CZ20012360A3

CZ20012360A3 - Farmaceutický prostředek, vakcína, protein a způsob prevence nebo léčby

Info

Publication number: CZ20012360A3
Application number: CZ20012360A
Authority: CZ
Inventors: Alonso Carlos Bedate
Original assignee: C. B. F. Leti S. A.
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2001-10-17
Also published as: EP1141305A1; MXPA01006548A; TR200102655T2; NL300830I2; PT1624063E; BG65569B1; NL300830I1; AU2434200A; HRP20010554A2; ES2273519T3; BE2016C049I2; PT1141305E; DE69931518T2; ATE327332T1; CY2016033I1; LU93259I2; BR9916549A; DE69931518D1; CY1105331T1; ATE429498T1

Description

(57) Anotace:

Předkládané řešení se vztahuje k farmaceutickému prostředku pro prevenci před a léčbu leishmaniózy u lidi nebo zvířat. Farmaceutický prostředek obsahuje proteinovou chiméru Q, která je produktem chimérického genu kódujícího antigenní determinanty čtyř proteinů prvoka Laishmania infantům.

Farmaceutický prostředek, vakcína, protein a způsob prevence nebo léčby

A — V2C»

OBLAST TECHNIKY -jýYEpý'

Předkládaná specifikace se vztahuje k přihlášce vynálezeckého patentu, který se týká chimérického genu tvořeného DNA sekvencemi, které kódují antigenní determinanty čtyř proteinů prvoka L. infantům, a k proteinům kódovaným zmíněným chimérickým genem, které jsou použitelné pro prevenci před nebo léčbu leishmaniózy, zvláště pak psí leishmaniózy. Zjevný účel tohoto spočívá v použití sekvence genu nebo proteinu, který je získán z chimérického genu, pro přípravu farmaceutického prostředku určeného k prevenci před nebo léčbě leishmaniózy, zvláště pak psí leishmaniózy, a který může být zaveden do těla pacienta, například jako vakcína nebo přípravek monoklonální protilátky. Tímto pacientem nemusím být pes, ale může jím být také lidská bytost, která trpí chorobami zahrnujícími imuno-depresi. Aby toho bylo dosaženo, bude produkován chimérický gen, který kóduje protein nazývaný PQ skládající z chimérického produktu pocházejícího z „in vitro“ syntézy chimérického genu konstruovaného „ad hoc“, který obsahuje pět antigenních determinant čtyř různých proteinů. Produkt je sestaven jako vysoce citlivý a specifický pro, například vyvolání ochranných imunitních reakcí proti psí leishmanióze nebo pro přípravu protilátek proti psí leishmanióze.

Tento vynález je užitečný v průmyslu, který se obecně věnuje výrobě farmaceutických výrobků.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Parazitičtí prvoci rodu Leishmania jsou etiologickými činidly, která způsobují leishmaniózy, širokou škálu chorob, které se vyskytují široce po celém světě, a které jsou charakteristické tím, že vykazují širokou pestrost klinických příznaků.

Hlavní formy leishmanióz jsou chorobami zvířat se své přirozenosti a lidé jsou považování za sekundární hostitele.

Druh označovaný jako L. infantům, a který je široce distribuován v celých oblastech Středozemí, je příčinou leishmaniózy vnitřností (LV) u lidí a psů.

V podstatě jsou psy infikovaní prvokem L. infantům hlavním animálním zdrojem tohoto parazita, zvláště během dlouhé inkubační doby před tím, než mohou být pozorovány klinické příznaky.

• ·

Epidemiologické údaje naznačují, že je zde přímá korelace mezi rozšířením psí leishmaniózy a přenosem parazita na Člověka. V tohoto důvodu je rozhodující detekovat chorobu nebo infekci dříve při kampaních, které mají za cíl kontrolovat rozšíření této choroby.

Parazit je přenášen na hostitelského obratlovce jako bičíkovec promastigot prostřednictví kousnutí mouchou z rodu „Phlebotominae“, a paraziti vstupují do buněk jednojaderných fágů, kde se diferencují a reprodukují jako amastigoty uvnitř fágové liposomální struktury.

Infikované buňky se shromažďují v určitých tkáních, hlavně ve slezině, v játrech a lymfatických uzlinách. Je určeno, že okolo 15 milionů lidí je infikováno leishmaniózou, a každý rok se ve světě objeví 500 000 nových klinických případů, hlavně v zaostalých a rozvojových zemích.

V jihozápadních státech Evropy je leishmanióza vnitřností (LV) chorobou zvířat způsobovanou druhy L. infantům, jak bylo zmíněno dříve. Nedávné údaje odvozené z epidemiologických studií naznačují, že je zde alarmující výskyt této infekce.

V Itálii se ohlášené údaje výskytu LV pohybují v rozmezí od 14,4 % do 37 % v závislosti na regionu.

V Portugalsku, zvláště v oblasti okolo Lisabonu, byly nalezeny hodnoty séropozitivů 8,4 % a v oblasti francouzských přímořských Alp byla nalezena různá centra rozšířením, které kolísá mezi 3,2% a 17,1 %.

Ve Španělsku závisí výskyt leishmaniózy na tom, která zóna byla studována. V Katalánsku byla pozorována průměrná hodnota výskytu 9,3 % ačkoliv v některých více zasažených místech bylo nalezeno rozšíření infekce u psů do 18 %.

Na ostrově Mallorca je hodnota výskytu 14 % a ostatní hodnoty, které byly nalezeny, jsou: 2,4 % vMurcii, 8,8 % v Granadě, od 10 do 15 % v Salamance, 5,25 % v provincii Madrid a 14 % v Caceres.

Ačkoliv řada případů LV u lidí způsobených prvokem L. infantům může být považována za relativně nízkou, vysoké procento pacientů s imuno-depresí, kteří byli infikováni Leishmanií, by mohlo souviset s vysokou hladinou této choroby u psů.

Ve skutečnosti v jižní Evropě 50 % dospělých lidí, kteří jsou infikováni leishmaniózou, jsou také pacienti infikovaní virem HIV. Na druhé straně podle těchto údajů spolu-infekce Leishmanie a viru HIV bylo určeno, že hladina infekce (způsobená parazitem) může být o jeden nebo dva řády vyšší než tato hodnota z důvodu existence velkého množství nedetekovaných infekcí.

Běžnou charakteristikou různých typů infekce leishmaniózy je to, že indukuje silné humorální odpovědi u hostitele. Proto diagnostické metody založené na sérologických technikách jsou současně nej rozšířeněji používány.

• · · · · ··· e · · · · ·· • · · ··· ·· • · · · · ·· ·· · · ·· ···

Bylo popsáno, že tyto protilátky jsou detekovány dokonce během asymptomatické fáze choroby u přírodních a experimentální infekcí.

Citlivost a specifičnost těchto metod závisí na typu, zdroji a čistotě použitého antigenů.

Imunologické procesy, které jsou v současnosti komerčně používány, kompletní promastigoty a přípravky více či méně z nich připravené jsou používány jako zdroj protilátky. Tato metoda normálně vede ke křížovým reakcím se sérem pacientů, kteří trpí malomocenstvím, tuberkulózou, africkou trypanosomózou, Chagasovou nemocí, malárií a jinými parazitózami.

Citlivost a specifičnost sérologických metod závisí na typu, zdroji a čistotě použité protilátky.

Během posledních let bylo charakterizováno velké množství protilátek proti leishmanióze, některé z nich mohou být brány v úvahu jako proteiny specifické pro parazita.

Mezi těmito proteiny specifickými pro parazita stojí za zmínku povrchová proteasa GP63, povrchový glykoprotein gp46 a s lipofosfoglykanem asociovaný protein KMP-11.

Další skupina protilátek proti Leishmanii je tvořená evolučně konzervovanými proteiny takovými, jako jsou kinesin, tepelně indukovatelné proteiny, aktin a tubulin.

Jako součást strategie vývoje specifického sérologického diagnostického systému pro psí leishmaniózu byl proveden základní laboratorní projekt s cílem identifikovány protilátky proti L.

infantům za použití prostředků imunodetekčního prohledávání expresní knihovny genů L.infantum a za použiti psího séra s aktivní leishmaniózou vnitřností.

Bylo pozorováno, že většina protilátek izolovaných touto metodou patřila do rodiny proteinů, které byly během evolučního vývoje konzervovány. Identifikace B epitopů těchto protilátek nicméně naznačuje, že ve všech případech byly antigenní determinanty lokalizovány v oblastech, které nebyly dobře konzervovány.

Zvláště kyselé ribozomální proteiny LiP2a a LiP2b jsou rozeznatelné ve více něž 80 % LV séra.

Bylo potvrzeno, že tyto proteiny obsahují pro chorobu specifické antigenní determinanty, a že rekombinantní proteiny LiP2a a LiP2b, z kterých byl odstraněn fragment, by mohly být použity jako specifický nástroj, který by byl schopný rozlišit mezi LV a Chagasovou nemocí.

Bylo také ukázáno, že PO ribozomální protein prvoka L. infantům, který je velmi vysoce konzervován v evolučním měřítku, je rozeznáván velmi vysokým procentem LV psího séra.

Kromě toho antigenní determinanty jsou nalézány exkluzivně na C-konci proteinu, takže řekněme v oblasti, která byla slabě konzervována během evolučního vývoje.

Bylo pozorováno, že v 78 % psího LV séra, jsou také přítomny protilátky proti H2A proteinu, a bylo potvrzeno, že navzdory sekvenční identitě u všech H2A proteinů mezi eukaryotními

organismy, humorální odpověď na tento protein v LV séru je zejména vyvolána determinantami specifickými pro protein H2A Leishmanie.

Antigenní determinanty rozeznávané psím LV sérem jsou nalezeny na obou koncích H2A proteinu.

Zjevným řešením problému, na který je nyní naráženo v tomto stavu techniky, by bylo mít vynález, který by umožnil sestavit syntetický chimérický gen, který obsahuje DNA oblasti kódující antigenní determinanty specifické pro proteiny LiP2a, LiP2b, LiPO a H2A, s výhledem na konstruování proteinu bohatého na antigenní determinanty.

Nicméně tak dalece jak si je přihlašovatel vědom, nyní se zde žádný vynález, který zahrnuje charakteristiky popsané jako ideální, s výhledem na dosažení popsaného cíle, není. Tímto cílem je zkonstruování proteinu bohatého na antigenní determinanty, vycházející z sestaveného chimérického syntetického genu, který zahrnuje DNA oblasti kódující specifické antigenní determinanty pro dříve zmíněné proteiny.

Vakcína proti Leishmanii - parazitičtí prvoci rodu Leishmania jsou zodpovědní za způsobování leishmaniózy, symptomaticky komplikované choroby, která hlavně účinkuje na člověka a zvířata v tropických a subtropických oblastech. Bylo vyhodnoceno, že počet nových případů lidské leishmaniózy útrob, může dosáhnout čísla 500 000, které je minimem několika desítek milionů nakažených lidí. Kromě toho počet kožních leishmanióz a leishmanióz mukokutálních může být v řádu 2 000 000 za rok (Modabber, 1990). Ačkoliv osoby u nichž je riziko, že se nakazí různými typy leishamaniózy, může být odhadnut na přibližně 350 milionů, počet osob s reálnou infekcí může být mnohem vyšší, z důvodu faktu, že zde nejsou jasná určení reálných případů asymptomatických infekcí, a protože existují kryptické infekce. Ve skutečnosti může být leishmanióza považována z globálního pohledu za infekci/chorobu endemické povahy, situovanou mezi 4. a 5. Místem v pořadí parazitických chorob s dopadem širokém světovém měřítku.

Tři hlavní formy leismaniózy mohou být rozlišeny: leishmanióza útrob, kožní a mukokutální, jejichž charakteristiky většinou závisí na lokalizaci parazita, rodech ke kterým patří a na klinických projevech, které způsobuje. Rody distribuované po celé Asii a jistých oblastech v Středozemí vyvolávají přibližně přítomnost kožní formy s lokalizovaným tvořením vředů, které, v mnoha případech, se spontánně hojí. Tyto projevy jsou způsobeny rody L. major a L. tropica. L. aethiopica (Středozemí, Asie, Afrika) také indukuje kožní formu leishmaniózy, ačkoliv její projevy jsou více rozptýlené. V Americe rod L. mexicana způsobuje kožní formu se zobecněnou lokalizaci, které se obvykle spontánně nehojí. Mukokutální forma choroby u lidí je způsobena rodem L. brasiliensis a je charakteristická přítomností kožních postižení v oronasálních a • · • · · · · • · · · ·· ·· faringeáíních oblastech, vyvolávající poškození sliznice. V Americe, Evropě, Africe a Asii je nejfrekventovanější formou leishmaniózy forma postihující útroby způsobovaná rody L. chagasi, L. donovani a L. infantům. Tato forma leishmaniózy je charakteristická klinickými příznaky spojenými s horečkou, anemií a intenzivní hepato/splenomegalií, která je smrtelná, pokud není léčena přiměřeně v pravý čas. V pokročilé formě choroby hostitel není schopen vyvíjet účinnou imunitní odpověď. Všechny tyto formy leishmaniózy jsou také detekovány u psovitých šelem a u některých hlodavců, kteří ve skutečnosti představují hlavní zdroj parazitů. Zdravotní problém vyvolávaný rodem L. infantům v Středozemní pánvi je vážný, protože je zde vysoký výskyt infekce/choroby u psů a bacilonosiČský hmyz je velmi rozšířený. Je spočítáno, že mezi 7 % a 20 % všech canids je infikováno Leishmanií, v některých oblastech Španělska dosahující 30 %, a kde je tento výskyt endemický. Tento fakt vyvolává vážný veterinární problém, který navíc zvyšuje riziko nákazy, hlavně u imunodepresivních osob. V Evropě je okolo 11 milionů psů ohrožených infekcí Leishmanie.

L. infantům, podobně jako zbytek rodů tohoto druhu, má dimorfický biologický cyklus. Prostředními hostiteli je hmyz čeledě Psychodidae, druh Phlebotomus. Ve Středozemní oblasti Evropy bylo demonstrováno, že rody P. arias a P. perniciosus jsou hlavními bacilonosiči, ačkoliv bacilonosiči P. papaíosi, P. longicusois a P. sergenti jsou také přítomni. Pokud je parazit pozřen bacilonosičem společně s krví obratlovce patřícího k obratlovcům, umisťuje se do střev v extracelulární formě, transformuje se do promastigotu a dělí se. Infekční forma migruje směrem k hltanu a k proboscis, odkud se bude přenášet na nového hostitele patřícího k obratlovcům. Promastigoty jsou charakteristické v tom, že mají bičík a prodloužený tvar přibližně 15 až 20 pm délky, se zaobleným zadním koncem a ostrým předním koncem. Jádro je situováno do centra a kinetoplast k přednímu konci. V kultivačním médiu paraziti vykazují jistý stupeň morfologické variability. Po inokulaci promastigotů na kůži hostitele patřícího k obratlovcům záleží vyvolání či nevyvolání infekce na dvou faktorech: existenci vhodné buněčné populace - makrofágů - a jiných buněk fagocytického monojaderného systému, a stabilitě parazita, aby přežil a zmnožil se uvnitř těchto buněk.

Prvním krokem penetrace Leishmanie do makrofágů je přiblížení a ulpění na plazmatické membráně cílové buňky. In vitro studie se zdá naznačují, že se nejedná o přímou chemotaktickou přitažlivost prostimagotů k makrofágům. V prostředí tkáně volné prostimagoty aktivují stav alternativní cestou, vyvolávající tvorbu koncentračního gradientu frakce C5a, který přitahuje makrofágy a jiné zánětlivé buňky směrem k místu inokulace. Jakmile je promastigot jednou uvnitř parazitické vakuoly, lysozomy s ním fúzují a vytváří fagolysozom. U infekcí způsobených jinými mikroorganismy je fagolysozom organelou odpovědnou za lýzi a eliminaci prostřednictvím několika mechanismů takových, jako je produkce toxických radikálů kyslíku oxidativním metabolickým procesem, způsobeným hydrolytickými lysozomálními enzymy, kationtovými proteiny a nízkým pH. Přežití parazita ve fagolysozomu je funkcí jeho schopnosti odolat a vyhnout se zmíněným mechanismům.

Existence imunitní odpovědi proti napadení parazitem Leishmanii, která zahrnuje obě, jak humorální, tak buněčnou, byla objevena v prvních momentech, v kterých byla choroba studována, a byla pozorována v řadě případů. Typ humorální odpovědi závisí na formě leishmaniózy. U kožní formy je humorální odpověď velmi slabá, zatímco u formy napadající útroby je pozorována vysoká odpověď protilátek. U kožních postižení je významná odpověď zprostředkovávaná buňkami a detekovatelná v obou případech, jak in vivo prostředky typu zpožděných testů hypersenzitivity (DTH), tak in vitro prostředky testů lymfoblastické transformace a testů inhibice makrofágové migrace. V těchto případech je koncentrace protilátek séra normálně nižší a přímo vztažená k závažnosti procesu. Jakmile jsou amastigoty jednou uvnitř makrofágů, záleží rozeznání infekce hlavně na imunitních mechanismech zprostředkovávanými buňkami. Buněčná odpověď je podmíněna spojením účinku makrofágů, B-buněk, několika sub-populací T-buněk a různých lymfokinů sekretovaných těmito všemi.

Makrofágy napadené parazitem zpracovávají antigeny Leishmanie a exprimují je na svůj povrch procesem zprostředkovávaným hlavním histokompatibilním komplexem (MHC-II) druhé třídy. Navíc makrofág vypouští IL-1, který působí jako druhý aktivační signál pro T-lymfocyt. U lidí je pro leishmaniózu útrob nebo kala-azar charakteristická slabost nebo absence buněčné odpovědi, obě detekovatelné absencí zpožděné hypercitlivosti (DTH) a metodami buněčné proliferace. Absence proliferace T-buněk je detekována dokonce v přítomnosti mitogenů takových, jako je konkanavelin A nebo íytohemaglutinin, a inhibice produkce IL-2 stimulovanými T-buňkami.

U myší je populace T-lymfocytů (CD4 feno typ) heterogenní a může být rozdělena do přinejmenším dvou sub-populací podle toho jaké lymfokiny tyto populace produkují. Tyto buňky jsou důležité pro vývoj ochranné imunity proti kožní leishmanióze (sub-populace Th-1) a jsou ve stejnou chvíli začleněny do procesu potlačení ochranné imunitní odpovědi (sub-populace Th-2), T-buňky indukované u rezistentních myší C57BL/6 nebo odléčených BALB/c myší jsou převážně typu Th-1, zatímco buňky u neodléčených BALB/c myší jsou typu Th-2. Obecně lymfokiny vypouštěné těmito buňkami upřednostňují vývoj buněčné linie, která je produkuje a má antagonistický účinek na vývoj ostatních sub-populací. Tudíž IL-4 a IL-10 produkované buňkami Th-2 přispívají k rozvinutí infekce tím, že podporují vývoj této linie. Navíc mohou přímo působit na makrofág, nedovolující jeho aktivaci. Nicméně u myších náchylných k infekci Leishamnií nepřítomnost genu, který kóduje IL-4 bylo dosaženo odporujících výsledků. V některých případech bylo pozorováno, že nepřítomnost tohoto cytokinu přesměrovává odpověď a zvyšuje rezistenci k infekci, zatímco u jiných nejsou u myší pozorovány žádné rozdíly v hladině infekce. U geneticky rezistentních myší bylo pozorováno, že absence exprese genů IFN-γ nebo jejich receptorů, CD40 nebo ligandů CD40, zvyšuje náchylnost k infekci. Interakce CD40 a jeho ligandů je nezbytná pro produkci cytokinu IFN-γ nezbytného pro řízení odpovědi proti Th-1. Myši s rezistentní genetickou podstatou, které vytvářejí Th-1 typ odpovědi, se stávají náchylné pokud jsou deficientní v expresi IL-12, který vyvolává Th-2 typ odpovědi. Nedávná data předpokládají, že produkce IL-12 je důležitá pro řízení odpovědi proti Th-1, a že absencí IL-4 může dojít k vyhnutí se vyvolání Th-2 odpovědi.

Je celá řada proteinů prvoka Leishmania, které mají antigenní charakter významně charakterizovaný metodami „Western Blot“. V séru pacientů a psů infikovaných prvokem Leishmanií bylo možné detekovat přítomnost protilátek proti membránovým proteinům takovým, jako jsou gp 63, gp 46, PSA a KPM-11. Navíc několik antigenů, které mají cytoplasmatickou intracelulární lokalizaci, bylo charakterizováno takových, jako jsou: Hsp70; Hsp83; LIP2a; LIP2b; LILIPO; H2A; H3 a protein příbuzný kinesinu K39 rodu L. chagasi. Reaktivita protilátek, které rozeznávaly konzervativní proteiny přítomné v séru psů infikovaných rodem L. infantům, je namířena proti přinejmenším konzervativním oblastem těchto proteinů. Některé membránové proteiny jsou velmi antigenní u přirozených infekcí. Ve věch případech přirozené infekce je velké omezení humorální odpovědi proti proteinům, protože protilátky vyvolané během infekčního procesu rozeznávají velmi omezené oblasti identického. Hladiny IgG normálně odpovídají intenzitě infekce odrážející stupeň a trvání antigenní stimulace, která je podmíněná množství infikujícího parazita. Antigen Leishmanie homologický k typu C kinázových receptorů (LACK) byl nedávno popsán, že vyvolává dřívější odpověď Th-2 typu. U transgenních myší pro LACK antigen a s genetickým pozadím náchylným k infekci vyvolání tolerance k tomuto antigenů chrání proti infekci rodem Leishamania major. Protilátky proti-Leishamnii mohou poškodit promastigoty in vitro za přítomnosti doplňku, podporují fagocytózu a indukují zachování několika částic na povrchu promastigotů a amastigotů.

Patologická reakce se zdá jít paralelně s hustotou makrofágů, které jsou napadené parazitem. U leishmaniózy útrob dochází k distribuci makrofágů obecně difuzním způsobem přes různé tkáně orgánů. Typ zánětu je tvořen důležitou buněčnou infiltrací s převahou lymfocytů a plamatických buněk společně s hyperplazií fagocytických buněk. Zánět doprovází změny ve fyziologii

postižených orgánů, které vytvářejí vážné systémové změny. V některých případech se vyskytuje místní granulační zánět s výskytem granulomu a mikrogranulomu v různých orgánech. Tyto granulomy jsou tvořeny makrofágy a histiocyty (vyvolaným buď parazity nebo ne) obklopenými plasmatickými buňkami a lymfocyty a v některých případech fibroblasty. Tento zánětlivý proces je doprovázen reakcí orgánů s výskytem charakteristických lézí u postižených orgánů. Někteří autoři nalezli sraženiny amyloidní látky v prakticky celých orgánech. Někteří autoři formulovali hypotézu, že poškození způsobované chorobou, se nedá přímo přisoudit etiologii zprostředkovatele, ale podnícené reakci orgánů.

Vakcína proti Leishmanii - silná imunita, která následuje po uzdravení z kožní leishmanie, dala silný impuls vyvinout profýlaktické vakcíny proti této chorobě. Tato imunita je odvozena od indukce T odpovědi, která byla spojená s produkcí zánětových cytokinů, které aktivují makrofágy a ničí parazity. Imunologická paměť v případě infekce je pravděpodobně udržována trvalou přítomností parazita v hostiteli v procesu známém jako průvodní imunita.

První studie týkající se vakcinace proti Leishmanii v dekádě čtyřicátých let používaly živé parazity jako imunogeny. Tyto studie vedly k produkci vakcín, které produkovaly významnou ochranu proti následné opětovné infekci. Nicméně vědomost možnosti, že živé organismy by mohly vyvolat opravdové infekce vedla k tomu, že takovéto vakcinační programy se neprosadily na dlouhou dobu, a naopak, zájem byl zaměřen na vakcíny založené na usmrcených parazitech. Tyto studie zajistily první důkaz možnosti výroby účinných vakcín inokulací parazitů.

Klinické zkoušky, které využily imunizaci s mrtvými promastigoty Leishmanie, také začaly v dekádě čtyřicátých let. Tyto vakcíny vykazují pozoruhodný úspěch, protože byl pozorován jistý stupeň ochrany, který mohl oscilovat mezi 0 a 82 % v závislosti na populaci. Tyto vakcíny měly menší účinek, než vakcíny s živými parazity. Izolace avirulentních klonů rodu L. major, které ochraňují myši proti infekci, také demonstrovala, že oslabená vakcína je možná. Nicméně neznalost mutací, které vedou ke ztrátě virulence a riziko produkce virulentních organismů, které se navrátily do původního stavu, učinily tento typ vakcinace v současnosti neakceptovatelným. Nedávno se podařilo dosáhnout významného pokroku směrem k identifikaci molekulárně definovaných kandidátů vakcín takových, jako jsou gp63, gp46/M2, povrchový antigen příbuzný kantigenu později známému jako PSA-2 a proteiny dp72a gp70-2, LACK protein a Kmpll. Specificky T epitopy přítomné v proteinu gp63 byly identifikovány s tím výsledkem, že pouze některé z nich jsou schopné indukovat T odpověď, obě jak Th-1, tak Th-2. Tyto antigeny indukují významnou ochranu u modelových zvířat, když jsou podávány s podpůrnou látkou. Protein PSA2 druhu Leishmania je schopný ochrany proti infekci způsobené rodem L. major tím, že indukuje • · ·· · ·· ···· • · · · · · · ·· • · · · · · ·· • · · · · ·· ··· ·· · ··*·· ·· · · · ·· ····

Th-I odpověď. Aby byl zhodnocen mechanismus ochrany vyvolaný tímto proteinem, jako vakcíny proti Leishmanii u lidských bytostí, byla studována jeho schopnost vyvolat proliferaci T-buněk u pacientů, kteří trpěli leishmaniózou a byli z ní vyléčeni. Bylo pozorováno, že protein je schopný vyvolat přibližně silnou proliferaci T-buněk u těchto jedinců, ale ne kontrolu s žádnou předchozí historií infekce. Odpověď byla typu Th-1, jak bylo demonstrováno indukcí cytokinového modelu. Podjednotkové vakcíny byly silně zaměřeny na proteinové antigeny, protože tyto jsou jednoduše identifikované, isolované a klonované. Nicméně je nezbytné vzít v úvahu, že ne všechny potenciální vakcínové molekuly musí být proteiny. Ve skutečnosti lipofosfoglykan (LPG) hraje hlavní roli ve vzniku infekce. Vakcinace s LPG může chránit proti infekci rodem Z. major. Přesto existence dogmatu, které prohlašuje, že T-buňky nerozeznávají neproteinové antigeny, molekula LPG se zdá, že je přítomna u T-buněk v Langerhansových buňkách pokožky. Navíc je zde důkaz, který má demonstrovat, že mikrobiální glykolipidy a jiné neproteinové molekuly mohou rozeznávat T-buňky, když jsou přítomny skrze CD-1 cestu. Ačkoliv zde není jasný důkaz, že protein KMP11 asociovaný do LPG indukuje ochrannou odpověď, bylo dokázáno, že proteinová frakce asociovaná s LPG je schopná indukce T odpovědi a IFN-γ, kdežto LPG frakce bez proteinu není.

Je normálně přijímáno, že podjednotkové vakcíny, ačkoliv působí ochranně, pouze indukují krátkodobou imunitu. Tento problém nemusí být důležitý vendemických oblastech, kde jednotlivci mohou být pravidelně inokulováni z důvodu přirozené infekce. Hlavní problém při použití podjednotek může vyplynout z faktu, že zde nemusí být odpověď na jeden antigen u geneticky různorodé populace. Směs antigenů obsahující B a T induktory může překonat tento nedostatek. Bylo nedávno publikováno, že extrakt membránových proteinů prvoka Leishmania infantům, když byl injikován intraperitoneálně, je schopný vyvolat ochranu proti virulentním formám promastigotů tohoto parazita, a že tato ochrana je větší, když proteiny jsou obaleny pozitivně nabitými liposomy. Pomoc a ochranná imunita vyvolaná antigeny rodu Leishmania donovani obalenými v pozitivně nabitých liposomech.

Vakcinace nukleovými kyselinami nesoucími geny, které kódují proteiny Leishmanie, zahrnuje podávání genetického materiálu parazita hostiteli. Tato DNA je pohlcena buňkami a je zavedena do jádra, kde je transkribována a následně translatována v cytoplasmě. Výhodou tohoto typu vakcinace je, že možné řídit imunitní odpověď pomocí prostředků MHC-I nebo MHC-II cesty. Antigeny, které jsou produkovány intracelulárně, jsou upravovány v buňkách a takto vzniklé peptidy jsou umístěny na povrchu buněk v asociaci s MHC-I molekulami. Následkem toho by bylo, že tyto molekuly by zvyšovaly indukci cytotoxických T-buněk. Antigeny produkované

v extraceluíárním prostředí by byly speciálně pohlcovány specializovanými antigen-doručujícími buňkami, upraveny a umístěny na jejich povrch vazbou na MHC-II molekuly, čehož výsledkem by byla indukce a aktivace CD4+ buněk, které vylučují cytokiny, které regulují efektorový mechanismus jiných buněk imunitního systému.

První DNA vektor připravený k podávání jako vakcína obsahoval gp63 gen. Také gen PSA-2 byl zaveden do plasmidu a bylo pozorováno, že vyvolává Th-1 odpověď a indukuje ochranu. Vakcinace s DNA plasmidy, které obsahují Ag-2, indukuje Th-1 odpověď a chrání před infekcí rodem L. major, zatímco Ag-2 ve stimulačně imunitních komplexech vyvolává kombinovanou Th1 a Th-2 odpověď a nechrání navzdory faktu, že IFN-γ je indukován. Rovněž gen kódující LACK protein byl podáván podkožně BALB/c myším v expresním vektoru, který exprimoval protein pod kontrolou cytomegalovirového promotoru, a byla pozorována ochrana proti infekci rodem L. major. Téměř ve všech případech, v kterých byla DNA podávána, byla zvolena intramuskulární cesta, ačkoliv intradermální injikace konkrétní DNA musí být také prozkoumána, protože to vyžaduje menší množství DNA. Jiné imunizační systémy vektory takové, jako jsou Salmonela, BCG nebo Vaccinia virus. Je zajímavé připomenout, že gen gp63 zahrnutý v BCG je schopný indukce ochrany proti rodu Z. major.

Gen, který kóduje protein gp63 byl také zaveden do genu delta araC pod kontrolou rac promotoru v oslabené bakterii Salmonella typhimurium. Ústní podání 1 x 10⁹ kolonií transformované bakterie indukuje T odpověď v rámci obou, Th-1 a cytotoxických buněk, proti mastocytoma buňkám, které exprimují gp63. Protein gp63 ve formě gp63-ISCOMs komplexu indukuje ochranu u myší, která je potvrzena snížením zánětu a potlačením poranění. V séru jsou protilátky typu IgG2a a navíc je možné pozorovat Th-1 odpověď indukcí IL-2, IFN-γ a IL-10. Nebyla pozorována žádná odpověď na DTH. Salmonella typhi Nramp 1 transformovaná gp63 vyvolává Th-1 odpověď s indukcí IL-2 a IFN-γ, a silné rozlišení lézí je detekováno. Protein rodu L. pifanoi, známý jako P-4, indukuje významnou ochranu proti infekci Leishmanií. Nedávné studie u lidí s kožní leihsmaniózou indikují, že tento protein nebo peptidy od něj odvozené jsou schopné vyvolat proliferaci T-buněk. Nedochází k indukci IL-4, zatímco IFN-γ je indukován. Aro-A a Aro-D mutanty bakterie Salmonella typhi transformované IL-2, IFN-γ a TNF-a podávané orálně mohou sloužit jako terapeutické systémy proti infekci rodem L. major. Je zajímavé pozorovat, že u těchto pacientů je větší indukce iNOS. Gen gp63 byl také klonován do Aro-A a Aro-D mutantů a bylo pozorováno, že po orálním podání kódovaný protein je schopný indukovat významnou ochranu proti infekci rodem L. major. Tento stejný protein je schopný ·· « ·· 9 9 99·

9 99 9 9 9 9 9 ·99

9 9 9 9 99 9 99

9 9 99 99 999 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9 99 9 9 9 9 9 999 9 indukovat ochranu, když podáván spojený s několika promotory ve specifických druzích (GID105 a GID106) Salmonely.

Umělý protein pojmenovaný Q a nedávno popsaný naší skupinou se skládá z několika antigenních fragmentů čtyř proteinů prvoka Leishmania infantům (přesněji Lip2a, Lip2b, PO a H2A), který, poté co byl použit jako antigen, bylo prokázáno, že má důležitou hodnotu pro diagnostiku psí leishmaniózy, s 93% citlivostí a 100% specifítou, když byl porovnáván se sérem kontrolních zvířat, která nejsou infikována. Rovněž naše skupina demonstrovala, že protein hsp70 prvoka Leishmania infantům je důležitým cílem imunitní odpovědi u infekcí způsobených infekcí tímto parazitem.

S předmětem zkoumání možnosti, že protein Q může být použit pro vytváření ochranných systému proti infekci prvokem Leishmania infantům, byly připraveny tři série experimentů pro oba, jak protein Q, tak v kombinaci s Hsp70, za použití křečka jako modelu. Experiment byl připraven tak, aby bylo zjištěno, zdali imunizace Proteinem Q ochrání zvířata proti infekci krátkodobě, dále byl připraven tak, aby bylo zjištěno, zdali imunizace je ochrání po dlouhou dobu a za třetí, aby byl zjištěn tento ochranný účinek imunizace pro dva proteiny společně. Bylo potom pozorováno z obou analýz, jak krátkodobé, tak dlouhodobé, že protein Q byl schopný vyvolat imunitní odpověď, která redukuje parazitickou zátěž v játrech a ve slezině po infekci prvokem Leishmania infantům u většiny imunizovaných zvířat, a že imunizace proteiny Q + Hsp70 také . indukuje významnou odpověď proti oběma proteinům a vede k významnému snížení parazitické zátěže u většiny imunizovaných zvířat.

PODSTATA VYNÁLEZU

Z prvního hlediska se předkládaný vynález vztahuje k chimérickému genu, který je tvořen DNA sekvencemi, které kódují antigenní determinanty čtyř proteinů prvoka L. infantům, použitelného pro prevenci před nebo léčbu psí leishmaniózy.

* Z dalšího hlediska se předkládaný vynález vztahuje k proteinu kódovanému zmíněným chimérickým genem, který obsahuje jednu nebo více antigenních determinant čtyř proteinů prvoka L. infantům kódovaných chimérickým genem.

Předkládaný vynález se dále vztahuje k metodě pro prevenci před a/nebo léčby psí leishmaniózy u lidských bytostí nebo zvířat. V této terapeutické metodě může být použit chimérický gen podle předkládaného vynálezu nebo protein kódovaný tímto genem. Také protilátky proti proteinu • · • · · ·· ·· • ··· · · · ·· «·· • · · · · · ··· · • · ··· ·· ··· · · ·· · · · · ·· · · •· ··· ·· ·· ·» · · · kódovanému chimérickým genem podle předkládaného vynálezu nebo antigenní část těchto protilátek taková, jako je epitop, může být použita.

Z dalších hledisek se předkládaný vynález vztahuje k farmaceutickým prostředkům pro prevenci před a/nebo léčbu, u lidí a/nebo zvířat, leishmaniózy, které zahrnují aktivní látku odvozenou od nebo nařízenou proti chimérickému genu podle předkládaného vynálezu a/nebo protein kódovaný tímto genem, nebo jeho Části. Aktivní látka je přednostně taková, že může být použita ve farmaceutickém prostředku pro léčbu a/nebo prevenci před leishmaniózou.

Zvláště farmaceutický prostředek bude ve formě vakcíny obsahující protein, který je kódován chimérickým genem podle předkládaného prostředku, nebo jednu nebo více jeho částí, které obsahují jednu nebo více antigenních determinant proteinu kódovaného chimérickým genem podle předkládaného vynálezu.

Tudíž z dalšího hlediska je předkládaný vynález vztahující se k farmaceutickému prostředku pro prevenci před a léčbu leishmaniózy u lidí a zvířat tvořen:

a) proteinovou chimérou Q nebo variantou tohoto proteinu, která obsahuje modifikace nebo substituce chráněných aminokyselin, podávanou pacientovi (lidská bytost nebo zvíře), nebo

b) proteinem Q v izolované formě nebo kombinovaným s jakoukoliv fyziologickou podpůrnou látkou a podávaným intraperitoneálně, podkožně nebo intramuskulární cestou.

Předkládaný vynález vztahující se také k vakcíně, která je schopna stimulovat produkci protilátek, které rozpoznávají parazita Leishmanii, je tvořen:

a) proteinovou chimérou Q nebo variantou tohoto proteinu, která se liší od proteinu Q v chráněných aminokyselinách, podávanou pacientovi (lidská bytost nebo zvíře), nebo

Dále se předkládaný vynález vztahující se k farmaceutickému prostředku pro prevenci před nebo léčbu, lidí nebo zvířat, leishmaniózy, je tvořen:

a) proteinem Q nebo variantou tohoto proteinu, která obsahuje modifikace nebo substituce chráněných aminokyselin, a kombinovaný s LiHsp70, kompletním nebo jeho fragmentem, který je podáván pacientovi (lidská bytost nebo zvíře), nebo

Z dalšího jiného hlediska předkládaný vynález vztahující se k farmaceutickému prostředku pro prevenci před nebo léčbu, lidí nebo zvířat, leishmaniózy, je tvořen:

a) jakýmkoliv DNA vektorem nesoucím sekvenci, která kóduje proteinovou chiméru Q nebo variantu této sekvence, která obsahuje modifikace nebo substituce nukleotidů, které kódují chráněné aminokyseliny, který je podáván pacientovi (lidská bytost nebo zvíře), nebo

b) DNA vektorem, který obsahuje Q protein kombinovaný s jakoukoliv fyziologickou podpůrnou látkou a podávaným intraperitoneálně, podkožně nebo intramuskulární cestou.

Dalším hlediskem předkládaného vynálezu vztahujícího se k farmaceutickému prostředku pro prevenci před nebo léčbu, lidí nebo zvířat, leishmaniózy, je tvořen:

a) jakýmkoliv DNA vektorem nesoucím:

1) sekvenci, která kóduje proteinovou chiméru Q nebo variantu této sekvence, která obsahuje modifikace nebo substituce nukleotidů, které kódují chráněné aminokyseliny, a

2) sekvenci nukleotidů, které kódují protein LiHsp70 nebo jeho varianty, které se liší s ohledem na chráněné aminokyseliny, a který je podáván pacientovi (lidská bytost nebo zvíře), nebo

b) jakýmkoliv vektorem, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje Q protein tak, jak je definováno v bodě a), a podávaným s fysiologickou podpůrnou látkou intraperitoneálně, podkožně nebo intramuskulární cestou.

V další části zahrnuje farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu protilátky namířené proti proteinu kódovanému chimérickým genem podle předkládaného vynálezu, nebo jeho částem.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat všechny známé podpůrné látky, rozpouštědla, pufry a tak dále, známé pro přípravu farmaceutických prostředků a/nebo vakcín.

Z dalšího hlediska se předkládaný vynález vztahuje k způsobu léčby nebo prevence před leishmaniózou, za použití farmaceutického prostředku nebo vakcíny podle předkládaného vynálezu, nebo přípravku, který zahrnuje protilátky namířené proti proteinu kódovanému chimérickým genem podle předkládaného vynálezu.

Tato metoda bude obecně zahrnovat podávání aktivní látky, která je namířená proti chimérickému genu nebo proteinu, lidské bytosti nebo zvířeti, takovému, jako je pes, ve farmaceuticky aktivním množství.

Pro prevenci před leishmaniózou bude podávána lidské bytosti vakcína obsahující protein kódovaný chimérickým genem nebo genem kódujícím jednu nebo více částí zmíněného proteinu,

který zahrnuje jednu nebo více antigenních determinant, aby došlo vyvolání obranné imunitní odpovědi.

Podávání přípravků, protilátek a/nebo vakcín podle předkládaného vynálezu může být prováděno způsobem známým pro osoby znalé stavu techniky, takovým, jako je orální způsob, intramuskulární, intravenózní, podkožní, kapačkovou infuzí a podobně. Přednostněji je prostředek nebo vakcína injikován, zatímco pro přípravek protilátek může být použita infuze.

Mělo by být poznamenáno, že, když je zde odkazováno na chimérický gen podle předkládaného vynálezu, pak tento termín také zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny, která může hybridizovat se sekvencí zmíněnou níže za mírných nebo striktních hybridizačních podmínek.

V tomto kontextu mohu být heterologní hybridizační podmínky následující: hybridizace v 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g pyrofosforečnanu sodného, 5* Denhardtův roztok (100 x Denhardtův roztok na 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g polyvinylpyrolidon, 10 g hovězí sérový albumin (Pentax Fraction V)) a 20 pg/ml denaturované spermatické DNA sledě při 56 °C po dobu 18 až 24 hodin, následováno dvě 30 minutovými omýváními v 5 x SSC, 0,1% SDS při 56 °C a dvěma 30 minutovými omýváními v 2 x SSC, 0,1% SDS při 56 °C.

Například sekvence, které mohou hybridizovat se sekvencí zmíněnou níže, zahrnují mutantní DNA sekvence, které kódují proteiny se stejnou biologickou funkcí, jako protein kódovaný sekvencí zmíněnou v tomto textu níže. Takovéto mutantní sekvence mohou zahrnovat jednu nebo více nukleotidových delecí, substitucí a/nebo adicí k sekvenci zmíněné níže. Vhodně mají mutantní sekvence stále přinejmenším 50%, vhodněji přinejmenším 70%, dokonce nejvhodněji více než 90% nukleotidovou homologii se sekvencí uvedenou zde níže.

Termín chimérický gen tak, jak je užit zde, také zahrnuje sekvence nukleové kyseliny, které zahrnují jednu nebo více částí sekvence zde zmíněné níže. Vhodně takovéto sekvence zahrnují přinejmenším 10 %, vhodněji přinejmenším 30 %, nejvhodněji 50 % nukleotidové sekvence uvedené zde níže. Takovéto sekvence mohou zahrnovat kontinuální fragment zmíněné sekvence zde uvedené níže nebo dva nebo více fragmentů sekvence zde uvedené níže, které byly zkombinovány a/nebo začleněny do jedné DNA sekvence.

Mělo by být zde upozorněno na to, že, pokud je odkaz proveden na protein kódovaný chimérickým genem podle předkládaného vynálezu, pak tento termín také zahrnuje mutantní proteiny, které stále hlavně mají stejnou biologickou funkci. Takovéto mutantní proteiny mohou zahrnovat jednu nebo více aminokyselinových delecí, substitucí a/nebo adicí v porovnání vůči proteinu kódovanému sekvencí zmíněnou níže. Vhodně mají mutantní proteiny stále přinejmenším

50%, vhodněji přinejmenším 70%, nejvhodněji dokonce více než 90% aminokyselinovou homologii se sekvencí uvedenou zde níže.

Termín protein také zahrnuje fragmenty proteinu kódovaného chimérickým genem podle předkládaného vynálezu. Takovéto fragmenty přednostně stále vykazují biologickou aktivitu celého proteinu. Vhodně takovéto fragmenty zahrnují přinejmenším 30 %, vhodněji přinejmenším 50 % aminokyselinové sekvence celého proteinu. Také dva nebo více fragmentů celého proteinu kódovaného chimérickým genem podle předkládaného vynálezu může být zkombinováno tak, aby vytvořily jeden protein.

Specifičtěji se předkládaný vynález vztahuje k chimérickému genu tvořenému DNA sekvencemi, které kódují antigenní determinanty čtyř proteinů prvoka L. infantům, a které kódují protein použitelný k farmakologickým účelům, zvláště pro prevenci před a/nebo léčbu leishmaniózy, zvláště psí leishmaniózy, a k získání konečného produktu nebo ke konstrukci chimérického genu, který kóduje polypeptid, který obsahuje všechny vybrané antigenní determinanty. Předkládaný vynález je charakteristický tím, že využívá klonovací strategii, v které klon, který exprimuje protein rLiPO-Ct-Q, je použit jako počáteční vektor, a k tomuto vektoru, za použití prostředků vhodných restrikčních míst, jsou postupně přidány fragmenty DNA, které kódují proteiny LiP2aQ, LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q, LiH2A-Nt-Q, a po každém klonovacím kroku je určena správná orientace každého jednotlivého inzertu a velikost expresních produktů. Celková odvozená aminokyselinová sekvence konečného fuzního proteinu pPQV, exprimovaného ve vektoru pMAl, je:

MBP IEGRPLTPRSAKKAVRKSGSKSAKCGLIFPVGRVGGMMRRGYARRIGA 50 SGAPRISEFSVKAAAQSGKKRCRLNPRTVMLAARHDDDIGTLLKNVTLSHSGVV 140 PNISKAMAKKKGGKKGKATPSAPEFGDSSRPMSTKYLAAYALASLSKASPSQAD 157 VEAICKA VHID VDQATLAFVMESVTGRDVATLIAEGAAKMSAMPAASSGAAAGV 211 TASAAGDAAPAAAAAKKDEPEEEADDDMGPSyRDPMQYLAAYALVALSGKTPSK 265 STAGAGAGAVAEAKKEEPEEEEADDDMGPVDLQPAAAAP AAPS AAAKAAPEESD 3 74 EDDFGMGGLF (SEQ ID No. 3)

Předkládaný vynález se také vztahuje k farmaceutickému prostředku pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, a který je tvořen:

·· ♦ ·· ·· ·· ··«· · · · · · ♦ * • · · · · · · · · · ·· · · · ·· ·· ·· ···

a) proteinovou chimérou Q nebo variantou tohoto proteinu, který obsahuje modifikace nebo substituce konzervovaných aminokyselin, pro podávání předmětu léčby (lidská bytost nebo zvíře), buď

b) v izolované formě nebo společně s jakoukoliv fysiologickou podpůrnou látkou intraperitoneálně, podkožně nebo intramuskulární cestou.

Předkládaný vynález se také vztahuje k vakcíně, která je schopná stimulovat produkci protilátek, které rozeznávají parazita Leishmanii, a která je tvořena:

a) proteinovou chimérou Q nebo variantou tohoto proteinu, který se odlišuje od proteinu Q v konzervovaných aminokyselinách, pro podávání předmětu léčby (lidská bytost nebo zvíře), buď

Jiné hledisko předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceutický prostředek pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, a který je tvořen:

a) proteinem Q nebo variantou tohoto proteinu, který obsahuje modifikace nebo substituce konzervovaných aminokyselin, vázaným na protein LiHsp70, celý nebo fragmentovaný, pro podávání předmětu léčby (lidská bytost nebo zvíře), buď

Další farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, může být tvořen:

a) jakýmkoliv DNA vektorem nesoucím sekvenci, která kóduje proteinovou chiméru Q nebo variantu této sekvence, která obsahuje modifikace nebo substituce nukleotidů, které kódují konzervované aminokyseliny, pro podávání předmětu léčby (lidská bytost nebo zvíře), buď

b) podkožní nebo intramuskulární cestou.

Z ještě jiného hlediska se předkládaný vynález vztahuje k farmaceutickému prostředku pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, který je tvořen:

a) jakýmkoliv DNA vektorem nesoucím 1- sekvenci, která kóduje proteinovou chiméru Q nebo variantu této sekvence, která obsahuje modifikace nebo substituce nukleotidů, které kódují konzervované aminokyseliny, a 2- sekvenci, která kóduje protein LiHsp70, nebo varianty stejného proteinu, které se liší v konzervovaných aminokyselinách, pro podávání předmětu léčby (lidská bytost nebo zvíře), buď

b) podkožní nebo intramuskulární cestou.

• * 9 99 99 999 • · · · ♦ · · 9 999

9 9 9 99999

9 99 99 999 99

9 9 9 9 9 9 99

999 99 9 9 9999 9

Předkládaný vynález se také vztahuje k nukleotidové sekvenci a k proteinu použitelnému k farmaceutickým účelům, zvláště pro prevenci před a/nebo léčbu leishmaniózy, zvláště pak psí leishmaniózy, který má DNA a aminokyselinovou sekvenci takovou, jaká je uvedena níže, a která je exprimována ve vektoru PQ31. Aminokyselinová sekvence obsahuje fragment vektoru (AK 1 až 37). Zbytek aminokyselinové sekvence je identický té, která je uvedena pod označením SEQ ID No. 3, kromě části MBP a prvních sedmi aminokyselin (AK 1 až 7):

145

ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala

1015

4690

AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

2530

91135

GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCG GTC Glu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val

4045

136180

CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCG Arg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Lau Ile Phe Pro

5560

181225

GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGC Val Gly Arg Val Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gin Tyr Ala Arg

7075

226270

CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTG Arg Ile Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Val

8590

271315

AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCG Lys Ala Ala Ala Gin Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro

100105

316360

CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACG Arg Thr Val Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr

110 115120

361405

CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC AGC GGC GTT GTG CCG AAC Leu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser His Ser Gly Val Val Pro Asn

125 130135

406450

ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAG Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys

140 145150

451495

GCG ACA CCG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATG TCC Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser

155 160165

496540

ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys Ala

170 175180

541585

TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC

Ser Pro Ser Gin Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys Ala Val His

185 190195

586630

ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTT Ile Asp Val Asp Gin Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu Ser Val

200 205210

631675

ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATG GCG GAG GGC GCC GCG AAG

Thr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys

215 220225

676720

ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val

230 235240

721765

ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro

245 250255

766 810 AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Thr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro

260 265270

811855

TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTG Ser Arg Val Asp Pro Met Gin Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val

275 280285

856900

GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTC Ala Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala Asp Val Gin Ala Val

290 295300

901945

CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCC Leu Lys Ala Ala Gly Val Ala Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala

305 310315

946990

GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC

Val Phe Gin Glu Val Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala

320 325330

9911035

GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCT Glu Gly Arg Thr Lys Leu Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala

335 340345

10361080

GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAG Gly Ala Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu

350 355360

10811125

GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATG Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met

365 370375

11361170

GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCT Gly Pro Val Asp Leu Gin Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro

380 385390

11711215

AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC Ser Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp

395 400405

TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT1256

Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe

410412

1257

AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306

1307

TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356

1357

CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406

1407

AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT

1436 (SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 2) nebo mutant nebo jeho fragment, který může být použit pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi, u lidské bytosti nebo zvířete, proti leishmanióze a k farmaceutickému prostředku pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, který zahrnuje tento protein nebo mutant nebo jeho fragment, který může být použit pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi u lidské bytosti nebo zvířete proti leishmanióze. Tento protein je odvozen od vloženého genu PQV v expresním vektoru pQE31. Zde zmíněný chimérický gene přednostně kóduje polypeptid vytvořený s molekulovou hmotností 38 kDa a izoelektrickým bodem 7,37.

Také se předkládaný vynález vztahuje kvakcíně schopné vyvolat produkci protilátek, které rozeznávají parazita Leishmanii, a která zahrnuje protein zmíněný výše nebo mutant nebo jeho fragment, který může být použit pro vyvolání obranné imunitní odpovědi u lidské bytosti nebo zvířete proti leishmanióze.

Další hledisko předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceutický prostředek pro prevenci před a léčbu, u lidí nebo zvířat, leishmaniózy, který zahrnuje protilátky namířené proti proteinu zmíněnému výše nebo mutantu nebo jeho fragmentu, vhodněji obsahující jednu nebo více antigenních determinant takových, jako je epitop.

Předkládaný vynález se dále vztahuje na metodu prevence před a léčby leishmaniózy u lidské bytosti nebo zvířete, která zahrnuje podávání farmaceutického prostředku lidské bytosti nebo zvířeti, jak je popsáno výše, nebo na metodu prevence před leishmaniózou u lidské bytosti nebo zvířete, která zahrnuje podávání vakcíny lidské bytosti nebo zvířeti, jak je popsáno výše.

Chimérický gene, který je tvořený DNA sekvencemi kódujícími antigenní determinanty čtyř proteinů L. infantům, a získaný protein, použitelný pro prevenci před a/nebo léčbu leishmaniózy, které předkládaný vynález navrhuje, vytvářejí ve své podstatě zjevnou novost v rámci pole jejich aplikace, jak vyplývá z předkládaného vynálezu. Syntetický chimérický gen je vytvářen tak, jak vyplývá z jeho sestavení, a obsahuje DNA oblast kódující antigenní determinanty specifické pro proteiny LiP2a, LiP2b, LiPO a H2A, tudíž sestavený protein je bohatý na antigenní determinanty. Získaný chimérický gen je exprimován v Escherichia coli a produkt byl analyzován s ohledem na

* 4 4 4

44 • ♦ ·

4 jeho antigenní vlastnosti. Výsledky potvrdily, že tento chimérický protein zachoval všechny antigenní determinanty původních proteinů, a že zahrnuje relevantní farmaceuticky použitelný element pro psí LV, s citlivostí, která osciluje mezi 80 % až 93 %, a specifitou mezi 96 % až 100 %.

Obzvláště chimérický gen tvořený DNA sekvencemi, které kódují antigenní determinanty čtyř proteinů parazita L. infantům, a protein kódovaný těmito sekvencemi, použitelný pro prevenci před a/nebo léčbu psí leishmaniózy, a protein získaný jako předmět předkládaného vynálezu, jsou vytvářeny prostředky podle následujících etap, zejména:

Konstrukce chimérického genu. Metodologie.

Strategie klonování.

Klonování DNA sekvencí, které kódují antigenní determinanty histonového proteinu H2A.

Klonování sekvencí, které kódují rLiP2a-Q a rLiP2b-Q.

Klonování sekvence rLiPO-Q.

Klonování chimérického genu.

Konstrukce chimérického genu z konstrukce intermediátových produktů.

Klonování epitopů specifických pro antigeny provoka L. infantům.

Konstrukce výsledného produktu.

Konstrukce chimérického genu, který kóduje polypeptid, který obsahuje všechny vybrané antigenní determinanty.

- volitelně exprese sekvence, která byla takto získána.

Vyhodnocení výsledného produktu.

Sérum.

Přečištění proteinů.

Elektroforéza proteinů a imuno-analýza.

Měření pomocí metody Fast-ELISA.

Vyhodnocení výsledného produktu.

Antigenní vlastnosti.

Citlivost a specifita chimérického proteinu CP v séru diagnostikovaném na psí LV. Strategie následující klonování DNA sekvencí, které kódují každou z vybraných antigenních determinant, je stejná ve všech případech, a v prvním kroku je sekvence, která je předmětem zájmu, amplifíkována pomocí metody PCR a za použití specifických oligonukleotidů, které obsahují místa pro restrikční enzymy na vzdálenějších koncích.

Φ Φ φ φφ φφ φφ · φ φ ·· ···· ···· φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφ φφ φφφ

Pro krok klonování je amplifíkovaný produkt řízen prostředky vhodného restrikčního enzymu a je vnesen do odpovídajícího restrikčního místa v p asmidu pUC18.

Po osekvenování je inzert získán zpět a subklonován do odpovídajícího restrikčního místa modifikovaného plasmidu označeného pMAL-c2. Modifikace je provedena vnesením terminačního kodónu pod místem pro restriktázu HindlII v polylinkeru plasmidu pMAL-c2, označení výsledného plasmidu je pMAL-c2*.

Vzhledem ke klonování DNA sekvence, která kóduje antigenní determinanty histonového proteinu H2A, by mělo být vyzdviženo, že cDNA klonu cL71, která kóduje histon H2A prvoka L. infantům, je použita jako templát pro PCR reakce a pro DNA amplifikaci, která kóduje Nkoncovou oblast histonu H2A, přesněji rLiH2A-Nt-Q, s tím, že následující oligonukleotidy jsou používány: hlavní řetězec 5'- CCTTTAGCTACTCCTCGCAGCGCCAAG - 3' (pozice 84 až 104 sekvence cL71); opačný řetězec 5'- CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG - 3' (inverzní a doplňková k pozici 204 až 224 sekvence cL71).

Sekvence, které jsou zahrnuty v těchto nukleotidech pro klonování, a které přítomny v původní sekvenci cL-71 jsou označeny tučným typem písma.

Amplifíkovaný DNA fragment je klonován přímo z restrikčního místa XmnI plasmidu pMAL-c2*. Fragment je sekvenován prostřednictvím iniciátoru #1234 malE a antigenní C-koncová oblast histonu H2A, zvláště zLiH2A-Ct-Q, je amplifikována za použití následujících nukleotidů. Jsou to tyto:

Hlavní řetězec 5 '- GAATTCTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG - 3' (pozice 276 až 296 sekvence cL71).

Opačný řetězec 5'- GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCCTTGCC - 3' (inverzní a komplementární k pozici 456 až 476 plasmidu cL71).

Triplet, který kóduje prolin (označený jako GGG za podtrženými písmeny), je zahrnut v oligonukleotidu opačného řetězce, restrikční místo pro EccRI, které je zahrnuto v obou oligonukleotidech pro klonování, je označeno podtrhnutím.

Vzhledem ke klonování sekvencí, které kódují rLiP2a-Q, by mělo být vyzdviženo, že oblasti, které jsou ve středu zájmu, jsou amplifikovány metodou PCR z cDNA kódující LiP2a a LiP2b. Oligonukleotidy, které jsou použity pro konstrukci expresního klonu LiP2a-Q, jsou následující: Hlavní řetězec 5'- GTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC - 3'.

Opačný řetězec 5'- GTCGACGGGGCCCATGTCATCATCGGCCTC - 3'.

Mělo by být vyzdviženo, že Sáli restrikční místa přidaná na 5'- koncová místa oligonukleotidu jsou podtržená.

Když byl konstruován expresní klon LiP2b-Q, byly použity tyto oligonukleotidy:

Hlavní řetězec 5'- TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGCC -3'.

Vedlejší řetězec 5'- TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGGCCTC - 3'.

Na 5'- koncích oligonukleotidů jsou začleněna restrikční místa pro enzym Xbal (podtrženo), a z důvodu potřeb klonování byl navíc začleněn triplet, kódující prolinový zbytek, za restrikčním místem.

Vzhledem ke klonování sekvence rLiPO-Q by mělo být vyzdviženo, že klonování DNA sekvence C-koncové oblasti proteinu PO prvoka L. infantům je provedeno amplifikací klonu cDNA nazývaného L27 a za použití následujících oligonukleotidů:

Hlavní řetězec 5'- CTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCC - 3' (pozice 1 až 24 L27 cDNA) a iniciátor pUC18 sekvence (#1211), amplifikovaná DNA je upravena enzymy Pstl + HindlII, s tím, že je později vnesena do plasmidu pMAL-c2.

Výsledný klon je označen pPQI a mělo by být uvedeno, že restrikční místo Pstl je začleněno v nukleotidu hlavního řetězce (podtrženo), a že restrikční místo pro HindlII je přítomno v cDNA L27.

Vzhledem ke klonování chimérického genu by mělo být vyzdviženo, že DNA sekvence, které kódují pět antigenních determinant, jsou složeny do chimérického genu a toto složení je provedeno v klonu pPQI, do kterého jsou následně po sobě systematicky utříděné regiony pro antigenní oblasti LiP2a-Q přidány ve směru 3' (pojmenovávající výsledků klonování pPQII), LiP2b-Q (klon pPQIII), LiH2a-Ct-Q (klon pPQIV) a LiH2A-Nt-Q (klon pPQV).

Nakonec inzert, získaný po vyštěpení konečného klonu pPQV enzymy Sací + HindlII, je vložen do expresního plasmidu pQE31, s tím, že konečný klon je pojmenován pPQ.

Chimérický gen vytvořené z DNA sekvencí, které kódují antigenní determinanty čtyř proteinů prvoka L. infantům, použitelný pro sérologickou diagnózu psí leishmaniózy, a z něho vzniklý předpokládaný protein, jsou vytvořeny z konstrukce intermediátových produktů. V první příkladě je klonování epitopů specifických pro antigeny prvoka L. infantům prováděno, a je konfigurováno na základě předchozích studií antigenních vlastností čtyř antigenních proteinů prvoka L. infantům (LiP2a, PÍPO, LiP2b, LiH2a), což umožňuje existenci B epitopů, aby byly definovány pro tyto proteiny, a které jsou specificky rozeznávány psím LV sérem.

Z pohledu, aby došlo ke zlepšení antigenní specifity těchto antigenů vzhledem k proteinům prvoka L. infantům, jsou specifické antigenní determinanty klonovány z těchto proteinů. Po deletování určitých oblastí těchto proteinů, mohou tyto být rozeznávány sérem zvířat, která jsou nositeli LV a jiných dalších nemoci.

• 0 • · ·· # 00 00 000 0 0 00 0 0000 00 0

000 0· 0· ·0 000

Za použití specifických nukleotidů a metodou amplifikace PCR oblastí specifických pro geny LiP2a, LiP2b, PO a H2A, je několik klonů zkonstruováno tak, že exprimují rekombinantní proteiny rLÍPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q a rLiH2A-Nt-Q, které právě byly popsány detailně v části popisu předkládaného vynálezu, která se k nim vztahuje k metodologii, kde jsou detaily klonování popsány.

Použité rekombinantní proteiny jsou následující:

- rLiPO-Ct-Q, který odpovídá 30 C-koncovým zbytkům ribozomálního proteinu LiPO.

- rLiP2a-Q a rLiP2b-Q, které jsou odvozené od ribozomálních proteinů LÍP2a a LiP2b, respektive.

- Dvě podoblasti histonu H2A, které odpovídají 46 N-koncovým zbytkům (xLiH2ANt-Q) a 67 C-koncovým zbytků (zbytky (xLiH2A-Ct-Q).

Každý jednotlivý z rekombinantních proteinů je spojený s maltózovým vazebným proteinem (MBP) a je exprimován v E. coli, jak je předvedeno na obrázku číslo 1A, a jsou přečištěny afinitní chromatografií na amylózové koloně B. Po procesu přečišťování byla provedena elektroforéza rekombinantních proteinů (dráhy 1 až 5).

S cílem analyzovat zdali rekombinantní proteiny byly rozeznávány psím LV sérem byl Western blot obsahující rekombinantní proteiny inkubován ve směsi tří psích LV sér. Na základě vyhodnocení, že všechny tyto proteiny jsou rozeznávány sérem, je uzavřeno, že antigenní determinanty přítomné v původních proteinech jsou zachovány v rekombinantních proteinech (C). Antigenní vlastnosti rekombinantních proteinů jsou porovnány s antigenními determinantami původních antigenů pomocí prostředků metody FAST ELISA, za použití testování proti sadě 26 psích LV sér, právě tak, jak je to ukázáno v sekci obrázku číslo ID, a fakt, že séra vykázala podobné hodnoty reaktivity proti oběma, jak vybraným antigenním oblastem, tak oblastem odpovídajícím kompletním proteinům, demonstruje, že se během klonovací procedury se nevyskytla žádná změna v antigenním epitopu.

Co se týká konstrukce konečného produktu, přesněji chimérického genu, který kóduje polypeptid, který obsahuje všechny vybrané antigenní determinanty, by mělo být vyzdviženo, že klonovací strategie je ukázána na obrázku číslo 2 v sekci A. Intermediátové produkty, které jsou během procesu vytvořeny, jsou ukázány.

Klon, který exprimuje proteiny rLiPO-Ct-Q (pPQI) je použit jako počáteční vektor, a fragmenty DNA, které kódují proteiny rLÍPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q a rLiH2A-Nt-Q, jsou postupně přidávány za použití vhodných restrikčních míst.

• · • * • · · · · ·· · * *· · ··· · · ·· · ·· • · ···»····· · • · · · · ♦ · · ·· ·· ··· ·· ·· ·· *··

Po každém klonovacím kroku je z velikosti produktů posouzena správná orientace každého jednotlivého inzertu, a nakonec je určena celková nukleotidová sekvence výsledného klonu pPQV a aminokyselinová sekvence, které jsou vyvozené ze sekvence představené na obrázku číslo 3.

Vytvořený polypeptid má molekulovou hmotnost 38 kDa, isoelektrický bod 7,37, obsahuje spojovací sekvence kódující prolin, které jsou na obrázku číslo 3 podtržené. Cílem tohoto bylo účinně oddělit antigenní domény a vyhnout se možným terciálním konformacím, které by mohly interferovat se stabilitou a anitigenicitou výsledného produktu.

Exprese a vytvoření každého z intermediátových produktů je ukázána na obrázku číslo 4, sekce A a B. Tak, jak bylo očekáváno, po každém přidání se velikost expresního produktu ve vektoru pMAL stupňovaně zvětšuje do té doby než dosáhne molekulové hmotnosti 80 kDa, přičemž bylo pozorován jistý stupeň narušení během purifikace.

Chimérický gen byl také klonován do plasmidu pQE, vektoru, který dovoluje expresi proteinů s fragmentem šesti histidinů na kraji N-konce. Výsledný klon a rekombinantní proteiny jsou označeny pPQ a PQ, respektive.

Úroveň exprese proteinu v bakterii, která byla transformována plasmidem pPQ, a přečištěné proteiny jsou ukázány na obrázku číslo 4, což se vztahuje zvláště k D, kde s proteinem PQ, který byl přečištěn afinitní chromatografií za denaturačních podmínek, je stabilnější ten rekombinantní protein pPQ představený na obrázku číslo 4, v sekci D dráha 2.

Z důvodu vyhodnocení konečného produktu byla použita řada různých materiálů a zjevně některé techniky, jak je popsáno níže.

Jsou použita LV séra získaná od psů různého původu. Zvířata jsou klinicky a analyticky vyšetřena ve vhodné laboratoři, obecně v oddělení parazitologie, a všechna pozitivní séra jsou testována nepřímou imuno-fluorescencí (IIF).

Přítomnost amastigotů parazitů u těchto zvířat je potvrzena přímým pozorováním podkolenních a podpažních lymfatických uzlin, a druhá skupina 33 LV sér pocházejících z jiných oblastí byla podrobena pozitivní diagnóze metodou ELISA proti celkovým proteinovým extraktům parazita a/nebo metodou IIF.

Séra psů postižených různými chorobami, které nebyly LV, jsou získány z různých zdrojů. V této sérové skupině jsou z následujících infekcí zjištěny:

Mesocestoides spp.

Dyphylidium caninum

Uncinaria stenoceephala

Toxocara canis • '· •· •· •· •♦

«* ·« ·· * « · · · · ··· • · · ·· · ·

9 · · · · » «· • · » · · ·· • · · «« »4 »··

Dipetalonema dranunculoides

Demodex canis

Babesia canis

Ehrlichia cannis

Ricketsia ricketsiae

Zbylá séra byla získána od psů, kteří vykazuji klinické příznaky, které se nevztahují k jakémukoliv infekčnímu procesu, a kontrolní séra byla získána od patnácti pečlivě prověřených zdravých zvířat.

Přečištění rekombinantních proteinů exprimovaných z klonů pMAl-c2 je provedeno afinitní chromatografií na amylózových kolonách a purifikace rekombinantního proteinu exprimovaného z klonu pPQ byla provedena na kolonách tvořených Ni-NTA pryskyřicí za denaturační podmínek (Qiagen).

Pro analýzu proteinů byla provedena elektroforéza v 10% polyakrylamidových gelech za přítomnosti SDS za standardních podmínek. Imunologická analýza proteinů separovaných elektroforézou byla provedena na nitrocelulózových membránách, na které byly proteiny přeneseny. Přenesené proteiny byly blokovány sušeným 5% sbíraným mlékem v PBS pufru s 0,5% Tweenem 20.

Filtry byly postupně dány do kontaktu s primárním a sekundárním antisérem v blokovacích roztocích a imuno-konjugát značený peroxidázou byl použit jako druhá protilátka, vizualizující specifickou vazbu prostřednictvím ECL systému. Obrázek 4E ukazuje Western blot proteinu PQ. Metoda FAST-ELISA byla použita místo klasické metody ELISA, a proces citlivosti antigenu byl prováděn po dobu 12 hodin při pokojové teplotě.

Misky byly podrobeny procesu citlivosti se 100 μΐ antigen, jehož koncentrace byla ve všech případech 2 pg/ml.

Po procesu citlivosti byly jamky misek inkubovány po dobu 1 hodiny s blokovacím roztokem (0,5% práškové sbírané mléko rozpuštěné v PBS - 0,5% Tween 20 a séra byla rozpuštěna třistakrát v blokovacím roztoku).

Jamky byly inkubovány se sérem po dobu 2 hodin při pokojové teplotě a po expozici s protilátkou byly jamky omyty roztokem PBS-Tween 20.

Protilátky značené peroxidázou byly použity jako druhé protilátky v ředění 1:2000 a barva reakce byla vyvinuta za použití substrátu orthofenylendiamin, absorpce byla měřena při 450 nm.

Pokud jde o vyhodnocení výsledného produktu, mělo by být vyzdviženo, že antigenní vlastnosti byly určeny za použití prostředků studie vztahující se k reaktivitě psího LV séra proti • 4 · ·* ♦· ·· * • e ·« «··· · ·♦ · ··· · · ·9··· «4 4 44 44 444 4 · 4 4 4 »······ ··« 44 ·4 44··· chimérickému proteinu a proti každému jednotlivému intermediátovému produktu ve „Western blotovém“ testu. Všechny intermediátové produkty si udržely svou antigenicitu právě tak, jako to udělal i konečný produkt pPQV, od začátku až do konce klonovacího procesu (obrázek 4C). Mělo by být také vyzdviženo, že rekombinantní protein exprimovaný zplasmidu pPQ byl rozpoznán LV sérem. Z hlediska toho, aby byla provedena analýza s vyšší přesností antigenních vlastností chimérického proteinu a intermediátových produktů, byla udělána analýza reaktivity široké řady různých psích LV sér za pomoci prostředků FAST-ELISA proti rekombinantním proteinům, jak je uvedeno v sekci F na obrázku 4. Může být zdůrazněno, že citlivost různých intermediátových klonovaných produktů se zvyšuje po každém přídavném kroku. Také by mělo být vyzdviženo, že protein pQI je rozpoznáván většinou LV sér a protein PQII rovnocenně většinou sér. Tento poměr je větší pro protein PQIII a proteiny PQIV, PQV a PQ jsou rozpoznávány prakticky všemi séry.

Vzhledem k tomu co bylo diskutováno výše, procento rozpoznání vykázané séry bylo podobné pro oba případy jak testování chimérických proteinů PQV a PQ, tak testování směsi rekombinantních proteinů rLiPO-Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b a rLiH2A. Bylo sledováno, že antigenní vlastnosti každé jednotlivé z pěti vybraných antigenních oblastí jsou přítomny v PQ expresním produktu, a proto tento produkt může být použit pro diagnózu místo směsi antigenů exprimováných individuálně.

Z hlediska toho, aby bylo určeno, zdali chimérický protein může být použit pro diagnózu psího LV séra, a podle analýzy týkající se široké řady různých psích sér proti tomuto proteinu, je drženo v mysli, že podle klinických charakteristik zvířat, bylo psí sérum klasifikováno ve třech skupinách. První skupina skládající se ze séra psů s reálnou infekcí L. infantům. Druhá skupina byla složena ze séra psů, kteří měli různé klinické příznaky bez toho, aniž by byli infikováni Leishamnií, včetně psů infikovaných parazity odličných od Leishamanie, a kteří mohli vykazovat klinické příznaky, které by mohly být zaměněny s těmi, které jsou pozorovány v případě leishmaniózy. Třetí skupina byla vytvořena z kontrolního séra pocházejícího od zdravých psů.

Na obrázku číslo 5 jsou ukázány průměrné hodnoty reaktivity od každé skupiny sér, reaktivita LV séra dosahuje hodnot průměrné reaktivity 0,8 (S.O. = 0,4).

Uvnitř této skupiny byla reaktivita 12 sér pozitivní, ale menší než 0,35, zatímco reaktivita 10 sér dosahuje hodnot mezi 0,35 a 0,5. Bylo pozorováno, že reaktivita 23 sér se odličovala mezi 0,5 a 1,0 se 14 séry vykazujícími reaktivitu vyšší než 1,0.

Průměrná absorpční hodnota séra druhé skupiny, která je, jak bylo řečeno, skupinou infikovanou parazity odlišnými od parazita Leishmanie, je 0,2 (S.O. = 0,05) a reaktivita kontrolního séra, jak ·· * · bylo řečeno, třetí skupiny, je 0,1 (S.O. = 0,003). Pouze dvě séra ze skupiny 2 vykazují reaktivitu mezi 0,35 a 0,4.

Data prezentovaná výše naznačují, že chimérický protein PQ v rámci metody FAST-ELISA má 80% citlivost pro diagnózu LV, pokud limitní hodnota je definována jako průměrná hodnota reaktivity sér druhé skupiny plus tři standardní odchylky (jak bylo řečeno 0,35).

Citlivost testované skupiny dosahuje 93 %, pokud limitní hodnota je definována hodnotami reaktivity kontrolní skupiny. Protein Q má 96% specifitu pro diagnózu LV, pokud limitní hodnota je definována již dříve zmíněného séra druhé skupiny. 100% specifita v testu byla dosažena, když hodnoty reaktivity zdravých psů byly vzat v úvahu.

Proces, který má být použit, je následující:

1. Mikrotitrační destičky pokryté 100 μΐ roztoku protilátek, který obsahuje lpg/ml antigenu rozpuštěného v pufru PBS - 0,5% Tween 20 - 5% sbírané mléko (pufr A), jsou inkubovány.

Inkubace je prováděna po dobu 12 hodin při pokojové teplotě, a pak jsou destičky omyty třikrát ve stejném pufru, který neobsahuje antigen. Suché destičky inkubované antigenem by mohly být udržovány při pokojové teplotě.

2. První inkubace jamek byla provedena se sérem zvířat při ředění 1/200 v pufru A. Inkubace trvala 1 hodinu.

3. Jamky jsou omyty pufrem A, jak je popsáno v bodě 1, třikrát omývací baňkou.

4. Pak jsou inkubovány s druhou protilátkou (IgG značená peroxidázou) naředěnou 1 : 2000 v pufru A, inkubace je prováděna po dobu 1 hodiny.

5. Jamky jsou ještě jednou omyty pufrem A třikrát, jak bylo naznačeno v třetí sekci, a jak již bylo řečeno omývací baňkou.

6. Reaktivita je prokázána použitím substrátu orthofenylendiamin a absorpce měřena při 450 nm.

Protein použitý pro diagnózu extrahovaný z chimérického genu je identifikován a nukleotidová sekvence kódující zmíněný protein je následující:

145

1015

4690

AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile *· • ·· •9 ♦· ·· ·<·· ·<· ·· • · · · « · • · ·· 9 · • · · · ·· 4·

91135

4045

136180

5560

181225

7075

226270

8590

271315

100105

316360

110 115120

361405

125 130135

406450

ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAG l Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys

140 145150

451495

155 160165

496540

ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG •· ·· ·· · • ·· · · · · · • · • ·

170

175

180

541 585

TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC

185

190

195

586 630

ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTT

200

205

210

631 675

ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATG GCG GAG GGC GCC GCG AAG Thr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys

215 220 225

676 720

ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC

721 765

ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG

245

250

255

766810

AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Thr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro

260 265270

855

TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTG

275

280

285

856900

290 295300

901945

305 310315

946990

GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC

320

325

330

9911035

335 340345

10361080

350 355360

10811125

365 370375

11361170

380 385390

11711215

AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC

Ser Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp

395 400405

TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT1256

Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe

410412

1257

AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306

1307

TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356

1357

CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406

1407

AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 2)

Není považováno za nezbytné rozšířit tento popis proto, že kdokoliv znalý stavu techniky může rozumět rámci předkládaného vynálezu a výhodám, které vytváří.

Materiály, formy, velikost a dispozice elementů jsou snadno měnitelné za předpokladu, že se nepřipouští změna v samé podstatě předkládaného vynálezu.

Termíny, které byly použity v tomto popisu, by měly být vždy považovány jako široké ve své podstatě a neomezující předkládaný vynález.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Aby byl dokončen popis vynálezu, který byl započat, a s cílem zajistit porozumění charakteristikám předkládaného vynálezu, je předkládaný popis vynálezu doplněn, jako jeho integrální součástí, souborem návrhů ilustrujících charakter, která nejsou omezeny. Toto je reprezentováno následujícím:

Obrázek 1 odpovídá expresi (A), přečištění na amylosových kolonách (B) a test antigenicity (C: Western blot; D: ELISA) každého jednotlivého rekombinantního proteiny spojeného s maltosový vazebný protein. Obrázek pod písmenem D také představuje reaktivitu při metodě ELISA každého jednotlivého rekombinantního proteinu vztaženo k celkovému proteinu.

Obrázek 2. Grafická prezentace různých vektorů zvažovaných pro získání chimérického genu, který je předmětem předkládaného vynálezu, z kterého případný protein předurčený, aby provedl přesnou diagnostiku u zvířat nebo lidských bytostí, které vykazují příznaky leishmaniózy, bude extrahován.

Obrázek 3 odpovídá identifikaci proteinu získaného z chimérického genu spojeného do MBP proteinu, jehož příprava je předvedena na obrázku 2.

Obrázek 4 odpovídá expresi (A), přečištění na amylosových kolonách (B) a test antigenicity (C: Western blot; D: ELISA) intermediátů a konečného chimérického proteinu napojeného na maltosový vazebný protein (PQI-PGV). Obrázek také představuje expresi chimérického proteinu (D: dráha 2) a test antigenicity přečištěného proteinu proti LV séru (E: Western blot) a proti sbírce sér (F: PQ při metodě ELISA).

Obrázek 5 ukazuje konečnou shrnutou grafickou reprezentaci reaktivnosti široké výběru psího séra rozděleného do tří skupin. První skupina obsahuje zvířata s reálnou infekcí prvokem L. infantům. Druhá skupina zahrnuje sérum získané ze psů s různými klinickými příznaky, ale kteří nejsou infikováni Leishmanií, a třetí skupina je vytvořena z patnácti kontrolních sér od zdravých psů. Tento obrázek demonstruje hodnotu předkládaného vynálezu pro vytvoření sérologické diagnózy LV.

• · · · · · · ·· · oo · · ·· ····♦♦·· ·····♦···· • · ········♦ · ··· ······· ·· ··· ·· ·· · · · ·¹

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1 - Imunizace proteinem Q

Čtyři zvířata byla imunizována 5 mikrogramy proteinu Q rozpuštěného ve 40 mikrolitrech Freundovy pomocné látky, a další čtyři zvířata byla imunizována stejným množstvím pomocné látky, která vytvářela emulsi ve 40 mikrolitrech PBS roztoku chloridu sodného bez proteinu. Při první imunizaci byla použita kompletní Freundova pomocná látka v kombinaci s proteinem, zatímco při následných dvou imunizacích byla nekompletní Freundova pomocná látka použita pro smíšení s proteinem ve stejném poměru protein/pomocná látka. Tři intraperitoneální imunizace byly provedeny v 15 denních intervalech. Počínaje druhým týdnem po každé imunizaci a po celou dobu imunizace byly odebírány krevní vzorky, aby byla měřena humorální odpověď proti proteinu Q ELISA testem. Bylo pozorováno, že už po druhém týdnu po první imunizaci se objevila pozitivní IgG odpověď, a že tato odpověď byla vysoká po druhém týdnu po infekci a zvyšovala se během imunizace dosahující koncentrací 1/100000. Rovněž bylo pozorováno, že imunitní odpověď proti proteinu Q se významně nezměnila po infekci parazitem (obr. 1).

Patnáct dnů po třetí imunizaci byla zvířata infikována dávkou 10⁵ promastigotů parazita diferencovaných od infekčních amastigotů pocházejících od infikovaného křečka. Bylo již dříve zjištěno, že inokulum bylo schopné indukovat silnou parazitemii společně s chorobou, čtyři měsíce po podání parazitů u 100 % infikovaných zvířat. Tabulka 1 naznačuje hladinu parazitemie na mg tkáně obou, jak jater, tak sleziny, kontrolních a vakcinovaných zvířat. Je možné pozorovat, že u všech vakcinovaných zvířat ze parazitická zátěž v játrech snižuje vzhledem ke kontrolám, a že toto se děje velmi významným způsobem u 75 % těchto zvířat. Když byla zjišťována parazitická zátěž ve slezině, bylo možno pozorovat že také u 75 % zvířat je tato zátěž významně nižší než u kontrol, RPL (snížení parazitické zátěže v %) dosahuje 83 % až 86 %. Zvířata, u kterých byl RPL 20% v játrech, měla 48% RPL ve slezině.

Tabulka 1. Parazitická zátěž v játrech a slezině u křečků vakcinovaných proteinem Q přes intraperitoneální cestu. Po čtyřech týdnech infekce byla měřena parazitická zátěž metodou limitních ředění (u krátkodobých). Parazitická zátěž je vyjádřena jako paraziti na miligram tkáně. RPL = snížení parazitické zátěže v %.

• · ·· · ·· ·· ·· • ••9 · · · · ·

Křeček imunizovaný proteinem Q

křeček	játra	(RPL)	slezina	(RPL)
1	4± 1	(71 %)	49 ±3	(83 %)
2	3+2	(78 %)	39 ±2	(86 %)
3	5 ± 1	(64 %)	50 ±4	(83 %)
4	11 ±3	(20 %)	153 ± 19	(48 %)

Čísla znamenají průměr ze tří určování

Kontroly křečci 14 ±5 295 ±30

Čísla znamenají průměr ze čtyř zvířat

Příklad 2

Z důvodu prošetření účinku vakcinace s proteinem Q na snížení parazitické zátěže u dlouhodobého pokusu, a za použití jiné cesty inokulace, byla 4 zvířata injikována podkožně 5 mikrogramy proteinu Q rozpuštěného v 40 mikrolitrech PBS a smíšeného s 40 mikrolitry Freundovy pomocné látky. Při první imunizaci byla použita kompletní Freundova pomocná látka, zatímco při následných dvou imunizacích byla nekompletní Freundova pomocná látka použita jak je naznačeno výše. Vakcinace byla podávána ve třech dávkách rozdělených 15 denními intervaly. Patnáct dnů po třetí imunizaci bylo zvířatům podáno inukulum 10⁵ infekčních parazitů. Během celé doby imunizace a po dobu celé infekce (pět měsíců) byla odebírána krev, aby byl určen druh humorální odpovědi proti proteinu Q a proti všem proteinům parazita. Obrázek 2 ukazuje, že již po druhém týdnu imunizace byla odpověď proti proteinu Q pozitivní, jako v předchozím případě, u tří myší, a že odpověď proti proteinu byla vysoká po dvou týdnech od první imunizace. Odpověď se udržovala velmi vysoká po zbývajících imunizacích dosahující koncentraci 1/75000 po jednom týdnu následujícím třetí imunizaci. U jednoho ze zvířat byla odpověď proti proteinu Q nižší ve vztahu k časovému období, ačkoliv odpověď dosáhla úrovně takové, jako u ostatních zvířat na konci experimentu. Následkem toho z údajů odvozených zobou, jak příkladu 1, tak příkladu 2, je možné vyvodit, že stupeň imunitní odpovědi proti proteinu, podávanému oběma cestami, intraperitoneálně a podkožně, je velmi rapidní, ačkoliv odpověď získaná na podání intraperitoneální cestou dosáhla vyšších koncentrací ve stejných časových intervalech (1/75000 proti 1/30000). Obrázek 3 indikuje odpověď proti proteinu Q u kontrolních zvířat. Je možně ·· · ·· ·· ·· · · ·· ····«··

JJ · · · ···· · · • · · ·· · · ··· · ··· · · · · ·· • · ··· · · ·· ·· · pozorovat, že reaktivita proti tomuto proteinu je detekována během 12 až 14 týdne po infekci, která je, když se objevují první příznaky doprovázející potenciální leishmaniózu, detekována u infikovaných zvířat. Tabulka 2 ukazuje úrovně parazitemie v játrech a slezině kontrolních a vakcinovaných zvířat. Je možno vidět, že 50 % zvířat bylo chráněno na úrovni jater vtom smyslu, že snížení úrovně parazitemie bylo velmi vysoké (87 až 89 %). Jedno ze zvířat nebylo chráněno, zatímco u jiných zvířat bylo snížení parazitické zátěže 22%. Na druhou stranu snížení parazitické zátěže bylo 98 až 99% u zvířat na úrovni sleziny.

Tabulka 2. Parazitická zátěž v játrech a slezině u křečků vakcinovaných proteinem Q přes podkožní cestu. Po 20 týdnech infekce byla měřena parazitická zátěž metodou limitních ředění (u dlouhodobých). Parazitická zátěž je vyjádřena jako paraziti na miligram tkáně. RPL = snížení parazitické zátěže v %.

Křečci imunizovaní proteinem Q

křeček	játra	(RPL)	slezina	(RPL)
1	1,4 x 10⁶	(22 %)	1,0 x 10⁴	(98 %)
2	2,0 x 10⁵	(89 %)	4,9 x 10⁵	(99,9 %)
3	2,4 x 10⁵	(87 %)	3,3 x 10⁵	(99,9 %)
4	2,4 x 10⁶	(0 %)	6,3 x 10⁵	(99,9 %)
Čísla znamenají průměr ze tří určování
Kontroly
4 křečci	1,8 x 10⁶	± 1,2 x 10⁵	5,2 x 10⁸	±2,6x 10⁷

Čísla znamenají průměr parazitická zátěže ze čtyř zvířat

S předmětem testování zda protein Q by mohl být použit pro vytváření ochranných systémů v prostředcích, které obsahují protein LiHsp70 prvoka Leishmania infantům, byl proveden experiment s Balb/c myšíma. Bylo pozorováno, že po imunizaci byla parazitická zátěž u obou, jak u jater, tak u sleziny, významně snížena u některých zvířat, o čtyři řády níže.

Příklad 3 - Imunizace proteinem Q + proteinem Hsp70 ve Freundově pomocné látce

Každý ze čtyř křečků byl injikován intraperitoneálně 5 mikrogramy proteinu Q a 5 mikrogramy proteinu LiHsp70 rozpuštěných v 40 mikrolitrech PBS a tvořících emulzi v 40 mikrolitrech ·· · ·· ·· ·· φ « ·· a···*·· jO · · · ···· ·· • · 9 9 · · · 9 9 9 · ··· ····♦· ·· · · · · · · · · · ·

Freundovy pomocné látky. Při první imunizaci byla použita kompletní Freundova pomocná látka, zatímco při následných dvou imunizacích byla nekompletní Freundova pomocná látka použita jak je naznačeno výše. Vakcinace byla podávána ve třech dávkách rozdělených 15 denními intervaly.

Patnáct dnů po třetí imunizaci bylo zvířatům podáno inukulum 10⁶ infekčních parazitů přes intrakardiální cestu a byly utraceny po 22 týdnech. Každé dva týdny po celé imunizační období a po celou dobu infekce byla zvířatům odebírána krev, aby byl určen druh humorální odpovědi proti proteinu Q a proti proteinu LiHsp70.

Relativní parazitická zátěž u myší imunizovaných proteinem Q plus proteinem LiHsp70 je uvedena v tabulce 3. Bylo pozorováno všechna zvířata byla vysoce chráněna, a u některých z nich bylo snížení ve slezině blízké dvěma řádům velikosti.

Tabulka 3. Relativní parazitická zátěž Balb/c myší imunizovaných proteinem Q plus proteinem LiHsp70 po čtyřech měsících infekce.

Myši imunizované proteinem Q a proteinem LiHsp70

myš	játra	(RPL)	slezina	(RPL)
1	1,5 x 10³	(97 %)	1,5 x 10⁴	(99 %)
2	0,9 x 10³	(98 %)	1,4 x 10³	(99 %)
3	2,0 x 10⁴	(60 %)	5,6 x 10⁴	(99 %)
4	0,8 x 10⁴	(84 %)	1,2 x 10⁵	(96 %)

Čísla znamenají průměr ze tří určování

Kontroly myši 5,1 x 10⁴ ± 2 x 10³ 3,2 x 10⁶ ± 8 x 10⁴

Čísla znamenají průměr parazitická zátěže ze čtyř zvířat.

Tabulky 4 a 5 ukazují všechna zvířata z příkladů 1 a 2 odpovídají imunologicky proteinu Q, a že počínaje od druhého týdne po imunizaci byla odpověď proti proteinu Q vysoká a tato odpověď se zvýšila po druhé imunizaci (4. týden). Tabulka 6 ukazuje, že odpověď proti proteinu LÍHps70 po celou dobu experimentu byla také pozitivní, ačkoliv nižší než odpověď v příkladu 3 proti proteinu Q

Tabulky 4 a 5. Ukazují imunitní odpověď u 4 křečků injikovaných intraperitoneálně 5 mikrogramy proteinu Q (tabulka 4 - příklad 1, krátkodobé) a imunitní odpověď u 4 křečků injikovaných podkožně 5 mikrogramy proteinu Q (tabulka 5 - příklad 2, dlouhodobé).

Tabulka 4. (příklad 1, krátkodobé)

Myši imunizované proteinem Q (krátkodobé)

Imunitní odpověď proti proteinu Q

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0,8	0,2	0,3	0,6
4	1,9	2,3	1,1	2,1
6 infikování	3	3	2,4	2,9
8	3	3	2,9	3
10	3	3	3	3

Séra (ředěná 1/200) vykazující optickou hustotu 3 mají koncentraci vyšší než 1/45000.

Kontrolní myši

Imunitní odpověď proti proteinu Q (krátkodobé).

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0

Séra byla ředěna 1/200

Tabulka 5. (příklad 2, dlouhodobé)

Myši imunizované proteinem Q (dlouhodobé)

Imunitní odpověď proti proteinu Q

týden

myši

myš2

myš3

myš4

·· ♦ · 9· • · · · · · · ·· ·· ·« 4··

2	1,8	1,3	1,9	0,4
4	2,1	1,8	2,2	0,7
6	2,5	2,7	2,5	0,5
8	2,8	2,2	2,2	0,8
10	3	2,9	2,5	0,7
12	3	3	3	0,9
14	3	3	3	1
16	3	3	2,9	1,5
18	3	3	3	1,7
20	3	3	3	2,2
22	3	3	3	2,6
24	3	3	3	3
26	3	3	3	3

Kontrolní myši

Imunitní odpověď proti proteinu Q (dlouhodobé).

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0,2	o,i	0,3	0,1
14	0,3	0,5	0,4	0,2
16	0,4	0,5	0,7	0,3
18	0,9	1,1	1,7	0,6
20	1,1	1,3	1,5	0,8
22	2,5	2,3	2,7	1,9
24	2,3	2,1	1,8	2,2
26	1,9	2,2	2,3	2,7

Séra byla ředěna 1/200 ·· · ·« ·· ·· · • · ·· · · · · ···· ··· · · ·* · · · ·· ·····*··· · • · · ···«··· ·· ··· *· ·· 4· ···

Tabulka 6. Ukazuje imunitní odpověď u 4 křečků injikovaných intraperitoneálně 5 mikrogramy proteinu Q plus 5 mikrogramy proteinu LiHSP 70 (příklad 3, dlouhodobé).

Myši imunizované proteinem Q + proteinem Hsp70

Imunitní odpověď proti proteinu Q

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0,4	0,6	0,5	0,4
4	1,6	1,1	1,6	1,7
6	3	2	1,9	1,9
8	3	2,4	2,6	2,5
10	3	2,9	3	2,9
12	2,7	2,9	2,9	2,9
14	2,5	2,6	2,9	2,7
16	2,6	2,5	2,5	2,4
18	2,8	2,7	2,7	2,5
20	2,5	2,8	2,4	2,7
22	2,5	2,4	2.8	2,9

Séra byla ředěná 1/800

Kontrolní myši

Imunitní odpověď proti proteinu Q.

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0	0,1	0,2	0,1
14	0,3	0,4	0,2	0,5
16	0,5	0,6	0,7	0,7
18	0,8	1,4	1,1	1,5
20	1,8	1,6	1,8	2,2

« »

4« ·· · · · ·· • · ·♦ · · • · « · · · ·· • 4 4 4 ·· «4 ··♦ ♦

4 •

4*4

Séra byla ředěna 1/200

Myši imunizované proteinem Q + proteinem Hsp70

Imunitní odpověď proti Hsp70 proteinu

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	OJ	0,2	0,1	0,4
4	0,4	0,6	0,3	0,5
6	0,8	0,7	0,4	0,3
8	0,7	1,1	1,2	0,5
10	1,2	1,4	1,5	0,8
12	1,9	1,9	2	1,2
14	2	1,8	2,2	1,7
16	1,9	2	2,2	1,9
18	2	2,1	2	2
20	2	2,1	2,2	1,9
22	2,4	2,3	2,1	1,9

Séra byla ředěná 1/800

Kontrolní myši

Imunitní odpověď proti Hsp70 proteinu.

týden	myši	myš2	myš3	myš4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0,1	0	0,3	0
14	0,3	0,2	0,5	0,4
16	0,5	0,6	0,6	0,3
18	0,7	0,6	0,7	0,5
20	1	0,8	0,5	1,2
22	1,7	1,4	0,8	1,1

• M 4 ·♦ *··· «4·· 4 · * ·«444 • <· * »4 44 · <·4

4 4 4 4 4 4 444 4· «4 4 « 4 4 4 4 44

444 44 44 ··444

Séra byla ředěna 1/200

Příklad 4 - Imunizace proteinem Q + BCG v Balb/c myších

Čtyři Balb/c myši byly každá injikována intraperitoneálně 5 mikrogramy proteinu Q a 10⁶jednotkami tvořícími kolonii (CFU) BCG (bacil Calmette-Gurin) rozpuštěnými ve 40 mikrolitrech PBS. Imunizace byla provedena ve třech dávkách, 15 dní po sobě. 15 dní po třetí imunizaci bylo myším podáno inokulum infekčních parazitů 10⁵ BCN150 prvoka L. infantům intrakardiální cestou. Každé dva týdny po dobu imunizace a po dobu infekce byly myším odebírány krevní vzorky pro testování stupně humorální odpovědi na protein Q. Zvířata byla utracena po 8 týdnech infekce.

Tabulka 7 (a a b) ukazuje, že imunizovaná zvířata odpovídala pozitivně na protein Q počínaje druhým týdnem, a že odpověď vzrůstá progresivně dokud v mnoha případech dosahuje hodnot 400000. Tabulka 8 ukazuje odlišnost parazitické zátěže mezi játry a slezinou vakcinovaných a kontrolních zvířat.

Tabulka 7. Imunitní odpověď na protein Q u Balb/c myší imunizovaných 5 mikrogramy proteinu Qa 10⁶ CFU BCG

Myši 1, 2, 3, 4 imunizované

Myši 5, 6, 7, 8 neimunizované kontroly

Reakce na protein Q

týden	myši	myš2	myš3	myš4
preimunizace	0	0	0	0
1. imunizace
I	0	0,2	0,1	0
2. imunizace
3	0,5	0,7	0,8	0,9
3. imunizace
6	1,6	2,1	2,6	2,7
7	1,8	2,3	2,4	2,1
9	2,1	2,6	2,5	1,9

1 i 13	2,7 3	42 2,9 3	• · · • · · · • · ♦ • · · · • · · • · · · · 3 3	• · • · · • · • · · • · · • · 3 3
týden	myš5	myš6	myš7	myš8
preimunizace	0	0	0	0
1. imunizace
1	0	0	0	0
2. imunizace
3	0	0	0	0
3. imunizace
6	0	0	0	0
7	0	0	0	0
9	0	0	0	0
11	0	0	0	0
13	0	0	0	0
číslo 3 je ekvivalentní přesycení měřícího systému séra byla vzata na počátku každého z označených týdnů první imunizace byla provedena v den 0, druhá v 15 den a třetí ve 30 den.

Tabulka 8. Parazitická zátěž v játrech a slezině Balb/c myší vakcinovaných proteinem Q podkožně + 10⁶ BCG. 8 týdnů po infekci byla měřena parazitická zátěž optickou mikroskopií tkáňových otisků pomocí měření různých polí obsahujících 7000 jaderných buněk. Parazitická zátěž je představována jako kvantita parazitů na miligram tkáně, s tím, že již dříve bylo vypočítáno, že 1 parazit na 1000 jaderných buněk je ekvivalentní přibližně množství 210 parazitů na miligram tkáně.

RPB = snížení parazitické zátěže v %.

myš	játra	(RPB)	slezina	(RPB)
1	72	(82 %)	457	(89 %)
2	40	(90 %)	207	(95 %)
3	48	(88 %)	n.d.	(100%)
4	n.d.	(100%)	90	(98 %)

Kontroly zvířata. průměr400± 15 4155 ±30

n.d. paraziti nemohli být detekováni v 5000 jaderných buňkách < SEZNAM SEKVENCÍ ~ <110> Laboratoře CBF-Leti <120> Chimérický gen tvořený DNA sekvencemi, které kóduji antigenní deterninanty čtyř proteinů prvoka L. infantům a protein kódovaný zmíněným genem, a Farmaceutický prostředek použitelný pro prevenci <130> BO 42418 <140> PCT <141> 1999-12-23

<160> 12 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 412 <212>PRT <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: protein Q exprimovaný v PQ31 <400> 1

Met

Arg

Gly

Ser

His

Thr

Aáp

Pro

His

Ala

Ser

1

5

10

15

30

Ser

Asn.

Asn

Leu

Gly

Ile

Glu

Gly

20

25

30

Arg

Pro

Leu

Ala

Thr

Pro

Arg

Ser

Ala

Lys

Ala

Val

Arg

Lys

Ser

35

40

45

Gly

Ser

Lys

Ser

Ala

Lys

Cys

Gly

Leu

Ile

Phe

Pro

Val

Gly Arg

Val

50

55

60

40

Gly

Met

Arg

Gly

Gin

Tyr

Ala

Arg

Ile

Gly

Ala

Ser

65

70

73

80

Gly

Ala

Pro

Arg

Ile

Ser

Glu

Phe

Ser

Val

Ly3

Ala

Gin

Ser

85

90

95

45

Gly

Lys

Arg

Cys

Arg

Leu

Asn

Pro

Arg

Thr

Val

Met

Leu

Ala

100

105

110

Arg

His

Asp Asp

Asp

Ile

Gly

Thr

Leu

Lys

Asn

Val

Thr

Leu

Ser

50

115

120

125

His

Ser

Gly

Val

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Ala

Met

Ala

Lys

130

135

140

55

Gly

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Pro

Ser

Ala

Pro

Glu

Phe

Gly

Ser

145

150

155

160

Ser

Arg

Pro

Met

Ser

Thr

Lys

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Ala

Ser

165

170

175

60

Leu

Ser

Lys

Ala

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Asp

Val

Glu

Ala

Ile

Cys

Lys

1S0

185

190

Ala

Val

His

Ile

Asp

Val

Asp

Gin

Ala

Thr

Leu

Ala

Phe

Val

Mat

Glu

65

195

200

205

Sér

Val 210

Thr Gly Arg

Asp

Val Ala Thr Leu Ile Ala

Glu Gly

Ala Ala

215

220

5

Lys

Met

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Ser

Gly

Ala

Gly

Val

225

230

235

240

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

Asp

Ala

Pro

Ala

Lys

245

250

255

10

Lys.

Asp

Glu

Pro

Glu

Ala

Asp

Met

Gly

Pro

Ser

Arg

260

263

270

Val

Asp

Pro

Met

Gin

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Val

Ala

Leu

Ser

15

275

280

285

Gly

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Ala

Asp

Val

Gin

Ala

Val

Leu

Lys

Ala

290

295

300

20

Gly

Val

Ala

Val

Asp

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ala

Val

Phe

Gin

Glu

Val

305

310

315

320

Glu

Gly

Lys

Ser

Phe

Asp

Ala

Leu

Val

Ala

Glu

Gly

Arg

Thr

Lys

Leu

325

330

335

25

Val

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Pro

Ala

Gly

Ala

Val

Ser

Thr

Ala

Gly

340

345

350

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Val

Ala

Glu

Ala

Lys

Glu

Pro

Glu

30

355

360

365

Glu

Ala

Asp

Met

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

Ala

370

375

380

35

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

Ala

Lys

Glu

Pro

Glu

385

390

395

400

Ser

Asp

Glu

Asp

Phe

Gly

Met

Gly

Leu.

Phe

405

410

40

<210> 2 <211> 1436 <212> DNA <213 > umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: DNA kódující protein Q <400> 2 atgagaggat ctcaccacca ecaccaccac acggatccgc atgcgagctc gaacaacaac 60 aacaataaca

120 gccaagaagg 180 gtgggacgog 240 ggagccccca 300 tgccgcctga 360 ataacaacaa ccgtocgoaa tcggcgggat ggatttcaga acccgcgcac cctcgggatc gagcggctcc gatgagccgc attctccgtg cgtgatgctg gagggaaggc aagtccgcga ggacagtacg aaggcggccg gccgcgcgcc ctttagctac aatgtggtct ctcgccgcat cgcagagcgg acgacgacga toctcgcagc gatcttcccg cggtgcctct gaagaagcgg catcggcacg

	cttctgaaga 420 gcaaagaaga 480 tctagaccca S40 tccccgtotc 600 gccaccctcg 660	acgtgacctt gtctcacagc ggcgttgtgc	cgaacatcag gcgcgcccga	caaggcgatg attcggatcc
agggcggcaa	gaagggcaag	gcgacacoga
5	tgtccaccaa	gtacctcgcc	gcgtacgctc	tggcctccct	gagcaaggcg
	aggcggacgt	ggaggctatc	tgcaaggccg	tceacatoga	cgtcgaccag
10	cctttgtgat	ggagagcgtt	acgggacgcg	acgtggccac	cctgatcgcg
	gagggcgccg 720 actgcttccg 780	cgaagatgag	cgcgatgccg	gcggccagct	ctggtgccgc	tgctggcgtc
	ctgcgggtga	tgcggctccg	gctgccgccg	ccgcgaagaa	ggacgagccc
15	gaggaggagg S4Ó	ccgacgacga	catgggoccc	tctagagtcg	accccatgca	gtacctcgcc
	V lí v gcgtacgccc 900	tagtggcgct	gtctggcaag	acgccgtcga	aggcggacgt	tcaggctgtc
20	yvw ctgaaggccg 960	ccggcgttgc	cgtggatgcc	tcccgcgtgg	atgccgtqtt	ccaggaggtg
	gagggcaaga 1020	gcttcgatgc	gctggtggcc	gagggccgca	cgaagctggt	gggctctggc
	tctgoogctc 10B0	cngotggcgc	tgtctocact	gctggtgccg	gcgctggcgc	ggtggccgag
25	gcgaagaagg 1140	aggagcccga	ggaggaggag	gccgatgatg	acatgggcco	cgtcgacctg
	cagcecgccg 1200	ctgccgcgcc	ggccgcccct	agcgccgctg	□caaggagga	gccggaggag
30	agcgacgagg 1260	acgacttcgg	catgggcggt	ctcttctaag	cgactcgcca	tctcttagec
	tccttgtggt 1320	gcgcttgagg	tgctctcgct	ctgcttctcc	ttgcagtgtt	ggatgactct
	ggcgggtatg 1380	tgccgtcgca	ttacacccac	ctctcccaoc	cctttgccct	acgcgctsgc
35	atgcgcaatc 1436	cgtgaaccat	qgagggaagt	ctctctgggt	ggcagtgggt	aagctt

<210>3 <211> 328 <212>PRT <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: protein Q exprimovaný v pMal <400>3

Ile

Glu

Gly

Arg

Pro

Leu

Thr

Pro

Arg

Ser

Ala

Lys

Ala

Val

Arg

1

5

10

15

Lys

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Ala

Lys

Cys

Gly

Leu

Ile

Phe

Pro

Val

Gly

20

25

30

Arg

Val

Gly

Met

Arg

Gly

Tyr

Ala

Arg

Ile

Gly

Ala

35

40

45

Ser

Gly

Ala

Pro

Arg

Ile

Ser

Glu

Phe

Ser

val

Lys

Ala

Gin

50

55

60

Sex

Gly

Lys

Arg

Cys

Arg

Leu

Asn

Pro

Arg

Thr

Val

Met

Leu

Ala

65

70

75

80

Ala

Arg

His

Asp

Ile

Gly

Thr

Leu

Lys

Asn

Val

Thr

Leu

Θ5

90

95

·· ♦·*

J l 9

~ 4 -

Ser

His

Ser

Gly

Val

Pro

Asn

rie

Ser

Lys

Ala

Met

Ala

Lys

100

105

110

Lys

Gly

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Pro

Ser

Ala

Pro

Glu

Phe

Gly

5

115

120

125

*

Asp

Ser

Arg

Pro

Met

Ser

Thr

Lys

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

130

135

140

10

Ala

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

Ser

Pro

Ser

Gin

Ala

Asp

Val

Glu

Ala

Ile

145

150

155

160

Cys

Lys

Ala

Val

His

Ile

Asp

Val

Asp

Gin

Ala

Thr

Leu

Ala

Phe

Val

165

170

175

15.

Met

Glu

Ser

Val

Thr

Gly

Arg

Asp

Val

Ala

Thr

Leu

Ile

Ala

Glu

Gly

180

135

190

20

Ala

Lys

Met

Ser

Ala

Met

Pro

Ala

Ser

Gly

Ala

195

200

205

Gly

Val

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

.Asp

Ala

Pro

Ala

210

215

220

25

Ala

Lys

Asp

Glu

Pro

Glu

Ala

Asp

Met

Gly

Pro

225

230

235

240

Sex

Val

Arg

Asp

Pro

Met

Gin

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Val

Ala

245

250

255

30

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Gly

2 60

265

270

35

Ala

Val

Ala

Glu

Ala

Lys

Glu

Pro

Glu

Ala

Asp

275

280

285

Asp

Met

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

Ala

Pro

Ala

290

295

300

i

40

Ala

Pro

Ser

Ala

Lys

Ala

Pro

Glu

Ser

Asp

Glu

Asp

•

305

310

315

320

Asp

Phe

Gly

Met

Gly

Leu

Phe

1

325

<210> 4 <211>27 <212>DNA ] <213> umělá sekvence ' I ^<220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid , <400>4 : cctttagcta ctcctcgcag cgccaag <210>5 <211> 27 <212> DNA <213> umělá sekvence

- 5 <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 5 cctgggggcg ccagaggcac cgatgcg <210>6 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 6 gaattctccg taaggcggcc gcgcag <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 7 gaattcgggc gcgctcggtg tcgccttgcc

v	<210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence
9	<220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid
	<400> 8 gtcgacccca tgcagtacct cgccgcgtac	30

<210> 9 <211> 30 , <212> DNA <213> umělá sekvence | <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 9 gtcgacgggg cccatgtcat catcggcctc <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> umělá sekvence

00	0	♦ ·	··	• 0	•
•	0	··	• ·	«	•	•	•
• ·	•	•	•	··		•	•	•
• ·	•	• ·		•		• ·	•
•	a	•	•	•	•	•	•	•	•
• 0	* ·<*	·*	00			··	♦ ♦ ·

<220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 10 tctagacccg ccatgtcgtc gtcttcctcg cc <210>11 <211> 29 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 11 tctagagggg ccatgtcgtc gtcggcctc <210> 12 <211> 30 <212>DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <400> 12 ctgcagcccg ccgctgccgc gccggccgcc

Claims

1. Protein vyznačující se tím, že vykazuje přinejmenším 90 % aminokyselinové identity s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 1.

2. Polynukleotid vyznačující se tím, že zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 1.

3. Polynukleotid podle nároku 2 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence je SEQ ID No. 2.

4. Transformovaný hostitel vyznačující se tím, že zahrnuje polynukleotid podle nároků 2 nebo 3.

5. Transformovaný hostitel podle nároku 4 vyznačující se tím, že hostitelem je baktérie.

6. Způsob produkce proteinu podle nároku 1 vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kroky a) kultivace transformovaného hostitele podle nároků 4 nebo 5 za podmínek vedoucích k expresi proteinu a b) optimální získání proteinu.

7. Prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje protein podle nároku 1.

8. Prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje polynukleotid podle nároků 2 nebo 3.

9. Prostředek podle nároků 7 nebo 8 vyznačující se tím, že prostředek je farmaceutickým prostředkem.

10. Farmaceutický prostředek pro prevenci před a léčbu, u lidí a zvířat, leishmaniózy, vyznačující se tím, že zahrnuje protein podle nároku 1.

11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že dále zahrnuje fyziologickou pomocnou látku pro intraperitoneální, podkožní a intramuskulární podávání.

12. Farmaceutický prostředek podle nároků 10 nebo 11 vyznačující se tím, že dále zahrnuje protein LiFIsp70, kompletní nebo fragmentovaný nebo jeho varianty.

• ·

13. Farmaceutický prostředek pro prevenci před a léčbu, u lidí a zvířat, leishmaniózy, vyznačující se tím, že zahrnuje polynukleotid podle nároku 2 nebo 3.

14. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že prostředkem je vakcína.

15. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že je určen pro použití při prevenci před nebo léčbě leishmaniózy u lidských nebo zvířecích pacientů.

16. Polynukleotid podle nároku 2 nebo 3 vyznačující se tím, že je určen pro použití při prevenci nebo léčbě leishmaniózy u lidských nebo zvířecích pacientů.

17. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že je určen pro použití při prevenci nebo léčbě leishmaniózy u lidských nebo zvířecích pacientů.

18. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že je určen pro použití při vyvolávání imunitních odpovědí.

19. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z nároků 10 až 12 a 14 vyznačující se tím, že je určen pro použití při vyvolávání imunitních odpovědí.

20. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje protilátky namířené proti proteinu podle nároku 1.

21. Způsob prevence před nebo léčby leishmaniózy u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutického prostředku podle jakéhokoliv z nároků 10 až 12, 14, 17, 19 a 20.

22. Způsob prevence před leishmaniózou u lidí nebo zvířat vyznačující se tím, že zahrnuje podávání vakcíny podle nároku 14.