ES2334706T3

ES2334706T3 - Vacunas contra la malaria.

Info

Publication number: ES2334706T3
Application number: ES06744328T
Authority: ES
Inventors: Kevin K. A. The London School Of Hygiene TETTEH; David J. Conway
Original assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Current assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2010-03-15
Anticipated expiration: 2026-05-26
Also published as: WO2006126030A2; EP1888625B1; WO2006126029A3; GB0510763D0; US20090196884A1; US20140093530A1; WO2006126029A2; WO2006126030A3; ATE446970T1; EP1888625A2; DE602006010061D1

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia antigénica derivada de regiones de repetición de alelos de bloque 2 de MSP1 de tipo K1 de Plasmodium falciparum, en el que dicha secuencia antigénica se selecciona de la secuencia de SEC. ID no.1 (denominada secuencia de repetición sintética 1 de tipo K1; KISR): **(Ver fórmula)** y análogos funcionales de la misma de la misma longitud y sustancialmente la misma inmunogenicidad tal como se determina en forma de una proteína de fusión unida en el extremo N-terminal a una secuencia de glutatión-S-transferasa (GST) N-terminal.

Description

Vacunas contra la malaria.

La presente invención se refiere a vacunas contra la malaria que incluyen como componente antigénico una secuencia sintética que representa una combinación de fragmentos de la región de repetición de bloque 2 de tipo K1 de la proteína de superficie del merozoíto 1 (MSP1) de Plasmodium falciparum. El tipo K1 de la región de bloque 2 de MSP1 es sumamente polimórfico y se ha encontrado que el tipo K1 es el más común de los tipos de región de bloque 2 de MSP 1 en poblaciones africanas. La presente invención se refiere entre otras cosas a aprovechar la amplia diversidad de secuencia de la región de bloque 2 de tipo K1 de MSP1 para su uso en vacunas en una secuencia denominada secuencia de repetición sintética de tipo K1 (K1SR). Esta secuencia puede inducir respuestas de anticuerpos que tienen amplia capacidad para seleccionar como diana alelos de la región de bloque 2 de tipo K1 de MSP1. Para mejorar la amplitud de la eficacia como inmunógeno frente a P. falciparum, además puede incorporarse en constructos de fusión con otros epítopos de MSP1 de P. falciparum.

Antecedentes de la invención

El polimorfismo en antígenos de patógenos representa un desafío complejo para el diseño de vacunas, particularmente cuando la diversidad es extensa. La región de bloque 2 N-terminal de MSP1 de Plasmodium falciparum ejemplifica una alta diversidad en un antígeno de patógenos. Se conoce que esta región es la diana de anticuerpos humanos adquiridos de manera natural que están asociados con un riesgo reducido de malaria clínica (Conway et al., (2000) Nature Med. 6, 689-692; Polley et al., (2003) Infect. & Immun. 71, 1833-1842; Cavanagh et al., (2004) Infect. & Immun.72, 6492-6502). Por tanto, ha habido un interés en respuestas de sensibilización frente a la región de bloque 2 de MSP 1 mediante vacunación, particularmente en niños pequeños. Sin embargo, hay tres tipos alélicos principales de la región de bloque 2 de MSP1 (el tipo K1, el tipo MAD20 y el tipo R033) y existe mucho polimorfismo de subtipo dentro de dos de éstos (K1 y MAD20).

Los tipos de bloque 2 tanto K1 como MAD20 presentan una extensa diversidad de secuencia dentro de las secuencias de repetición de tri- y hexa-péptido central de cada tipo. Los tipos K1 y MAD20 contienen secuencias de repetición de tri- y hexa-péptido diferentes con serina en la primera posición y las variaciones en la secuencia y el número de repeticiones producen diferencias alélicas de subtipo dentro de cada uno de los tipos (Conway et al., (2000) Nature Med. 6, 689-692; Miller et al., (1993) Mol. Biochem. Parasitol. 59,1-14). A pesar de esta diversidad de secuencia, la mayoría de los sueros humanos de individuos en regiones endémicas de malaria reconocen múltiples variantes alélicas del bloque 2 dentro de un tipo, y aunque algunos individuos tienen respuestas de anticuerpos específicos de un único alelo frente al bloque 2 de MSP1, esto es menos común (Cavanagh et al. (1998) J. Immunol. 161, 347-359; Cavanagh & McBride (1997) Mol. & Biochem. Parasitol. 85,197-211). Esto puede explicarse de dos modos. En primer lugar, hay secuencias flanqueantes específicas del tipo compartidas asociadas con los tipos de bloque 2 tanto K1 como MAD20, que son la diana de algunas respuestas de anticuerpos, y en segundo lugar, las características específicas de la diversidad de secuencia dentro de los tipos K1 y MAD20. Se usan cuatro tripéptidos diferentes en el tipo K1 y se usan 5 tripéptidos (diferentes) en el tipo MAD20. Por tanto, todos los alelos de bloque 2 de tipo K1 contienen combinaciones de los tripéptidos SAQ, SGA, SGP y SGT, flanqueadas por secuencias comunes únicas para el tipo K1 del bloque 2. Todos los alelos de bloque 2 de tipo MAD20 contienen combinaciones de los tripéptidos SGG y SVA (con variaciones menores en el extremo N-terminal de las repeticiones usando los tripéptidos SVT, SKG y SSG), flanqueadas por secuencias comunes del tipo MAD20. La variación dentro de los tipos de bloque 2 K1 y MAD20 parece estar restringida a estas diferencias, más alguna restricción de tamaño en la longitud de la secuencia repetitiva permitida por la molécula MSP1 (Jiang et al. (2000) Acta Tropica 74, 51-61).

Tal como ya se indicó anteriormente, el tipo K1 es el más común de los tipos de región de bloque 2 de MSP1 en poblaciones africanas. Por ejemplo, los inventores encontraron en una población de Zambia que 49 de 91 alelos de la región de bloque 2 de MSP1 de P. falciparum eran del tipo K1 y que la mayoría de éstos tenían secuencias únicas debido a la variación en motivos repetitivos de tri- y hexa-péptido. Tal como se indica en Polley et al. (2003) ibídem, hay por tanto un interés particular en respuestas inmunitarias de sensibilización que seleccionen como diana ampliamente la diversidad alélica asociada con las repeticiones de las regiones de bloque 2 de tipo K1 de MSP1 incluyendo motivos de repetición a partir de tales regiones en vacunas contra la malaria.

Sumario de la invención

Como enfoque para abordar la necesidad indicada anteriormente, se ha diseñado una secuencia polipeptídica novedosa de longitud mínima de 78 residuos de aminoácido que contiene una gran proporción de todos los epítopos de anticuerpo dentro de las secuencias de repetición de la región de bloque 2 de tipo K1 de MSP1 (la secuencia de repetición sintética de tipo K1 denominada K1SR y presentada como SEC. ID. No.1). Esto se logró usando sueros de regiones endémicas de malaria y 23 péptidos sintéticos que representan todas las secuencias de aminoácidos de 12-meros (con la serina de los tri-péptidos en la posición 1) derivados de una colección de secuencias de repetición del bloque 2 de tipo K1 de MSP 1 presentes en la base de datos GenBank. La secuencia sintética resultante se ha expresado como una proteína de fusión recombinante que tiene en el extremo N-terminal una secuencia de glutatión-S-transferasa (GST) y de esta forma se ha mostrado que presenta una reactividad específica de tipo más amplio con el suero humano que alelos individuales conocidos de la región de bloque 2 de tipo K1 de MSP1.

En un aspecto, la presente invención proporciona por tanto un polipéptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos como secuencia antigénica (SEC ID no.1; véase también la figura 4):

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La invención también se extiende a polipéptidos antigénicos que comprenden un análogo funcional de la secuencia de K1SR que es de la misma longitud y que conserva sustancialmente la misma inmunogenicidad que la secuencia de K1SR cuando está en forma de una proteína de fusión con GST, es decir, unida en el extremo N-terminal a una secuencia de GST. Una secuencia de este tipo puede ser cualquier secuencia de GST convencional tal como se emplea comúnmente para la expresión y purificación de proteínas recombinantes como proteínas de fusión, por ejemplo, una secuencia de GST codificada por un vector de expresión pGEX (Smith et al., Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase (1988) Gene 67, 31-40). Se ha encontrado que las regiones de repetición de bloque 2 de MSP1 son poco inmunógenas a menos que se conjuguen con una proteína portadora. Puede considerarse "sustancialmente la misma inmunogenicidad" usando un panel de diferentes sueros o anticuerpos monoclonales que se unen a fragmentos que presentan epítopos que abarcan toda la secuencia de K1SR. Una variante con "sustancialmente la misma inmunogenicidad" se unirá deseablemente con todos los mismos anticuerpos o al menos aproximadamente del 90 al 99% de los mismos, preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de los mismos. Un análogo funcional de este tipo puede tener una o más sustituciones, por ejemplo, una o más sustituciones conservadoras, que conservan la inmunogenicidad deseada.

Tal como se trató anteriormente, puede esperarse que un análogo funcional comparta con la secuencia de SEC. ID. NO.1 la capacidad de unirse con anticuerpos monoclonales a cada una de las siguientes secuencias: (i) SGASAQSG (ii) SAQSGTSGTS y (iii) SAQSGTSGT. Tales anticuerpos monoclonales se ejemplifican mediante los anticuerpos monoclonales Mab 12.2, Mab 123D3 y Mab CE2, respectivamente, tal como se denominan en los ejemplos más adelante. Tales anticuerpos monoclonales pueden usarse en la selección inicial para buscar análogos funcionales de SEC. ID. No. 1.

Los polipéptidos preferidos de la invención son proteínas de fusión en las que una secuencia de repetición sintética seleccionada de la K1SR y análogos funcionales de la misma está unida en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos adicional. Por ejemplo, tal como se indicó anteriormente, una secuencia de repetición sintética de tipo K1 tal como se describió anteriormente puede expresarse preferiblemente como una proteína de fusión en la que está unida en el extremo N-terminal a una secuencia de GST u otra secuencia de aminoácidos que puede usarse para ayudar en la purificación, por ejemplo una secuencia N-terminal para proporcionar una proteína con una cola de His. Tales constructos de fusión presentan una reactividad específica de tipo más amplia con sueros de individuos infectados por P. falciparum que los alelos de bloque 2 de tipo K1 de MSP1 conocidos, más particularmente, por ejemplo, los alelos designados 3D7 y Palo Alto.

De particular interés para el diseño de vacunas son constructos de fusión en los que una secuencia de repetición sintética de tipo K1 tal como se describió anteriormente presenta inmunogenicidad, es decir, puede producir una respuesta inmunitaria frente a varios alelos de la región de bloque 2 de tipo K1 de MSP1, y está unida a una o más secuencias que contienen epítopos adicionales que pueden producir una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria celular en seres humanos frente a un antígeno de P. falciparum. De especial interés son constructos de fusión en los que una secuencia de repetición sintética de tipo K1 de la invención presenta una inmunogenicidad deseable, por ejemplo tal como cuando está unida a una secuencia de GST N-terminal, y está unida a una o más secuencias que contienen epítopos adicionales seleccionadas de otras secuencias derivadas de MSP1, preferiblemente secuencias que contienen epítopos de células T humanas que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular frente a regiones de bloque 2 de MSP1 y P. falciparum de los tipos MAD20 y RO33. Preferiblemente, un constructo de fusión híbrido de este tipo puede incorporar, por ejemplo, o estar constituido por, por ejemplo, todas las siguientes secuencias unidas consecutivamente en la dirección de N-terminal a C-terminal: (i) una secuencia N-terminal, por ejemplo, para ayudar en la purificación tal como una secuencia de GST o una secuencia de cola de His; (ii) una secuencia que comprende una o más secuencias que presentan epítopos de células T humanas derivadas de un alelo de tipo K1 de MSP1 tal como el alelo 3D7 y que puede activar una respuesta inmunitaria celular y (iii) una secuencia de repetición sintética de tipo K1 de la invención. El componente (ii) puede ser, por ejemplo, un alelo de bloque 1-bloque 2 de tipo K1 completo o una parte o partes del mismo. Puede comprender una secuencia artificial que proporciona una combinación de epítopos de células T, por ejemplo el epítopo 1 de células T (T1) y el epítopo 2 de células T (T2) derivados del alelo de bloque 1-bloque 2 3D7. Una secuencia híbrida de este tipo puede extenderse adicionalmente de manera deseable en el extremo C-terminal mediante unión tanto a una región de bloque 2 de MSP1 del tipo MAD20 como a una región de bloque 2 de tipo R033 de MSP1.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición para inducir una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum que incluye como elemento antigénico una secuencia de repetición sintética de tipo K1 en forma de un polipéptido o una proteína de fusión tal como se trató anteriormente.

Los aspectos de la invención indicados anteriormente se tratan en más detalle a continuación con referencia especialmente a las siguientes secuencias y figuras.

SEC. ID no. 1: la secuencia de aminoácidos (78 residuos de aminoácidos) de la invención indicada anteriormente y designada secuencia de repetición sintética de tipo K1 o K1 SR; el inserto de ADN tal como se mostró anteriormente para la clonación de una secuencia codificante optimizada para la K1SR en pPCR-Script Amp y la transferencia de la secuencia codificante al vector de expresión pGEX-2T para la expresión de la K1SR como una proteína de fusión con GST en E. coli; el inserto de ADN tal como se muestra en la figura 8 constituido por los siguientes módulos comenzando en el extremo 5' terminal: (i) sitio de endonucleasa de restricción BamH1 (GGATTC) que codifica GS; (ii) secuencia codificante para la K1 SR que comienza en TCT y que acaba en ACC, precedida por una secuencia flanqueante en 5' que incluye el epítopo 1 de células T (conservado en MSP1) y el epítopo 2 de células T (menos conservado en MSP1) y seguida por una secuencia flanqueante en 3'; (ii) un sitio de endonucleasa de restricción Sac1 (GAGCTC) que codifica EL; (iii) una secuencia codificante para un alelo del bloque 2 de tipo R033 de MSP1; (iv) un sitio de restricción de KpnI (GGTACC) que codifica GT; (v) secuencia codificante para el alelo del bloque 2 Wellcome (un alelo de tipo MAD 20); (vi) el codón de terminación TAA y (vii) un sitio de restricción SmaI (CCCGGG); expresándose la proteína multialélica híbrida usando el inserto de ADN tal como se muestra en la figura 8. La secuencia del epítopo 1 de células T (T1) y la secuencia del epítopo 2 de células T (T2) están subrayadas.

Breve descripción de las figuras

Se hace referencia a las siguientes figuras a continuación para describir adicionalmente el diseño y la construcción de la secuencia de repetición sintética de tipo K1 indicada anteriormente y constructos de fusión más largos que contienen esa secuencia de repetición sintética:

Figura 1.A. Representación esquemática de secuencias de las repeticiones de bloque 2 de MSP1 de tipo K1 en 49 alelos de este tipo muestreados en el norte de Zambia. B. Correlación negativa entre la longitud de secuencia de aminoácidos en la parte N-terminal de las repeticiones (región SAQSGA) y la parte central de las repeticiones (región SAQSGT). C. Correlación negativa entre la longitud de secuencia de aminoácidos y la parte C-terminal de las repeticiones (región SGPSGT) y la parte central de las repeticiones (región SAQSGT).

Figura 2. Reactividades de diferentes anticuerpos contra un panel de 23 péptidos sintéticos que representan las secuencias de repetición de aminoácidos de 12-meros en el tipo K1 de bloque 2 de MSP1. Los péptidos se exponen en tres columnas verticales de 8, 8 y 7 puntos sobre las membranas y las identidades de estas secuencias peptídicas se enumeran a la derecha de cada membrana (leyendo hacia abajo para cada columna de puntos y comenzando con la columna a mano izquierda). Las secuencias que corresponden a los puntos que son visiblemente reactivos con un anticuerpo dado están destacadas en negrita. A. Reactividad de dos anticuerpos monoclonales murinos (AcM) que se sabe que reaccionan con el tipo K1 del bloque 2 de MSP1. B. Reactividad de dos sueros humanos de adultos que viven en zonas endémicas en África.

Figura 3.A. Esquema que muestra las reactividades de AcM murinos (12.2, 123D3 y CE2 contra bloque 2 de MSP1) y un control negativo (12.1 contra bloque 4) y 24 sueros de africanos adultos (12 de Lagos, Nigeria y 12 del pueblo de Brefet en Gambia) y un suero control europeo representativo (E1) frente a los 23 péptidos sintéticos elegidos usados para llegar a la K1SR. B. Especificidad deducida de los AcM y los anticuerpos en cada uno de los sueros humanos facilitada como líneas horizontales que se mapean en diferentes partes de la secuencia de superrepetición compuesta designada K1 SR tal como se muestra esquemáticamente.

Figura 4. Figura que muestra la estructura completa de la K1SR expresada como una proteína de fusión con GST.

Figura 5.A. SDS-PAGE teñido con Coomassie que muestra la proteína de fusión GST-K1SR (carril 1) y el portador GST solo (carril 2). B. Reactividades de los AcM frente a la K1SR mediante ELISA. C. Gráfico de dispersión de los valores de DO del ELISA para la reactividad de IgG frente a la K1 SR y frente a cada uno de los dos antígenos de repetición de alelo único (Palo Alto y 3D7) en sueros de 78 adultos del oeste de África (38 de Nigeria y 40 de Gambia).

Figura 6.A. Especificidad deducida de los anticuerpos de cada uno de cinco ratones inmunizados con la K1SR y dos grupos de tres ratones inmunizados con antígenos de repetición de alelo único (3D7 y Palo Alto) tal como se determina mediante la reactividad con péptidos sintéticos (el mismo panel de 23 péptidos que se describió en las figuras 2 y 3). B. Secuencias de aminoácidos deducidas de las repeticiones de bloque 2 de MSP1 en 5 líneas cultivadas de P. falciparum que tienen alelos de bloque 2 de MSP1 de tipo K1 y títulos de anticuerpos en cada uno de los ratones inmunizados con K1SR contra esquizontes de cada una de las líneas cultivadas mediante inmunofluorescencia.

Figura 7. Representación esquemática de un constructo híbrido con una cola de His N-terminal que incorpora la K1SR precedida por el alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 3D7 (un alelo del tipo K1) que proporciona epítopos de células T (número de acceso de Genbank NP_704838.1; residuos de aminoácido 20 a 133 en los que el residuo de aminoácido 1 es el residuo de metionina inicial de la secuencia de MSP1) y seguida por regiones de bloque 2 de MSP1 de los tipos R033 y MAD20 (residuos de aminoácido 54-106 de número de acceso de Genbank AB116601 y residuos de aminoácido 54 a 118 de número de acceso de Genbank CAA33163, respectivamente) (B); (A) representaciones esquemáticas de constructos quiméricos correspondientes constituidos por alelos de MSP 1 únicos unidos y el ADN codificante.

Figura 8: Inserto de ADN en el que los diferentes módulos tal como se indicó anteriormente están destacados en diferentes tonos de gris y la correspondiente secuencia de proteína híbrida codificada.

Figura 9: Esquema que muestra constructos parciales que corresponden a la proteína híbrida mostrada en la figura 8. Las secuencias se derivaron tal como sigue: (a) el epítopo 1 de células T y el epítopo 2 de células T corresponden a las posiciones de residuos de aminoácido 20 a 29 y 44 a 63, respectivamente, del alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 3D7 (número de acceso de Genbank NP_704838.1; posiciones de aminoácidos 20-133; bloque 1 de MSP1 3D7, residuos de aminoácido 20-53 y bloque 2 de MSP1 3D7 (incluyendo las secuencias flanqueantes), residuos de aminoácido 54-133); (b) la K1SR más la secuencia flanqueante en 3'; (c) bloque 2 de MSP1 RO33 (número de acceso de Genbank AB116601; residuos de aminoácido 54-106); (d) bloque 2 de MSP1 Wellcome (número de acceso de Genbank CAA33163; residuos de aminoácidos 54-118).

Tamaños pronosticados de las proteínas:

: Antígeno (a): [Plus K1 Bk1/T]-3D7-Ro33 [3R] 16,6 kDa

: Antígeno (b): R033-Wellcome [RW] 11,0 kDa

: Antígeno (c): [Plus K1 Bk1/T]-3D7-RO33-Wellcome [3RW] 22,5 kDa

: Antígeno (d): [Minus K1 Bk1]-3D7-RO33-Wellcome [3RW] 17,3 kDa

: Antígeno (e): [Minus K1 Bk1]-K1SR-RO33-Wellcome [3RW] 17,8 kDa

: Producto final: [Plus K1 Bk1/T]-K1SR-RO33-Wellcome [3RW] 22,8 kDa.

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En el ejemplo 3 se facilita un esquema de construcción para la proteína híbrida final.

Descripción detallada Secuencia de repetición sintética de tipo K1

Tal como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende como secuencia antigénica una secuencia sintética diseñada para contener múltiples epítopos que se producen entre diferentes subtipos serológicos de la región de bloque 2 de tipo K1 sumamente polimórfica de la proteína MSP1 de P. falciparum. Más particularmente, se proporciona un polipéptido de este tipo en el que dicha secuencia antigénica es una secuencia de repetición sintética seleccionada de la secuencia de SEC. ID. No.1 (la K1SR; véase también la figura 4) y análogos funcionales de la misma, de la misma longitud y sustancialmente la misma inmunogenicidad tal como se determina en forma de una proteína de fusión con GST. La K1SR apenas supera la longitud de regiones de repetición de tipo K1 que se producen de manera natural de MSP1. Sin embargo, en forma de una proteína de fusión con GST recombinante, se ha mostrado que la secuencia contiene epítopos que reaccionan con los tres AcM 12.2, 123D3 y CE2 que tienen especificidad conocida por péptidos de la región de bloque 2 de MSP 1 de tipo K1 y diversos sueros humanos que se sabe que reaccionan con las secuencias de repetición de bloque 2 de MSP1 de tipo K1. La K1SR de la invención tiene una reactividad específica de tipo más amplia que los alelos de MSP1 de tipo K1 que se producen de manera individual tal como se ilustra en los ejemplos más adelante en referencia a estudios comparativos con los alelos de MSP1 de tipo K1 conocidos 3D7 y Palo Alto. En ratones, se ha mostrado también que la K1SR como proteína de fusión con GST induce anticuerpos que reaccionan con un conjunto más amplio de parásitos P. falciparum que proteínas recombinantes basadas en alelos únicos del tipo K1 de MSP1.

Por tanto, la KISR de la invención y análogos funcionales de la misma se proponen como secuencias sumamente ventajosas para su provisión en composiciones para inducir respuestas inmunitarias frente a P. falciparum, particularmente en seres humanos. Tal como se indicó anteriormente, hay un interés particular en tales composiciones, por ejemplo, para sensibilizar respuestas inmunitarias frente a P. falciparum en niños pequeños en regiones en las que hay un alto riesgo futuro de malaria clínica. Una composición de este tipo contendrá de manera deseable secuencias que presentan epítopos adicionales que pueden inducir respuestas inmunitarias frente a un antígeno de P. falciparum. Tal como se indicó anteriormente, pueden proporcionarse una o más secuencias en un constructo de fusión que incorpora la K1SR o un análogo funcional de la misma. Sin embargo, tales secuencias pueden proporcionarse también como uno o más polipéptidos separados tal como se trata adicionalmente a continuación.

Proteínas de fusión que contienen una secuencia de repetición sintética de tipo K1

Tal como se indicó anteriormente, la secuencia de repetición sintética de tipo K1 de la invención se expresa normalmente como una proteína de fusión recombinante. Por ejemplo, para facilitar la purificación, una secuencia de repetición sintética de tipo K1 puede expresarse unida en el extremo N-terminal a una secuencia de GST o una secuencia de cola de residuos de His. Además, tal como se indicó anteriormente, una proteína de fusión de este tipo puede usarse directamente como inmunógeno para inducir respuestas de anticuerpo frente a P. falciparum.

En una realización adicional, la presente invención proporciona por tanto un constructo de fusión en el que una secuencia sintética de tipo K1 de la invención está unida en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos adicional. Por ejemplo, la secuencia sintética puede unirse directa o indirectamente en el extremo N-terminal a una secuencia de GST o una secuencia de cola de His, por ejemplo una secuencia de cola que contiene 6 His. En un constructo de fusión de este tipo, o en un constructo de fusión de la invención con una secuencia de cola de His o GST N-terminal, la secuencia de repetición sintética de tipo K1 puede proporcionarse como parte de un constructo híbrido más largo que contienen secuencias que presentan epítopos adicionales.

Para la mejora de la amplitud de la selección como diana, tal como se indicó anteriormente, puede proporcionarse una secuencia de repetición sintética de tipo K1 de la invención en una proteína de fusión en forma de una secuencia antigénica más larga en la que se une a una o más secuencias que contienen epítopos adicionales que pueden producir una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria celular en seres humanos frente a un antígeno de P. falciparum. Tales secuencias que contienen epítopos adicionales serán de manera deseable secuencias derivadas de MSP 1 de P. falciparum seleccionadas de (i) secuencias que contienen epítopos de células T humanas que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular frente a P. falciparum (ii) una secuencia que proporciona una región de repetición de bloque 2 de MSP 1 del tipo MAD 20 y (iii) una secuencia que proporciona una región de repetición de bloque 2 de MSP 1 del tipo R033. De especial interés para el diseño de vacunas son proteínas de fusión que incluyen todas de (i) a (iii) y una secuencia de repetición sintética de tipo K1 tal como se describió anteriormente.

Las pruebas procedentes del trabajo publicado previamente (Parra et al. (2000) Infect. Immun. 68, 2685-2691; Quakyi et al. (1994) J. Immunol. 153, 2082-2092), y del uso de algoritmos predictivos basados en ordenador, han indicado la presencia de epítopos de células T humanas dentro de las secuencias flanqueantes de la región de bloque 2 de MSP1, es decir, en las regiones específicas de tipo que preceden y siguen a las repeticiones de bloque 2, en la región de unión entre el bloque 2 de MSP 1 y el bloque 1 de MSP1 y en el propio bloque 1 de MSP1. Por tanto, el componente (i) en un constructo híbrido tal como se describió anteriormente puede ser un alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP 1 de tipo K1, tal como el alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 3D7 (residuos de aminoácido 20 a 133 de número de acceso de Genbank Nip_704838.1; derivado de la secuencia de 3D7 de P. falciparum) o una parte o partes del mismo que proporcionan uno o más epítopos de células T humanas. Tal como se indicó anteriormente, puede ser una secuencia artificial que proporciona una combinación de epítopo 1 de células T y epítopo 2 de células T derivados del mismo alelo de bloque 1-bloque 2 tal como se ilustra en las figuras 8 y 9.

El componente (ii) puede ser uno o más alelos de bloque 2 de tipo MSP 1 MAD 20, por ejemplo el alelo Wellcome conocido (residuos de aminoácido 54-118 de número de acceso de Genbank CAA33163).

El componente (iii) puede ser de manera deseable una secuencia de bloque 2 de MSP 1 de tipo RO33 completa (por ejemplo, residuos de aminoácido 54-106 de número de acceso de Genbank AB 116601).

También pueden encontrarse secuencias de alelos de bloque 2 de MSP-1 relevantes (3D7, Palo Alto, MAD 20, Wellcome y RO33) en la figura 2 de Cavanagh y McBride (1997) Mol. & Biochem. Parasitol. 85, 197-211: Antigenicity of recombinant proteins derived from Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1. La misma figura también proporciona la secuencia de los alelos de bloque 1 de MSP I Palo Alto y MAD 20 que pueden usarse en un constructo híbrido tal como se describió anteriormente.

En una realización preferida, se proporciona por tanto un constructo de fusión en el que un único alelo de bloque 1-bloque 2 de tipo K1, por ejemplo el alelo 3D7 de MSP1, está unido al extremo N-terminal de la secuencia de repetición sintética K1. Un constructo híbrido de este tipo puede extenderse adicionalmente de manera deseable, normalmente en el extremo C-terminal, mediante la adición de una región de bloque 2 de MSP 1 del tipo R033 y una región de bloque 2 de MSP 1 del tipo MAD 20. Una proteína de fusión de este tipo con una secuencia N-terminal para ayudar en la purificación (una secuencia de cola de His) y que incluye tanto un alelo de bloque 2 de MSP1 de tipo RO33 como un alelo de bloque 2 de MSP1 de tipo MAD 20 (el alelo Wellcome) se ilustra mediante la figura 7. La secuencia N-terminal puede ser alternativamente una secuencia de GST. El alelo de bloque 2 de tipo MAD20 Wellcome puede sustituirse por cualquier alelo de bloque 2 de tipo MAD20.

Un tipo particularmente preferido de constructo de fusión de la invención es un constructo de fusión en el que la K1SR está unida en su extremo N-terminal a una secuencia artificial que proporciona uno o más epítopos de células T derivados de un alelo de MSP1 de tipo K1, por ejemplo el epítopo 1 de células T y el epítopo 2 de células T derivados del alelo de bloque 1-bloque 2 de 3D7 y está unida en su extremo C-terminal a una secuencia que proporciona tanto una región de bloque 2 de MSP1 del tipo R033 como una región de bloque 2 de MSP 1 del tipo MAD 20, por ejemplo un alelo de bloque 2 de tipo RO33 completo y un alelo de tipo MAD 20 completo tal como el alelo Welcome, tal como se ilustra mediante las figuras 8 y 9.

Constructos de ADN

En otro aspecto, la presente invención proporciona polinucleótidos, que pueden ser ADN o ARN, que comprenden una secuencia codificante para un polipéptido o una proteína de la invención, incluyendo constructos de fusión tal como se trató anteriormente. Como realizaciones particularmente preferidas de ADN según la invención, se proporcionan ADN que comprenden la secuencia codificante de K1SR tal como se muestra en el inserto de ADN anterior (posición de nucleótido 28 a posición de nucleótido 261). Esta secuencia tiene codones optimizados para su expresión en células E. coli.

La invención también se extiende a vectores que codifican un polipéptido o una proteína de la invención. La invención proporciona adicionalmente constructos de expresión, por ejemplo vectores de expresión, en los que un ADN que codifica una secuencia para un polipéptido o una proteína de la invención está operativamente unido a una secuencia promotora y opcionalmente a otras secuencias de control. Tales constructos de expresión que pueden expresar un polipéptido o una proteína de la invención en células humanas pueden administrarse a seres humanos para el fin de promover una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum tal como se trata adicionalmente más adelante.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de producción de un polipéptido o una proteína de la invención que comprende cultivar células huésped que contienen un vector de expresión de la invención en condiciones por las cuales dicho polipéptido o dicha proteína se expresa y aislar dicho polipéptido o dicha proteína. Las células huésped pueden ser cualquier célula empleada convencionalmente para la expresión de proteínas recombinantes incluyendo además de células E. coli, otras células bacterianas, células de levaduras y células de mamífero. Tales células huésped in vitro que contienen un vector de expresión para su uso en un procedimiento de expresión tal como se describió anteriormente constituyen un aspecto todavía adicional de la invención.

Composiciones y usos

Para la administración para inducir una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum, puede administrarse un polipéptido o una proteína de la invención a un individuo, por ejemplo un ser humano, junto con un diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Una composición de este tipo puede tomar la forma de una composición de vacuna convencional. Se prevé que polipéptidos o proteínas relevantes de la invención puedan administrarse, por ejemplo, adsorbidos sobre alumbre (Alhydrogel o Adju-Phos, superfos Biosector, Kvistgárd, Dinamarca) o emulsionados en los adyuvantes Montanide ISA51 o Montanide ISA720 (Seppic, Francia). Podrían emplearse otros adyuvantes conocidos para uso humano. Tales adyuvantes incluyen AS02 (GSK, Bélgica) o MF59 (Chiron, Siena, Italia). Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, puede preferirse administrar una composición de ADN para la expresión de un polipéptido o una proteína de la invención in vivo. Por tanto, la invención también proporciona una composición para inducir una respuesta frente a P. falciparum que comprende un constructo de expresión tal como se describió anteriormente junto con un vehículo. Una composición de este tipo puede comprender, por ejemplo, ADN depositado sobre perlas de oro de manera convencional para la formulación de una vacuna de ADN.

Una composición de la invención que comprende, o que puede expresar en células humanas, una secuencia de repetición sintética de tipo K1 tal como se describió anteriormente, puede comprender un constructo de fusión que proporciona en las células no sólo la secuencia de repetición sintética sino también otras secuencias que contienen epítopos tal como se trató anteriormente. Sin embargo, se apreciará que tales secuencias que contienen epítopos adicionales pueden proporcionarse alternativamente mediante uno o más polipéptidos o polinucleótidos adicionales en la misma composición o en una o más composiciones diferentes.

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En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido o una proteína de la invención o el uso de un polinucleótido de la invención que puede expresar un polipéptido o una proteína de este tipo en la fabricación de una composición para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum.

Todavía en un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum en un individuo, por ejemplo un ser humano, que comprende administrar a dicho individuo un polipéptido o una proteína de la invención. Tal como se apreciará a partir de la discusión anterior, tal administración puede ser administración directa del polipéptido o la proteína o administración indirecta mediante expresión in vivo a partir de un ADN que codifica el polipéptido o la proteína.

Tipificación de bloque 2 de MSP1

Los polipéptidos que presentan como elemento antigénico una secuencia de repetición sintética de tipo K1 de la invención y los sueros producidos frente a tales secuencias también pueden usarse para tipificar la región de bloque 2 de MSP1 en sueros de individuos infectados con P. falciparum y en esquizontes de P. falciparum cultivados.

Por tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento de tipificación de la región de bloque 2 de MSP1 en un suero de un individuo infectado con P. falciparum que comprende poner en contacto el suero con un polipéptido que comprende como secuencia antigénica una secuencia de repetición sintética de tipo K1 tal como se trató anteriormente y determinar si se unen anticuerpos en dicho suero a la secuencia de repetición sintética de tipo K1 presentada. Un procedimiento de tipificación de este tipo puede adoptar convenientemente un formato de ELISA convencional.

En un aspecto todavía adicional, la invención proporciona un procedimiento de tipificación de la región de bloque 2 de MSP1 en esquizontes de P. falciparum cultivados que comprende poner en contacto los esquizontes con un suero que contiene anticuerpos producidos frente a una secuencia de repetición sintética K1 de la invención y determinar la unión de dichos anticuerpos a dichos esquizontes. Los anticuerpos pueden producirse mediante inmunización usando una proteína de fusión tal como se trató anteriormente, por ejemplo mediante inmunización de ratones con el adyuvante Montanide ISA720. Un procedimiento de tipificación de este tipo puede tomar la forma convenientemente de un ensayo de inmunofluorescencia que emplea anticuerpos marcados secundarios marcados con un marcador fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de la secuencia de superrepetición de tipo K1 designada K1SR 1 Secuenciación de la región de bloque 2 de MSP1 de P. falciparum a partir de muestras de Zambia

Se amplificó una parte del gen msp1 que abarcaba la región de bloque 2 a partir de ADN genómico aislado de muestras de sangre periférica de 91 individuos con infecciones por P. falciparum en el norte de Zambia. Se usaron cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa BK1F y BK3R que se hibridaban con secuencias conservadas en el bloque 1 y el bloque 3 con condiciones de amplificación tal como se describió anteriormente (Conway et al., (1998) J. Immunol. 161, 347-359). Se procesaron los productos de amplificación y se visualizaron en geles de agarosa al 2%. Los tamaños alélicos del fragmento de gen oscilan entre aproximadamente 400-600 pares de bases, y muchos aislados contienen más de un tipo genético de P. falciparum, de modo que se cortó la banda predominante para cada aislado. Se purificó entonces esto y se realizó directamente la secuenciación del ADN de ambas hebras usando los cebadores BK1F y BK3R, usando química BigDye v3.1 y electroforesis en un secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Se examinaron visualmente los datos de secuencia para cada aislado para determinar la calidad de cada nucleótido usando el programa Sequence Navigator, repitiéndose las reacciones de PCR y secuenciación en el caso de cualquier duda. Se compilaron entonces los datos de toda la muestra de población usando el programa MEGALIGN (DNAStar Inc, Madison, WI).

Resultados

De los 91 alelos de la región de bloque 2 de MSP1 que se secuenciaron, 49 (54%) eran del tipo K1, 32 (35%) eran del tipo R033 y 10 (11%) eran del tipo MAD20. La figura 1A muestra las secuencias de repetición de los alelos de tipo K1 que revelan 39 secuencias alélicas diferentes de las 49 muestreadas. Todos los alelos tenían el motivo de secuencia núcleo SAQSGT con diversas permutaciones repetidas de este hexa-péptido o el componente de tri-péptido SGT. De manera C-terminal a esto, todos excepto dos de los alelos tenían el motivo de secuencia SGPSGT con permutaciones repetidas de este hexa-péptido o los componentes de tri-péptido SGP o SGT. En el extremo N-terminal de las repeticiones, algunos alelos tenían el motivo SAQSGA con permutaciones repetidas de éste.

Aunque la varianza en la longitud de repetición global era considerable (longitud de repeticiones de aminoácidos media = 35,6, varianza = 146,1), era mucho menor que la suma de la varianza en la longitud de cada una de las subregiones de repetición (región SAQSGT, media = 23,1, varianza = 196,6; región SGPSGT, media = 10,0, varianza = 43,6; región SAQSGA, media = 2,6, varianza = 36,0). Esto se debía a correlaciones negativas significativamente no aleatorias entre las longitudes de las diferentes subregiones de repetición en cada alelo (región SAQSGT frente a región SAQSGA, r = -0,50, p < 0,001, figura 1B; región SAQSGT frente a región SGPSGT, r = -0,33, p<0,022, figura 1C).

Se consideró que las correlaciones negativas entre las longitudes de las diferentes subregiones de las repeticiones podrían deberse a selección mediante respuestas inmunitarias específicas para cada una, de manera que habría una selección fuerte contra alelos con secuencias largas en más de una subregión y por tanto se restringiría la longitud global. Para identificar epítopos en estas secuencias de repetición, se sometieron a ensayo anticuerpos frente a un panel de 23 péptidos sintéticos (véase la tabla 1 a continuación) que representan todas las secuencias de aminoácidos de 12-meros (con la serina de tri-péptidos en la posición 1) en repeticiones de tipo K1 de secuencias de bloque 2 de MSP1 derivadas globalmente.

TABLA 1

2

Ensayos de péptidos sintéticos (i) Síntesis de péptidos

Se sintetizaron los veintitrés péptidos indicados anteriormente sobre un soporte sólido de celulosa (Whatman) usando procedimientos descritos en Frank, R. (1997) Immunology Methods Manual vol. 2, ed. Lefkovits, I. (Academic Press, págs. 763-795). Se diseñaron estos péptidos para que representasen todas las secuencias de aminoácidos de 12-meros contenidas en la región de repetición de todos los alelos de bloque 2 de MSP1 similares a P. falciparum K1 encontrados en la base de datos GenBank y en el estudio indicado anteriormente, que comenzaban por una serina en la posición uno (en vez de en las posiciones dos o tres) de cada repetición de tri-péptido (véase la tabla 1). Como controles para la reactividad específica de tipo, se sintetizaron también y se sometieron a prueba con anticuerpos 24 péptidos sintéticos del tipo alélico similar a MAD20 (que representaban todas las secuencias de repetición de 12-meros que comenzaban por una serina) y 12 péptidos sintéticos del tipo similar a RO33 (todos los péptidos contiguos que se solapaban con 9 aminoácidos que abarcaban esta secuencia alélica de no repetición).

(ii) Anticuerpos monoclonales murinos y sueros humanos

Se emplearon sueros de setenta y ocho adultos del oeste de África, treinta y ocho (edades de 18 a 60) de Lagos en Nigeria y cuarenta adultos (edades de 22 a 70) del pueblo de Brefet en Gambia en el ELISA tal como se describe a continuación y se empleó un subconjunto en inmunoensayos de péptidos sintéticos. Como controles negativos, se usaron veinte sueros de adultos que vivían en el Reino Unido que nunca habían tenido malaria. Se obtuvieron todas estas muestras con el consentimiento informado con la aprobación de los comités éticos institucionales y locales relevantes. Se emplearon también cuatro anticuerpos monoclonales murinos. Se conocían las especificidades de tres de éstos (AcM 12.2, 123D3 y CE2) para algunos productos alélicos del tipo similar a K1 de bloque 2 de MSP1 (Locher et al., (1996) Exp. Parasitol. 84, 74-83; Cavanagh & McBride (1997) Mol. Biochem. Parasitol. 85, 197-211) y se sabía que un control (AcM 12.1) reaccionaba con el bloque 4 de MSP1.

(iii) ELISA

Se recubrieron placas de microtitulación de fondo plano Immulon 4HBX (Dynex Technologies Inc) con 50 ng/poci-
llo de cada antígeno recombinante (expresados como una proteína de fusión con GST) durante la noche a 4ºC en 100 \mul de tampón de recubrimiento (Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,3). Se lavaron las placas (en PBS con Tween 20 al 0,05%), se bloquearon (leche desnatada al 1% en PBS con Tween) durante cinco horas y se lavaron de nuevo. Se diluyeron los anticuerpos monoclonales tal como se indica, se diluyeron los sueros 1/500 y se incubaron alícuotas de 100 \mul por duplicado en tampón de bloqueo durante la noche a 4ºC en pocillos recubiertos con antígeno. Se lavaron los pocillos, y entonces se incubaron con 100 \mul de anticuerpos de conejo anti-IgG humana conjugado con HRP (a 1/5000) (Dako Ltd.) antes de la detección con O-fenilendiamina/H_{2}O_{2} (Sigma). Se calculó el valor de DO media de cada reacción de suero-antígeno tras la corrección para la unión del suero a GST sola (esta DO de fondo era generalmente < 0,1). Se puntuó un suero como positivo si el valor de DO corregida era superior a la media + 3 DE de los valores para los 20 sueros control negativo de residentes en el RU. Usando sueros positivos seleccionados, se llevaron a cabo ELISA de competencia entre pares de antígenos para definir la especificidad de los anticuerpos. El protocolo era idéntico al del ELISA directo, excepto porque los sueros diluidos 1/500 se incubaron previamente con antígenos de competencia solubles a concentraciones que oscilaban entre 0-10 \mug ml^{-1} durante 5 horas antes de la incubación durante la noche con 50 ng de antígeno unido a la placa.

(iv) Inmunoensayos de péptidos

Se incubaron series de péptidos por duplicado sobre membranas de celulosa en disolución de bloqueo (TBS/tween-20, sacarosa al 5%, BSA al 2% y leche desnatada en polvo al 3%) a 4ºC durante la noche. Se escurrió cada membrana sobre papel de filtro para eliminar la disolución de bloqueo en exceso y entonces se incubaron con una dilución 1/500 de suero (o anticuerpos monoclonales diluidos según se especifique) en disolución de bloqueo nueva y se almacenaron a 4ºC. Al día siguiente, se lavaron las membranas dos veces en cada una de las siguientes disoluciones a base de Tris, TBS/T-20, TBS/T-20/NaCl, TBS/T-20/Triton X-100 y TBS/T-20. Se secaron las membranas y se incubaron entonces con una dilución 1/5000 de anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con HRP (DAKO) en disolución de bloqueo durante 4 horas. Se lavaron las membranas dos veces en cada una de las disoluciones anteriores seguido por dos lavados en TBS. Se secaron las membranas del tampón en exceso y se visualizaron los resultados tras revelado en sustrato TMB estabilizado (Promega) durante 2 minutos.

Resultados

Cada uno de los tres AcM 12.1, 123D3 y CE2 tenía un perfil de reactividad diferente con los péptidos sintéticos similares a K1 (figura 2A: el AcM 12.2 reaccionó con seis péptidos, el AcM 123D3 reaccionó con dos y el AcM CE2 reaccionó con cuatro). Ninguno reaccionó con ninguno de los controles de péptidos similares a MAD20 o similares a RO33 y el anticuerpo control negativo (AcM 12.1 contra el bloque 4 de MSP1) no era reactivo con ninguno de los péptidos. A partir del examen de los perfiles de reactividad, se dedujeron las especificidades de secuencia primaria mínima como SGASAQSG para el AcM 12.2, SAQSGTSGTS para el AcM 123D3 y SAQSGTSGT para el AcM CE2. Se diseñaron los péptidos para que tuviesen una serina en la primera posición de cada repetición de tri-péptido en vez de en la segunda o la tercera, de modo que no se sabe si uno o dos aminoácidos terminales son esenciales en el caso de algunas especificidades deducidas.

Se sometieron a prueba entonces doce sueros de adultos nigerianos y doce de adultos gambianos que tenían anticuerpos frente a proteínas recombinantes de bloque 2 de MSP1 tal como se sometió a ensayo mediante ELISA, para ver si las especificidades de anticuerpos humanos podían deducirse con la serie de péptidos sintéticos. Se hizo reaccionar cada suero con entre tres y nueve péptidos diferentes. Se muestran las reactividades de dos de los sueros en la figura 2B y se facilitan los resultados puntuados de todos en la figura 3A. A partir de cada uno de estos perfiles de reactividad, se dedujo que estaban presentes entre una y tres especificidades distintas en cada suero (para algunos sueros también había pruebas de reactividades más débiles adicionales). Se diseñó una secuencia compuesta (SEC. ID. no. 1) que abarcaba las diferentes especificidades específicas deducidas en la longitud de secuencia global mínima (véase la figura 3B y la figura 4). Se mapearon todos los epítopos deducidos en una secuencia de 78 aminoácidos (que contenía 26 tri-péptidos) que era sólo ligeramente más larga que la repetición más larga de bloque 2 de MSP1 de tipo K1 individual que se produce de manera natural que se ha descrito (Ferreira et al., (2003) Gene 304, 65-75).

Expresión de la secuencia compuesta

Para expresar la secuencia compuesta de repeticiones como un antígeno, se construyó una secuencia de ADN novedosa y se clonó en un plásmido pGEX para su expresión como una proteína de fusión con GST en E. coli.

En primer lugar, se ensambló una secuencia génica sintética (SEC. ID no. 2) que codificaba el constructo de superrepetición diseñado a partir de oligonucleótidos sintéticos para clonar en los sitios de restricción KpnI y SacI del vector pPCR-Script Amp (GeneArt, Regensburg, Alemania). Esta secuencia, que proporcionaba una secuencia codificante con codones optimizados para la expresión en E. coli y sitios Bam H1 y EcoRI terminales, se subclonó a partir del vector pPCR-Script Amp en pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech) para la expresión de la secuencia de repetición sintética de tipo K1 como una proteína de fusión con GST en células E. coli BL21 (DE3). La expresión y purificación siguieron los protocolos del fabricante tal como se describió previamente para otras proteínas recombinantes de bloque 2 de MSP1 (Polley et al., (2003) Infect. Immun. 71, 1833-1842; Cavanagh & McBride (1997) Mol. Biochem. Parasitol. 85, 197-211). La K1SR se expresaba abundantemente en forma soluble y se purificó en una columna de glutatión (figura 5A). El antígeno recombinante reaccionaba específicamente con cada uno de los 3 AcM contra epítopos en las secuencias de repetición similares a K1 (figura 5B) y con sueros de adultos nigerianos y gambianos (figura 5C). Significativamente, se encontró que la K1SR mostraba una reactividad más amplia con estos anticuerpos que antígenos que representaban alelos individuales (figuras 5B y 5C).

Inmunizaciones de ratones

Se inmunizaron cinco ratones consanguíneos MF1 con la proteína recombinante K1SR siguiendo un protocolo usado previamente para la inmunización con otras proteínas recombinantes de bloque 2 de MSP1 (Polley et al., (2003) Infect. Immun. 71, 1833-1842; Cavanagh & McBride (1997) Mol. Biochem. Parasitol. 85, 197-211). Se administraron a todos los animales tres dosis de 50 \mug de proteína purificada en el adyuvante ImjectAlum (Pierce) a intervalos mensuales; se recogió el suero antes de la inmunización y 12-14 días tras cada dosis.

Resultados

Los ratones inmunizados con la proteína recombinante K1SR produjeron anticuerpos frente a diferentes determinantes de secuencia primaria tal como se determinó mediante inmunoensayo de péptidos (figura 6A). De manera interesante, los cinco ratones produjeron anticuerpos frente al epítopo SGTSGTSGT, aunque el perfil de anticuerpos restantes difería entre cada animal. Como comparación, también se sometieron a prueba sueros de ratones inmunizados previamente con antígenos de repetición de tipo K1 distintos (3D7 y Palo Alto) contra el panel de péptidos sintéticos similares a K1 y demostraron un intervalo más estrecho de reactividades específicas (figura 6A). Los ratones inmunizados con el antígeno de secuencia de repetición 3D7 mostraron un perfil de reactividad que abarcaba los motivos SAQSGASAQ y SGASAQS (en la parte N-terminal de la serie de repetición). Los ratones inmunizados con el antígeno de secuencia de repetición Palo Alto reaccionaron con los motivos SAQSGTSAQ, SGTSGT y SGTSAQSGT más centrales (figura 6A). En cambio, los ratones inmunizados con la secuencia de superrepetición de tipo K1 reconocieron epítopos de secuencia de repetición más diversos ubicados en las subregiones N-terminal, central y C-terminal.

Ensayos de inmunofluorescencia (IFA)

Se sometió a prueba entonces la reactividad de anticuerpos contra un panel de 5 líneas cultivadas de P. falciparum con diferentes secuencias de repetición de bloque 2 de MSP1 similar a K1 (figura 6B), mediante inmunofluorescencia con esquizontes de parásitos. Se realizó el IFA tal como se describió para sueros producidos frente a otros antígenos de bloque 2 de MSP1 (Polley et al., (2003) Infect. Immun. 71, 1833-1842; Cavanagh & McBride (1997) Mol. Biochem. Parasitol. 85, 197-211). Se estudiaron con sonda portaobjetos de múltiples pocillos fijados con acetona de esquizontes de cinco líneas cultivadas de P. falciparum (Palo Alto, 3D7, T9/96, T9/102 y K1) con los sueros murinos producidos contra la K1SR (a diluciones de duplicación desde 1/50 hasta 1/51200). Se determinaron rigurosamente los títulos de punto final y se expresaron como la dilución más alta que todavía producía una fluorescencia clara específica de esquizonte (puntuada como "++", en un esquema de puntuación visual de "+" a "++++").

Resultados

Todos los ratones produjeron anticuerpos con títulos de punto final de al menos 1/6400 contra esquizontes de al menos una de las líneas cultivadas. El perfil de reactividad frente a diferentes parásitos varió entre los ratones (figura 6B) de una manera consecuente con la especificidad deducida de los anticuerpos frente a secuencias de repetición particulares (figura 6A). Por ejemplo, la mayoría de los sueros de ratones reconocieron todas las líneas de parásitos, aunque los sueros de los ratones 3 y 4 no reconocieron T9/96 y 3D7 (figura 6B), líneas de parásitos que no tenían los motivos de secuencia primaria que se definieron para los anticuerpos de esos ratones (figura 6A).

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Ejemplo 2 Construcción de proteínas de fusión de serie en tándem que contienen la K1SR 1

Se obtuvo ADN del clon 3D7 de P. falciparum y los aislados RO33 y Wellcome de P. falciparum mantenidos por el Registro de la OMS de Cepas Patrón de Parásitos de Malaria ("WHO Registry of Standard Strains of Malaria Parasites") en la Universidad de Edimburgo. Se insertó un ADN recombinante con extremos BamH1 y Sma I en el vector pQE30 de modo que se proporcionó una secuencia que codificaba una proteína de fusión de serie en tándem marcada con His en el extremo N-terminal constituida por los siguientes componentes desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal:

(a): una cola de His de 6 residuos de His codificada por el vector;

(b): un alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 3D7 (número de acceso de Genbank NP_704838.1; posiciones de aminoácido 20-133; bloque 1 de MSP1 3D7, residuos de aminoácido 20-53 y alelo de bloque 2 de MSP1 3D7 (incluyendo las secuencias flanqueantes), residuos de aminoácido 54-133.)

(c): la secuencia de repetición sintética de tipo K1;

(d): el alelo de bloque 2 de MSP1 RO33 (número de acceso AB116601; residuos de aminoácido 54-106; incluyendo el alelo completo las secuencias flanqueantes) y

(e): el alelo de bloque 2 de MSP1 Wellcome (número de acceso CAA33163; posiciones de aminoácido 54-118; tipo MAD 20; incluyendo el alelo completo las secuencias flanqueantes.)

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El elemento (b) proporcionado reconoció epítopos de células T humanas (epítopo 1 de células T (T1) en las posiciones de aminoácido 20-29; epítopo de células T [T2] en las posiciones de aminoácido 44 a 63).

Se muestran esquemáticamente en la figura 7 constructos parciales correspondientes que comprenden combinaciones de alelos únicos e insertos de ADN codificante correspondientes.

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Ejemplo 3 Construcción del constructo híbrido multialélico mostrado en la figura 8

Parte 1

Generación de la K1SR fusionada a las secuencias flanqueantes de tipo K1 tanto en 5' como en 3'

Etapa 1

Generación de la región flanqueante N-terminal y epítopos de células T

Se fusionaron entre sí dos oligonucleótidos largos [5' flank hyb R1 + 5' flank hyb F1] que cubrían ambos epítopos de células T deseados y la región flanqueante de bloque 2 produciendo un producto de 163 pb usando un protocolo de PCR.

Etapa 2

Fusión de la K1SR a la región flanqueante en 3'

Se usó un cebador directo de K1SR junto con un cebador en 3' (3' flank R1) que se diseñó con una proyección complementaria a K1SR para fusionar a la perfección usando PCR.

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Etapa 3

Fusión de los epítopos de células T/región flanqueante en 5' a la K1SR + región flanqueante en 3'

Pueden combinarse los productos purificados de las etapas 1 y 2 en una reacción de PCR y fusionarse entre sí usando los cebadores 5' flank hyb R1 y 3' flank R1.

Parte 2

Etapa 4

Verificación de los productos

Cada uno de los productos generados en las etapas 1-3 puede clonarse en el vector pGEMT-easy y verificarse su secuencia, usando tanto cebadores específicos de vector como cebadores específicos de inserto (cuando sea apropiado).

Etapa 5

Construcción del producto final (T-K1SR-RO33-Wellcome)

Una vez que se ha verificado la secuencia de cada módulo, puede digerirse por restricción la K1 SR + el inserto flanqueante y ligarse en un vector de expresión con cola de His con los módulos de los alelos R033 y Wellcome ya en su sitio.

Las características inmunológicas del constructo final pueden compararse con las de los constructos parciales mostrados en la figura 9.

Claims

1. Un polipéptido que comprende una secuencia antigénica derivada de regiones de repetición de alelos de bloque 2 de MSP1 de tipo K1 de Plasmodium falciparum, en el que dicha secuencia antigénica se selecciona de la secuencia de SEC. ID no.1 (denominada secuencia de repetición sintética 1 de tipo K1; KISR):

3

y análogos funcionales de la misma de la misma longitud y sustancialmente la misma inmunogenicidad tal como se determina en forma de una proteína de fusión unida en el extremo N-terminal a una secuencia de glutatión-S-transferasa (GST) N-terminal.

2. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia antigénica está unida en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos adicional.

3. Una proteína de fusión según la reivindicación 2, en la que dicha secuencia antigénica está unida directa o indirectamente en el extremo N-terminal a una secuencia de GST o una secuencia de cola de His.

4. Una proteína de fusión según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que dicha secuencia antigénica está unida a una o más secuencias que contienen epítopos adicionales que pueden producir una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria celular en seres humanos frente a un antígeno de P. falciparum.

5. Una proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que dichas secuencias que contienen epítopos adicionales son secuencias derivadas de MSP 1 de P. falciparum seleccionadas de (i) secuencias que contienen epítopos de células T humanas que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular frente a P. falciparum; (ii) una secuencia que proporciona una región de repetición de bloque 2 de MSP1 del tipo MAD 20 y (iii) una secuencia que proporciona una región de repetición de bloque 2 de MSP 1 del tipo RO33.

6. Una proteína de fusión según la reivindicación 5, que comprende un constructo híbrido en el que una secuencia antigénica según la reivindicación 1 está unida en el extremo N-terminal a una secuencia que proporciona uno o más epítopos de células T humanas derivados de un alelo de MSP1.

7. Una proteína de fusión según la reivindicación 6, que comprende un constructo híbrido constituido por (i) un alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 de tipo K1 y (ii) una secuencia antigénica según la reivindicación 1.

8. Una proteína de fusión según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en la que dicho constructo híbrido se extiende adicionalmente mediante la adición de una secuencia que proporciona una región de bloque 2 de MSP1 del tipo RO33 y una región de bloque 2 de MSP 1 del tipo MAD 20.

9. Una proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que dicho constructo híbrido está constituido por los siguientes componentes en la dirección de N- a C-terminal: (i) un alelo de bloque 1-bloque 2 de MSP1 de tipo K1; (ii) una secuencia antigénica según la reivindicación 1; y (iii) una secuencia que proporciona una región de bloque 2 de MSP1 del tipo RO33 y una región de bloque 2 de MSP1 del tipo MAD 20.

10. Una proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que dicho constructo híbrido está constituido por los siguientes componentes en la dirección de N- a C-terminal: (i) una secuencia que proporciona uno o más epítopos de células T humanas derivados de un alelo de MSP1 de tipo K1; (ii) una secuencia antigénica según la reivindicación 1 y (iii) una secuencia que proporciona una región de bloque 2 de MSP1 del tipo RO33 y una región de bloque 2 de MSP1 del tipo MAD 20.

11. Una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que dicho constructo híbrido está unido además en el extremo N-terminal a una secuencia de cola de His o secuencia de GST N-terminal.

12. Un polinucleótido que codifica un polipéptido o una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

13. Un polinucleótido según la reivindicación 12, que es un ADN.

14. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 13.

15. Un polinucleótido según la reivindicación 13, en el que la secuencia codificante para dicho polipéptido o dicha proteína está operativamente unida a una secuencia promotora.

16. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15.

17. Un procedimiento de producción de un polipéptido o una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende cultivar células huésped que contienen un vector de expresión según la reivindicación 16 en condiciones por las cuales se expresa dicho polipéptido o dicha proteína y aislar dicho polipéptido o dicha proteína.

18. Una célula huésped in vitro que contiene un vector de expresión según la reivindicación 16.

19. Una composición para inducir una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum que comprende un polipéptido o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 junto con un adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición para inducir una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15 o un vector de expresión según la reivindicación 16 junto con un vehículo.

21. Uso de un polipéptido o una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un polinucleótido según la reivindicación 15 o un vector de expresión según la reivindicación 16, en la fabricación de una composición para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente a P. falciparum.

22. Un procedimiento de tipificación de la región de bloque 2 de MSP 1 en un suero de un individuo infectado con P. falciparum que comprende poner en contacto dicho suero con un polipéptido que comprende una secuencia antigénica según la reivindicación 1 y determinar si se unen anticuerpos en dicho suero a dicha secuencia.

23. Un procedimiento de tipificación de la región de bloque 2 de MSP 1 en esquizontes de P. falciparum cultivados que comprende poner en contacto los esquizontes con un suero que contiene anticuerpos producidos frente a una secuencia antigénica según la reivindicación 1 y determinar la unión de dichos anticuerpos a dichos esquizontes.