BRPI0609847A2 - composição imunogênica, polipeptìdeo, polipeptìdeo variante, molécula de ácido nucléico, vacina, vetor de expressão e plasmìdeos - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, POLIPEPTìDEO, POLIPEPTìDEO VARIANTE, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, VACINA, VETOR DE EXPRESSãO E PLASMìDEOS. A presente invenção trata de uma composição imunogênica que compreende: i) um polipeptídeo aritigênico que consiste em um fragmento da proteína histona H2B de Leishmania, fragmento esse que compreende toda ou parte da região N-terminal da referida proteína histona H2B e ii) um adjuvante que estimula a resposta imunológica.

Description

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, POLIPEPTÍDEO, POLIPEPTÍDEOVARIANTE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VACINA, VETOR DEEXPRESSÃO E PLASMÍDEOS"

A presente invenção trata de uma composição imunogênica quecompreende: i) um polipeptídeo antigênico que consiste em um fragmento daproteína histona H2B de Leishmania, fragmento esse que compreende toda ouparte da região N-terminal da referida proteína histona H2B e ii) um adjuvanteque estimula a resposta imunológica.

A presente invenção trata igualmente de um polipeptídeo queconsiste em um fragmento da proteína histona H2B de Leishmania, fragmentoesse que compreende toda ou parte da região N-terminal da referida proteínahistona H2B, um polipeptídeo variante que conserva pelo menos 50% deidentidade, de preferência pelo menos 80% de identidade com o referidopolipeptídeo, e uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ouo polipeptídeo variante.

A presente invenção trata também de uma vacina que permiteobter uma proteção contra uma infecção por Leishmania, cujo princípio ativocompreende o polipeptídeo, o polipeptídeo variante ou a molécula de ácidonucléico de acordo com o presente invenção, e um vetor de expressão capazde expressar o polipeptídeo ou o polipeptídeo variante, que compreende amolécula de ácido nucléico.

As leishmanioses constituem um grupo heterogêneo de patologiasque afetam vários milhões de indivíduos e são devidas à infecção dohospedeiro animal ou humano por um parasita protozoário do gêneroLeishmania (Desjeux et coll, 1996). A expressão clínica da infecção écaracterizada por um grande polimorfismo que inclui a infecção assintomática,as formas cutâneas simples ou recidivantes, as formas cutâneas difusas ouanérgicas, as formas cutâneo-mucosas, e as formas viscerais mortais naausência de tratamento específico (WHO Expert Committee, 1990). Duranteseu ciclo, o parasita alterna entre dois estágios: o estágio promastigoteflagelado que se encontra no tubo digestivo do inseto vetor e o estadoamastigote no macrófago do hospedeiro mamífero.

O desenvolvimento de uma vacina anti-leishmaniana é desejávelpois foi claramente demonstrado no homem que a infecção por Leishmaniaconfere uma imunidade protetora à reinfecção (Guirges et coll, 1971; Davies etcoll, 1995). Essa proteção está associada ao desenvolvimento de uma respostaimune celular específica do parasita.

Diversas candidatos a vacinas foram avaliados contra a infecçãopelo parasita Leishmania, tanto no modelo murídeo como no homem.

Atualmente, nenhuma vacina para uso humano ou veterináriomostrou uma eficácia significativa na proteção contra as leshmanioses (Sharifiet col., 1998; Khalil et coll, 2002; De Luca et coll, 2001; Armijos et coll. 2004).

Essas vacinas podem ser divididas em três grupos: as vacinas deprimeira geração são constituídas de promastigotes mortos pelo calor ou porirradiação; apesar de sua inocuidade, a eficácia dessas vacinas não foi aindaprovada (Sharifi et coll, 1998; Khalil et coll, 2000; De Luca et coll, 2001, Armijoset coll, 2004).

As vacinas de segunda geração são constituídas de proteínas nativasobtidas por purificação bioquímica, de proteínas recombinantes e de peptídeossintéticos obtidos por engenharia genética. Muitas dessas proteínas foram descritasna literatura pelo fato de induzirem uma proteção significativa no modeloexperimental murídeo. As mais importantes são representadas pela poliproteínaLeish-111f composta de 3 proteínas fortemente imunogênicas, colocadas emassociação, o LeIF {Leishmania elongation initiation factor); a proteína LmSTH (Lmajor stress-inducible protein) e a proteína TSA (thiol-specific antioxidant). Váriostrabalhos permitiram mostrar que cada uma dessas proteínas testadasindividualmente ou associada a IL-12 é capaz de induzir uma diminuição muitosignificativa da evolução da doença nos camundongos BALBc injetados com Lmajor (Sheiky et coll, 1998; Coler et coll, 202; Sheiky et coll, 2002; Campos-Neto etcoll, 2002). A proteína LACK (leishamina homolog of receptor for activated c kinase)em presença da IL-12 é também capaz de conferir uma proteção dos camundongosBALBc contra um desafio virulento por L. major (Gurunathan et coll, 1997).Finalmente, o antígeno PSA-2 purificado a partir de Leishmania confere aoscamundongos uma boa proteção (Handman, 1995).

As vacinas de terceira geração compreendem as vacinas à basede DNA que contêm um ou mais genes que codificam para antígenosleishmanianos (Iborra et coll, 2003; Camphell et coll, 2003; Ramiro et coll,2003; Dumonteil et coll, 2003).

As vacinas de terceira geração compreendem igualmente asleshmanias cujo poder patogênico foi atenuado geneticamente pela deleção degenes de virulência. Pode-se citar o caso das leishmanias deletadas do geneque codifica para a diidrofolato redutase timidilato sintetase (dhfr-ts). Váriosestudos mostraram no modelo murídeo que a vacinação dos camundongos poresses parasitas dhfr-ts podia induzir uma proteção contra a infecção porLeishmania (Brodskyn et coll, 2000; Streit et coll, 2001). É também possívelincluir nas vacinas de terceira geração as vacinas à base de peptídeossintéticos. Diversos ensaios de vacinação foram realizados com diferentespeptídeos que incluem geralmente epítopos T. O exemplo mais conhecido é odo peptídeo PT3 que corresponde a "histidina zinc binding region" da gp63.Assim, esse peptídeo em presença de um adjuvante "poloxâmero 407" é capazde conferir uma proteção duradoura aos camundongos sensíveis BALB/c,depois de um desafio por L. major (Spitzer et al, 1999).

Alguns autores se interessaram pelas proteínas histonas: oprimeiro trabalho remonta a 1999, no qual Soto et coll (1999) mostraram que aproteína H2B podia constituir um alvo da resposta anticorpo da leishmaniosecanina. Mais tarde, Maalej et coll avaliaram a proteína H2B, em comparaçãocom outras proteínas parasitárias, propondo-a como antígeno para odiagnóstico sorológico da leishmaniose visceral humana e mostraram que elapodia constituir um alvo interessante (Maalej et coll, 2003).

No que diz respeito à resposta celular, Probst et coll (2001)mostraram que a proteína H2B, em sua forma recombinante, era capaz deinduzir uma forte proliferação de células mononucleadas de sangue periférico(PBMC) em pacientes que sararam de uma leishmaniose cutânea causada porL. major. Essa proliferação estava acompanhada de uma grande produção deINF-y com ausência de IL-4 (Probst et coll 2001).

No modo murídeo da leishmaniose visceral (LV) causada por L .donovani, Melby et coll (2000) mostraram que a vacinação de camundongossensíveis BALBc por uma fração de vacinas de DNA obtidas a partir de umbanco cDNA, contendo em particular H2B, era capaz de proteger parcialmenteesses camundongos após um desafio virulento por L donovani.

Bem recentemente, nesse modelo da leishamiose experimentalde infecção dos camundongos BALB/c por L. major, Iborra et coll (2004)mostraram que a vacinação dos camundongos com um coquetel de vacinas deDNa que codifica para as proteínas histonas (H2A, H2B, H3 e H4) induzia umaresposta imune importante de tipo Th1 com secreção de INFy associada a umaproteção parcial dos camundongos vacinas após um desafio por L. major.

Por outro lado, foi demonstrado que o parasita Leishmania é capaz deinduzir a ativação das células T reguladoras (Belkaid et coll, 2002), que vão suprimiras respostas imunes efetoras e permitir a multiplicação e a persistência do parasita.

Dados concordantes sugerem que as células T reguladoras sãoselecionadas positivamente após uma forte interação com os peptídeospróprios (TCR-CMH-peptide) (Gavin et Rudensky, 2003).Os inventores se interessaram pela proteína histona H2B comocandidato à vacina. Mais precisamente, eles formularam primeiramente ahipótese de que certas regiões conservadas das proteínas parasitáriaspoderiam ativar preferencialmente as células reguladoras, ao passo que asseqüências divergentes ativariam células efetoras, e também, que uma mesmaproteína parasitária poderia conter peptídeos indutores de respostasreguladoras e de outros indutores de respostas efetoras.

Os inventores analisaram comparativamente a imunogenicidade eo papel protetor das duas regiões amino-terminal, divergente, e carbóxi-terminal, conservada, da proteína recombinante H2B de L. major bem como daproteína inteira.

Eles perceberam que, de modo surpreendente, a parte amino-terminal (divergente) de H2B, adjuvada ao CpG, conferia a melhor proteçãoaos camundongos sensíveis BALB/c contra um desafio virulento por L. major.Essa proteína truncada poderia constituir um bom candidato à vacina contra asleishmanioses.

A presente invenção trata de uma composição imunogênicacaracterizada pelo fato de compreender: i) um polipeptídeo antigênico queconsiste em fragmento da proteína histona H2B de Leishmania, fragmento esseque compreende toda ou parte da região N-terminal da referida proteínahistona H2B e ii) um adjuvante que estimula a resposta imunológica.

Em um modo de realização particular da presente invenção, oprincípio ativo imunogênico da referida composição imunogênica consiste noreferido polipeptídeo imunogênico que consiste em um fragmento derivadounicamente da parte N-terminal da proteína histona H2B de Leishmania.

O termo "fragmento" aplicado a um polipeptídeo ou maisparticularmente a um antígeno, se refere a uma parte da proteína nativaconsiderada, excluindo a totalidade da referida proteína.A parte N-terminal de um polipeptídeo nativo, por exemplo daproteína histona H2B de Leishmania representa de modo geral menos dametade da seqüência de ácidos aminados total desse polipeptídeo, e aseqüência escolhida é a da extremidade N-terminal.

Em um exemplo específico, o polipídeo possui de acordo com apresente invenção uma seqüência polipeptídica de menos de 65 ácidosaminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados. O polipídeo possuiuma seqüência que compreende 6 ácidos aminados provenientes da região N-terminal da referida proteína H2B

Em um exemplo específico, o comprimento da seqüência doreferido polipeptídeo representa 10a 45% do comprimento da proteína histona.

A seqüência dos ácidos aminados de um polipeptídeo de acordocom a presente invenção é por exemplo a seguinte: MASSRSASRKASN P H KSH RKP KRSWN VYVGRS LKAI N AQ M SMSH RT.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo é característico dahistona H2B de Leishmania major.

O polipeptídeo pode ser também característico da proteínahistona H2B de L. infantum, L. Donovani, L. Tropica, L. Enríetti.

As seqüências das proteínas hisstona H2B desses parasitasforam descritas: H2B de L Infantum foi descrita em Soto M. et al, 1999;

Antigenicity of the Leishmania infantum histones H2B and H4 during canineviscerocutaneos leishmaniasis; Journal Clin. Exp. Immunol. 115(2), 342-349(1999); H2B L. Enríetti foi descrita em Genske J.E. et al; 1991; Structure andregulation of histone H2B mRNAs from Leishmania enríetti; Mol. Cell. Biol. 11(1), 240-249(1991).

As seqüências protéicas H2B de L. Donovani et L. Tropica nãoforam ainda descritas. Entretanto, a conservação esperada das proteínashistonas H2B de Leishmania deveria ser superior a 80%.De modo geral, o polipeptídeo pode ser característico de umaespécie escolhida na totalidade do gênero Leishmania.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo compreendido nacomposição imunogênica de acordo com a presente invenção é umpolipeptídeo purificado ou isolado de seu ambiente de produção.

Em um exemplo específico, a referida composição imunogênicacompreende um DNA em forma de uma seqüência polinucleotídica que codificapara o polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, opolinucleotídeo está inserido em um plasmídeo de expressão eucariota.

Um ou mais ácidos aminados do polipeptídeo determinado a partir deuma proteína histona H2B de uma espécie de Leishmania, tal como ilustrado acimae designado pela expressão "polipeptídeo de referência", podem ser substituídos,deletados ou adicionados para formar um polipeptídeo variante que conserva pelomenos 50% de identidade, de preferência pelo menos 80% de identidade com opolipeptídeo de referência, e o referido polipeptídeo variante conserva aspropriedades imunogênicas do polipeptídeo de referência.

A porcentagem de identidade entre o polipeptídeo de referência eo polipeptídeo variante é determinada depois da realização de um alinhamentoglobal ótimo. Esse alinhamento pode ser obtido em particular pelo uso doalgoritmo "Needleman-Wunsch" (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443-453) ou Clusta/W (Higgins & Sharp, a package for performing multiplesequence alignment on a microcomputer, 1988, Dec 15:73(1)237-44).

A noção de identidade significa que um ácido aminado com umaposição determinada no polipeptídeo de referência é idêntico a um ácidoaminado correspondente no polipeptídeo variante que foi objeto de umalinhamento em relação ao polipeptídeo de referência.

O fato da seqüência do polipeptídeo de referência ser n% idênticaà seqüência do polipeptídeo variante significa que n% das posições doalinhamento global ótimo entre as duas seqüências consistem em ácidosaminados idênticos.

A expressão "propriedades imunogênicas de um polipeptídeo"significa que o polipeptídeo é capaz de provocar, sozinho ou em associaçãocom um adjuvante da imunidade ou uma molécula portadora se for preciso,uma reação imunológica, em particular uma resposta imunológica de tipocelular, por exemplo uma resposta de células T CD4+.

Por exemplo, o polipeptídeo variante possui uma seqüênciapolipeptídica de menos de 75 ácidos aminados, de preferência menos de 60ácidos aminados.

A título ilustrativo, os polipeptídeos variantes podem comportarsubstituições conservativas de ácidos aminados na seqüência da histona H2Bde Leishmania ilustrada acima.

Um ou mais ácidos aminados do polipeptídeo de referênciapodem ser substituídos, deletados ou adicionados para formar um polipeptídeovariante que conserva pelo menos 50% de similaridade, de preferência pelomenos 80% de similaridade com o polipeptídeo de referência, e o referidopolipeptídeo variante conserva as propriedades imunogênicas do polipeptídeode referência.

Por oposição à noção de identidade, a noção de similaridadese refere a ácidos aminados idênticos, e ácido aminados diferentes masque dão origem a um polipeptídeo que conserva as propriedadesimunogênicas do polipeptídeo de referência; ou apenas esses ácidosaminados diferentes.

O fato da seqüência do polipeptídeo de referência ser n% similarà seqüência do polipeptídeo variante significa que n% das posições doalinhamento global ótimo entre as duas seqüências consistem em ácidosaminados idênticos, e ácidos aminados diferentes cuja presença nopolipeptídeo não modifica sensivelmente suas propriedades imunogênicas; ouapenas esses ácidos aminados diferentes.

Em particular, as substituições no polipeptídeo são substituiçõesconservativas.

Uma substituição conservativa é qualquer substituição que possuium escore positivo na matriz de substituição Blosum62, "blosum62 substitutionmatrix" (Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-10919).

Outro modo de realização das variantes polipeptídicas utiliza apreparação de peptídeos da proteína histona H2B considerada, peptídeosesses que possuem por exemplo seqüências peptídicas que comportam de 6 a30, por exemplo de 6 a 20 ou de 6 a 15 ácidos aminados.escolhidas a partir daseqüência N-terminal da proteína histona.

Os peptídeos podem ser usados em misturas, inclusive em formade mixotopos. As misturas peptídicas compreendem por exemplo pelo menos 2ou pelo menos 5 seqüências peptídicas diferentes entre si e, ao contrário, quepossuem ácidos aminados consecutivos em comum.

Os polipeptídeos (incluindo os peptídeos) da presente invençãosão preparados por quaisquer métodos conhecidos do técnico no assunto, porexemplo por síntese química, ou expressão em um sistema celular, emparticular bacteriano, ou in vitro em um sistema "cell free".

O termo "adjuvante" significa toda substância ou composto capazde promover ou de aumentar a resposta imunologica contra um princípio ativodeterminado em um mamífero, por comparação, com a resposta imunologicaobtida nessas obtida nas mesmas condições quando se administra o princípioativo sozinho.

Em um exemplo específico de realização da presente invenção, oadjuvante favorece uma resposta imunologica de tipo celular. O adjuvante é porexemplo o CpG ou qualquer outro adjuvante autorizado em um uso medicinalno homem ou no animal. A concentração de CpG utilizada para a vacinaçãodos camundongos é de 1 [xg/pl e a quantidade injetada é de 50 |xg.

Em um exemplo específico, a composição imunogênica de acordocom a presente invenção compreende ainda pelo menos outro antígeno deLeishmania que possui propriedades imunogênicas para desencadear e/oufavorecer uma resposta imunologica de tipo B e/ou T em um hospedeirohumano ou animal.

A composição imunogênica de acordo com a presente invençãopode compreender ainda pelo menos um polipeptídeo que consiste em umfragmento de pelo menos uma proteína histona adicional de Leishmania.

O referido fragmento de uma proteína histona é escolhido emparticular entre as proteínas histona H2A, H3 e H4. A proteína histona é porexemplo característica de L. Major, L. Infantum, L Donovani, L. Tropica, L.Enrietti. De modo geral, a proteína Histona pode ser característica de umaespécie escolhida na totalidade do gênero Leishmania.

O referido fragmento pode por exemplo compreender toda ouparte da região N-terminal da referida proteína histona. O referido fragmentopossui por exemplo uma seqüência polipetídica de menos de 65 ácidosaminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados.

Em um exemplo específico, o comprimento da seqüência doreferido fragmento representa 10 a 45% do comprimento da proteína histona.

A composição imunogênica de acordo com a presente invençãopode compreender alternativamente pelo menos uma proteína histona inteirade Leishmania, em associação com o polipeptídeo antigênico da histona H2Bdescrito acima.

A referida pelo menos uma proteína histona inteira é escolhida emparticular entre H2A, H3 e H4. Ela pode ser característica de L. Major, L.Infantum, L Donovani, L Tropica, L Enrietti. De modo geral, a referida pelomenos uma proteína histona inteira pode ser característica de uma espécieescolhida na totalidade do gênero Leishmania.

A referida composição imunogênica é injetada tal qual, ou com umveículo farmaceuticamente aceitável. A composição imunogênica de acordo com apresente invenção pode portanto compreender ainda um veículofarmaceuticamente aceitável que possa ser administrado a um hospedeiro humanoou animal. Um veículo farmaceuticamente aceitável poderá ser facilmente escolhidopelo técnico no assunto entre a água, substâncias polares tais como o etileno glicol,o polietileno glicol, ou o propileno glicol, bem como substâncias não polares.

De acordo com um modo de realização particular da presenteinvenção, a composição imunogênica é capaz de induzir uma respostaimunológica de tipo celular das células T efetoras, por exemplo as célulasCD4+, quando é administrada em um ser humano ou em um animal.

As células T comportam células efetoras da imunidade commediação celular(mediada por células) (por exemplo as células T CD4+ ouCD8) bem como células reguladoras ("helper" e supressivas) das respostasimunológicas. O polipeptídeo de acordo com a presente invenção ativapreferencialmente as células efetoras da imunidade com mediação celular.

Na presente invenção, a resposta imunológica de tipo celularpode ser em particular uma resposta imunológica de tipo Th1.

O polipeptídeo ou o polipeptídeo variante está presente, nacomposição de acordo com a presente invenção, em uma concentraçãocompreendida entre 0,01 ng/^l e 5 \ig/\i\, por exemplo entre 0,01 ng/^l e 2ng/jil, ou entre 0,4 e 1 \igl\x\.

A presente invenção se refere também a um polipeptídeo queconsiste em um fragmento da proteína histona H2B de Leishmania, fragmentoesse que compreende toda ou parte da região N-terminal da referida proteínahistona H2B.Em um exemplo específico, o polipeptídeo é característico dahistona H2B de Leishmania major.

O polipeptídeo pode ser característica da proteína histona H2B deL. Infantum, L. Donovani, L Tropica, L. Enrietti. De modo geral, o polipeptídeopode ser característico de uma espécie escolhida entre a totalidade do gêneroLeishmania.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo de acordo com apresente invenção possui uma seqüência polipeptídica de menos de 65 ácidosaminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo de acordo com apresente invenção possui uma seqüência polipeptídica de menos de 65 ácidosaminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados. O polipeptídeo possuinesse caso uma seqüência que compreende pelo menos 6 ácidos aminados daparte N-terminal do antígeno H2B considerado.

O comprimento da seqüência do referido polipeptídeo representapelo menos exemplo 10 a 45% do comprimento da proteína histona.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo de acordo com apresente invenção compreende os 50 primeiros ácidos aminados da proteínahistona H2B, mais particularmente os 46 primeiros ácidos aminados daproteína histona H2B, como representa a figura 1.

A seqüência de ácidos aminados de um polipeptídeo de acordocom a presente invenção é por exemplo a seguinte: MASSRSASRKASNPHKSHRKPKRSWNVYVGRSLKAINAQMSMSHRT.

Em um exemplo específico, o polipeptídeo de acordo com a presenteinvenção é um polipeptídeo purificado ou isolado de seu ambiente de produção.

A presente invenção tem igualmente por objeto um polipeptídeovariante que conserva pelo menos 50% de identidade, de preferência pelomenos 80% de identidade com o polipeptídeo de acordo com a presenteinvenção. O referido polipeptídeo variante apresenta uma substituição, umadeleção ou uma adição, de pelo menos um ácido aminado, em relação àseqüência do referido polipeptídeo e conserva as propriedades imunogênicasdo referido polipeptídeo.

O polipeptídeo variante possui uma seqüência polipeptídica demenos de 75 ácidos aminados, de preferência menos de 60 ácidos aminados.

A título ilustrativo, os polipeptídeos variantes podem comportarsubstituições conservativas de ácidos aminados na seqüência da histona H2Bde Leishmania ilustrada acima.

Outro modo de realização das variantes polipeptídicas utiliza apreparação de peptídeos da proteína histona H2B considerada, peptídeosesses que possuem por exemplo seqüências peptídicas que comportam de 6 a30, por exemplo de 6 a 20 ou de 6 a 15 ácidos aminados, escolhidas a partir daseqüência N-terminal da proteína histona.

Os peptídeos podem ser utilizados em misturas, inclusive naforma de mixotopos. As misturas peptídicas compreendem por exemplo pelomenos 2 ou pelo menos 5 seqüências peptídicas diferentes entre si ou, aocontrário, que possuem ácidos aminados consecutivos em comum.

Os polipeptídeos (incluindo os peptídeos) da presente invençãosão preparados por quaisquer métodos conhecidos do técnico no assunto, porexemplo, por síntese química, ou expressão em um sistema celular, emparticular bacteriano, ou in vitro em um sistema "cell free".

A presente invenção se refere ainda a uma molécula de ácidonucléico que codifica o polipeptídeo ou o polipeptídeo variante de acordo com apresente invenção.

A seqüência nucleotídica da referida molécula de ácido nucléicopode ser a seguinte ou uma parte desta seqüência ATG GCC TCT TCT CGCTCT GCT TCC CGC AAG GCT TCC AAC CCG CAC AAG TGC CAC CGCAAG CCG AAG CGC TCG TGG AAC GTG TAC GTG GGC CGC TCG CTGAAG GCG ATC AAC GCC CAG ATG TCG ATG TCG CAC CGC ACG.

A presente invenção trata também de uma vacina que permiteobter uma proteção contra uma infecção por Leishmania.

O princípio ativo da referida vacina compreende o polipeptídeo, opolipeptídeo variante ou a molécula de ácido nucléico de acordo com apresente invenção. Em um exemplo específico, a vacina compreende ainda umadjuvante que estimula a resposta imunológica quando é administrada em umhospedeiro humano ou animal, e de modo geral, a referida vacina é preparadaa partir de uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção,descrita acima.

O termo "vacina" significa uma preparação antigênica que permiterealizar a prevenção de infecções microbianas por vacinação de um hospedeiro. Avacina de acordo com a presente invenção pode ser alternativamente preparadapara conduzir a uma atividade terapêutica contra a infecção.

O adjuvante favorece por exemplo uma resposta imunológica detipo celular e no caso da presente invenção pode ser o CpG.

A referida vacina pode ser administrada, por exemplo, injetadacomo tal, ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículofarmaceuticamente aceitável poderá ser facilmente escolhido pelo técnico noassunto entre a água, substâncias polares tais como o etileno glicol, opolietileno glicol, ou o propileno glicol, bem como as substâncias não polares.

No exemplo específico, a vacina compreende pelo menos um outroantígeno de Leishmania adicionado como princípio ativo, e o referido antígenopossui propriedades imunogênicas para desencadear e/ou favorecer umaresposta imunológica, de tipo B e/ou T em um hospedeiro humano ou animal.

A vacina pode compreender ainda pelo menos um polipeptídeo queconsiste em um fragmento de pelo menos uma proteína histona diferente deH2B de Leishmania ou uma molécula de ácido nucléico que codifica para oreferido ou os referidos polipeptídeo(s), ou pode compreender ainda pelo menosuma proteína histona inteira de Leishmania, em associação com o polipeptídeoantigênico da histona H2B descrito acima, ou uma molécula de ácido nucléicoque codifica para a referida ou as referidas proteína(s) histona(s) inteira(s).

O fragmento de uma proteína histona é escolhido em particularentre as proteínas histonas H2A, H3 e H4. De modo geral, a referida pelomenos uma proteína histona pode ser característica de uma espécie escolhidana totalidade do gênero Leishmania. A referida pelo menos uma proteínahistona é por exemplo característica de L Major, L. infantum, L. Donovani, L.Tropica, L. Enríetti.

O referido fragmento pode por exemplo compreender toda ouparte da região N-terminal da referida proteína histona. O referido fragmentotem por exemplo uma seqüência polipeptídica de menos de 65 ácidosaminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados.

Em um exemplo específico, o comprimento da seqüência doreferido fragmento representa 10 a 45% do comprimento da proteína histona.

A vacina de acordo com a presente invenção pode ser utilizadapara prevenir ou tratar uma infecção por Leishmania major quando éadministrada em um ser humano ou em um animal.

A vacina de acordo com a presente invenção é capaz de induziruma resposta imunológica de tipo celular das células T efetoras, por exemplo ascélulas CD4+ quando ela é administrada em um ser humano ou em um animal.

As células T comportam células efetoras da imunidade commediação celular(mediada por células) (por exemplo as células T CD4 ou CD8)bem como células reguladoras ("helper" e supressivas) das respostasimunológicas. O polipeptídeo de acordo com a presente invenção ativapreferencialmente as células efetoras da imunidade com mediação celular.Essa resposta imunológica de tipo celular pode ser em particularuma resposta imunológica de tipo Th1.

Sabe-se que o CpG é capaz de ativar os monócitos, osmacrófagos e as células dendríticas. Assim, o CpG injetado ao mesmotempo que um antígeno pode orientar a resposta imune específica para otipo Th1.

As vias de administração da vacina de acordo com a presenteinvenção são diversas e compreendem as vias intravenosa, oral,transdérmica e nasal; entretanto as vias intramuscular e subcutânea são asmais usuais.

O princípio ativo da vacina de acordo com a presente invençãoestá presente em uma quantidade suficiente. A expressão "quantidadesuficiente" significa uma quantidade ou uma concentração de princípio ativocapaz de gerar uma proteção imunológica contra as Leishmanioses.

Eventualmente, as diretrizes para a vacinação podem prescrever aadministração repetida de doses de vacina.

O polipeptídeo, ou o polipeptídeo variante ou a molécula de ácidonucléico está presente na vacina, de acordo com a presente invenção, em umaconcentração compreendida entre 0,01 [ig/\i\ e 5 jag/^il, por exemplo entre 0,01ng/ul e 2 |xg/nl, ou entre 0,4 ng/jxl e 1 ng/y.\.

A presente invenção trata finalmente de um vetor de expressãocapaz de expressar o polipeptídeo ou o polipeptídeo variante de acordo com apresente invenção, que compreende uma molécula de ácido nucléico deacordo com a presente invenção.

O termo "vetor de expressão" significa um meio pelo qual osácidos nucléicos, em particular do DNA, do DNA complementar, do RNA ousua variante, são introduzidos em uma célula, particularmente uma célulaprocariote, para expressar ou produzir uma proteína determinada.Com a finalidade de expressar uma certa proteína ou um certopolipeptídeo, o vetor de expressão pode conter pelo menos um promotor, pelomenos um operador, pelo menos um códon de terminação, bem comoquaisquer seqüências necessárias a uma transcrição eficaz e a uma traduçãodos ácidos nucléicos a partir do vetor. A totalidade desses elementos éconhecida do técnico no assunto.

A presente invenção tem também por objeto células hospedeiras,por exemplo procariotes, em particular bacterianas, transformadas outransfectadas por um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeoque codifica para o polipeptídeo de acordo com a presente invenção, emcondições que permitem sua expressão.

A presente invenção tem também por objeto um plasmídeo pET-CH2B que contém a seqüência da parte carbóxi-terminal da proteína H2B,depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM) sobo n° I-3362, em 24 de fevereiro de 2005.

A presente invenção tem também por objeto um plasmídeo pET-NH2B que contém a seqüência da parte amino-terminal divergente da proteínaH2B, depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos(CNCM) sob o n° I-3363, em 24 de fevereiro de 2005.

A presente invenção tem também por objeto um plasmídeo pET-H2Bque contém a seqüência da proteína H2B, depositado na Coleção Nacional deCulturas de Microorganismos (CNCM) sob o n° 1-3361, em 24 de fevereiro de 2005.

Legenda das Figuras

Figura 1: A seqüência nucleotídica e protéica da histona H2B deL. major. As seqüências identificadas pelas referências H2B1 P-ND up, H2B2-X-S rev, H3B P-Nd up e H3B P-Xh rev devem corresponder aos iniciadores deamplificação das duas partes h2bdAC85(1-138pb) (N-terminal) eh2bdAN46(139-333pb) (C-terminal) da proteína.Figura 2: Análise da expressão e da purificação das proteínashistonas recombinantes H2BAC65 (A), H2BAN46 (B) e H2B (C) de L major sobregel de poliacrilamida a 18% após coloração com o corante Commassie blue.

Poço 1: extrato bruto de bactérias BL21 transformadas pelosplasmídeos recombinantes respectivos e não induzidos com IPTG.

Poço 2: extrato bruto de bactérias BL21 transformadas pelosplasmídeos recombinantes respectivos e induzidos com IPTG.

Poço 3: proteínas histonas recombinantes purificadas em colunade níquel (H2B, H2BAC65 e H2BAN46 de L. major).

Poços PM: marcadores de pesos moleculares.

Figura 3: Análse por imunoblot da reatividade dos anticorpospoliclonais anti-H2B de coelho diante das proteínas histonas recombinantesH2B, H2BAC65 e H2BAN46 de L. major após purificação em coluna de Níquel.

Poço 1: Extrato bruto de bactérias BL21 transformadas pelos1plasmídeos recombinantes respectivos e não induzidos com IPTG.

Poços 2, 3, 4: Proteínas histonas recombinantes purificadas emcoluna de Níquel (H2B, H2BAC65 e H2BAN46 de L major).

Figura 4: Representação gráfica da evolução do diâmetro daslesões nos camundongos BALB/c de controle (PBS) ou imunizados com H2B(H2B-Cpg) ou apenas na parte amino terminal de H2B (H2BDC65-CpG) empresença de 28 ng de CpG/injeção, utilizado como adjuvante. Os camundongosforam infectados, 30 dias após o reforço, por 105 promastigotos de L. major. Osvalores representam a média das lesões expressas em mm +/- o desvio padrão.

Figura 5: Determinação da média do número de parasitas porgânglio pela técnica de diluições limite nos diferentes lotes dos camundongosimunizados duas vezes por via subcutânea, no coxim plantar por H2B+CpG,H2BAC65+CpG e H2BAN46+CpG. A quantificação foi realizada 8 semanasapós o desafio por 106 promastigotos de L. major. Os resultados estãoexpressos pela média do número de parasitas por gânglio da diluição maisforte na qual pelo menos um promastigoto de L. major é viável.

Figura 6: Representação gráfica da evolução das médias dosdiâmetros das lesões (mm) nos camundongos BALB/c vacinados ou não eapós um desafio por L. major à razão de 105 (A) ou 106 (B) promastigotosmetacíclicos.

T+5 ou 6: grupos de controle (PBS) após desafio com 105 (5) ou106 (parasitas).

N+5 ou 6: Camundongos que receberam a região amino terminalde H2B

C+5 ou 6: Camundongos que receberam a região carbóxi terminalde H2B

CpG+5 ou 6: Camundongos que receberam apenas o adjuvante (CpG).

Os valores representam a média das lesões expressas em m +/- odesvio-padrão.

Figura 7: Determinação da carga parasitária pela técnica dediluições limite nos diferentes lotes dos camundongos imunizados três vezespor via subcutânea, no coxim plantar por H2BAN46+CpG e H2BAC65+CpGbem como os controles CpG. A quantificação foi realizada 10 semanas após odesafio por 105 ou 106 promastigotos de L. major. Os resultados estãoexpressos como na figura 5.

Exemplos

Equipamento e Métodos

Parasitas e Condições de Cultura

A linhagem parasitária MHOM/TN/94/GLC94 (GLC94) isolada deuma lesão humana de leishmaniose cutânea zoonótica (LCZ) foi utilizada nopresente invenção trabalho (Louzir et coll, 1998). Esse isolado pertence àespécie L. major, zimodemo MON25 (Kebaier et coll, 2001). Os parasitas foramcultivados em meio NNN a 26°C e progressivamente transferidas para um meioRPMI (Sigma, St Louis, MO) contendo 2mM de L-Glutamina, 100U/ml depenicilina, 1000 pg/ml de estreptomicina e 10% de Soro de Bezerro Fetalinativado (meio completo). Os promastigotos, tomados na fase logarítmica decrescimento, são ajustados a 106 parasitas/ml em um volume constante demeio completo e incubados a seguir a 26°C. A fase estacionaria decrescimento é atingida após 4 a 6 dias de cultura com densidades de parasitasque variam de 3.107 a 8.107 parasitas/ml. Os promastigotos metacíliclicos sãopurificados a seguir em um gradiente de Ficoll 5%-20%, lavados, contados einjetados nos camundongos.

Expressão e purificação das Diferentes Proteínas Recombinantes nasBactérias E. coli BL21

As seqüências codificadoras para a proteína histona H2B inteira(339 pb), a parte temrinal (1-46aa) divergente H2BAC65 (138pb) e a partecarbóxi terminal (47-111aa) conservada H2BAN46 (198pb) foram clonadas novetor de expressão bacteriano pET-22b (Novagen) (figura 1). As bactérias E.coli contendo os plasmídeos recombinantes (pET-22b-H2B, pET- H2BAC65 epET- H2BAN460 foram cultivadas no meio LB e a seguir a síntese da proteínarecombinante foi induzida em presença de 1 mM de isopropil-1-tio-p-D-galactopiranosido (IPTG) durante 4 horas. As proteínas recombinantes forampurificadas por cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel (Ni2+)(Amersham-Pharmacia). A pureza das proteínas produzidas foi verificada porSDS-PAGE (figura 2).

O plasmídeo pET-CH2B contendo a seqüência da parte carbóxi-terminal da proteína H2B foi depositada na Coleção Nacional de Culturas deMicroorganismos (CNCM), em 24 de fevereiro de 2005 sob o n° I-3362.

Descrição do pET-CH2B: O plasmídeo pET-CH2B foi obtido porclonagem do plasmídeo pET-22b+ (Novagen) da seqüência de ADN complementarque codifica para a proteína histona H2B truncada dos 46 primeiros ácidosaminados (H2BAN46) de Leishmania major. O gene H2BAN46 foi clonado nos sítiosde restrição Ndel e Xhol de pET-22b+. Bactérias recombinantes E. coli XL1-blueforam transformadas com pET-CH2B. Elas são resistentes à tetraciclina e àampicilina. Os genes de resistência à tetraciclina e à ampicilina são portados pelasbactérias XL1-blue e pelo plasmídeo pET-22+ recombinante.

O plasmídeo pET-NH2B contendo a seqüência da parte amino-terminal divergente da proteína H2B foi depositado na Coleção Nacional de Culturasde Microorganismos (CNCM), em 24 de fevereiro de 2005 sob o n° I-3363.

Descrição do pET-NH2B: o plasmídeo pET-HN2B foi obtido porclonagem no plasmídeo pET-22b+ (Novagen), da seqüência de DNAcomplementar que codifica para a proteína histona H2B truncada dos 65últimos ácidos aminados (H2BAC65) de Leishmania major.

O gene H2BAC65 foi clonado nos sítios de restrição Ndel e Xhol.

Bactérias recombinantes E. coli XL1-blue foram transformadas com pET-NH2B.Elas são resistentes à tetraciclina e à ampicilina. Os genes de resistência àtetraciclina e à ampicilina são portados pelas bactérias XL1-blue e peloplasmídeo pET-22+ recombinante.

O plasmídeo pET-H2B contendo a seqüência da proteína H2B foidepositado na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM), em24 de fevereiro de 2005 sob o n° 1-3361.

Descrição do pET-H2B: o plasmídeo pET-H2B foi obtido porclonagem no plasmídeo pET-22b+ (Novagen), da seqüência de DNAcomplementar que codifica para a proteína histona H2B inteira de Leishmaniamajor. O gene H2B foi clonado nos sítios de restrição Ndel e Xhol.

Bactérias recombinantes E. coli XL1-blue foram transformadascom pET-H2B. Elas são resistentes à tetraciclina e à ampicilina. Os genes deresistência à tetraciclina e à ampicilina são portados pelas bactérias XL1-blue epelo plasmídeo pET-22+ recombinante.

O plasmídeo pET-H2B é também designado pET-22b-H2B notexto a seguir.

O plasmídeo pET-CH2B é também designado pET-H2BAN46 notexto a seguir.

O plasmídeo pET-NH2B é também designado pET-H2BAC65 notexto a seguir.

As condições de cultura das bactérias transformadas são asseguintes:

Meio de Cultura Preconizado

As bactérias recombinantes são cultivadas em meio de culturalíquido ou em meio de cultura sólido.

O meio de cultura líquido, Luria Broth (LB), é composto de: 1%(peso/volume) de Bactotriptona, 0,5% (p/v) de extratos de levedura e de 1%(p/v) de NaCI. O pH do meio deve ser regulado em 7. Esse meio é preconizadopara a multiplicação dos plasmídeos pET-22b+ que contêm o gene H2BAC65(ou que contêm o gene H2BAN46 ou o gene H2B).

O meio de cultura sólido, Luria Broth Agar (LB-Agar) é constituídode 1% (peso/volume) de Bactotriptona, 0,5% (p/v) de extratos de levedura, de1% (p/v) de NaCI e de 1,5% (p/v) de ágar. Esse meio é essencialmentepreconizado nas culturas realizadas a partir de bactérias recombinantescongeladas a -0,80°C.

Esses dois meios de cultura são esterilizados a 120°C durante 20minutos logo depois de sua preparação.

Condições de Inoculação

As bactérias recombinantes congeladas a -80°C sãoprimeiramente espalhadas em uma caixa contendo um meio de cultura sólidaLB-Ágar suplementado com 15 (xg/ml de tetraciclina e com 50 jag/ml deampicilina durante 18 horas a 37°C. A seguir, uma coluna isolada é coletada eincubada em 5 ml de LB com adição dos mesmos antibióticos. A cultura érealizada durante 18 horas a 37°C.

Incubação (temperatura, atmosfera, agitação, iluminação)

A temperatura de cultura é sempre realizada a 37°C sob umaagitação de 200 rpm (aparelho Sanyo Orbital Incubation). A cultura é realizadasob temperatura ambiente e iluminação natural.

Protocolo de Vacinação e Desafio dos Camundongos

Foram realizados dois protocolos experimentais. Em um primeiroprotocolo, os camundongos foram injetados duas vezes com 15 dias deintervalo com diferentes preparações vacinais (tabela 1). O segundo protocolofoi utilizado para a confirmação e a otimização de certos resultados (ver osdetalhes na tabela 2).

Todas as injeções foram realizadas por via subcutânea, no coximplantar da pata direita traseira em um volume final de 50 |_tl por injeção. Quatrosemanas depois do último reforço, os camundongos receberam uma injeçãodos parasitas L. major (promastigotes metacíclicos) no coxim plantar da patadireita traseira. Foram utilizadas duas quantidades de parasitas, ou seja, 105 e106 parasitas por injeção. O acompanhamento da evolução da doençaexperimental foi feito pela medida semanal do diâmetro da lesão.

Tabela 1

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Tabela 2

Experiência 2. Protocolo Experimental de Imunização e de Desafio dos

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Carga Parasitária

A quantificação dos parasitas foi estimada nos sítios lesionaisutilizando uma variante da técnica das diluições limite (Titus RG, Marchand M.Boon T, Louis JA. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major intissues of infected mice. Parasite Immunol 1985; 7:545-55). Rapidamente, apata infectada foi cortada, homogeneizada em um volume de 5ml de meioRPMI com adição de antibióticos e a seguir uma série de diluições de 1:10 até1:1011 foram feitas em quatro exemplares cada uma em uma placa demitrotitulação (96 poços, Nunc, Roskilde, Dinamarca) contendo meio RPMI comadição de 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina, 2mM de L-glutamina e 10% de soro de bezerro sem complemento. As placas foramincubadas a 28°C durante pelo menos 15 dias. a pesquisa dos parasitas vivosé feita com microscópio invertido. A carga parasitária é expressa pela média donegativo do log da última diluição na qual parasitas móveis foram detectados.

Resultados

Produção e Purificação das Diferentes Proteínas Recombinantes

A proteína H2B inteira (111aa), a parte divergente de H2B situadanos 46 primeiros aa e a parte conservada de H2B localizada entre os ácidosaminados 47 a 111 foram expressas primeiramente por meio do sistema deexpressão procariote pET e purificadas a seguir por cromatografia de afinidadeem uma coluna de níquel (figura 2). O anticorpo policlonal anti-H2B obtido apósimunização de camundongo BALB/C pela proteína recombinante H2B inteirareconhece especificamente, por imunoblot, as proteínas recombinantes H2B,H2BAC65 e H2BAN46 (figura 3).

Avaliação Clínica e Parasitológica do Efeito da Vacinação dosCamundongos BALB/C com a Proteína H2B Inteira ou Mutada após umDesafio Virulento por L. Major

Experiências preliminares feitas com os camundongos BALBcvacinados com a proteína H2B sozinha ou em presença de adjuvante (duasinjeções de 20 mg de proteína +/- 25 jj.g de CpG a 15 dias de intervalo)mostraram que esses camundongos eram capazes, um mês depois da últimaimunização, de produzir grandes quantidades de IFN-y quando suas célulasganglionares (que drenam os sítios de injeção) são re-estimuladas in vitro coma proteína H2B. As quantidades de IL-10 ou IL-4 são muito fracas e nãodetectáveis. Esses resultados sugerem que a proteína H2B tem a capacidadede induzir, nos camundongos BALB/c, uma resposta Th1 específica.

A capacidade das diferentes preparações vacinais de induzir umaproteção no modelo murídeo da leishmaniose experimental foi avaliada noscamundongos sensíveis BALB/c por meio de experiências diferentes ecomplementares.

Experiência 1

Grupos de camundongos BALB/c (4 camundongos por grupo),fêmeas com 6 a 8 semanas de idade, foram injetadas duas vezes com 15 diasde intervalo com diferentes preparações vacinais (tabela 1). As proteínasrecombinantes testadas foram adjuvadas com CpG, ou então com um controlenegativo do CpG, o não CpG (nCpG). O CpG é um oligodexoinucleotídeo deDNa não metilado que possui um motivo particular de CpG. Foi claramentedemostrado na literatura que o adjvante CpG é capaz de ativar os monócitos,os macrófagos e as células dendríticas. Assim, o CpG injectado ao mesmotempo que um antígeno pode orientar a resposta imune específica para o tipoTh1 (para um exame detalhado, ver Klinman et coll, 2004).

Duas imunizações foram portanto realizadas por via subcutâneano coxim plantar da pata direita traseira. Um mês depois, os diferentes gruposde camundongos BALB/c foram infectados com 2*105 promastigotosmetacíclicos da linhagem parasitária virulenta de L. major (GLC94) no coximplantar da pata esquerda traseira.

O resultado da evolução da lesão em cada lote de camundongosimunizados e infectados foi expresso pela média do tamanho das lesõesobtidas nos camundongos do mesmo grupo. Após um acompanhamento clínicode oito semanas, apenas dois lotes de camundongos mostraram umadiminuição muito significativa das lesões experimentais: trata-se doscamundongos imunizados com a proteína H2B inteira em presença de CpG(H2B+CpG) e dos camundongos imunizados com a parte amino-terminal deH2B em presença de CpG (H2BAC65+CpG). As diferenças foram muitosignificativas com todos os outros grupos, incluindo o grupo de camundongosde controle (p<0,001 a partir da semana 5) (figura 4). É muito interessante5salientar que os camundongos imunizados com parte amino-terminal de H2Bem presença de CpG eram mais resistente que os imunizados, nas mesmascondições, com a proteína inteira (p<0,05 a partir da semana 5) quando foraminfectados a seguir com L major. Por outro lado, todos os outros grupo sdesenvolveram uma doença similar experimental similar à que foi observadanos camundongos de controle (infectados com PBS),

Concluindo, os resultados obtidos mostram que a parte NH2-terminal da proteína H2B e a proteína H2B inteira em presença do adjuvanteCpG eram capazes de induzir um efeito protetor nos camundongos BALB/capós um desafio virulento por L. major. Além disso, a comparação das curvasde evolução de lesões entre esses dois lotes de camundongos mostra umamelhor resistência (estatisticamente significativa) dos camundongos vacinadoscom H2BAC65+CpG em relação aos camundongos vacinados com H2B+CpG.

Avaliação da Carga Parasitária

A determinação da carga parasitária no gânglio popliteal quedrena a lesão representa um fator determinante na avaliação da vacina anti-leishmaniana (Kébaier et al; 2002, "Heterogeneity of wild Leishmania majorisolates in experimental murine pathogenicity and specif immune response",Infect. Immun. 2001, Aug, 69(8): 49 H2BAC65+CpG 06-15). A carga parasitáriafoi avaliada (8 semanas após a infecção experimental) apenas dos grupos decamundongos a seguir:- Camundongos de controle (PBS)

- Camundongos vacinados com H2B-CpG

- Camundongos vacinados com H2BAC65+CpG

- Camundongos vacinados com H2BAN46+CpG

Na figura 5 estão representados os resultados da cargaparasitária analisada do gânglio que drena o sítio de injeção dos parasitas.Existe uma correlação muito boa entre a carga parasitária e a severidade daslesões experimentais induzidas nos diferentes tipos de camundongos. Oscamundongos vacinados com H2BAN46, não protegidos, tinham uma cargaparasitária similar à que foi encontrada nos camundongos de controle. Emcompensação, os dois grupos de camundongos que receberam H2B ou a parteamino-terminal (H2BAC65) apresentaram uma carga parasitária muitonitidamente inferior à dos grupos de controle (100 a 1000 vezes inferior). Éinteressante sublinhar que os camundongos imunizados com a parte amino-terminal de B2B tinham uma carga parasitária média pelo menos 10 vezesinferior à que foi encontrada nos camundongos imunizados com a proteínainteira (H2B). Esses resultados confirmam a superioridade da parte divergente(amino-terminal) em relação à proteína H2B inteira em sua capacidade deconferir uma proteção dos camundongos sensíveis BALB/c contra um desafiovirulento por L major.

Experiência 2

Com a finalidade de confirmar os resultados utilizando emparticular 10 vezes mais parasitas para o desafio, os inventores seinteressaram pelas proteínas truncadas de H2B (H2BAC65 e H2BAN46)utilizando uma concentração mais elevada de CpG (50|ig/injeção) e trêsimunizações com 21 dias de intervalo. Além disso, dois grupos de controleforam utilizados (um grupo recebeu penas CpG e o outro apenas o tampãoPBS). Um mês depois da última dose de vacina, os camundongos foraminfectados com duas doses de parasitas (ou seja, 105 ou 106 parasitas(promastigotes metacíclicas)/injeção). O protocolo experimental está detalhadona tabela 2.

As figuras 6 e 7 mostram claramente que apenas oscamundongos imunizados com a parte divergente da proteína H2B (H2BAC65)resistiam à infecção experimental por L. major mesmo após o uso de 106promastigotes metacíclicos para o desafio. Existe uma correlação perfeita entrea resistência clínica e a carga parasitária realizada no fim do protocolo (10semanas depois da infecção).

Esses resultados confirmam os resultados obtidos com a primeiraexperiência e sugerem que o segundo protocolo de imunização confere melhorproteção aos camundongos BALB/c contra a infecção por L. major.

Discussão

De acordo com os números da Organização Mundial de Saúde(OMS), as leishmanioses ameaçam em 88 países, 350 milhões de pessoas queestão expostas aos ricos de picadas de flebotomas, insetos vetores, e estima-se em 12 milhões o número de indivíduos afetados. Em sua forma mais grave,essa doença mata. O fato da maior parte dos indivíduos que desenvolveramuma leishmaniose ou simplesmente uma infecção assintomática, resistirem àreinfecção, justifica as pesquisas para o desenvolvimento de vacinas.

Entretanto, dois problemas principais persistem: o melhor conhecimento danatureza precisa dos mecanismos efetores da resistência bem como anatureza dos antígenos parasitários e o adjuvante a ser utilizado. Não existeatualmente uma vacina para uso humano. As vacinas de primeira geração, asúnicas que foram testadas no homem, mostraram sua ineficácia (Sharifi et coll,1998; Khalil et coll, 2000; De Luca e coll, 2001; Armijos et coll, 2004).

As experiências relatadas aqui permitem identificar e avaliarnovas vacinas candidatos contra as leishmanioses.A proteína histona H2B L infantum foi inicialmente selecionadaem laboratório como proteína parasitária de baixo peso molecular capaz deinduzir uma resposta TH1 no homem. Dados mais recentes sugeriram o papeldessa proteína como candidato à vacina (Melby, 2000; Probst et coll, 2001;Iborra et coll, 2004).

Os trabalhos descritos aqui repousam na análise comparada daimunogenicidade e do papel protetor das duas regiões (divergente econservada) da proteína recombinante H2B de Leishmania bem como daproteína inteira. Os resultados mostram claramente que a parte amino-terminal(divergente) de H2B adjuvada com CpG conferiu uma proteção muito boa doscamundongos sensíveis BALBc contra um desafio virulento por L. major. Aocontrário, a parte conservada (carbóxi-terminal), injetada nas mesmascondições, não teve nenhum efeito protetor. É extremamente interessantesublinhar que a proteína H2B inteira conferiu uma proteção intermediária. Oconjunto dos resultados sugere que a parte amino-terminal (divergente) de H2Bpode constituir um bom candidato a vacina contra as leishmanioses.#

Referências

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Wolffe AP. Transcription regulation in the context of chromatinstructure. Essays Biochem. 2001;37:45-57.Listagem de Seqüências

<110> INSTITUT PASTEUR DE PARISINSTITUT PASTEUR DE TUNIS

<120> COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE A REGIÃO N-TERMINAL H2B DE

LEISHMANIA - UTILIZAÇÃO POR INDUÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNITÂRIA

<130> b6259a-AD/YH/KP

<140> Novo pedido de patente Pct<141> 17-03-2006

<150> FR2005/o2725<151> 18-03-2005

<160> 2

<170> patentin version 3.3

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> Natural

<400> 1

Met Ala ser Ser Arg Ser Ala ser Arg Lys Ala ser Asn Pro His Lys1 5 10 15

ser His Arg Lys Pro Lys Arg ser Trp Asn Vai Tyr vai Gly Arg Ser20 25 30

Leu Lys Ala lie Asn Ala Gln Met Ser Met Ser His Arg Thr Met Lys35 40 45

lie Vai Asn ser Tyr Vai Asn Asp vai Met Glu Arg lie cys .Thr Glu50 55 60

Ala Ala ser lie vai Arg Ala Asn Lys Lys Arg Thr Leu Gly Ala Arg65 70 75 80

Glu Vai Gln Ttir Ala vai Arg ile Vai Leu Pro Ala Glu Leu Ala Lys85 90 95

His Ala Met Ala Glu Gly Thr Lys Ala Vai ser ser Ala ser Ala100 105 110

<210> 2<213> 336<212> DNA<213> Natural

<400> 2

atggcctctt ctcgctctgc ttcccgcaag gcttccaacc cgcacaagtc gcaccgcaag 60

ccgaagcgct cgtggaacgt gtacgtgggc cgctcgctga aggcgatcaa cgcccagatg 120

tcgatgtcgc accgcacgat gaagatcgtg aactcgtacg tgaacgacgt gatggagcgc 180

atctgcaccg aggccgcgtc gattgttcgc gcgaacaaga agcgcacgtt gggtgcgcgc 240gaggtgcaga cggcggtgcg cattgtgctg ccggcggagc tcgcgaagca cgccatggct 300gagggcacga aggccgtgtc gagcgcgtcg gcttga 336

Claims (40)

1. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, no qual compreende: i)um polipeptídeo antigênico que consiste em um fragmento da proteína histonaH2B de Leishmania, fragmento esse que compreende toda ou parte da regiãoN-terminal da referida proteína histona H2B e ii) um adjuvante que estimula aresposta imunológica.

2. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 1, em que o polipeptídeo possui uma seqüência polipeptídica demenos de 65 ácidos aminados, de preferência menos de 50 ácidos aminados.

3. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 1 ou 2, em que o polipeptídeo é característico da histona H2B deLeishmania major.

4. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com uma dasreivindicações 1 ou 2, em que um ou mais ácidos aminados do polipeptídeo,chamado polipeptídeo de referência, são substituídos, deletados, ouadicionados para formar um polipeptídeo variante que conserva pelo menos 50% de identidade, de preferência pelo menos 80% de idêntico com opolipeptídeo de referência, e o polipeptídeo variante conserva as propriedadesinunogênicas do polipeptídeo de referência.

5. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 4, em que o polipeptídeo variante possui uma seqüênciapolipeptídica de menos de 75 ácidos aminados, de preferência menos de 60ácidos aminados.

6. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 5, em que o adjuvante favorece uma respostaimunológica de tipo celular.

7. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 6, em que o adjuvante é o CpG.

8. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 7, que compreende ainda pelo menos um antígeno deLeishmania que possui propriedades imogênicas para desencadear e/ou favoreceruma resposta imunológica de tipo B e/ou T em um hospedeiro humano ou animal.

9. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 8, que compreende ainda pelo menos umpolipeptídeo que consiste em um fragmento de pelo menos uma proteínahistona adicional de Leishmania.

10. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 8, que compreende ainda pelo menos uma proteínahistona inteira de Leishmania.

11. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com areivindicação 9 ou 10, na qual pelo menos uma proteína histona é escolhidaentre H2A, H3 e H4.

12. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com asreivindicações 9, 10 ou 11, em que a referida pelo menos uma proteína histonaé característica de L. Major, L. Infantum, L. Donovani, L. Tropica, L. Enríetti.

13. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 12, que compreende ainda um veículofarmaceuticamente aceitável para ser administrado em um hospedeiro humanoou animal.

14. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser capaz de induziruma resposta imunológica de tipo celular das células T efetoras de imunidadequando é administrada em um ser humano ou animal.

15. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de ser capaz de induzir uma resposta imunológicade tipo Th1.

16. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 15, em que o polipeptídeo ou o polipeptídeo varianteestá presente em uma concentração compreendida entre 0,01 jag/jj.! e 5 ng/|j.l.

17. POLIPEPTÍDEO, que consiste em um fragmento da proteínahistona H2B DE Leishmania, fragmento esse que compreende toda ou parte daregião N-terminal da referida proteína histona H2B.

18. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 17,característico de Leishmania Major.

19. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 17 ou 18,que possui uma seqüência polipeptídica de menos de 65 ácidos aminados, depreferência menos de 50 ácidos aminados.

20. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 17 a 19 que possui a seguinte seqüência de ácidos aminados: MASSRSASRKASNPHKSHRKPKRSWNVYVGRSLKAINAQMSMSHRT.

21. POLIPEPTÍDEO VARIANTE, que conserva pelo menos 50% de identidade ou de similaridade, de preferência pelo menos 80% deidentidade ou de similaridade com o polipeptídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações 17 a 20, polipeptídeo variante esse que apresenta umasubstituição, uma deleção ou uma adição de pelo menos um ácido aminado,em relação à seqüência do referido polipeptídeo e que conserva aspropriedades imunogênicas do referido polipeptídeo.

22. POLIPEPTÍDEO VARIANTE, de acordo com areivindicação 21, que possui menos de 75% ácidos aminados, de preferênciamenos de 60 ácidos aminados.

23. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, que codifica opolipeptídeo ou o polipeptídeo variante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 17 a 22

24. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com areivindicação 23, que possui a seqüência nucleotídica indicada a seguir ou umaparte dessa seqüência: ATG GCC TCT TCT CGC TCT GCT TCC CGC AAGGCT TCC AAC CCG CAC AAG TGC CAC CGC AAG CCG AAG CGC TCGTGG AAC GTG TAC GTG GGC CGC TCG CTG AAG GCG ATC AAC GCCCAG ATG TCG ATG TCG CAC CGC ACG.

25. VACINA, que permite obter uma proteção contra umainfecção por Leishmania, no qual o seu princípio ativo compreende opolipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, opolipeptídeo variante de acordo com a reivindicação 21 ou 22, ou a moléculade ácido nucléico de acordo com a reivindicação 23 ou 24.

26. VACINA, de acordo com a reivindicação 25, quecompreende ainda um adjuvante que estimula a resposta imunológica quandoé administrada em um hospedeiro humano ou animal.

27. VACINA, de acordo com a reivindicação 26, em que oadjuvante favorece uma resposta imunológica de tipo celular.

28. VACINA, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em queo adjvante é o CpG.

29. VACINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, que compreende pelo menos um antígeno de Leishmania adicionadocomo princípio ativo, antígeno esse que possui propriedades imunogênicaspara desencadear e/ou favorecer uma resposta imunológica, de tipo B e/ou Tem um hospedeiro humano ou animal.

30. VACINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, que compreende ainda pelo menos um polipeptídeo que consiste emum fragmento de pelo menos uma proteína histona diferente de H2B deLeishmania ou uma molécula de ácido nucléico que codifica para o referido ouos referidos polipeptídeo(s).

31. VACINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, que compreende ainda pelo menos uma proteína histona inteira deLeishmania ou uma molécula de ácido nucléico que codifica para a referida ouas referidas proteína(s) histona(s) inteira(s).

32. VACINA, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, na quala referida pelo menos uma proteína histona é escolhida entre H2A, H3 e H4.

33. VACINA, de acordo com as reivindicações 30, 31 ou 32, naqual a referida pelo menos uma proteína histona é característica de L. Major, LInfantum, L. Donovani, L. Tropica, L. Enrietti.

34. VACINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 33, para prevenir ou tratar uma infecção por Leishmania Major.

35. VACINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizada pelo fato de ser capaz de induzir uma respostaimunológica de tipo celular das células T efetoras da imunidade quando éadministrada em um ser humano ou em um animal.

36. VACINA, de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de ser capaz de induzir uma resposta imunológica de tipo Th1 quandoé administrada em um ser humano ou em um animal.

37. VETOR DE EXPRESSÃO, capaz de expressar opolipeptídeo ou o polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 17 a 22, que compreende uma molécula de ácido nucléico deacordo com a reivindicação 23 ou 24.

38. PLASMÍDEO, pET-CH2B, que contém a seqüência daparte carbóxi-terminal da proteína H2B depositado na Coleção Nacional deCulturas de Microorganismos (CNCM) sob o n° I-3362.

39. PLASMÍDEO, pET-NH2B, que contém a seqüência daparte amino-terminal divergente da proteína H2B depositado na ColeçãoNacional de Culturas de Microorganismos (CNCM) sob o n° I-3363.

40. PLASMÍDEO, pET-H2B, que contém a seqüência daproteína H2B depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos(CNCM) sobon° 1-3361.