ES2273519T3 - Gen quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de l. infantum. - Google Patents
Gen quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de l. infantum. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína (a) que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°. 1 o (b) que tiene al menos el 90% de identidad de los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°. 1 y que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un ser humano o animal.
Description
Gen quimérico que codifica los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas de L. infantum.
La presente descripción se refiere a una
proteína
(a) que tiene la secuencia de aminoácidos como
se muestra en SEC ID N°. 1 o
(b) que tiene al menos el 90% de identidad de
los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1
y que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en
un ser humano o animal o a un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención,
útil para la prevención o el tratamiento de la Leishmaniosis, en
particular la Leishmaniosis canina. El objetivo obvio de esta
invención se basa en usar la secuencia de genes o la proteína
obtenida del gen quimérico para suministrar composiciones
farmacéuticas para prevenir o tratar la leishmaniosis, en
particular la Leishmaniosis canina, que puede estar presente en el
cuerpo de un paciente, por ejemplo como una vacuna o una
preparación del anticuerpo monoclonal. Este paciente no tiene que
ser un perro sino que puede también ser un ser humano que padezca
enfermedades que implican la inmunodepresión. Para conseguir este
objetivo, se producirá un gen quimérico el cual codifica una
proteína (a) que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra
en la SEC ID N°. 1 o (b) que tiene al menos el 90% identidad de los
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°. 1 y que
genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un ser
humano o animal, originada a partir de una síntesis "in
vitro" de un gen quimérico construido "ad hoc",
que contiene cinco de los determinantes antigénicos de cuatro
proteínas diferentes. El producto está configurado como altamente
sensible y es específico para, por ejemplo, generar una respuesta
inmunológica protectora contra la Leishmaniosis canina, o para
preparar anticuerpos contra la Leishmaniosis canina.
Esta invención es de utilidad dentro de la
industria dedicada a la producción de productos farmacéuticos en
general.
Los protozoos parasitarios del género de la
Leishmania son los agentes etiológicos que causan la Leishmaniosis,
una gama de enfermedades que tienen una distribución mundial y que
están caracterizadas porque dan lugar a una amplia variedad de
síntomas clínicos.
Las formas principales de Leishmaniosis son
zoonóticas en la naturaleza y los seres humanos están considerados
como huéspedes secundarios.
Las especies denominadas L. Infantum,
ampliamente distribuidas por muchas áreas mediterráneas es la causa
de la Leishmaniosis visceral (LV) en los seres humanos y
perros.
De hecho, los perros infectados con L.
Infantum son la principal reserva animal de este parásito,
particularmente durante el periodo de una larga incubación antes de
que los síntomas clínicos puedan ser observados.
Los datos epidemiológicos indican que hay una
correlación directa entre la prevalencia de la Leishmaniosis canina
y la transmisión del parásito a los seres humanos. Por esta razón,
es crucial detectar la enfermedad o infección pronto en campañas
emprendidas para controlar la extensión de la enfermedad.
El parásito es transmitido al huésped vertebrado
como un promastigoto flagelado, mediante la picadura de una mosca
de la familia "Phlebotominae", y el parásito introduce las
células de los fagos mononucleados en las cuales se diferencian y
se reproducen como amastigotos, dentro de la estructura
fagolisosómica.
Las células infectadas se acumulan en ciertos
tejidos, principalmente bazo, hígado y ganglios linfáticos. Se
estima que alrededor de 15 millones de personas están infectadas
por Leishmaniosis, y cada año en el mundo aparecen 500.000 casos
clínicos nuevos, principalmente en el mundo subdesarrollado y en
vías de desarrollo.
En los países sudoccidentales de Europa, la
Leishmaniosis visceral (VL), es una enfermedad zoonótica provocada
por las especies de L. infantum, como se ha mencionado
antes. Los datos recientes derivados de estudios epidemiológicos
indican que hay una incidencia inquietante de esta infección.
En Italia los datos proporcionados sobre la
incidencia de LV varía entre el 14,4% y el 37% según la región.
En Portugal, más particularmente en la región
alrededor de Lisboa, se han encontrado índices seropositivos del
8.4% y en la región de los Alpes marítimos franceses se han
encontrado centros diferentes de prevalencia que varían entre el
3,2% y el 17,1%.
\newpage
En España, la prevalencia de Leishmaniosis
depende de la zona en estudio. En Cataluña un índice de promedio de
incidencia del 9.3% ha sido observado aunque en algunos focos se ha
encontrado una prevalencia de perros infectados de hasta un
18%.
En la Isla de Mallorca, el índice de incidencia
es del 14%, y otros índices que han sido encontrados son: el 2,4%
en Murcia, el 8.8% en Granada, del 10 al 15% en Salamanca, el 5,25%
en la provincia de Madrid, y el 14% en Cáceres.
Aunque el número de casos de LV en seres humanos
provocado por L. Infantum puede ser considerado
relativamente bajo, el alto porcentaje de pacientes con
inmunodepresión que han sido infectados por Leishmania podría estar
relacionado con el nivel elevado de esta enfermedad en los
perros.
De hecho, en el sur de Europa, el 50% de los
adultos que son infectados por Leishmaniosis son también pacientes
infectados por el virus del VIH. En cambio, según estos datos de
coinfección de Leishmania y VIH, se ha estimado que el nivel de
infección (por parásitos) puede ser una o dos veces mayor que esta
figura debido a la existencia de un gran número de infecciones no
detectadas.
Una característica común de los diferentes tipos
de infección por Leishmania es que ésta induce una respuesta
humoral fuerte en el huésped. En consecuencia, se utilizan
habitualmente de forma más amplia los métodos diagnósticos basados
en técnicas serológicas.
Se ha descrito que estos anticuerpos dependen
del tipo, fuente y pureza del antígeno usado. En los procesos
inmunológicos que son comercializados habitualmente, los
promastigotos completos y las preparaciones más o menos preparadas
a partir de estos son usadas como una fuente antigénica. Este
método normalmente conduce a reacciones cruzadas con suero de
pacientes que padecen lepra, tuberculosis, tripanosomiasis
africana, enfermedad de Chagas, malaria y otras parasitosis.
La sensibilidad y especificidad de los métodos
serológicos dependen del tipo, fuente y pureza del antígeno
empleado. Durante los últimos años un gran número de antígenos de
Leishmania han sido caracterizados, algunos de éstos pueden ser
considerados como proteínas específicas del parásito.
Entre estas proteínas específicas del parásito,
la proteasa de superficie GP63, la glicoproteina de superficie gp46
y la proteína KMP-11 asociada al lipofosfoglicano
merecen ser nombradas.
Un grupo adicional de antígenos de Leishmania se
forma a partir de proteínas conservadas evolutivamente, tales como
la quinesina, proteínas inducidas térmicamente, actina y
tubulina.
Varias estrategias para desarrollar vacunas
contra la infección por Leishmania han sido descritas en la técnica
anterior. La publicación PCT WO96/10081 describe la producción
recombinante de la proteasa gp63 de la membrana externa de la
Lesihmania mayor y de la vacuna que comprende la gp63
recombinante. WO96/33414 describe el uso de un epítopo del antígeno
ribosómico LcPO de Leishmania chagasi en diagnósticos y en
composiciones farmacéuticas. Además, Rico et al (Infection
and Immunity, Jan 1998, Vol 66, No. 1, pp347-352)
revelan el uso de la proteína HSP70 de choque térmico de L.
infantum fusionada a la proteína de unión a la maltosa de E.
coli para aumentar la respuesta inmunitaria en los ratones. Y
Soto et al. (J. Clinical Microbiology Jan 1998, Vol. 36, No.
1, pp58-63), describen un antígeno quimérico
multicomponente, que difiere de los péptidos de la invención en su
secuencia de aminoácidos. En particular, éste tiene menos del 90% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con la SEC ID NO: 1 de
esta invención.
Como parte de una estrategia para desarrollar un
sistema diagnóstico serológico específico para la Leishmaniosis
canina, se ha emprendido un proyecto de laboratorio para
identificar los antígenos de L. Infantum, mediante una
búsqueda por inmunodetección de una genoteca de expresión para genes
de L. Infantum que usan suero de perro con Leishmaniosis
visceral activa.
Se ha observado que la mayor parte de los
antígenos aislados por este método pertenecen a la familia de
proteínas conservada durante el transcurso de la evolución. La
identificación de epítopos B de estos antígenos indican, no
obstante, que en cualquier caso los determinantes antigénicos
estaban localizados en regiones que no estaban bien
conservadas.
En particular, las proteínas ribosómicas
acídicas LiP2a y LiP2b son reconocidas por más del 80% de los
sueros de VL.
Se ha confirmado que estas proteínas contienen
determinantes antigénicos específicos de enfermedades, y que las
proteínas recombinantes LiP2a y LiP2b, en las que se ha eliminado
un fragmento, podrían ser usadas como instrumento específico capaz
de distinguir entre LV y la enfermedad de Chagas.
También se ha mostrado que la proteína
ribosómica PO de L. Infantum, muy conservada en la escala
evolutiva, está reconocida por un alto porcentaje de sueros de LV
de perro. Además, los determinantes antigénicos son encontrados
exclusivamente en el C-término de la proteína, es
decir, en la región que ha sido mal conservada durante el
transcurso de la evolución.
Se ha observado que el 78% de los sueros de LV
de perro, anticuerpos contra la proteína H2A están también
presentes, y ha sido confirmado que a pesar de la identidad de las
secuencias en todas las proteínas H2A entre organismos
eucarióticos, la respuesta humoral para esta proteína en sueros de
LV está particularmente provocada por determinantes específicos para
la proteína H2A de Leishmania.
Los determinantes antigénicos reconocidos por
los sueros de LV de perro se encuentran en ambos terminales de la
proteína H2A.
La solución obvia para el problema encontrado de
forma habitual en esta técnica sería tener una invención que
permita el ensamblaje de un gen quimérico sintético que contenga
las regiones del ADN que codifican los determinantes antigénicos
específicos para las proteínas LiP2a, LiP2b, LiPO, y H2A, con el
propósito de construir una proteína rica en determinantes
antigénicos.
No obstante, por lo que el solicitante sabe, no
hay hasta ahora ninguna invención que contenga las características
descritas como ideales, con el propósito de alcanzar el objetivo
deseado. Este objetivo es la construcción de una proteína rica en
determinantes antigénicos, procedente del ensamblaje de un gen
sintético quimérico, que contiene las regiones del ADN que codifican
los determinantes antigénicos específicos para las proteínas
mencionadas.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra
en la SEC ID N°. 1, que contiene uno o más de los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas de L. infantum o a una
proteína que tiene al menos el 90% de identidad de los aminoácidos
con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y que genera una
respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un ser humano o
animal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína de la invención, en particular a un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos según la
SEC ID N°. 2. útil para prevenir o tratar la Leishmaniosis
canina.
En otros aspectos, la invención se refiere a una
composición que comprende una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos como se muestra en la SEC ID N°. 1, o una proteína que
tiene al menos el 90% identidad de los aminoácidos con la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y que genera una respuesta
inmunitaria contra la Leishmaniasis en un ser humano o animal; o un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína de la invención, en particular un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos según la
SEC ID N°. 2. En una forma de realización, la composición es una
composición farmacéutica, en particular una vacuna.
Así, en otro aspecto, la invención se refiere a
una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento,
en un ser humano o animal, de la Leishmaniasis, que comprende una
proteína con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC
ID N°. 1, o una proteína con al menos el 90% de identidad de los
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y
que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un
ser humano o animal.
La invención también se refiere a una vacuna que
es capaz de estimular la producción de anticuerpos que reconocen al
parásito de la Leishmania, la cual se basa en una composición
farmacéutica de la invención.
Además, la invención también se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento, en un
ser humano o animal, de la leishmaniasis que comprende una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID
N°. 1, o una proteína que tiene al menos el 90% de identidad de los
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y
que genera una respuesta inmunitaria contra la leishmaniasis en un
ser humano o animal en combinación con la proteína LiHsp70,
completa o fragmentada.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición farmacéutica para la prevención y el
tratamiento, en un ser humano o animal, de la leishmaniasis, que
comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de la invención, en
particular un polinucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos según la SEC ID N°. 2.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento, en un
ser humano o animal, de la leishmaniasis, que comprende un vector
de ADN que contiene:
1) un polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una proteína de la invención, en
particular un polinucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos según la SEC ID N°. 2., y
2) la secuencia de nucleótidos que codifica para
la proteína LiHsp70 o sus variantes que difiere con respecto a los
aminoácidos conservados.
En otra forma de realización, la composición
farmacéutica de la invención comprende anticuerpos dirigidos a un
proteína con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC
ID N°. 1, o a una proteína con al menos el 90% de identidad de los
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y
que genera una respuesta inmunitaria contra la leishmaniasis en un
ser humano o animal.
Las preparaciones farmacéuticas de la invención
pueden además contener todos los adyuvantes conocidos, disolventes,
tampones etc. conocidos per se para composiciones
farmacéuticas y/o vacunas. En particular estos pueden comprender un
adyuvante fisiológico que hace que la composición sea adecuada para
la administración intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
Para la prevención de la leishmaniasis, una
vacuna que comprende una proteína según la invención será
administrada a un ser humano para obtener una respuesta inmunitaria
protectora.
La administración de las preparaciones,
anticuerpos y/o vacunas de la invención pueden ser realizadas en
cierto modo conocido per se, tal como por vía oral,
intramuscular, intravenosa, subcutánea, por infusión (goteo) etc.
preferiblemente, la preparación o vacuna es inyectada, mientras que
con una preparación de anticuerpos, se puede usar una infusión.
Más específicamente, la invención se refiere a
un gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican
los determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L.
Infantum, que codifican una proteína útil para fines
farmacológicos, en particular para la prevención y/o tratamiento de
Leishmaniosis, en particular la Leishmaniosis canina, y obteniendo
el producto final o la construcción del gen quimérico que codifica
un polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos
seleccionados, caracterizado porque éste usa una estrategia de
clonación en la que el clon que expresa la proteína
rLiPO-Ct-Q se usa como vector
inicial, y para este vector, mediante el uso de lugares de
restricción adecuados, se añaden de forma secuencia) fragmentos de
ADN que codifican las proteínas LiP2a-Q,
LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q,
LiH2A-Nt-Q, y después de cada fase
de donación se deduce la orientación correcta de cada uno de los
insertos y el tamaño de los productos de la expresión, la secuencia
deducida completa de aminoácidos de la proteína de fusión final,
pPQV, expresada en ella es el vector pMal:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a una proteína
que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID
N°. 1, o una proteína que tiene al menos el 90% identidad de los
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°. 1 y
que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un
ser humano o animal; y a un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención,
en particular un polinucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos según la SEC ID N°. 2. útil para fines farmacológicos,
en particular para la prevención y/o el tratamiento de la
Leishmaniasis, en particular la Leishmaniasis canina. En
particular, se refiere a un polinucleótido y a una proteína que
tiene la secuencia de ADN y de aminoácidos como se muestra más
abajo expresada en el vector PQ31. La secuencia de aminoácidos
contiene un fragmento del vector (AA 1-37). El resto
de la secuencia de aminoácidos es idéntica a la de SEC ID NO 3
excepto en la fracción MBP y los siete primeros aminoácidos (AA
1-7):
y a una composición farmacéutica
para la prevención y el tratamiento, en seres humanos o animales,
de la Leishmaniasis, que comprende esta proteína o un polinucleótido
que comprende este ADN. Esta proteína según SEC ID No. 1 está
derivada de la inserción del gen PQV en el vector de expresión
pQE31. Aquí dicho gen quimérico preferiblemente codifica un
polipéptido generado con un peso molecular de 38 kD y un punto
isoeléctrico de
7,37.
Un huésped transformado que comprende un
polinucleótido según la invención está también comprendido en la
presente invención. En una forma de realización, el huésped es una
bacteria. Este huésped puede ser usado en un método para producir
una proteína de la invención, donde el método comprende las fases
de a) cultivar un huésped transformado según la invención bajo
condiciones propicias para la expresión de la proteína y b)
opcionalmente recuperar la proteína. Este método forma también parte
de la presente invención. Según la invención, un gen quimérico
sintético que codifica una proteína de la invención es producido.
Se obtiene por ensamblaje, con la región del ADN que codifica los
determinantes antigénicos específicos para las proteínas LiP2a,
LiP2b, LiPO y H2A, construyendo así una proteína rica en
determinantes antigénicos. El gen quimérico obtenido es expresado en
Escherichia coli y el producto se analiza con respecto a sus
propiedades antigénicas. Los resultados confirman que esta proteína
quimérica mantiene todos los determinantes antigénicos de las
proteínas genitoras y que ésta constituye un elemento útil
farmacéuticamente relevante para la LV canina, con una sensibilidad
que oscila entre el 80% y el 93%, y una especificidad de entre el
96% y el 100%.
Más particularmente, el gen quimérico formado
por las secuencias de ADN que codifican los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas de L. Infantum y la proteína
codificada por él, útil para la prevención y/o el tratamiento de la
Leishmaniosis canina y la proteína obtenida objeto de la invención,
es producido mediante los estadios siguientes, es decir:
- -
- Construcción del gen quimérico. Metodología.
- Estrategia de donación.
- Clonación de las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de la proteína histona H2A.
- Clonación de las secuencias que codifican rLiP2a-Q y rLiP2b-Q.
- Clonación de la secuencia rLiPO-Q.
- Clonación del gen quimérico.
- -
- Construcción del gen quimérico a partir de la construcción de productos intermedios.
- Clonación de epítopos específicos para los antígenos de L. infantum.
- -
- Construcción del producto final.
- Construcción del gen quimérico que codifica un polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos seleccionados.
- -
- Opcionalmente expresión de la secuencia así obtenida.
- -
- Evaluación del producto final.
- Sueros.
- Purificación de proteínas
- Electroforesis de proteínas e inmunoanálisis.
- Mediciones por Fast-ELISA
- -
- Evaluación del producto final.
- Propiedades antigénicas.
La sensibilidad y especificidad de la proteína
quimérica CP en la diagnosis del suero de LV canina.
La estrategia seguida de la clonación de las
secuencias de ADN que codifican cada uno de los determinantes
antigénicos seleccionados es la misma en cualquier caso, y en una
primera fase, la secuencia de interés es amplificada mediante una
PCR y el uso de oligonucleótidos específicos que contienen
objetivos para las enzimas de restricción en los extremos.
Para la fase de clonación, el producto
amplificado es dirigido mediante la enzima de restricción apropiada
y es insertado en el centro de restricción correspondiente del
plásmido pUC18.
Después de la secuenciación del ADN, el inserto
es recuperado y subclonado para el centro de restricción
correspondiente del plásmido modificado denominado
pMAL-c2. La modificación se hace por la inserción de
un codón de terminación descendente del objetivo HindIII en el
poliligador de pMal-c2, denominando al plásmido
resultante pMAL-c2*.
Con respecto a la clonación de la secuencia de
ADN que codifica los determinantes antigénicos de la proteína
histona H2A, debe ser señalado que el ADNc del clon cL71, que
codifica la histona H2A de L. Infantum, se usa como molde
para las reacciones de la PCR, y para la amplificación del ADN, que
codifica la región N-terminal de la histona H2A, más
exactamente rLiH2A-Nt-Q, los
oligonucleótidos siguientes son usados:
- Sentido, 5'-CCTTTAGCTACTCCTCGCAGCGCCAAG-3' (posición 84-104 de la secuencia cL71);
- Antisentido, 5'CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG-3' (inverso y complementario a la posición 204-224 de la secuencia cL71).
Las secuencias que están incluidas en los
oligonucleótidos para la donación y que no están presentes en la
secuencia madre cL-71 están marcadas con letras en
negrita.
El fragmento de ADN amplificado es donado
directamente a partir del centro de restricción Xmnl de
pMAI-c2*.
El fragmento es ordenado mediante el iniciador
#1234 malE y la región C-terminal antigénica de la
histona H2A, en particular
rLiH2A-Ct-Q, es amplificada con los
oligonucleótidos siguientes. Estos son:
- Sentido, 5'-GAATTCTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG-3' (posición 276-296 de la secuencia cL71).
- Antisentido,5'-GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCCTTGCC-3' (inverso y complementario a las posiciones 456- 476 del plásmido cL71).
Un triplete que codifica prolina (indicado como
GGG después de las letras subrayadas) está incluido en el
oligonucleótido sin sentido, el sitio de restricción EccRI incluido
en ambos oligonucleótidos para la donación está indicado por
subrayado.
Con respecto a la donación de las secuencias que
codifican rLiP2a-Q, debe ser señalado que las
regiones de interés son amplificadas por PCR de los ADNcs que
codifican LiP2a y LiP2b.
Los oligonucleótidos que son usados para
construir el clon de expresión LiP2a-Q, son los
siguientes.
- Sentido, 5'-GTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC-3'.
- Antisentido, 5'-GTCGACGGGGCCCATGTCATCATCGGCCTC-3'.
Se debe señalar que los sitios de restricción
SalI añadidos a los extremos 5' de los oligonucleótidos han sido
subrayados.
Al construir el clon de expresión
LiP2b-Q, los oligonucleótidos usados fueron:
- Sentido, 5'-TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGCC-3'.
- Antisentido, TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGGCCTC-3'.
En los extremos 5' de los oligonucleótidos los
sitios de restricción son incluidos para la enzima XbaI
(subrayada), y debido a la clonación necesita un triplete adicional
que codifique un residuo de prolina, incluido abajo del sitio de
restricción.
Con respecto a la donación de la secuencia
rLiPO-Q, debe ser señalado que se realiza la
clonación de la secuencia de ADN de la región
C-terminal de la proteína PO de L. Infantum
para amplificar un clon de ADNc llamado L27 y los oligonucleótidos
siguientes:
- Sentido, 5'-CTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCC-3' (posiciones 1-24 del L27 ADNc) y el iniciador de la secuencia pUC18 (#1211), el ADN amplificado es dirigido por las enzimas PstI+HindIII, con la inserción posterior en el plásmido pMAL-c2.
El clon resultante es denominado pPQI y se debe
destacar que el sitio de restricción PstI está incluido en el
nucleótido con sentido (secuencia subrayada) y que el objetivo de
restricción HindIII está presente en el L27 de ADNc.
Con respecto a la clonación del gen quimérico,
se debe señalar que las secuencias de ADN que codifican los cinco
determinantes antigénicos están ensamblados en un gen quimérico, y
este ensamblaje se realiza en el clon pPQI, al cual se añaden las
regiones de codificación para las regiones antigénicas
LiP2a-Q de forma secuencial en la dirección 3'
(llamando a los resultados de la clonación pPQII),
LiP2b-Q (clon pPQIII),
LiH2a-Ct-Q (clon pPQIV) y
LiH2A-Nt-Q (clon pPQV).
Finalmente, el inserto obtenido después de la
digestión con SacI+HindIII del clon final pPQV es insertado en el
plásmido de expresión pQE31, llamando al clon resultante pPQ.
Para completar la descripción que está siendo
realizada y con el fin de ayudar a la comprensión de las
características de la invención, la presente descripción está
acompañada, como parte íntegra de la misma, por un grupo de planos
de naturaleza ilustrativa sin ser limitante. Lo siguiente está
representado:
Figura 1. Corresponde a la expresión (A), la
purificación en columnas de amilosa (b) y la antigenicidad (C:
Western blot; D: ELISA) de cada una de las proteínas recombinantes
fusionadas a la proteína de enlace a la maltosa. La figura D
también presenta la reactividad en ELISA de cada una de las
proteínas recombinantes con respecto a la proteína completa.
Figura 2. Representación gráfica de los vectores
diferentes considerados para obtener el gen quimérico objeto de la
invención, donde la proteína pertinente destinada a llevar a cabo
un diagnóstico preciso en animales o seres humanos que muestra
síntomas de Leishmaniosis será extraída.
Figura 3. Corresponde a la identificación de la
proteína obtenida del gen quimérico fusionado a la proteína MBP,
cuya preparación está representada en la figura 2.
Figura 4. Corresponde a la expresión (A), la
purificación en columnas de amilosa (B) y la antigenicidad (C:
Western blot; F: ELISA) de los productos intermedios y de la
proteína quimérica final fusionada a proteína de enlace a la
maltosa (PQI-PGV). La figura también representa la
expresión de la proteína quimérica (D fila 1), purificación en
columnas de agarosa Ni-Nt (D fila 2) y la
antigenicidad de la proteína purificada contra un suero de LV (E:
Western blot) y contra una recogida de sueros (F: PQ en elisa).
Figura 5. Muestra finalmente una representación
gráfica sintetizada de la reactividad de una amplia variedad de
sueros caninos, divididos en tres grupos. El primer grupo contiene
animales con verdadera infección por L. Infantum. El segundo
grupo incluye suero obtenido de perros con varios síntomas clínicos
pero que no están infectados con Leishmania, y un tercer grupo se
compone de quince sueros de control de perros saludables. Esta
figura demuestra el valor de la invención para llevar a cabo la
diagnosis serológica de LV.
El gen quimérico formado a partir de las
secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de
cuatro proteínas de L. Infantum, útiles para la diagnosis
serológica de la Leishmaniosis canina y la proteína obtenida
propuesta están constituidos por la construcción de productos
intermedios. En un primer ejemplo, se realiza la clonación de
epítopos específicos para los antígenos de L. Infantum, que
está configurada en base a estudios anteriores sobre las
propiedades antigénicas de cuatro antígenos de proteínas de L.
Infantum (LiP2a, PIPO, LiP2b, LiH2a), que permiten la
existencia de epítopos B para ser definidos para estas proteínas, y
que son reconocidos específicamente por los sueros caninos de
LV.
Con el propósito de mejorar la especificidad
antigénica de estos antígenos con respecto a las proteínas de L.
Infantum, los determinantes antigénicos específicos son
clonados a partir de estas proteínas. Después eliminar ciertas
regiones de estas proteínas, éstas pueden ser reconocidas por
sueros de animales que son portadores de LV y otras enfermedades
diferentes.
Usando los oligonucleótidos específicos y la
amplificación por PCR de regiones específicas para los genes LiP2a,
LiP2b, Po y H2A, diferentes clones son construidos los cuales
expresan las proteínas recombinantes
rLiPO-Ct-Q,
rLiP2a-Q, rLiP2b-Q,
rLiH2A-Ct-Q y
rLiH2A-Nt-Q, recién detalladas en la
descripción de la invención con respecto a la metodología, donde se
han descrito los detalles de la clonación.
Las proteínas recombinantes usadas son las
siguientes:
- -
- rLiPO-Ct-Q, que corresponde a los 30 residuos C-terminales de la proteína ribosómica LiPO.
- -
- rLiP2a-Q y rLiP2b-Q, que son derivados de las proteínas ribosómicas LiP2a y LiP2b respectivamente.
- -
- dos subregiones de la histona H2A, que corresponden a los 46 residuos del N-término (xLiH2A-Nt-q), y a los 67 residuos del C-término (residuos (xLiH2A-Ct-q).
Cada una de las proteínas recombinantes
fusionadas a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) es expresada
en E. coli, según está representado en la figura número 1A,
y éstas fueron purificadas por cromatografía de afinidad en una
columna de amilosa B. Después del proceso de purificación, se
efectuó la electroforesis en las proteínas recombinantes
(direcciones 1 a 5).
Con el objetivo de analizar si las proteínas
recombinantes fueron reconocidas por sueros caninos de LV, se
incubó un Western blot, que contenía las proteínas recombinantes en
una mezcla de tres sueros caninos de LV. Suponiendo que todas estas
proteínas son reconocidas por los sueros, se concluye que los
determinantes antigénicos presentes en las proteínas madres se
mantienen en las proteínas recombinantes (C).
Las propiedades antigénicas de las proteínas
recombinantes son comparadas con los determinantes antigénicos de
los antígenos padres mediante un FAST ELISA, realizando la prueba
contra una recolecta de 26 sueros caninos de LV, justo como está
mostrado en la sección de la figura número ID, y el hecho de que
los sueros mostrasen un valor de reactividad similar, contra las
regiones antigénicas seleccionadas y las proteínas completas
correspondientes, demuestra que no ha ocurrido ninguna alteración
en el epítopo antigénico durante el procedimiento de clonación.
Con respecto a la construcción del producto
final, más exactamente del gen quimérico que codifica un
polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos
seleccionados, se debe señalar que la estrategia de la clonación
está indicada según la figura 2 sección A. Los productos intermedios
generados durante el proceso están mostrados.
Un clon que expresa las proteínas
rLiPO-Ct-Q (pPQI) se usa como el
vector inicial, y los fragmentos de ADN que codifican las proteínas
rLiPO-Ct-Q,
rLiP2a-Q, rLiP2b-Q,
rLiH2A-Ct-Q y
rLiH2A-Nt-Q son añadidos de forma
secuencial usando los sitios de restricción apropiados.
Después de cada fase de la clonación, la
orientación correcta de cada uno de los insertos es deducida a
partir del tamaño de los productos de la expresión, y finalmente la
secuencia de nucleótidos completa del clon final pPQV es
determinada y la secuencia de aminoácidos es deducida de la
secuencia representada en la figura número 3.
El polipéptido generado tiene una masa molecular
de 38 kD, con un punto isoeléctrico de 7,37, incluyendo las
secuencias separadoras que codifican la prolina, subrayadas en la
figura número 3. El objetivo de hacer esto es separar eficazmente
los dominios antigénicos y prevenir conformaciones terciarias
posibles que podrían interferir con la estabilidad y la
antigenicidad del producto final.
La expresión y recuperación de cada uno de los
productos intermedios está mostrada en la figura número 4, cuadros
A y B. Según estaba previsto, después de cada adición, el tamaño
del producto de la expresión en el vector pMAL aumenta gradualmente
hasta alcanzar un peso molecular de 80 kDa, observando un cierto
grado de rotura durante la purificación.
El gen quimérico fue también clonado en el
plásmido pQE, un vector que permite la expresión de las proteínas
con un fragmento de 6 histidinas en el N-término
extremo. El clon resultante y las proteínas recombinantes se
denominan pPQ y PQ respectivamente.
El nivel de expresión de la proteína en las
bacterias transformadas con el plásmido pPQ y las proteínas
purificadas está mostrado en la figura número 4, referenciado en
particular con una D, con la proteína PQ, purificada por
cromatografía de afinidad en condiciones de desnaturalización es más
estable que con la proteína recombinante pPQV representada en la
figura número 4, en el cuadro D fila 2.
Para evaluar el producto final, se usó una serie
de materiales, y obviamente algunas técnicas, según está descrito a
continuación.
Se usan sueros de LV obtenidos de perros de
diferentes orígenes. Los animales son evaluados clínicamente y
analíticamente en el laboratorio pertinente, generalmente en un
Departamento de Parasitología, y todos los sueros positivos son
evaluados para la inmunofluorescencia indirecta (IIF).
La presencia de amastigotos de los parásitos de
estos animales está confirmada por observación directa de los
ganglios linfáticos poplíteos y preescapulares, y a un segundo
grupo de 33 sueros de LV originados en otras regiones, se le dio
una diagnosis positiva en la ELISA contra los extractos proteínicos
del parásito y/o por IIF.
Los sueros de perros afectados por enfermedades
diferentes distintas de la LV son obtenidos a partir de distintos
orígenes. Dentro de este grupo, se encuentran sueros de las
infecciones siguientes:
- Mesocestoides spp.
- Dyphylidium caninum
- Uncinaria stenocephala
- Toxocara canis
- Dipetalonema dranunculoides
- Demodex canis
- Babesia canis
- Ehrlichia cannis
- Ricketsia ricketsiae.
El resto de los sueros fueron obtenidos a partir
de perros que mostraron varios síntomas clínicos que no estaban
relacionados con ningún proceso infeccioso, y los controles del
suero fueron obtenidos a partir de quince animales saludables
controlados cuidadosamente.
La purificación de las proteínas recombinantes
expresadas por los clones pMAI-c2 se realiza por
cromatografía de afinidad en columnas de amilosa, y la purificación
de la proteína recombinante expresada por el clon pPQ fue realizada
en columnas de resina Ni-NTA en condiciones de
desnaturalización (Qiagen).
Para analizar las proteínas, se efectuó una
electroforesis en geles de poliacrimida al 10% en presencia de SDS
bajo condiciones estándares. El análisis inmunológico de las
proteínas separadas por electroforesis se efectuó en las membranas
de la nitrocelulosa a las que las proteínas habían sido
transferidas. Las proteínas transferidas fueron bloqueadas con el 5%
leche desnatada en seco en un tampón PBS con el 0,5% de Tween
20.
Los filtros fueron consecutivamente puestos en
contacto con antisuero primario y secundario en soluciones de
bloqueo y uno inmunoconjugado marcado con peroxidasa fue usado como
segundo anticuerpo, visualizando el enlace específico mediante un
sistema ECL. La Figura 4E muestra un Western blot de la proteína
PQ.
Se usó una Fast-ELISA en vez de
la ELISA clásica, y la activación del antígeno se efectuó durante
12 horas a la temperatura ambiente.
Las placas fueron sensibilizadas con 100 \mul
de antígeno cuya concentración en cualquier caso fue de 2
\mug/ml.
Después de sensibilizar los pocillos las placas
fueron incubadas durante 1 hora con la solución de bloqueo (0,5% de
leche desnatada en polvo disuelta en PBS - 0,5% de Tween 20 y los
sueros fueron diluidos trescientas veces en la solución de
bloqueo).
Los pocillos fueron incubados con suero durante
2 horas a la temperatura ambiente, y después de la exposición de
los anticuerpos los pocillos fueron lavados con
PBS-Tween 20.
Los anticuerpos marcados con peroxidasa fueron
usados como segundos anticuerpos a una dilución de 1:2000 y el
color de la reacción fue desarrollado usando la ortofenilendiamina
del sustrato, midiendo la absorción a 450 nm.
En cuanto a la evaluación del producto final,
debe ser señalado que las propiedades antigénicas fueron
determinadas mediante el estudio pertinente de la reactividad de
los sueros caninos de LV contra la proteína quimérica y contra cada
uno de los productos intermedios en un ensayo "Western blot".
Todos los productos intermedios mantuvieron su antigenicidad al
igual que lo hizo el producto pPQV final, en todo el proceso de
clonación (Fig. 4C).
También debería ser señalado que la proteína
recombinante expresada por el plásmido pPQ fue reconocida por los
sueros de LV. Con el propósito de analizar con mayor precisión las
propiedades antigénicas de la proteína quimérica y los productos
intermedios, un análisis de la reactividad de una amplia variedad
de sueros caninos de LV fue realizado mediante una
fast-ELISA contra las proteínas recombinantes, como
se muestra en la sección F de la figura número 4. Se puede subrayar
que la sensibilidad de los diferentes productos intermedios de la
clonación aumenta después de cada fase de adición. También debería
ser señalado que la proteína pQI es reconocida por la mayor parte
de los sueros de LV y la proteína PQII igualmente por la mayor
parte de los sueros. Esta proporción es superior para la proteína
PQIII y las proteínas PQIV, PQV y PQ son reconocidas prácticamente
por todos los sueros.
Según lo mencionado anteriormente, el porcentaje
de reconocimiento mostrado por los sueros fue similar tanto en el
caso de la evaluación de las proteínas quiméricas PQV y PQ, como en
el de la evaluación de una mezcla de proteínas recombinantes rLiPO-
Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b y rLiH2A. Se constató que las
propiedades antigénicas de cada una de las 5 regiones antigénicas
seleccionadas están presentes en el producto de la expresión PQ, y
en consecuencia este producto puede ser usado para el diagnóstico
en vez de una mezcla de los antígenos expresados
individualmente.
Para determinar si la proteína quimérica puede
ser usada para la diagnosis del suero de la LV canina, y según el
análisis pertinente de una amplia variedad de sueros caninos contra
esta proteína, teniendo en cuenta las características clínicas de
los animales, los sueros caninos han sido clasificados en tres
grupos. Un primer grupo consistió en sueros de perros con una
verdadera infección por L. infantum. Un segundo grupo estaba
compuesto por sueros de perros que tenían varios síntomas clínicos
sin estar infectados con Leishmania, incluyendo perros infectados
con parásitos diferentes a la Leishmania, y que podrían mostrar
síntomas clínicos que podrían ser confundidos con aquellos
observados durante la Leishmaniosis.
El tercer grupo estaba constituido por sueros de
control, originados a partir de perros saludables.
En la figura número 5 los valores de reactividad
de promedio están mostrados para cada grupo de sueros, la
reactividad de los sueros de la LV alcanzando un valor de
reactividad de promedio de 0,8 (S.D. = 0,4).
Dentro de este grupo la reactividad de 12 sueros
fue positiva pero inferior a 0,35, mientras que la reactividad de
10 sueros alcanza valores de entre 0,35 y 0,5. Se observó que la
reactividad de 23 sueros varía entre 0,5 y 1,0, con 14 sueros que
muestran una reactividad superior a 1,0,
El valor de absorción de promedio de los sueros
del segundo grupo, es decir, el grupo infectado con parásitos
diferentes a los parásitos de la Leishmania, es 0,2 (S.D. = 0,05) y
la reactividad de los sueros de control, es decir, el tercer grupo,
es 0,1 (S.D. = 0,003). Sólo dos sueros del grupo 2 mostraron
reactividad entre 0,35 y 0,40.
Los datos presentados arriba indican que la
proteína quimérica PQ en la FAST ELISA tiene una sensibilidad del
80% para la diagnosis de la LV, si se define el valor de corte como
el valor de la reactividad de promedio de los sueros del grupo 2
más tres S.D.'s (es decir 0,35).
La sensibilidad del grupo evaluado alcanza el
93%, si el valor de corte está definido por los valores de la
reactividad del grupo de control. La proteína Q tiene una
especificidad del 96% para la diagnosis de la LV, cuando el valor
de corte está definido por los sueros mencionados del grupo 2. El
100% de la especificidad en el ensayo fue alcanzado al considerar
los valores de la reactividad de perros saludables.
El proceso que se debe usar es el siguiente:
1. Las placas de microtitulación están cubiertas
con anticuerpos por 100 \mul incubados de una solución que
contiene 1 \mug/ml de antígeno disuelto en un tampón PBS - 0,5%
Tween 20 - 5% leche desnatada (Tampón A).
La incubación se realiza durante 12 horas a la
temperatura ambiente, y luego las placas son lavadas tres veces con
el mismo tampón que no contiene ningún antígeno. Las placas
antigenadas secas podrían ser mantenidas a la temperatura
ambiente.
2. Una primera incubación de los pocillos se
efectuó con el suero del animal a una dilución de 1/200 en el
Tampón A. La incubación duró 1 hora.
3. Los pocillos son lavados con el tampón A,
según se describe en el punto 1, tres veces con un matraz de
lavado.
4. Se incuban con un segundo anticuerpo (IgG
marcado con peróxido) diluido 1:2000 en el tampón A, llevando a
cabo la incubación durante 1 hora.
5. Los pocillos son lavados otra vez con el
tampón A tres veces, como se indicó en la tercera sección, es decir
con un matraz de lavado.
6. La reactividad es revelada usando la
ortofenilendiamina del sustrato y la absorción medida a 450 nm.
La proteína usada para la diagnosis extraída del
gen quimérico es identificada, y la secuencia de nucleótidos que
codifica dicha proteína, siendo las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
No se considera necesario el hecho de extender
esta descripción puesto que un experto en la técnica puede entender
el objetivo de la invención y las ventajas que ésta confiere.
Los materiales, forma, tamaño y disposición de
los elementos son susceptibles al cambio, siempre que ello no
suponga un cambio en la esencia de la invención.
Los términos en los cuales esta descripción ha
sido escrita deberían siempre ser considerados de naturaleza amplia
y no limitantes.
La inmunidad intensa después de la recuperación
de Leishmaniasis cutánea ha supuesto un gran impulso para el
desarrollo de vacunas profilácticas contra esta enfermedad. Esta
inmunidad está derivada de la inducción de una respuesta T a la
cual se asocia la producción de citoquinas inflamatorias que
activan los macrófagos y destruyen los parásitos. La memoria
inmunológica en los casos de infección es probablemente mantenida
por la presencia persistente del parásito en el huésped en un
proceso conocido como inmunidad concomitante.
Los primeros estudios con respecto a la
vacunación contra la Leishmania en la década de los 40
usaban parásitos vivos como immunogenes. Estos estudios condujeron a
la producción de vacunas que producían una protección significante
contra una posterior reinfección. No obstante, el conocimiento de
la posibilidad de que los organismos vivos podrían producir
verdaderas infecciones condujo a que tales programas de vacunación
no se realizaran durante mucho tiempo y, por el contrario, el
interés se centró en vacunas basadas en parásitos muertos. Estos
estudios proporcionaron la primera evidencia de la posibilidad de
producir vacunas eficaces por inoculación de parásitos.
Las vacunas de subunidades se han centrado
fuertemente en antígenos proteínicos porque estos son fáciles de
identificar, aislar y clonar. No obstante, es preciso tener en
cuenta que no todas las moléculas de la vacuna potencial han de ser
proteínas. De hecho, el lipofosfoglicano (LPG) juega un papel
esencial en el establecimiento de la infección. Un problema más
importante en el uso de subunidades puede surgir a partir del hecho
de que puede no haya una respuesta a un único antígeno en una
población diversa genéticamente.
La vacunación con genes portadores de ácidos
nucleicos que codifican proteínas de Leishmania implica la
administración de material genético del parásito al huésped.
El primer vector de ADN para ser administrado
como vacuna contenía el gen gp63. También, el gen
PSA-2 ha sido introducido en un plásmido y se ha
observado que genera una respuesta Th-1 y la
inducción de protección.
Una proteína artificial denominada Q ha sido
recientemente descrita por nuestro grupo, la cual está compuesta
por diferentes fragmentos antigénicos de 4 proteínas de
Leishmania infantum (más específicamente, Lip2a, Lip2b, Po y
H2A), las cuales, después de ser usadas como antígeno, ha demostrado
tener un valor importante para la diagnosis de la Leishmaniasis
canina, con un 93% de sensibilidad y un 100% de especificidad en
comparación con sueros de animales de control sin infectar.
Igualmente, nuestro grupo ha demostrado que la proteína hsp70 de
Leishmania infantum es un objetivo importante de la
respuesta inmunitaria en infecciones provocadas por infección con
este parásito.
Con el objetivo de explorar la posibilidad de
que la proteína Q pueda ser usada para diseñar sistemas de
protección contra la infección por Leishmania infantum,
tanto por sí misma como en combinación con Hsp70, tres series de
experimentos fueron diseñadas usando el hámster como modelo. Un
experimento fue diseñado para controlar si la inmunización con la
proteína Q protegía a los animales contra la infección a corto
plazo, otro para comprobar si la inmunización los protegía a largo
plazo y el tercero fue realizado para comprobar este efecto
protector después de la inmunización con las dos proteínas juntas.
Después se observó tanto a partir del análisis a corto plazo como
del análisis a largo plazo, que la proteína Q era capaz de suscitar
una respuesta inmunitaria que reduce la carga parasitaria tanto en
el hígado como en el bazo tras la infección por Leishmania
Infantum en la mayor parte de los animales inmunizados, y que
la inmunización con las proteínas Q+Hsp70 también inducía una
respuesta significante contra ambas proteínas y conducía a una
reducción significante de la carga parasitaria en la mayoría de los
animales inmunizados.
4 animales fueron inmunizados con 5 microgramos
de proteína Q disueltos en 40 microlitros de adyuvante de Freund, y
otros 4 animales fueron inmunizados con la misma cantidad de
adyuvante emulsionada con 40 microlitros de solución salina PBS sin
la proteína. En la primera inmunización, el adyuvante de Freund
completo fue empleado combinado con la proteína, mientras que en
las dos inmunizaciones posteriores, se usó el adyuvante de Freund
incompleto mezclado con la proteína en la misma proporción de
proteína/adyuvante. Tres inmunizaciones intraperitoneales fueron
realizadas en intervalos de 15 días. Empezando desde la semana
después de cada inmunización y durante todo el periodo de
inmunización, se extrajeron muestras de sangre para medir la
respuesta humoral contra la proteína Q en ensayos ELISA. Se observó
que ya en la segunda semana después de la inmunización hubo una
respuesta IgG positiva contra la proteína Q, y que esta respuesta
fue alta después de la segunda semana tras la infección, y
aumentaba con el tiempo de inmunización alcanzando títulos de
1/100.000. Igualmente, se observó que la respuesta inmunitaria
contra la proteína Q no fue modificada significativamente después
de la infección con el parásito Fig. 1.
Quince días después de la inmunización, los
animales fueron infectados con una dosis de 10^{5} parásitos
promastigotos, diferenciados de amastigotos infecciosos originados
a partir de un hámster infectado. Se ha comprobado previamente que
el inóculo era capaz de inducir una parasitemia fuerte con la
enfermedad cuatro meses después de haberse administrado a los
parásitos, en el 100% de los animales infectados. La Tabla 1 indica
el nivel de parasitemia por mg de tejido tanto en el hígado como en
el bazo del los animales de control y vacunados. Es posible
observar que en todos los animales vacunados la carga parasitaria
en el hígado decrece con respecto a los controles, y que esto
ocurre de forma muy significante en el 75% de ellos. Cuando la carga
parasitaria en el bazo es examinada, es posible observar que
también en el 75% de los animales esta carga fue inferior
significativamente que la de los animales de control,
la RPL alcanzando el 83%-86%. El animal donde la RPL fue del 20% en el hígado, tuvo una del 48% en el bazo.
la RPL alcanzando el 83%-86%. El animal donde la RPL fue del 20% en el hígado, tuvo una del 48% en el bazo.
Después de cuatro semanas de infección, la carga
parasitaria fue medida por el método de diluciones limites (corto
plazo). La carga parasitaria está expresada como parásitos por
miligramo de tejido. RPL = reducción en la carga parasitaria en %.
Hámster inmunizado con la proteína Q.
\hskip0.5cm Los números representan la media
de tres determinaciones.
4 hámsters \hskip2cm 14 \pm 5
\hskip2cm 295 \pm
30
\hskip0.5cm El número representa la media de
los 4 aminales.
Para verificar el efecto de la vacunación con la
proteína Q en la reducción de la carga parasitaria a largo plazo,
usando otra vía de inoculación, 4 animales fueron inyectados
subcutáneamente con 5 microgramos de proteína Q disueltos en 40
microlitros de PBS y mezclados con 40 microlitros de adyuvante de
Freund. En la primera inmunización, se empleó adyuvante completo de
Freund, mientras que en las dos posteriores, se usó adyuvante de
Freund incompleto como se ha indicado anteriormente. La vacunación
fue administrada en tres dosis separadas en intervalos de 15 días.
Quince días después de la inmunización se les administró un inóculo
de 10^{5} parásitos infecciosos. Durante todo el periodo de la
inmunización y durante toda la infección (cinco meses) se extrajo
sangre para determinar el tipo de respuesta humoral contra la
proteína Q y contra las proteínas totales del parásito. La Figura 2
muestra que ya después de la segunda semana de inmunización, la
respuesta contra la proteína Q fue positiva, como en el caso
anterior, en tres de los ratones, y que la respuesta contra la
proteína fue altísima después de dos semanas desde la primera
inmunización. La respuesta siguió siendo altísima después de las
inmunizaciones restantes, alcanzando una concentración de 1/75.000
en la semana después de la tercera inmunización. En uno de los
animales la respuesta contra la proteína Q fue más lenta en tiempo,
aunque la respuesta alcanzó el nivel de los demás animales hacia el
final del experimento. Consecuentemente, a partir de los datos
derivados ambos del Ejemplo 1 y del Ejemplo 2, es posible concluir
que el grado de la respuesta inmunitaria contra la proteína, por
ambas vías, intraperitoneal y subcutánea, es muy rápido, aunque la
respuesta por vía intraperitoneal lograse títulos más altos en los
mismos periodos de tiempo (1/75.000 contra 1/30.000). La Figura 3
indica la respuesta contra la proteína Q en los animales de control.
Es posible observar que la reactividad contra esta proteína está
detectada en la 12-14ª semana después de la
infección, que es cuando los primeros síntomas atribuibles a una
leishmaniasis potencial empiezan a ser detectados en los animales
infectados. La Tabla 2 muestra los niveles de parasitemia en el
hígado y bazo de los animales de control y vacunados. Se puede
observar que el 50% de los animales fueron protegidos al nivel del
hígado, en cuanto a que la reducción en el nivel de parasitemia fue
altísima (87-89%). Uno de los animales no fue
protegido, mientras que en otro animal la reducción de la carga
parasitaria fue del 22%. Por el contrario, la reducción de la carga
parasitaria fue del 98-99% en el 100% de los
animales a nivel del bazo.
Después de 20 semanas de infección, la carga
parasitaria fue medida por el método de diluciones limites (largo
plazo). La carga parasitaria está expresada como parásitos por
miligramo de tejido. RPL = reducción en carga parasitaria en %.
Hámsters inmunizados con la proteína Q.
\hskip0.5cm El número representa la media de
tres determinaciones.
4 hámsters. \hskip2cm 1,8 x
10^{6} \pm 1,2 x 10^{5} \hskip2cm 5,2 x 10^{8} \pm 2,6 x
10^{7}
\hskip0.5cm Los números representan la media
de la carga parasitaria de los 4 animales.
Con el fin de evaluar si la proteína Q podría
ser usada para diseñar sistemas de protección en formulaciones que
contenían la proteína LiHsp70 de Leishmania infantum, se
efectuó un experimento en ratones Balb/C. Se observó que después de
la inmunización, la carga parasitaria tanto en el hígado como en el
bazo fue reducida significativamente, siendo en algunos animales,
cuatro órdenes de magnitud inferior.
Cada uno de los 4 hámsters fue inyectado
intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q y 5
microgramos de proteína LiHsp70 disueltos en 40 microlitros de PBS
y emulsionados en 40 microlitros de adyuvante de Freund. En la
primera inmunización, se empleó adyuvante de Freund completo,
mientras que en las dos posteriores, se usó adyuvante de Freund
incompleto como se ha indicado anteriormente. La vacunación fue
administrada en tres dosis separadas en intervalos de 15 días.
Quince días después de la inmunización se les
administró un inóculo de 10^{6} parásitos infecciosos por vía
intracardiaca y fueron sacrificados en la semana 22. Cada dos
semanas, a pesar del periodo de inmunización y durante toda la
infección, se extrajo sangre de ellos para determinar el grado de
respuesta humoral contra la proteína Q y contra la proteína
LiHsp70.
La carga parasitaria relativa entre los ratones
inmunizados con la proteína Q más LiHsp70 está mostrada en la tabla
3, Se observó que todos los animales fueron altamente protegidos y
en algunos de ellos, en el bazo, la reducción fue próxima a
dos-tres órdenes de magnitud.
\hskip0.5cm Los números representan la media
de tres determinaciones.
4 ratones \hskip2cm 5,1 x
10^{4} \pm 2 x 10^{3} \hskip2cm 3,2 x 10^{6} \pm 8 x
10^{4}
\hskip0.5cm Los números representan la media
de la carga parasitaria de los 4 animales.
Las Tablas 4 y 5 muestran que todos los animales
de los ejemplos 1 y 2 responden immunológicamente a la proteína Q,
y que empezando desde la segunda semana después de la inmunización,
la respuesta contra la proteína Q fue alta y esta respuesta aumentó
después de la inmunización (semana 4). La Tabla 6 muestra que la
respuesta contra la proteína LiHsp70 durante toda la duración del
experimento fue también positiva, aunque más baja que la respuesta
en el ejemplo 3 contra la proteína Q.
Las Tablas 4 y 5. Muestran la respuesta
inmunitaria en 4 hámsters inyectados intraperitonealmente con 5
microgramos de proteína Q (tabla 4-ejemplo 1, corto
plazo) y la respuesta inmunitaria en 4 hámsters inyectados
subcutáneamente con 5 microgramos de proteína Q (tabla 5 - ejemplo
2, largo plazo).
\hskip0.5cm Los sueros (diluidos 1/200) que
mostraban una densidad óptica de 3 tenían un título superior a
1/45.000.
Respuesta inmunitaria contra la
proteína Q (corto
plazo)
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/200.
\hskip0.5cm Los sueros (diluidos 1/200) que
mostraban una densidad óptica de 3 tenían un título superior a
1/45.000.
\newpage
Respuesta inmunitaria contra la
proteína Q (largo
plazo)
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/200.
Muestra la respuesta inmunitaria en 4 hámsters
inyectados intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q más
5 microgramos de proteína LiHSP 70 (ejemplo 3, largo plazo). Los
ratones inmunizados con la proteína Q + Hsp70 respuesta inmunitaria
contra la proteína Q.
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/800.
Respuesta inmunitaria contra la
proteína
Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/200.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones inmunizados con la
proteína Q + Hsp70 respuesta inmunitaria contra la proteína
Hsp70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/800.
\newpage
Respuesta inmunitaria contra la
proteína
Hsp70
\hskip0.5cm Los sueros fueron diluidos
1/200.
Cuatro ratones Balb/C fueron inyectados cada uno
intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q y 10^{6}
Unidades de Formación de Colonias(CFU) de BCG (Bacille
Calmette-Gu_rin) disueltas en 40 microlitros de
PBS. La inmunización fue efectuada en tres dosis, después de 15
días. 15 días después de la inmunización, se les administró un
inóculo de parásitos infecciosos de 10^{5} BCN150 de L.
Infantum por vía intracardiaca. Cada dos semanas, durante toda
la duración de la inmunización y durante toda la infección, se
tomaron muestras de sangre de ellos para examinar el grado de
respuesta humoral a la proteína Q. Los animales fueron sacrificados
8 semanas después de la infección.
La Tabla 7 (a y b) muestra que los animales
inmunizados responden positivamente a la proteína Q empezando desde
la segunda semana y que la respuesta aumenta progresivamente hasta
que en muchos casos alcanza valores de 400,000. La Tabla 8 muestra
la diferencia de carga parasitaria entre el hígado y bazo de los
animales vacunados y de control.
| \hskip0.5cm el número 3. es equivalente a un excedente en el sistema de medición |
| \hskip0.5cm los sueros fueron tomados al principio de cada una de las semanas indicadas |
| \hskip0.5cm la primera inmunización fue efectuada en el día 0, la 2ª en el día 15 y la tercera en el día 30. |
\newpage
8 semanas después de la infección, la carga
parasitaria fue medida por microscopía óptica de impresiones
tisulares mediante la medición de distintos campos que contienen
7000 células nucleadas. La carga parasitaria está representada como
la cantidad de parásitos por miligramo de tejido, habiendo
calculado previamente que 1 parásito por 1000 células nucleadas es
equivalente a una cantidad aproximada de 210 parásitos por
miligramo de tejido. RPB = reducción de carga parasitaria, %.
4 animales. Media \hskip2cm 400
\pm 15 \hskip2cm 4155 \pm
30
\hskip0.5cm n.d. parásitos podrían no ser
detectados en 5000 células nucleadas.
<110> Laboratorios
CBF-Leti
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> gen quimérico formado por secuencias
de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro
proteínas de L. Infantum y proteína codificada por dicho
gen, y composición farmacéutica útil de prevención
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BO 42418,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-12-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:proteína Q expresada en PQ31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de secuencia artificial:
ADN que codifica la proteína Q
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de secuencia
artificial:proteína Q expresada en pMAL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctttagcta ctcctcgcag cgccaag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgggggcg ccagaggcac cgatgcg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattctccg taaggcggcc gcgcag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcgggc gcgctcggtg tcgccttgcc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacccca tgcagtacct cgccgcgtac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgggg cccatgtcat catcggcctc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagacccg acatgtcgtc gtcttcctcg cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagagggg ccatgtcgtc gtcggcctc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagcccg ccgctgccgc gccggccgcc
\hfill30
Claims (22)
1. Proteína
(a) que tiene la secuencia de aminoácidos como
se muestra en SEC ID N°. 1 o
(b) que tiene al menos el 90% de identidad de
los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°. 1 y
que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis en un
ser humano o animal.
2. Polinucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína según la reivindicación
1.
3. Polinucleótido según la reivindicación 2,
donde la secuencia de nucleótidos es la SEC ID N°. 2.
4. Huésped no humano transformado que comprende
un polinucleótido según las reivindicaciones 2 o 3.
5. Huésped transformado según la reivindicación
4, donde el huésped es una bacteria.
6. Método para producir una proteína según la
reivindicación 1, donde dicho método comprende las fases de a)
cultivar un huésped transformado según las reivindicaciones 4 o 5
bajo las condiciones propicias para la expresión de la proteína y
b) opcionalmente recuperación de la proteína.
7. Composición que comprende una proteína según
la reivindicación 1.
8. Composición que comprende un polinucleótido
según las reivindicaciones 2 o 3.
9. Composición según las reivindicaciones 7 u 8,
donde la composición es una composición farmacéutica.
10. Composición farmacéutica para la prevención
y tratamiento, en seres humanos y animales, de la Leishmaniasis,
que comprenden una proteína según la reivindicación 1.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10, que además comprende un adyuvante fisiológico
adecuado para administración por vía intraperitoneal, subcutánea o
intramuscular.
12. Composición farmacéutica según las
reivindicaciones 10 u 11, que además comprende la proteína LiHsp70,
completa o fragmentada, o sus variantes.
13. Composición farmacéutica para la prevención
y tratamiento, en seres humanos y animales, de la Leishmaniasis,
que comprende un polinucleótido según las reivindicaciones 2 o
3.
14. Composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 10-12, donde la composición
es una vacuna.
15. Proteína según la reivindicación 1 para el
uso para la prevención o tratamiento de la Leishmaniasis en un ser
humano o animal.
16. Polinucleótido según las reivindicaciones 2
o 3 para el uso para la prevención o tratamiento de la
Leishmaniasis en un ser humano o animal.
17. Composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 10-12 o 14 para el uso para
la prevención o tratamiento de la Leishmaniasis en un ser humano o
animal.
18. Proteína según la reivindicación 1 para el
uso para generar una respuesta inmunitaria.
19. Composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 10-12 y 14 para el uso para
generar una respuesta inmunitaria.
20. Composición farmacéutica que comprende
anticuerpos dirigidos contra la proteína según la reivindicación
1.
21. Uso de una composición farmacéutica según
las reivindicaciones 10-14, 17, 19 o 20 para la
preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de
la Leishmaniasis en un ser humano o animal.
22. Uso según la reivindicación 21 donde el
medicamento es una vacuna.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11382598P | 1998-12-23 | 1998-12-23 | |
| CA2256124A CA2256124C (en) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Chimeric gene formed of the dna sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of l. infantum, and protein encoded by said gene, and pharmaceutical composition useful for preventing and/or treating leishmaniosis in animals or humans |
| CA2256124 | 1998-12-23 | ||
| US113825P | 1998-12-23 |
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Family Applications Before (1)
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|---|---|---|---|
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