidina-zinc" de la gp63. Asimismo, este péptido en presencia de un adyuvante "poloxámero 407", es capaz de conferir una protección duradera en ratones sensibles BALB/c, después de un desafío con L. major (Spitzer et al , 1 999). Ciertas otras proteínas que son de interés, son las histonas: el primer trabajo se remonta a 1999 , en el cual Soto et al (1999) demostraron que la proteína H2B puede constituir un blanco de la respuesta de anticuerpos en la leishmaniasis canina. Posteriormente , Maalej et al evaluaron la proteína H2B , en comparación con otras proteínas parasitarias, proponiéndola como antígeno para el diagnóstico serológico de la leishmaniasis visceral humana, y demostraron que ésta puede constituir un blanco interesante (Maalej et al , 2003). Con respecto a la respuesta celular, Probs et al (2001 ) demostraron que la proteína H2B , en su forma recombinante, era capaz de inducir una fuerte proliferación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en pacientes que sanaron de una leishmaniasis cutánea causada por L. major. Esta proliferación estuvo acompañada por una importante producción de I FN-?, con ausencia de I L-4 (Probst et al , 2001 ). En el modelo murino de la leishmaniasis visceral (LV) causada por L. donovani, Melby et al (2000), demostraron que la vacunación de ratones sensibles BALB/c, con una fracción de vacunas de ADN obtenidas a partir de un banco de ADNc, conteniendo principalmente H2B , era capaz de proteger parcialmente a los ratones después de un desafío con L. donovani virulenta. Muy recientemente, en el modelo de la leishmaniasis experimental en ratones BALB/c infectados por L. major, I borra et al (2004) demostraron que la vacunación de estos ratones con una combinación de vacuna de ADN que codifica para las proteínas histonas (H2A, H2B , H3 y H4), inducía una importante respuesta inmunitaria de ti po Th 1 , con la secreción de I FN-?, asociada a la protección parcial de los ratones vacunados después de un desafío con L. major. Además, se ha demostrado que el parásito Leishmania es capaz de inducir la activación de células T reguladoras (Belkaid et al, 2002), que suprimen las respuestas inmunes efectoras y permiten la multiplicación y la persistencia del parásito. Resultados concordantes sugieren que las células T reguladoras son seleccionadas positivamente después de una fuerte interacción con los péptidos de sí mismas (TCR-CMH-péptido) (Gavin y Rudensky, 2003). Los inventores están interesados en la proteína histona H2B como candidato para vacuna. Más precisamente, en primer lugar sugieren la hipótesis que ciertas regiones conservadas de las proteínas parasitarias podrían activar preferentemente las células reguladoras, además de las secuencias divergentes que activarían las células efectoras, igualmente, que una misma proteína parasitaria podría contener los péptidos inductores de respuestas reguladoras y otros inductores de respuestas efectoras. Los inventores analizaron comparativamente la inmunogenicidad y el papel protector de dos regiones amino-terminales, divergentes y carboxilo-terminales, conservadas, de la proteína recombinante H2B de L. major, así como de la proteína completa. Se observó que, de manera sorprendente, la porción amino-terminal, (divergente) de la H2B , ayudada por CpG, confiere la mejor protección en ratones sensibles BALB/c contra un desafío con L. major virulenta . Esta proteína truncada, podría constituir un buen candidato para vacuna contra la leishmaniasis. La invención se basa en una composición inmunogénica caracterizada porque comprende: i) un polipéptido antigénico que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o una porción de la región N-terminal de la proteína histona H2B y ii) un adyuvante estimulante de la respuesta inmunitaria. En una modalidad particular de la investigación , el principio activo inmunogénico de dicha composición inmunogénica, consiste en el polipéptido antigénico que consiste de un fragmento derivado únicamente de la porción N-terminal de la proteína histona H2B de Leishmania. El término "fragmento" aplicado a un polipétido o más particularmente a un antígeno, significa una parte de la proteína nativa considerada, excluyendo la totalidad de dicha proteína. La porción N-terminal de un polipéptido nativo, por ejemplo, de la proteína histona H2B de Leishmania, representa , de manera general, menos de la mitad de la secuencia de aminoácidos totales de ese pol ipéptido , en donde la secuencia restante es el extremo N-terminal . En un ejemplo específico, el polipéptido de conformidad con la invención tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. El polipéptido en su marco tiene una secuencia que comprende cuando menos 6 aminoácidos consecutivos de la porción N-terminal del antígeno H2B considerado. En un ejemplo específico, la longitud de la secuencia de dicho polipéptido se presenta del 10 al 45% de la longitud de la proteína histona. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido de conformidad con la invención, por ejemplo, es la siguiente: M A S S R S A S R K A S N P H K S H R K P K R S W N V Y V G R S L K A I N A Q M S M S H R T. En un ejemplo específico, el polipéptido es característico de la histona H2B de Leishmania major. El polipéptido, de la misma manera, puede ser característico de la proteína histona H2B de L. infantum, L. donovani, L. trópica y L. enrietti. Las secuencias de las proteínas histonas H2B de estos parásitos, ya se han descrito: la H2B de L. infantum, fue descrita en Soto M et al, 1999; Antigenicity of the Leishmania infantum histones H2B and H4 during canine viscerocutaneous leishmaniasis; Journal Clin. Exp. Immuno. 115(2), 342-349 (1999); la H2B de L. enrietti fue descrita en Genske J. E. et al; 1991; Structure and regulating of histone H2B mRNAs from Leishmania enrietti; Mol. Cell. Biol. 11(1), 240-249 (1991). Las secuencias proteicas de H2B de L. donovani y L. trópica todavía no se han descrito. No obstante, la conservación esperada a nivel de las proteínas histonas H2B de Leishmania, debe ser superior al 80% . De manera general , el polipéptido puede ser característico de una especie seleccionada del conjunto del género Leishmania. En un ejemplo específico, el polipéptido comprendido en la composición inmunogénica de conformidad con la invención , es un polipéptido purificado o aislado de su ambiente de producción. En un ejemplo específico, dicha composición inmunogénica comprende un ADN en forma de una secuencia polinucleotídica que codifica para el polipéptido de conformidad con la invención. Por ejemplo, el polinucléotido está insertado en un plásmido de expresión en eucariotes. Uno o una pluralidad de aminoácidos del polipéptido determinado a partir de una proteína histona H2B de una especie de Leishmania, tal como se ilustra más adelante y se designa con la expresión "polipéptido de referencia", puede ser sustituido, eliminado o agregado , para formar un polipéptido variante que conserva cuando menos el 50% de identidad , de preferencia, cuando menos el 80% de identidad con el polipéptido de referencia, en donde dicho polipéptido variante conserva las propiedad inmunogénicas del pol.ipéptido de referencia. El porcentaje de identidad entre el polipéptido de referencia y el polipéptido variante se determina después de haber realizado una alineación global óptima. Esta alineación se puede obtener, principalmente, utilizando el algoritmo "Needleman-Wunsch" (Needleman y Wunsch , 1 970 , J . Mol . Biol. 48:443-453) o Clustal W (Higgins & Sharp, a package for performing múltiple sequence alignment on a microcomputer, 1 988, Dec 1 5;73(1 ):237-44). La noción de identidad significa que un aminoácido tiene una posición determinada en el polipéptido que es idéntica a un aminoácido correspondiente en el polipéptido variante, después de haber sido sometido a una alineación con respecto al pol ipéptido de referencia. El hecho de que la secuencia del polipéptido de referencia tenga n% de identidad con la secuencia del polipéptido variante, significa que n% de las posiciones de alineación global óptima entre las dos secuencias, consisten en aminoácidos idénticos. La expresión "propiedad inmunogénicas de un polipéptido" significa que el polipéptido es capaz de provocar, por sí solo o en asociación con un adyuvante de i nmunidad o una molécula proteica, una reacción inmunitaria, principalmente una respuesta inmunitaria de tipo celular, por ejemplo, una respuestas de células T CD4+ . Por ejemplo, el polipéptido variante tiene una secuencia polipeptídica menor de 75 aminoácidos, de preferencia menor de 60 aminoácidos. De manera ilustrativa, los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones conservadoras de aminoácidos en la secuencia de la histona H2B de Leishmania anteriormente ilustrada. Uno o una pluralidad de aminoácidos del poli péptido de referencia , se pueden sustituir, eliminar o agregar, para formar un polipéptido variante que conserve cuando menos el 50% de similitud , de preferencia cuando menos el 80% de simi litud con el polipéptido de referencia, en donde el polipéptido variante conserva las propiedad i nmunogénicas del polipéptido de referencia. Por el contrario a la noción de identidad , la noción de similitud se refiere a aminoácidos idénticos, y aminoácidos diferentes pero que producen un polipéptido que conserva las propiedades inmunogénicas del polipéptido de referencia ; o solamente tales aminoácidos diferentes. El hecho de que la secuencia del polipéptido de referencia tenga n% de similitud con la secuencia del polipéptido variante, significa que n% de las posiciones de alineación global óptima entre las dos secuencias, consisten en aminoácidos idénticos, y aminoácidos diferentes cuya presencia en el polipéptido no modifica sensiblemente sus propiedades inmunogénicas; o solamente tales aminoácidos diferentes. En particular, las sustituciones en el polipéptido son sustituciones conservadoras. Una sustitución conservadora siempre es una sustitución que tiene una calificación positiva en la matriz de sustituciones Blosum62, "blosum62 substitution matrix" (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Nati. Acad . Sel . USA 89: 1 091 5-1 091 9). Otra modalidad de variantes polipeptídicas se refiere a la preparación de péptidos de la proteína histona H2B considerada, en donde los péptidos tiene, por ejemplo, secuencias peptídicas que comprenden de 6 a 30, por ejemplo de 6 a 20 o de 6 a 1 5 aminoácidos, seleccionados a partir de la secuencia N-terminal de la proteína histona. Los péptidos se pueden utilizar en mezclas, y comprender solamente la forma de mixótopos. Las mezclas peptídicas comprenden , por ejemplo, cuando menos 2 o cuando menos 5 secuencias peptídicas diferentes unas de las otras, o, por el contrario, que contengan aminoácidos consecutivos en común. Los polipéptidos (y comprendidos los péptidos) de la invención , se preparan por métodos conocidos para los técnicos en la materia , por ejemplo, por síntesis qu ímica, o por expresión en un sistema celular, principalmente bacteriano, o in vitro en un sistema "libre de células" . El término "adyuvante" significa cualquier sustancia o compuesto capaz de promover o aumentar la respuesta inmunitaria contra un principio activo determi nado , en un mamífero , en comparación con la respuesta in munitaria obtenida, en las mismas condiciones, pero administrando el principio activo por sí solo. En un ejemplo específico de modalidad de la invención, el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria de tipo celular. El adyuvante , por ejemplo, el CpG o cualquier otro adyuvante autorizado para uso en vacunas en seres humanos o animales. La concentración de CpG utilizada para la vacunación de ratones es de 1 µg/µl y la cantidad inyectada es de 50 µg. En un ejemplo específico, la composición inmunogénica de conformidad con la invención , comprende además, cuando menos otro antígeno de Leishmania que tenga propiedad inmunogénicas para desencadenar y/o favorecer una respuesta inmunitaria, de tipo B y/o T, en huéspedes humanos o animales. La composición inmunogénica de conformidad con la invención , puede comprender además, cuando menos un polipéptido que consiste de un fragmento de cuando menos una proteína histona suplementaria de Leishmania. Dicho fragmento de una proteína de histona, se selecciona principalmente de entre las proteínas histonas H2A, H3 y H4. La proteína histona es, por ejemplo, característica de L. major, L. infantum, L. donovani, L. trópica y L. enrietti. De manera general , la proteína histona puede ser característica de una especie que se selecciona dentro del género Leishmania. Dicho fragmento, por ejemplo, puede comprender la totalidad o una porción de la región N-terminal de dicha proteína histona. El fragmento, por ejemplo, tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. En un ejemplo específico, la longitud de la secuencia de dicho fragmento representa de 1 0 al 45% de la longitud de la proteína histona . La composición inmunogénica de conformidad con la invención , puede comprender alternativamente cuando menos una proteína histona completa de Leishmania, en asociación con el polipéptido antigénico de la histona H2B que se describió anteriormente. La mencionada cuando menos una proteína histona completa, se selecciona principal mente de entre H2A, H3 y H4. Ésta puede ser característica de L. major, L. infantum, L. donovani, L. trópica y L. enrietti. De manera general , dicha cuando menos una proteína histona completa , puede ser característica de una especie que se seleccione dentro del género Leishmania. La composición inmunogénica se puede inyectar como tal , o con un veh ículo farmacéuticamente aceptable. La composición inmunogénica de conformidad con la invención , también puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable que pueda ser administrado a un huésped humano o animal . Un veh ículo farmacéuticamente aceptable puede ser seleccionado fácilmente por un técnico en la materia, entre agua , sustancias polares, tales como etilénglicol , polietilénglicol o propilénglicol, así como sustancias no polares. De conformidad con una modalidad particular de la invención , la composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de tipo celular, de células T efectoras, por ejemplo, células CD4+ , cuando dicha composición es administrada a un ser humano o un animal . Las células T comprenden células efectoras de inmunidad mediada por células (por ejemplo, las células T CD4+ ó CD8+), así como células reguladoras ("cooperadoras" y supresoras) de la respuesta inmunitaria . El polipéptido de conformidad con la invención , activa de preferencia las células efectoras de inmunidad mediada por células. En la presente invención, la respuesta inmunitaria de ti po celular, pri ncipalmente puede ser una respuesta inmunitaria de tipo Th1 . El polipéptido o polipéptido variante, está presente en la composición inmunogénica de conformidad con la invención en una concentración comprendida entre 0.01 y 5 µg/µl, por ejemplo entre 0.01 y 2 µg/µl , o entre 0.4 y 1 µg/µl . Igualmente, la invención se refiere a un polipéptido que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o una porción de la región N-terminal de dicha proteína histona H2B . En un ejemplo específico, el polipéptido es característico de la histona H2B de Leishmania major. El polipéptido puede ser característico de la proteína histona H2B de L. infantum, L. donovani, L. trópica y L. enrietti. De manera general , el polipéptido puede ser característico de una especia que se selecciona del género Leishmania. En un ejemplo específico, el polipéptido de conformidad con la invención tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. En un ejemplo específico , el polipéptido de conformidad con la invención tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. El polipéptido en su marco de secuencia, comprende cuando menos 6 aminoácidos consecutivos de la porción N-terminal del antígeno H2B considerado. La longitud de la secuencia de dicho polipéptido, representa por ejemplo, del 10 al 45% de la longitud de la proteína histona. En un ejemplo específico, el polipéptido de conformidad con la invención comprende los 50 primeros aminoácidos de la proteína histona H2B, más particularmente los primeros 46 aminoácidos de la proteína histona H2B, tal como se representa en la figura 1. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido de conformidad con la invención, por ejemplo, es la siguiente: M A S S R S A S R K A S N P H K S H R K P K R S W N V Y V G R S L K A I N A Q M S M S H R T. En un ejemplo específico, el polipéptido de conformidad con la invención es un polipéptido purificado o aislado de su ambiente de producción. La invención también tiene como objetivo un polipéptido variante que conserva cuando menos 50% de identidad, de preferencia cuando menos 80% de identidad con el polipéptido de conformidad con la invención. Dicho polipéptido variante presente una sustitución, una deleción o una adición, de cuando menos un aminoácido, con respecto a la secuencia del polipéptido y conserva las propiedad inmunogénicas de dicho polipéptido.

El pol ipéptido variante tiene una secuencia polipeptídica menor de 75 aminoácidos, de preferencia menor de 60 aminoácidos. De manera ilustrativa, los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones conservadoras de aminoácidos en la secuencia de la histona H2B de Leishmania que se ilustró anteriormente. Otra modalidad de variantes polipeptídicas recurre a la preparación de péptidos de la proteína histona H2B considerada, en donde los péptidos tienen , por ejemplo, secuencias peptídicas que comprenden de 6 a 30, por ejemplo de 6 a 20 ó de 6 a 1 5 aminoácidos, seleccionados a partir de la secuencia N-terminal de la proteína histona. Los péptidos se pueden utilizar en mezclas, y estar en forma de mixótopos. Las mezclas peptídicas comprenden, por ejemplo, cuando menos 2 ó cuando menos 5 secuencias peptídicas diferentes unas de las otras o por el contrario, tienen aminoácidos consecutivos en común. Los polipéptidos (comprendidos los péptidos) de la invención , se preparan por métodos conocidos para los técnicos en la materia , por ejemplo, por síntesis qu ímica, o por expresión en un sistema celular, principalmente bacteriano, o in vitro en un sistema "libre de células". Igual mente, la i nvención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido o el polipéptido variante de conformidad con la invención .

La secuencia nucleotídica de dicha molécula de ácido nucleico , puede ser la siguiente o una porción de esta secuencia: ATG GCC TCT TCT CGC TCT GCT TCC CGC AAG GCT TCC AAC CCG CAC AAG TCG CAC CGC AAG CCG AAG CGC TCG TGG AAC GTG TAC GTG GGC CGC TCG CTG AAG GCG ATC AAC GCC CAG ATG TCG ATG TCG CAC CGC ACG . De la misma manera, la invención se refiere a una vacuna que permite obtener una protección contra una infección por Leishmania. El principio activo de dicha vacuna comprende el polipéptido, el polipéptido variante o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención . En un ejemplo específico, la vacuna comprende además un adyuvante que estimula la respuesta inmunitaria cuando es administrado a un huésped humano o animal , y de manera general , dicha vacuna se prepara a partir de una composición inmunogénica de conformidad con la invención, tal como se describió anteriormente. El término "vacuna" significa una preparación antigénica que permite obtener la prevención de infecciones microbianas, mediante la vacunación de un huésped . La vacuna de conformidad con la invención, alternativamente se puede preparar para cond ucir una actividad terapéutica contra la infección. El adyuvante favorece, por ejemplo, una respuesta inmunitaria de tipo celular y, en el caso de la presente invención , puede ser el CpG .

Dicha vacuna se puede administrar, por ejemplo , inyectada como tal , o con un vehículo farmacéuticamente aceptable . Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser seleccionado fácilmente por un técnico en la materia, entre agua, sustancia polares, tales como etilénglicol , polietilénglicol o propilénglicol , así como sustancias no polares. En un ejemplo específico, la vacuna comprende cuando menos otro antígeno de Leishmania agregado como principio activo, en donde dicho antígeno tiene propiedad inmunogénicas para desencadenar y/o favorecer una respuesta inmunitaria, de tipo B y/o T, en un huésped humano o animal . La vacuna además puede comprender cuando un polipéptido que consiste de un fragmento de cuando menos una proteína histona diferente de la H2B de Leishmania, o una molécula de ácido nucleico que codifica para dicho o dichos polipéptidos, o puede comprender además cuando menos una proteína histona completa de Leishmania, en asociación con el polipéptido antigénico de la histona H2B anteriormente descrito , o una molécula de ácido nucleico que codifica para dicha o dichas proteínas histonas completas. Dicho fragmento de una proteína histona, se selecciona principalmente entre las proteínas histonas H2A, H3 y H4. De manera general , la cuando menos una proteína histona puede ser característica de una especie que se selecciona dentro del género Leishmania. Dicha cuando menos una proteína histona, es por ejemplo característica de L. major, L. infantum, L. donovani, L. trópica y L. enrietti. Este fragmento, por ejemplo, puede comprender la totalidad o una parte de la región N-terminal de la proteína histona. El fragmento , por ejemplo, tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. En un ejemplo específico, la longitud de la secuencia de dicho fragmento, representa del 1 0 al 45% de la longitud de la proteína histona. La vacuna de conformidad con la invención , se puede utilizar para prevenir o tratar una infección por Leishmania major, cuando es administrada a un ser h umano o a un animal. La vacuna de conformidad con la invención es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de tipo celular, de células T efectoras, por ejemplo células CD4+ , cuando es administrada a un ser humano o a un animal . Las células T comprenden células efectoras de inmunidad mediada por células (por ejemplo , las células T CD4+ ó CD8+), así como células reguladoras ("cooperadoras" y supresoras) de la respuesta inmunitaria. El polipéptido de conformidad con la invención , activa de preferencia las células efectoras de inmunidad mediada por células. Esta respuesta inmunitaria de tipo celular, principalmente puede ser una respuesta inmunitaria de tipo Th 1 . Se sabe que el CpG es capaz de activar monocitos, macrófagos y células dendríticas . Así pues, el CpG inyectado al mismo tiempo que un antígeno, puede orientar la respuesta inmune específica hacia una de tipo Th 1 . Las vías de administración de la vacuna de conformidad con la invención , son diversas y comprenden la vía intravenosa , oral , transdérmica y nasal ; no obstante, las vías intramuscular y subcutánea son las más comunes. El principio activo de la vacuna de conformidad con la invención , está presente en una cantidad suficiente. La expresión "cantidad suficiente" significa una cantidad o una concentración del principio activo, capaz de inducir una protección inmunitaria contra la Leishmaniasis. Eventualmente, las indicaciones para la vacunación pueden prescribir la administración repetida de dosis de la vacuna. El polipéptido o el polipéptido variante o la molécula de ácido nucleico, están presentes en la vacuna de conformidad con la invención en una concentración comprendida entre 0.01 y 5 µg/µL, por ejemplo entre 0.01 y 2 µg/µL o entre 0.4 y 1 µg/µL. Finalmente, la invención se refiere también a un vector de expresión capaz de expresar el polipéptido o el polipéptido variante de conformidad con la invención , que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención. El término "vector de expresión" significa el medio por el cual los ácidos nucleicos, principalmente el ADN , ADN complementario , ARN o variantes de los mismos, son introducidos en una célula , particularmente una célula procariótica, para expresar o produci r una proteína determi nad a. En el objetivo de expresar cierta proteína o cierto polipéptido, el vector de expresió n puede contener cuando menos un promotor, cuando menos un operador, cuando menos un codón de terminación , así como cualquier secuencia necesaria para lograr una transcripción eficaz y una traducción de los ácidos nucleicos a partir del vector. El conjunto de estos elementos es conocido por los técnicos en la materia. La invención también tiene como objetivo células huésped , por ejemplo procarióticas, principalmente bacterias, transformadas o transfectadas por un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido de conformidad con la invención , bajo condiciones que permitan su expresión . La invención también tiene como objetivo un plásmido pET-CH2B que comprende la secuencia de la porción carboxilo-terminal de la proteína H2B, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM ), con el No. I-3362, el 24 de febrero del 2005. La invención también tiene como objetivo un plásmido pET-N H2B , que contiene la secuencia de la porción amino-terminal divergente de la proteína H2B, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM ), con el No. I-3363, el 24 de febrero del 2005. La invención también tiene como objetivo un plásmido pET-H2B, que contiene la secuencia de la proteína H2B, depositado en la Colección Nacional de Cultivos d e Microorganismos (CNCM), con el No. 1-3361 , el 24 de febrero del 2005. Figura 1 : Secuencia nucleotídica y proteína de la histona H2B de L. major. Las secuencias representadas por las notaciones H2B 1 P-N D up, H2B2 X-S rev, H3B P-Nd up y H3B P-Xh rev, corresponden a los cebadores de amplificación de las dos partes h2b?C65(1 -138pb) (N-terminal ) y h2b?N46( 1 39-333pb) (C-terminal ) de la proteína. Figura 2: Análisis de la expresión y purificación de las proteínas histonas recombinantes H2B?C65 (A), H2B?N46 (B) y H2B (C) de L. major, en gel de poliacrilamida al 18%, después de una tinción con azul de Commassie. Pozo 1 : extracto crudo de bacterias BL21 transformadas con los plásmidos recombinantes respectivos y no inducidas con I PTG . Pozo 2: extracto crudo de bacterias BL21 transformadas con los plásmidos recombinantes respectivos e inducidas con I PTG. Pozo 3: proteínas histonas recombinantes purificadas en una columna de níquel (H2B , H2B?C65 y H2B?N46 de L. major). Pozo PM : marcadores de peso molecular. Figura 3: Análisis por inmunoelectrotransferencia (inmunoblot) de la reactividad de anticuerpos policlonales anti-H2B de conejo, frente a las proteínas histonas recombinantes H2B, H2B?C65 y H2B?N46 de L. major, después de una purificación en una columna de níquel. Pozo 1 : extracto crudo de bacterias BL21 transformadas con los plásmídos recombinantes respectivos y no inducidas con I PTG . Pozos 2, 3, 4: proteínas histonas recombinantes purificadas en una columna de níquel (H2B, H2B?C65 y H2B?N46 de L. major). Fig ura 4: representación gráfica de la evolución del diámetro de las lesiones en ratones BALB/c de control ( PBS) o inmunizados con H2B (H2B-CpG) o sólo la parte amino-terminal de H2B (H2B DC65-CpG), e presencia de 25 µg de CpG/inyección, utilizado como adyuvante. Los ratones fueron infectados 30 d ías después del inicio , con 1 05 promastigotes de L. major. Los valores representan el promedio de las lesiones, expresado en mm ± desviación estándar. Fig ura 5: Determinación del promedio del número de parásitos por ganglio, por la técnica de diluciones límite en los diferentes grupos de ratones inmunizados dos veces por vía subcutánea, en la almohadilla plantar, con H2B+CpG, H2B?C65+CpG y H2B?N46+CpG . La cuantificación se realizó 8 semanas después del desafío con 1 06 promastigotes de L. major. Los resultados se expresan en el promedio del número de parásitos por ganglio de la dilución más alta en la cual al menos un promastigote de L. major era viable. Fig ura 6: Representación gráfica de la evolución del promedio de los diámetros de las lesiones (mm), en ratones BALB/c vacunados o no, y después de un desafío con L. major, a razón de 1 05 (A) ó 1 06 (B) promastigotes metacíclicos. T+5 ó 6: grupo control (PBS) después de un desafío con 1 05 (5) ó 1 06 (6) parásitos. N + 5 ó 6: ratones que recibieron la región amino-terminal de la H2B . C+5 ó 6: ratones q ue recibieron la región carboxilo-terminal de la H2B . CpG + 5 ó 6: ratones q ue recibieron solamente adyuvante (CpG). Los valores representan el promedio de las lesiones, expresado en mm ± desviación estándar. Figura 7: determi nación de la carga parasitaria , por la técnica de diluciones límite en diferentes grupos de ratones inmunizados tres veces, por vía subcutánea, en la almohadilla plantar, con H2B?N46+CpG , H2B?C65+CpG , así como los controles CpG . La cuantificación se realizó 1 0 semanas después del desafío con 1 05 ó 1 06 promastigotes de L. major. Los resultados se expresan como en la Figura 5. EJEM PLOS Material y Métodos Parásitos y condiciones de cultivo La cepa parasitaria M HOM/TN/94/GLC95 (GLC94) aislada de una lesión humana de leishmaniasis cutánea zoonótica (LCZ), se utilizó en el presente trabajo (Louzir et ai, 1 998). Este aislamiento pertenece a la especie L. major, zimodemo MON25 (Kebaier et ai, 2001 ). Los parásitos se cultivaron en medio NN N a 26°C y progresivamente fueron transferidos a medio RPM I (S IGMA, St. Louis, MO) que conten ía L-glutamina 2 mM , 1 00 U/mL de penicilina, 1 00 µg/mL de estreptomicina y 1 0% de suero fetal de ternera inactivado (medio completo). Los promastigotes, tomados en fase logarítmica de crecimiento, se ajustaron a 106 parásitos/mL en un volumen constante de medio completo y después se incubaron a 26°C. La fase estacionaria de crecimiento se alcanzó después de 4 a 6 días de cultivo, con una densidad de parásitos de 3.107 a 8.107 parásitos/mL. Los promastigotes metacíclicos, posteriormente, se purificaron bajo un gradiente de Ficoll al 5-20% , se lavaron, se contaron y después se inyectaron a los ratones. Expresión y purificación de las diferentes proteínas recombinantes, en bacterias E. coli BL21 Las secuencias que codifican para la proteína histona H2B completa (339pb), la porción amino-terminal (aminoácidos del 1 al 46) divergente H2B?C65 (1 38pb) y la porción carboxilo-terminal (aminoácidos del 47 al 1 1 1 ) conservada H2B?N46 ( 1 98pb), se clonaron en el vector de expresión bacteriano pET-22b (Novagen) (Figura 1 ). Las bacterias E. coli BL21 que contenían los plásmidos recombinantes (pET-22b-H2B , pET-H2B?C65 y pET-H2B?N46), se cultivaron en el medio LB y después se indujo la síntesis de la proteína recombi nante en presencia de isopropil-1 -tio-ß-D-galactopiranósido ( I PTG ) 1 mM , durante 4 horas. Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad, en una columna de níquel (Ni2+) (Amersham-Pharmacia). La pureza de las proteínas producidas se verificó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS ) (Figura 2). El plásmido pET-CH2B que conten ía la secuencia de la porción carboxilo-termi nal de la proteína H2B , se depositó en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), el 24 de febrero del 2005, con el No. 1-3362. Descri pción del pET-CH2B. El plásmido pET-CH2B se obtuvo por clonación en el plásmido pET-22b+ (Novagen), de la secuencia de ADN complementaria que codifica para la proteína histona H2B truncada, de los 46 primeros aminoácidos (H2B?N46) de Leishmania major. El gen H2B?N46 fue clonado a nivel de los sitios de restricción Nde\ y Xho\ del pET-22b+. Las bacterias recombinantes E. coli XL 1 -blue se transformaron con el plásmido pET-CH2B . Éstas son resistentes a la tetraciclina y a la ampicilina . Los genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina son portados por las bacterias XL 1 -blue y el plásmido pET-22b+ rcombinante. El plásmido pET-N H2B que contenía la secuencia de la porción amino-terminal divergente de la proteína H2B, se depositó en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM ), el 24 de febrero del 2005 , con el No. I-3363. Descri pción del pET-N H2B : el plásmido pET-N H2B se obtuvo mediante la clonación en el plásmido pET-22b+ (Novagen) de la secuencia de ADN complementaria que codifica para la proteína histona H2B truncada de los últimos 65 aminoácidos (H2B?C65) de Leishmania major. El gen H2B?C65 se clonó a nivel de los sitios de restricción Nde\ y Xho\ . Se transformaron bacterias recombinantes E. coli XL 1 -blue con pET-N H2B . Éstas son resistentes a la tetraciclina y a la ampicilina . Los genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina son portados por las bacterias XL1 -blue y el plásmido pET-22b+ recombi nante. El plásmido pET-H2B que contenía la secuencia de la proteína H2B , se depositó en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM ), el 24 de febrero del 2005, con el No: I-3361 . Descripción del pET-H2B : el plásmido pET-H2B se obtuvo mediante la clonación en el plásmido pET-22b+ (Novagen) de la secuencia de ADN complementaria que codifica para la proteína histona H2B completa de Leishmania major. El gen H2B fue clonado a nivel de los sitios de restricción Nde\ y Xho\ . Se transformaron bacterias recombinantes E. coli XL1 -blue con pET-H2B . Éstas son resistentes a la tetraciclina y a la ampicilina. Los genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina son portados por las bacterias XL1 -blue y por el plásmido pET-22b+ rcombinante. El plásmido pET-H2B, en lo sucesivo, se designará como pET-22b-H2B . El plásmido pET-CH2B , en lo sucesivo, se designará como pET-H2B?N46. El plásmido pET-CH2B , en lo sucesivo, se designará como pET-H2B?C65. Las condiciones de cultivo de las bacterias transformadas fueron las siguientes: Medio de cultivo propuesto Las bacterias recombinantes se cultivaron ya sea en medios de cultivo l íquidos o bien , en medios de cultivo sólidos. El medio de cultivo l íquido, Caldo Luria (LB), está compuesto de: bactotriptona al 1 % (peso/volumen ), 0.5% (p/v) de extracto de levadura y NaCI al 1 % (p/v). El pH del medio debe estar regulado a 7. Este medio se propone para la multiplicación de los plásmidos pET-22b+ que contienen el gen H2B?C65 (o que contienen el gen H2B?N46 ó el gen H2B ). El medio de cultivo sólido, Agar de Caldo Luria (Agar-LB) está constituido por: bactotriptona al 1 % (peso/volumen), 0.05% (p/v) de extracto de levadura, NaCI al 1 % (p/v) y 1 .5% (p/v) de agar. Este medio se propone esencialmente cuando se realizan cultivos a partir de bacterias recombinantes congeladas a -0.80°C. Estos dos medios de cultivo se esterilizan a 1 20°C durante 20 minutos, justo después de su preparación . Condiciones de almacenamiento Las bacterias recombinantes congeladas a -80°C, se extendieron en una botella que contenía medio de cultivo sólido Agar-LB suplementado con 1 5 µg/m L de tetraciclina y 50 µg/mL de ampicilina, durante 1 8 horas, a 37°C, y después una colonia aislada se tomó y se incubó en 5 mL de LB adicionando los mismos antibióticos. El cultivo se realizó durante 1 8 horas a 37°C. I ncubación (temperatura, atmósfera, agitación, iluminación). La temperatura del cultivo siempre fue a 37°C bajo una agitación de 200 revoluciones/min (aparato I ncubadora Orbital Sanyo). El cultivo se realiza bajo la atmósfera ambiental y bajo una iluminación natural . Protocolo de vacunación y desafío en ratones Se realizaron dos protocolos experimentales, en el primer protocolo, los ratones fueron inyectados dos veces a intervalos de 1 5 d ías con las diferentes preparaciones de vacuna (Tabla 1 ). El segundo protocolo se utilizó para confirmar y optimizar ciertos resultados (véanse los detalles en la Tabla 2). Todas las inyecciones fueron por vía subcutánea, en la almohadilla plantar de la pata delantera derecha, con un volumen final de 50 µl por inyección . Cuatro semanas después de la última inyección , los ratones recibieron una inyección de parásitos L. major (promastigotes metacíclicos), en la almohadilla plantar de la pata delantera derecha. Se utilizaron dos cantidades de parásitos, 1 05 y 1 06 parásitos/inyección . El seguimiento de la evolución de la enfermedad experimental , se realizó mediante la medición semanal del diámetro de la lesión .

TABLA 1 Experimento 1 , protocolo experimental de inmunización y desafío en ratones.

TABLA 2 Experimento 2, protocolo experimental de inmunización y desafío en ratones.

Carga parasitaria La cuantificación de los parásitos se estimó a nivel de los sitios de lesión, utilizando una variante de la técnica de diluciones limitadas (Titus RG, Marchand M, Boon T, Louis JA. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol 1985; 7:545-55). Brevemente, la pata infectada se cortó, se homogeneizó en un volumen de 5 mi de medio RPMI adicionado con antibióticos y después se hizo una serie de diluciones de 1:10 hasta 1:1011, por cuadruplicado, en una placa de microtitulación (96 pozos, Nunc, Roskilde, Dinamarca) que contenía medio RPMI suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM y suero bovino sin complementado al 1 0% . Las placas se incubaron a 26°C durante cuando menos 1 5 d ías. La búsqueda de parásitos vivos se realizó con un microscopio invertido. La carga parasitaria se expresó como el promedio del logaritmo negativo de la última dilución en la cual se detectaron parásitos móviles. Resultados Producción y purificación de las diferentes proteínas recombinantes La proteína H2B completa (1 1 1 aa), la porción divergente de la H2B situada a nivel de los 46 primeros aminoácidos y la porción conservada de la H2B localizada entre los aa 47 y 1 1 1 , se expresaron utilizando el sistema de expresión procariótico pET, y después se purificaron por cromatografía de afinidad en una columna de níquel (Fig . 2 ). Los anticuerpos policlonales anti-H2B obtenidos después de la inmunización de ratones BALB/c con la proteína recombinante H2B completa, reconocieron específicamente, por inmunoeletrotransferencia, las proteínas recombinantes H2B , H2B?C65 y H2B?N46 ( Fig . 3). Eval uación cl ín ica y patológica del efecto de la vacu nación de ratones BALB/c con la proteína H2B completa, o mutada, seguida por un desafío con L. major virulenta. Los experimentos preliminares realizados en ratones BALB/c vacunados con la proteína H2B por sí sola o en presencia de un adyuvante (dos inyecciones de 20 mg de proteína ± 25 µg de CpG, a intervalos de 1 5 d ías), demostraron que estos ratones fueron capaces, un mes después de la última inmunización, de producir grandes cantidades de I N F-? cuando sus células ganglionares (drenadas de los sitios de inyección) fueron reestimuladas in vitro con la proteína H2B . Las cantidades de I L-1 0 ó I L-4 fueron muy bajas o no detectables. Estos resultados sugieren que la proteína H2B tiene la capacidad de induci r, en ratones BALB/c, una respuesta específica Th 1 . La capacidad de las d iferentes preparaciones de vacuna para inducir una protección en el modelo murino de leishmaniasis experimental , fue evaluada en ratones sensibles BALB/c, utilizando dos experimentos diferentes y complementarios. Experimento 1 Dos grupos de ratones BALB/c (4 ratones por grupo), hembras de 6 a 8 semanas de edad , fueron inyectados dos veces a intervalos de 1 5 d ías, con diferentes preparaciones de vacuna (Tabla 1 ). Las proteínas recombinantes probadas ya sea fueron auxiliadas con el adyuvante CpG , o bien, con un control negativo de CpG, denominado no-CpG (nCpG ). El CpG es un oligodesoxinucleótido de ADN no metilado, que posee una porción particular de CpG . Se ha demostrado claramente en la literatura científica, que el adyuvante CpG es capaz de activar monocitos, macrófagos y células dendríticas. Asimismo , el CpG inyectado al mismo tiempo que un antígeno, puede orientar la respuesta inmune específica hacia el tipo Th 1 (para revisión , véase Klinman et al . , 2004).

Se realizaron dos inmunizaciones por vía subcutánea, en la almohadilla plantar de la pata delantera derecha. Un mes después, los diferentes g rupos de ratones BALB/c fueron infectados con 2x1 05 promastigotes metacíclicos de la cepa parasitaria virulenta L. major (GLC94), en la almohadilla plantar de la pata delantera izquierda . El resultado de la evolución de la lesión en cada lote de ratones inmunizados e infectados , se expresó como el promedio del tamaño de las lesiones observadas en los ratones del mismo grupo. Después de un seguimiento cl ínico de 8 semanas, sólo dos lotes de ratones mostraron una mejoría muy significativa de las lesiones experimentales . Se trata de los ratones inmunizados con la proteína H2B completa , en presencia de CpG (H2B+CpG) y los ratones inmunizados con la porción amino-terminal de la H2B, en presencia de CpG (H2B?C65+CpG). Las diferencias fueron muy significativas con respecto a los otros grupos, incluyendo el grupo de ratones de control (p<0.001 a partir de la semana 5) (Fig. 4). Es muy interesante subrayar que los ratones inmunizados con la porción amino-terminal de la H2B , en presencia de CpG, fueron más resistentes que aquellos inmunizados, bajo las mismas condiciones, con la proteína completa (p<0.05 , a partir de la semana 5), cuando fueron posteriormente infectados con L. major. Además, todos los demás grupos desarrollaron una enfermedad experimental similar a la observada en los ratones de control (inyectados con PBS). En conclusión, los resultados obtenidos demuestran que la porción N H2-terminal de la proteína H2B y la proteína H2B completa , en presencia del adyuvante CpG , son capaces de inducir un efecto protector en ratones BALB/c, después de un desafío con L. major virulenta . Además, la comparación de las curvas de evolución de las lesiones entre estos dos lotes de ratones, demuestra una mayor resistencia (estad ísticamente significativa) de los ratones vacunados con H2B?C65+CpG , con respecto a los ratones vacunados con H2B+CpG . Eval uación de la carga parasitaria. La determinación de la carga parasitaria en ganglios poplíteos drenados de la lesión, representó un factor determinante en la evaluación de la vacuna contra la leishmaniasis (Kébaier et al. ; 2001 , "Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response, Infect. Immun. 2001 , Ago, 69(8):4906-1 5). La carga parasitaria fue evaluada (8 semanas después de la infección experimental ) únicamente en los grupos de ratones que se mencionan a continuación : - ratones de control (PBS) - ratones vacunados con H2B + CpG - ratones vacunados con H2B?C65+CpG - ratones vacunados con H2B?N46+CpG En la Fig. 5 se representan los resultados de la carga parasitaria analizada en ganglios drenados del sitio de inyección de parásitos. Existe una muy buena correlación entre la carga parasitaria y la gravedad de las lesiones experimentales inducidas en los diferentes grupos de ratones. Los ratones vacunados con H2B?N46, no protegidos, tuvieron una carga parasitaria similar a la observada en los ratones de control . En cambio, los dos grupos de ratones que recibieron H2B o la porción amino-terminal (H2B?C65), presentaron una carga parasitaria muy inferior a la de los grupos de control (de 1 00 a 1 000 veces inferior). Es interesante subrayar que los ratones inmunizados con la porción amino-terminal de la H2B , presentaron una carga parasitaria promedio al menos 1 0 veces inferior a la encontrada en los ratones inmunizados con la proteína completa (H2B). Estos resultados confirman la superioridad de la porción divergente (amino-terminal) con respecto a la proteína H2B completa, en su capacidad de conferir una protección de los ratones sensibles BALB/c contra un desafío con L. major virulenta. Experimento 2 Con el fi n de confirmar los resultados utilizando 1 0 veces más parásitos para el desafío, los inventores se interesaron en las proteínas truncadas de la H2B (H2B?C65 y H2B?N46), utilizando una concentración más elevada de CpG (50 µg/inyección) y tres inmunizaciones a intervalos de 21 d ías. Además, se emplearon dos grupos de control (un grupo que recibió solamente CpG y el otro que recibió solamente solución reguladora PBS). Un mes después de la última dosis de vacuna, los ratones fueron infectados con dos dosis de parásitos (ya sea 1 05, o bien , 1 06 parásitos (promastigotes metacíclicos)/inyección). El protocolo experimental se detalla en la Tabla 2.

Las Figs. 6 y 7 demuestran claramente que sólo los ratones inmunizados con la porción d ivergente de la proteína H2B (H2B?C65), resistieron la infección experimental por L. major, después del uso de 1 06 promastigotes metacíclicos para el desafío. Existe una perfecta correlación entre la resistencia clínica y la carga parasitaria observada al final del protocolo (10 semanas después de la infección). Estos resultados confi rman los obtenidos en el primer experimento y sugieren que el segundo protocolo de inmunización confiere una mayor protección a los ratones BALB/c contra la infección por L. major. Discusión Según las cifras de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la leishmaniasis es una amenaza en 88 países, 350 millones de personas están expuestas a los riesgos de picaduras de phlebotomos, que son los insectos vectores, y se estima un número de 12 millones de individ uos infectados. En su forma más grave, esta enfermedad causa la muerte. El hecho de que la mayoría de los individuos que han desarrollado una leishmaniasis, o simplemente una infección asintomática, han resistido la infección , justifica las investigaciones para el desarrollo de vacunas. No obstante, todavía existen dos grandes problemas: un mejor conocimiento de la naturaleza precisa de los mecanismos efectores de la resistencia, así como la naturaleza de los antígenos parasitarios y el adyuvante a utilizar. Actual mente no existen vacunas para aplicación en seres humanos. Las vacunas de primera generación , que son las únicas que se han probado en seres h umanos, demostraron su ineficacia (Sharifi et al. , 1988; Khalil et al. , 2000; De Luca et al. , 2001 ; Armijos et al . , 2004). Los experimentos aqu í reportados, permiten identificar y evaluar novedosos candidatos para vacuna contra la leishmaniasis. La proteína histona H2B de L. infantum, inicialmente fue seleccionada en el laboratorio como proteína parasitaria de bajo peso molecular, capaz de inducir una respuesta Th 1 en seres humanos. Los resultados más recientes sugieren la función de esta proteína como candidato para vacuna (Mel by, 2000; Probst et al ., 2001 ; Iborra et al . , 2004). Los trabajos aquí descritos, se basan en el análisis comparativo de la inmunogenicidad y de la función protectora de dos regiones (divergente y conservada) de la proteína recombinante H2B de Leishmania, así como la proteína completa. Los resultados demuestran claramente que la porción amino-terminal (divergente) de la H2B , con el adyuvante CpG , confieren una muy buena protección a ratones sensibles BALB/c contra un desafío con L. major virulenta. Por el contrario, la porción conservada (carboxilo-terminal), inyectada bajo las mismas condiciones, no tuvo ningún efecto protector. Es muy interesante señalar que la proteína H2B completa confiere una protección mediana. El conjunto de resultados sugiere que la porción amino-terminal (divergente) de la H2B , puede constituir u n buen candidato para vacuna contra la leishmaniasis.

Referencias Alimohammadian M H , Khamesipour A, Darabi H, et al. The role of BCG in human immune responses induced by múltiple injections of autoclaved Leishmania major as a candidate vaccine against leishmaniasis. Vaccine 2002; 21 : 1 74-80. Armijos RX, Weigel MM , Calvopina M , Hidalgo A, Cevallos W, Correa J . Safety, immunogenicity, and efficacy of an autoclaved Leishmania amazonensis vaccine plus BCG adjuvant against New World cutaneous leishmaniasis. Vaccine. 12 marzo 2004; 22(9-1 0): 1 320-6. Belkaid Y, Piccirilio CA, Méndez S, Shevach EM, Sacks DL: CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature 2002; 420-502-507. Brodskyn C, Beverley SM , Titus RG. Virulent or avirulent (dhfr-ts-) Leishmania major elicit predominantly a type-1 cytokine response by human cells in vitro. Clin Exp Immunol. 2000; 1 19(2):299-304. Campbell K, Diao H , J¡ J , Soong L. DNA immunization with the gene encoding P4 nuclease of Leishmania amazonensis protects mice against cutaneous Leishmaniasis. Infect Immun. 2003; 71 ( 1 1 ):6270-8. Campos-Neto A, Webb JR, Greeson K, Coler RN, Skeiky YA, Reed SG. Vaccination with p lasmid DNA encoding TSA/LmSTI 1 leishmanial fusión proteins confers protection against Leishmania major infectíon in susceptible BALB/c mice. I nfect Immun. 2002; 70(6):2828-36.

Coler RN, Skeiky YA, Bernards K, Greeson K, Cárter D, Comellison CD, Modabber F, Cam pos-Neto A, Reed SG. Immunization with a polyprotein vaccine consisting of the T-Cell antigens thiol-specific antioxidant, Leishmania major stress-inducible protein 1 , and Leishmania elongation initiation factor protects against leishmaniasis. Infect I mmun. 2002; 70(8):421 5-25. Davies CR, Lianos-Cuentas EA, Pyke SDM et al. Cutaneous leishmaniasis ¡n the Peruvian Andes: an epidemiological study of infection and immunity. Epedimiol I nfect 1995; 1 14:297-318. De Luca PM, Mayrink W , Pinto JA, et ai A randomized dobule-blind placebo-controlled trial to evalúate the immunogenicity of a candidate vaccine against American Tegumentary leishmaniasis. Acta Trop 2001 ; 80:251 -60. Desjeux P. Leishmaniasis. Public health aspects and control. Clin Dermatol 1996; 14:41 7-23. Dumonteil E, Maria Jesús RS, Javier EO, Maria del Rosario GM . DNA vaccines induce partial protection against Leishmania mexicana. Vaccine. 2003; 21 ( 1 7-1 8):2161 -8. Gavin, M. and Rudensky, A. Control of ¡mmune homeostasis by naturally arising regulatory CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol 2003; 1 5(6):690-6. Guirges SY. Natural and experimental re-infection of man with oriental score. Ann Trop Med Parasitol 1971 ; 65: 1 97-205. Gurunathan S, Sacks DL, Brown DR, Reiner SL, Charest H , Glaichenhaus N, Seder RA. Vaccination with DNA encoding the immunodominant LACK parasite antigen confers protective immunity to mice infected with Leishmania major. J Exp Med . 1997; 1 86(7): 1 1 37-47. Handman E, Symons FM , Baldwin TM, Curtís JM, Scheerlinck JP. Protective vaccination wit promastigote surface antigen 2 from Leishmania major is mediated by a TH 1 type of immune response. Infecí Immun. 1995; 63( 1 1 ):4261 -7. Iborra S, Sot M, Carrion J, Nieto A, Fernandez E, Alonso C, Requena J M. The Leishmania infantum acidic ribosomal protein PO administered as a DNA vaccine confers protective immunity to Leishmania major infections in BALB/c mice. Infect I mmun. 2003; 71 ( 1 1 ):6562-72. I borra S, Soto M, Carrion J, Alonso C, Requena JM. Vaccination with a plasmid DNA cocktail encoding the nucleosomal histones of Leishmania confers protection against murine cutaneous leishmaniosis. Vaccine. 2004; 22(29-30):3865-76. Kéba?er C, Louzir H, Chenik M , Ben Salah A, Dellagi K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 2001 . 69(8), 4906-491 5. Khalil, EA, El Hassan AM, Zijlstra EE, er al. Autoclaved Leishmania major vaccine for prevention of visceral leishmaniasis: a randomized , double-blind , BCG-controlled trial in Sudan. Lancet 2000; 356: 1 565-9. Klinman DM. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immunoprotective agents. Expert Opin Biol Ther. 2004; 4(6):937-46.

WHO Expert Committee. Control of the Leishmaniasis. WHO Tech Rep Ser 1990; 793: 0-1 58. Louzir H , Melby PC, Ben Salah A, Marrakchi H, Aoun K, Ben Ismail R, Dellagi K. Immunologic determinants of disease evolution in localized cutaneous leishma niasis due to Leishmania major. Journal of Infectious Diseases. 1998. 1 77(6), 1687-1695. Maalej IA, Chenik M , Louzir H , Ben Salah A, Bahloul C, Amri F, Dellagi K. Comparative evaluation of ELISAs based on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis. Am J Trop med Hyg . 2003; 68(3):31 2-20. Melby PC, Ogden GB, Flores HA, Zhao W, Geldmacher C, Biediger NM, Ahuja SK, Uranga J, Melendez M. Identification of vaccine candidates for experimental visceral leishmaniasis by immunization with sequential fractions of a cDNA expression library. Infect Immun. 2000;68( 1 0):5595-602. Probst P, Stromberg E, Ghalib HW, Mozel M, Badaro R, Reed SG, Webb JR. Identification and characterization of T cell-stimulating antigens from Leishmania by CD4 T cell expression cloning. J Immunol. 2001 ; 1 66( 1 ):498-505. Ramiro MJ , Zarate JJ, Hanke T, Rodríguez D, Rodríguez JR; Esteban M, Lucientes J, Castillo JA, Laraga V. Protection in dogs against visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum is achieved by immunization with a heterologous prime-boost regime using DNA and vaccinia recombinant vectors expressing LACK. Vaccine. 2003; 21 ( 1 9-20):2474-84. Sharifi I , Reza A, Aflatonian MR, et al. Randomised vaccine trial of single dose of killed Leishmania major plus BCG against anthroponotic cutaneous leishman iasis in Bam , Irán. Lancet 1998; 351 : 1 540-3. Skeiky YA, Coler RN, Brannon M , Stromberg E, Greeson K, Crane RT, Webb JR, Campos-Neto A, Reed SG. Protective efficacy of a tandemly linked, multi-subunit recombinant leishmanial vaccine (Leish- 1 1 1 f) formulated in MPL adjuvant. Vaccine. 2002; 1 0;20(27-28):3292-303. Skeiky YA, Kennedy M, Kaufman D, Borges MM , Guderian JA, Scholler JK, Ovendale PJ, Picha KS, Morrissey PJ, Grabstein KH, Campos-Neto A, Reed SG. Lel F: a recombinant Leishmania protein that ind uces and I L-12-mediated Th 1 cytokine profile. J Immunol. 1998; 161 ( 1 1 ):61 71 -9. Soto M, Requena JM, Quijada L, Pérez MJ, Nieto CG, Guzman F, Patarroyo ME, Alonso C. Antigenicity of the Leishmania infantum histones H2B and H4 during canine viscerocutaneous leishmaniasis. Clin Exp Immunol. 1999; 1 15(2):342-9. Spitzer N, Jardim A, Lippert D, Olafson RW. Long-term protection of mice against Leishmania major with a synthetic peptide vaccine. Vaccine. 1 7 marzo 1 999; 1 7( 1 1 -12): 1298-300. Streit JA, Recker TJ , Filho FG, Beverley SM, Wilson ME.

Protective immunity against the protozoan Leish anía chagasi is induced by subclinical cutaneous infection with virulent but not avirulent organisms. J Immunol.2001; 166(3):1921 -9. Wolffe AP. Transcriptional regulation in the context of chromatin structure. Essays Biochem.2001;37:45-57.

Claims (1)

1. REIVIN DI CACION ES 1 . Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende: i ) un polipéptido antigénico que consiste de un fragmento de la proteína H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o una parte de la región N-terminal de dicha proteína histona H2B , y ii ) un adyuvante que estimula la respuesta inmunitaria. 2. La composición i nmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el polipéptido tiene una secuencia polipeptídíca menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. 3. La composición i nmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde uno o una pluralidad de aminoácidos del polipéptido, denominado polipéptido de referencia, son sustituidos, eliminados o agregados, para formar un polipéptido variante que conserva cuando menos el 50% de identidad , de preferencia cuando menos el 80% de identidad , con el polipéptido de referencia , en donde el polipéptido variante conserva las propiedades inmunogénicas del polipéptido de referencia. 5. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 4, en donde el polipéptido variante tiene una secuencia polipeptídica menor de 75 aminoácidos, de preferencia menor de 60 aminoácidos. 6. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria de tipo celular. 7. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el adyuvante es CpG . 8. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además comprende cuando menos otro antígeno de Leishmania que tiene propiedades inmunogénicas para inducir y/o favorecer una respuesta inmunitaria de tipo B y/o T, en seres humanos o animales. 9. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende cuando menos un polipéptido q ue consiste de un fragmento de cuando menos una proteína histona suplementaria de Leishmania. 1 0. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende cuando menos una proteína histona completa de Leishmania. 1 1 . La composición i nmunogénica de conformidad con la reivindicación 9 ó 1 0, en donde dicha cuando menos una proteína histona se selecciona principalmente de entre H2A, H3 y H4. 1 2. La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 9, 1 0 u 1 1 , en donde dicha cuando menos una proteína histona es característica de L. major, L. infantum, L. donovani, L. trópica o L. enrietti. 1 3. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que además comprende un veh ículo farmacéuticamente aceptable, para ser administrada a un huésped humano o animal . 14. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 3, caracterizada porque es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de tipo celular, de células T efectoras de i nmunidad , cuando es administrada a un ser humano o un animal . 1 5. La composición i nmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 4, caracterizada porque es capaz de induci r una respuesta inmunitaria de tipo Th1 . 1 6. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 5, en donde el polipéptido o polipéptido variante, está presente en una concentración comprendida entre 0.01 y 5 µg/ml . 1 7. Un polipéptido que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la totalidad o una parte de la región N-terminal de dicha proteína histona H2B . 1 8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 7 , característico de Leishmania major. 1 9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 7 ó 1 8, que tiene una secuencia polipeptídica menor de 65 aminoácidos, de preferencia menor de 50 aminoácidos. 20. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 7 a 1 9, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: M A S S R S A S R K A S N P H K S H R K P K R S W N V Y V G R S L K A I N A Q M S M S H R T. 21. Un polipéptido variante que conserva cuando menos el 50% de identidad o similitud, de preferencia cuando menos el 80% de identidad o similitud, con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde el polipéptido variante presenta una sustitución, una deleción o una adición, de cuando menos un aminoácido, con respecto a la secuencia de dicho polipéptido, y conserva las propiedades inmunogénicas de dicho polipéptido. 22. El polipéptido variante de conformidad con la reivindicación 21, que posee menos de 75 aminoácidos, de preferencia menos de 60 aminoácidos. 23. Una molécula de ácido nucleico, que codifica para el polipéptido o polipéptido variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22. 24. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23, que posee la siguiente secuencia nucleotídica o una porción de dicha secuencia: ATG GCC TCT TCT CGC TCT GCT TCC CGC AAG GCT TCC AAC CCG CAC AAG TCG CAC CGC AAG CCG AAG CGC TCG TGG AAC GTG TAC GTG GGC CGC TCG CTG AAG GCG ATC AAC GCC CAG ATG TCG ATG TCG CAC CGC ACG. 25. Una vacuna que permite obtener protección contra una infección causada por Leishmania, caracterizada porque su principio activo comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 7 a 20, el péptido variante de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 ó 24. 26. La vacuna de conformidad con la reivindicación 25 , que además comprende un adyuvante que estimula la respuesta inmunitaria , cuando es administrada a un huésped humano o animal . 27. La vacuna de conformidad con la reivindicación 26, en donde el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria de tipo celular. 28. La vacuna de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, en donde el adyuvante es CpG . 29. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que comprende cuando menos otro antígeno de Leishmania, agregado como principio activo, en donde dicho antígeno tiene propiedades inmunogénicas para inducir y/o favorecer una respuesta inmunitaria , de tipo B y/o T, en un huésped humano o animal . 30. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que además comprende cuando menos un polipéptido que consiste de un fragmento de cuando menos una proteína histona diferente de la H2B de Leishmania, o una molécula de ácido nucleico que codifica para dicho o dichos polipéptidos. 31 . La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que además comprende cuando menos una proteína histona completa de Leishmania, o una molécula de ácido nucleico que codifica para dicha o dichas proteínas histonas completas. 32. La vacuna de conformidad con la reivindicación 30 ó 31 , en donde dicha cuando menos una proteína histona , se selecciona principalmente de entre H2A, H3 y H4. 33. La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 30, 31 ó 32, en donde dicha cuando menos una proteína histona, es característica de L. major, L. infantum, L. donovani, L. trópica o L. enrietti. 34. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, para prevenir o tratar una infección causada por Leishmania major. 35. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34, caracterizada porque es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de tipo celular, de células T efectoras de inmunidad , cuando es administrada a un ser humano o un animal . 36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de tipo Th 1 , cuando es administrada a un ser humano o un animal . 37. Un vector de expresión capaz de expresar el polipéptido o polipéptido variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 7 a 22 , que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 ó 24. 38. El plásmido pET-CH2B que contiene la secuencia de la porción carboxilo-terminal de la proteína H2B , depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), con el número 1-3362. 39. El plásmido pET-NH2B que contiene la secuencia de la porción amino-terminal divergente de la proteína H2B, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), con el número 1-3363. 40. El plásmido pET-H2B que contiene la secuencia de la proteína H2B, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), con el número 1-3361. RES UM EN La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende: i) un polipéptido antigénico que consiste de un fragmento de la proteína histona H2B de Leishmania, en donde el fragmento comprende la región N-terminal de dicha proteína histona H2B , y ii ) un adyuvante estimulante de la respuesta inmunitaria.