CN117730255A - E型肝炎病毒感染的检测方法、e型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒 - Google Patents
E型肝炎病毒感染的检测方法、e型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
E型肝炎病毒感染的检测方法,包括以选自下述(a)~(c)中的至少1种多肽作为抗原多肽来检测试样中的抗E型肝炎病毒抗体的检测工序。(a)由包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽;(b)由在包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽;(c)由与包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽。
Description
技术领域
本发明涉及E型肝炎病毒感染的检测方法、用于该方法的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒。
背景技术
E型肝炎是由E型肝炎病毒(HEV:hepatitis E Virus)引起的急性或重症的肝炎,其死亡率据说高达A型肝炎的约10倍,也有妊娠期妇女中的死亡率达20%这样的报告。已知E型肝炎主要在印度、亚洲、非洲、中南美等发散地流行,即使在除此以外的地域,近年随着食物多样化,也有报告强烈怀疑由被HEV污染的食物(例如,猪、野猪、鹿等的食用肉)的非加热经口摄取造成的发病的事例。另外,也散在地发现输血后感染、肝炎的再活化的例子,因此在受检者中调查HEV感染的有无的检查的需要逐年提高。
以往,受检者中的HEV感染的检测采取通过PCR的手法检测受检者的血清中的HEV基因的方法。然而,血清中的HEV基因仅在HEV感染后约2周~1个月的有限期间内能够检测,因此该期间外的检测是困难的。
另外,由于感染了的人或动物分泌的HEV的浓度低,因而使用抗E型肝炎病毒抗体(抗HEV抗体)直接检测HEV也是困难的。因此,现在被临床应用的方法的主流是通过用以HEV为基础合成的抗原多肽、重组抗原检测受检者中的抗HEV抗体,从而间接地检测HEV感染的方法。抗HEV抗体例如对于IgA类或IgM类,在E型肝炎病毒感染之后持续到约2~5个月。
作为这样的方法、在其中应用的试剂,例如,市售有用于用使用了固相化有重组HEV抗原多肽的板和标记抗人IgA抗体的2步ELISA检测IgA类抗HEV抗体的试剂盒,非专利文献1中记载了以基因4型的HEV基因的ORF2(DDBJ/GenBank/EMBL Accession No.:AB082545)所编码的氨基酸的111~660位作为重组HEV抗原多肽检测抗HEV抗体。
另外,也市售有用于用使用了标记重组HEV抗原多肽和抗人IgM抗体的固相化板的2步ELISA检测IgM类抗HEV抗体的试剂盒,日本特表2004-525613号公报(专利文献1)中记载了HEV感染诊断用试剂盒,包含相当于基因1型的HEV基因的ORF2(DDBJ Accession No.:D11092)所编码的氨基酸序列的序列的394~606位的多肽片段。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2004-525613号公报
非专利文献
非专利文献1:Mizuo H.et al.,J.Clin.Microbopl.,Vol.40,No.9,2002年,p.3209-3218
发明内容
发明要解决的课题
然而,本发明者们对于现在在日本被临床应用的E型肝炎病毒感染检测用试剂盒进行了进一步验证,结果确认了多个用上述的现有的试剂盒不能检测的样本,发现了使用这些试剂盒的方法的抗HEV抗体的检测灵敏度尚不充分。
本发明是鉴于上述本发明者们所发现的课题而提出的,目的在于提供能够比现有的方法高灵敏度地检测抗E型肝炎病毒抗体的E型肝炎病毒感染的检测方法、用于该方法的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒。
用于解决课题的手段
本发明者们发现,通过间接地检测HEV感染的方法、即在通过用HEV抗原检测抗HEV抗体来检测HEV感染的方法中,特别使用位于由编码HEV的衣壳蛋白(capsid protein)的ORF2所编码的氨基酸的C末端侧的E2s结构域作为HEV抗原多肽,并且将该多肽的长度缩短为200残基以下,从而即使对于用现有的试剂盒不能检测抗HEV抗体的样本,也能够高灵敏度地检测,从而完成了本发明,所述现有的试剂盒是使用由基因4型的HEV基因的ORF2(DDBJ/GenBank/EMBL Accession No.:AB082545)所编码的氨基酸的111~660位作为HEV抗原多肽的试剂盒、使用由基因1型的HEV基因的ORF2(DDBJ Accession No.:D11092)所编码的氨基酸的394~606位作为HEV抗原多肽的试剂盒。通过该见解得到的本发明的方案如下。
[1]
E型肝炎病毒感染的检测方法,包括以选自下述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽作为抗原多肽来检测试样中的抗E型肝炎病毒抗体的检测工序。
(1a)由包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(1b)由在包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(1c)由与包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(2a)由包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(2b)由在包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(2c)由与包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(3a)由包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(3b)由在包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(3c)由与包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(4a)由包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(4b)由在包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(4c)由与包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽。
[2]
根据[1]所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,以选自所述(3a)~(3c)中的至少1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合作为所述抗原多肽。
[3]
根据[1]或[2]所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,以由选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的任意1种多肽组成的二聚体作为所述抗原多肽。
[4]
根据[1]~[3]中的任一项所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,所述抗E型肝炎病毒抗体的同种型为IgM。
[5]
根据[1]~[4]中的任一项所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,
所述检测工序是使所述试样、与捕捉体和标记体接触的工序,
所述捕捉体具备非水溶性载体和能与抗E型肝炎病毒抗体结合的探针分子,并且
所述标记体具备标记物质和所述抗原多肽。
[6]
E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是用于[1]~[5]中的任一项所述的E型肝炎病毒感染的检测方法的抗原多肽,是选自下述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽。
(1a)由包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(1b)由在包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(1c)由与包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(2a)由包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(2b)由在包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(2c)由与包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(3a)由包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(3b)由在包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(3c)由与包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
(4a)由包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(4b)由在包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(4c)由与包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽。
[7]
根据[6]所述的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是选自所述(3a)~(3c)中的至少1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合。
[8]
根据[6]或[7]所述的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是由选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的任意1种多肽组成的二聚体。
[9]
根据[6]~[8]中的任一项所述的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是经标记物质标记的标记体。
[10]
E型肝炎病毒感染检测用试剂盒,是用于[1]~[5]中的任一项所述的E型肝炎病毒感染的检测方法的试剂盒,包含[6]~[9]中的任一项所述的抗原多肽。
[11]
根据[10]所述的E型肝炎病毒感染检测用试剂盒,进一步包含具备非水溶性载体和能与抗E型肝炎病毒抗体结合的探针分子的捕捉体。
发明的效果
根据本发明,可以提供能够比现有的方法更高灵敏度地检测抗E型肝炎病毒抗体的E型肝炎病毒感染的检测方法、用于该检测方法的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒。
附图说明
图1是显示序列号1~4中记载的1型~4型的基因型(Gen1~Gen4)的氨基酸序列的图。
图2是对于在Hybrid-E2s(G3/G1-E2s)的各纯化阶段中得到的溶液或沉淀物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而得的电泳照片。
图3A是对于在Hybrid-E2s(G3/G4-E2s)的各纯化阶段中得到的溶液或沉淀物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而得的电泳照片。
图3B是对于在Hybrid-E2s(G3/G4-E2s)的各纯化阶段中得到的溶液或沉淀物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而得的电泳照片。
具体实施方式
以下,通过其优选的实施方式详细地说明本发明。
<E型肝炎病毒感染的检测方法>
本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法是包括以选自下述(a)~(c):
(a)由包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
(b)由在包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
(c)由与包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽
中的至少1种多肽作为抗原多肽来检测试样中的抗E型肝炎病毒抗体的检测工序的方法,检测所述试样的E型肝炎病毒感染的有无。
[E型肝炎病毒]
在本发明中,通过检测针对试样中的E型肝炎病毒的抗体、即抗E型肝炎病毒抗体,来间接地检测E型肝炎病毒的存在。更具体地,检测该试样、优选为同一试样所来源的受检者有无感染E型肝炎病毒。E型肝炎病毒(hepatitis E Virus;本说明书中,根据情况称为“HEV”)是未被包膜包覆的小型球状粒子(直径:27~34nm),现在已知4个基因型(基因1型~基因4型)。其基因组是约7200碱基的单链RNA,具有3个ORF(开放式阅读框(open readingframe):ORF1、ORF2、ORF3)。ORF1编码解旋酶、RNA聚合酶等非结构蛋白,ORF2编码衣壳蛋白,ORF3编码由113或114个氨基酸残基组成的磷酸化蛋白质。其中,ORF2典型地编码由660个残基的氨基酸序列组成的多肽,该多肽的129~606位的氨基酸构成衣壳蛋白,从其N末端侧开始具备形成病毒壳体的S结构域(典型地为129~319位的氨基酸);形成二、三或五聚体的M结构域(M:典型地为320~455位的氨基酸);形成突起的P结构域(P:典型地为456~606位的氨基酸)。另外,报告了所述P结构域中,典型地,由所述ORF2编码的氨基酸序列的459~606位的氨基酸组成的E2s结构域形成二聚体,对病毒的宿主识别发挥重要作用(Li,S.et al.,PLos Pathog.5,e1000537,2009年)。此外,本发明中,在氨基酸序列中显示“位”和数时,表示从N末端侧开始的氨基酸残基的数。
[抗E型肝炎病毒抗体]
本发明中,抗E型肝炎病毒抗体(本说明书中,根据情况称为“抗HEV抗体”)是能够与所述E型肝炎病毒特应性地结合的抗体,更具体为在试样所来源的受检者的体内产生的抗体。作为本发明所涉及的抗HEV抗体,只要能够识别下述的抗原多肽,则可以不是完全的抗体,也可以是抗体片段。
作为本发明所涉及的抗HEV抗体的同种型,不特别限定,可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任意者,也可以是它们之中的2种以上的组合。另外,作为所述同种型分别也可以是任意的亚类。例如,在人感染了HEV的情况下,首先是IgM、接着是IgA在血清中出现,并持续数月(最大5个月左右),通过以它们作为对象,从而能够进行感染初期阶段的检测。另外,IgG比它们略晚出现、持续更长期间,因此也能够进行过去的HEV感染的检测。其中,从在使用下述的夹心法(例如夹心ELISA)时能更早期地检测的观点考虑优选IgM,例如,从能够实现感染时期的特定等的更详细的分析的观点考虑,优选IgM与IgG的组合,但不限于这些。
[受检者]
本发明中,所谓“受检者”,表示本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法的试样所来源的人,另外,表示进行下述的本发明的E型肝炎病毒的检查方法的对象。作为所述受检者,可列举人或人以外的哺乳类(猪、野猪、牛、鹿等),优选为人。作为本发明所涉及的受检者不特别限制,既可以是没有感染HEV且未发病E型肝炎的健常者,也可以是感染了HEV但未发病E型肝炎的人。另外,为了发病时期的特定等,也可以是已知已经感染了HEV的患者、过去发病过E型肝炎的患者。
[试样]
本发明中,所谓“试样”,是本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法的对象,作为所述试样,只要是所述抗HEV抗体可以存在的试样就不特别限制。一般地,可列举从所述受检者等对象采集的血清、血浆、和全血等血液样本;尿、粪便、痰、唾液、汗、脑脊液、消化液、精液、淋巴液、腹水等血液以外的体液样本;口腔粘膜、咽喉粘膜、肠道粘膜等粘膜样本;以及各种活检样本等。它们之中,作为本发明所涉及的试样优选为血液样本,更优选为血清或血浆。
这些试样可以是根据需要用稀释液稀释或悬浮后的。作为所述稀释液,可列举例如,磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液等缓冲液。另外,作为本发明所涉及的试样,根据需要可以是适宜实施了前处理的。作为所述前处理,可列举粉碎、冷冻、加热、浓缩、分级、脱盐等处理;pH调节剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、表面活性剂等添加处理;纯化处理等,可以是它们中的1种,也可以是2种以上的组合。
[抗原多肽]
本发明的方法包括以选自下述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽作为抗原多肽来检测试样中的抗HEV抗体的检测工序。本发明中,“检测”除了将试样中的抗HEV抗体的存在的有无和量作为信号获取的检测之外,还包括将所检测的抗HEV抗体根据所述信号量进行定量或半定量。
本发明中,在抗HEV抗体的检测中使用的抗原多肽,典型地为(a)由包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,即,选自
(1a)由包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽、
(2a)由包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽、
(3a)由包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽、和
(4a)由包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽
中的至少1种多肽(以下,根据情况称为“抗原多肽(a)”)。
序列号1所记载的氨基酸序列是基因1型的HEV的ORF2(DDBJ Accession No.:D11092)的432~660位的氨基酸序列,序列号2所记载的氨基酸序列是基因2型的HEV的ORF2(DDBJ Accession No.:M74506)的432~660位的氨基酸序列,序列号3所记载的氨基酸序列是基因3型的HEV的ORF2(GenBank Accession No.:AB481229)的432~660位的氨基酸序列,序列号4所记载的氨基酸序列是基因4型的HEV的ORF2(GenBank Accession No.:AB481227)的432~660位的氨基酸序列。
图1中作为Gen1~Gen4分别显示序列号1~4所记载的氨基酸序列。另外,将各氨基酸序列中的21~186位的氨基酸序列之间的同一性(Identity)示于下述的表1。如图1和表1所示,1型~4型的基因型之间的氨基酸同一性高。
表1
序列号1~4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸,典型地相当于由HEV基因的ORF2所编码的氨基酸序列的459~606位的氨基酸(E2s结构域)。作为需要包含在所述抗原多肽(a)中的氨基酸序列,在序列号1~4所记载的氨基酸序列中,各自独立地优选为21~175位,更优选为21~186位,进一步优选为14~186位。另外,在本发明所涉及的抗原多肽为下述的二聚体(异源二聚体)的情况下,在是选自(3a)~(3c)中的任意1种多肽与选自(4a)~(4c)中的任意1种多肽(抗原多肽(4))的组合时,从更容易纯化该异源二聚体的观点考虑,作为需要在一方多肽(优选为抗原多肽(4))中包含的氨基酸序列,优选序列号3、4(优选为序列号4)所记载的氨基酸序列中的14~175位,更优选为14~186位。
作为本发明所涉及的抗原多肽(a)的长度,分别需要全长为序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的200残基以下。由此,能够比现有的方法更高灵敏度地检测抗HEV抗体。作为所述抗原多肽(a)的长度,优选为173残基以下,更优选为166残基以下。
另外,在自然界中,会发生由于核苷酸序列的突变而该序列所编码的氨基酸序列突变。进而,在现在的技术水准下,只要是本领域技术人员,例如,在得到了所述抗原多肽(a)的氨基酸序列信息或编码其的核苷酸序列信息的情况下,就能够使用公知的定点诱变(site-directed mutagenesis)法等改变其序列,制备抗原多肽(a)的改变体。
因此,本发明所涉及的抗原多肽的方案还包括(b)由在包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,即,选自
(1b)由在包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽、
(2b)由在包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽、
(3b)由在包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽、和
(4b)由在包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽
中的至少1种多肽(以下,根据情况称为“抗原多肽(b)”)。
其中,所谓在氨基酸序列中“替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列”,表示是该氨基酸序列中的氨基酸残基被替换、缺失、插入和/或添加了的氨基酸序列,或进行了它们之中的2种以上的组合的氨基酸序列。另外,所谓“多个”表示是20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个的整数。所谓1个或多个氨基酸残基,优选为氨基酸残基为1个以上且10个以下、更优选为1个以上且5个以下、进一步优选为1个以上且3个以下、特别优选为2个以下。
进而,在现在的技术水准下,只要是本领域技术人员,例如,在得到了所述抗原多肽(a)的氨基酸序列信息的情况下,就能够基于编码其的核苷酸序列,通过杂交技术(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,1975年,p.503-517)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki,R.K.等,Science,230,1985年,p.1350-1354、Saiki,R.K等,Science,239,1988年,p.487-491)等,从其他病毒等获得同源基因。
例如由通过这样的方法获得的同源基因编码的多肽,通常与所述抗原多肽(a)的氨基酸序列具有高同源性、同一性。因此,本发明所涉及的抗原多肽的方案也包括(c)由与包含序列号1~4中的任一项所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为该序列号所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性(优选为同一性)的氨基酸序列组成的多肽,即,选自
(1c)由与包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性(优选为同一性)的氨基酸序列组成的多肽、
(2c)由与包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性(优选为同一性)的氨基酸序列组成的多肽、
(3c)由与包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性(优选为同一性)的氨基酸序列组成的多肽、和
(4c)由与包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性(优选为同一性)的氨基酸序列组成的多肽
中的至少1种多肽(以下,根据情况称为“抗原多肽(c)”)。
此外,提到氨基酸序列的同源性的情况下,在将被比较对象的氨基酸序列与对象的氨基酸序列使用氨基酸序列分析软件等对齐时,与被比较对象的氨基酸序列上的被比较对象氨基酸位于同列的对象氨基酸可以是与所述被比较对象氨基酸相同氨基酸,也可以是与所述被比较对象氨基酸具有相同性质的氨基酸。提到氨基酸序列的同一性的情况下,与被比较对象的氨基酸序列上的被比较对象氨基酸位于同列的对象氨基酸是与所述被比较对象氨基酸相同的氨基酸。具有相同性质的氨基酸的组在本发明所属的技术领域广为人知,例如,可以用酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸);碱性氨基酸(赖氨酸/精氨酸/组氨酸);在中性氨基酸中,具有烃链的氨基酸(甘氨酸/丙氨酸/缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸/脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸/苏氨酸)、含硫的氨基酸(半胱氨酸/蛋氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺/谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香族基的氨基酸(苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸)来分类。
这样的氨基酸序列的同源性和同一性例如可以使用BLASTP的程序(Altschul等,J.Mol.Biol.,215,1990年、p.403-410)来确定。另外,与所述抗原多肽(a)的氨基酸序列的同源性为80%以上即可,但优选为85%以上、90%以上、95%以上(例如,96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)。更优选同一性为80%以上即可,优选为85%以上、90%以上、95%以上(例如,96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)。
在本发明中,在所述抗原多肽之中,从能够更多地检测出抗HEV抗体存在的试样(例如,能够更多地检测出阳性样本)的观点、和检测灵敏度更高(例如,即使抗HEV抗体量少也能够检测)的观点考虑,优选为选自所述(3a)~(3c)中的至少1种多肽(以下,根据情况称为“抗原多肽(3)”)。已知HEV中如上所述存在1型~4型的基因型,但在现有的E型肝炎病毒感染检测用试剂盒中,使用来源于基因1型、基因4型的抗原多肽。与此相对,虽然到目前为止在日本检测到的HEV是基因1型、基因3型、和基因4型,在北海道也散在地检测到4型,但是其中主流是基因3型。因此,认为现有的试剂盒在相当多的样本中产生假阴性。与此相对,本发明者们推测,通过以来自基因3型的HEV的所述抗原多肽(3)作为HEV抗原,能够减少这样的漏检的频率。
另外,作为本发明所涉及的抗原多肽,从能够更多地检测到抗HEV抗体存在的试样(能够更多地检测到阳性样本)的观点、和进一步提高检测灵敏度(即使抗HEV抗体量更少也能够检测)的观点考虑,进一步优选所述抗原多肽(3)、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合,进一步更优选所述抗原多肽(3)、与选自所述(1a)~(1c)和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合,特别优选所述抗原多肽(3)、与选自所述(1a)~(1c)中的至少1种多肽的组合。由此,除了通过以上述的抗原多肽(3)作为HEV抗原带来的漏检的频率减少,还能够对多样的基因型的HEV进行更全面的检测。本发明者们进而发现,该组合的多肽协同地作用,令人惊讶地,对于用该多肽的一方分别单独不能检测抗HEV抗体、或灵敏度低的试样,也能够高灵敏度地检测抗HEV抗体。
进而,作为所述抗原多肽的组合的方案,不特别限制,可列举所述抗原多肽(3)中的1种或2种以上与所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)的中的1种或2种以上的组合,可以形成二聚体以上的多聚体。本发明中,作为所述组合的方案,特别优选选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、和(4a)~(4c)中的任意1种多肽形成二聚体(异源二聚体),更优选选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)和(4a)~(4c)中的任意1种多肽形成二聚体(异源二聚体),进一步优选选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)中的任意1种多肽形成二聚体(异源二聚体)。如后所述,本发明者们发现了,本发明所涉及的抗原多肽作为异源二聚体纯化容易,另外,在所述异源二聚体中,由上述的2种多肽的组合产生的协同效果更高,即,即使对于用该多肽的一方分别单独不能检测抗HEV抗体、或灵敏度低的试样,也能够检测抗HEV抗体,进而其检测灵敏度更高。
[抗原多肽的制造方法]
本发明所涉及的抗原多肽可以适宜使用公知的方法或依据其的方法获得。例如,可以通过包括下述工序的方法获得:培养导入了选自编码所述抗原多肽的核苷酸和包含所述核苷酸的载体中的至少1种的宿主细胞,采集在所述宿主细胞中表达的多肽的工序。更具体地,例如,首先,由HEV通过惯用方法获得编码所述抗原多肽的RNA,合成cDNA。作为所述cDNA,例如,可以是以本发明所涉及的抗原多肽的氨基酸序列为基础人工地化学合成的合成DNA。接着,由该cDNA制备编码所述抗原多肽的DNA片段或包含其的表达载体,导入宿主细胞获得转化体,通过培养该转化体,从而使本发明所涉及的抗原多肽表达,可以从培养物作为重组多肽获得。
作为由HEV获得编码本发明所涉及的抗原多肽的核苷酸的方法,可以列举例如,将以由HEV提取的RNA为基础合成的cDNA,与质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、BAC载体、PAC载体等载体连接而制作cDNA文库,使用基于编码所述抗原多肽的核苷酸序列制成的引物,扩增包含目的核苷酸序列的DNA片段,根据需要将其与适当的载体连接的方法。
所述表达载体是能够在宿主细胞内复制、且以能够在宿主细胞内表达的状态包含该核苷酸序列所编码的多肽的载体。该表达载体基本上可以构建自我复制载体,即作为染色体外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制的例如质粒(例如,pBR322等)。另外,所述表达载体在被导入宿主细胞的情况下,也可以基本上构建整合到该宿主细胞的基因组中、与整合了该表达载体的染色体一起被复制的噬菌体DNA(例如,λ噬菌体等)。
所述表达载体的构建的步骤和方法可以适宜采用公知的方法或依据其的方法。例如,为了将包含所述目的核苷酸序列的DNA片段插入表达载体,可采用将所述DNA片段用适当的限制性酶切断,插入适当的质粒的限制性酶位点或多克隆位点与该质粒连接的方法等。所述表达载体为了将其实际导入宿主细胞使所述抗原多肽表达,除了编码该抗原多肽的核苷酸序列之外,优选含有控制其表达的核苷酸序列(例如,编码启动子、终止子等的序列)、控制所述表达的核苷酸序列以外的诱导表达的核苷酸序列(例如,乳糖操纵子等)、和用于选择细胞的基因标志物序列(例如,耐药性基因的序列)等。
作为所述宿主细胞,不特别限制,但优选为微生物,可列举例如,丝状菌、酵母、大肠杆菌、放线菌、乳酸菌等。作为所述宿主细胞,根据需要可以是已经以特定的功能缺损的方式进行了转化的细胞、突变体。作为对这些宿主细胞导入所述DNA片段或表达载体的方法,可以适宜采用公知的方法或依据其的方法,可列举例如,热休克法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法。
所述抗原多肽通过将在所述宿主细胞中导入了所述DNA片段或表达载体的转化体用适当的培养基进行培养,从而可以从其培养物(例如,培养微生物细胞)采集。作为所述转化体的培养条件,例如,可以应用宿主细胞的培养条件,只要是本领域技术人员,就能够根据宿主细胞的种类、所使用的培养基等适宜调整温度、空气添加的有无、氧浓度、二氧化碳的浓度、培养基的pH、培养温度、培养时间、湿度等来设定。
作为从所述培养物采集所述抗原多肽的方法,可以适宜采用公知的方法或依据其的方法。例如,可以使所述抗原多肽在宿主细胞(例如,大肠杆菌)内表达,转化体的培养结束后,将培养细胞破碎,将通过离心分离、过滤等而得到不溶性级分作为粗纯化物获得的方法。进而,将该不溶性级分根据需要洗涤,例如,可以通过脲、盐酸胍等变性剂使其可溶化后,通过将盐析法、透析法、有机溶剂沉淀法、膜分离法、色谱分离法单独或2种以上组合使用而进行纯化。或者,使添加了纯化用标签(例如,HIS标签、trpE标签等)的所述抗原多肽在宿主细胞(例如大肠杆菌)内表达,使其粗提取液通过带有标签的蛋白质的纯化用柱(例如,Ni柱、亲和柱等)之后,通过使带有标签的蛋白质溶出来纯化。这些纯化方法可以使用1种也可以组合使用2种以上。
本发明所涉及的抗原多肽可以通过例如添加HIS标签使其表达,从而使用Ni柱容易地纯化。另外,通过添加trpE标签而使其表达,从而能够提高表达效率、使用抗trpE抗体的亲和柱进行纯化。作为本发明所涉及的抗原多肽的纯化方法的一方案,更具体地,首先,将添加HIS标签使其表达而得的所述粗纯化物根据需要适宜洗涤之后,使其可溶化。作为在所述可溶化中使用的溶液,优选例如含有4~8M脲的溶液。接着,用PBS(pH7.3)等透析,在Ni柱捕捉透析后的离心上清之后,根据需要进行洗涤,用咪唑等溶出,从而可以作为溶出物获得所述抗原多肽的纯化物。所述溶出物根据需要可以再次进行所述透析。
另外,在本发明所涉及的抗原多肽是所述二聚体(异源二聚体)的情况下,作为其制造方法的一方案,例如,首先,对构成目的异源二聚体的一方的多肽(多肽A)添加HIS标签使其表达,对另一方的多肽(多肽B)不添加HIS标签使其表达后,通过与上述同样的方法分别使其可溶化。作为在所述可溶化中使用的溶液,优选例如含有4~8M脲的溶液。接着,将它们混合之后进行透析。作为在所述透析中使用的溶液,优选例如PBS(pH7.3)等。由此,具有HIS标签的多肽A的单体和同源二聚体的大多数作为沉淀被回收,但通过与不具有HIS标签的多肽B形成异源二聚体,从而可以可溶化而作为上清回收。本发明者们推测这是因为多肽B对多肽A发挥分子伴侣效果。接着,通过使Ni柱捕捉所述上清,从而不具有HIS标签的多肽B的单体和同源二聚体作为通过级分被除去,因此通过将被Ni柱捕捉的蛋白质溶出,从而能够获得多肽A与多肽B的异源二聚体。作为在所述溶出中使用的溶液,可列举例如咪唑溶液。
[检测工序]
在本发明中,作为用所述抗原多肽检测抗HEV抗体的检测方法,只要是能够检测抗HEV抗体的方法就不特别限制,可以适宜采用现有公知的方法、依据其的方法、或它们的组合。可列举例如,夹心法、竞争法、和免疫比浊法等免疫学手法、依据它们的原理的检测方法,不特别限制。在该检测方法中,例如,一般可以采用ELISA、数字ELISA、CLEIA(化学发光酶免疫测定法)、CLIA(化学发光免疫测定法)、ECLIA(电化学免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)等以微板、粒子等作为载体的方法;免疫层析;表面等离子体共振分析法;利用荧光共振能量转移的检测方法等。
作为本发明中的检测方法,从倾向于能够构建灵敏度和特异度更高的测定系统的观点考虑,优选为夹心法。以下,对于本发明所涉及的检测工序,列举夹心法为例说明更具体的方案。
在使用所述夹心法的情况下,作为本发明所涉及的夹心法的方案,可列举
所述检测工序是使所述试样、与捕捉体和标记体接触的工序,
所述捕捉体具备非水溶性载体和能与抗HEV抗体结合的探针分子,并且所述标记体具备标记物质和所述抗原多肽(所述多肽中的至少1种)的方案(以下,根据情况称为“第1方案”);以及
所述检测工序是使所述试样、与捕捉体和标记体接触的工序,
所述捕捉体具备非水溶性载体和所述抗原多肽,并且
所述标记体具备标记物质和能与抗HEV抗体结合的探针分子的方案(以下,根据情况称为“第2方案”)。从进一步降低非特异反应的观点考虑,优选第1方案。
在所述夹心法中,能与抗HEV抗体结合的探针分子(以下,根据情况仅称为“探针分子”)和所述多肽中的至少1种(以下,称为“抗原多肽”)分别可以在所述捕捉体和所述标记体中的任意者具备,但一方包含于捕捉体,另一方包含于标记体。由此能够将试样中的抗HEV抗体用所述捕捉体捕捉、并且用所述标记体标记,因此通过检测来源于所述标记物质的信号,能够高准确度且容易地检测该抗HEV抗体。
检测到的信号可以根据需要将其量进行半定量或定量,从而作为抗HEV抗体量。所述“信号”根据所述标记物质而包含显色(发色)、消光、反射光、发光、荧光、由放射性同位素产生的放射线等,除了可以用肉眼确认的之外,也包含可以通过适应信号的种类的检测方法/装置来确认的。本发明中,作为抗HEV抗体量,可以通过使用了标准试样的标准曲线等来定量其量,但从更简便且迅速的观点考虑,也可以将所述信号量直接作为本发明的抗HEV抗体量处理。
作为这样的夹心法,可列举作为2步法的正向夹心法(将捕捉体与试样中的抗HEV抗体的反应、结合于捕捉体的抗HEV抗体与标记体的反应按顺序进行的方法)、反向夹心法(预先使标记体与试样中的抗HEV抗体反应,使生成的复合体与捕捉体反应的方法)、和1步法(将试样中的抗HEV抗体、捕捉体、标记体的反应同时1步进行的方法),它们可以任意采用。
例如,在第1方案或第2方案中的正向夹心法中,首先,使所述试样与所述捕捉体接触,经由所述捕捉体的探针分子(或抗原多肽)与抗HEV抗体的结合而使该捕捉体捕捉抗HEV抗体(1次反应:捕捉步骤)。接着,使被所述捕捉体捕捉的抗HEV抗体接触所述标记体,经由所述标记体的抗原多肽(或探针分子)与抗HEV抗体的结合而进行标记(2次反应:标记步骤)。通过该反应,形成包含捕捉体-抗HEV抗体-标记体的复合体。将未结合的试样和标记体根据需要洗涤除去(洗涤步骤)之后,通过适应所述标记物质的规定的方法,检测来源于该标记物质的信号(检测步骤)。
〔非水溶性载体〕
所述非水溶性载体主要担载所述探针分子或所述抗原多肽,作为固相化的载体发挥功能,是非水溶性的物质。本发明中,所谓“非水溶性的物质”,表示在常温常压下对水为不溶(相对于水的溶解度为0.001g/mL以下、优选为0.0001g/mL以下,以下同样)的物质。
作为这样的非水溶性载体的材质,可以使用一般在免疫测定和依据其的测定中使用的材质,不特别限制,可列举例如,选自高分子聚合物(聚苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亚胺、尼龙等)、明胶、玻璃、胶乳、二氧化硅、金属(金、铂等)、和金属化合物(氧化铁、氧化钴、镍铁氧体等)中的至少1种。另外,作为所述非水溶性载体的材质,可以是这些物质的复合材、这些物质与其他物质的复合材,例如,可以是由选自所述高分子聚合物、明胶、和胶乳中的至少1种有机高分子、与选自氧化铁(尖晶石型铁氧体等)、氧化钴、和镍铁氧体中的至少1种金属化合物组成的有机无机复合材(例如,磁性粒子等)。进而,作为所述非水溶性载体,可以是用羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基、羟基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、叠氮基、醛基、碳酸酯基、烯丙基、氨基氧基、马来酰亚胺基、硫醇基等活性基进行了表面修饰的非水溶性载体。
另外,在本发明中,作为所述非水溶性载体的形状不特别限制,例如,可以是板、纤维、膜、粒子等任意。作为这样的非水溶性载体,可以适宜使用现有公知的,也可以适宜使用市售的。
〔能与抗HEV抗体结合的探针分子〕
作为所述能与抗HEV抗体结合的探针分子,可列举例如,抗原;抗体;蛋白A、蛋白G、蛋白L等结合蛋白质;抗生物素蛋白D、链霉抗生物素蛋白等抗生物素蛋白类;凝集素;半乳凝素、糖链受体、免疫受体等。所述“抗体”除了完整的抗体之外,也包含抗体片段(例如,Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链抗体、双特异性抗体等)、使抗体的可变区结合而成的低分子化抗体。其中,作为所述探针分子,优选为能与抗HEV抗体结合的抗体。作为这样的抗体,例如,可以根据所检测的目的抗HEV抗体的同种型而从抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体、抗IgE抗体、抗IgD抗体中选择,也可以将它们之中的2种以上组合。适应这些同种型的抗体可以通过现有公知的方法适宜制备,另外,也可以适宜使用市售的。
〔标记物质〕
作为所述标记物质,可以无特别限制地使用在公知的免疫测定方法、依据其的方法中作为标记物质使用的物质。可列举例如,酶;吖啶酯衍生物等发光物质;铕等荧光物质;别藻蓝蛋白(APC)和藻红蛋白(R-PE)等荧光蛋白质;125I等放射性物质;异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸罗丹明(RITC)等低分子量标记物质;金粒子;抗生物素蛋白;生物素;胶乳;二硝基苯(DNP);地高辛(DIG),可以是它们中的1种也可以是2种以上的组合。例如,在作为所述标记物质使用酶的情况下,可以通过添加显色底物、荧光底物、化学发光底物等作为底物,从而适应该底物进行各种信号的检测。作为所述酶,可列举例如,过氧化物酶(POD:辣根过氧化物酶(HRP)等)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、葡萄糖氧化酶、萤光素酶,但不限于这些。
〔捕捉体〕
所述标记体是具备所述非水溶性载体、和所述探针分子或所述抗原多肽的复合体,所述非水溶性载体与所述探针分子或所述抗原多肽直接或间接地结合。
所述捕捉体中,作为所述探针分子或所述抗原多肽的含量不特别限制,可以适应它们与抗HEV抗体的结合的容易性等而适宜调整,例如,在所述非水溶性载体是板的情况下,相对于其表面积1cm2的质量(在2种以上的组合的情况下为它们的合计)优选为0.01~1.5μg。
所述捕捉体可以通过对所述非水溶性载体结合所述探针分子或所述抗原多肽来制造。作为该制造方法,可以适宜采用现有公知的方法或依据其的方法,可以在所述非水溶性载体上直接结合所述探针分子或所述抗原多肽(以下,根据情况称为“被担载体”),也可以间接地结合。
在直接结合的情况下,例如,作为所述非水溶性载体和/或所述被担载体,可以使用具有羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基、羟基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、叠氮基、醛基、碳酸酯基、烯丙基、氨基氧基、马来酰亚胺基、硫醇基、吡啶基二硫化物基等活性基的,或根据需要付与所述活性基使它们结合,从而将所述被担载体直接固定于所述非水溶性载体。另外,在所述非水溶性载体是板的情况下,可以在板上涂布所述被担载体,根据需要用酪蛋白酸钠、牛血清白蛋白(BSA)等封闭之后,使其干燥,从而将所述被担载体直接固定于所述非水溶性载体。
在间接结合的情况下,例如,可以经由多聚组氨酸、聚乙二醇、包含半胱氨酸和/或赖氨酸的寡肽、结合于所述被担载体的连接物等使其结合,从而将所述被担载体间接地固定于所述非水溶性载体。作为所述连接物,不特别限制,可列举例如,能与被担载体(优选为所述探针分子)结合的二次抗体、蛋白G、蛋白A、能光分解的光切断型连接物、具有所述活性基的连接物分子(例如,肼盐、酰肼)等。另外,可以对所述被担载体(优选为所述探针分子)进行某些修饰,将捕捉该修饰部分的物质固定化于所述非水溶性载体,从而在所述非水溶性载体上固定所述被担载体。例如,作为所述修饰部分的代表例可列举生物素,作为捕捉该修饰部分的物质的代表例可列举链霉抗生物素蛋白,但不限于这些。
供于这些反应的非水溶性载体和所述被担载体的比率可以以实现上述的捕捉体中的比率的优选范围的方式适宜选择。另外,根据需要,为了防止向所述被担载体、非水溶性载体的非特异性吸附,可以用适当的封闭剂(例如,牛血清白蛋白、明胶等)进行所述非水溶性载体的封闭。进而,作为这样的捕捉体,在所述被担载体是所述探针分子的情况下,可以适宜使用市售的。
〔标记体〕
所述标记体是具备所述标记物质、和所述探针分子或所述抗原多肽的复合体,所述标记物质与所述探针分子或所述抗原多肽直接或间接地结合。所述标记体中,作为所述标记物质、所述探针分子或所述抗原多肽的含量不特别限制,可以根据所述标记物质的种类等而适宜调整。
所述标记体可以通过使所述标记物质与所述探针分子或所述抗原多肽结合来制造。作为该制造方法,可以适宜采用现有公知的方法或依据其的方法,可以使所述标记物质与所述探针分子或所述抗原多肽直接结合,也可以间接地结合。作为它们的结合方法,分别可列举与在所述捕捉体中记载的结合方法同样的方法。
(捕捉步骤)
在所述捕捉步骤中,作为使所述抗HEV抗体与所述捕捉体接触的方法不特别限制,可以适宜采用现有公知的方法或依据其的方法,例如,在所述非水溶性载体是板的情况下,可列举对其(被担载体固相化板)注入所述试样的方法,在所述非水溶性载体是粒子的情况下,可列举在所述试样中添加所述捕捉体(被担载体固相化粒子)的方法。
在所述捕捉步骤中的所述试样与所述捕捉体的反应中,作为所述试样的量,不特别限制,可以根据试样的种类、浓度等而适宜调整。另外,作为所述捕捉步骤的条件不特别限制,可以适宜调整,例如,可以在室温~45℃、优选为20~37℃、pH6.0~9.0左右、优选为pH7.0~8.0进行30~90分钟左右、优选为60分钟左右,但不限于这些条件。
(标记步骤)
在所述标记步骤中的所述标记体与抗HEV抗体的反应中,作为包含所述标记体和抗HEV抗体的反应液中的、标记体的含量(终浓度)(标记体为2种以上的组合的情况下是它们的合计),不特别限制,是根据试样的种类、浓度等适宜调整的,因此不特别限制,从如果过量使用则可能产生高背景信号的观点考虑,例如,优选为0.01~10μg/mL,更优选为0.1~5μg/mL,进一步优选为0.2~1μg/mL。
另外,作为所述标记步骤的其他条件不特别限制,可以适宜调整,例如,可以在室温~37℃、优选为20~37℃、pH5.0~7.0、优选为5.5~6.5进行30~90分钟左右、优选为60分钟左右,但不限于这些条件。
(洗涤步骤)
所述夹心法在所述捕捉步骤和/或所述标记步骤之后,优选进一步包括分离结合于所述捕捉体的抗HEV抗体、和除此以外的未结合于所述捕捉体的(即,未被捕捉的)夹杂物分离,除去所述夹杂物的洗涤步骤。作为除去所述夹杂物的方法,不特别限制,可以适宜采用现有公知的方法或依据其的方法,可列举例如,在所述捕捉体是所述被担载体固相化板的情况下,可列举从板上除去液相(上清)的方法,在所述捕捉体是所述被担载体固相化粒子的情况下,可列举将所述粒子通过离心或集磁进行回收而除去液相(上清)的方法。另外,所述洗涤步骤中可以根据需要重复洗涤液的注入和除去。作为所述洗涤液,可列举例如,中性(优选为pH6.0~9.0)的公知的缓冲液(磷酸钠缓冲液、MES、Tris、CFB、MOPS、PIPES、HEPES、联甲苯胺缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等),另外,可以添加BSA等稳定化蛋白质、表面活性剂等。
在作为本发明所涉及的检测工序使用所述夹心法的情况下,作为所述试样可以如上所述用稀释液稀释而使用,但在所述捕捉体是所述被担载体固相化粒子等的情况下,可以在其粒子悬浮介质(粒子液)中悬浮使用,进而,可以在所述试样与所述捕捉体和/或所述标记体的反应体系中适宜添加其他反应用缓冲液。作为这些粒子悬浮介质、反应用缓冲液,不特别限制,例如,各自独立地可列举公知的缓冲液(磷酸钠缓冲液、MES、Tris、CFB、MOPS、PIPES、HEPES、联甲苯胺缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等),另外,各自独立地可以添加BSA等稳定化蛋白质、血清等。
(检测步骤)
所述检测步骤中根据所述标记物质检测信号。例如,在所述标记物质是酶的情况下,通过添加与该酶对应的显色底物、发光底物使其反应而生成信号(例如,显色、发光)。由此,通过信号的有无来检测试样中的抗HEV抗体的有无,进而,在抗HEV抗体存在的情况下可以获得试样中的抗HEV抗体量作为信号量,另外,可以根据需要通过与标准试样中的信号量的比较来检查试样中的抗HEV抗体量。
<E型肝炎病毒的检查方法>
根据本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法,通过以上述的检测工序检测到的抗HEV抗体的有无作为指标,从而能够检测所述试样中有无感染E型肝炎病毒,优选为检测同一试样所来源的受检者有无感染E型肝炎病毒。另外,通过以上述的检测工序检测到的抗HEV抗体量作为指标,能够获得关于所述试样、优选为同一试样所来源的受检者中的E型肝炎病毒的感染程度(感染时期、E型肝炎的程度)的信息。因此,本发明还提供E型肝炎病毒的检查方法(以下,根据情况仅称为“检查方法”),包括用所述本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法检测受检者来源的试样中的抗E型肝炎病毒抗体的工序。
作为本发明的检查方法的方案,具体可列举例如以下方案:
包括用所述抗原多肽检测受检者来源的试样中的抗HEV抗体的检测工序、和以检测到的抗HEV抗体作为指标判定受检者是否感染HEV的判定工序的方法;
包括用所述抗原多肽检测受检者来源的试样中的抗HEV抗体的检测工序、和以检测到的抗HEV抗体作为指标挑选被预测为E型肝炎或发病E型肝炎的可能性高的受检者的挑选工序的方法(筛选方法);
包括用所述抗原多肽检测受检者来源的试样中的抗HEV抗体的检测工序、和以检测到的抗HEV抗体作为指标鉴别受检者是否患有E型肝炎的鉴别工序。
在所述各检查方法中,对于所述判定工序、挑选工序、和鉴别工序,只要在所述检测工序中在所述试样中检测到了即使一点点抗HEV抗体,就可以将该试样所来源的受检者分别作为感染了E型肝炎病毒、是E型肝炎或发病E型肝炎的可能性高、和患有E型肝炎(即,为阳性),但优选根据所检测到的抗HEV抗体量进行判定、挑选、或鉴别。例如,可以将所述检测工序中检测到的抗HEV抗体量与预先设定的截止值比较,将所述抗HEV抗体量高于所述截止值的受检者作为感染了E型肝炎病毒、是E型肝炎或发病E型肝炎的可能性高、或者患有E型肝炎。
所述“截止值”,是成为用于根据所述抗HEV抗体量进行判定的基准的预定的值,表示用于判定阳性组与阴性组的边界值。这样的截止值是根据本发明的检查方法的目的、抗HEV抗体的检测方法、受检者及试样的性质、稀释条件等而适宜设定的,因而无特别限定。例如,通过将截止值设定为比较低的值,从而能够提高检测灵敏度,即,某种程度上广泛地收集有阳性怀疑的受检者,另一方面,通过将所述截止值设定为比较高的值,从而能够更高准确度地进行所述各检查方法。
根据这样的本发明的检查方法,能够与其他肝炎相区别地提供用于对E型肝炎特异的治疗方针的确定等的信息。另外,通过特定患(包括再活化)E型肝炎的可能性高的受检者,从而能够实现早期治疗介入等。进而,作为本发明的检查方法的方案,还可列举包括用所述抗原多肽检测受检者来源的试样中的抗HEV抗体的检测工序、和以检测到的抗HEV抗体作为指标预测受检者的HEV感染时期的预测工序的方法,例如,通过作为所述探针分子适宜选择抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体,从而能够由抗HEV抗体的同种型预测受检者的HEV感染时期。此外,本发明的检查方法是辅助由医师等进行的E型肝炎的诊断的方法、或提供用于由医师等进行的E型肝炎的诊断的信息的方法。
<E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒>
本发明的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽是用于在上述本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法中使用的抗原多肽,是选自上述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)、和(4a)~(4c)中的至少1种多肽。作为本发明的抗原多肽,也包括其优选的方案,如上所述。另外,本发明的E型肝炎病毒感染检测用试剂盒是用于在上述本发明的E型肝炎病毒感染的检测方法使用的试剂盒,包含上述本发明的抗原多肽。
作为本发明的试剂盒所包含的抗原多肽,可以仅由所述抗原多肽(包括2种以上的多肽的组合)组成,也可以是包含所述抗原多肽的组合物。作为所述组合物,可以进一步含有其他成分,作为该其他成分,不特别限制,可列举例如,灭菌水、生理盐水、表面活性剂、保存剂等,可以是它们中的1种,也可以是2种以上的组合。
作为本发明的试剂盒,优选进一步包含具有所述非水溶性载体和所述探针分子的所述捕捉体。该情况下,作为所述抗原多肽,优选为所述经标记物质标记的所述标记体。另外,作为本发明的试剂盒,还优选进一步包含具备所述标记物质和所述探针分子的所述标记体,该情况下,作为所述抗原多肽,优选为担载于所述非水溶性载体的所述捕捉体。作为所述捕捉体和所述标记体,分别包括它们的优选方案在内,如上所述。另外,该情况下,作为所述捕捉体和所述标记体,各自独立地可以为固体(粉末)状也可以为溶解或分散于缓冲液的液体状(所述捕捉体的情况下例如为粒子分散液)。在为液体状的情况下,各溶液中的所述捕捉体和所述标记体的浓度不特别限定,各自独立地例如,优选为0.01~10μg/mL,更优选为0.1~5.0μg/mL,进一步优选为0.2~1.0μg/mL。
作为本发明的试剂盒,此外还可以进一步具备在ELISA、CLEIA、免疫层析等通常免疫测定方法和依据其的方法中应具备的构成。例如,在以上述的夹心法作为本发明所涉及的检测方法的原理的情况下,可以进一步包含选自用于将所述被担载体固相化的磁性珠或板;所述标记物质;所述标准试样(各浓度);对照试剂;所述粒子悬浮介质;所述反应用缓冲液;和所述洗涤液中的至少1种。另外,在所述标记物质是酶的情况下,可以进一步包含该标记物质的检测/定量所需的底物、反应停止液等。
进而,本发明的试剂盒根据需要可以具备所述稀释液、用于进行试样的前处理的前处理液;稀释用套盒;前处理的反应停止液或中和液等。另外,在作为所述夹心法采用免疫层析的情况下,可以进一步包含含有担载有所述捕捉体和/或所述标记体的区带的器件。作为所述器件,可以具备展开液衬块、吸收衬块等适合免疫层析的其他构成要素。进而,本发明的试剂盒可以进一步包含该试剂盒的使用说明书。
实施例
以下,基于实施例和比较例更具体地说明本发明,但本发明不限于以下实施例。
(制备例1)基因3型的HEV的E2s(G3E2s)基因的克隆
(1-1)利用RT-PCR的基因3型的HEV基因的克隆
对于基因3型的HEV(HEVG3、GenBank Accession No.:AB481229),通过RT-PCR进行HEV基因的克隆。即,首先,由HEVG3样品100μL(HEVG3:104拷贝左右)使用High Pure ViralRNA Kit(ロシュ社制)提取RNA(HEV-RNA)并进行纯化。将纯化后的HEV-RNA 11μL、反向引物G3AS1(2μM、序列号:5)1μL、和dNTP(各10mM)1μL分注到0.5mL管中之后,在65℃加热5分钟,在冰上迅速冷却。接着,在各管中加入RNase抑制剂(宝酒造社制)1μL、100mM DTT 1μL、5×SSIV缓冲液(インビトロジェン社制)4μL、和逆转录酶SSIV(インビトロジェン社制)1μL,制备反应液20μL。使所述反应液在50℃反应10分钟之后,在80℃加热10分钟,使酶失活,获得包含cDNA的cDNA合成反应液。
PCR中为了提高检测DNA的扩增灵敏度和特异性,使用巢式PCR法。即,首先,用2种引物进行第1次PCR(1st step PCR),接着,使用存在于该PCR产物的DNA序列的内侧的2种引物,进行第2次PCR(2nd step PCR)。1st step PCR中使用引物G3S1(序列号:6)和所述反向引物G3AS1,2nd step PCR中使用引物G3S2(序列号:7)和引物G3AS2(序列号:8)。
1st step PCR的反应液为所述cDNA合成反应液5μL、1st step PCR用的引物2种(各50pmole)各2μL、KAPATaq Extra HS RM+dye(KAPA Biosystems社制)10μL、和灭菌水3μL,总量20μL。1st step PCR反应在95℃加热3分钟,以变性:95℃30秒、退火:55℃30秒、延伸:72℃2分钟的条件进行30个循环。
2nd step PCR的反应液为1st PCR反应结束液2μL、2nd step PCR用的引物2种(各50pmole)各2μL、KAPATaq Extra HS RM+dye 9μL、和灭菌水7μL,总量20μL,与1st step PCR反应在相同的条件进行。
将2nd step PCR反应结束液10μL进行琼脂糖凝胶电泳,将以约5kbp的长度特应性地被扩增出的DNA片段使用QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社制)从琼脂糖凝胶回收,克隆到pGEM-T Easy(プロメガ社制)中,获得包含基因3型的HEV基因的ORF2的核苷酸序列的pGEM-HEV3。
(1-2)基因3型的E2s(G3E2s)基因向表达载体的克隆
以所述pGEM-HEV3作为模板,使用引物G3E2s-his452-S(序列号:9)和引物G3E2s-617-AS(序列号:10)进行PCR,扩增了编码G3E2s的DNA片段(约530bp)。引物以在扩增出的DNA片段的5’末端侧从其5’末端侧开始依次添加限制性酶EcoRI的识别序列、HIS标签,在3’末端侧从其5’末端侧开始依次添加终止密码子、限制性酶BamHI的识别序列的方式设计。利用这2种限制性酶,将扩增出的DNA片段克隆到pAT-trp-trpE表达载体(大肠杆菌trpE蛋白质表达载体、日本专利3217600号所记载的载体)的EcoRI-BamHI位点,获得包含基因3型的HEV基因的ORF2中的编码序列号3所记载的氨基酸序列中的21~186位的全长166残基的氨基酸(G3E2s)的核苷酸序列的pAT-trp-trpE-his-G3E2s(有HIS标签、trpE)。
另外,使用没有添加HIS标签的引物:引物G3E2s-452-S(序列号:11)和所述引物G3E2s-617-AS进行PCR,扩增编码G3E2s的DNA片段(约510bp)。引物以在扩增出的DNA片段的5’末端侧添加限制性酶EcoRI的识别序列,在3’末端侧从其5’末端侧开始依次添加终止密码子、限制性酶BamHI的识别序列的方式设计。利用这2种限制性酶,将扩增出的DNA片段克隆到pAT-trp-trpE表达载体的EcoRI-BamHI位点,获得包含基因3型的HEV基因的ORF2中的编码序列号3所记载的氨基酸序列中的21~186位的全长166残基的氨基酸(G3E2s)的核苷酸序列的pAT-trp-trpE-G3E2s(无HIS标签、有trpE)。
(制备例2)其他基因型的HEV的E2s基因的克隆
(2-1)基因1型的E2s(G1E2s)基因向表达载体的克隆
对于基因1型的HEV(HEVG1),将其ORF2的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列通过DNA Data Bank of Japan(DDBJ)获得(DDBJ Accession No.:D11092)。将编码获得的氨基酸序列(ORF2)的394~617位的氨基酸的核苷酸(G1E2s 394-617、序列号:12中显示序列)委托ユーロフィン·ジェノミクス社合成,获得包含序列号12所记载的核苷酸序列的pEX-A-HEV1。
以所述pEX-A-HEV1作为模板,使用引物G1E2s-his452-S(序列号:13)和引物G1E2s-617-AS(序列号:14)进行PCR,扩增编码G1E2s的DNA片段(约530bp)。引物以在扩增出的DNA片段的5’末端侧从其5’末端侧开始依次添加限制性酶EcoRI的识别序列、HIS标签,在3’末端侧从其5’末端侧开始依次添加终止密码子、限制性酶BamHI的识别序列的方式设计。利用这2种限制性酶将扩增出的DNA片段克隆到pAT-trp-trpE表达载体的EcoRI-BamHI位点,获得包含基因1型的HEV基因的ORF2中的编码序列号1所记载的氨基酸序列中的21~186位的全长166残基的氨基酸(G1E2s)的核苷酸序列的pAT-trp-trpE-his-G1E2s(有HIS标签、trpE)。
(2-2)利用RT-PCR的基因4型的HEV基因的克隆
对于基因4型的HEV(HEVG4、GenBank Accession No.:AB481227),与(1-1)同样地通过RT-PCR进行克隆。即,首先,从HEVG4样品100μL(HEVG4:104拷贝左右)使用High PureViral RNA Kit(ロシュ社制)提取RNA(HEV-RNA)并进行纯化。将纯化出的HEV-RNA 11μL、反向引物G4AS1(2μM、序列号:15)1μL、dNTP(各10mM)1μL分注到0.5mL管中,然后在65℃加热5分钟,在冰上迅速冷却。接着,在各管中加入RNase抑制剂(宝酒造社制)1μL、100mM DTT 1μL、5×SSIV缓冲液(インビトロジェン社制)4μL、和逆转录酶SSIV(インビトロジェン社制)1μL,制备反应液20μL。使所述反应液在50℃反应10分钟之后,在80℃加热10分钟,使酶失活,获得包含cDNA的cDNA合成反应液。
1st step PCR使用引物G4S1(序列号:16)和所述反向引物G4AS1,2nd step PCR使用引物G4S2(序列号:17)和引物G4AS2(序列号:18)。
1st step PCR的反应液为所述cDNA合成反应液5μL、1st step PCR用的引物2种(各50pmole)各2μL、KAPATaq Extra HS RM+dye(KAPA Biosystems社制)10μL、和灭菌水3μL,总量20μL。1st step PCR反应在95℃加热3分钟,在变性:95℃30秒、退火:55℃30秒、延伸:72℃2分钟的条件进行30个循环。
2nd step PCR的反应液为1st PCR反应结束液2μL、2nd step PCR用的引物2种(各50pmole)各2μL、KAPATaq Extra HS RM+dye 9μL、和灭菌水7μL,总量20μL,与1st step PCR反应在相同条件下进行。
将2nd step PCR反应结束液10μL进行琼脂糖凝胶电泳,将以约5kbp的长度被特应性地扩增的DNA片段使用QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社制)从琼脂糖凝胶回收,克隆到pGEM-T Easy(プロメガ社制)中,获得包含基因4型的HEV基因的ORF2的核苷酸序列的pGEM-HEV4。
(2-3)基因4型的E2s(G4E2s)基因向表达载体的克隆
以所述pGEM-HEV4作为模板,使用引物G4E2s-his445-S(序列号:19)和引物G4E2s-606-AS(序列号:20)进行PCR,扩增出编码G4E2s的DNA片段(约530bp)。引物以在扩增出的DNA片段的5’末端侧从其5’末端侧开始依次添加限制性酶EcoRI的识别序列、HIS标签,在3’末端侧从其5’末端侧开始依次添加终止密码子、限制性酶BamHI的识别序列的方式设计。利用这2种限制性酶,将扩增出的DNA片段克隆到pAT-trp-trpE表达载体的EcoRI-BamHI位点,获得包含基因4型的HEV基因的ORF2中的编码序列号4所记载的氨基酸序列中的14~175位的全长162残基的氨基酸(G4E2s)的核苷酸序列的pAT-trp-trpE-his-G4E2s(有HIS标签、trpE)。
(制备例3)多肽(E2s)的表达和纯化
使用上述制备例1~2中制作的4种各表达质粒,分别进行4种多肽:trpE-his-G3E2s、trpE-G3E2s、trpE-his-G1E2s、和trpE-his-G4E2s的表达和纯化。即,首先,将制备例1~2中制作的具有4种各表达质粒的大肠杆菌XL1-Blue接种于包含50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基40mL,在37℃培养一晚。将该培养液40mL继续接种到包含50μg/mL的氨苄青霉素的4L的M9-CA培养基(0.6%Na2HPO4、0.5%KH2PO4、0.5%NaCl、0.1%NH4Cl、0.1mM CaCl2、2mMMgSO4、0.5%酪蛋白氨基酸、0.2%葡萄糖)中,在37℃培养。当OD600=0.3时加入吲哚丙烯酸使其为终浓度40mg/L,进一步培养16小时。将该培养液离心分离,收集约12g的菌体。
接着,在所得的菌体中加入溶菌缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、30mM NaCl、5mMEDTA)60mL进行悬浮,加入溶菌酶(生化学工业社制)12mg在37℃使其反应1小时。反应后,通过超声波破碎150秒将大肠杆菌膜破碎(1),在15000rpm、30分钟、4℃的条件进行离心分离除去上清(2),获得包含由各目的核苷酸序列所编码的多肽与trpE的融合肽的不溶性级分。
接着,在所述不溶性级分中加入包含表面活性剂的洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、0.1%NP-40)55mL进行悬浮,在15000rpm、30分钟、4℃的条件下进行离心分离除去上清(3),获得经洗涤的不溶性级分。进而,在所述不溶性级分加入洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA)55mL进行再悬浮,在15000rpm、30分钟、4℃的条件下进行离心分离除去上清(4),获得经再洗涤的不溶性级分。接着,在所述经再洗涤的不溶性级分中加入可溶化缓冲液(4M脲、25mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA)55mL,获得使所述融合肽可溶化了的可溶化物(5)。
接着,将所述可溶化物装入透析袋(MWCO:10kD、スペクトラム社制)中,相对于PBS(包含0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3))在3L容量烧杯中一边搅拌,一边在4℃进行整夜透析,结果在透析袋中确认了白色的沉淀。将透析后的试样在15000rpm、30分钟、4℃的条件下进行离心分离除去沉淀(7),将上清用0.22μm的过滤膜过滤,获得粗纯化物(6)。
对于带有HIS标签的3种融合肽的粗纯化物,进一步上样到Ni柱(His GraviTrap、GEヘルスケア社制)使其捕捉之后,用500mM咪唑溶出,将所得的溶出物相对于PBS进行透析,制成纯化物。
(制备例4)Hybrid-E2s的制备
制备例3中制备的trpE-his-G1E2s和trpE-his-G4E2s的2种多肽在用所述可溶化缓冲液可溶化后的透析中产生大量的沉淀物,因此可以通过分别与不易产生沉淀物的trpE-G3E2s混合,从而作为异源二聚体(Hybrid)进行纯化。例如,将由大肠杆菌的超声波破碎物(1)用所述可溶化缓冲液使其可溶化了的trpE-G3E2s与trpE-his-G1E2s或trpE-his-G4E2s混合之后,通过透析,从而能够作为它们的异源二聚体(Hybrid-E2s)进行纯化。
(4-1)Hybrid-E2s(G3/G1-E2s)的制备
首先,将制备例3中获得的trpE-his-G1E2s的可溶化物(G1E2s-4MUrea(5))与trpE-G3E2s的可溶化物(G3E2s-4MUrea(5))以等浓度混合(1:1),获得混合液(Hyb-4MUreamix(5))。接着,对于所述混合液,与制备例3同样地相对于PBS在4℃进行整夜透析。将透析后的试样在15000rpm、30分钟、4℃的条件进行离心分离而除去沉淀(Hyb-4M-dia-ppt(7)),回收上清(Hyb-4M-dia-sup(6))。接着,将回收到的上清上样至Ni柱(His GraviTrap、GEヘルスケア社制)。此时的通过级分(Hyb-Ni-FT(8))是不具有HIS标签的trpE-G3E2s(下述图2的泳道8(III))。接着,用柱洗涤缓冲液(PBS)洗涤之后(通过级分:Hyb-Ni-Wash(9)),将用500mM咪唑溶出而得的溶出物相对于PBS进行透析,制成纯化物(Hyb-Ni-Elute(10))。
对于分子量标志物(MWM)和在各纯化阶段获得的溶液或沉淀物(5)~(10),对沉淀物在含有6M脲的PBS中使其可溶化,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将所得的电泳照片示于图2。图2中合并显示在制备例3中用可溶化缓冲液(含有4M脲)使其可溶化了的trpE-his-G1E2s的单独透析中产生的沉淀(G1E2s-4M-dia-ppt(7))的电泳结果。由于在trpE-his-G1E2s不形成异源二聚体而为单独的情况下,这样通过所述透析大部分作为沉淀物被除去(图2的泳道3(I)),因而由所述透析的上清获得的纯化物中(图2的泳道10(IV))中包含trpE-G3E2s与trpE-his-G1E2s的异源二聚体(Hybrid-E2s(G3/G1-E2s))、和trpE-his-G1E2s的二聚体(同源二聚体),但由于如前所述trpE-his-G1E2s通过所述透析大部分作为沉淀物被除去,因而可以说大部分为Hybrid-E2s。此外,trpE-his-G1E2s如果与trpE-G3E2s混合进行透析,则通过它们的接触和二聚体的形成,从而trpE-G3E2s发挥相对于trpE-his-G1E2s的分子伴侣效果。
(4-2)Hybrid-E2s(G3/G4-E2s)的制备
除了代替trpE-his-G1E2s的可溶化物(G1E2s-4MUrea(5)),使用制备例3中得到的trpE-his-G4E2s的可溶化物(G4E2s-4MUrea(5))以外,与制备例4-1同样地获得纯化物。
对于分子量标志物(MWM)和在各纯化阶段中得到的溶液或沉淀物,对沉淀物在含有6M脲的PBS中使其可溶化,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将所得的电泳照片示于图3A和图3B。在图3A中,从面向照片的左侧开始,为分子量标志物(MWM)、trpE-his-G4E2s的大肠杆菌的超声波破碎物(G4E2s-cell(1))及其离心分离上清(G4E2s-sup(2))、用包含表面活性剂的洗涤液洗涤后的离心分离上清(G4E2s-NP40(3))及其再洗涤后的离心分离上清(G4E2s-Wash(4))、用可溶化缓冲液(2M、4M、6M、或4M脲、25mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA)使其可溶化后的可溶化物(G4E2s-2M、4M、6M、4MUrera(5))、用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物的透析后的粗纯化物(G4E2s-4M-dia-sup(6))及其离心分离沉淀(G4E2s-4M-dia-ppt(7))、trpE-G3E2s的用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物(G3E2s-4MUrera(5))、trpE-his-G4E2s的用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物与trpE-G3E2s的用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物的混合液的透析后的离心分离沉淀(Hyb-dia ppt(7))和粗纯化物(Hyb-dia sup(6))。
在图3B中,从面向照片的左侧开始,为分子量标志物(MWM)、所述Hyb-dia-sup(6)、所述Hyb-dia-ppt(7)、trpE-his-G4E2s的用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物与trpE-G3E2s的用含有4M脲的可溶化缓冲液使其可溶化后的可溶化物的混合液(Hyb-4MUrea mix(5))、所述混合液的透析后上清的Ni柱通过级分(Hyb-Ni-FT(8))、Ni柱洗涤时的通过级分(Hyb-Ni-Wash(9))、Ni柱溶出物的纯化物(Hyb-Ni-Elute(10))、泳道19~21各自的2倍体积量。
如果将trpE-his-G4E2s单独透析,则大部分作为沉淀被回收(图3A的泳道10~11)。由此,同trpE-G3E2s与trpE-his-G1E2s的组合同样地,纯化物中包含trpE-G3E2s与trpE-his-G4E2s的异源二聚体(Hybrid-E2s(G3/G4-E2s))、和trpE-his-G4E2s的二聚体(同源二聚体),但可以说其大部分为Hybrid-E2s。
(制备例5)识别G1E2s和G3E2s的单克隆抗体的制作
(5-1)杂交瘤的制作
为了制作识别trpE-his-G1E2s和trpE-his-G3E2s作为抗原多肽的单克隆抗体,如下进行对小鼠的免疫。即,将在制备例3中纯化出的trpE-his-G1E2s与trpE-his-G3E2s等量混合而得的混合抗原25~100μg,与作为佐剂的TiterMax Gold(Titer Max社制)一起对BALB/c小鼠进行腹腔内施与。2周后,进行同样的追加免疫,进一步约2周后,将所述混合抗原溶解于PBS而得的溶液作为最终免疫施与尾静脉内。
在最终免疫后第3天从小鼠无菌地摘出脾脏,使用剪刀和金属网将脾脏揉碎成单个细胞,用RPMI-1640培养基洗涤3次。将对数增殖期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14用RPMI-1640培养基洗涤3次后,将该细胞与所述脾脏细胞以1:5的细胞数比混合。以200×g离心5分钟后,除去上清,一边将沉淀的细胞块缓缓混合,一边慢慢加入包含50%聚乙二醇(PEG)4000(Merk社制)的RPMI-1640培养基1mL,进一步加入RPMI-1640培养基10mL,使细胞融合。
将所得的融合细胞以200×g离心5分钟除去PEG后,悬浮于包含10%胎牛血清和次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640培养基中,接种于96孔细胞培养板。培养约10天而仅使杂交瘤增殖之后,通过ELISA法检索产生与所述混合抗原特应性地反应的单克隆抗体的克隆,获得与所述混合抗原反应的杂交瘤。通过有限稀释法进行单克隆化,建立了目的杂交瘤6株(A505、A519、A906、A907、A924、A926)。
将所建立的各杂交瘤株使用无血清培养基(Hybridoma-SFM、GIBCO社制),在37℃、5%二氧化碳中培养2~3周。将培养后的培养液施行使用了蛋白A Sephorose柱的亲和层析,纯化出所述培养液中所产生的各单克隆抗体(A505、A519、A924、和A926)。
接着,评价分别以trpE-his-G1E2s(G1E2s抗原)和trpE-his-G3E2s(G3E2s抗原)作为抗原多肽时的ELISA反应性。首先,将制备例3中纯化出的各抗原多肽以终浓度为0.5μg/mL的方式用PBS(包含0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3))进行稀释,对96孔微板(ヌンク社制)的1孔分别各分注100μL。接着,将其在4℃静置一晚后,使用PBS 0.35mL将各个孔洗涤2次。然后,将封闭液(包含0.5%酪蛋白-Na的PBS)0.35mL添加到各个孔中,进而在室温静置3小时。除去封闭液后,使微板真空干燥而准备ELISA板,在4℃保管直到使用。
接着,在所述ELISA板的各孔中分别添加在反应液缓冲液1(0.2M NaCl、1%BSA、包含0.07%酪蛋白-Na的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.3))中含有上述得到的各单克隆抗体0.2μg/mL的抗体反应液各100μL,在室温保温60分钟后,用PBS-T(含有0.05%Tween20的PBS)洗涤5次。接着,在各孔中添加在所述反应液缓冲液1中含有POD(过氧化物酶)标记抗小鼠IgG抗体(ジャクソン·イムノリサーチ社制)的标记体液并在室温保温60分钟后,用PBS-T洗涤5次。接着,在各孔中添加ELISA POD底物TMB试剂盒(ナカライテスク社制)的混合溶液各100μL,在室温、避光处使其反应30分钟反应。反应后,在各孔中添加2N硫酸溶液各100μL,以波长630nm的吸光度(OD630)作为对照,测定波长450nm的吸光度(OD450),评价ELISA反应性。
下述的表2显示分别以G1E2s抗原和G3E2s抗原作为抗原多肽时的ELISA反应性的结果。表2中,“-”表示无反应性(OD450:小于0.500),“+”表示有充分的反应性(OD450:1.000以上且小于3.000),“++”表示有强的反应性(OD450:3.000以上)。如表2所示,在以G1E2s作为抗原多肽时,对于A505以外确认了反应性。另一方面,在以G3E2s作为抗原多肽时,对于A505、A519、A924、和A926确认了反应性。
(5-2)获得单克隆抗体的同种型
将(5-1)中建立的各杂交瘤株使用无血清培养基(Hybridoma-SFM、GIBCO社制),在37℃、5%二氧化碳中培养2~3周。将培养后的培养液施行利用了蛋白A Sephorose柱的亲和层析,纯化出所述培养液中产生的各单克隆抗体(A505、A519、A924、和A926)。接着,对于纯化出的各单克隆抗体,通过利用了抗小鼠Ig各同种型抗体的同种型分型试剂盒(Zymed社制)鉴定了亚类。将结果合并在下述的表2中表示。如表2所示,确认了同种型全部为IgG,除了作为亚类IgG2b的A505以外,全部为亚类IgG1。
表2
(制备例6)生物素化E2s抗原和生物素化单克隆抗体的制作
为了将G1E2s抗原、G3E2s抗原、和Hybrid-E2s抗原、以及各单克隆抗体生物素化,使用生物素试剂(Sulfo-NHS-LC-Biotin、サーモ社制),将各个抗原/抗体用生物素修饰。即,首先,在就要使用之前将生物素试剂1mg溶解于超纯水180μL,制备10mM生物素溶液。接着,将溶解于1mL的PBS中的、制备例3中制备的trpE-his-G1E2s(G1E2s抗原)和trpE-his-G3E2s(G3E2s抗原)、制备例4中制备的Hybrid-E2s(G3/G1-E2s)(Hybrid-E2s抗原、Hyb-Ag)、以及制备例5中制备的各单克隆抗体各1mg、分别与所述10mM生物素溶液66.7μL混合,在室温保温30分钟。接着,使用PD-10将未反应的生物素试剂用PBS脱盐,纯化出经生物素修饰的各E2s抗原(生物素化E2s抗原)和各单克隆抗体(生物素化抗体)。
(试验例1)Hybrid-E2s(G3/G1-E2s)的评价
在表2中,分别使用对G1E2s抗原无反应性的单克隆抗体A505与对G3E2s抗原无反应性的单克隆抗体A907的夹心ELISA、对G3E2s抗原无反应性的单克隆抗体A906与对G1E2s抗原和G3E2s抗原双方有反应性的单克隆抗体A924的夹心ELISA、对G1E2s抗原和G3E2s抗原双方有反应性的单克隆抗体A926与对G3E2s抗原无反应性的单克隆抗体A907的夹心ELISA、以及对G1E2s抗原和G3E2s抗原双方有反应性的单克隆抗体A924与A926的夹心ELISA,进行了制备例4中制备的Hybrid-E2s(G3/G1-E2s)(Hybrid-E2s抗原)的评价。
首先,与下述的实施例1同样地,将单克隆抗体A907和A924分别在96孔微板中固相化(对1孔各0.5μg)。接着,在各孔中分别添加所述反应液缓冲液1 90μL、和各1μg/mL的制备例3中制备的trpE-his-G1E2s(G1E2s抗原)、trpE-his-G3E2s(G3E2s抗原)、或制备例4中制备的所述Hybrid-E2s抗原10μL(抗原的终浓度各0.1μg/mL),在室温使其反应1小时。反应后,使用洗涤液(含有0.05%Tween20的PBS)0.35mL,将各个孔洗涤5次。然后,将在所述反应液缓冲液1中含有制备例6中制作的各生物素化单克隆抗体(0.2μg/mL)的标记体液,以成为下述的表3所示的组合的方式,在所述板的孔中分别添加各100μL,在室温使其反应1小时。接着,用所述洗涤液洗涤5次后,在各孔中分别添加将经POD标记的链霉抗生物素蛋白(500unit/mL)(SA-POD、ロシュ社制)稀释5000倍而制备的标记体液100μL,在室温使其反应30分钟。5次洗涤液后,添加ELISA POD底物TMB试剂盒(ナカライテスク社)的混合溶液100μl,在室温、避光处使其反应30分钟。反应后,将2N硫酸溶液100μL添加在各个孔中,以波长630nm的吸光度(OD630)作为对照,测定波长450nm的吸光度(OD450)。以用以下式:OD450-OD630计算出的值作为测定值,示于下述的表3中。此外,表3中也显示各测定值的S/N值(将各测定值除以未添加各抗原时的OD450-OD630的值(空白)而得的值)。在表3的“(反应性)”栏中,“-”表示无反应性(测定值:小于0.100),“+”表示有充分的反应性(测定值:0.100以上且小于1.000),“++”表示有强的反应性(测定值:1.000以上)。
表3
如表3所示,在作为仅与G3E2s抗原特应性地反应的组合的单克隆抗体A505与A907的夹心ELISA、以及作为仅与G1E2s抗原特应性地反应的组合的单克隆抗体A906与A924的夹心ELISA的任意者中,均与Hybrid-E2s抗原反应,因此确认了Hybrid-E2s抗原由G3E2s抗原和G1E2s抗原构成。
(试验例2)HEV阳性/阴性样本的利用各测定系统的反应性的确认
(实施例1)IgM测定系统
将通过市售或现有公知的方法生成的抗人IgM抗体以终浓度为5μg/mL的方式用PBS(包含0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3))稀释,对96孔微板(ヌンク社制)的1孔分别分注各100μL。接着,将其在4℃静置一晚后,使用PBS 0.35mL将各个孔洗涤2次。然后,将封闭液(包含0.5%酪蛋白-Na的PBS)0.35mL添加到各个孔中,进一步在室温静置3小时。除去封闭液后,使微板真空干燥而准备抗人IgM抗体固相化板,在4℃保管直到使用。
使用该微板,对于从TRINA社购入的由包含E型肝炎患者血浆的人血浆组成的样本组(16样本),测定样本中的HEV IgM抗体效价。即,在所述抗人IgM抗体固相化板上添加包含50mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、1mM EDTA、2%BSA、KLG 20ppm、和2%明胶的反应液缓冲液2 90μL、和用所述反应液缓冲液2稀释了10倍的各样本10μL,在室温使其反应1小时。反应后,使用洗涤液(含有0.05%Tween20的PBS)0.35mL,将各个孔洗涤5次。然后,将制备例6中制备的3种生物素化E2s抗原(1mg/mL)的各5000倍稀释物(稀释液:反应液缓冲液2)各100μL,添加到所述抗人IgM抗体固相化板的各孔中,在室温使其反应1小时。接着,用所述洗涤液洗涤后,在各孔中,将经碱性磷酸酶(ALP)标记了的链霉抗生物素蛋白(0.2mg/mL)(SA-ALP、サーモ社制)稀释5000倍而制备的标记体液100μL添加到各个孔中,在室温使其反应30分钟。接着,用所述洗涤液洗涤后,添加包含AMPPD(3-(2’-螺旋金刚)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷·2钠盐)的ルミパルス(注册商标)底物液(富士レビオ社制)100μL,在室温避光处使其反应20分钟。反应后,使用ルミパルス(注册商标)L-2400(富士レビオ社制)测量通过ALP的催化作用而AMPPD被分解而放出的、在波长463nm有极大吸收的光的发光强度(计数),作为测定结果(样本中的HEV IgM抗体效价)。将各样本中的测定结果示于下述的表4。此外,表4所示的结果表示二次测定的平均值。
(比较例1)IgM测定系统
利用使用了基因1型的HEV基因的ORF2(DDBJ Accession No.:D11092)所编码的氨基酸的394~606位作为重组HEV抗原多肽的市售的抗HEV-IgM ELISA试剂盒,通过使用作为捕捉体固相化了抗IgM抗体的板、作为标记体经POD标记的所述重组HEV抗原多肽的ELISA法,测定与实施例1同样的样本组。对于由POD与过氧化氢和四甲基联苯胺(TMBZ)底物的反应中游离的TMBZ氧化物产生的显色,以波长630nm的吸光度(OD630)作为对照,测定波长450nm的吸光度(OD450),将通过以下式:OD450-OD630计算出的值作为样本中的HEV IgM抗体效价。
(比较例2)IgA测定系统
利用使用了基因4型的HEV基因的ORF2(DDBJ/GenBank/EMBL Accession No.:AB082545)所编码的氨基酸的111~660位作为重组HEV抗原多肽的市售的抗HEV-IgA ELISA试剂盒,通过使用作为捕捉体固相化了所述重组HEV抗原多肽的板、作为标记体经POD标记的抗人IgA抗体的ELISA法,测定与实施例1同样的样本组。对于由POD与过氧化氢和四甲基联苯胺(TMBZ)底物的反应中游离的TMBZ氧化物产生的显色,以波长630nm的吸光度(OD630)作为对照,测定波长450nm的吸光度(OD450),将通过以下式:OD450-OD630计算出的值作为样本中的HEV IgA抗体效价。
将实施例1中测定得到的测定结果(3种)和比较例1~2中测定得到的测定结果归纳于下述的表4。比较例1的截止值通过以下式:(阴性对照(不含有IgM类抗HEV抗体的样品)的平均值)+0.26计算出,比较例2的截止值通过以下式:(阳性对照(含有IgA类抗HEV抗体的样品)的平均值-阴性对照(不含有IgA类抗HEV抗体的样品)的平均值)×0.5计算出。实施例1的截止值应用另外由从TRINA社购入的不含肝炎患者血浆的人血浆组成的样本组(阴性样本:n=40)的平均值+8SD。表4的实施例1中,“-”表示阴性(小于截止值),“+”表示阳性(截止值以上、且小于截止值×3),“++”表示强的阳性(截止值×3以上、且小于截止值×6),“+++”表示特别强的阳性(截止值×6以上、且小于截止值×30),“++++”表示极强的阳性(截止值×30以上)(在下述的表5的实施例2中相同)。另外表4的比较例1和2中,“-”表示阴性(小于截止值),“+”表示阳性(截止值以上、且小于截止值×3),“++”表示强的阳性(截止值×3以上)(在下述的表5的比较例1和2中相同)。
表4
在表4中,No.3、No.5、No.16的3个样本是HEV感染阴性样本。其他样本在任一测定系统显示反应。首先,如果与IgM测定系统比较,则在任意样本中,利用了G1E2s抗原、G3E2s抗原、或Hybrid-E2s抗原的实施例1的测定系统与比较例1的测定系统相比反应性高,特别对于No.4、No.8、No.10、No.12、No.13、No.14的6个样本,实施例1的任意者均为阳性,与此相对在比较例1变成阴性(假阴性)。
进而,即使在实施例1中,与单独使用G1E2s抗原或G3E2s抗原的情况相比,使用了作为它们的异源二聚体的Hybrid-E2s抗原的情况下,对在至少一方的抗原单独为阴性的样本显示高的反应性(No.10),进而对在任意抗原中对单独一方为阴性的检验也显示反应性(No.14),由此确认了检测出用单独的抗原多肽不能检测的阳性样本的协同效果。
接着,如果与IgA测定系统比较,则在任意样本中,利用了G1E2s抗原、G3E2s抗原、或Hybrid-E2s抗原的实施例1的测定系统都与比较例2的测定系统相比反应性高,特别对于No.4、No.7、No.8、No.10~12、No.14、No.15的8个样本,实施例1任意者均为阳性,与此相对,在比较例2中变为阴性(假阴性)。其中,IgA由与IgM不同的免疫机制产生,因而难以直接比较,考虑显示了IgM与IgG的中间的反应性。
(实施例2)IgG测定系统
将制备例3中制备的trpE-his-G3E2s(G3E2s抗原)以终浓度为0.5μg/mL的方式用PBS稀释,对96孔微板的1孔分注各100μL。接着,将该微板在4℃静置一晚后,使用PBS0.35mL将各个孔洗涤2次。然后,将与实施例1相同的封闭液0.35mL添加在各个孔中,进而在室温静置3小时。除去封闭液后,使微板真空干燥而准备G3E2s抗原固相化板,在4℃保管直到使用。
使用该微板,对于与实施例1相同的样本组,测定样本中的HEV IgG抗体效价。即,在所述G3E2s抗原固相化板中添加所述反应液缓冲液290μL、和用所述反应液缓冲液2稀释了10倍的各样本10μL,在室温使其反应1小时。反应后,使用与实施例1相同的洗涤液0.35mL,将各个孔洗涤5次。然后,将经POD标记的抗人IgG抗体(1mg/mL)的5000倍稀释物(稀释液:反应液缓冲液2)各100μL分别添加在各个孔中,在室温使其反应1小时。接着,用所述洗涤液洗涤5次后,在各孔中添加ELISA POD底物TMB试剂盒(ナカライテスク社制)的混合溶液100μL,在室温/避光处使其反应30分钟。反应后,将2N硫酸溶液100μL添加在各个孔,以波长630nm的吸光度(OD630)作为对照,测定波长450nm的吸光度(OD450),将用以下式:OD450-OD630计算出的值作为样本中的HEV IgG抗体效价。
将实施例2中测定得到的结果示于下述的表5。实施例2的截止值以另外由从TRINA社购入的不包含E型肝炎患者血浆的人血浆组成的样本组(阴性样本:n=40)的平均值作为对照,以S/N比计为约10倍(0.400)。表5中合并显示各样本的比较例1~2中的结果。
表5
与表4所示结果同样地,No.3、No.5、No.16的3个样本是HEV感染阴性样本,进而HEV-IgG阴性样本在No.10、No.14的2个样本中确认了。其他样本在任意测定系统中显示反应。如表5所示那样,在IgG测定系统中,利用了G3E2s抗原的实施例2的测定系统与比较例1的测定系统相比反应性高,另外,与实施例2同样地,与以抗原作为捕捉体的比较例2的测定系统相比反应性也高。
产业可利用性
根据本发明,能够提供与现有的方法相比能高灵敏度地检测抗E型肝炎病毒抗体的E型肝炎病毒感染的检测方法、用于在该检测方法中使用的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽和试剂盒。
序列表自由文本
序列号:5
<223>反向引物G3AS1
序列号:6
<223>引物G3S1
序列号:7
<223>引物G3S2
序列号:8
<223>引物G3AS2
序列号:9
<223>引物G3E2s-his452-S
序列号:10
<223>引物G3E2s-617-AS
序列号:11
<223>引物G3E2s-452-S
序列号:12
<223>G1E2s 394-617
序列号:13
<223>引物G1E2s-his452-S
序列号:14
<223>引物G1E2s-617-AS
序列号:15
<223>反向引物G4AS1
序列号:16
<223>引物G4S1
序列号:17
<223>引物G4S2
序列号:18
<223>引物G4AS2
序列号:19
<223>引物G4E2s-his445-S
序列号:20
<223>引物G4E2s-606-AS 。
Claims (11)
1.E型肝炎病毒感染的检测方法,包括以选自下述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)和(4a)~(4c)中的至少1种多肽作为抗原多肽来检测试样中的抗E型肝炎病毒抗体的检测工序,
(1a)由包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(1b)由在包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(1c)由与包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(2a)由包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(2b)由在包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(2c)由与包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(3a)由包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(3b)由在包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(3c)由与包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(4a)由包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(4b)由在包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(4c)由与包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽。
2.根据权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,以选自所述(3a)~(3c)中的至少1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合作为所述抗原多肽。
3.根据权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,以由选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)和(4a)~(4c)中的任意1种多肽组成的二聚体作为所述抗原多肽。
4.根据权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,所述抗E型肝炎病毒抗体的同种型为IgM。
5.根据权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法,
所述检测工序是使所述试样、与捕捉体和标记体接触的工序,
所述捕捉体具备非水溶性载体和能与抗E型肝炎病毒抗体结合的探针分子,并且
所述标记体具备标记物质和所述抗原多肽。
6.E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是用于权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法的抗原多肽,并且是选自下述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)、(3a)~(3c)和(4a)~(4c)中的至少1种多肽,
(1a)由包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(1b)由在包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(1c)由与包含序列号1所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号1所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(2a)由包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(2b)由在包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(2c)由与包含序列号2所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号2所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(3a)由包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(3b)由在包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(3c)由与包含序列号3所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号3所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽,
(4a)由包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列组成的多肽,
(4b)由在包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽,
(4c)由与包含序列号4所记载的氨基酸序列中的28~175位的氨基酸、且全长为序列号4所记载的氨基酸序列中的200个残基以下的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列组成的多肽。
7.根据权利要求6所述的E型肝炎病毒感染检测用抗原多肽,是选自所述(3a)~(3c)中的至少1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)和(4a)~(4c)中的至少1种多肽的组合。
8.根据权利要求6所述的抗原多肽,是由选自所述(3a)~(3c)中的任意1种多肽、与选自所述(1a)~(1c)、(2a)~(2c)和(4a)~(4c)中的任意1种多肽组成的二聚体。
9.根据权利要求6所述的抗原多肽,是经标记物质标记的标记体。
10.E型肝炎病毒感染检测用试剂盒,是用于权利要求1所述的E型肝炎病毒感染的检测方法的试剂盒,包含权利要求6~9中的任一项所述的抗原多肽。
11.根据权利要求10所述的E型肝炎病毒感染检测用试剂盒,进一步包含具备非水溶性载体和能与抗E型肝炎病毒抗体结合的探针分子的捕捉体。
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