MXPA01006548A

MXPA01006548A - Gen de quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de l. infantum.

Info

Publication number: MXPA01006548A
Application number: MXPA01006548A
Authority: MX
Inventors: Alonso Carlos Bedate
Original assignee: Leti Lab
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2003-03-27
Also published as: BR9916549A; AU2434200A; IL143956A; ES2326174T3; ATE429498T1; BRPI9916549B1; TR200102655T2; CZ20012360A3; ATE327332T1; BE2016C049I2; AU759316B2; CY1109221T1; BG105725A; DK1141305T3; EP1141305B1; NL300830I1; NL300830I2; EP1141305A1; SI1624063T1; BRPI9916549B8

Abstract

La presente invencion. se refiere a una composicion farmaceutica para la prevencion y tratamiento, humano o animal, de leishamaniasis. La composicion farmaceutica contiene la proteina quimera Q, la cual el producto de un gen quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de Leishmania infantum.

Description

GEN QUIMÉRICO QUE CODIFICA LOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DE CUATRO PROTEÍNAS DE L. INFANTUM OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente especificación se refiere a una aplicación para una Patente de la Invención, con respecto a un gen quimérico formado de las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro proteinas de L. infantum, y a proteinas codificadas por el gen quimérico, útil para la prevención o tratamiento de leishmaniosis, en particular leishmaniosis canina. El propósito obvio de esto yace en el uso de la secuencia del gen o la proteina obtenida del gen quimérico para proporcionar composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar la leishmaniosis, en particular la leishmaniosis canina, que se puede presentar en el cuerpo de un paciente, por ejemplo, como una vacuna o una preparación de anticuerpo monoclonal. Este paciente no tiene que ser un perro sino también puede ser un humano que es quién sufre de la enfermedad que involucra la inmunodepresión. Para lograr esto, un gen quimérico se producirá el cual codifica una proteina llamada PQ que consiste de un producto quimérico -*£: 231235 que se origina de una sintesis "in vitro" de un gen quimérico construido "ad hoc", el cual contienen cinco de los determinantes antigénicos de cuatro proteínas diferentes. El producto está configurado como altamente sensible y especifico para -por ejemplo- generar una respuesta inmune protectora contra la Leishmaniosis canina, o para preparar anticuerpos contra la leishmaniosis canina.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención es de utilidad dentro de la industria dedicada a la producción de productos farmacéuticos en general.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los protozoarios parasíticos del orden Leishmania son los agentes etiológicos que causan la Leishmaniosis, un rango de enfermedad que tiene una distribución a nivel mundial y que se caracteriza porque la misma da origen a una amplia variedad de síntomas clínicos. Las formas principales de Leishmaniosis son zoonóticos en naturaleza y los humanos so.- considerados como hospederos secundarios.

La especie denotada L. Infantum, ampliamente distribuida a lo largo de muchas áreas del Mediterráneo, es la causa 'de Leishmaniosis visceral (LV) en humanos y perros. En efecto, los perros infectados con L. Infantum son la principal reserva animal de este parásito, particularmente durante el periodo de incubación largo antes de que los síntomas clínicos puedan ser observados. Los datos epidemiológicos indican que existe una correlación directa entre la frecuencia de la Leishmaniosis canina y la transmisión del parásito a humanos. Por esta razón, es crucial detectar la enfermedad o infección más temprano en campañas emprendidas para controlar la expansión de la enfermedad. El parásito es trasmitido al vertebrado hospedero como un promastigoto flagelado, por medio de una picadura de una mosca de la familia " Phlebotominae" , y el parásito entra a las células de los fagos mononucleares en donde los mismos se diferencian y reproducen como amastigotos, dentro de la estructura fago-lisosómica . Las células infectadas se recolectan en ciertos tejidos, principalmente bazo, higado y nodos linfáticos. Se estima que alrededor de 15 millones de personas son infectadas con Leishmaniosis, y cada año en el mundo 500,000 nuevos casos clínicos aparecen en el mundo, principalmente en el mundo subdesarrollado y en desarrollo. En los países del sudoeste de Europa, la Leishmaniosis visceral (por sus siglas en inglés, VL) , es una enfermedad zoonótica causada por la especie L. Infantum, como se mencionó anteriormente. Los datos recientes derivados de los estudios epidemiológicos indican que existe una incidencia alarmante de esta infección. En Italia, los datos reportados para la incidencia de VL varian desde 14.4% a 37% de acuerdo con la región. En Portugal, en forma más particular en el área alrededor de Lisboa, los porcentajes de seropositivos de 8.4% se han encontrado y en la región de los centros diferentes de ocurrencia de los Alpes Marítimos de Francia se ha encontrado que varia entre 3.2% y 17.1%. En España, la ocurrencia de Leishmaniosis depende de la zona que es estudiada. En Cataluña, una proporción de incidencia promedio de 9.3% se ha observado aunque se ha encontrado en algunas situaciones precarias, una ocurrencia de perros infectados de hasta 18%. En la Isla de Mallorca, el porcentaje de incidencia es de 14%, y otras proporciones que se han encontrado son: 2.4% en Murcia, 8.8% en Granada, a partir de 10 a 15% en Salamanca, 5.25% en la provincia de Madrid, y 14% en Cáceres. Aunque el número de casos de VL en humanos causado por L. infantum se puede considerar relativamente bajo, el alto porcentaje de pacientes con inmunodepresión que llegan a ser infectados por Leishmania podria estar relacionado con el alto nivel de esta enfermedad en perros. En efecto, en el Sur de Europa, 50% de adultos que son infectados por Leishmaniosis también son pacientes infectados por el virus del VIH. Por otra parte, de acuerdo con ejstos datos de coinfección de Leishmania-VIH, se ha estimado que el nivel de. infección (por parásitos) puede ser uno o dos ordenes de magnitud superior que esta figura debido a la existencia de un gran número de infecciones no detectadas. Una caracteristica común de los diferentes tipos de la infección de Leishmania es que induce una fuerte respuesta humoral en el hospedero. Por lo tanto, los métodos de diagnóstico basados en las técnicas serológicas son habitualmente los más ampliamente usados. Se ha descrito que estos anticuerpos son detectados aún durante la fase asintomática de la enfermedad en infecciones naturales y experimentales.

La sensibilidad y especificidad de estos métodos depende del tipo, fuente y pureza del antigeno usado. En los procesos inmunológicos que habitualmente se comercializan, se usan como una fuente de antigeno los promastigotos completos y preparaciones más o menos preparadas a partir de estos. Este método normalmente conduce a reacciones cruzadas con suero de pacientes que sufren de lepra, tuberculosis, tripanosomiasis Africana, enfermedad de Chagas, malaria, y otras parasitosis. La sensibilidad y especificidad de los métodos serológicos dependen del tipo, fuente y pureza del antigeno empleado. Durante los últimos años se han caracterizado un gran número de antigenos de Leishmania, algunos de ellos pueden estar considerados como proteínas especificas para el parásito. Entre estas proteinas especificas para el parásito, la proteasa GP63 de la superficie, la gp46 de la glicoproteina de la superficie y la proteina KMP-11 asociada con el lipofosfoglicano merecen una mención. Un grupo adicional de los antigenos de Leishmania está formado de proteinas evolucionarlas conservadas, tales como cinesina, proteinas térmicamente inducidas, actina y tubulina .

Como parte de una estrategia para desarrollar un sistema de diagnóstico serológico, especifico, para Leishmaniosis canina, un proyecto basado en laboratorio se ha intentado para identificar los antigenos de L. infantum, por medio de una búsqueda de inmunodetección de una genoteca de expresión para genes de L. infantum que usan suero de perro con Leishmaniosis visceral. Se ha observado que la mayoria de los antigenos aislados por este método pertenecen a la familia de proteinas conservadas durante el curso de evolución. La identificación de lqs epitopes B de estos antigenos indica, sin embargo, que en todos los casos los determinantes antigénicos se localizaron en regiones que no fueron bien conservadas . En particular, las proteinas LiP2a y LiP2b ribosómicas acidas, se reconocen por más del 80% del suero de VL. Se ha confirmado que estas proteinas contienen determinantes antigénicos específicos de la enfermedad, y que las proteinas LiP2a y LiP2b recombinantes, a partir de las cuales se ha removido un fragmento, podrían ser usadas como un instrumento especifico capaz de distinguir entre VL y la enfermedad de Chagas.

También se ha mostrado que la- proteina ribosómica PO de L. infantum, muy altamente conservada en la escala evolutiva, se reconoce por un alto porcentaje de suero de perro con VL. Además, los determinantes antigénicos se encuentran exclusivamente en el C-terminal de la proteina, es decir, en la región que ha sido conservada pobremente durante el curso de evolución. Se ha observado que en 78% del suero de perro con VL, también están presentes anticuerpos contra la proteina H2A, y se ha confirmado que a pesar de la identidad de secuencia en todas las proteinas H2A entre los organismos eucarióticos, la respuesta humoral a esta proteina en el suero de VL particularmente es provocada por determinantes específicos para la proteina H2A de Leishmania. Los determinantes antigénicos reconocidos por el suero de perro con VL se encuentran en ambas terminales de la proteina H2A. La solución obvia para el problema habitualmente encontrado en esta técnica, podria ser que tiene una invención que podria permitir el agrupamiento de un gen quimérico sintético que contiene las regiones de ADN que codifican los determinantes antigénicos específicos a las proteinas LiP2a, LiP2b, LiPO, y H2A, con una vista para construir una proteina rica en determinantes antigénicos. Sin embargo, hasta el solicitante está enterado que no existe habitualmente invención que contenga las características descritas como ideales, con una vista para alcanzar la finalidad deseada. Esta finalidad es la construcción de una proteina rica en determinantes antigénicos, que resultan del agrupamiento de un gen sintético quimérico, que contiene las regiones de ADN que codifican los determinantes antigénicos específicos para las proteinas anteriormente mencionadas .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se refiere a un gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro proteinas de L. infantum, útiles para prevenir o tratar Leishmaniosis canina. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una proteina codificada por el gen quimérico, que contiene uno o más de los determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L. infantum codificado por el gen quimérico.

La invención además se refiere a un método para prevenir y/o tratar Leishmaniosis canina en un ser humano o un animal. En este método terapéutico, se puede usar el gen quimérico de la invención o la proteina codificada por él mismo. También, pueden ser usados los anticuerpos contra la proteina codificada por el gen quimérico de la invención, o una parte antigénica de los mismos tal como un epitope. En aspectos adicionales, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para la prevención y/o tratamiento, en humanos y/o animales, de Leishmaniosis, que comprenden una substancia activa derivada de o dirigida contra el gen quimérico de la invención y/o la proteina codifica por él mismo, o partes del mismo. La substancia activa es preferiblemente tal que la misma puede ser usada en una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de Leishmaniosis. En particular, la composición farmacéutica estará en una forma de una vacuna, que contiene la proteina codificada por el gen quimérico de la invención, o una o más partes de la misma, que contiene uno o más de los determinantes antigénicos de la proteina codificados por el gen quimérico de la invención.

Asi, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o animal, de leishmaniosis, formado: a) por la proteina Quimera Q, o una variante de esta proteina que contiene modificaciones o substituciones de aminoácidos preservados administrada a un sujeto (humano o animal) , o b) por la proteina Q en la forma aislada o combinada con cualquier adyuvante fisiológico por la ruta intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La invención también se refiere a una vacuna que es capaz de estimular la producción de anticuerpos que reconocen el parásito de Leishmania, formada: a) por la proteina Quimera Q o una variante de esta proteina que difiere de la proteina Q en aminoácidos preservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , o b) por la proteina Q en la forma aislada o combinada con un adyuvante fisiológico por la ruta intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o animal, de leishmaniasis formada: a) por la proteina Q, o una variante de esta proteina que contiene modificaciones o substituciones de aminoácidos preservados, combinados con la proteina LiHsp70, completa o fragmentada, administrada a un sujeto (humano o animal) , o b) por la proteina Q en la forma aislada o combinada con un adyuvante fisiológico por la ruta intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o animal, de Leishmaniasis, formada: a) por cualquier vector de ADN que lleva la secuencia que codifica para la proteina Quimera Q, o una variante de esta secuencia que contiene modificaciones o substituciones de nucleótidos que codifican para los aminoácidos preservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , o b) por un vector de ADN que contiene la proteina Q combinada con un adyuvante fisiológico, administrada por la ruta intraperitoneal, intramuscular o subcutánea. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o animal, de leishmaniasis, formada: a) por un vector de ADN que lleva: 1) la secuencia que codifica para la proteina Quimera Q, o una variante de esta secuencia que contiene modificaciones o substituciones de nucleótidos que codifican para los aminoácidos preservados, y 2) la secuencia de nucleótidos que se codifican para la proteina LiHsp70 o variantes de la misma que difieren con respecto a los aminoácidos preservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , o b) por cualquier vector que contiene la secuencia de ADN que se codifica por la proteina Q como se define bajo a) administrada con un adyuvante fisiológico por la ruta intraperitoneal, intramuscular o subcutánea. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica de la invención comprende anticuerpos dirigidos a la proteina codificada por el gen quimérico de la invención, o partes de la misma. Las preparaciones farmacéuticas de la invención pueden contener además todos los adyuvantes conocidos, solventes, soluciones amortiguadoras, etc., conocidos per se para las composiciones farmacéuticas y/o vacunas.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de Leishmaniosis, usando una composición farmacéutica o una vacuna de acuerdo con la invención, o una preparación que comprende anticuerpos dirigidos contra la proteina codificada por el gen quimérico de la invención. Este método ^generalmente comprenderá la administración de una substancia activa dirigida contra el gen quimérico o la proteina a un ser humano o animal, tal como un perro, en una cantidad farmacéuticamente activa. Para la prevención de Leishmaniasis, una vacuna que comprende la proteina codificada por el gen quimérico, o que codifica una o más partes de la proteina que comprende uno o más de los determinantes antigénicos, será administrada a un ser humano para producir una respuesta inmune protectora. La administración de las preparaciones, anticuerpos y/o vacunas de la invención, se puede realizar de una manera conocida per se, tal como oralmente, intramuscular, intravenosa, subcutánea, por (goteo) infusión, etc. Preferiblemente, la preparación o una vacuna es inyectada, mientras que con una preparación de anticuerpo, se puede usar una infusión.

Se deberá señalar que cuando aqui, se hace referencia al gen quimérico de la invención, este término también abarca las secuencias de ácido nucleico que pueden producir hídridos con la secuencia mencionada posteriormente bajo condiciones de hibridación moderadas o estrictas. En este contexto, las condiciones de hibridación heterólogas pueden ser como sigue: hibridación en 6 x SSC (20xSSC por 1000 ml : 175.3 g de NaCl, 107.1 g de citrato de sodio.5H20, pH 7.0), 0.1% de SDS, 0.05% de pirofosfato de sodio, 5* de solución de Denhardt (100 x solución de Denhardt por 500 ml : 10 g Ficoll-400, 10 g de polivinilpirrolidona, 10 g de Albúmina de Suero de Bovino (Pentax Fraction V) y 20 µg/ml de ADN de esperma arenque desnaturalizado a 56°C por 18-24 horas seguido por dos lavados de 30 minutos en 5 x SSC, 0.1% de SDS a 5ß°C y dos lavados de 30 minutos en 2 x SSC, 0.1% de SDS a 56°C. Por ejemplo, las secuencias que pueden formar híbridos con la secuencia mencionada posteriormente incluyen secuencias de ADN mutantes las cuales codifican las proteinas con la misma función biológica como la proteina codificada por la secuencia mencionada posteriormente. Tales secuencias mutantes pueden comprender una o más anulaciones, substituciones y/o adiciones de nucleótidos a la secuencia mencionada posteriormente. Preferiblemente las secuencias mutantes aún tienen al menos 50%, en forma más preferible al menos 70%, en forma aún más preferible 90% de homología del nucleótido con la secuencia dada aqui posteriormente. El término gen quimérico como se usa aqui también abarca secuencias de ácido nucleico que comprenden una o más partes de la secuencia mencionada posteriormente. Preferiblemente, tales secuencias comprenden al menos 10%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 50% de la secuencia del nucleótido dada posteriormente. Tales secuencias pueden comprender un fragmento contiguo de la secuencia mencionada posteriormente, o dos o más fragmentos de la secuencia dada posteriormente que se han combinado en y/o incorporado en una secuencia de ADN sencilla. Deberá ser notado que cuando aqui, la referencia se hace a una proteina codificada por el gen quimérico de la invención, este término también incluye proteinas mutantes que aún esencialmente tienen la misma función biológica. Tales proteinas mutantes pueden comprender una o más anulaciones, substituciones y/o adiciones del aminoácido comparadas con la proteina codificada por la secuencia mencionada posteriormente. Preferiblemente, las proteinas mutantes aún tienen al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente más de 90% de homología de aminoácido con la secuencia dada posteriormente. El término proteina también abarca fragmentos de la proteina codificada por el gen quimérico de la invención. Tales fragmentos preferiblemente aún muestran la actividad biológica de la proteina completa. Preferiblemente, tales proteinas comprenden al menos 30%, más preferiblemente al menos 50% de la secuencia de aminoácido de la proteina completa. También, dos o más fragmentos de la proteina completa codificada por el gen quimérico de la invención se pueden combinar para formar una proteina sencilla. Más específicamente, la invención se refiere a un gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro proteinas de L. infantum, que codifica una proteina útil para los propósitos farmacológicos, en particular para la prevención y/o tratamiento de Leishmaniosis, en particular Leishmaniosis canina, y obteniendo el producto final o la construcción del gen quimérico que codifica un polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos seleccionados, caracterizado porque usa una estrategia de clonación en la -cual el clon que expresa la proteina rLiPo- Ct-Q se usa como un vector inicial, y a este vector, por medio del uso de los sitios de restricción adecuados, fragmentos de ADN son agregados secuencialmente que codifican la proteina LiP2a-Q, LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q, LÍH2A-Nt-Q, y después cada paso de la clonación de la orientación correcta de cada una de las inserciones se deduce y el tamaño de los productos de expresión, la secuencia completa deducida de los aminoácidos de la proteina de fusión final, pPQV, expresada en el vector pMal es: MBP IEGRP TP SAKIAVRKSGSKSAKCGLIFPVGRVGGMMJlRsYARRisA 50 SGAPS:*"=y*""FSW^ 140 PNISKAyA'-CK'^^ 157 VEAGCKAVHIDVDQATLAFVMESVTGRI-)f?7?.T IAEGAAKMSAMPAA.SSGAAA.sV 11 T^SAAGDAAPAAAAA.GDEPEE]"""APDDM 2 €5 SI,AGAC--AGAV-A.'a*. 374 EDDFGMGGLP (SEQ ID NO.3) La invención también se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos o animales, de Leishmaniasis formada: a- por la proteina Quimera Q, o una variante de esta proteina la cual contiene modificaciones o substituciones de los aminoácidos conservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , ambas b- en forma aislada o junta con cualquier adyuvante fisiológico via las rutas intraperitoneal, subcutánea o intramuscular . También, la invención se refiere a una vacuna capaz de estimular la producción de anticuerpos los cuales reconocen el parásito de Leishmania, formada a- por la proteina Quimera Q o una variante de esta proteina la cual difiere de la proteina Q en aminoácidos conservados, administrada a un sujeto (humano o animal), ambas b- en forma aislada o junta con cualquier adyuvante fisiológico via las rutas intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Otro aspecto de la invención comprende una composición farmacéutica perra la prevención y tratamiento, en humanos o animales, de Leishmaniasis formada: a- por la proteina Q, o una variante de esta proteina la cual contiene modificaciones o substituciones de aminoácidos conservados, unidos a una proteina LiHsp70, completa o fragmentada, administrada a un sujeto (humano o animal) , ambas b- en forma aislada o junta con cualquier adyuvante fisiológico via las rutas intraperitoneal, subcutánea o intramuscular . Una composición farmacéutica adicional de la invención para prevención y tratamiento, en humanos o animales, de Leishmaniasis se puede formar: a- por cualquier vector de ADN que porta la secuencia la cual codifica la proteina Quimera Q, o una variante de esta secuencia la cual contiene modificaciones o substituciones de nucleótidos la cual codifica para los aminoácidos conservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , ambas, b- por las rutas intramuscular o subcutánea. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos o animales, de Leishmaniasis formada : a- por un vector de ADN que porta 1- la secuencia la cual codifica la proteina Quimera Q, o una variante de esta secuencia la cual contiene modificaciones o substituciones de nucleótidos los cuales codifican para los aminoácidos conservados, y 2- la secuencia la cual codifica la proteina LiHsp70, o variantes de la misma la cual difiere de los aminoácidos conservados, administrada a un sujeto (humano o animal) , ambas, b- por las rutas intramuscular o subcutánea o intramuscular .

La invención también se refiere a una secuencia de nucleótido y a una proteina útil para los propósitos farmacológicos, en particular para ~~ la prevención y/o tratamiento de Leishmaniosis, en particular Leishmaniosis canina, que tiene la secuencia de ADN y aminoácido como se muestra posteriormente expresada en el vector PQ31. La secuencia de aminoácido contiene un fragmento del vector (AA 1-37) . El resto de la secuencia de aminoácido es idéntico a aquel de la SEQ ID NO 3 excepto en la porción MBP y los primero siete aminoácidos (AA 1-7) : 1 45 ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Met. Arg Gly Ser Hxs His His KAS His His Thr Asp Pro Hxs Ala 5 10 1S 46 90 AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asri Asn Asn A_3n Asn Asn Asn Asn Leu Gly lie 20 25 30 91 135 GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTC Glu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys "Lys Ala Val 35 40 45 136 1B0 CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCG Arg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala It s Cy» Gly Leu llß Phß Pro 50 55 60 181 225 GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGC val Gly Arg Val Gly Gly Hst Mßt Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg 65 70 75 226 270 CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTG Arg He Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg llß Ser Glu Phß Ser Val 80 85 90 271 315 AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCG Lys Ala Ala Ala Gln Ser Gly Lya Lys Arg Cys Arg Lau Aan Pro 95 100 105 316 360 CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACG Arg Thr Val Met eu Ala Ala Arg Hxs Asp Asp Asp llß Gly Thr 110 115 120 361 405 CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC ACC GGC GTT GTG CCG AAC Leu Lau Lys Aan Val Thr Leu Ser His Ser Gly Val Val Pro Asn 125 130 135 406 450 ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAG l a Sar Lys Ala Met Ala Lys Lys Lya Gly Gly Lys Lys Gly Lys 140 145 150 391 495 SCG ACA CCG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATS TCC Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Pha Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser 155 160 165 496 54G ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala eu Ala Ser Leu Ser Lys Ala 170 175 180 541 585 TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC Sar Pro Ser Gln Ala Aap Val Glu Ala lie Cys Lys Ala Val His 185 190 X95 59S 630 ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTT llß Aap Vaa Asp Gln AXa Thr Leu Ala Phß Val Mat Glu Ser Val . 200 205 210 641 675 ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAG Thr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu ?lß Ala Glu Gly Ala Ala Lys 215 220 225 676 720 ATG AGC GCG ATG CCG SCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC Mßt Ser Ala Mßt Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val 230 235 240 721 765 ACT GCT TCC GCT GCß GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG sly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro 245 250 255 766 810 AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Tfcx Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Aap Asp Asp Met Gly Pro 260 Z65 270 811 855 TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC S ß St=r Arg Val Aßp Pro Mßt ßln Tyr Leu Ala ?la Tyr Ala Leu Val 275 280 285 856 900 GCG CTG TCT GßC A?G ACG CCG TCG AAß GCG GAC GTT CAG GCT GTC Ala Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala ASP Val Gln Ala Val 290 295 300 901 945 CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTß GAT GCC Leu Lys Ala Ala Gly Val Ala Val Aßp Ala Ser Arg Val Asp Ala 305 315 315 946 990 GTC TTC CAG GAS GTG GAG GGC AAß AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC Val Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala 320 325 330 991 1035 GAG GGC CS ACG AAG CTO GTG GßC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCT Glu Gly Arg Thr Lys Leu Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala 10 33S 340 345 1036 1080 GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAG Gly Ala Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu 350 3S5 360 1081 1125 GCG AAG AAG GAS GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATG Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met 365 37C 375 1136 1170 GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCT 15 Gly Pro Val Asp Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro 380 365 390 1171 1215 AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG' GAC GAC Ser Ala Ala Ala Lya Glu Glu Pro ßlu Glu Ser Asp Glu Asp Asp 395 400 405 TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT 1256 Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe 410 412 1257 AGCCTCCTTG TGGTGCGCTG GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306 20 1307 TGTTGGCTGA CTC?GGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356 1357 CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406 1407 AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEQ ID NO.l y SEQ ID NO.2) o un mutante o fragmento del mismo que se puede usar para generar una respuesta inmune protectora en un humano o animal contra la Leishmaniosis, y a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos o animales, -de Leishmaniasis, "que comprende esta proteina o un mutante o fragmento de la misma se puede usar para generar una respuesta inmune protectora en un humano o animal contra Leishmaniosis. Esta proteina se deriva de la inserción del gen PQV en el vector de -expresión pQE31. Aqui dicho gen quimérico preferiblemente codifica un polipéptido generado con un peso molecular de 38 kD y un punto isoeléctrico de 7.37. También, la invención se refiere a una vacuna capaz de estimular la producción de anticuerpos los cuales reconocen el parásito de Leishmania, que comprende la proteína mencionada anteriormente o un mutante o f agmento de esta que se puede usar para generar una respuesta inmune protectora en un humano o animal contra Leishmaniosis.

Un aspecto adicional de la invención abarca una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos o animales, de Leishmaniasis, que comprende anticuerpos dirigidos contra la protei?a mencionada anteriormente o un mutante o fragmento de la misma, preferiblemente conteniendo uno o más determinantes antigénicos tal como un epitope. La invención se refiere adicionalmente a un método para la prevención o tratamiento de Leishmaniosis en un humano o animal, que comprende la administración a un humano o animal de una composición farmacéutica como se describió anteriormente, o a un método para la prevención de Leishmaniosis en un humano o animal, que comprende la administración al humano o animal de una vacuna como se describió anteriormente. El gen quimérico formado de las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L. infantum y la proteína obtenida, útil para la prevención y/o tratamiento de Leishmaniosis, que la invención propone, en su propia dirección constituye una novedad obvia dentro de su aplicación, de acuerdo con la invención, un gen quimérico sintético es producido tal como es obtenido por agrupamiento, conteniendo la región de ADN que codifica los determinantes antigénicos específicos para las proteinas LiP2a, LiP2b, LiPO y H2A, así construyendo una proteína rica en determinantes antigénicos. El gen quimérico obtenido es expresado en Escherichia Coii y el producto se ha analizado con respecto a sus propiedades antigénicas. Los resultados confirman que esta proteína quimérica mantiene todos los determinantes antigénicos de las proteinas principales y que constituye un elemento farmacéuticamente útil, relevante para la VL canina, con una sensibilidad que oscila entre 80% a 93%, y una especificidad de entre 96% a 100%. Más particularmente, el gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de las cuatro proteinas de L. infantum y la proteína codificada por esta, útil para la prevención y/o tratamiento de Leishmaniosis canina y la proteina obtenida, objeto de esta invención, se produce por medio de las siguientes etapas, específicamente: Construcción del gen quimérico. Metodología. Estrategia de clonación. Clonación de las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de la proteína H2A histona.

Clonación de las secuencias que codifican la rLiP2a-Q y la rLiP2b-Q. Clonación de la secuencia rLiPO-Q. Clonación del gen quimérico. Construcción del gen quimérico de la construcción de los productos intermediarios. Clonación de epitopes específicos a los antígenos a L. infantum. Construcción del producto final Construcción del gen quimérico que codifica a un polipéptido que contiene todas las determinantes antigénicas seleccionados . - expresión de manera opcional de la secuencia así obtenida. - Evaluación del producto final. Suero. Purificación de proteinas Electroforesis de proteínas e inmuno-análisis. Mediciones por Fast-Elisa Evaluación del producto final. Propiedades antigénicas. Sensibilidad y especificidad de la proteina quimérica CP en la diagnosis del suero de canino VL .

La estrategia seguida por la clonación de las secuencias de ADN que codifican a cada una de las determinantes antigénicas seleccionadas es la misma en todos los casos, y en una primera etapa, la secuencia de interés es amplificada por medio de un PCR y el uso de oligonucleótidos específicos que contienen objetivos para las enzimas de restricción en los extremos. Para el paso de clonación, el producto amplificado se dirige por medio de la enzima de restricción apropiada y se inserta en el sitio de restricción correspondiente del plásmido pUC18. Después del secuenciamiento del ADN, el inserto se recupera y se sub-clona al sitio correspondiente de restricción del plásmido modificado denominado pMAL-c2. La modificación se hace al insertar un codon de determinación corriente abajo del HindIII objetivo en el polienlazador de pMal-c2, denominando el plásmido resultante pMal-c2*. Respecto a la secuencia de clonación de ADN que codifica las determinantes antigénicas de la proteina histona H2A, se debe anotar que el cADN del clon cL71, que codifica la histona H2A de L. infantum, se usa como una plantilla para las reacciones de PCR y para la amplificación del ADN, que codifica la región N-terminal de la histona H2A, más exactamente rLiH2A-Nt-Q, se usan los siguientes oligonucleótidos: sentido 5' -CCTTTAGCTACTCCTCGCAGCGCCAAG-3' (posición 84-104 de la secuencia cL71) ; antisentido 5'CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG-3' (inverso y complementario a la posición 204-224 de la secuencia cL71. Las secuencias que están incluidas en los oligonucleótidos para la clonación y que no están presentes en la secuencia original cL-71 se marcan en negritas. El fragmento de ADN amplificado se clona directamente desde el sitio de restricción Xmnl de pMAI-c2*. El fragmento es secuenciado por medio del iniciador #1234 malE y la región C-terminal antigénica de la histona H2A, en particular rLiH2A-Ct-0, se amplifica con los siguientes nucleótidos . Estos son: Sentido, 5' -GAATTCTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG-3' (posición 276-296 de la secuencia cL71) . Antisentido, 5' -GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCCTTGCC-3' (inverso y complementario a las posiciones 456-476 del plásmido cL71). Un triplete que codifica a la prolina (se indica como GGG después de las letras subrayadas) se incluye en el oligonucleótido antisentido, el sitio de restricción EcoRI que se incluye en ambos oligonucleótidos para la clonación se indica con subrayado. Con respecto a la clonación de las secuencias que codifican rLiP2a-Q, se debe anotar que las regiones de interés se amplifican por PCR de cADNs que codifican a LiP2a y LiP2b. Los oligonucleótidos que se usan para construir el clon de expresión LiP2a-Q, son los siguientes: •Sentido, 5 ' GTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC-3' . Anti-sentido, 5' -GJCGACGGGGCCCATGTCATCATCGGCCTC-3 ' . Se debe anotar que los sitios de restricción Salí agregados a los extremos 5' de los oligonucleótidos se han subrayado. Cuando se construye el clon de^expresión LiPb-Q, el oligonucleótido que usado es: Sentido, 5 ' -TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGCC-3' . Anti-sentido, TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGCCCTC-3' . En los extremos del 5' de los oligonucleótidos, los sitios de restricciones se incluyen por la enzima Xbal (subrayada) y debido a las necesidades de clonación, un triplete adicional, que codifica un residuo de prolina, se incluye corriente abajo del sitio de restricción.

Con respecto a la clonación de la secuencia rLiPO- Q, debería anotarse que la clonación de la secuencia de ADN de la región C-terminal de la proteína PO de L. infantum se lleva a cabo por la amplificación de un clon de cADN llamado L27 y los siguientes oligonucleótidos: Sentido 5' -CTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCC-3' (posiciones 1-24 del cADN L27) y el iniciador de la secuencia pUC18 (#1211), el ADN amplificado se dirige por las enzimas PstI+HindIII, con inserción posterior en el plásmido pMAL-c2. El clon resultante se denomina pPQI y se debe notar que el sitio de restricción PstI se incluye en el nucleótido con sentido (secuencia subrayada) y que el objetivo de restricción está presente en el cADN L27. Con respecto a la clonación del gen quimérico, se debe anotar que las secuencias de ADN que codifican las 5 determinantes antigénicas se agrupan en un gen quimérico y este agrupamiento se lleva a cabo en el clon pPQI, al cual las regiones de codificación para las regiones antigénicas LiP2a-Q se agregan secuencialmente en la dirección 3' (llamado el resultado de la clonación pPQII), LiP2b-Q (clon pPQIII) , LiH2a-Ct-Q (clon pPQIV) y LiHa2A-Nt-Q (clon pPQV) .

Finalmente, el inserto obtenido después de la digestión SacI+HindIII del clon final pPQV, se inserta en el plásmido de expresión pQE31, llamado el clon resultante pPQ.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS.

Para completar la descripción que se hace y con el objetivo de ayudar a la comprensión de las características de la invención, la presente descripción se acompaña, como una parte integral de la misma, por una serie de gráficas de naturaleza ilustrativa que no están limitados. Se representan los siguientes: Fig. la - Id Corresponden a la expresión (A), purificación en columnas de amilosa (B) y la antigenicidad (C: Manchado Western; D: ELISA) de cada una de las proteínas recombinantes fusionadas a la proteína ligada a la maltosa. La figura debajo de la D presenta también la reactividad en ELISA de cada una de las proteínas recombinantes con relación a la proteina completa. Fig. 2. Representación gráfica de los diferentes vectores considerados para obtener el gen quimérico objeto de la invención, del cual se extraerá la proteína pertinente destinada para llevar a cabo un diagnóstico exacto en animales o seres humanos que muestran síntomas de Leishmaniosis. — Fig. 3. Corresponde a la identificación de la proteína obtenida del gen quimérico fusionado a la proteína MBP, la preparación del cual se representa en la figura 2. Fig. 4a - 4f Corresponden a la expresión (A), purificación en columnas de amilosa (B) y la antigenicidad (manchado Western; F: ELISA) de los intermediarios y de la proteína quimérica final fusionada a la proteina ligada a la maltosa (PQI-PGV) . La figura representa también la expresión de la proteína quimérica (D linea 1) , purificación en columnas de agarosa Ni-Nt (D línea 2) y la antigenicidad de la proteína purificada contra el suero VL (E: manchado Western) y contra una colección de sueros (F: PQ en ELISA) . Fig. 5. Muestra finalmente una representación gráfica sintetizada de la reactividad de un amplia variedad de sueros caninos, divididos en tres grupos. El primer grupo contiene animales con infección real de L. infantum. El segundo grupo incluye suero obtenido de perros con varios síntomas clínicos pero que no están infectados con Leishmania y el tercer grupo está hecho de quince sueros de control de perros saludables. Esta figura demuestra el valor de la invención para llevar a cabo la diagnosis serológica de VL.

MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN.

El gen quimérico formado de las secuencias de ADN que codifican a las determinantes antigénicas de cuatro proteínas de L. infantum, usadas para la diagnosis serológica de la Leishmaniosis canina y la proteína obtenida que está siendo propuesta, están constituidos de la construcción de los productos intermedios . En un primer ejemplo, se lleva a cabo la clonación de epitopes específicos a los antígenos de L. infantum, el cual se configura sobre la base de estudios recientes a las propiedades antigénicas de cuatro proteínas antígenos de L. infantum (LiP2a, PiPO, LiP2b, LiH2a) , las cuales permiten la existencia de epitopes B para definirse por estas proteínas y las cuales son específicamente reconocidas por los sueros caninos de VL. Con una visión para mejorar la especificidad antigénica de estos antígenos con respecto a las proteínas de L. infantum, las determinantes antigénicas específicas son reproducidos de estas proteínas. Después de suprimir ciertas regiones de estas proteínas, se podrán reconocer por el suero de animales que son portadores de VL y otros padecimientos diferentes . - Al usar los oligonucleótidos específicos y la amplificación por PCR de las regiones específicas a los genes LiP2a, LiP2b, PO y H2A, se construyen diversos clones que expresan a las proteinas recombinantes rLiPO, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLi2A-Ct-Q y rLiH2A-Nt-Q, se han detallado solo en la descripción de la invención refiriéndose a la metodología, donde se describen los detalles de la clonación. Las proteínas .recombinantes que se usan son las siguientes : rLiPO-Ct-Q, la cual corresponde a los residuos de la C-terminal 30 de la proteína ribosomal LiPO. rLiP2a-Q y rLiP2b-Q, que se deriva de las proteínas riboso ales LiP2a y Lip2b respectivamente. Dos sub-regiones de la histona H2A que corresponde a los 46 residuos del N-terminal (xLiH2A-Nt-Q) , y a los 67 residuos del C-terminal (xLiH2A-Ct-QJ . Cada una de las proteínas recombinantes" fusionadas a la proteína ligada a la maltosa (MBP) están expresadas en E. Coli, como se representa en la Figura número ÍA, y se purificaron por cromatografía de afinidad en una columna B de amilosa. Después los procesos de electroforesis de purificación se llevaron a cabo en las proteinas recombinantes (lineas 1 a 5) . Con el objetivo de analizar si las proteinas recombinantes fueron reconocidas por los sueros caninos VL, se incubó un manchado Western, conteniendo las proteínas recombinantes en una mezcla de tres sueros caninos VL. Dado que todas estas proteínas son reconocidas por los sueros, se concluye que todas las determinantes antigénicas presentes en las proteínas de origen, se mantienen en las proteínas recombinantes (C) . Las propiedades antigénicas de las proteinas recombinantes se comparan con las determinantes antigénicas de los antigenos de origen por medio de una FAST ELISA, probando contra una colección de 26 sueros caninos VL, solo como se muestra en la sección de la Figura ID y el hecho de que los sueros muestran un valor de reactividad similar, ambos contra las regiones antigénicas seleccionadas y las proteínas completas correspondientes, demuestran que no ocurre una alteración al epitope antigénico durante el procedimiento de clonación. 3 Con respecto a la construcción del producto final, más exactamente del gen quimérico - que codifica un polipéptido que contiene todas las determinantes antigénicas seleccionadas, se deberá anotar que la 'estrategia de clonación se indica siguiendo la Figura 2 sección A. Se muestran los productos intermedios generados durante el proceso. 'Un clon que expresa las proteínas rLiPO-Ct-Q (pPQI) se usa como el vector inicial y los fragmentos de ADN que codifican a las proteínas rLiPO-Ct-Q, rLiP2A-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q y rLiH2A-Nt-Q se agregan secuencialmente usando sitios de restricción apropiados. Después de cada paso de clonación, la orientación correcta de cada uno de los insertos se deduce del tamaño de los productos de expresión y finalmente se determina la secuencia del nucleótido completa del clon final pPQV y la secuencia de amino ácido deducida de la secuencia representada en la Figura 3. El polipéptido generado tiene una masa molecular de 38 kD, con un punto isoeléctrico de 7.37, incluyendo prolina que codifica a las secuencias separadoras, subrayadas en la Figura número 3. El objetivo de hacer esto es separar eficientemente los dominios antigénicos y prevenir posibles confirmaciones terciarias que pudieran interferir con la estabilidad y antigenicidad del producto final. La expresión y recuperación de cada uno de los productos intermedios se muestra en la Figura 4, cuadros A y B. Como se esperaba, después de cada adición, el tamaño del producto de expresión en el vector pMAL se incrementa gradualmente hasta alcanzar un peso molecular de 80 kDa, observando un cierto grado de ruptura durante la purificación. Se clonó también el gen quimérico en el plásmido pQE, un vector que permite la expresión de proteínas con un fragmento de 6 histidinas en el extremo del N-terminal. El clon resultante y las proteínas recombinantes se denominan pPQ y PQ respectivamente. El nivel de expresión de la proteína en la bacteria transformada con el plásmido pPQ y las proteínas purificadas se muestran en la Figura número 4, referidas en particular con una D, con la proteína PQ, purificada por cromatografía de afinidad en condiciones de desnaturalización es mas estable que la proteina recombinante pPQV que se representa en la Figura número 4, en el cuadro D linea 2.

Debido a la evaluación del producto final, se usaron una serie de materiales y obviamente algunas técnicas, como las descritas abajo. Se usaron sueros de VL que se obtuvieron de perros de orígenes diversos. Los animales se evaluaron clínica y analíticamente en el laboratorio pertinente, generalmente en un Departamento de Parasitología y todos los sueros positivos se ensayaron por la inmuno-fluorescencia indirecta (IIF) . La presencia de amastigotos de los parásitos de estos animales se confirmó por observación directa de los nudos linfáticos popliteales y pleescapulares y un segundo grupo de 33 sueros de VL originarios de otras regiones, dieron un diagnóstico positivo en la Elisa contra los extractos de proteína total del parásito y/o por IIF. Los sueros de perros afectados por los diferentes padecimientos que no fueron VL, se obtuvieron de diferentes orígenes. Dentro de este grupo de sueros se encuentran las siguientes infecciones: Mesocestoides spp. Dyphylidium caninum. Uncinaria stenocephala . Toxocara canis.

Dipetalomena dranunculoides. Demodex canis. Babesia canis. Ricketsia ricketsiae. El resto de los sueros se obtuvieron de perros que mostraron varios síntomas clínicos que no se relacionaron con ningún proceso infeccioso y los controles de suero se obtuvieron de quince animales saludables cuidadosamente controlados . La purificación de las proteinas recombinantes expresadas por los clones pMAl-c2 se lleva a cabo por cromatografía de afinidad sobre columnas de amilosa y la purificación de la proteína recombinante que se -expresa por el clon pPQ se realizó sobre columnas de resina Ni-NTA en condiciones de desnaturalización (Qiagen) . Para analizar las proteínas, la electroforesis en geles de poliacrimida al 10% en la presencia de SDS se llevo a cabo bajo condiciones normales. Los análisis inmunológicos de las proteinas separadas por electroforesis se llevaron a cabo sobre membranas de nitrocelulosa a las cuales las proteínas se han transferido. Se bloquearon las proteínas transferidas con leche descremada seca al 5% en un amortiguador de PBS con Tween 20 al 0.5%.

Se trajeron los filtros secuencialmente al contacto con anti-sueros primarios y secundarios en soluciones bloqueadoras y se usó un inmuno-conjugado etiquetado con peroxidasa como segundo anticuerpo, visualizando el enlace específico por medio de un sistema ECL. La Figura 4E muestra un manchado Western de proteína PQ. La Fast-Elisa se usa en lugar de la ELISA clásica y la sensibilización de un antigeno se llevó a cabo por 12 horas a temperatura ambiente. Las plaquetas se sensibilizaron con 100 µl de antígeno cuya concentración en todos los casos fue de 2 µg/ml. Después de la sensibilización los pozos las placas se incubaron por 1 hora con solución bloqueadora (0.5% leche descremada en polvo disuelta en PBS - 0.5% Tween 20 y los sueros se diluyeron en tres cientos partes en solución bloqueadora) . Los pozos se incubaron con suero por 2 horas a temperatura ambiente, y después de la exposición al anticuerpo, los pozos se lavaron con PBS-Tween 20. Los anticuerpos etiquetados con peroxidasa se usaron como segundos anticuerpos en una dilución 1:2000 y se desarrolló un color de la reacción al usar el substrato ortofenilendamina, midiendo la absorción a 450 nm. Con respecto a la evaluación del producto final, se debería anotar que las propiedades antigénicas se determinaron por medio del estudio pertinente de la reactividad de los sueros caninos VL contra la proteína quimérica y contra cada uno de los productos intermedios en un ensayo de "manchado Western" . Todos los productos intermedios mantuvieron su antigenicidad así también como lo hizo el producto final pPQV, a través del proceso entero de clonación (Fig. 4c) . Deberá anotarse también que la proteina recombinante que se expresa por el plásmido pPQ se reconoció por los sueros VL. Con una visión para analizar con mayor precisión las propiedades antigénicas de la proteina quimérica y los productos intermedios, un análisis de la reactividad de una amplia variedad de sueros caninos VL se realizó por medio de una Fast-Elisa contra las proteínas recombinantes, como se muestra en la sección F de la Figura número 4. Se puede resaltar que la sensibilidad de los diferentes productos intermedios de clonación se incrementan después de cada paso de adición. Se deberá anotar también que la proteína pQI se reconoce por la mayoría de los sueros VL y la proteina pQII igualmente por la mayoria de los sueros. Esta proporción es mayor para la proteína PQIII y las proteínas PPQIV, PQV y PQ son reconocidas por prácticamente todos los sueros. De acuerdo a lo que se ha discutido arriba, el porcentaje de reconocimiento mostrado por los sueros fue similar en ambos en el caso de ensayo de las proteinas quiméricas PQV y PQ y del ensayo de una mezcla de proteínas recombinantes rLJPO-Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b y rLiH2A. Se vio que las propiedades antigénicas de cada una de las 5 regiones antigénicas seleccionadas están presentes en el producto de expresión PQ y por lo tanto este producto se puede usar para la diagnosis en lugar de una mezcla de los antigenos individualmente expresados. Con un vistazo para determinar si la proteina quimérica se puede usar para la diagnosis de suero canino VL y de acuerdo al análisis pertinente de una amplia variedad de sueros caninos contra esta proteína, tener en mente que de acuerdo a las características clínicas de los animales, el suero canino se ha clasificado en tres grupos. Un primer grupo que consiste en sueros de perros con infección real de L. infantum. Un segundo grupo se compuso de sueros de perros que tuvieron síntomas clínicos diversos sin estar infectados con Leishmania, incluyendo "perros infectados con diferentes parásitos y que podían exhibir síntomas clínicos que pudieran ser confusos con las observadas durante la Leishmaniosis . El tercer grupo se hizo de sueros de control, originados de perros saludables. En la Figura número 5 los valores promedio de reactividad se muestran para cada grupo de sueros, la reactividad de los sueros VL alcanzan un valor promedio de reactividad de 0.8 (S.D. = 0.4). Dentro de este grupo la reactividad de 12 sueros fue positiva pero menor que 0.35, mientras la reactividad de 10 sueros alcanzó valores de entre 0.35 y 0.5. Se observó que la reactividad de 23 sueros verían entre 0.5 y 1.0, con 14 sueros se mostró una reactividad mayor a 1.0. El valor promedio de la absorción de los sueros del segundo grupo, que se dice, el grupo infectado con parásitos diferentes a los parásitos de la Leishmania, es de 0.2 (S.D. = 0.05) y la reactividad de los sueros de control, que se dice, el tercer grupo, es de 0.1 (S.D. 0 0.003). Solamente dos sueros del grupo 2 mostraron reactividad entre 0.35 y 0.40.

Los datos presentados arriba indican que la proteína quimérica PQ en el FAST ELISA, tienen una sensibilidad de 80% para la diagnosis VL, si el valor de corte se define como el valor promedio de reactividad de los sueros del grupo 2 mas tres S . Ds . (que se dice es 0.35) . La sensibilidad del grupo ensayado alcanzó 93%, si el valor de corte se define por Jos valores de reactividad del grupo de control. La proteína Q tiene una especificidad de 96% para la diagnosis VL, cuando el valor de corte se define por los sueros del grupo 2 antes mencionado. El 100% de especificidad en el ensayo se alcanzó cuando se consideraron los valores de reactividad de perros saludable. El proceso a ser usado es el siguiente: 1-- Las placas microtituladoras se cubren con anticuerpos por 100 µl incubados de una solución que contiene Iµg/ml de antigeno disuelto en un amortiguador PBS -Tween 20 al 0.5%- leche descremada al 5% (Amortiguador A). La incubación se realiza por 12 horas a temperatura ambiente y después las placas se lavan 3 veces con el mismo amortiguador que no contiene antígeno. Las placas secas antigenadas se podrán mantener a temperatura ambiente. 4 2.- Se llevó a cabo una primera incubación de los pozos con el suero del animal en una dilución de 1/200 en un amortiguador A. La incubación duró 1 hora. 3.- Los pozos se lavaron con un amortiguador A, como se describe en el punto 1, tres veces con un matraz de lavado. 4.- Se incubaron con un segundo anticuerpo (IgG etiquetado con peroxidasa) diluido 1:2000 en un amortiguador A, la incubación se lleva a cabo por 1 hora. 5.- Los pozos se lavaron una vez más con el Amortiguador A tres veces, como se indica en la tercera sección, como se dice con un matraz de lavado. 6.- La reactividad se reveló usando el substrato orto-fenilendiamina y la absorción se midió a 450 nm. Se identifica la proteina usada para la diagnosis extraída del gen quimérico y la secuencia de nucleótido que codifica a dicha proteína, es como sigue: 1 45 ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Mßt Arg Gly Ser Eis His His His His His Thr Asp Pro His Ala 5 10 15 46 90 AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Xle 20 25 30 91 135 4 GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTC Glu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val 35 40 45 136 180 CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCG Arg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu He Phe Pro 50 55 60 181 225 GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGC Val Gly Arg Val Gly Gly Mßt Met Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg 65 70 75 226 270 CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTG Arg He Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg He Ser Glu Phe Ser Val 80 85 90 271 315 AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCG Lys Ala Ala Ala Gln Ser Gly Lys Lys ?rg Cys ?rg Leu ?sn Pro 10 95 100 105 316 360 CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACG Arg Thr Val Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp He Gly Thr 110 115 120 361 405 CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC AGC GGC GTT GTG CCG AAC Leu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser Kis Ser Gly Val Val Pro ?sn 125 130 135 406 450 ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAG 15 Xle Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys 140 145 150 391 495 GCG ACA CCG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATG TCC Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser 155 160 165 496 540 ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys ?la 170 175 180 20 541 585 TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC Ser Pro Ser Gln Ala Asp Val Glu Ala Xle Cys Lys Ala Val His 185 190 195 596 630 ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTi GTG ATG GAG AGC GTT lie Asp Val Asp Gln Ala Thr Leu Ala Phß Val Met Glu Ser Val 200 205 210 641 675 ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAG Thr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu He Ala Glu Gly Ala Ala Lys 215 220 225 676 720 ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val 230 235 240 721 765 ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG Gly Asp Ala ?la Pro ?la ?la ?la Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro 245 250 255 766 810 AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Thr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp ?sp ?sp Met Gly Pro 260 265 270 811 855 TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTG Ser Arg Val Asp Pro Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val 275 280 285 856 900 GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTC Ala Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala ASP Val Gln ?la Val 290 295 300 901 945 CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCC Leu Lys Ala Ala Gly Val Ala Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala 305 315 315 946 - _ 990 GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC Val Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys Ser Phe ?sp ?la Leu Val ?la 320 325 330 991 1035 GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCT Glu Gly Arg Thr Lys Leu Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala 335 340 345 1036 ? 1080 GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAG Gly ?la Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu 350 355 360 1081 1125 GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATG Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu ?la ?sp ?sp ?ßp Met 365 370 375 1136 1170 GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCT Gly Pro Val ?sp Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ala Pro -Ala ?la Pro 380 385 390 1171 1215 AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC Ser Ala Ala Ala Lyß Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp ?sp 395 400 405 TTC GGC ?TG GGC GGT CTC TTC T?AGCGACTC GCCATCTCTT 1256 Phe ßly Mßt Gly Gly Leu Phe 410 412 1258 AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306 1307 TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356 1357 CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TC?TCGAGGG 1406 1407 ??GTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEC ID NO. 1 y SEC ID NO. 2 ] Esto no se considera necesario extender esta descripción con el fin de que algún experto en la técnica pueda comprender el campo de la invención y las ventajas que esto confiere. Los materiales, formas, tamaño y disposición de los elementos son susceptibles al cambio, esto no proporciona la suposición de un cambio en la esencia de la invención. Los términos en el cual esta descripción se ha escrito, se deberán considerar siempre como amplios en la naturaleza y no limitantes.

Vacuna contra la Leishmania ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los parásitos protozoarios del género Lei shmania son los responsables de causar la Leishmaniasis, un complejo de enfermedad sintomática, el cual se afecta esencialmente al hombre y animales en regiones tropicales y subtropicales. Se estima que el número de nuevos casos de leishmaniasis visceral humana puede alcanzar el número de los 500,000, siendo un mínimo de algunos diez millones de personas afectadas. Adicionalmente el número de leishmaniasis cutánea y mucocutánea puede estar en el orden de los 2 000,000 por año (Modabber., 1990). Aunque las personas con riesgo de contraer los diferentes tipo de leishmaniasis se pueden estimar en cerca de los 350 millones, el número de personas con infección verdadera puede ser mucho más alto, debido al hecho de que no hay estimaciones claras de casos reales de infecciones asintomáticas y debido a la existencia de las infecciones crípticas. De hecho, la leishmaniasis se puede considerar en el contexto glcbal como una infección/enfermedad de naturaleza endémica, situada en el 4° y 5° lugar en el rango de enfermedades parasíticas con repercusión alrededor del mundo.

Se pueden distinguir tres formas principales de leishmaniasis: la cutánea, la mucocutánea y la visceral, se producen las características las cuales dependen mayormente de la localización del parásito, las especies a las cuales pertenecen y las manifestaciones clínicas. Las especies distribuidas a lo largo de Asia y ciertas regiones en el área del Mediterráneo originan la presencia de formas cutáneas, con ulceración localizada la cual, en muchos casos, sana espontáneamente. Estas manifestaciones son causadas por L . major y L . trópica . La L . aethiopica (Mediterráneo, Asia, África) inducen también la forma cutánea de la leishmaniasis, aunque su manifestación es mas difusa. En América, la especie L . mexi cana produce la forma cutánea con una localización generalizada que usualmente no sana espontáneamente. La forma mucocutánea de enfermedad en humanos es causada por la L. brasiliensis y se caracteriza por la presencia de lesiones cutáneas en regiones oronasales y faríngeas, originando la destrucción de la mucosa. En América, Europa, África y Asia, la forma mas frecuente de leishmaniasis es la forma visceral, causada por la L . chagasi , la L . donovani y la L. infantum . Esta forma de leishmaniasis se caracteriza por síntomas clínicos asociados con la fiebre, anemia y una intensa hepato/esplenomegalia, la cual es mortal si esta no se trata adecuadamente en el tiempo correcto. En la forma avanzada de la enfermedad, el hospedero es incapaz de desarrollar una respuesta inmune efectiva. Todas estas formas de leishmaniasis se detectan también en cánidos y algunos roedores, de hecho constituyen el principal depósito de este parásito. El problema de salud generado por la L. infantum en la cuenca Mediterránea es serio debido a que hay una alta incidencia de la infección/enfermedad en los perros y en el insecto vector está muy extendido. Se calcula que entre el 7% y el 20% de todos los cánidos están infectados de leishmania, alcanzando el 30% en algunas áreas de España de donde es endémico. Este hecho constituye un serio problema veterinario el cual incrementa adicionalmente el riesgo de contagio, fundamentalmente por personas inmunodepresivas . En Europa, hay algunos 11 millones de perros con riesgo de infección de Leishmania . La L. infantum, como el resto de las especies en el género tienen un ciclo biológico dimórfico. Los hospederos intermedios son los insectos de la familia de los Psychodidae, género Phlebotomus . En el área Mediterránea de Europa, se ha demostrado que las especies P. arias y P. Perniciosus son los principales vectores, aunque los 5 vectores P. papa tosi , P. longicuspis y P. sergen ti están también presentes. Cuando el parásito es ingerido por el vector junto con la sangre de un huésped vertebrado, este se coloca a sí mismo en los intestinos en una forma extracelular, se transforma en un promastigoto y se divide. Las formas infecciosas migran hacia la faringe y la nariz, de donde se inocularán en un nuevo hospedero vertebrado. Los promastigotos se caracterizan en que tienen un flagelo y una forma alargada de algunos 15 a 20 µm en la longitud, con un extremo posterior redondeado y un extremo anterior agudo. Los núcleos se sitúan en una posición central y el cinetoplasto en el extremo anterior. En un medio de cultivo, los parásitos exhiben un cierto grado de variabilidad morfológica. Después la inoculación de los promastigotos en la piel del hospedero vertebrado, el establecimiento o no de la infección depende esencialmente de 2 factores: la existencia una población celular adecuada -macrógrafos- y otras células del sistema fagocítico mononuclear y la habilidad del parásito para sobrevivir y multiplicarse a si mismo en el interior de estas células. El primer paso en la penetración de la Leishmania en los macrógrafos es la aproximación y la adherencia a la membrana del plasma de la célula objetivo. Estudios in vi tro parecen indicar que no hay atracción quimiotáctica de los promastigotos sobre los macrógrafos. Dentro del ambiente de tejidos, los promastigotos libres activan complementos por rutas alternativas, causando la formación de una gradiente concentración de fracción C5a, los cuales atraen macrógrafos y otras células inflamatorias hacia el sitio de inoculación. Una vez que el promastigoto está dentro de una vacuola de parasitóforos, los lisosomas se fusionan a este formando un fagolisosoma. En infecciones causadas por otros micro-organismos, los fagolisosomas son responsables de la lisis y la eliminación por medio de diversos mecanismos tal como la producción de radicales de oxigeno tóxicos, por un proceso metabólico oxidante, la acción de enzimas lisosomales hidroliticas, proteínas catiónicas y bajo pH. La sobrevivencia del parásito en el fagolisosoma es una función de su habilidad para resistir y prevenir dichos mecanismos . La existencia de una respuesta inmune contra la parasitación por la Leishmania la cual es humoral y celular, se descubrió desde los primeros momentos en los cuales la enfermedad se estudió y se ha revisado en numerosas ocasiones. El tipo de respuesta humoral depende de la forma de la leishmaniasis. En la forma cutánea, la respuesta humoral es muy débil, así como en el tipo visceral se observa una alta respuesta de anticuerpo. En las afecciones cutáneas hay una remarcable respuesta mediada por las células, detectables tanto in vivo por medio' de una prueba de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) , así como también in vi tro por medio de pruebas de transformación linfoblástica y pruebas de inhibición de migración de macrógrafo. En estos casos el título de los anticuerpos de los sueros es normalmente bajo y directamente relacionado con la seriedad del proceso. Una vez que los amastigotos están dentro del macrógrafo, la resolución de la infección depende esencialmente de los mecanismos inmunes mediados por la célula. La respuesta celular se determina por la acción de la articulación de los macrógrafos, las células B, diversas sub-poblaciones de T-células, y las diferentes linfocinas secretados por todas ellas. El macrógrafo parasítico procesa los antigenos de la Leishmania y los expresa sobre su superficie por un proceso mediado por la clase II del Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC-II) . Adicionalmente, el macrógrafo secreta IL-1, el cual actúa como una segunda señal de activación para el linfocito-T. En los humanos, la leishmaniasis visceral o kala-azar se caracteriza por una respuesta celular ausente o debilitada, ambas detectables por la ausencia de la hipersensibilidad retardada (DTH) y por métodos de proliferación celular. La ausencia de proliferación de las células-T se detecta aún con la presencia de mitógenos tales como la concanavelina A o la fitohemaglutinina y la inhibición en la producción de IL-2 por las células-T estimuladas. En los ratones, la población de linfocitos-T (fenotipo CD4) es heterogénea y se puede dividir en al menos dos sub-poblaciones de acuerdo a los linfocinos que ellos producen. Estas células son esenciales en el desarrollo de inmunidad protectora en contra de la leishmaniosis cutánea (sub-población Th-1) y están involucradas al mismo tiempo en la supresión de la respuesta. inmuno protectora (subpoblación Th-2) , las células T inducidas en ratones resistentes C57BL/6 o ratones curados BALB/c son predominantemente del tipo Th-1, mientras las células de ratones BALB/c sin curar son del tipo Th-2. En general, las linfocinas secretadas por estas células favorecen el desarrollo de la línea celular la cual las produce y tienen un efecto antagónico sobre el desarrollo de otras subpoblaciones. Por lo tanto, IL-4 y IL-10 producidas por células Th-2 contribuyen al progreso de la infección, favoreciendo el desarrollo de esta línea. Adicionalmente, pueden actuar directamente sobre el macrógrafo, no permitiendo su activación. Sin embargo. en los ratones susceptibles de infección por leishmania, deficientes en el gen que codifica IL-4, han obtenido resultados contradictorios. En algunos casos se ha observado que la ausencia de esta citocina redirige la respuesta e incrementa la resistencia a la infección mientras que en otros no se observan diferencias en el nivel de infección del ratón. En ratones genéticamente resistentes, se ha observado que la ausencia de expresión de los genes de IFN-? o su receptor, el CD-40 o el ligando de CD-40 incrementan la susceptibilidad de la infección. La interacción de CD-40 y su ligando es necesaria para la producción de la citocina IFN-? necesaria para dirigir la respuesta hacia Th-1. Los ratones con una base genética resistente, los cuales desarrollan un tipo de respuesta Th-1, llegan a ser susceptible si son deficientes en la expresión de IL-12., desarrollando un tipo de respuesta Th-2. Datos recientes sugieren la producción de IL-12 es importante para dirigir la respuesta hacia Th-1, y que la ausencia de IL-4 puede prevenir la respuesta Th-2. Hay un gran número de proteinas de Leishmania las cuales tienen un carácter antigénico esencialmente caracterizado por métodos de "manchado Western" . En los sueros de pacientes y perros infectados por Leishmania , se hizo posible detectar la presencia de anticuerpos contra proteínas de membrana tal como gp63, gp46, PSA y KPM-11. Adicionalmente, diversos antígenos de localización intracelular citoplasmática se han caracterizado tal como: Hsp70; Hsp83; LIP2a, LIP2b," LILIPO, H2A, H3 y una proteina relacionada con la cinesina, K39 de L . chagasi . La reactividad de los anticuerpos, los cuales reconocen proteínas conservadas presentes en los sueros de los perros infectados por L. infantum se dirige hacia las áreas menos conservadas de estas proteínas. Algunas proteínas de la membrana son muy antigénicas en infecciones naturales. En todos los casos de infección natural hay una gran restricción en la respuesta humoral contra las proteinas debido a que los anticuerpos desarrollados durante el proceso infectivo reconocen áreas muy restringidas de las mismas. Los niveles IgG corresponden normalmente a la intensidad del reflejo de infección, el grado y la duración de la estimulación antigénica determinada por la carga parasítica. Un antígeno de Leishmania homólogo a los tipos de receptores cinasas C (LACK) se ha descrito recientemente, el cual produce una respuesta temprana del tipo Th-2. En ratones transgénicos para el antígeno LACK y con un antecedente genético susceptible a la infección, la inducción de tolerancia a este antígeno lo protege contra la infección por Leishmania mayor. Los anticuerpos anti-Leishmania pueden destruir Jos promastigotos in vitro en la presencia del complemento, promueven la fagocitosis e inducen la adherencia de partículas diversas a la superficie de promastigotos y amastigotos. La reacción patológica parece ir en paralelo con la densidad de macrógrafos parasitizados o parasíticos. En la leishmaniasis visceral los macrógrafos se distribuyen generalmente a sí mismos en una manera difusa por todos los diferentes tejidos orgánicos. El tipo de inflamación está constituido por un infiltrado celular importante con una predominancia de linfocitos y células plasmáticas junto con la hiperplasia de las células fagocíticas. La inflamación trae alteraciones en la fisiología de los órganos afectados produciendo serias alteraciones del sistema. En algunas ocasiones ocurre inflamación granulomatosa local, con aparición de granuloma y microgranuloma en los diferentes órganos. Estos granulomas se constituyen por macrógrafos e histiocitos (afectados o no por parásitos) rodeados por células plasmáticas y linfocitos y, en algunos casos, por fibroblastos. Estos procesos inflamatorios se acompañan por una reacción orgánica con la aparición de lesiones características en los órganos afectados. Algunos autores han encontrado' depósitos de la substancia amíloide virtualmente en la totalidad de los órganos. Algunos autores han formulado la hipótesis de que los daños producidos por el padecimiento no son atribuibles directamente al agente etiológico sino a la reacción orgánico generada.

Vacuna contra Leishmania La inmunidad intensa que sigue a la recuperación de la leishmaniasis cutánea ha dado un gran impulso al desarrollo de vacunas . profilácticas contra este padecimiento. Esta inmunidad se deriva de la inducción de una respuesta T que tiene asociada a la misma la producción de citocinas inflamatorias que activan los macrófagos y destruyen los parásitos. La memoria inmunológica en los casos de infección se mantiene probablemente por la presencia persistente del parásito en un proceso conocido como inmunidad concomitante. Los primeros estudios con relación a la vacuna contra Leishmania en la década de los 40 utilizó parásitos vivos así como inmunógenos. Estos estudios llevaron a la producción de vacunas que produjeron una protección significativa contra la re-infección subsecuente. Sin embargo, el conocimiento de la posibilidad de que los organismos vivos podrían producir infecciones reales llevó a que tales programas de vacunación no tuvieran lugar por un largo plazo y, por el contrario, se enfocará el interés hacia las vacunas basadas en parásitos muertos. Estos estudios proporcionaron la primera evidencia sobre la posibilidad de producir vacunas efectivas mediante inoculación de parásitos. . Los ensayos clínicos que utilizaron inmunización con promastigotos de Leishmania muertos también empezaron en la década de los 40. Estas vacunas produjeron un éxito remarcable puesto que se observó un cierto grado de protección, puesto que podría oscilar entre 0 y 82% dependiendo de la población. Estas vacunas tuvieron un efecto menor que las vacunas con parásitos vivos. El aislamiento de los clones no virulentos de L . major que protegen a los ratones contra la infección también han demostrado que es posible una vacuna atenuada. Sin embargo, la ignorancia de las mutaciones que lleva a la pérdida de la virulencia y al riesgo de producción de organismos que se vuelven virulentos haciendo este tipo de vacunación actualmente inaceptable.

Recientemente ha habido un progreso importante hacia la identificación de vacunas candidatas definidas molecularmente, tales como gp63, gp46/M2, el antigeno de superficie relacionado al último antígeno conocido como PSA-2 y las proteínas dp72 y gp70-2, la proteína LACK y Kmpll. Específicamente, los epitopes T presentes en la proteina gp63 han sido identificados, dando como resultado que solamente algunos de ellos son capaces de inducir una respuesta T, ambos de Th-1 como de Th-2. Estos antigenos inducen una protección significativa en modelos de animales cuando se administran con adyuvantes. La proteína PSA-2 de Leishmania es capaz de proteger contra la identificación por L. major induciendo una respuesta Th-1. Para evaluar el mecanismo de protección de esta proteína como una vacuna contra Leishmania en humanóos, su capacidad para inducir la proliferación de células T fue estudiada, en pacientes que habían sufrido leishmaniasis y que se recuperaron de la misma. Se observó que la proteína es capaz de generar una proliferación fuerte de células T de estos individuos, pero no de los controles sin una historia previa de infección. La respuesta fue del tipo Th-1, como se demostró por el patrón de inducción de citocina.

Las vacunas de sub-unidades se han enfocado fuertemente sobre los antígenos de proteínas porque son fáciles de identificar, aislar y clonar. Sin embargo, es necesario tomar en cuenta que no todas las moléculas de vacunas potenciales tienen que ser proteínas. De hecho, el lipofosfoglicano (LPG) juega un papel esencial en el establecimiento de la infección. La vacunación con LPG puede proteger contra la infección con L . major. A pesar de Ja existencia de un dogma que establece que las células T no reconocen antigenos no proteináceos, la molécula LPG parece presentarse a las células T mediante las células Langerhans de la piel. Adicionalmente, hay evidencia que ha demostrado que los gJicolípidos microbianos y otras moléculas no proteináceas pueden reconocer las células T cuando se presentan vía la ruta CD-1. Aunque no hay evidencia clara que la proteína KMP11 asociada a la LPG induzca una respuesta protectora, se ha probado que la fracción proteinácea asociada a la LPG es capaz de inducir una respuesta T e IFN-?, mientras que la fracción LPG sin la proteína no la induce. Se acepta normalmente que las vacunas de subunidades aunque protectoras, solamente inducen una inmunidad a corto plazo. Este problema puede no ser importante en las áreas endémicas, mientras que los individuos se refuercen periódicamente debido a las infecciones naturales. Un problema principal en el uso de las sub-unidades puede surgir del hecho de que puede no haber respuesta a un solo antígeno en una población genéticamente diversa. Un cóctel o mezcla de antigenos que contienen los inductores B y T pueden superar esta desventaja. Se ha publicado recientemente que un extracto de las proteinas de membrana de Leishmania infan tum, cuando se inyectó intraperitonealmente, es capaz de conferir protección contra las formas de promastigotes virulentos, y que esta protección es mayor cuando las proteínas están encapsuladas en liposomas cargados positivamente. La adyuvanticidad y la inmunidad protectora generada por los antígenos de Leishmania donovani encapsulados en los liposomas cargados positivamente . La vacunación con ácidos nucleicos que portan los genes que codifican las proteínas de Leishmania involucra la administración de material genética del parásito al huésped. Este ADN se toma de las células y se introduce hacia el núcleo en donde se transcribe y subsecuentemente se traduce en el citoplasma. La ventaja de este tipo de vacuna es que es posible dirigir la respuesta inmune por medio de la ruta MHC-I o MHC-II. Los antigenos producidos intracelularmente se procesan en la célula y los péptidos generados se presentan en la superficie celular en asociación con las moléculas MHC-I . La consecuencia seria que estas moléculas darían lugar a la inducción de las células T citotóxicas. Los antígenos producidos en un medio ambiente extracelular se tomarían especialmente por células que presentan antígenos especializados, se procesarían y se presentarían en su superficie enlazada a las moléculas MHC-II, dando como resultado la inducción y activación de las células CD4+ las cuales secretan citocinas que regulan los mecanismos efectores de otras células del sistema inmune. El primer vector de ADN que se va a administrar como una vacuna contenida en el gen gp63. También, el gen PSA-2 había sido introducido dentro de un plásmido y se ha observado que genera una respuesta Th-1 y la inducción de la protección. La vacuna con plásmidos de ADN que contienen Ag-2 inducen una respuesta Th-1 y protegen contra la infección con L . major, mientras que el Ag-2 en los complejos inmunes generan una respuesta combinada de Th-1 y Th-2 y no protegen a pesar del hecho de que se inducen el IFN-?. Igualmente, el gen que codifica la proteina LACK ha sido administrado subcutáneamente a los ratones BALB/c, en un vector de expresión que expresa la proteína bajo el control del promotor de citomegalovirus, y se observó la protección contra la infección con L. major. En casi todos los casos en los cuales se habia administrado el, ADN, la ruta ha sido intramuscular, aunque la inyección intradérmica del ADN particulado también se debe explorar, puesto que requiere una cantidad menor de ADN. Otros sistemas de inmunización utilizan vectores tales como Salmonella, BCG o virus Vaccinia . Es interesante remarcar que la inclusión del gen gp63 en BCG es capaz de inducir la protección contra L . major. El gen que codifica la proteina gp63 también se ha introducido dentro del gen araC bajo el control del promotor rae en una Salmonella typhimurium atenuada. La administración oral de lxlO9 colonias de la bacteria transformada induce una respuesta T dentro del alcance de tanto el Th-1 y de las células citotóxicas contra las células de mastocitoma que expresan el gp63. La proteína gp63 en la forma del complejo gp63-ISCOMs induce la protección en los ratones, evidenciado por la reducción en la inflamación y supresión de lesiones. En el suero, hay anticuerpos del tipo IgG2a y, adicionalmente, es posible observar una respuesta Th-1 por la inducción de IFN-? e IL- 10. No se observó respuesta del DTH. La Salmonella typhi Nramp 1 transformada con la gp63 generada con una respuesta Th-1 con la inducción de IL-2 e IFN-?, y se detectó una fuerte resolución de las lesiones. Una proteína de L. pifanoi conocida como P-4 induce la protección significativa contra la infección por Leishmania . Recientes estudios en humanos con leishmaniasis cutánea indicaron que esta proteína o los péptidos derivados de la misma son capaces de hacer proliferar las células T. No hay inducción de IL-4, mientras que se induce el IFN-?. Los mutantes Aro-A y Aro-D de la Salmonella typhi transformada con IL-2, IFN-? y TNF-a administrados oralmente pueden servir como sistemas terapéuticos contra la infección por L . major. Es interesante observar que en estos pacientes hay una gran inducción con iNOS. El gen gp&3 también ha sido clonado en los mutantes Aro-A y Aro-D, y se ha observado que después de la administración oral, la proteina codificada es capaz de inducir la protección significativa contra la infección con L. major. Esta misma proteína es capaz de inducir la protección cuando se administra fusionada a varios promotores en variedades específicas (GID105 y GID106) de Salmonella . 6 Una proteína artificial denominada Q se ha descrito recientemente por nuestro grupo, la cual está compuesta de varios fragmentos antigénicos de 4 proteínas de Leishmania infantum (más específicamente, Lip2a, Lip2b, PO y H2A) , los cuales, después de ser utilizados como antígenos, han probado tener un valor importante para el diagnóstico de leishmaniasis canina, con una sensibilidad del 93% y una especificidad del 100% cuando se compara con el suero de los animales de control que no están infectados. Igualmente, nuestro grupo demostró que la proteina hap70 de Leishmania infantum es un objetivo importante de la respuesta inmune en las infecciones provocadas por la infección con este parásito. - Con el objeto de explorar la posibilidad que la proteína Q pueda ser utilizada diseñar sistemas de protección contra la infección por Leishmania infantum, ambos por sí mismos como en combinación con Hap70, tres series de experimentos se diseñaron utilizando el hámster como modelo. Un experimento se diseñó para verificar sí la inmunización con la Proteína Q protegió los animales contra la infección a corto plazo, otra para verificar sí la inmunización los protegió a largo plazo y el tercero fue para verificar este efecto protector después de la inmunización con dos proteínas conjuntas. Se observó posteriormente tanto del análisis a corto plazo asi como del análisis a largo plazo, que la proteína Q fue capaz de generar una respuesta inmune que reduce la carga parasítica tanto en el Hígado como en el Bazo después de la infección por Leishmania infantum en la mayoría de los animales inmunizados, y que la inmunización con las proteínas Q+Hap70 también indujo una respuesta significativa contra ambas proteínas y llevó a una reducción significativa de la carga parasítica en la mayoria de los animales inmunizados.

Ejemplo 1: Inmunización con la Proteina Q Se inmunizaron 4 animales con 5 microgramos de la proteína Q disuelta en 40 microlitros del adyuvante de Freund, y otros 4 animales se inmunizaron con la misma cantidad del adyuvante emulsificado con 40 microlitros de solución salina PBS sin la proteina. En la primera inmunización, el adyuvante completo de Freund se empleó combinado con la proteina, mientas que en las dos inmunizaciones subsecuentes, se utilizó el adyuvante incompleto de Freund mezclado con la proteína en la misma proporción de la proteína/adyuvante. Se llevaron a cabo tres inmunizaciones intraperitoneales a intervalos de 15 dias.

Iniciando desde la segunda semana después de cada inmunización y a través de todo el periodo de inmunización, las muestras de sangre se extrajeron para medir la respuesta humoral contra la proteína Q en los ensayos ELISA. Se observó que ya en la segunda semana después de la primera inmunización hay una respuesta positiva IgG contra la proteína Q, y que esta respuesta fue alta después de la segunda semana después de la inyección, y se incrementó con el tiempo de la inmunización alcanzando títulos de 1/100.000. Igualmente, se observó que la respuesta inmune contra la proteína Q no se modificó significativamente después de la infección con el parásito de la Fig. 1. Quince días después de la tercera inmunización, los animales se infectaron con una dosis de 105 parásitos de promastigoto, diferenciados de los amastigotos infecciosos que se originan de un hámster infectado. Se había verificado previamente que el inoculo fuera capaz de inducir una parasitemia fuerte junto con el padecimiento cuatro meses después de haber administrado los parásitos, en el 100% de los animales infectados. La Tabla 1 indica el nivel de parasitemia por mg de tejido tanto en el hígado como en el bazo de los animales de control y vacunados. Es posible observar que en todos los animales vacunados la carga parasítica en el hígado disminuye con respecto a los controles, y que esto sucede de una manera muy significativa en el 75% de ellos. Cuando se examina la carga parasítica en el bazo, es posible observar que también en el 75% de los animales esta carga fue significativamente inferior que aquélla de los controles, el RPL alcanzó el 83%-86%. El animal en el cual el RPL fue del 20% en el hígado, tuvo un 48% en el bazo.

Tabla 1. Carga parasítica en el higado y en el bazo de los hámsters vacunados con la proteina Q via la ruta intraperitoneal. Después de cuatro semanas de infección, se midió la carga parasítica por el método de diluciones límite (a corto plazo) . Las cargas parasíticas se expresan como parásitos por miligramo de tejido. RPL = reducción en la carga parasítica en % .

Hámster inmunizado con la proteina Q Hámster Higado (RPL) Bazo (RPL) 1 4 + 1 (71%) 49 ± 3 (83%) 2 3 ± 2 (78%) 39 + 2 (86%) 3 5 ± 1 (64%) 50 ± 4 (83%) 4 11 + 3 (20%) 153 ± 19 (48%) Los números representan la media de tres determinaciones Controles 4 hámsters 14 + 5 295 ± 30 El número representa la media de los 4 animales Ejemplo 2 Para verificar el efecto de la vacunación con la proteína Q en la reducción de la carga parasítica a largo plazo, utilizando otra ruta de inoculación, 4 animales se inyectaron subcutáneamente con 5 microgramos de la proteina Q disuelta en 40 microlitros de PBS y se mezcló con 40 microlitros del adyuvante de Freund. En la primera inmunización, se empleó el adyuvante completo de Freund, mientras que en las dos subsecuentes, se utilizó el adyuvante incompleto de Freund como se indicó - arriba . La vacunación se administró en tres dosis separadas a intervalos de 15 días. Quince días después de la tercera inmunización se administró un inoculo de 105 parásitos infecciosos. Durante todo el periodo de inmunización y a través de toda la infección (cinco meses) se extrajo sangre para determinar la clase de respuesta humoral contra la proteína Q y contra las proteínas totales del parásito. La Figura 2 muestra que ya después de la segunda semana de inmunización, la respuesta contra la proteína Q fue positiva, como en el caso previo, en tres de los ratones, y que la respuesta contra la proteína fue muy lta después de dos semanas de la primera inmunización. La respuesta se mantuvo muy alta después de las inmunizaciones restantes, alcanzando una titulación de 1/75.000 en la semana siguiente a la tercera inmunización. En uno de los animales la respuesta contra la proteína Q fue más lenta en relación al tiempo, aunque la respuesta alcanzó el nivel de aquél en los otros animales al final del experimento. Consecuentemente, de los datos derivados tanto del ejemplo 1 como del ejemplo 2, es posible concluir que el grado de respuesta inmune contra la proteína, por ambas rutas, intraperitoneal y subcutánea, es muy rápida, aunque la respuesta vía la ruta intraperitoneal logra títulos más altos al mismo tiempo (1/75.000 contra 1/30.000). La Figura 3 indica la respuesta contra la proteína Q en los animales de control. Es posible observar que la reactividad contra esta proteína está detectada en la 12ava-14ava semana después de la infección, que es cuando los primeros síntomas atribuibles a una leishmaniasis potencial empiezan a detectarse en los animales infectados. La Tabla 2 muestra los niveles de parasitemia en el hígado y en el bazo de los animales de control y vacunados. Se puede observar que el 50% de los animales se protegieron al nivel del hígado, en el sentido que la reducción en el nivel de parasitemia fue muy alto (87-89%) . Uno de los animales no se protegió, mientras que en otro de los animales la reducción de la carga parasítica fue del 22%. Por el contrario, la reducción de la carga parasítica fue del 98-99% en el 100% de los animales al nivel del bazo.

Tabla 2. Carga parasítica en el hígado y en el bazo de los hámsters vacunados con la proteína Q mediante la ruta subcutánea. Después de 20 semanas de infección, se midió la carga parasítica por el método de diluciones límite (a largo plazo) . La carga parasítica se expresó como parásitos por miligramo de tejido. RPL = reducción en la carga parasítica en % .

Hámster inmunizado con la proteina Q Hámster Higado (RPL) Bazo (RPL) 1 1.4 x 106 (22%) 1.0 x 107 (98%) 2 2.0 x 105 (89%) 4.9 x 105 (99.9%; 3 2.4 x 105 (87%) 3.3 x 105 (99.9%; 4 2.4 x 106 (0%) 6.3 x 105 (99.9%) El número representa la media de tres determinaciones Controles 4 hámsters 1.8 x 106 ± 1.2 x 105 5.2 x 108 ± 2.6 x 107 Los números representan la media de la carga parasítica de los 4 animales Con el objeto de probar si la proteina Q podría ser utilizada para diseñar sistemas de protección en las formulaciones que contuvieran la proteína LiHsp70 de Leishmania infan tum, se realizó un experimento en ratones Balb/c. Se observó que después de la carga parasítica tanto en el hígado como en el bazo se redujo significativamente, siendo en algunos de los animales, cuatro órdenes de magnitud inferior.

Ejemplo 3: Inmunizaciones con la proteina Q + la proteína Hsp70 en el Adyuvante de Freund. Cada uno de los 4 hámsters se inyectaron intraperitonealmente con 5 microgramos de la proteina Q y 5 microgramos de la proteina LiHsp70 disuelta en 40 microlitros de PBS y emulsificado en 40 microlitros del adyuvante de Freund. En la primera inmunización, se empleó el adyuvante completo de Freund, mientras que en las dos subsecuentes, se utilizó el adyuvante incompleto de Freund como se indicó arriba. La vacunación se administró en tres dosis separadas a intervalos de 15 días. Quince días después de la tercera inmunización se administró un inoculo de 106 parásitos infecciosos vía la ruta intracardiaca y se sacrificaron a la semana 22. Cada dos semanas, para todo el periodo de inmunización y a través de toda la infección, se extrajo sangre de ellos para determinar el grado de respuesta humoral contra la proteína Q y contra la proteína LíHsp70. La carga parasítica relativa entre los ratones inmunizados con la proteína Q más LiHsp70 se muestra en la Tabla 3. Se observó que todos los animales estuvieron altamente protegidos y en algunos de ellos, en el bazo, la reducción fue cercana a dos-tres órdenes de magnitud.

Tabla 3. Carga parasítica relativa de los ratones Balb/c inmunizados con la proteína Q más LiHsp70 después de 4 meses de infección.

Ratones inmunizados con la proteina Q y LiHsp70 Raton Hígado (RPL) Bazo (RPL) 1 1.5 x 103 (97%) 1.5 x~104 (99%) 2 0.9 x 103 (98%) 1.4 x 103 (99%) 3 2.0 x 104 (60%) 5.6 x 104 (99%) 4 0.8 x 104 (84%) 1.2 x 105 (96%) Los números representan la media de tres determinaciones.

Controles 4 ratones 5.1 x 104 ± 2 x 103 3.2 x 106 ± 8 x 104 Los números representan la media de la carga parasítica de los 4 animales.

Las Tablas 4 y 5 muestran que todos los animales de los Ejemplos 1 y 2 responden inmunológicamente a la proteína Q, y que iniciando desde la segunda semana después de la inmunización la respuesta contra la proteína Q fue alta y esta respuesta se incrementó después de la segunda inmunización (semana 4). La Tabla 6 muestra que la respuesta contra la proteína LiHsp70 a través de todo el tiempo del experimento también fue positivo, aunque menor que la respuesta en el Ejemplo 3 contra la proteina Q.

Tablas 4 y 5. Muestran la respuesta inmune en los 4 hámsters inyectados intraperitonealmente con 5 microgramos de la proteina Q (TABLA 4 - Ejemplo 1, corto plazo) y la respuesta inmune en 4 hámsters inyectados subcutáneamente con 5 microgramos de la proteína Q (TABLA 5 - Ejemplo 1, largo plazo) .

TABLA 4 - Ejemplo 1, corto plazo Ratones Inmunizados con la proteína Q (Corto plazo) Respuesta inmune contra la proteina Q El suero (diluido 1/200) muestra una densidad óptica de 3 tiene un título más alto que 1/45.000.

Ratones de control Respuesta inmune contra la proteína Q (Corto plazo) El suero fue diluido 1/200 TABLA 5 - Ejemplo 2, largo plazo Ratones Inmunizados con la proteína Q (Largo plazo) Respuesta inmune contra la proteína Q El suero (diluido 1/200) muestra una densidad óptica de 3 tiene un título más alto que 1/45.000.

Ratones de control Respuesta inmune contra la proteina Q (Largo plazo; El suero fue diluido 1/200 Tabla 6. Muestra la respuesta inmune en los 4 hámsters inyectados intraperitonealmente con 5 microgramos de la proteína Q + 5 microgramos de la proteina LiHSP 70 (Ejemplo 3, largo plazo) Ratones Inmunizados con la proteína Q + Hsp70 Respuesta inmune contra la proteina Q El suero fue diluido 1/800 Ratones de control Respuesta inmune contra la proteína Q El suero fue diluido 1/200 Ratones Inmunizados con la proteína Q + Hsp70 Respuesta inmune contra la proteina Hsp70 El suero fue diluido 1/800 Ratones de control Respuesta inmune contra la proteina Hsp70 El suero fue diluido 1/200 Ejemplo 4: Inmunización con la proteina Q + BCG en ratones Balb/c Cuatro ratones Balb/c fueron inyectados cada uno intraperitonealmente con 5 microgramos de la proteina Q y 106 Unidades Formadoras de Colonias (CFU) de BCG (bacilo Calmette-Gu rin) disueltas en 40 microlitros de PBS. La inmunización fue efectuada en tres dosis, 15 días por separado. 15 días después de la tercera inmunización, se administró un inoculo de parásitos infecciosos de 105 de BCN150 de L. infantum por la ruta intracardiaca . Cada dos semanas, a través de todo el tiempo de inmunización y a través de toda la infección, se tomaron -nuestras de sangre de ellos para probar el grado de respuesta humoral a la proteína Q. Los animales fueron sacrificados a la semana 8 después de la infección. La Tabla 7 (a y b) muestra que los animales inmunizados responden positivamente a la proteína Q iniciando desde la segunda semana y que la respuesta se incrementa progresivamente hasta que en muchos casos alcanza los valores de 400,000. La Tabla 8 muestra la diferencia en la carga parasítica entre el higado y bazo de los animales vacunados y de control.

Tabla 7: Respuesta inmune a la proteína Q en ratones Balb/c inmunizados con 5 microgramos de la proteína Q y 106 CFU de BCG Ratones 1, 2, 3, 4 inmunizados Ratones 5, 6, 7, 8 controles no inmunizados Tabla 7 : Reacción a la proteJna Q Semana Ratón 1 Ratón 2 Ratón 3 Ratón 4 preinmune 0 0 la. inmunización 1 0 0.2 0.1 2a. inmunización 3 0, .5 0.7 0.8 0.9 3a. inmunización 6 1. ,6 2.1 2.6 2.7 7 1. ,8 2.3 2.4 2.1 9 2. ,1 2.6 2.5 1.9 11 2. ,7 2.9 3 3 13 3 3 3 3 Semana RRatón 5 Ratón 6 Ratón 7 Ratón preinmune 0 la. inmunización 1 0 2a. inmunización 3 0 3a. inmunización 6 0 O 0 O 7 0 O O O 9 0 O O O 11 0 O O O 13 0 O O O el número 3 es equivalente para .el sobreflujo en el sistema de medición los sueros fueron tomados . al inicio de cada una de las semanas indicadas la la. inmunización se efectuó en el día 0, la 2a. en el día 15 y la tercera en el dia 30.

Tabla 8. Carga parasítica en el higado y en el bazo de los ratones Balb/c vacunados con la proteina Q subcutáneamente + 106 de BCG. 8 semanas después de la infección, se midió la carga parasítica mediante microscopía óptica de las impresiones del tejido midiendo los diferentes campos que contienen 7000 células nucleadas. La carga parasítica se representa como la cantidad de parásitos por miligramo de tejido, habiendo previamente calculado que 1 parásito por 1000 células nucleadas es equivalente a una cantidad aproximada de 210 parásitos por miligramo de tejido. RPB = reducción en la carga parasítica, %.

Ratón Higado (RPB) Bazo (RPB) 1 72 (82%) 457 (89%) 2 40 (9%) 207 (95%) 3 (88%) n.d. (100%; 4 n.d. (100%; 90 (98%) Controles 4 animales. Media 400 ± 15 4155 ± 30 n.d. los parásitos no pudieron ser detectados en 5000 células nucleadas Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la intención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una proteína caracterizada porque exhibe al menos 90% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 1. 2. Un polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de conformidad con la reivindicación 1. 3. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia del nucleótido es SEQ ID No. 2. . Un hospedero transformado caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3. 5. Un hospedero transformado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el hospedero es una bacteria. 6. Un método de producción de una proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende los pasos de a) cultivar un hospedero de transformación de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5 bajo las condiciones favorables a la expresión de la proteína y b) la recuperación de mañera opcional de la proteína . 7. Una composición caracterizada porque comprende una proteína de conformidad con la reivindicación 1. 8. Una composición caracterizada porque comprende un nucleótido de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3. 9. Una composición de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 8, caracterizada porque la composición es una composición farmacéutica. 10. Una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos y animales, de Leishmaniasis, caracterizada por que comprende una proteína de conformidad con la reivindicación 1. 11. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicionalmente un adyuvante fisiológico adecuado para la administración intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. 12. Una composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 10 ó 11, caracterizada porque comprende adicionalmente la proteína LiHsp70, completa o fragmentada, o variantes de la misma. 13. Una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en humanos y animales, de leishmaniasis, caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3. 14. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizada porque la composición es una vacuna. 15. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1 para el uso en la prevención o tratamiento de leishmaniasis en un sujeto humano o animal. 16. Un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3 para el uso en la prevención o tratamiento de leishmaniasis en un sujeto humano o animal. 17. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 ó 14 para el uso en la prevención o tratamiento de leishmaniasis en un sujeto humano o animal. 18. Una proteína de conformidad con la reivindicación 1 para el uso en la generación de una respuesta inmune. 19. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 y 14 para el uso en la generación de una respuesta inmune. 20. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende anticuerpos dirigidos contra la proteina de conformidad con la reivindicación 1. 21. Un método para la prevención o tratamiento de leishmaniasis en un humano o animal, caracterizado porque comprende la administración de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, 14, 17, 19 y 20. 22. Un método para la prevención de leishmaniasis en un humano o animal, caracterizado porque comprende la administración de una vacuna de conformidad con la reivindicación 14.