KR100927221B1

KR100927221B1 - Ｅ형 간염 바이러스의 폴리펩티드 단편, 그를 이용한 백신조성물 및 진단용 키트

Info

Publication number: KR100927221B1
Application number: KR1020037004589A
Authority: KR
Inventors: 시아닝샤오; 장준; 리샤오웨이; 게쉥시앙; 구잉; 헤지퀴앙
Original assignee: 베이징 완타이 바이오로지컬 파마시 엔터프라이즈 코포레이션 리미티드
Priority date: 2000-09-30
Filing date: 2001-09-30
Publication date: 2009-11-16
Also published as: US8524868B2; EP2298793A2; US20100143410A1; CN101367869A; EP1331271B1; KR20030048052A; KR20090088429A; JP2004525613A; MXPA03002751A; US7615228B2; AU2002220460A1; JP2011201881A; US20040052813A1; BR0114510A; JP5829830B2; EP2298793A3; JP5681337B2; KR101121754B1; WO2002040681A1; EP1331271A1

Abstract

본 발명은 n-폴리머형 폴리펩티드 (여기서 N은 2 내지 180의 정수임) 형태의 E형 간염 바이러스 ORF2의 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 보존적 단편에 융합된 상기 단편의 키메릭 폴리펩티드, 및 E형 간염 바이러스 ORF3으로부터의 에피토프를 함유하는 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 백신 조성물 및 HEV의 감염 여부를 진단하기 위해 HEV의 상기 폴리펩티드를 포함하는 키트, 및 IgG, IgM 및 총 항체를 포함하는 진단용 키트, 및 HEV 감염의 예방, 진단 및/또는 치료를 위한 그의 용도도 제공한다.

Description

Ｅ형 간염 바이러스의 폴리펩티드 단편, 그를 이용한 백신 조성물 및 진단용 키트 {THE POLYPEPTIDE FRAGMENTS OF HEPATITIS E VIRUS, THE VACCINE COMPOSITION COMPRISING SAID FRAGMENTS AND THE DIAGNOSTIC KITS}

본 발명은 N-폴리머형 폴리펩티드 (여기서 N은 1 내지 180의 정수임) 형태의 E형 간염 바이러스 ORF2의 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편; 본 발명의 폴리펩티드로 이루어진 키메릭 단백질 및 인플루엔자 바이러스로부터 얻은 헤마글루틴 항원의 보존형 단편; E형 간염 바이러스 ORF3으로부터의 에피토프를 함유하는 폴리펩티드에 결합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편; 상기 폴리펩티드들을 코딩하는, DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 E형 간염 바이러스에 대한 백신 조성물, 또는 IgG, IgM를 비롯한 상기 폴리펩티드를 포함하는 E형 간염 바이러스 감염 여부에 대한 진단용 키트, 또는 E형 간염 바이러스에 대한 총 항체 진단용 키트, 및 상기 백신 조성물의 용도 및 E형 간염 바이러스 감염의 예방, 진단 및/또는 치료를 위한 진단용 키트에 관한 것이다.

E형 간염 바이러스 (HEV: Hepatitis E Virus)는 1983 처음으로, 장내 전달되는 비-A형, 비-B형 (non-A, non-B) 간염 병원균으로 인식되었다 (Balayan 외, 1983, Interovirology 20:23). E형 간염은 아시아, 아프리카 및 중앙 아메리카의 저개발 국가에서 주로 발병한다. 선진국의 경우, E형 간염은 주로 해외로부터 이주해 온 이민자나 해외 여행자들에게서 발견되었다. 산발성인 경우와 대규모로 전염된 경우가 모두 문서로 기록되었다. 1950년대부터 1990년대까지의 기간동안, 오염된 식수로 인해 수차례에 걸쳐 E형 간염이 대규모로 발병한 바 있다 (Visvanathan, 1957, Indian J. Med. Res.(Suppl). 45:1-30; Wong 외, 1980 Lancet, 2:882-885; Myint 외, 1985, Am J Trop Med Hyg., 34:1183-1189; Belabbes 외, 1985 J Med Virol., 16:257-263; Hau 외, 1999, Am J Trop Med Hyg., 60:277-280). 대부분의 E형 간염 감염은 자기-제한적이었으며 만성적으로 발전하는 경우는 드물었다; 그러나, 임산부의 경우, 그 후유증은 사망률이 17%를 상회할 정도로 심하였다 (Tsega 외, 1992, Clin. Infec Dis., 14:961-965; Dilawari 외, 1994, Indian J Gastroenterol., 13:44-48; Hussaini 외, 1997, J Viral Hepat., 4:51-54).

1991년, 연구자들은 처음으로, 싱글-스트랜드의 엔벨롭되지 않은 양성 RNA 바이러스인 HEV의 완전한 게놈 서열을 얻어냈다 (Tam 외, 1991, Virology 185: 120-131). 서열 분석 결과 이 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임을 가지며 길이는 7.2 kb인 것으로 나타났다. 5' 말단에 위치하는 ORF1은 이 바이러스의 비-구조 단백질을 코딩하며, 3' 말단에 위치하는 ORF2는 이 바이러스의 주요 구조 단백질을 코딩한다. ORF3의 5' 말단은, ORF1 3' 말단과 1bp만큼 오버랩된다. ORF3의 3'말단 은, ORF2 말단과 339 bp만큼 오버랩된다. ORF3은 그 기능이 알려지지 않은 다른 구조 단백질을 코딩하는 것으로 인식되고 있다 (Tam 외, 1991, Virology, 185:120-131; Aye 외, 1992, Nucleic Acids Res., 20:3512; Aye 외 1993, Virus Genes, 7:95-109; Huang 외, 1992, Virology 191; 550-558; Reyes 외, 1993, Arch Virol Suppl., 7:15-25).

HEV 감염 여부의 확인은 주로 장기간의 면역학적 전자현미경 (IEM: Immunological Electron Microscope) 관찰 또는 면역학적 형광 기술에 의존하지만, 이러한 기술은 매우 복잡하고 고가이며 여러 실험실에서 수행하기가 어렵다.

HEV 게놈을 클로닝 및 시퀀싱한 후, ELISA, 웨스턴 블롯, PCR 등과 같은 보다 정밀한 기술이 HEV 감염을 검사하는데 사용될 수 있도록 개발되었다.

혈청 HEV 항체 키트의 개발이 절대적으로 필요하다는 것은 익히 인식되어 있는 형편이지만, 감염된 인간이나 동물이 분비하는 HEV 바이러스가 워낙 저농도라서 이러한 혈청을 항원 소스로 이용하는 것은 불가능하다. 이제까지, HEV 세포 배양의 효율은 여전히 극히 저조한 실정이고, 이로 인해, HEV 검출을 위한 충분한 양의 항원 이용성이 제한되고 있다. 따라서, HEV 항체의 검출은 여전히 합성 폴리펩티드나 재조합 항원에 의존하고 있다. 불행하게도, 많은 혈청 연구결과, 상이한 HEV 게놈 대역으로부터의 재조합 항원이나 합성 폴리펩티들에 따라 그 컨시스턴스 (consistence)가 현저하게 차이가 나는 것으로 나타났다. 예컨대, Goldsmith 등 (1992, Lancet, 399:328-331)은 병원에서 E형 간염바이러스 감염 케이스를 찾아내는데 ORF2 3-2(M) 항원 (a.a.613-660, 멕시코 균주)을 이용하였다. IgG의 검출비율 은 91%였으나 6~12개월 후에는 27~50%로 저하되었다. 그가 3-2(B) (버마 균주로부터의 동일한 ORF2 단편)을 검출에 사용하자 그 비율은 단지 64%에 불과했으며, 6~12개월이 지난 후에도 어떠한 양성 결과도 얻지 못하였다. 이와 반대로, 3-2(M)은 파키스탄 환자에서는 회복기 혈청과 반응하지 못했지만 3-2(B)는 4.5년 후 동일 환자의 혈청과 반응할 수 있었다. 이러한 단백질에 있어서, 항체가 어떤 경우 음성으로 전환되나, 다른 경우에는, 여전히 고역가 (high titer)로 남아있다. 이러한 결과는 E. Coli에서 발현된 몇몇 선형 에피토프를 모자이크 단백질과 함께 사용한 경우와 유사하였다. 우수한 HEV 항체 키트의 부재로 인해 HEV 감염이 진행되는 동안의 항체 동력학에 관한 심도있는 연구가 제한되었다. 일반적으로 HEV 감염이 일어나는 동안, 특정 IgG 항체가 초기 단계에서 검출가능하고 2~4주일 후에 피크가 오며 그 후에는 급속도로 저하된다. 대부분은 9개월 후 음성으로 전환되지만, 몇몇 환자들은 수년이 지난 후에도 양성을 유지하였다. 최근, 몇가지 재조합 항원들이 배큘로바이러스와 E. coli 모두에서 발현되었는데 이들은 급성 발병 페이즈 및 회복기 페이즈 모두의 혈청과 강하게 반응한다. 기본적으로, 이 항원들은 혈청-역학 조사에 있어서 더욱 적합하다: 혈청 HEV IgG의 역가는 급성 페이즈가 지난 후에는 급격히 감소하지만, 여전히 검출가능한 수준으로 남아있다. 이 질환이 퍼지는 동안 감염으로부터의 보호에 이 항체가 연관되어 있다는 것은 주목할만하다.

다른 한편, 현재까지 오로지 간적접인 검출 방식만이 가능했다는 사실로 인해, 전 세계적으로 HEV IgM 키트가 개발되지 못했다. 간접 방식과 관련해서, 한편으로는, 검출 결과가 여러가지 인자에 의해 영향을 받고 그 재생성이 저조한 반면; 다른 한편으로는, 결과의 신뢰도가 나빠서 거짓 양성이나 거짓 음성값, 또는 저조한 감작성의 가능성이 높다. 최근의 연구보고에 따르면, 임상 샘플을 검색하는 동안, IgM의 결과가 양성이면, IgG도 일반적으로 양성이고, 따라서, 초기 진단에 있어서의 그 값이 제한되지만 급성 감염의 진단 특이성을 높이는데는 도움이 될 수 있을 것이다.

몇몇 합성 펩티드 및 몇몇 재조합 항원에 대한 항체들이 많은 감염 환자들에 있어서 신속히 사라져버릴 것이어서, 급성 E형 간염 바이러스 감염의 임상 진단은 임상학적 합치 (concordance)가 더 높은 IgG 항체에 일반적으로 기초할 것이라는 보고가 있으나, 이 방법의 가장 중요한 단점은 과거의 감염과 현재의 감염을 구별할 수 없음으로 해서 E형 간염바이러스 감염이 유행하고 있는 지역에서, 그리고 역학 조사가 진행되고 있는 동안의 E형 간염 바이러스 감염의 유병율 평가시 거짓 진단 결과를 유도할 수 있다는 데 있다. 따라서, 회복기 혈청에 대한 감작성이 높은, 신뢰성이 우수하고 민감한 항-μ체인 IgM 진단용 키트 및 IgG 진단용 키트를 개발하는 것이 시급히 요구되고 있다.

최근, 고감도 IgG 진단용 키트의 개발에 상당한 진전이 있었다. Mast 등 (1998, Hepatology, 27: 857-861)은 전 세계의 10대 주의 IgG 항체 EIA에 대한 알기 쉬운 평가 자료를 제시한 바 있다. 공지의 양성 혈청을 검출하는데 있어서는 많은 키트들이 상당히 우수하게 일치된 결과를 제공하지만, 미국의 혈액 공여자를 대상으로 한 검색에 있어서는 키트들마다 상당한 차이가 여전히 존재한다. 이는 이 질환이 잘 발생하지 않는 지역에서의 HEV 유행성 연구에 있어서는 그 결과의 신뢰 도가 더 저조하다는 것을 시사하는 것이다. 이들 키트들에 있어서, 대부분의 항원은 HEV의 선형 에피토프에 기초하지만, 2개의 키트는 항원으로서 컨포메이션 에피토프 (conformational epitopes)를 이용하고 있다. 하나는 ORF2.1 (aa394~660)이고, 다른 하나는 배큘로바이러스 발현된 VLP (aa112~607)이다. 두가지 항원 모두 회복기 항체를 검색할 수 있지만, 이들 두 항원 사이의 합치 여부를 비교하는 직접적인 데이타는 현재까지 얻어지지 못하고 있다. 이들 두 항원이 상이한 항체를 인식했을 가능성이 있다. 또한, VLP 키트를 이용한 경우 이 질환의 비-유행지역인 미국에서 거의 20%의 유병율이 보고되었는데, 이는 그 특이성에 의구심을 불러일으키고 있다. 그러나 돼지, 염소, 소, 닭, 쥐, 야생 원숭이 및 사육되는 원숭이들에 있어서 양성 HEV 감염이 보고된 것과 매릴랜드와 루이지애나의 들쥐의 77%와 44%가 각각 항체를 갖고 있다는 사실로부터, 비록 짐승의 HEV는 그의 독성 (virulence)으로 인해 임상적 질환을 일으키지 못함에도 불구하고, 미국 인구 중의 이 항체의 보균율이 과소평가되었을 가능성도 있다 (Kabrane-Lazizi외, 1999 Am J Tropic Medicine, 61:331-335). 또한 ORF2.1 키트는 CMV 감염과 자기면역 질환에 있어서 보다 높은 양성률을 검색할 수 있다. 이에 더해, GST-콘키메릭 (conchimeric) 단백질 또는 폴리아르기닌 콘키메릭 단백질인, 보고된 ORF2.1 폴리펩티드는 실무상 거짓 양성 결과를 얻기 위한 것이다.

HEV의 세포배양과 조직배양은 모두 성공적이었으나, 이 바이러스를 대량으로 얻을 수 있는 실질적인 방법은 아직까지 개발되지 못하여서, 종래의 죽이거나 약화시킨 백신을 사용하는 것으로부터 유전자 조작을 통한 서브유닛이나 DNA 백신을 사 용하는 방식으로 전환하는 것이 유일한 연구방식이다.

5147에 위치한 염기로부터 시작하는 HEV ORF2는 1980개의 뉴클레오타이드를 갖는데 이것은 주요 구조 단백질로 추정되는 660개의 아미노산으로 된 폴리펩티드를 코딩하고 이 바이러스의 캡시드를 구성한다. ORF2 단백질의 N 말단에는, 아르기닌이 풍부한 대역과 이어진, 전통적인 시그날 서열이 존재하는데, 이는 양전하가 매우 높은 대역이면서 바이러스 어셈블리가 진행되는 동안 게놈 RNA 캡슐화에 관련있는 것으로 믿어지고 있다. 번역 프로세스가 진행되는 동안, ORF2는 시그날 펩티드 인식된 단백질 (SRP: signal peptide recognized protein)의 메카니즘에 의해 소포체 (ER: endoplasmic reticulum)내로 들어가서 ER 내부에서 글리코실화 및 축적된 다음 그 자리에서 (in situ) 캡시드의 캡소머 (capsomer)를 형성하는 듯 하다. 3군데의 N-글리코실화 사이트인 Asn-137, Asn-310 및 Asn-562는 ORF2에 위치한다. 이들은 여러 종의 바이러스 균주 중에서도 고도로 보존적이며, Asn-310은 주요 글리코실화 사이트이다. ORF2-트랜스펙션된 포유류 세포 COS, 인간의 간세포 육종 Huh-7, HepG2는 따라서 세포질과 막 모두에서 발견될 수 있는 88kD의 당단백질을 발현할 수 있다. 이들 글리코실화 사이트에서의 돌연변이는 세포막 상의 PORF2의 로케이션에 하등 영향을 미치지 않았다. 그러나, 시그날 펩티드 서열이 그로부터 제거된 후에는, PORF2는 세포질에서만 발견되었다. 이것은 글리코실화 대신 PORF2의 이동이 세포막 상에서의 단백질 로케이션에 필요함을 가리키는 것이다. HBV내에서의 MS 단백질처럼, PORF2는 골지체 대신 ER을 통해 세포막에 직접 분비될 가능성이 있다. 트랜스펙션된 세포의 표면에서, gpORF2는 무작위적으로 분포하는 것이 아 니라, 특정 대역에 집중적으로 존재하며, 이는 단백질 서브유닛의 활성적인 컴비네이션 작용을 가리키는 것으로서, 보다 잘 정비된 진화된 형태로 응집될 가능성을 시사하는 것이다. 바이러스가 최종적으로 어셈블리/성숙화하려면 게놈 RNA의 캡슐화가 필요하며, 따라서 이 과정은 세포막의 내벽이나 ER의 세포질 밖에서 일어나야만 한다. 막 중에 gpORF2이 축적된다는 것은 바이러스가 어셈블리됨을 가리키는 것일 수 있다. 이와 동시에, 막 상의 캡시드 단백질의 로케이션 역시 버딩(budding)을 통한 세포외로의 성숙한 바이러스의 분비 가능성을 암시하는 것이다. 또 한가지 주의할 것은 번역 및 변형 기능을 갖는 생체외 번역 시스템을 이용한 PORF2의 생체외 전사 및 번역에 의해 88kD의 gpORF2를 모노머 및 다이머의 두가지 형태 모두로 생산할 수 있다는 점이다. 이것은 gpORF2가 동종 다이머를 형성하기 쉽다는 것과 캡시드의 캡소머가 상기 gpORF2의 동종 다이머로 구성될 수 있음을 설명해 주는 것이다 (Jameel외 1996, J. Virol., 70:207-216). 프로스트 에칭 일렉션 현미경을 통해서, Li 등은 배큘로바이러스에 의해 발현된 재조합 HEV VLP가 직경이 22-23nm인 p50 서브유닛 50개로 이루어진 20면체의 대칭 비리온 (T=1)을 갖고 있다는 것을 발견하였다. 이크기의 입자의 내부 공간은 약 1 kb RNA를 함유할 수 있도, HEV 게놈은 길이가 7.5 kb이므로, 천연의 HEV가 T ≥3의 결정격자 구조를 가지나, 캡소머의 위상기하학적 (topological) 구조는 유사하다고 추정된다. T=3 서브유닛의 총 갯수는 90 캡소머이다 (Li 외, 1999, virology, 265:35-45).

상기 설명에 따르면, HEV는 엔벨롭되지 않은 바이러스이다. 바이러스 캡시드는 ORF2-코딩된 단백질로 이루어진다. 이 단백질은 주요 면역학적 에피토프와 몇몇 무력화 (neutralizing) 에피토프를 나타내기 때문에, 서브유닛 백신 연구에 있어서 가장 선호되는 단편들이 되었다.

사이노몰구스 원숭이 4마리에게 HEV Burma 균주 ORF2 C 말단 2/3 (aa225~660)을 포함하는 E. coli 에서 발현된 재조합 단백질 trpE-C2를 i.m. 주사한 것이 Reyes 등의 미국특허 제 5,885,768호에서 처음으로 보고되었는데 여기서 상기 단백질은 제 0, 30일에 50μg/투여량으로 투여됨으로써 명반 어쥬번트 (alum adjuvant)와 함꼐 포뮬레이션된 것이다. 다른 2마리에 원숭이들은 어쥬번트만을 사용한 대조군이었다. 4주일 후, 채취된 혈액으로부터 나타난 항체에 대해서는 웨스턴 블로팅에 의해 양성 결과가 얻어지지 않았다. 2마리의 원숭이에 대해 80μg 비용해성 재조합 단백질을 어쥬번트 없이 투여함으로써 3번째로 면역화시켰다. 4주일 후, 원숭이 두마리 모두 양성이었다 (WB). 이들 6마리의 원숭이를 각각 3마리씩 제 1 그룹과 제 2 그룹으로 나누고, 각 그룹마다 2마리는 3회 또는 2회 접종시켜 면역화시키고 나머지 한마리는 대조군으로 하였다. 제 1 그룹에는 Burma HEV를 사용하고 제 2 그룹에는 Mexico HEV를 사용하였다. 그 결과 (1) ALT는 면역화된 그룹 중 항상 정상을 유지하였으나 대조군에서는 면역화 전에 6~10배 더 높아졌다; (2) 간의 생검 샘플을 면역학적 형광법에 의해 검사하였다. 3 차례의 투여에 의해 면역화되어 Burma 균주로 처리한 것들을 제외한 모든 원숭이들에서 항원이 발견되었다. (3) 3 차례의 투여에 의해 면역화되어 Burma 균주로 처리한 것들을 제외한 모든 원숭이들에서 분변 중에 바이러스가 분비되는 것으로 나타났다. 이러한 연구 샘플은 작지만, ORF2로부터의 재조합 단백질이 바이러스 간염의 생화학적 인덱스의 발 생을 차단하여 원숭이들이 야생 HEV에 의해 공격당할 경우 그에 감염되는 것을 완전히 방지해줌을 시사해준다.

Tsarev 등 (1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10198-10202; Tsarev 외, 1993, J. Infect. Dis., 168:369-378; Tsarev 외, 1997, Vaccine 15:1834-1838)은 곤충의 배큘로바이러스 (SF 세포)를 이용하여 HEV ORF2를 발현시켜 세포 용액중 20nm~30nm의 다양한 크기의 단백질 입자들을 얻었다. 소형 입자의 백분율은 곤충 세포의 분열 말기 (anaphse) 동안 실질적으로 증가되었다. 25 kD, 29kD, 35kD, 40~45kD, 55~70kD, 7kD의 특정의 다양한 크기 밴드를 갖는 배큘로바이러스 발현 ORF2를 검출하는데 WB법을 이용하였다. 이온 교환 및 분자 스크리닝법을 이용하여 HEV 특이 단백질을 정제하였다. 재조합 바이러스에 의해 세포가 감염된지 1일 후에, 72 kD의 전체 ORF2 펩티드가 처음으로 나타났으며 점차 사라졌다. 제 2일에, 63kD 및 55kD의 펩티드가 나타났다. 제 1일에, 53 kD의 펩티드가 대량으로 세포 용액에 나타났으며 제 3일에 피크를 이루었다. 이는 주요 72 kD 단백질이 55 kD (세포 용해 용액 중) 및/또는 53 kD (세포 용액)의 HEV 단백질로 무작위적으로 절단되었음을 가리키는 것이었다. 이들 2가지 단백질들을 시퀀싱하자 55 kD는 ORF2 aa112-607에 위치하였으나 53kD는 aa112~578에, 63kD는 aa112~660에 위치하는 것으로 나타났다. ELISA 분석 결과 55 kD의 활성은 53 kD의 활성보다 더 강력한 것으로 나타났다. aa112~660 단편이 곤충의 배큘로바이러스에서 발현되었다면, 63 kD 및 55 kD 재조합 HEV 단백질 역시 발견되었을 것이다.

SF9 세포들을 감염된 세포로부터 제 7일에 수확하였다. 이 단백질을 일차로 정제하여 명반 어쥬번트와 함께 흡수시켰다. 이어서 사이노몰구스 원숭이들을 1회 투여시 50μg 단백질로 근육주사에 의해 면역화시켰다. 4마리는 1회 투여하고, 다른 4마리는 2회 투여하였다 (0일, 28일). 최종 투여 후, 모든 원숭이들을 샘플 HEV 균주 (파키스탄 환자로부터 얻은 SAR-55)를 1000~10000 CDI50 정맥주사함으로써 공격하였다. 15주일 이내에, 간을 생감하고, 혈청과 분변을 매주 수집하였다. 바이러스 공격 전의 1회 투여 원숭이에 있어서의 항체 역가는 1:100 ~ 1:10000이었으나, 2회 투여 그룹에 있어서는 모두 1:10000이었다 (정제된 55kD로 코팅됨). 1회 투여 그룹에 있어서, 원숭이 한마리가 바이러스 공격 9주일 후 마취사고로 인해 죽었다 (결과에는 여전히 산입함). 2회 투여 그룹에 있어서는, 바이러스 공격 후 원숭이 2마리가 알 수 없는 이유로 죽었다 (결과에 산입하지 않음). 면역 후 6마리의 원숭이는 모두 ALT가 상승되지 않았으며 간 생검 병인학도 변화하지 않은 것으로 나타났으며, 바이러스혈증도 감지되지 않았다. 1회 투여 그룹 중 4마리 원숭이 중, 3마리는 바이러스를 분비하였으나, 2회 투여 그룹 중 2마리는 바이러스를 분비하지 않은 것으로 나타났다.

정제순도 99% 이상이 달성되도록 이온 교환법과 분자체법에 의해 배큘로바이러스 시스템에서 발현된 55 kD 단백질을 추가로 정제하였다. 명반 어쥬번트 흡수 후, 투여량 50 μg, 10μg, 2μg, 0.4μg, 0μg (대조군)으로 단백질을 0일과 28일에 4마리 레수스 원숭이에게 주사하였다. 최종 투여로부터 4주일 후, 원숭이들을 동일 바이러스 (SAR-55)로 공격하였다. 면역된 그룹 중 16마리의 원숭이는 모두 정상적이었으며, 2 μg 투여된 원숭이 한마리와 0.4μg 투여된 또 다른 원숭이만은 경미한 병인학 변화를 나타내었다. 면역에 의해 간염을 예방할 수는 있지만 감염 자체를 피할 수는 없다. 면역화된 원숭이 16마리는 모두 바이러스를 분비하였으며 50μg 투여된 원숭이 한마리와 10μg 투여된 또 다른 원숭이를 제외하고는 모두 바이러스 혈증을 나타내었다. 바이러스의 양은 대부분의 원숭이에서 제한적이었지만, 그 기간이 단축되지는 않았다. 또 다른 4 마리의 원숭이를 2 x 50 μ으로 면역시키고 최종 투여로부터 4주일 후에 다른 HEV 4로 100,000 MID 50으로 공격하였다. 결과는 유사하였다. 다른 원숭이 4마리는 어느것도 ALT 증가나 병인학 변화를 나타내지는 않았으나, 원숭이 한마리만은 바이러스 분비도, 바이러스 혈증도 나타내지 않앗다. 바이러스의 양은 눈에 띠게 감소하였지만, 그 기간은 단축되지 않았다. 저자의 의견에 따르면, 이들 원숭이에 있어서 완전한 보호 효과는 이전 시간보다 더 악화되었다고 한다. 아마도 이것은 공격에 사용된 바이러스의 양과 관련이 있을 수 있다. 이 실험에 사용된 바이러스의 양은 300,000이었으나 1000 ~ 10000MID 50최종회였다. 한가지 더 유의할만한 것은, 그룹 당 0.4μg 내지 50μg 에 달하는 항체 역가가 공격 전과 비교해 아무런 차이를 나타내지 않았다는 것이다.

Genelabs 사의 스탭들은 곤충의 동일한 배큘로바이러스를 이용하여 ORF2 aa112~660을 발현시키고 대량의 가용성 재조합 62 kD 단백질을 얻었다. 정제 후, 사이노몰구스 원숭이들을 면역화시켜 1000CID50 투여량에 의해 바이러스 (멕시코 균주)의 공격으로부터 보호하였다 (20μg으로 면역화된 원숭이 3마리는 병에 걸리지 않았다. 2마리에서는 바이러스 분비가 발견되지 않았고 바이러스 분비량도 감소하였다). (Zhang 외, 1997, Clin Diagn Lab Immunol.; 4:423-8).

McAtee 등 (1996, Protein Expr. Purif. 8:262-270)은 재조합 배큘로바이러스에서 다이머발현된 Burma ORF2 62kD를 제조하였다. 이 다이머를 HPLC-MS에 의해 56.5kD와 58.1kD의 2개의 펩티드로 각각 분리시켰다. 펩티드 질량 핑거프린트 분석 결과 이들 2개의 펩티드의 N 말단은 동일한 아미노산 112이고, C 말단은 각각 aa637 및 aa652인 것으로 나타났다. 56.5 kD 단백질은 매우 우수한 면역원 (immunogen)이었다.

호주의 앤더슨 그룹 (Anderson 외, 1999 J. Virol. Methods., 81:131-142: Li외, 1994, J Clin Micrbio.) 32:2060-2066; Li외, 1997 J. Med. Virol., 52:289-300; Li외, 2000, J. Med. Virol., 60:379-386)은 E. coli에서 발현된 ORF2 aa394-660 (ORF2.1)을 사용하였다. 이 생성물은 고도로 컨포메이셔널한 회복기 에피토프를 형성할 수 있는 폴리 아르기닌 단백질 또는 GST-콘키오메릭 단백질이다. 이 에피토프는 매우 높은 속도로 회복기 혈청을 검색할 수 있으나, 그 단편이 N 말단을 향해 트렁케이트되거나 또는 연장되는 경우에는 사라질 것이다. 재조합 ORF2.1 단백질로 쥐들을 면역화한지 30주일 후에 혈청을 코팅된 항원으로서 이용함으로써 배큘로바이러스에서 발현된 VLP를 갖는 회복기 환자로부터의 혈청을 블로킹하였다. 블로킹 비율은 81% ~86%에 달하였다. 모노클로날 항체를 ORF2.1 단백질을 이용하여 제조하고 ORF2.1 컨포메이셔널 에피토프를 동정할 수 있는 2개의 모노클로날 항체 2E2와 4B2 및 5개의 가능한 식별가능한 모노클로날 항체들이 얻어졌다. 블로킹 비율은 2E2나 또는 4B2가 항원으로서 VLP와 함께 회복기 혈청을 블로킹하는데 이용되었는지에 따라 60%에 달할 수 있다. 이것은 이들 두가지 모노클로날 항체들이 회복 기 혈청 중 항체 동정된 에피토프의 주요 성분들인 에피토프를 식별할 수 있음을 가리키는 것이다. 또 다른 데이타는 ORF2.1이 오히려 VLP와 구조가 유사한 주요 에피토프를 가짐을 보여주었다. 이 에피토프에 대한 항체는 HEV 감염 혈청에서 장기간 존재할 수 있다. 이것은 아마도 중요한 보호 에피토프일 것이나, ORF2.1에 관한 동물 보호 실험은 아직까지 보고된 바 없다.

발명의 요약

본 발명의 한가지 측면에 따라 E형 간염 바이러스 오픈 리딩프레임 (ORF)2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (서열번호 1에 제시됨) 또는 그의 단편이 제공되며, 이것은 n-폴리머형 폴리펩티드로서 여기서 n은 1-180인 정수이고 E형 간염 바이러스 OF2의 서열번호 1에 제시된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편은 다음 중에서 선택된다:

1) 아미노산 잔기 113과 469 사이에서 시작되는 아미노 말단 및 아미노산 잔기 596과 660 사이에서 종결되는 카르복실 잔기를 갖는 폴리펩티드;

2) 아미노산 잔기 370과 469 사이에서 시작되는 아미노 말단 및 아미노산 잔기 601과 628 사이에서 종결되는 카르복실 잔기를 갖는 폴리펩티드;

3) 아미노산 잔기 390과 459 사이에서 시작되는 아미노 말단 및 아미노산 잔기 601과 610 사이에서 종결되는 카르복실 잔기를 갖는 폴리펩티드;

4) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 414 내지 660의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 247;

5) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 429 내지 660의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 232;

6) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 439 내지 660의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 222;

7) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 459 내지 660의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 201;

8) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 628의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 235N;

9) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 225N;

10) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 602의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 209N;

11) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 601의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 208N;

12) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 606의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 NE2I;

13) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 390 내지 603의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 217D;

14) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 374 내지 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 205;

15) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 414 내지 602의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 289;

16) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 414 내지 601의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 188;

17) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 459 내지 628의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및

18) 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 X 내지 603의 아미노산 서열을 가지며 N-말단에 Met가 부가되어 있고, C-말단이 변형되어 있는 폴리펩티드로서, 여기서, 상기 변형된 C-말단이라 함은 5'-3' 방향에서, 아미노산 서열 -Pro-Pro-Arg가 아미노산 잔기 603, Pro에 그의 3' 말단에 부가된 것을 의미하는 것으로 다음을 포함한다:

a) X가 아미노산 잔기 394이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 바와 같음, 즉, NE2임;

b) X가 아미노산 잔기 414이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 바와 같음, 즉, 193C임;

c) X가 아미노산 잔기 429이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 4에 제시된 바와 같음, 즉, 178C임;

d) X가 아미노산 잔기 439이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 72에 제시된 바와 같음, 즉, 168C임;

e) X가 아미노산 잔기 449이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 8에 제시된 바와 같음, 즉, 158C임;

f) X가 아미노산 잔기 459이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 9에 제시된 바와 같음, 즉, 148C임;

g) X가 아미노산 잔기 469이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 10에 제시된 바와 같음, 즉, 138C임;

본 발명의 또 다른 측면에 따라 상기 1) 내지 18)에 제시된 바와 같은 전술한 폴리펩티드들 중 어느 하나와 적어도 80%의 상동성을 가지며 항원성이나 면역원성 등 실제로 동일한 생물학적 특성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 상기한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드(들)을 발현할 수 있는, 상기 재조합 발현 벡터 중 어느 하나에 의해 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드들 중 적어도 하나 또는 그의 여하한 조합, 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 어쥬번트를 함유하는, 포유류에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드와 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 항원의 보존 단편을 포함하여 이루어진 키메릭 단백질이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드와 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 항원의 보존 단편으로 된 키메릭 단백질 및 임의로 약학 적으로 허용되는 담체 및/또는 어쥬번트를 포함하여 이루어진 포유류에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 포유류가 E형 간염 바이러스에 감염되는 것을 예방하기 위해 포유류 동물을 백신화시키기 위한 상기 백신 조성물의 용도도 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 적어도 한가지의 상기 폴리펩티드(들) 또는 적어도 한가지의 상기 폴리펩티드와 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글리티닌 항원의 보존 단편으로 구성된 키메릭 단백질(들)의 예방 및/또는 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 되는, 포유동물에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 적어도 한가지의 폴리펩티드 또는 그의 조합의 진단 유효량을 포함하는, 생물학적 샘플에서 E형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 진단용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 적어도 한가지 또는 그의 조합의 진단 유효량, 및 추가로 폴리펩티드 함유 E형 간염 바이러스 ORF3으로부터의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 함유하는 생물학적 샘플에 있어서 E형 간염 바이러스 감염 여부를 진단하기 위한 진단용 키트가 제공되며, 여기서 상기 폴리펩티드 함유 E형 간염 바이러스 ORF3으로부터의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편은 임의로 상기 폴리펩티드에 공유결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 진단용 키트를 항원과 항체와의 상호 반응에 적합한 조건 하에서, 검색하고자 하는 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하여 이루어지는, 생물학적 샘플에서 E형 간염 바이러스 감염을 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, E형 간염 바이러스에 대한 총 항체를 검출하는 방법, E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG를 검출하는 방법, 및 생물학적 샘플 중에서 E형 간염 바이러스에 대해 항체 IgM을 검출하는 방법도 제공된다.

달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 용어와 명명법은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용되는 것이다. 세포 배양, 분자유전공학, 핵산 화학, 및 면역학적 처리절차에서 통상적인 제조와 관련해서 이 분야에서 널리 사용되는 기술로서 수행되었다. 본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 이들 용어들은 다음의 의미를 갖는다:

"E형 간염 바이러스" 또는 "HEV"라 함은 i) 수인성 (water-borne), 감염성 간염을 일으키고; ii) 혈청학적 특성 측면에서 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 또는 D형 간염 바이러스 (HDV)와도 구별되며; iii) American Type Culture Collection (ATCC)에 수탁번호 67717호로 기탁된 E. coli 균주에 삽입된 플라스미드 pTZKF1 (ET1.1)에 삽입된 1.33 kb의 cDNA와 상동성을 갖는 게놈 대역을 함유하는 바이러스, 바이러스 유형 또는 바이러스군을 가리킨다.

본 발명의 폴리펩티드

한가지 측면에서, 본 발명은 놀랍게도 만족할만한 항체 반응성 및/또는 면역원성을 갖는 일련의 HEV의 폴리펩티드 단편들을 제공하며, 여기서 상기 단편들은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 HEV ORF2의 아미노산 서열 중에 포함된다. 각각의 단편의 명칭을 실시예 6의 표 1에 나타내었다.

본 발명에서, 아미노산 서열 중의 위치에 따른 아미노산 잔기의 넘버링은 International Union of Pure and Applied Chemistry 및 International Union of Biochemisty, Joint commission on biochemical Nomenclature, "Nomenclature and symbolism for Amino Acids and Peptdes", Pure Appl. Chem., 56, 595-624 (1984)에 따른 것이다. 특히, 서열번호 1 중 코딩 개시 사이트 Met는 위치 1로서 지정되었으며, 5'에서 3' 방향으로 증가되었다.

본 발명의 한가지 측면에서, n-폴리머형 폴리펩티드 (여기서 n은 1 - 180의 정수임) 형태로서, E형 간염 바이러스 ORF2의 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하여 이루어진 폴리펩티드가 제공된다. n이 2이면, 상기 폴리펩티드는 다이머 폴리펩티드이고; n이 3이면 상기 폴리펩티드는 트라이머 폴리펩티드; n이 4이면 상기 폴리펩티드는 테트라머 폴리펩티드, 이런 식으로 계속 명명된다.

본 발명에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 상기 폴리펩티드 단편의 아미노 말단 (5' 말단)은 아미노산 잔기 113 내지 469, 바람직하게는 아미노산 잔기 370 내지 469, 더욱 바람직하게는 아미노산 잔기 390 내지 459에서 시작하는 것이 좋고; 상기 폴리펩티드의 카르복실 말단 (3' 말단)은 아미노산 잔기 596 내지 660, 바람직하게는 아미노산 잔기 601 내지 628, 더욱 바람직하게는 아미노산 잔기 601 내지 610에서 종결되는 것이 좋다. 특히, 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 폴리펩티드 247, 폴리펩티드 232, 폴리펩티드 222, 폴리펩티드 201, 포리펩티드 235N, 폴리펩티드 225N, 폴리펩티드 209N, 폴리펩티드 208N, 폴리펩티드 NE2I, 폴리펩티드 217D, 폴리펩티드 205, 폴리펩티드 189, 폴리펩티드 188, 및 E형 간염1의 아미노산 잔기 459 내지 628의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

본 발명은 또한, N-말단에 Met가 부가되고 변형된 C-말단을 갖는, 서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 X 내지 603의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에도 관계되며, 여기서, 상기 변형된 C-말단이라 함은 5'-3' 방향에서, 아미노산 서열 -Pro-Pro-Arg가 아미노산 잔기 603, Pro에 그의 3' 말단에 부가된 것을 의미하는 것으로 다음을 포함한다: a) NE2; b) 193C; c) 178C; d) 168C; e) 158C; f) 148C; g) 138C.

본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 적어도 80%의 상동성을 가지면서 항원성이나 면역원성과 같은 생물학적 특성이 실질적으로 동일한 폴리펩티드, 즉 본 발명의 폴리펩티드의 유도체와도 관계된다. 특히, 상기 폴리펩티드의 아미노산이 그의 N-말단 및/또는 C-말단에서 본 발명의 폴리펩티드와 이웃하는 천연 서열 이외의 아미노산과 함께 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 조건 하에서, 본 발명의 폴리펩티드의 그것과 항원성 및/또는 면역원성 등과 같은 생물학적 측면에서 여전히 유사한 특성을 유지할 경우, 그러한 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 유도체로서 간주된다. 결과적으로, 이것에 상응하는 DNA 단편은 본 발명의 DNA의 유도체라고 불리운다. 예컨대, 발현 및/또는 정제 목적에 있어서, 그의 N-말단에 개시 아미노산 (메티오닌)이나 기타 선도 펩티드 및/또는 시그날 펩티드를 부가하거나, 또는 그의 C-말단에 몇몇 히스티딘을 부가함으로써 정제를 용이하게 할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 중 어느 하나와 동일한 생물학적 특성, 예컨대 동일한 항원성 및/또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드 중 어느 하나와 적어도 80%의 서열 동일성 (sequence idntity)을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이기도 하다. "동일성 백분율 (percentage identity)"라는 용어는 최적의 얼라인먼트 후 얻어진, 비교하고자 하는 2개의 서열들 간에 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율을 가리키는 것으로서, 이 백분율은 순전히 통계학적인 것으로서고, 2개의 서열간의 차이는 무작위적으로 그 전 길이에 걸쳐 분포하는 것이다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 이들을 최적상태로 정렬 (align) 시킨 후, 수행하는 것이 통상적이며, 상기한 바와 같이 수행되는 비교는 서열 유사성을 나타내는 국부적인 대역을 동정 및 비교하기 위한 "비교창 (window of comparison)"에 의하거나 또는 세그먼트일 수 있다. 서열 비교를 위한 최적 얼라인먼트는 수작업 방식 이외에도, Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math., 2:482의 국부적 상동성 알고리듬 방식, Neddleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bio., 48:443의 국부적 상동성 알고리듬 방식, Pearson and Lipman (1988), Proc. natl. Acad. Sci., USA, 85:2444의 유사성 서치 방법, 이러한 알고리듬을 이용하는 컴퓨터 프로그램 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)을 이용하여 수행할 수 있다.

2개의 핵산이나 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은, 최적 방식으로 정렬된 이들 2개의 서열을 비교함으로써 측정되는데, 이러한 최적 정렬 방식에서는 이들 두가지 서열 사이의 최적의 얼라인먼트를 위한 레퍼런스 서열과 비교할 때, 비교하고자 하는 핵산 또는 아미노산 서열에 부가 또는 결실이 가해질 수 있다. 동일성 백분율은 2개의 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 동일 위치 수를 측정한 다음, 이 수를 비교된 위치의 수로 나눈 다음 얻어진 결과에 100을 곱함으로써 얻을 수 있다.

예컨대, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 얻어진 BLAST "BLAST2 서열" 프로그램을 이용할 수 있는데, 이 프로그램에서 변수는 디폴트 (특히, 오픈 갭 페널티 (open gap penalty)는 5이고, 익스텐젼 갭 페널티는 2임; 이러한 프로그램에 의해 제공된 매트릭스는 "blosum 62"이다)이고, 정렬될 2개의 서열간의 동일성 백분율은 이 프로그램에 의해 직접 계산된다.

본 발명의 폴리펩티드의 제조

본 발명의 폴리펩티드는 예컨대 화학합성법 및 재조합 DNA 기술과 같은 공지 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법은 재조합 DNA 발현을 통해 수행하는 것이 좋다. 재조합 단백질의 제조방법은 기술 분야에 잘 알려져 있기 때문에 본 명세서에 상세히 설명할 필요는 없다; 또한, 실시예를 통해서도 그 방법을 알 수 있다. 재조합 단백질을 생산하는데 유용한 세포에 관해서는 박테리아 세포 (P.O. Olins 및 S.C. Lee, 1993, Cur. Opi. Biotechnology, 4:520-525), 효모 세포 (R.G. Buckholz, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:538-542), 동물 세포, 특히 포유류 세포 배양체 (C.P. Edwards and A. Aruffo, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:558-563), 및 곤충 세포에 대해 언급하여야 할 것이다, 곤충 세포를 이용한 방법과 관련하여서는, 예컨대 배큘로바이러스 (V. A. Luckow, 1993, Curr. Opi. Biotechnology, 4:564-572)에 관해 참조할 수 있다. 이와 관련해서, 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진 재조합 발현 벡터도 제공한다. 본 발명은 또한 그 안에 함유된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포도 추가로 제공한다.

본 발명의 한가지 구체예에서, E. coli는 다음과 같이 본 발명의 폴리펩티드를 개별적으로 발현시킨다: 폴리펩티드 247, 폴리펩티드 232, 폴리펩티드 222, 폴리펩티드 201, 폴리펩티드 235N, 폴리펩티드 225N, 폴리펩티드 209N, 폴리펩티드 208N, 폴리펩티드 NE2I, 폴리펩티드 217D, 폴리펩티드 205, 폴리펩티드 189, 폴리펩티드 188, 및 폴리펩티드 a) NE2; b)193C.

상기 폴리펩티드의 모노머와 다이머간의 비율, 폴리머형 폴리펩티드와 개개의 라듐 (radium)을 측정한다 (상세는 실시예 6 참조). 결과가 보여주듯 발현된 생성물을 리폴드 (refold)하는 경향이 있다. 리폴딩 후 용액 중에서 안정한 폴리머를 자가-형성할 수 있는 능력이 있음으로 해서 본 발명의 폴리머는 HEV의 예방 및/또는 치료를 위한 백신으로서 사용하는데 특히 적합하다. 본 발명의 한가지 구체예에 서, 다이머, 트라이머 및 테트라머를 비롯한 폴리머들이 하나의 테스트에서 검출된 바 있다. 오늘날의 방법학에 의해 제한적이긴 하지만, 연역된 트라이머가 실제로는 다이머와 테트라머가 적절한 비율로 혼합된 혼합물로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 방법학의 발달로 인해 균일하고 보다 큰 폴리펩티드를 형성할 수 있는 것으로 여겨진다. 공지 문헌 (Jameel 외, 1996, J. Virology, 70:207-216; Li 외, 1999, Virology, 265:35-45)으로부터 유추해보면, 천연의 HEV는 개개의 서브-파티클이 ORF2 폴리펩티드의 다이머인 90개의 서브-파티클 (sub-particles)로 구성되어 있을 가능성이 있다. 따라서, 바이러스 구조에 대한 이해가 진전되면, 본 발명의 폴리펩티드는 180-머 (180-meric)까지의 폴리펩티드로 된 폴리머, 또는 그보다 더 큰 폴리머를 형성할 수 있을 것으로 추정된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 201이 E. coli에 의해 봉입체 (inclusion body) 형태로서 고수율로 발현된다고 해도, 본 발명자들은 놀랍게도 상기 봉입체가 pH7.45의 PBS 완충액 중에서 자발적으로 자가-복원 (self-renature)할 수 있음으로 해서, 구아니딘 염산염 첨가 및 그에 이어 다단계의 투석을 거치는 단계를 포함하여서 시간이 많이 걸리고 지루할 뿐만 아니라 복원율도 저조한 종래의 변성/복원 프로세스가 필요없다는 것을 발견하였다. 또한, E. coli에 의해 동시적으로 발현된 다른 바람직하지 못한 단백질 봉입체는 자발적인 자가-복원을 하지 못하기 대문에, 본 발명의 흥미로운 단백질은 원심분리 및 상등액 회수에 의해 실제로 간편하게 정제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드로 이루어진 키메릭 단백질 및 인플루엔자 바이러스로 부터의 헤마글루티닌 항원의 보존 단편

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 폴리펩티드와 인플루엔자로부터의 헤마글루티닌 항원의 보존 단편 중 어느 하나로 이루어진 키메릭 단백질도 제공된다. 헤마글루티닌 항원 (이하 HA라 칭함)은 인플루엔자 바이러스의 2표면 항원으로서 환자 혈청 중의 인플루엔자 바이러스에 대한 항체에 대한 특이적 검출에 사용되는 대부분의 수입 항원이다. HA에 의해 백신화시킨 동물에 의해 발생한 항체는 인플루엔자 바이러스의 재감염을 효과적으로 방지한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 대부분의 사람들이 HA에 대한 항체를 갖는 것으로 믿는 것이 합리적이다. 이전의 보고 (McEwen J. 외, Vaccine, 1992; 10 (6):405-11)에 따르면, 에피토프 91-108 aa는 인플루엔자 바이러스 타잎 A의 모든 HE 균주 중 HA 유전자의 보존된 아미노 서열이다. 본 발명의 한가지 바람직한 구체예에서, 우선, 원핵 발현 시스템, 특히 E. coli에서의 키메릭 발현은 유전자 조작에 의해, HA 유전자 (91-108aa)를 Gly-Gly-Ser와 같이 면역성이 높은 본 발명의 HEV ORF2 유전자의 폴리펩티드 단편에 유연하게 연결(flexibly linking)시킴으로써 수립한다. 이어서 인플루엔자 바이러스에 미리 감염시킴으로써 발생시킨 HA 항체로 부스트시켜서, 고역가의 보호적인 항-HEV 항체를 생산할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 ORF2 단편만을 단독으로 함유하는 백신보다 강력한 HEV 백신을 얻는다.

본 발명의 이러한 내용에 비추어서, 본 발명의 백신 성분에 유용한 에피토프를 당업자라면 HA 유전자 중의 다른 보존된 단편으로부터 선별할 수 있을 것이다. HA의 특이적 에피토프를 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 유연하게 연결시킬 수 있는 링커는, 그것이 본 발명의 폴리펩티드와 HA의 선별된 단편 간에 연결을 제공할 수만 있다면, 그리고 포유류의 HEV 감염을 예방/치료하기 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 조건 하에, 적절한 펩티드 단편 또는 그의 동족체로 이루어질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 HA를 연결하기 위한 링커의 선택은 본 발명의 선택된 폴리펩티드의 독특 특성에 주로 의존함을 이해하여야 한다. 예컨대, HA와 연결될 본 발명의 선택된 폴리펩티드에 따라 여러가지 링커를 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 HA의 보존 단편들은 아미노산 잔기 91-108로부터의 단편인 것이 좋다.

면역원으로서의 본 발명의 폴리펩티드와 HA의 선택된 단편간의 연결을 위한 링커는 화학 합성 기술과 같은 통상적인 합성 기술에 의해 합성하는 것이 바람직하다. 또한, 자동 펩티드 합성기에 의한 t-BOC법과 같은, 표준 화학적 방법에 따라 당업자라면 어떠한 펩티드든 합성할 수 있다 (예컨대 L.A. Caprino, J.Am Chem. Soc., 79:4427, 1957 참조). 그러나, 다른 공지방법이나 단백질의 화학적 가수분해에 의해서도 펩티드를 생산할 수 있다.

다른 한편, 본 발명의 폴리펩티드와 HA와의 키메릭 단백질은 DNA 분자의 핵산 서열로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 생산할 수도 있는데, 이 방법에서 상기 DNA 분자는 재조합 DNA 기술과 같은 통상적인 유전자 조작법을 통해 숙주 미생물 또는 숙주 세포를 클로닝함으로써 얻어진 본 발명의 폴리펩티드와 HA 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 형질전환된 세포에서 재조합 기술에 의해 생산할 경우, 결과적인 키메릭 단백질은 배양 배지, 숙주 세포 또는 이들 두가지 모두로부터 상법 에 따라 정제 및 회수될 수 있다. 재조합 기술에 의해 생산된 상기 키메릭 단백질을 분리함으로써 얻어진 펩티드를 재조합 DNA 기술에 의한 재조합 생성시 세포 물질 또는 배양 배지로부터 분리시킬 수 있다. 또한, 얻어진 펩티드의 코딩 서열 역시 합성에 의해, 또는 공지 방법에 따른 바이러스 RNA를 이용함으로써 또는 그의 cDNA를 함유하는 플라스미드를 이용함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 이용되기 위해서, 전술한 키메릭 단백질은 그의 생산성을 증대시키기 위해 또는 그의 정제를 용이하게 하기 위해 일반적인 공지 구조 또는 다른 구조로 고안할 수 있다. E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, 포유류, 효모, 곤충 세포 및 식물 세포를 비롯한 다양한 세포 및 미생물에서 키메릭 펩티드를 클로닝 및 발현하는데 적합한 시스템과 벡터가 알려져 있으며 공중이 이용가능하고, 상업적으로도 이용가능하다.

재조합 기술 또는 합성에 의해 생산된 키메릭 단백질은 통상적인 정제방법에 의해 정제가 가능하다. 당업자라면 목적하는 용도에 따라 폴리펩티드의 소망되는 순도를 쉽게 결정할 수 있다.

백신 조성물

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 조합체 적어도 한가지 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 어쥬번트를 함유하여 이루어지는, 포유류에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신 조성물이 추가로 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명에 따른 폴리펩티드와 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 항원으로부터의 보존 단편을 함유하는 키메릭 단백질 및 임의로, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 어쥬번트를 포함하여 이루어지는, 포유류에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신 조성물도 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기한 E형 간염 바이러스 감염을 예방하기 위해 포유류를 백신화시키기 위한 상기 백신 조성물의 용도도 제공된다.

본 발명에서, 접종되거나 치료될 포유류로는 인간 및 다른 영장류, 예컨대, 비비 원숭이, 유인원, 원숭이 등; 소, 염소, 돼지, 토끼, 쥐와 같은 경제적 목적으로 사육되는 동물, 고양이, 개, 등과 같은 애완동물을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 백신 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 적어도 한가지의 치료 및/또는 예방 유효량을 함유하며 여기서 상기 유효량은 그 양을 투여 후, HEV에 감염된 대상을 일정 기간 동안 효과적으로 치료하는데 충분한 또는 HEV 감염을 방지하는데 충분한 양을 말한다.

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 또는 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 방출속도 조절제를 함유하는 치료나 예방을 위한 다른 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 상기 담체는 HEV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 벡터 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 적절한 약학적으로 허용가능한 벡터라 함은 생물학적으로 불활성이고/또는 무독성인 것을 의미한다. 기술분야에 알려진 다양한 벡터를 이러한 목적에 따라 선택할 수 있다. 일반적으로, 상기 벡터로는: 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 오르토포스페이 트, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 명반, 알루미늄 옥사이드, 알루미늄 히드록사이드, 피넛 오일, 올리브 오일, 세서미 오일 및 물을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 벡터 또는 희석제는 글리세릴 모노스테아레이트/글리세릴 디스테아레이트와 같은 방출속도 조절 물질을 단독으로 또는 파라핀과의 조합 형태로 추가로 함유할 수 있다. 또한, 가용 유리 (soluble glass)를 비롯한 통상적인 방출속도 조절 폴리머 조성물도 이용가능하다.

또한, 필요하다면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 조합체 적어도 한가지를 포함하는 본 발명의 백신 조성물은 다른 치료약물/예방약물을 추가로 함유할 수도 있다. 예컨대, 상기 조성물은 HEV 감염의 치료 또는 예방에 유용한 여러가지 약제의 "칵테일 혼합물"을 포함할 수 있다. 이러한 칵테일 혼합물은 인터페론, 뉴클레오티드 동족체 및/또는 N-아세틸-시스테인과 같은 다른 약제도 추가로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 폴리펩티드를 적어도 한가지 함유하는 본 발명의 백신 조성물은 치료 대상자에서 T 세포 응답과 항체를 추가로 유도하는데 유용한 시토카인 또는 어쥬번트와 같은 면역시스템 변형제 (immune system modifier)도 추가로 함유할 수 있다. 상기 변형제로는 통상적인 명반-기제 어쥬번트, 뮤라밀 디펩티드, 보존제, 화학 안정제 또는 기타 항원성 단백질이 포함된다. 일반적으로, 안정화제, 어쥬번트 또는 보존제 등은 소망되는 용도에 효능을 부여하기 위한 최상의 조성물을 제공하도록 최적화된다. 적절한 보존제로는 클로릴부티놀, 포타슘 소르베이트, 소르바인산, 이산화황, 프로필 갈레이드, 파라벤, 글리세린 및 페놀을 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물을 이용하여 포유류에서 HEV 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(들) 또는 적어도 한가지의 본 발명의 폴리펩티드 및 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 보존 단편으로 이루어진 키메릭 단백질(들)의 예방 및/또는 치료적 유효량을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 포유류에 있어서 E형 간염 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법도 제공한다. 특히, 상기 방법은 대상자에게 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 선택된 보존 단편이 아미노산 잔기 91-108로부터 얻어진 아미노산 단편인 것이 좋다.

이러한 조성물의 적정량은 소망되는 응답 수준에 따라 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 약 5 ug 내지 약 200 ug의 파티클을 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 일회 또는 수회에 걸친 접종에 의해 투여될 수 있다. 예컨대, 2 내지 6개월의 간격으로 3회에 걸쳐 접종할 수 있다. 적절한 투여량은 또한 환자의 건강 상태, 체중 또는 연령이나 단독요법으로 투여시 면역원 성분의 통상적인 투여량등의 다양한 인자를 고려하여 시술자의 판단에 따라 결정될 수도 있다. 환자 상태의 호전되거나 주어진 병원체에 대한 노출 위험도가 증가할 경우에, 필요에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 유지 투여량을 투여할 수 있다. 이어서, 소망하는 효과가 유지되는 수준으로 투여량이나 투여빈도 또는 두가지 모두를 감소시킬 수 있다. 이 시점에서 치료를 멈추어야 한다. 그러나 각 개체는 주어진 바람직하지 못한 상태의 재발시 장기간에 걸쳐 간헐적으로 치료 를 받아야 한다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 예컨대 경구 투여 뿐만 아니라 비경구 투여, 특히 근육내 또는 피하 투여 방식과 같은 통상적인 적절한 여하한 경로에 따라 투여될 수 있다. 폐, 코, 귀, 항문, 피부, 눈, 정맥, 동맥, 복강, 점막, 설하, 피하 또는 두개골을 경유하는 다른 경로 역시 이용가능하다.

본 발명의 백신 조성물은 주사가능한 조성물 또는 백신을 액체 용액이나 현탁액으로서 제조될 수 있다. 주사에 앞서 액상 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조할 수 있다. 특정 구체예에서 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되어 서방형 및/또는 장기간의 약물 전달을 가능하게 할 수도 있다. 또한, 이러한 제제는 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 약학적으로 허용가능하며 활성 성분 또는 성분들과 공존가능한 부형제를 활성 성분과 함께 혼합할 수 있다. 이러한 부형제의 예로는 프로인트 불완전 어쥬반트, 세균성 리포폴리사카라이드, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 뮤라밀 디펩티드, 레시틴, 완충물질, 셀룰로스-기제 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다.

생물학적 샘플 중 HEV에 대한 항체 IgG, IgM 또는 총 항체를 검색하기 위한 진단용 키트 및 진단방법

본 발명의 폴리펩티드는 생물학적 샘플 내에서 HEV에 대한 IgG, IgM 또는 총 항체의 존재 여부를 검출하는데도 이용가능하며, 이것은 기존의 검색 키트나 검색법에 비해 고감도 및 고특이성을 자랑한다. 따라서, 본 발명은 검색하고자 하는 샘 플을 항체/항원 상호반응에 적합한 조건 하에서 본 발명의 폴리펩티드의 검색 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 HEV 감염 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에서 검색되는 생물학적 샘플은 인간 및 다른 영장류, 예컨대 비비 원숭이, 유인원, 원승이 등; 소, 염소, 돼지, 토끼, 쥐와 같은 경제적 목적으로 사육되는 동물 뿐만 아니라 고양이, 개 등과 같은 동물을 포함하여 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 생물학적 샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 IgG 항체를 측정하기 위한 진단용 키트가 제공되며, 이것은 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나를 포함하고 (상기 폴리펩티드는 소망시 적절한 지지체로 그 표면을 예비 코팅시킬 수 있음); 상업적으로 이용가능하거나 통상적으로 제조된, 검색하고자 하는 생물학적 샘플로부터의 IgG에 지향된, 검색가능한 표지된 항체 항-IgG, 및 상기 검색가능한 표지에 대응하는 검색제를 추가로 함유할 수 있으며; 필요에 따라, 적절한 완충 시스템도 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 검색하고자 하는 상기 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래한 것이며 여기서 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 더욱 특이적으로, 본 발명의 IgG 항체용 진단 키트는 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 여기서 상기 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편은 본 발명의 폴리펩티드에 임의로 공유결합된다.

상기 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편이 본 발명의 폴리펩티드에 임의로 공유결합된 상황에서는, 유전자 재조합법에 의해 키메릭 폴리펩티드가 바람직하게 생산된다. HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 상기 폴리펩티드에 공유결합시키는데 화학적 방법도 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 생물학적 샘플 중에서 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM을 측정하기 위한 진단용 키트가 제공되며, 이 키트는 상업적으로 입수할 수 있거나 통상적으로 생산되는 검색가능한 표지된 항체 인 항-IgM을 검색하고자 하는 생물학적 샘플로부터 IgM에 대해 지향된 포획 항체 (capture antibody)로서 포함하며, 소망되는 경우 상기 포획 항체는 그 표면이 적절한 지지체로 예비-코팅되어 있으며; 추가로 검색가능하게 표지된 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나 및 상기 검색가능한 표지에 대응하는 검색제를 추가로 함유할 수 있고; 소망되는 경우 적절한 완충 시스템을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 검색하고자 하는 상기 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래되는 것으로서 여기서 항체는 항-인간 IgM 항체이다. 더욱 특이적으로, 본 발명의 IgM 항체 진단용 키트는 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 여기서 상기 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편은 본 발명의 폴리펩티드에 임의로 공유결합된다.

상기 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편이 본 발명의 폴리펩티드에 임의로 공유결합된 상황에서는, 유전자 재조합법에 의해 키메릭 폴리 펩티드가 바람직하게 생산된다. HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 상기 폴리펩티드에 공유결합시키는데 화학적 방법도 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서 생물학적 샘플 중 E형 간염 바이러스에 대한 총 항체의 측정을 위한 진단용 키트도 제공되며, 이것은 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나를 포함하고, 필요에 따라 상기 폴리펩티드는 적절한 지지체로 표면이 예비-코팅되고; 검색가능하게 표지된 제 1항에 따른 폴리펩티드 중 적어도 하나 및 상기 검색 가능한 표지에 대응하는 검색제를 추가로 포함하고; 여기서 지지체 표면 예비-코팅을 위한 제 1항에 따른 폴리펩티드 중에서 선택된 상기 폴리펩티드 및 제 1항에 따른 폴리펩티드 중에서 선택된 검색가능하게 표지된 폴리펩티드는 동일하거나 서로 다른 폴리펩티드일 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 총 항체 진단용 키트는 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편을 갖는 폴리펩티드를 추가로 함유하며, 여기서 상기 HEV ORF3의 면역원성 에피토프 또는 그의 면역원성 단편은 본 발명의 폴리펩티드에 임의로 공유결합될 수 있다.

기술분야에서는, 상기 진단용 키트에서, 여러 동물의 장점을 이용한 상업적으로 이용가능하거나 통상적인 다양한 방법으로 생산된 항-인간 IgG 또는 항-인간 IgM이 사용된다는 것이 잘 알려져 있다. 다른 한편, 검색하고자 하는 생물학적 샘플이 유도된 특정 동물에 대한 항-IgG 또는 항-IgM이 사용될 수 있으며 이들은 관 련 동물의 잇점을 이용하여 생산될 수 있다. 항체 제조 목적을 위해, 선택된 동물의 예로는 염소, 양, 쥐, 새앙쥐, 토끼, 기니픽, 돼지 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 표지를 위한 검색가능한 표지는 단독으로 이용할 수도 있고 또는, 샘플 중 목적하는 물질의 존재를 가시화시키기 위해 검색가능한 신호를 제공하는 다른 조성물이나 화합물과 조합하여 이용될 수 있다. 상기 검색가능한 표지는 검색 기술 분야에서 잘 알려지고 쉽게 구할 수 있는 물질들일 수 있으며 그 예로 효소 마커, 형광 마커, 방사능 마커 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 특정 표지의 특정 선택예로 한정되지 않으며, 기술분야에 알려진 모든 검색 방법을 포함하는 것으로 한다. 편의상, 상기 검색제는 키트 형태로 제공될 수 있다.

상기 키트는 임의로 본 발명의 폴리펩티드로 예비-코팅된 마이크로타이터 플레이트, 여러가지 적당하게 조성된 희석제 및/또는 완충액, 표지된 물질 또는 효소 기질, 코-팩터 및 크로모포어와 같이 특이적으로 결합된 항원/항체 복합체의 검색을 위한 다른 시그날-생성제기타 시그날-생성제를 포함할 수 있다. 이들 중의 다른 성분들은 당업자라면 쉽게 선택할 수 있다.

또한, 생물학적 샘플 중 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG를 검색하기 위한 방법도 제공되며, 이 방법은: 본 발명의 폴리펩티드들 중 적어도 하나를 지지체 표면에 고정시킨 다음; 적절한 완충액으로 세정하고; 이것을 항원항체반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 검색하고자 하는 샘플과 접촉시킨 다음; 적절한 완충액으로 다시 세정한 후; 시판되거나 상법으로 제조되는, 검색가능하게 표지된 항-IgG 항체와 함께 항원/항체 반응이 일어나는데 충분한 시간동안 인큐베이션시키고 (여기서 상기 항-IgG는 검색될 생물학적 샘플이 유래하는 동물에 대한 것임); 그 후, 상기 검색가능한 표지에 대응하는 검색제를 이용함ㅇ로써 지지체 표면 상의 항원/항체 복합체를 검색하여 샘플 중의 항체 IgG의 양을 산출하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 상기 검색될 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래하며, 사용된 상기 항체는 항-인간 IgG이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는 폴리펩티드 NE2I가 소정의 지지체 표면에 항원으로서 예비-코팅된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, HEV ORF3의 에피토프와 커플링된 폴리펩티드 247가 항원으로서 지지체의 특정 표면에 예비코팅된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플에서 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM을 검색하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은: 시판되거나 상법에 따라 생산되는 항체 항-IgM을 지지체 표면에 고정시키고 (여기서 상기 항-IgM은 검색될 생물학적 샘플이 유래된 동물에 대한 것임); 적당히 세정한 다음; 이것을 항원항체 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 검색하고자 하는 샘플, 바람직하게는 혈청과 접촉시킨 후; 적당한 완충액으로 다시 세정하고; 항원항체 반응이 일어나는데 충분한 시간동안 검색가능하게 표지된 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나와 함께 인큐베이션시킨 후, 상기 검색가능한 표지에 대응하는 검색제를 이용하여 지지체 표면상의 항원/항체 복합체를 검출하여 샘플 중의 항 IgM의 양을 산출하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 검출하고자 하는 상기 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래되며, 상기 사용된 항체는 항-인간 IgM이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 샘플 중의 상기 IgM 항체는 포스래디쉬 퍼옥시다제와 커플링된 폴리펩티드 225N에 의해 검색된 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, HEV IRF3의 에피토프와 커플링된 폴리펩티드 247은 샘플에 함유된 IgM을 검색하기 위해 호스래디쉬 퍼옥시다제와 추가로 커플링된다.

또한, 생물학적 샘플 중 E형 간염 바이러스에 대한 총 항체 검색방법도 제공되며, 이 방법은: 지지체의 표면에 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나를 고정시키고; 적절한 완충액으로 세정한 다음; 이것을 항원항체 반응이 일어나느데 적합한 조건 하에서 검색될 생물학적 샘플과 접촉시킨 다음; 임의로 적절한 완충액으로 다시 세정하고; 항원항체사이에 반응이 일어나는데 충분한 시간동안 검색가능하게 표지시킨 본 발명의 폴리펩티드 적어도 하나와 함께 인큐베이션 시킨 후; 검색가능한 표지로 표지시킨 E형 간염 바이러스의 항원과 그에 상응하는 검색제를 이용함으로써 지지체 표면상에 항원/항체 복합체를 검색하여, 샘플 중 총 항체의 양을 산출하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 한가지 구체예에서, NE2I를 지지체 표면에 예비-코팅시키고 샘플 중 총 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제와 미리 커플링된 폴리펩티드 225에 의해 검출해낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, HEV ORF3으로부터의 에피토프와 커플링된 NE2I를 지지체 표면에 예비-코팅시켜서, 샘플 중 총 항체를 HEV ORF3으로부터의 에피토프와 미리 커플링된 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합된 폴리펩티드 225에 의해 검 색해낸다.

다음에 도면과 실시예를 참조로 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이다. 본 발명의 보호범위가 이들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다.

도 1은 폴리펩티드 201의 발현을 위한 플라스미드 pTO-T7-ORF2-201 제작을 위한 개략적인 다이아그램이다.

도 2는 발현 벡터 pTO-T7-ORF2-201에 의한 형질전환에 의해 유도된 E. coli의 배양 용해액 (lysates)과 관련하여 12% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴미드 젤 (SDS-PAGE)을 이용한 분석 결과를 나타낸 것이다 (배양 배지를 원심분리하여, 침전된 세포들을 수집한 다음, 0.1% SDS를 함유하는 로딩 완충액에 펠릿을 재현탁시킨 후 끓는 물로 10분간 처리한 다음 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취해서 측정하는 단계로 이루어짐). 레인 1과 레인 2는 각각 2가지 서로 다른 세균 배양 용해액을 함유한다. 발현된 생성물들은 Uvi젤 영상화 시스템 (UVItec, ltd., 모델 DBT-08)에 의해 분석한 결과 35% 총 단백질 부근에서 테이크업하였다.

도 3은 폴리펩티드 201의 4가지 뱃치로부터 얻어진 정제된 폴리펩티드 201 인클루젼 바디의 2M 및 4M 요소(urea) 용액에 대한 쿠마씨 블루 R250-염색된 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 (SDS-PAGE) 분석 결과를 나타낸 것으로서, 여기서 상기 샘플들은 발현 벡터 pTO-T7-ORF2-201에 의한 형질전환된 재조합 E.coli로부터 얻어진 것들이다. 상기 분석 결과는 폴리펩티드 201 중 몇몇은 복원 (renaturation)되어 다이머 폴리펩티드를 형성하였음을 보여주는데, 상기 다이머 폴리펩티드의 비율은 10% 내지 60%이다. 복원 비율은 1 X PBS (20 X PBS (1L): Na₂HPO₄-12H₂O, 73.344g; KH₂PO₄ 4g; NaCl, 163.632g; KCl, 4.024g, pH 7.45)에서 복원된 샘플의 비율보다 더 낮다. 도 4에 도시된 바와 같이, 다이머 백분율이 99%이다.

도 4는 HEV-감염 환자로부터 얻어진 샘플에 대한 폴리펩티드 201의 웨스턴 블로팅 분석 결과를 도시한 것이다. 레인 1-3은 SDS PAGE 대조군이고, 여기서 레인 1은 단백질 분자량 마커; 레인 2는 1 X PBS에서의 폴리펩티드 201의 복원 샘플; 레인 3은 끓는 수조에서 10분간 처리된 복원 폴리펩티드 201; 레인 4와 레인 5는 각각 레인 2와 레인 3에 대응하는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.

도 5는 상기 폴리펩티드 201의 다이내믹 광산란 기기에 의한 수화된 다이내믹 반지름으로부터의 결과를 나타낸 것으로, 여기서 폴리펩티드 201은 젤 여과 HPLC에 의해 미리 정제되어, 20000g에서 10분간 원심분리 된 후, 0.1um 여과막으로 여과된 것이다.

도 6은 Mab 1F6, 2C9 및 3F5와 폴리펩티드 208N, 209N 및 225N와의 웨스턴 블로 반응 결과를 도시한 것이다. 레인 1, 2, 3은 각각 폴리펩티드 208N을 끓는 수조에서 10분간 처리하여 복원시킨 샘플, 복원된 샘플 및 침전된 복원 샘플에 대응한다; 레인 4, 5, 6은 각각 폴리펩티드 209N을 끓는 수조에서 10분간 처리하여 복원시킨 샘플, 복원된 샘플 및 침전된 복원 샘플에 대응한다; 레인 7, 8, 9는 각각 폴리펩티드 225N을 끓는 수조에서 10분간 처리하여 복원시킨 샘플, 복원된 샘플 및 침전된 복원 샘플에 대응한다; 레인 10은 대조군으로서 모노머 폴리펩티드 201이다.

도 7은 마우스들을 폴리펩티드 201 백신 (프로인트 어쥬번트 함유)을 투여량을 달리하여 면역시킨 후 마우스 혈청에서 일어난 HEV 항체 프로필을 도시한 것이다. 좌표의 수평축은 최초 면역 후 경과된 일수를 가리킨다. 수직축은 ELISA에 의해 측정된 OD_450nm/620nm이다.

도 8은 마우스들을 폴리펩티드 201 백신 (어쥬번트를 함유하지 않음)을 투여량을 달리하여 면역시킨 후 마우스 혈청에서 일어난 HEV 항체 프로필을 도시한 것이다. 좌표의 수평축은 최초 면역 후 경과된 일수를 가리킨다. 수직축은 ELISA에 의해 측정된 OD_450nm/620nm이다.

도 9는 마우스들을 폴리펩티드 201 백신 (프로인트 어쥬번트 함유)을 투여량을 달리하여 면역시킨 후 마우스 혈청에서 일어난 HEV 항체 프로필을 도시한 것이다. 좌표의 수평축은 최초 면역 후 경과된 일수를 가리킨다. 수직축은 ELISA에 의해 측정된 OD_450nm/620nm이다.

도 10A, 10B, 10C 및 10D는 각각 그룹 No.1, No.2, No.3, 및 No.13의 레서스 원숭이의 혈청에서 얻은 HEV 항체의 프로필을 나타낸 것이다. 대상동물 모두를 정맥 주사에 의해 HEV로 챌린지시킨다. 수평축은 최초 면역 후 경과된 일수를 나타낸다. 수직축은 ELISA에 의해 측정된 OD_450nm/620nm이다. 결과는 그룹 No.1, No.2, 및 No.3 원숭이의 혈청에서 항-NE2I-IgG가 GENELAPS-IgG 및 WANTAI 항-HEV-IgG보다 5~10일 먼저 나타남을 보여준다; 항-NE2I-IgG는 No.13 원숭이 혈청에서 검출되었으나, GENELAPS-IgG 및 WANTAI 항-HEV-IgG는 No.13 원숭이의 혈청에서 검출되지 않았다.

달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 분자 생물학과 면역분석법은 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Joseph Sambrook, David W.Russell, by Cold Spring Harbor Laboratory Press and Short Protocols in Molecular Biology,3rd Edition, John Wiley & Sons,Inc.,1995에 설명된 방법에 따른 것이다. 제한효소 엔도뉴클리아제의 사용은 프로듀서에 의해 제공된 프로토콜에 따른다.

실시예 1 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 제조 및 이를 함유하는 발현 벡터의 제작

주형(template)으로서 HEV ORF2 분획의 제조

목적하는 유전자를 제조하기 위해, 주형으로서 (Aye,T.T., Uchida etc., Nucleic Acids Research, 20(13),3512(1992); GeneBank accession number D11092) 중국 신장 (Xin Jiang) 지방의 HEV-감염 환자로부터 클로닝된 완전한 길이의 HEV 유전자를 2개의 프라이머, 즉, 상류 프라이머로서 ORF2 FP:5'-atgcgccctcggcca-3' 및 하류 프라이머로서 ORF2 RP: 5'-aaataaactataactcccga-3'와 함께 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 실시하였다. 다음 조건하에, 열 사이클러 (BIOMETRA t3) 중에서 PCR 반응을 수행하였다: 94℃ 5분; 이어서 94℃에서 50초, 57℃에서 50초 및 72℃에서 2.5분을 25회; 72℃에서 10분간. HEV ORF2로부터 약 2 kb의 DNA 단편이 얻어지며 이를 본 발명의 폴리펩티드 제조시 주형으로서 사용한다. 상기 PCR 산물을 시판하는 벡터인 pMD18-T (TAKARA CO.) 내로 링크시킨 다음 BamH I/Hind III으로 절단하여 ORF2 유전자가 삽입된 양성 클론을 동정한다. M13(+)/(-)을 프라이머로서 사용하여, 얻어진 생성물의 서열을 결정함으로써 본 발명의 폴리펩티드 제조를 위한 주형으로서 사용되는 HEV ORF2의 2개의 DNA 단편을 동정하는데, 이들 중 하나는 보존 서열 (주형 1, 서열번호 5)이고 다른 하나는 돌연변이 서열 (주형 2, 서열번호 6)이다.

서열 정렬 및 ORF 분석에 의해, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 주형으로서 HEV ORF2 (서열번호 6)의 돌연변이 서열이 보존 서열 (서열번호 5)과 비교할 때 염기 A가 결실되고, 이로 인해 ORF2의 아미노산 잔기 604-605가 His-Ser-Val에서 Pro-Pro-Arg로 쉬프트 돌연변이 (shift mutation)되어, 그에 따라 상기 폴리펩티드의 변역이 이러한 돌연변이에 의해 형성된 종결 코돈 택에 의해 중단되는 것으로 밝혀졌다.

이하에서는, 폴리펩티드 201을 코딩하는 뉴클레오타이드 및 그를 함유하는 발현벡터의 제조를 설명하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드 201을 예로 들어 설명한다.

본 발명의 폴리펩티드 201을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그를 함유하는 발현벡터의 제조

주형으로서 상기한 바와 같이 얻어진 서열 서열번호 5를, 상류 프라이머인 201FP:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3' (표 1 참조)과 함께 사용하고 (여기에는 BamHI 사이트, NdeI 사이트 (CAT ATG) 및 E.coli 시스템의 번역 개시 코돈으로서 ATG가 도입됨) ; 보존 프라이머로서 201RP: 5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' (표 1 참조)를 사용하여 (여기에는 종결 코돈과 EcoR I 사이트가 도입됨) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 상기 유전자를 합성한다. 열 사이클러 중에서 다음과 같이 PCR 반응을 수행한다: 94℃에서 5분간 열-변성; 이어서 94℃에서 50초, 57℃에서 40초 및 72℃에서 40초, 마지막으로 72℃에서10분간 30회 증폭시킴. 얻어진 ~ 600 bp의 PCR 산물은 본 발명의 폴리펩티드 201을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 것으로 동정되었다.

본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 벡터인 pTO-T7의 제작은 참조문헌인 LUO Wen-Xin 등의 Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57에 기재된 방법에 따라 수행한다. 상기 방법은: 상기 PCR 산물을 시판하는 pMD18-T 벡터 (TAKARA사) 내로 클로닝시키고, BamHI/HindIII로 절단하여 폴리펩티드 201을 코딩하는 뉴클레오티드가 삽입된 양성 서브클론을 동정 및 수득하고; 상기 양성 클론을 NdeI 및 EcoRI으로 추가 절단하여 폴리펩티드 201의 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 얻은 다음 NdeI/EcoRI-절단된 pTO-T7 내로 클로닝하는 단계를 포함한다. 폴리펩티드 201의 서열을 코딩하는 양성 클론 pTO-T7-ORF2-201은 NdeI/EcoRI 절단에 의해 동정된다. 폴리펩티드 201의 서열을 코딩하는 양성 클론 pTO-T7-ORF2-201은 NdeI/EcoRI으로 절단함으로써 동정한다. ORF201의 폴리펩티드의 발현 벡터의 제작 전략을 도 1에 도시하였다.

마찬가지로, 카르복실 말단이 Pro-Pro-Arg가 아닌 본 발명의 다른 폴리펩티드들도 주형으로서 서열번호 6의 서열을 사용하고 목적하는 개개 폴리펩티드에 대해 특이적으로 고안된 표에 수록된 프라이머를 이용함으로써 상기 방법에 따라 얻을 수 있다.

카르복실 말단이 Pro-Pro-Arg인 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 및 이를 함유하는 발현 벡터

ORF2-201의 발현벡터의 상기 제조방법에 따라 얻어진 발현 벡터를 이용하여 E.coli ERR 2566을 형질전환시킴으로써 카르복실 말단이 Pro-Pro-Arg인 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킨다. 특히, 주형으로서 상기 HEV ORF2 돌연변이 서열 서열번호 6을 주형으로서 사용하고, 본 발명의 개개의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 고안된 정방향/역방향 프라이머 (표 1 참조)를 사용함으로써 폴리펩티드 201의 발현 벡터를 생산하는 것과 유사한 조건 하에 PCR에 의해 대응하는 발현 벡터를 얻는다. 이러한 방식으로, 면역원성과 면역반응성이 우수한 본 발명의 일련의 폴리펩티드들을 얻으며, 여기서 결과적인 폴리펩티드는 그의 N-말단에 Met가 부가되어 있고 그의 카르복실 말단에서는 아미노산 603, Pro의 3' 말단에 5'-3' 방향으로 아미노산 서열 -Pro-Pro-Arg가 부가되어 있다.

[표 1]

*ppr은 C-말단 상의 아미노산 603, Pro의 3' 말단에 5'-3' 방향으로 아미노산 서열 -Pro-Pro-Arg을 갖는 폴리펩티드를 가리킨다.

실시예 2: 폴리펩티드 201의 발현

형질전환을 위해 E. coli ERR2566의 40uL 컴피턴트 세포 (염화칼슘법으로 생산)내로 플라스미드 pTO-T7-ORF2-201 (0.15 mg/mL) 1uL를 첨가하였다. 이어서 이 혼합물을 카나마이신-LB 플레이트 상에 스크롤링시키고 이 플레이트를 개개의 클론이 나타날 때까지 37℃에서 10~12시간 동안 인큐베이션시켰다. 개개의 클론을 취하여 4mL LB 배지가 담긴 시험관에 추가 접종하여, 배지의 OD_{550 nm}값이 약 1.5가 될 때까지 37℃ 에서 10분간 220 rpm에서 진탕시켰다. 이어서, 나중의 사용을 위해 1mL 배양 배지를 4℃에서 보관하고, 나머지 3 mL의 배양 배지 (최종 함량 0.3mM)내로 2uL 0.5M IPTG를 첨가하였다. IPTG를 함유하는 이 배양 배지를 37℃에서 4시간 동안 220 rpm에서 진탕시키면서 인큐베이션시켜 목적하는 폴리펩티드 발현을 유도하였다. 1.5 mL의 유도된 배양 배지를 12000g에서 30초간 원심분리시켰다. 침전된 세 포들을 100uL 단백질 로딩 완충액 (50mM Tris Cl pH6.8, 100mM DTT, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10%글리세롤) 중에 재현탁시킨 다음 10분간 더 끓인 후, 12000 g에서 10분간 원심분리하였다. 10 uL 상등액을 12% SDS-PAGE 상에 로딩시켜 폴리펩티드 201의 발현에 대해 분석하였다. 고수율로 발현된 클론을 이후의 발효에 사용하였다.

500 mL LG 배지를 함유하는 1L들이 어얼렌마이어 플라스크에 200uL 종배양 배지를 첨가하였다. 배양체의 OD_550nm 값이 2.0에 달할 때까지 37℃에서 190 rpm으로 약 11시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시킨 후, 300 uL 0.5M IPTG를 최종농도 0.3 mM이 되도록 첨가하였다. 상기 조건 하에서 이 혼합물을 4시간 더 인큐베이션시켰다. 1.5mL의 유도된 배양체를 12000g에서 30초간 원심분리하였다. 세포들을 100 uL 단백질 로딩 완충액에 재현탁시킨 다음 10분간 끓인 후 12000g에서 10분간 원심분리하였다. 폴리펩티드 201의 발현여부를 분석하기 위해 10 uL 상등액을 12% SDS-PAGE 상에 로딩시켰다. SDS-PAGE 분석 결과 (쿠마씨 브릴리언트 블루 R250으로 염색함) UVI 젤 영상화 기기 (UVItech, 모델 DBT-08)가 보여주는 바에 따르면 폴리펩티드 201의 발현은 발현된 총 세포 단백질의 약 35%인 것으로 나타났다.

실시예 3: E. coli에서 발현된 폴리펩티드 201 봉입체의 정제

실시예 2에서 얻어진 재조합 폴리펩티드 201을 함유하는 E. coli 배양 배지를 4000 rpm에서 15분간 원심분리한 다음 500 mL 배양체 침전물 각각을 15 mL 용해 완충액 (lysis buffer: dH₂O 중 50mM Tris Cl, 10mM EDTA 및 300mM NaCl, pH 7.2)에 재현탁시켰다. 세포들을 초음파 기기에서 초음파 처리하였다 (Uilbra-Cell VCX500, SONICS&MATERIALS사, 전력 70%; 40초 온; 60초 오프; 총 20분간 초음파처리함). 이렇게 초음파처리된 혼합물을 4℃에서 10분간 12000 rpm에서 원심분리하여 펠릿을 2% Triton-X100을 함유하는 완충액 I 용액 (200mM Tris Cl, pH. 8.5; 5mM EDTA; 100mM NaCl)에 재현탁시켰으며, 최종 부피는 본래 용해용액의 부피와 같았다. 이 혼합물을 37℃에서 30분간 200 rpm에서 진탕시킨 다음 4℃, 10000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 펠릿을 동 부피의 완충액 I에 재현탁시키고 혼합물을 초음파처리하였다 (40초 온; 60초 오프; 전력 70%, 총 3분간 초음파 처리함). 그 후 이 혼합물을 4℃에서 10분간 원심분리하였다 (10000 rpm). 최종 부피가 이전과 동일하도록 2% Triton-X100을 함유하는 완충액 I에 펠릿을 재현탁시켰다. 37℃에서 30분간 혼합물을 진탕 (200 rpm)시킨 다음 이것을 4℃에서 10분간 원심분리하였다 (10000 rpm). 펠릿을 동 부피의 완충액 I에 재현탁시키고, 37℃에서 30분간 진탕 (200rpm)시켰다. 이어서 이 혼합물을 4℃에서 10분간 10000 rpm으로 원심분리하였다. 이 펠릿을, 원래의 혼합물과 동일한 최종 부피를 갖도록 2M 우레아를 함유하는 완충액 I중에 재현탁시켰다. 37℃에서 30분간 200 rpm에서 진탕시킨 후, 혼합물을 4℃에서 10분간 10000 rpm으로 원심분리시켰다. 이 상등액을 201-2M이라 표시한다. 이 펠릿을, 원래의 혼합물과 동일한 최종 부피를 갖도록 4M 우레아를 함유하는 완충액 I중에 재현탁시켰다. 37℃에서 1시간 동안 진탕시킨 후 (200 rpm), 혼합물을 4℃에서 하룻밤 보관한 다음 4℃에서 10분간 12000 rpm으로 원심분리시켰다. 이 상등액을 201-4M으로 표시한다. 상기 모든 샘플의 순도를 12% SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 4: 재조합 폴리펩티드 201의 복원

실시예 3에 따라 제조된 샘플 201-4M 100mL를 2개의 투석 주머니 (36 DM, retentate MW: 8000~10000, United Carbon Compound, U.S.A.)에 로딩시키고 이를 25℃에서 밤새 (10시간) 900mL의 1 x PBS (Na₂HOPO₄-12H₂O 73.344g, KH₂PO₄ 4g, NaCl 163.632g, KCl 4.024g를 함유하며 pH 7.45인 20XPBS (1L)) 를 함유하는 1L 비이커에서 교반하면서 투석시키자 투석 주머니에서 흰색 침전물이 관찰되었다. 이 투석물 (dialysate)을 리프레쉬시키고 계속 투석한 다음 투석물을 3시간마다 4회 리프레쉬시켰다. 이론상, 샘플 중 요소의 농도는 투석이 끝나면 4 x 10-6M이 될 것이다. 투석된 샘플을 25℃에서 10분간 12000 rpm으로 원심분리시킨 다음; 상등액을 추가 정제를 위해 0.22μm 필터막을 이용하여 여과하였다; 4M 요소/완충액 I에서 재현탁된 펠릿을 새로운 투석에 사용할 수 있으며 이동안 침전물이 역시 나타나나, 얻어잰 단백질 샘플의 농도는 최초에 얻어진 샘플의 그것보다는 낮을 것이다.

실시예 5: 젤 여과 HPLC를 이용한 재조합 폴리펩티드 201의 정제

실시예 4의 방법에 따라 제조된 복원된 201 샘플을 다음 조건 하에서 HPLC에 의해 추가 정제하였다:

기기: Beckman System Gold Nouveau 125NMP/166NMP HPLC,

컬럼: TSK GEL SW3000 21.5mm x 60cm,

용출: 1 X PBS pH 7.45

유속: 4ml/분,

검출: 280nm에서 UV

샘플: 4M NE2 2mL (8mg/mL)

수집: 윈도우 모드의 자동 에이팩스 (apex) 수집,

수집 시간: 1 튜브/20초,

수집 지연: 6초.

결과는 분자 여과는 크로마토그램에서 매유 효과적이지만, 에이팩스 성분이 모노머와 다이머 사이에 잘 분포하는 단백질 뿐만 아니라 모노머와 다이머도 함유함을 보여주고 있다. 샘플을 끓는 물에서 10분간 처리한 후, 샘플 단백질을 목적하는 단백질 피크의 모노머 순도 (95% 이상에 달함)를 위해 12% 아크릴아미드를 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 그 결과 자기-응집 (self-aggregated)에 더해, ORF-201 모노머는 다른 작은 단백질과도 응집할 뿐만 아니라 크로마토그램시 함께 용출되었던 다른 다량체 (multimer) 중에서도 상호반응이 일어난 것으로 밝혀졌다.

실시예 6 본 발명의 재조합 폴리펩티드 산물의 특징화

본 발명의 재조합 폴리펩티드를 실시예 1-5의 방법에 따라 이제가지 제작 및 발현시켰다. 또한, 실시예 3-4의 방법에 따라 각각의 재조합 펩티드를 세정 및 투석하였다. 표 2에 E형 간염 바이러스의 각각의 재조합 펩티드의 상응하는 아미노산 위치, 발현된 재조합 산물의 복원 특성 및 그들의 SDS-PAGE에서의 모노머 및 다이머의 비율, 그리고 다량체 형성 여부에 대해 수록하였다.

[표 2]

표 2에 나타난 바와 같이, HEV ORF2의 서열번호 2의 아미노산 서열에 포함된 본 발명의 폴리펩티드는 복원성이 우수하며, 이는, 서열번호 1의 aa 601 (Leu)와 aa 660 사이에 카르복실 말단이 위치할 경우, 이들이 본래의 HEV 단백질에 근접한 크기의 구조를 나타내도록 의도된 것이다. 특히, 펩티드 247, 232, 222, 201, 235N, 225N, 209N, NE2I, 217D, 205, 189, 188, NE2 (서열번호 2) 및 193C (서열번호 3)은 모노머 분자량과 모노머 분자량 2배에 대응하는 위치에 발현 결합을 갖는 것으로 나타난 한편 다이머의 양은 모노머들의 그것보다 큰 것으로 나타났다. NE2와 193C는 더 큰 분자량 위치에서 명백한 결합을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 상기 펩티드가 자발적으로 다량화 (multimerize)함을 시사하는 것이다.

표 2의 복원가능한 재조합 펩티드 193C, 201, 208N, 209N, NE2, 222, 25N, 232 및 247을 젤 여과 HPLC에 의해 정제하고 이를 각각 20000g에서 10분간 원심분리한 다음 0.1μm Al₂O₃ 여과막으로 여과한 후에, 이들 펩티드의 다이나믹 반경 (dynamic radius)을 다이나믹 광산란 기기 (DYNAPRO99-D-50 다이나믹 광산란 기기, PROTEIN SOLUTIONS사 제작)에 의해 측정하고 이들의 어셈블 상태를 표 3에 나타내었다. 각각의 재조합 펩티드의 얻어진 분자 반경은 모노머의 예상된 반경보다 분명히 더 컸다. 분자량 추정에 따르면, 이들 펩티드들은 용액 중에서 적어도 다이머를 형성하고, 대부분은 그보다 더 높은 중합도의 다량체를 형성하는 것으로 결론지어졌는데, 이는 SDS-PAGE에서의 이들의 양상과도 일치하는 것이다. 실제로, 상기 방법에 따라 제조된 본 발명의 폴리펩티드는 180개 혹은 그 이상의 모노머로 된 다량체 (multimer)를 형성할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 예기치 못한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 즉, E. coli 계에서 발현된 상기 재조합 펩티드들은 변성시약이 들어있지 않은 PBS 용액에서 자발적으로 다량화하며 이는, 백신으로서의 그의 면역원성 증강에 유리한 것이다.

[표 3]

실시예 7: 폴리펩티드의 이화학적 특성

봉입체(inclusion body)로부터의 재생

실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 제조된 재조합 폴리펩티드의 봉입체를 4M 요소로 변성시킨 후, 실시예 4에 기재한 바와 같이, 100 부피 이상의 PBS로 투석시켰다. 투석물(dialysate)를 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액은 재조합 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함하였고, 이는 상기 재조합 폴리펩티드가 재생 가능함을 보여주는 것이다.

재조합 펩티드의 중합

통상적인 SDS-PAGE를 사용하는 상청액의의 분석에 있어서, 모노머, 다이머 및 폴리머에 상대적으로 대응하는 밴드들을 확인하였다. 통상적인 웨스턴 블라팅에 의하여 상기 밴드들의 특이성을 추가적으로 확인함으로써, 재조합 폴리펩티드 201이 재생 후에 폴리머를 형성한다는 것을 증명하였다(도 4 참조).

광-산란 기술을 이용한 폴리펩티드 201의 분자 크기 측정

실시예 6에 따라서, 폴리펩티드 201을 HPLC로 정제한 후 20,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고 나서, 0.1 ㎛ 밀리포어(Millipore) 알루미나 멤브레인을 사용하여 여과시켰다. 824.0 nm에서 동적 광-산란기(dynamic light-scattering instrument; DYNAPOR99-D-50, PROTEIN SOLUTION Com. Ltd. U.S.A)를 사용하여 상기 여과물을 측정하였다. 통제 알고리즘(Regulation algorithm)을 사용하여 추산하였고, 많은 표준 샘플들에 의하여 그것의 적용 가능성을 확인하였다. % 강도 최대값에 상응하는 동적 반지름으로부터 분자 반지름을 계산하였다. 샘플 버퍼 PBS를 용매로 사용하였다. 측정된 결과를 도 5에 나타내었으며, 이는 변성체를 포함하지 않는 용액 내 폴리펩티드 201의 추산 MW 값이 62.7 KD (트라이머의 경우)임과 함께 평균 반지름이 3.08 nm임을 보여준다. 상기 본 발명의 폴리펩티드가 180 개 이상의 모노머의 폴리머를 실질적으로 형성할 수 있다는 것은 이 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 사실이다.

실시예 8: 마우스 항-NE2 모노클로날 항체의 제조

하이브리도마 세포주의 수립

일차 면역화를 위하여, 각각의 암컷 Balb/C 마우스 (생후 6~8주)에 플로인트 불완전 아쥬반트 (총 부피 50 ㎕)에 에멀젼화된 5 ㎍의 재조합 항원 NE2를 접종하였다. 15일 후, 불완전 플로인트 아쥬반트에 에멀젼화된 동량의 NE2를 사용하여 마 우스를 근육내 2차 면역화하였다. 30일 경과 후, 아쥬반트 없이 5 ㎍의 항원을 사용하여 마우스를 정맥내(꼬리 정맥을 통하여) 추가 면역화하였다. 추가 면역화 후 72 ~ 96 시간 후에 마우스를 희생시켰다. 그리고 나서, 혈액을 모으고 비장을 잘라내어 비세포(splenocyte) 현탁액(RPMI 1640 배지에 현탁시킴)을 제조하였다. 비세포 수를 셀 카운터로 측정하였다. 그리고 나서, 비세포를 SP2/0 마우스 골수종 세포와 6:1의 비율로 혼합하고 원심분리하였다. 세포들을 PEG(PEG 500)으로 융합시키고 나서, 동일한 부피의 지지세포(feeder cells)와 혼합하고, 96-웰 플레이트로 옮겼다(200㎕/웰). 5 % CO₂ 대기중에서, 96-웰 플레이트를 인큐베이터(ESPEC BNA-31)에서 37 ℃로 배양하였다. 3일 후, 배양액의 절반을 신선한 HT 배지 (하이포크산틴(hypoxanthn) 1.361 mg + 티미딘 0.388 mg, RPMI 1640 배지 (GIBCO Int.)를 첨가하여 100 mL로 만듬, 약 45 ~ 50 ℃에서 용해되고 살균을 위하여 여과됨)로 대체시켰다. 7일 후, 96-웰 플레이트를 NE2로 코팅시키고, 하이브리도마 세포 배양물에 대하여 하기하는 바와 같이 ELISA 분석(assay)을 수행하였다. ELISA 분석에 양성인 세포를 한계 희석법에 의하여 클로닝하였다.

ELISA 분석

NE2 100 ㎕를 실시예 5에서 설명된 HPLC에 의하여 37 ℃에서 정제한 후, 0.05 mol/L CB (Na₂CO₃ 20.02 g + NaHCO₃ 2.52 g, ddH₂O를 첨가하여 1L로 만듬, pH 9.5)에 녹여서, 최종 농도가 0.3 ㎍/mL가 되도록 하였다. 96-웰 폴리비닐 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 상기의 얻어진 용액으로 37 ℃에서 2 시간 동안 처 리한 후, 4 ℃에서 하룻밤동안 처리하였다. 마이크로타이터 플레이트를 PBST (NaCl 8.0 g + KH₂PO₄ 0.2 g + Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9 g + KCl 0.2 g + Tween-20 0.5 mL, ddH₂O를 첨가하여 1L로 만듬, pH 7.4)로 세척하여 흡수되지 않은 항원을 제거하였다. 그리고 나서, 블로킹 용액 (2% 글루틴, 0.2% 카제인 및 2% 수크로오스를 함유하는 1XPBS) 200 μL를 각각의 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 상기 용액을 따라내고, 웰을 건조시키고 4 ℃의 진공상태에서 보관하였다.

분석을 위하여, 세포 배양물 100 μL를 각각의 웰에 첨가하고, 각각의 플레이트마다 하나의 양성 대조군 (1:100 희석 폴리클로날 항-NE2 혈청 100 μL 첨가) 및 하나의 음성 대조군 (HT 배지 100 μL 첨가)를 놓아두었다. 37 ℃에서 30 분 동안 배양한 후, 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고 나서 건조시켰다. HRP-GAM Ig (DAKO company)를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 더 배양하였다. 플레이트를 PBS-Tween-20으로 다시 5 회 세척하고 건조시켰다. 기질 용액 A(Na₂HPO₄ 13.42 g + 시트르산 ·H₂O 4.2 g + H₂O₂ 0.3 g, ddH₂O를 첨가하여 700 mL를 만듬) 50 μL 및 기질 용액 B (TMD 0.2 g + 디케틸포름아미드 20 mL, ddH₂O를 첨가하여 700 mL를 만듬) 50 μL를 플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 10 분 동안 배양하였다. 스톱 용액(stop solution) 50 μL을 사용하여 반응을 종결시켰다. 각 웰의 OD₄₅₀ 값을 ELISA 리더를 사용하여 측정하였다. 일반적으로, OD₄₅₀ 값이 음성 대조군의 적어도 두 배 이상인 경우를 양성이라고 간주할 수 있다.

복수(ascites)의 제조 및 모노클로날 항체의 정제

각각의 10 주령 Balb/C 마우스에 0.5 mL의 불완전 프로인트 아쥬반트를 복강내 접종하였다. 2 ~ 7일 후, 하이브리도마 세포를 수집하고 원심분리하였다. 그리고 나서, 상청액을 버리고, 무혈청 배지를 세포에 첨가하여 최종 농도가 2 ×10⁵ ~ 2 ×10⁶ 세포/mL이 되도록 하였다. 얻어진 세포 현탁액 0.5 mL을 사용하여 각각의 마우스에 접종하였다. 7 ~ 10일 후, 마우스의 복부가 팽윤되었을 때, 복수를 채취하고 나서, 3,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 튜브 중간부분의 투명한 액체를 정량하여 취하고 살균을 위하여 0.45 μm 밀리포어 멤브레인으로 여과시켰다. 여과물을 -20 ℃에서 보관하였다.

상기 처리된 복수를 동일 부피의 PBS (0.2 mol/L Na₂HPO₄ 81 mL + 0.2 mol/L NaH₂PO₄ 19 mL, 일반 생리식염수를 첨가하여 100 mL로 만듬)로 희석하였다. 그리고 나서, (NH₄)₂SO₄를 50 % 포화시까지 서서히 교반하면서 적가(dropwise)하고, 4 ℃에서 하룻밤동안 두었다. 상기 용액을 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하고(12,000 rpm), 상청액을 버렸다. 펠렛을 PBS (사용된 복수의 2 부피)에 용해시켰다. (NH₄)₂SO₄를 33 % 포화시까지 교반하면서 상기 얻어진 용액에 다시 적가하고, 4 ℃에서 하룻밤동안 두었다. 용액을 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리하고(12,000 rpm), 상청액을 버렸다. 펠렛을 PBS (사용된 복수의 2 부피)에 용해시켰다. (NH₄)₂SO₄를 50 % 포화시까지 서서히 교반하면서 적가하고, 4 ℃에서 하룻밤동안 두었다. 용액을 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리하고(12,000 rpm), 상청액을 버렸다. 그리고 나서, 펠렛을 투석백 내에서 적정양의 PBS에 용해시키고, 저어주면서 4 ℃에서 약 12 시간 동안 50 ~ 100 부피의 120 mmol/L Tris-HCl 버퍼(10 mmol/L NaCl 함유, pH 7.8)에서 투석하였다. 버퍼를 3 번 이상 교체해주었다. 투석물을 -20 ℃에서 보관하였다.

상기한 방법에 있어서, Balb/C 마우스를 본 발명의 폴리펩티드 NE2로 면역화시킴으로써 모노클로날 항체를 제조하였고, 8 개의 항-NE2 모노클로날 항체를 동정하였다 (1F6, 2C9, 3F5, 8C11, 8H3, 13D8, 15B2 및 16D7). 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)를 8 개의 항체로 각각 코팅하고, 포획(capture) RT-PCR (실시예 9 참조)에 의하여 상기 항체가 천연 HEV에 결합하는 능력을 테스트하였다. 그 결과, 8C11, 8H3 및 12D8은 HEV 결합의 상당한 활성을 나타냈으며, 이는 이들의 인지 부위가 바이러스 코팅 표면의 천연 에피토프임을 의미하는 것이다. 상기한 3 항체를 실시예 10에서 사용하였다.

실시예 9: 항체-포획(antibody-capturing) RT-PCR에 의한 mAb의 HEV에의 결합 능력 테스트

에펜도르프 1.5 mL에 자외선을 30 분 동안 조사한 후, CB (Na₂CO₃ 20.02 g + NaHCO₃ 2.52 g, ddH₂O를 첨가하여 1L로 만듬, pH 9.5)에 1:1000 희석된 mAb 500 μL를 첨가하였다. 37 ℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 버퍼를 따라내고, 블로킹 버퍼(2% 알부민을 함유하는 1X PBS, pH 7.4) 1.5 mL를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 블로킹하였다. 그리고 나서, 블로킹 버퍼를 따라내고, 10 % 배설물을 함유하는 HEV 에 대하여 양성인 살균 일반 생리식염수 500 μL를 첨가하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 반응 후, 에펜도르프를 PBST로 6 회 세척하고 나서, ddH2O 259 μL를 각각의 에펜도르프에 첨가하였다. 그리고 나서, 실시예 14에 따라서 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 8C11, 8H3 및 12D8의 모노클로날 항체가 HEV에 결합할 수 있는 반면, 1F6, 2C9, 3F5, 15B2 및 16D7은 HEV에 결합하지 못하였다.

실시예 10: 양성 레서스 원숭이에서 얻은 혈청, 인간에서 얻은 혈청 및 마우스 유래 모노클로날 항체를 사용하는 본 발명의 폴리펩티드의 ELISA 및 마우스 유래 모노클로날 항체를 사용하는 본 발명의 폴리펩티드의 도트 블라팅

양성 레서스 원숭이에서 얻은 혈청, 인간에서 얻은 혈청 및 마우스 유래 모노클로날 항체를 사용하는 재조합 폴리펩티드의 ELISA

실시예 1 ~ 6에서 설명한 방법들에 의하여 표 2에 나타난 본 발명의 폴리펩티드를 제조하고 정제하였다. 1 mg/ml 농도를 갖는 얻어진 정제된 재조합 단백질 샘플을 PBS 버퍼(20 Mm, pH 7.4)로 1:500으로 희석하고, 다음과 같은 조건하에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 각 웰당 100 ㎕씩 코팅하였다: 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한 후 4 ℃에서 약 12 시간 동안 하룻밤 배양함. 자동 세척기 (TECAN, M12/4R Columbus plus) 상에서 PBS-Tween20 세척액 (NaCl 8.0 g + KH₂PO₄ 0.2 g + Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9 g + KCl 0.2 g + Tween 20 0.2 ml, 최종 부피가 1L가 되도록 비이온 H₂O 참가, pH 7.4)으로 한 번 세척하고 건조시킨 후, 블로킹 용액 (2% 글루틴, 0.2% 카제인 및 2% 수크로오스를 함유하는 PBS)를 200 ㎕/웰의 양으로 첨가하고, 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 37 ℃에서 30 분 동안, 적절하게 희석된 항-혈청 또는 모노클로날 항체를 첨가하였다. 자동 세척기 상에서 PBS-Tween20 세척액으로 20 초의 간격을 두고 5 회 세척하고 건조시킨 후, 37 ℃에서 30 분 동안 적절하게 희석된 HRP-표지 이차 항체(염소 항-인간 항체, 마우스 IgG 항체)를 첨가하였다. PBS-Tween20 세척액으로 자동 세척기 상에서 20 초의 간격을 두고 5 회 세척하고 건조시킨 후, 37 ℃에서 10 분 동안 색소 생산제(chromogenic agent) A 및 B (A: Na₂HPO₄ ·12H₂O 13.42 g + 시트르산 ·H₂O 4.2 g + H₂O₂ 0.3 g, 비-이온수로 부피를 700 mL까지 조절; B: TMB 0.2 g + 디메틸포름아미드 20 ml, 비-이온수로 부피를 700 ml까지 조절)을 각각 한 방울씩 첨가하여 발색시켰다. 스탑 용액 (2M H₂SO₄)을 한 방울 첨가하였다. 마이크로플레이트 리더(TECAN, Sunrise Remote/Touch Screen)(기준 파장 620 nm) 상에서 OD₄₅₀을 측정하였다. 음성 대조군 평균값의 3배 값을 양성 역치값으로 정하였고, 이들의 OD 값이 역치보다 높을 때 그 결과는 양성이다.

다양한 마우스 유래 모노클로날 항체를 이용하는 본 발명의 폴리펩티드의 도트 블라팅(dot blotting)

실시예 1 내지 5의 방법에 따라서 제조되고 HPLC 겔 여과에 의하여 정제된 표 2에 열거된 각각의 폴리펩타이드 10 ㎕(1mg/ml)를 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 각각 천천히 도팅(dotting)하고 공기중에서 건조시켰다. 5% 탈지유로 1.5 시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 실시예 8에 설명된 바와 같이 제조된 다양한 마우 스 유래 모노클로날 항체(5% 탈지유로 1:100 희석된 모노클로날 B 림프구에 의하여 분비되는 세포 상청액)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, TNT (10 mM Tris.Cl, pH 8.0 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)을 사용하여 5 분 간격으로 3 회 멤브레인을 세척하였다. HRP-표지된 염소의 항-마우스 IgG (JINGMEI Biological Company에서 제조, 5% 탈지유로 1:1000 희석)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. TNT로 5 분 간격으로 3 회 세척한 후, NBT/BCIP (C₄₀H₃₀N₁₀O₆Cl₂/C₈H₆BrClNO ₄P ·C₇H₉N)을 첨가하여 발색시켰다. 도트를 겔 이미징 시스템으로 스캐닝하고 그레이 정도(grey degree) 수치로 변환시키고, +++, +++, ++, +, +-와 같은 5 개 양성 등급 및 -와 같은 음성 등급으로 나누었다. 통상적인 웨스턴 블라팅과 비교하여, 이 방법은 SDS로 변성되도록 하지 않는 변성제(denaturing agent)의 부재시의 면역활성을 보다 실질적으로 반영할 수 있다.

[표 5]

결과

표 4에 열거된 정제된 재조합 폴리펩티드를 각각 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 실시예 8에서 언급한 3 가지의 마우스 유래 모노클로날 항체 8C11, 8H3 및 13D8, 회복 상태인 HEV 환자의 혈청 및 심한 상태의 HEV-감염 레서스 원숭이로부터 얻은 혈청에 대한 이들의 활성을 ELISA로 검사하고, 사용된 3 가지 모노 클로날 항체에 대한 이들의 활성을 도트 블라팅 분석법에 의하여 검사하였다. 그 결과는 폴리펩티드 NE2, 193C, 178C, NE2I, 235N, 225N, 209N, 247, 232, 222 및 201이 각각의 혈청/모노클로날 항체에 대하여 보다 우수한 활성을 가진다는 것을 보여주었다. 이는 폴리펩티드들이 보다 우수한 천연 HEV 에피토프를 가지고 HEV용 백신 및/또는 진단 키트로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

폴리펩티드 138C, C160, 150, 142 및 134는 보다 여러 가지 항체에 대하여 낮은 활성을 가졌다. 이는 주요한 천연 에피토프 ORF2의 형성이 적어도 aa469 내지 aa600의 단편을 수반한다는 것을 보여주었다.

폴리펩티드 170, C160, N160, 150, 144, 142 및 134의 서열은 ORF2의 aa459 ~ aa628, aa469 ~ aa628, aa459 ~ aa618, aa469 ~ aa618, aa459 ~ aa602. aa459 ~ aa600이 각각 개시 아미노산 (Met)에 연결된 것들이었다.

실시예 11: 마우스 유래 모노클로날 항체를 이용하는 본 발명의 폴리펩티드의 웨스턴 블라팅

실시예 8에서 생산된 마우스 유래 모노클로날 항체 1F6, 2C9, 3F5를 이용하여 실시예 1 내지 5에서 설명된 바와 같이 생산된 본발명의 폴리펩티드 208N, 209N 및 225N의 웨스턴 블라팅을 수행하였다. 상기 폴리펩티드를 SDS-PAGE에 의하여 분리하고 나서, 통상적인 방법에 따라서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고, 5% 탈지유를 첨가하여 1.5 시간 블로킹하고; 여러 가지 마우스 유래 모노클로날 항체 (5% 탈지유로 1:100 희석된 모노클로날 B 림프구에 의하여 분비되는 세포 상청액)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시키고; 5 분 간격으로 3 회 세척한 후, 항-마우스 HRP (5% 탈지유로 1: 1000 희석)로 표지된 IgG를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시키고; TNT로 5 분 간격으로 3 회 세척한 후, NBT/BCIP를 첨가하여 발색시켰다. 웨스턴 블라팅의 결과를 도 6에 나타내었다. 이 결과는, 특히 8번 레인에 있어서, Coomassie Brilliant Blue R250의 염색에 의하여 관찰될 수 없는 폴리머 밴드가 웨스턴 블라팅 분석법의 효소-결합 증폭 효과에 기인하여 관찰될 수 있음을 보여준다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드 208N은 12% SDS-PAGE 동안 폴리머로 형성하지 않고, 모노클로날 항체 1R6은 모노클로날 항체 2C9 및 3F5와 비교하여 209N 및 225N에 대하여 보다 강력한 활성을 갖는다는 것을 추가적으로 확인하였다.

실시예 12: 폴리펩티드 201을 함유하는 백신의 제조 및 이를 이용하여 면역화된 마우스의 분석

프로인트 아쥬반트를 사용하여 폴리펩티드 201을 함유하는 백신의 제조

상기한 바와 같이 제조되고 HPLC(순도 > 95%, 단백질 농도 1.02 mg/ml)에 의하여 정제된 본 발명의 폴리펩티드 201을 PBS로 희석하고, 동일한 부피의 완전 프로인트 아쥬반트 (BCG 함유)를 첨가하여 원하는 폴리펩티드 201의 최종 농도에 도달시킨다 (예컨대, 각각의 마우스를 100 μl, 5 ㎍ 면역화 시키고자 한다면, 폴리 펩티드 201의 농도는 0.05 mg/ml로 제조될 것이다). 30분 동안 방치 후 분리된 액상이 나타나지 않을 때까지, 상기 용액을 30 분동안 혼합하고 에멀젼화하였다.

백신 아쥬반트로서 프로인트 아쥬반트를 사용하여, 4 마우스 그룹(각각의 그룹은 3 마리의 쿤밍 화이트 마우스로 구성)에 0, 7 및 28일의 면역화 스케줄에 따라서 마우스 당 100 μl 내 0.5, 1, 2, 5 ㎍ 씩을 각각 근육내 주입하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 결과는 2 ㎍ 이상의 양을 포함하여 프로인트 아쥬반트와 함께 제조된 ORF2-201 백신이 강력한 면역원성(immunogenicity)을 가지며 항체는 면역화 후 2 번째 주부터 만들어지기 시작해서 4 번째 주에 최고 역가에 도달한다는 것을 보여주었다. 면역학에 관한 통상적인 서적 및 문헌에 의하면, 최고 역가를 갖는 항체는 마우스 당 30 ~ 70 ㎍의 단백질 항원으로 면역화된 마우스에서만 생산될 수 있다고 생각된다. 따라서, 상기 결과는 백신, 즉, 프로인트 아쥬반트와 혼합된 본 발명의 폴리펩티드 201은 이용 가능한 백신과 비교하여 상당히 높은 면역원성 효과를 가짐을 보여주는 것이다.

알루미늄 아쥬반트를 사용하여 폴리펩티드 201을 함유하는 백신의 제조

란쯔하우 생물제품연구소(Lanzhou Biological Product Institute, China)에서 입수한 원시 알루미늄 아쥬반트 (A1³⁺ 13.68%, Na⁺3.36%, pH 5.55)의 원하는 양을 침전물을 생성할 때까지 1N NaOH로 조정하였다. 완전히 혼합한 후, 1X PBS를 첨가하여 부피가 두 배가 되도록 하였다. 그리고 나서, 10,000에서 1 분 동안 원심분리를 수행하고, 상청액을 버렸다. 침전물을 1X PBS로 재현탁시켜서 부피가 다시 두 배가 되게하고, 10,000에서 1 분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. pH가 7 ~ 7.4에 도달할 때까지 이러한 과정을 수 차례 반복하였다. 마지막으로, 침전물을 동일한 부피의 1X PBS로 재현탁시키고, 용액을 살균하고 4 ℃에서 보관하고, 9 스토어(store) 용액으로서 사용하였다.

유사하게, 상기한 바와 같이 제조되고 HPLC(순도 > 95%, 단백질 농도 1.02 mg/ml)에 의하여 정제된 폴리펩티드 201을 PBS로 희석하고, 알루미늄 1/9 부피를 첨가하여 원하는 최종 농도의 폴리펩티드 201을 얻고, 4 ℃에서 하룻밤동안 혼합하였다. 면역화 분량은 마우스 당 100 ㎕이다. 백신 아쥬반트로서 알루미늄 아쥬반트를 사용하여, 각각 3 마리로 구성된 Bal b/c 마우스 그룹의 각각에 0, 7, 28일 면역화 스케줄에 따라서 마우스 당 2, 5, 10 ㎍을 근육내 주입하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 결과는 5, 10 ㎍ 분량이 보다 우수한 면역원성 효과를 가지며, 이는 현재 사용 가능한 HBV 표면 항원 백신의 면역원성 효과에 필적하는 것이며, 미립자 항원이고 모노머 항원과 비교할 때 보다 우수한 면역원성을 갖는다고 판단될 수 있음을 보여준다. 따라서, 상기 결과는 본 발명의 폴리머가 백신으로서 유용하다는 것을 보여준다.

아쥬반트를 사용하지 않는 폴리펩티드 201의 면역 분석

상기한 바와 같이 얻은 폴리펩티드 201을 4M 요소에 녹이고, 상청액을 PBS (pH 7.45)로 투석하여 약 95%의 순도로 재생시켰다. 백신 아쥬반트로서 프로인트 아쥬반트를 사용하여, 각각 3 마리의 쿤밍 마우스로 구성된 그룹 각각에 0, 7, 28일 면역화 스케줄에 따라서 마우스 당 5, 25, 50 ㎍ (대조군은 마우스 당 5 ㎍ 주 입)을 근육내 주입하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 결과는 아쥬반트 없는 ORF2-201 백신으로 면역화된 마우스에서 상당히 많은 항체가 생산되고, 이들의 사용량은 프로인트 아주반트와 함께 사용되는 통상적인 항원과 필적할 수 있다는 것을 나타내었다. 이는 또한 본 발명의 폴리머 폴리펩티드가 통상적인 항원과 비교하여 높은 면역원성을 갖는달는 것을 보여준다.

상기 결과들로부터 재조합 폴리펩티드 201 및 NE2 (5 ㎍/마우스) 모두로 면역화되었을 때, 프로인트 아쥬반트 또는 알루미늄 아쥬반트의 제제화에 관계없이, Balb/c 마우스가 특정 항체를 생산하도록 유도될 수 있다고 결론지을 수 있다. 그리고, 프로인트 아쥬반트로 제제화된 다른 재생 폴리펩티드 또한 마우스의 특정 항체 생산을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 백신으로서 사용되기 위한 우수한 특성을 갖는다.

실시예 13: 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 백신을 사용하는 레서스 원숭이의 면역화

정상 ALT 및 음성 HEV를 갖는 6 마리의 레서스 원숭이를 선별하고 이들을 2 그룹으로 나누어서, 한 그룹은 HF1, HF2 및 HF3 이라 칭하고, 다른 그룹은 HF4, HF5 및 HF6 이라 칭하였다. 두 그룹의 피검 레서스 원숭이들에게 실시예 1 내지 5 및 12에서 설명된 바와 같이 제조된 폴리펩티드 NE21 백신 및 폴리펩티드 201 백신을 알루미늄 아쥬반트를 각각 20 ㎍의 투여량으로 삼각근내(intradeltoidal) 주입하여 백신화시켰다. 이러한 백신화를 0, 10 및 30 일째에 각각 수행하였다. 마지막 백신화 후 3 주째에, 피검체로부터 얻은 항-NE2I IgG 항체의 역가를 간접 ELISA에 의하여 테스트하여서 다음과 같은 결과를 얻었다: HF1(1:16000), HF2(1:4000), HF3(1:8000), HF4(1:2000), HF5(1:3000) and HF6(1:5000).

폴리펩티드 NE21 및 201에 의하여 나타난 상기 결과는 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 미국특허 제5885768호에서 면역원으로서 사용된 HEV ORF2 폴리펩티드 trpE-C2 (서열번호 1의 아미노산 225-660)와 비교하여 보다 우수한 면역원성을 가진다는 것을 보여주었다. 미국특허 제5885768호 (Reyes, et al.)에 있어서, 개선된 알루미늄 아쥬반트와 함께 E. coli에서 발현된 50 ㎍의 HEV ORF2 폴리펩티드 trpE-C2를 0 및 30일째에 각각 정맥내 주입함으로써 4 마리 시노몰구스 원숭이 (Cynomolgus monkey)를 백신화시켰다. 아쥬반트만 주입시킨 두 마리의 시노몰구스 원숭이를 대조군으로 사용하였다. 이차 백신화 후 4 주째에 백신화된 원숭이들의 그룹에서 HEV에 대한 항체가 발견되지 않았다. 이들 백신화된 원숭이 중 2 마리를 선택하여 아쥬반트 없이 80 ㎍의 불용성 trpE-C2 폴리펩티드를 사용하여 58일째 되는 날에 삼차 백신화시켰더니, 단지 4 주일 후에 항-HEV 항체가 발견되었다.

실시예 14: 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 백신으로 면역화된 레서스 원숭이의 HEV에 의한 항원자극(Challenging)

PE형 간염 바이러스 (HEV)의 제조 및 정량(quantification)

HEV 환자 (Xinjiang, China)로부터 채취한 배설물을 살균 생리식염수 용액에 현탁하여 10 % 현탁액으로 제제화하였다. 현탁액을 4 ℃에서 12000g으로 20 분 동안 원심분리하고, 상청액을 0.2 ㎛ 멸균 필터 (NALGENE

Cat.No.190-2520)로 필터-살균하였다. PCR-탐지 가능한 양의 HEV를 감염 분량(infection dosage)으로 사용하였다.

배설물로부터 HEV RNA의 추출, 역전사 및 PCR: Trizol 시약 (GIBCOL)을 사용하여 그것의 사용 설명서에 따라서 10% 배설물 현탁액으로부터 HEV RNAs를 추출하고, AMV 역전사효소를 사용하는 RT 프라이머로서 특수 프라이머 A3(4566-4586, 5'-ggctcaccggagtgtttcttc-3')를 사용하여 42 ℃에서 40 분 동안 20 ㎕ 부피에서 역전사시켰다. 그리고 나서, 2 ㎕의 RT 산물을 주형으로 사용하고 A3 프라이머 및 A5 프라이머 (4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3')를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피에서 RT-PCR의 첫 번째 회(round)를 수행하였으며, 반응조건은 다음과 같다: 94 ℃에서 5 분 동안 예비-변성; 94 ℃에서 40 초 동안 변성 및 68 ℃에서 40 초 동안 신장(extending)의 35 순환; 75 ℃에서 5 분 동안 신장. 2 ㎕의 첫 번째 라운드 반응 산물을 주형으로서 사용하고 프라이머 B5 (4372-7392, 5'-gccgcagcaaaggcatccatg-3') 및 B3 (4554-4575, 5'-gtgtttcttccaaaaccctcgc-3')를 사용하여 최종 부피 20 ㎕에서 PCR의 두 번째 회를 수행하였으며, 반응조건은 다음과 같다: 94 ℃에서 5 분 동안 예비-변성; 94 ℃에서 40 초 동안 변성, 56 ℃에서 40 초 동안 아닐링 및 68 ℃에서 40 초 동안 신장의 35 순환; 72 ℃에서 1분 20초 동안 신장; 75 ℃에서 5 분 동안 신장.

이러한 실험에 사용된 레서스 원숭이들을 분류하였다: 각각 실시예 2의 피검체 HF1, HF2 및 HF3에 해당하는 레서스 원숭이 V10, V11 및 V12를 포함하는 면역화 그룹 1; 각각 실시예 2의 피검체 HF4, HF5 및 HF6에 해당하는 레서스 원숭이 V13, V14 및 V15를 포함하는 면역화 그룹 2; V16, V17 및 V18라고 정한 3 마리의 비-면 역화 레서스 원숭이를 포함하는 대조군.

HEV에 의한 항원자극

PCR-탐지 가능한 양의 HEV를 1 감염분량으로서 사용하였다. 실시예 13에 설명된 바와 같은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 백신을 사용한 레서스 원숭이 HF1 ~ 6의 마지막 백신화 후 3 주째에, 상기 레서스 원숭이들을 1,000 감염 분량의 HEV로 항원자극하였다. 항원자극 후, 각각의 원숭이의 ALT는 증가하지 않았다. 피검체 V16 및 V17에서 4주째에 항-NE2I-IgG이 검출되었고 피검체 V18에서 5주째에 항-NE2-IgG이 검출되었다. 1일부터 37일까지, 피검체 V10 ~ 15에서 HEV 배설이 관찰되지 않았으며; 피검체 V16에서 5일에 시작하여 30일째까지 HEV 배설이 관찰되었으며; 피검체 17 및 V18에서는 동일하게 5일째에 시작하지만 37일째까지 멈추지 않는 HEV 배설이 관찰되었다. 이들 결과들은 백신으로서의 본 발명의 폴리펩티드가 미국특허 제5885768호의 HEV ORF2의 폴리펩티드 trpE-C2와 비교하여 보다 우수한 방어를 일으키고 보다 우수한 면역원성을 갖는다는 것을 보여주었다.

이들 결과로부터, 원숭이를 백신화시키기 위하여 본 발명의 백신이 적은 양으로 사용될 때, 백신화된 원숭이들이 HEV에 반응하는 우수한 항체를 생산할 수 있고, HFV에 의한 항원자극 후 배설물에서 비정상적 ALT 및 바이러스 배설이 관찰되지 않았다는 것을 보여줄 수 있다. 따라서, 보고된 HEV ORF2로부터 얻은 폴리펩티드 trpE-C2 (미국특허 제5885768호)를 사용하여 제조된 백신 및 Tsarev 등에 의하여 제조된 폴리펩티드를 함유하는 백신의 백신화 결과와 비교하여 보다 우수한 면역 방어(immunoprotection)를 일으켰다. 게다가, Tsarev 및 Genelabs 사에 의하여 적용된 배큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템은 인체에 잠재적으로 유해한 것이며, 그래서, 지금까지 이러한 발현 시스템에 의하여 발현된 어떠한 재조합 단백질도 인간에 사용되는 시판용 약품 또는 시판용 백신으로서 승인받았다는 보고가 없다. 이와 반대로, 본 발명에 따라서 E.coli 발현 시스템에 의하여 발현된 재조합 단백질은 인체에 사용되는 시판용 생체내(in vivo) 약품으로서 승인을 받았으며, 보다 믿을 수 있는 안정성을 갖는다.

실시예 15: HEV ORF3 내의 에피토프와 연결된 본 발명의 폴리펩티드 247을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 제조

E형 간염 바이러스 (HEV) 환자 (XinJiang, China; Aye,T.T.,Uchida et al. Nucleic Acids Research, 20(13), 3512(1992); GenBank accession number: GI221701)로부터 분리된 HEV의 전장 게놈을 주형으로 하고, 5'-말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위 BamHI 및 NdeI를 도입하는 정방향 프라이머, 372FP (5'-ggatcccatatgaataacatgtcttttgct-3') 및 5'-말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위 BamHI을 도입하는 역방향 프라이머, 372BRP (5'-ggatcctcggcgcggcc-3')를 사용하여 PCR 반응을 수행하였으며, 반응조건은 다음과 같다: 94 ℃에서 5 분, 94 ℃에서 50 초, 56 ℃에서 50 초 및 72 ℃에서 3 초씩 30 순환, 및 70 ℃에서 10 분. HEV ORF3 내의 에피토프를 코딩하는 약 370 bp 크기의 특정 DNA 단편을 얻었다. 상기에서 얻어진 PCR 산물을 시판되는 pMD 18-T 플라스미드 (TAKARA Co.)에 연결시켰다. HEV ORF3의 에피토프 유전자가 삽입된 양성 서브-클론을 BamHI으로 분해하여 동정하였다. DNA 시퀀싱은 클론 내 돌연변이가 없음을 보여주었으며, 이에 의하여, 서열번호 11에 나타낸 HEV ORF3 내 에피토프 유전자의 아미노산 서열을 얻었다.

BamHI으로 분해시켜 HEV-ORF3 유전자 단편을 얻고, 이를 BamHI로 분해시킨 pTO-T7-ORF2-247 발현 플라스미드 벡터 (실시예 1에 기재된 방법에 의하여 제조됨)에 연결시켰다. BamHI으로 처리함으로써, HEV ORF3 유전자 단편이 삽입된 양성 발현 클론, pTO-T7-ORF3-247을 동정하였다. 이 클론을 E.coli ERR2566 균주내로 형질변환시켜서, ORF3-247 키메라 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 사용하였다.

실시예 16: 인플루엔자 바이러스에서 유래하는 적혈구 응집소(hemagglutin) 항원과 연결된 NE2D의 키메라 폴리펩티드의 제조

실시예 1에서 제조된 HEV-ORF2 변이체 서열(서열번호 6)을 주형으로 사용하고, 프라이머 쌍 HAFP/E2RD를 사용하는 PCR 증폭에 의하여 키메라 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 얻었다. PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 94 ℃에서 5 분 동안 예비-가열; 94 ℃에서 50 초 동안 변성, 56 ℃에서 50 초 동안 아닐링 및 72 ℃에서 70 초 동안 신장의 30 순환; 및 72 ℃에서 적어도 10 분 동안 신장. 얻어진 PCR 산물은 약 800 bp DNA 단편이며, 인플루엔자 바이러스에서 유래하는 HA 및 본 발명의 폴리펩티드 NE2D를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 코딩한다. 정방향 프라이머 HAFP는 BamHI 및 NdeI 제한 부위를 포함한다. 역방향 프라이머 E2RD는 EcoRI 제한 부위 및 번역 종결 코돈 TAA를 포함하였다. NdeI 부위에 해당하는 서열은 CAT ATG이며, 여기서 ATG는 번역 개시 코돈이다. 또한, 두 펩티드 HA 및 NE2D 각각의 정확한 입체구조를 유지하기 위하여, CAG CTG TTC에 의하여 코딩되는 가동 연결부 Gly-Gly-Ser를 HA 및 NE2D 펩티드 사이에 도입하였다. 따라서, 키메라 폴리펩티드 HA-NE2D를 HEV 백신에 적절하게 사용할 수 있었다. 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다:

HAFP: 5'- AGA TCT CAT ATG TCT AAA GCT TTC TCT AAC TGC TAC CCT

BglII NdeI 91 Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro

TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TTA GGT GGA TCC

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu108 Gly Gly Ser

CAG CTG TTC TAC TCT CGT CC-3'

E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3'

얻어진 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구조물를 포함하는 발현 벡터의 제조

상기한 PCR 산물을 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 pMD 18-T (TAKARA com. Ltd.) 내로 클로닝하였다. 그리고 나서, BamHI/EcoRI 분해에 의하여 pMD 18-T-HA-ORF2- NE2D로부터 원하는 서열을 얻고, 이를 BamHI/EcoRI 분해 및 연결(ligation)에 의하여 발현 백터에 삽입하였다. pTO-T7-HA-ORF2-NE2D 발현 플라스미드로 형질변환된 E.coli ERR2566 숙주세포로부터 HA-ORF2-NE2D 키메라 펩티드를 분리하였다. 아미노산 서열을 서열번호 12에 나타내었다.

실시예 17: 본 발명의 폴리펩티드 NE2I에 기초한 간접 ELISA 키트를 사용하는 생물학적 샘플 내 HEV에 대한 IgG의 검출

본 발명의 폴리펩티드 NE2I를 사용하여 HEV에 대한 IgG를 검출하는 키트는 다음을 포함한다: 재조합 폴리펩티드 NE2I로 코팅되고 블로킹 용액(20mM pH7.2 PB, 0.5% 카제인, 2% 젤라틴)으로 블로킹된 마이크로타이터 플레이트; 희석액 샘플(20mM pH7.2 PB, 1% 카제인); 작업 콘쥬게이트 (효소 희석액(20mM pH7.2 PB, 0.5% 카제인, 10% NBS)으로 희석된 HRP로 표지된 염소의 항-인간 IgG (DAKO)); 20 PBST, 크로마토겐 A, 크로마토겐 B 및 스톱 용액 (Beijing wantai)과 같은 비생물활성 물질.

Beijing wantai 및 Singapore Genelabs에서 상업적으로 입수한 두 개의 항-HEV IgG 키트와 비교하여 NE2I에 기초한 항-HEV IgG 키트로 일련의 원숭이 혈청을 검출하였다. 원숭이 혈청은 정맥내 항원자극 후 0 내지 18주에 HEV에 의하여 천연 감염된 원숭이와 유사한 원숭이 No1, No2, No3 및 No13의 혈청이었다.

조작 과정은 다음과 같다: 100 ㎕의 샘플 솔루언트를 각각의 마이크로타이터에 첨가하고; 시료 10 ㎕를 마이크로타이터에 첨가하고; 마이크플레이트의 모든 면을 가볍게 두드려서 완전히 혼합하고; 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고; 마이크로플레이트를 1배 PBST로 5회 세척하고; 마이크로플레이트를 뒤집고 흡수지 상에서 단단하게 두드려서 블라트 건조시키고; 모든 웰에 작업 콘쥬게이트 100 ㎕를 첨가하고 마이크로플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고; 다시 마이크로플레이트를 5번 세척하고 블라팅 건고하고; 크로마토겐 A 50 ㎕ 및 크로마토겐 50 ㎕를 첨가하고 가볍게 두드려서 완전히 혼합하고; 마이크로플레이트를 37 ℃ 암실에서 10 분 동안 배양하고; 각 웰에 스탑 용액 50 ㎕를 첨가하고 플레이트를 두드려서 천천히 혼합하고; 450nm/620nm에서의 각각의 웰의 흡광도를 측정한다. 두 개의 시판되는 항-HEV IgG 키트는 각각의 분석 방법에 의하여 정확하게 분석하였다.

결과는 다음과 같다: NE2I에 기초한 키트에서는 Beijing wantai 및 Singapore Genelabs에서 상업적으로 입수한 두 개의 키트보다 7 ~ 14일 일찍 혈청변환(seroconversion)이 검출됨; 항-NE2I-IgG이 지속기간은 Genelabs 항-HEV-IgG 및 WAVNTAI 항-HEV-IgG 보다 김; 항-NE2I-IgG의 검출율은 시판되는 두 개의 항-HEV-IgG 키트보다 높음 (도 10 참조, 원 데이터는 표 5에 나타냄). 정상 펩티드의 34 무작위 혈청이 검출되었을 때, 항-NE2I-IgG 및 Genelabs 항-HEV-IgG의 양성 비율이 각각 35% lac 11%였으며, 후자는 절대적으로 전자에 포함되었다. 간염 환자의 263 임상 혈청에 있어서, 항-NE2I-IgG 및 of WANTAI 항-HEV-IgG의 양성 비율은 각각 27.2% 및 10.6%였다. 비-A 간염 환자, 비-B 간염환자 및 비-C 간염환자의 91 혈청에 있어서, 항-NE2I-IgG 및 Genelabs 항-HEV-IgG의 양성 비율은 각각 69.2% 및 24.2%였다. 요컨대, 본 발명의 NE2I에 기초한 항-HEV-IgG가 시판되는 항-HEV-IgG 키트보다 감도가 우수하다.

[표 5]

실시예 18: 본 발명의 재조합 단백질을 HRP로 표지하기 위한 모델

1 mg의 HRP (Biozyme R/Z>3) 및 NaIO4를 각각 초순수(ultra-pure water, UPW)에 용해시키고; 교반하면서 NaIO4 용액을 적가하고; 혼합 용액을 실온의 암실에 30 분 동안 방치하고; 1 % 에틸렌 글리콜 용액 100 ㎕를 순차적으로 첨가하고 혼합하고; 4 ℃ 암실에 30 분 동안 방치시킨다. 재조합 단백질을 카르보네이트 버퍼 (10mM pH9.6)에 대하여 3 시간 투석하고; 적당하게 투석된 재조합 단백질을 산소화된 HRP에 첨가하고, 서서히 교반하면서 실온(또는 4 ℃)에서 카르보네이트 버퍼 (10mM pH9.5)에 대하여 6 시간 동안 투석하고; 새로 제조된 0.1M NaBH4 용액 20 ㎕을 상기한 블렌딩에 첨가하고; 이를 4 ℃에서 암실에 2 시간 동안 방치하고, 30 분마다 한번씩 천천히 볼텍스하고; 이를 4℃ PBS (10mM pH7.2)에서 하룻밤동안 투석하였다.

실시예 19: 생물학적 샘플 내의 HEV에 대한 항체 IgM 검출용 진단 키트 및 생물학적 샘플 내의 HEV에 대한 항체 IgM 검출용 포획 분석 (capture assay)

실시예 18에 기재된 바에 따라서 폴리펩티드 225N를 HRP로 표지하였다.

본 발명의 HRP-표지된 폴리펩티드 NE2I를 포함하는 HEV에 대한 항체 IgM 검출용 진단 키트는 다음을 포함한다: 마우스 항-인간 IgM 체인 폴리클로날 항체 (Dako company, Denmark)로 예비-코팅되고 블로킹 용액으로 블로킹된 마이크로타이터 스트립; 희석액 샘플 (20mM pH7.2 PB, 1% 카제인); 작업 콘쥬게이트 (효소 희석액 (20mM pH7.2 PB, 0.5% 카제인, 10% NBS)으로 적절하게 희석된 HRP-표지된 폴리펩티드225N); 20 PBST, 크로마토겐제(chromatogen agent) A, 크로마토겐제 B 및 스 톱 용액 (WANTAI company, Beijing)과 같은 비-생물활성 물질.

본 발명의 진단 키트를 사용하는 포획 분석은 다음과 같이 수행한다: 희석 버퍼 100 ㎕를 마우스 항-인간 IgM 체인 폴리클로날 항체로 예비-코팅된 각각의 웰에 첨가하고; 검출할 샘플 1 ㎕을 희석 버퍼에 첨가하고; 천천히 두드리면서 완전히 혼합하고; 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고; PBST로 5 번 세척하고; 마이크로플레이트 위아래를 뒤집고 티슈 위에서 단단하게 두드려서 블라트 건조하고; 작업 콘쥬게이트 (적절하게 희석된 HRP-표지 폴리펩티드 225N) 100 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고 마이크로플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고; 다시 5 번 세척하고 블라팅 건조하고; 그리고 나서, 크로마토겐 A 50 ㎕ 및 크로마토겐 B 50 ㎕를 첨가하고 천천히 두드리면서 완전히 혼합하고; 37℃ 암실에서 10 분 동안 배양하고; 스톱 용액 50 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 두드리면서 천천히 혼합하고; OD_450nm/620nm에서 각각의 웰의 흡광도를 측정한다.

본 발명에 따라 제조된 항-HEV-IgM 진단 키트를 사용하여, 간염환자의 263 임상 혈청을 상기한 포획 분석에 의하여 측정한 결과 양성 비율이 11%였고; 비-A, 비-B 및 비-C 간염 환자의 91 혈청 또한 상기 포획 분석에 의하여 측정한 결과 양성 비율이 48.4%였다. 한편, Genelabs의 항-HEV-IgG 진단 키트에 의하여 측정한 이들 91 혈청의 양성 비율은 24.2%에 불과하였다. 상기 결과에 나타난 바와 같이, 포획 분석법을 사용하는 본 발명의 항-HEV-IgG 진단 키트에 의하여 검출된 양성 샘플은 임상 진단과 잘 일치하였다. 또한, Genelabs 항-HEV-IgG에 의하여 검출된 대부 분의 양성 샘플은 본 발명의 포획분석에서도 역시 양성이다. 즉, 상기한 포획 분석 뿐만 아니라 본 발명의 항-HEV-IgM 키트도 임상적 HEV 진단에 있어서 종래의 상업적으로 입수 가능한 키트보다 높은 감도 및 특이성을 갖는다.

실시예 20: 생물학적 샘플에서의 HEV에 대한 전체 항체 검출용 진단 키트 및 생물학적 샘플에서의 HEV에 대한 모든 항체 검출 방법

실시예 18에 기재된 방법에 의하여 양고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase, HRP)로 폴리펩티드 225N를 표지하였다.

본 발명의 폴리펩티드 NE2I 및 225N을 포함하는 HEV에 대한 전체 항체 검출 키트는 다음을 포함한다: 재조합 폴리펩티드 NE2I로 예비-코팅되고 블로킹 용액(20mM pH7.2 PB, 0.5% 카제인, 2% 젤라틴)으로 블로킹된 마이크로타이터 스트립; 작업 콘쥬게이트(효소 희석액 (20mM pH7.2 PB, 0.5% 카제인, 10% NBS)으로 희석되고 HRP로 표지된 폴리펩티드 225N); 20 PBST, 크로마토겐제 A, 크로마토겐제 B 및 스톱 용액 (WANTAI company, Beijing)와 같은 비-생물활성 물질.

본 키트의 검출 프로토콜은 다음과 같다: 혈청 50 ㎕ 및 HRP로 표지된 적절하게 희석된 재조합 폴리펩티드 225N 50 ㎕를 미리 폴리펩티드 NE2I로 코팅된 스트립 상의 마이크로타이터에 첨가하고; 마이크로-플레이트의 모든 면을 가볍게 두드려서 혼합하고; 37 ℃에서 60 분 동안 배양하고; 마이크로-플레이트를 PBST로 5 번 세척하고; 마이크로-플레이트를 뒤집어서 블라트 건조하고; 크로마토겐 A 50 ㎕ 및 크로마토겐 B 50 ㎕를 첨가하고; 그리고 나서, 마이크로플레이트를 37 ℃에서 15 분 동안 배양하고; 마지막으로 각각의 웰에 스톱 용액 50 ㎕를 첨가하고 플레이트 를 두드려서 천천히 혼합하고; OD_450nm/620nm에서의 각각의 웰의 흡광도를 측정한다.

검출 결과는 다음과 같이 나타났다: 본 발명의 NE2I 및 225N에 기초하는 샌드위치 전체 항-HEV 항체로 검출하며, 간염 환자로부터 얻은 263 임상 혈청을 검출하여 52 %의 양성 비율이 측정된 반면, WANTAI 항-HEV-IgG 키트를 사용한 검출에 의해서는 단지 10.6 %이 측정되었다. 그리고, 추가적인 비-A, 비-B 및 비-C 간염 환자로부터 얻은 91 혈청을 동일한 샌드위치 키트를 사용하여 측정하여 양성 비율이 54.9%였다. 그러나, 이들 91 혈청에 있어서, Genelabs 항-HEV-IgG에 의하여 측정된 양성 비율은 24.2%에 불과하였다. 상기 데이터에 의하여 나타난 바와 같이, 임상적 진단에 있어서 본 발명의 진단 키트를 사용하는 검출은 종래의 상업적으로 입수 가능한 키트보다 우수하다.

<110> YANG SHENG TANG company, Ltd. <120> THE POLYPEPTIDE FRAGMENT OF HEPATISIS E VIRUS, THE VACCINE COMPOSITION COMPRISING SAID FRAGMENTS AND THE DIAGNOSTIC KITS <130> IEC010037PCT <140> PCT/CN01/01469 <141> 2001-09-30 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 660 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 1 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn Pro Phe Ala Pro 50 55 60 Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val Arg Gln Pro Ala 65 70 75 80 Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln Arg Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala 100 105 110 Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg 115 120 125 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr 130 135 140 Ser Ser Val 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Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile 355 360 365 Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro 370 375 380 Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro 385 390 395 400 Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val 405 410 415 Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp 420 425 430 Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu 435 440 445 Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val 450 455 460 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr 465 470 475 480 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp 485 490 495 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg 500 505 510 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr 515 520 525 Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys 530 535 540 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn 545 550 555 560 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly 565 570 575 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro 580 585 590 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala 595 600 605 Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp 610 615 620 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe 625 630 635 640 Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys 645 650 655 Thr Arg Glu Leu 660 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 2 Met Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly 20 25 30 Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile 35 40 45 Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro 50 55 60 Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp 65 70 75 80 Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala 100 105 110 Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr 115 120 125 Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe 130 135 140 Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr 145 150 155 160 Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln 165 170 175 Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr 180 185 190 Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val 195 200 205 Leu Ala Pro Pro Pro Arg 210 <210> 3 <211> 194 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 3 Met Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro 1 5 10 15 His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp 20 25 30 Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr 50 55 60 Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val 65 70 75 80 Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln 85 90 95 Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg 100 105 110 Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro 115 120 125 Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly 130 135 140 Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu 145 150 155 160 Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu 165 170 175 Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro 180 185 190 Pro Arg <210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 4 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser His Met 1 5 10 15 Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Gln Pro Cys Ala Leu 20 25 30 Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys Cys Pro Arg 35 40 45 His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly Gly Ala Ala Ala 50 55 60 Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu Ile Pro Ser Pro Ser 65 70 75 80 Gln Ser Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Pro Ser Pro Pro Met Ser Pro 85 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300 Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly 305 310 315 320 Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu 325 330 335 Ala Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe 340 345 350 Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala 355 360 365 Phe Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly 370 375 380 Lys Thr Arg Glu Leu 385 <210> 5 <211> 1990 <212> DNA <213> hepatitis E virus <400> 5 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt 120 ttctggggtg accgggttga ttctcagccc ttcgcaatcc cctatattca tccaaccaac 180 cccttcgccc ccgatgtcac cgctgcggcc ggggctggac ctcgtgttcg ccaacccgcc 240 cgaccactcg gctccgcttg gcgtgaccag gcccagcgcc ccgccgttgc ctcacgtcgt 300 agacctacca cagctggggc cgcgccgcta accgcggtcg ctccggccca tgacaccccg 360 ccagtgcctg atgttgactc ccgcggcgcc atcctgcgcc ggcagtataa cctatcaaca 420 tctcccctta cttcttccgt ggccaccggt acaaacttgg ttctatacgc cgctcctctt 480 agcccacttc tacccctcca ggacggcacc aatactcata taatggccac agaagcttct 540 aattatgccc agtaccgggt tgctcgtgcc acaattcgct accgcccgct ggtccccaac 600 gctgttggtg gctacgccat ctccatctcg ttctggccac agaccaccac caccccgacg 660 tccgttgaca tgaattcaat aacctcgacg gatgttcgta ttttagtcca gcccggcata 720 gcctccgagc ttgttatccc aagtgagcgc ctacactacc gtaaccaagg ttggcgctct 780 gttgagacct ccggggtggc ggaggaggag gccacctctg gtcttgttat gctctgcata 840 catggctcac ctgtaaattc ttatactaat acaccttata ccggtgccct cgggctgttg 900 gactttgccc tcgaacttga gttccgcaac ctcacccccg gtaataccaa cacgcgggtc 960 tcccgttact ccagcactgc ccgtcaccgc cttcgtcgcg gtgcagatgg gactgccgag 1020 cttaccacca cggctgctac ccgcttcatg aaggacctct attttactag tactaatggt 1080 gtcggtgaga tcggccgtgg gatagcgctt accctgttta accttgctga caccctgctt 1140 ggcggtctac cgacagaatt gatttcgtcg gctggtggcc agctgttcta ctctcgtccc 1200 gtcgtctcag ccaatggcga gccgactgtt aagctttata catctgtaga gaatgctcag 1260 caggataagg gtattgcaat cccgcatgac atcgacctcg gggagtctcg tgtagttatt 1320 caggattatg acaaccaaca tgagcaggac cgaccgacac cttccccagc cccatcgcgc 1380 cctttttctg tcctccgagc taatgatgtg ctttggcttt ctctcaccgc tgccgagtat 1440 gaccagtcca cttacggctc ttcgaccggc ccagtctatg tctctgactc tgtgaccttg 1500 gttaatgttg cgaccggcgc gcaggccgtt gcccggtcac tcgactggac caaggtcaca 1560 cttgatggtc gccccctttc caccatccag cagtattcaa agaccttctt tgtcctgccg 1620 ctccgcggta agctctcctt ttgggaggca ggtactacta aagccgggta cccttataat 1680 tataacacca ctgctagtga ccaactgctc gttgagaatg ccgctgggca tcgggttgct 1740 atttccactt acaccactag cctgggtgct ggtcccgtct ctatttccgc ggttgctgtt 1800 ttagcccccc actccgcgct agcattgctt gaggatacca tggactaccc tgcccgcgcc 1860 catactttcg atgacttctg cccggagtgc cgcccccttg gcctccaggg ctgtgctttt 1920 cagtctactg tcgctgagct tcagcgcctt aagatgaagg tgggtaaaac tcgggagtta 1980 tagtttattt 1990 <210> 6 <211> 1989 <212> DNA <213> hepatitis E virus <400> 6 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt 120 ttctggggtg accgggttga ttctcagccc ttcgcaatcc cctatattca tccaaccaac 180 cccttcgccc ccgatgtcac cgctgcggcc ggggctggac ctcgtgttcg ccaacccgcc 240 cgaccactcg gctccgcttg gcgtgaccag gcccagcgcc ccgccgttgc ctcacgtcgt 300 agacctacca cagctggggc cgcgccgcta accgcggtcg ctccggccca tgacaccccg 360 ccagtgcctg atgttgactc ccgcggcgcc atcctgcgcc ggcagtataa cctatcaaca 420 tctcccctta cttcttccgt ggccaccggt acaaacttgg ttctatacgc cgctcctctt 480 agcccacttc tacccctcca ggacggcacc aatactcata taatggccac agaagcttct 540 aattatgccc agtaccgggt tgctcgtgcc acaattcgct accgcccgct ggtccccaac 600 gctgttggtg gctacgccat ctccatctcg ttctggccac agaccaccac caccccgacg 660 tccgttgaca tgaattcaat aacctcgacg gatgttcgta ttttagtcca gcccggcata 720 gcctccgagc ttgttatccc aagtgagcgc ctacactacc gtaaccaagg ttggcgctct 780 gttgagacct ccggggtggc ggaggaggag gccacctctg gtcttgttat gctctgcata 840 catggctcac ctgtaaattc ttatactaat acaccttata ccggtgccct cgggctgttg 900 gactttgccc tcgaacttga gttccgcaac ctcacccccg gtaataccaa cacgcgggtc 960 tcccgttact ccagcactgc ccgtcaccgc cttcgtcgcg gtgcagatgg gactgccgag 1020 cttaccacca cggctgctac ccgcttcatg aaggacctct attttactag tactaatggt 1080 gtcggtgaga tcggccgtgg gatagcgctt accctgttta accttgctga caccctgctt 1140 ggcggtctac cgacagaatt gatttcgtcg gctggtggcc agctgttcta ctctcgtccc 1200 gtcgtctcag ccaatggcga gccgactgtt aagctttata catctgtaga gaatgctcag 1260 caggataagg gtattgcaat cccgcatgac atcgacctcg gggagtctcg tgtagttatt 1320 caggattatg acaaccaaca tgagcaggac cgaccgacac cttccccagc cccatcgcgc 1380 cctttttctg tcctccgagc taatgatgtg ctttggcttt ctctcaccgc tgccgagtat 1440 gaccagtcca cttacggctc ttcgaccggc ccagtctatg tctctgactc tgtgaccttg 1500 gttaatgttg cgaccggcgc gcaggccgtt gcccggtcac tcgactggac caaggtcaca 1560 cttgatggtc gccccctttc caccatccag cagtattcaa agaccttctt tgtcctgccg 1620 ctccgcggta agctctcctt ttgggaggca ggtactacta aagccgggta cccttataat 1680 tataacacca ctgctagtga ccaactgctc gttgagaatg ccgctgggca tcgggttgct 1740 atttccactt acaccactag cctgggtgct ggtcccgtct ctatttccgc ggttgctgtt 1800 ttagcccccc ctccgcgcta gcattgcttg aggataccat ggactaccct gcccgcgccc 1860 atactttcga tgacttctgc ccggagtgcc gcccccttgg cctccagggc tgtgcttttc 1920 agtctactgt cgctgagctt cagcgcctta agatgaaggt gggtaaaact cgggagttat 1980 agtttattt 1989 <210> 7 <211> 169 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 7 Met Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp 20 25 30 Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr 35 40 45 Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val 50 55 60 Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr 65 70 75 80 Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser 85 90 95 Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala 115 120 125 Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile 130 135 140 Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala 145 150 155 160 Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 165 <210> 8 <211> 159 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 8 Met Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser 1 5 10 15 Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu 20 25 30 Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser 35 40 45 Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala 50 55 60 Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser 65 70 75 80 Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly 85 90 95 Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr 100 105 110 Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala 115 120 125 Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly 130 135 140 Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 145 150 155 <210> 9 <211> 149 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 9 Met Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr 20 25 30 Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr 35 40 45 Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu 50 55 60 Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe 65 70 75 80 Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr 85 90 95 Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu 100 105 110 Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr 115 120 125 Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu 130 135 140 Ala Pro Pro Pro Arg 145 <210> 10 <211> 139 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 10 Met Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr 20 25 30 Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp 35 40 45 Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln 50 55 60 Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe 65 70 75 80 Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val 100 105 110 Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile 115 120 125 Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 130 135 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 11 Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys Ala 1 5 10 15 Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys Cys Pro 20 25 30 Arg His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly Gly Ala Ala 35 40 45 Ala Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu Ile Leu Ser Pro 50 55 60 Ser Gln Ser Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Pro Ser Pro Pro Met Ser 65 70 75 80 Pro Leu Arg Pro Gly Leu Asp Leu Val Phe Ala Asn Pro Pro Asp His 85 90 95 Ser Ala Pro Leu Gly Val Thr Arg Pro Ser Ala Pro Pro Leu Pro His 100 105 110 Val Val Asp Leu Pro Gln Leu Gly Pro Arg Arg 115 120 <210> 12 <211> 232 <212> PRT <213> hepatitis E virus <400> 12 Met Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Ala Ser Leu Gly Gly Ser Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser 20 25 30 Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala 35 40 45 Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg 65 70 75 80 Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala 85 90 95 Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser 100 105 110 Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr 115 120 125 Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp 130 135 140 Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln 145 150 155 160 Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe 165 170 175 Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr 180 185 190 Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val 195 200 205 Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile 210 215 220 Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro 225 230

Claims

서열번호 1에 나타난 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 서열의 단편을 포함하는 정제된 폴리펩티드의 다량체(multimer)로, 상기 다량체는 2 내지 180개의 모노머 폴리펩티드의 자기 응집 (self-aggregation)에 의해 형성된 것이고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 370 및 469 사이에서 개시하는 아미노 말단, 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 601 및 628 사이에서 종결하는 카르복실 말단을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열의 단편을 가지고, 상기 단편은 다음의 폴리펩티드들로 구성된 군에서 선택되는 것인 정제된 폴리펩티드의 다량체:

서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 628의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 235N;

서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 618의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 225N;

서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 602의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 209N;

서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 394 내지 606의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉, 폴리펩티드 NE2I; 및

서열번호 1로부터의 아미노산 잔기 X 내지 603의 아미노산 서열을 가지며 N-말단에 Met가 부가되어 있고, C-말단이 변형되어 있는 폴리펩티드로서, 여기서, 상기 변형된 C-말단이라 함은 5'-3' 방향에서, 아미노산 서열 -Pro-Pro-Arg가 아미노산 잔기 603, Pro에 그의 3' 말단에 부가된 것을 의미하는 것으로 다음을 포함한다:

a) X가 아미노산 잔기 394이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 바와 같음, 즉, NE2임;

b) X가 아미노산 잔기 414이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 바와 같음, 즉, 193C임;

c) X가 아미노산 잔기 429이면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 4에 제시된 바와 같음, 즉, 178C임.
제1항에 따른 다량체를 포함하는, 포유류에서의 E형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제2항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 아쥬반트, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는, 포유류에서의 E형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
정제된 모노머 폴리펩티드의 다량체로, 상기 다량체는 2 내지 180개의 정제된 모노머 폴리펩티드의 자기 응집에 의해 형성된 것이고, 상기 각각의 정제된 모노머 폴리펩티드는 제1항에 기재된 폴리펩티드 및 인플루엔자 바이러스 유래의 적혈구 응집원 (hemagglutin antigen)의 보존적 단편을 포함하는 키메라 단백질인, 다량체.
제4항에 기재된 키메라 단백질을 포함하는, 포유류에서의 E형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제5항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 아쥬반트 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는, 포유류에서의 E형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 따른 다량체를 진단 유효량으로 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 진단 키트.
제7항에 있어서, E형 간염 바이러스 ORF3의 면역원성 에피토프 또는 이들의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 추가적으로 포함하는, 진단 키트.
제8항에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스 ORF3의 면역원성 에피토프 또는 이들의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드가, 제1항에 기재된 폴리펩티드에 공유적으로 결합되어 있는, 진단 키트.
제7항에 있어서, 제1항에 따른 다량체를 포함하고, IgG에 대하여 검출 대상 생물학적 샘플로부터 얻은 검출 가능하게 표지된 항-IgG 항체, 및 상기 검출 가능한 표지에 대응하는 검출 시약를 추가적으로 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG의 측정용 진단 키트.
제10항에 있어서, 상기 다량체는 지지체의 표면상에 예비-코팅되어 있는, 진단 키트.
제10항에 있어서, 버퍼 시스템을 추가적으로 포함하는, 진단 키트.
제7항에 있어서, 포획 항체(capture antibody)로서 IgM에 대하여 검출 대상 생물학적 샘플로부터 얻은 검출 가능하게 표지된 항-IgM 항체를 포함하고, 검출 가능하게 표지된 제1항에 따른 다량체 및 상기 검출 가능한 표지에 대응하는 검출 시약을 추가적으로 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM의 측정용 진단 키트.
제13항에 있어서, 상기 포획 항체가 지지체 표면 상에 예비-코팅되어 있는, 진단 키트.
제13항에 있어서, 버퍼 시스템을 추가적으로 포함하는, 진단 키트.
제7항에 있어서, 제1항에 따른 다량체를 포함하고, 검출 가능하게 표지된 제1항에 따른 다량체, 및 상기 검출 가능한 표지에 대응하는 검출 시약을 추가적으로 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 전체 항체의 측정용 진단 키트.
제16항에 있어서, 상기 다량체가 지지체의 표면 상에 예비-코팅되어 있고, 상기 지지체 표면을 예비-코팅하기 위하여 상기 다량체로부터 선택된 다량체 및 상기 다량체로부터 선택된 검출 가능하게 표지된 다량체가 동일한 다량체 또는 서로 다른 다량체일 수 있는, 진단 키트.
제1항에 따른 다량체를 지지체 표면에 고정시키는 단계; 항원 항체 상호작용을 위한 조건하에서 이를 검출 대상 샘플과 접촉시키는 단계; 버퍼로 세척하는 단계; 및 검출 가능한 표지를 갖는 E형 간염 바이러스 항원 및 대응 검출 시약을 사용하여 지지체 표면에서 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 전체 항체의 검출 방법.
제1항에 따른 다량체를 지지체 표면에 고정시키는 단계; 항원 항체 상호작용을 위한 조건하에서 이를 검출 대상 샘플과 접촉시키는 단계; 버퍼로 세척하는 단계; 및 검출 가능하게 표지된 E형 간염 바이러스에 대한 항-IgG 항체 및 대응 검출 시약을 사용하여 지지체 표면에서 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG의 검출 방법.
항-IgM 항체를 지지체 표면에 고정시키는 단계; 항원 항체 상호작용을 위한조건하에서 이를 검출 대상 샘플과 접촉시키는 단계; 버퍼로 세척하는 단계; 및 검출 가능하게 표지된 제1항에 따른 다량체 및 대응 검출 시약을 사용하여 지지체 표면에서 항-IgM/IgM 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM의 검출 방법.
항-IgM 항체를 지지체 표면에 고정시키는 단계; 항원 항체 상호작용을 위한 조건하에서 이를 검출 대상 샘플과 접촉시키는 단계; 버퍼로 세척하는 단계; 그리고 나서, 항원 항체 상호작용을 위한 조건하에서 제1항에 따른 다량체와 접촉시키는 단계; 버퍼로 세척하는 단계; 및 검출 가능하게 표지된 항-HEV 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 및 대응 검출 시약을 사용하여 지지체 표면에서 항원/항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM의 검출 방법.