JP2024022080A - ポリペプチド、抗ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗ｅ型肝炎ウイルス抗体及びｅ型肝炎ウイルスの同時検出方法、及びキット - Google Patents

Abstract

【課題】抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出、特に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出を十分に高感度で行うことが可能なポリペプチドを提供すること。【解決手段】下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されてよい、少なくとも１種のポリペプチド。（ａ）それぞれ配列が異なる、ある特定の４種のアミノ酸配列のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｂ）前記ある特定の４種の配列番号のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、その配列番号に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド【選択図】なし

Description

本発明は、ポリペプチド、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法、及びキットに関し、より詳しくは、新規ポリペプチド、それを抗原ポリペプチドとして用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、並びに、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法、さらには、これらの検出方法に用いるキットに関する。

Ｅ型肝炎は、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ）によって惹き起こされる急性又は劇症の肝炎であり、その死亡率はＡ型肝炎の約１０倍ともいわれ、妊婦での死亡率は２０％に達するという報告もある。Ｅ型肝炎は、主に、インドやアジア、アフリカ、中南米等で散発的に流行することが知られているが、これ以外の地域においても、近年では食の多様化に伴って、ＨＥＶに汚染された食物（例えば、ブタ、イノシシ、シカ等の食肉）の非加熱での経口摂取による発症が強く疑われる事例も報告されている。また、輸血後感染や肝炎の再活性化の例も散見されるようになっていることから、被験者においてＨＥＶ感染の有無を検出する検査の需要は年々高まっている。

従来、被験者におけるＨＥＶ感染の検出には、ＰＣＲの手法によって、被験者の血清中のＨＥＶ遺伝子を検出する方法がとられていた。しかしながら、血清中のＨＥＶ遺伝子は、ＨＥＶ感染後、約２週間～１ヶ月の限られた期間でのみ検出可能であるため、かかる期間外での検出は困難であった。

そのため、現在、臨床応用されている方法の主流は、ＨＥＶを基に合成したＨＥＶ抗原ポリペプチドで被験者における抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＥＶ抗体）を検出することによって、間接的にＨＥＶ感染を検出する方法である。抗ＨＥＶ抗体の産生は、例えば、ＩｇＡクラス又はＩｇＭクラスでは、ＨＥＶ感染後、約２～５ヶ月迄持続する。

このような抗ＨＥＶ抗体の検出方法やそれに用いる試薬としては、例えば、組み換えＨＥＶ抗原ポリペプチドを固相化したプレートと標識抗ヒトＩｇＡ抗体とを用いた２ステップＥＬＩＳＡでＩｇＡクラス抗ＨＥＶ抗体を検出するためのキットが株式会社特殊免疫研究所により製造販売されており、非特許文献１には、遺伝子４型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＢ０８２５４５）にコードされるアミノ酸の１１１～６６０番目を組み換えＨＥＶ抗原ポリペプチドとして抗ＨＥＶ抗体を検出することが記載されている。

また、前記抗ＨＥＶ抗体の検出方法に用いる試薬としては、標識組み換えＨＥＶ抗原ポリペプチドと抗ヒトＩｇＭ抗体の固相化プレートとを用いた２ステップＥＬＩＳＡでＩｇＭクラス抗ＨＥＶ抗体を検出するためのキット「ＨＥＶ－ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ」もＷａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．により製造販売されており、特表２００４－５２５６１３号公報（特許文献１）には、遺伝子１型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２（ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ１１０９２）にコードされるアミノ酸配列に相当する配列の３９４～６０６番目のポリペプチド断片を含むＨＥＶ感染診断用キットが記載されている。

さらに、現在、臨床応用されている他の方法としては、抗ＨＥＶ抗体によってＨＥＶを検出する方法も挙げられ（Ｚｈａｎｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，Ｎｏ．４，２００３年，ｐ．５１８－５２６（非特許文献２））、例えば、標識抗ＨＥＶモノクローナル抗体と抗ＨＥＶポリクローナル抗体の固相化プレートとを用いた２ステップＥＬＩＳＡでＨＥＶを検出するためのキット「ＨＥＶ－Ａｇ ＥＬＩＳＡ」がＷａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．により製造販売されている。

ＨＥＶ感染を検出するにあたり、感染後直ぐには、先ずウイルス粒子の産生が先行して、抗ＨＥＶ抗体はまだ産生されずほとんど検出されない。そのため、この段階では、ＨＥＶを検出することが求められる。他方、感染後暫くして、ＩｇＭ抗体等の抗ＨＥＶ抗体が産生され始めると、ＨＥＶは当該抗体と抗原抗体複合体を形成等するため、ＨＥＶが検出されにくくなる。そのため、この段階では、抗ＨＥＶ抗体を検出することが求められる。したがって、ＨＥＶ感染を、漏れなく、かつ、早期から検出するためには、ＨＥＶの検出と共に、抗ＨＥＶ抗体の検出も行うことが必要である。

しかしながら、従来の検出方法では、上記のように抗ＨＥＶ抗体とＨＥＶとを別々の検出系でそれぞれ検出する必要があった。例えば、従来のＨＥＶ検出キット「ＨＥＶ－Ａｇ ＥＬＩＳＡ」では、抗ＨＥＶ抗体検出キットに使用されている組み換えＨＥＶ抗原ポリペプチドを用いて前記抗ＨＥＶモノクローナル抗体を取得しているため、例えば、両キットに含まれる抗ＨＥＶモノクローナル抗体と組み換えＨＥＶ抗原ポリペプチドとを同一の反応系で同時に用いると、これらが互いに結合してしまい、試料中の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶを正しく検出することができない。

抗体と抗原とを同時に検出する方法としては、抗体検出系で検出対象の抗体を認識する検出用及び／又は捕捉用の抗原ポリペプチドの領域と、抗原検出系で検出用及び／又は捕捉用の抗体に認識される検出対象の抗原ポリペプチドの領域とを、異なる領域とする方法が一般に知られている。しかしながら、ＨＥＶでは、産生される大部分の抗ＨＥＶ抗体が結合可能な領域が、そのカプシドタンパク質（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の表面にある領域に限られるため、検出用及び／又は捕捉用の抗原ポリペプチドの領域と検出対象の抗原ポリペプチドの領域とで異なる領域を設定することは、感度及び特異度等の性能の観点から困難である。

特表２００４－５２５６１３号公報

Ｍｉｚｕｏ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｏｐｌ．，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．９，２００２年，ｐ．３２０９－３２１８ Ｚｈａｎｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，Ｎｏ．４，２００３年，ｐ．５１８－５２６

本発明は上記従来技術が有する課題に鑑みてなされたものであり、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＥＶ抗体）の検出、特に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の同時検出を十分に高感度で行うことが可能なポリペプチド、それを用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法、並びに、これらの検出方法に用いるキットを提供することを目的とする。

本発明者らは、抗ＨＥＶ抗体の検出方法、すなわち、ＨＥＶで抗ＨＥＶ抗体を検出することによってＨＥＶ感染を検出する方法（抗ＨＥＶ抗体検出方法）において、前記ＨＥＶについて検討するうち、ＨＥＶの変異株の中から、特異的な変異株を見出した。この変異株は、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするカプシドタンパク質（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の突起を形成するＰドメインのうちのウイルス粒子表面に露出するＥ２ｓドメインをＨＥＶ抗原ポリペプチドとして、試料中の抗ＨＥＶ抗体を検出する方法において、当該変異株のＥ２ｓドメインを抗原ポリペプチドとしても、試料に対して野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）の株のＥ２ｓドメインを抗原ポリペプチドとした場合と同等の検出感度を有するものであった。そこで、本発明者らが上記変異株のＥ２ｓドメインについてさらに詳細に検証したところ、上記変異株は、ＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のヌクレオチド配列において、これがコードするアミノ酸配列の第４９６番目のアスパラギン酸（Ｄ）に対応するヌクレオチド配列（５’－ｇａｕ）が、グリシン（Ｇ）に対応するヌクレオチド配列（５’－ｇｇｕ）に点変異したものであった。

そのため、本発明者らは、この位置のアスパラギン酸（Ｄ４９６）に点変異を導入したアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原ポリペプチドとして用い、これを基に取得した抗体と組み合わせることにより、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出が可能になると考えた。かかる知見に基づいて、本発明者らは、前記位置（Ｄ４９６）に点変異を含むＥ２ｓドメインの一部、より具体的には、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｇ３Ｅ２ｓ）において、同アミノ酸配列内のＤ４９６に対応するアスパラギン酸（配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸）が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む新規のポリペプチドを作製した。また、野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）のＥ２ｓドメインの一部、より具体的には、遺伝子１型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列のうち、配列番号５に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｇ１Ｅ２ｓ）を抗原として調製したモノクローナル抗体の中から、野生型のＧ１Ｅ２ｓやＧ３Ｅ２ｓには結合するが、前記点変異を導入した新規のポリペプチドには結合しない抗体を得た。さらに、これらと、抗ＨＥＶ抗体検出のための抗体（例えば、抗ＩｇＭ抗体）とを組み合わせることにより、抗ＨＥＶ抗体の検出とＨＥＶの検出とを、互いに阻害することなく、かつ、従来の個別の検出方法と同等の十分に高い感度で、同一の反応系で同時に行えることを見出した。

さらに、上記配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目のアミノ酸配列は遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の一部であるが、かかる配列は１型～４型の遺伝子型において同一性が高く、同配列内のＤ４９６に対応するアミノ酸も全遺伝子型において共通してアスパラギン酸である。したがって本発明者らは、上記点変異を導入したポリペプチドを用い、これを基に取得した抗体と組み合わせることによって、全遺伝子型において抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。

［１］
下記（１ａ）～（１ｃ）、（２ａ）～（２ｃ）、（３ａ）～（３ｃ）、及び（４ａ）～（４ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするポリペプチド。
（１ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（３ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（３ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（３ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（４ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（４ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（４ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。

［２］
（１ａ）～（１ｃ）、（２ａ）～（２ｃ）、（３ａ）～（３ｃ）、及び（４ａ）～（４ｃ）のポリペプチドにおいて、前記置換アミノ酸が、それぞれ独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、又はスレオニンである、［１］に記載のポリペプチド。

［３］
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法に用いるための抗原ポリペプチドである、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。

［４］
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法に用いるためのキットであり、
抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する抗原ポリペプチドを含み、
前記抗原ポリペプチドが［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のポリペプチドである、キット。

［５］
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスを同時に検出する方法に用いるためのキットであり、
抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体と、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する抗原ポリペプチドと、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第２の抗体と、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第３の抗体と、を含み、
前記抗原ポリペプチドが［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のポリペプチドであり、
第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体である、キット。

［６］
前記抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体のアイソタイプがＩｇＭである、［４］又は［５］に記載のキット。

［７］
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法であり、
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する検出工程を含み、
前記抗原ポリペプチドが［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のポリペプチドである、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。

［８］
前記検出工程が、前記試料と、第１の捕捉体と、第１の検出体と、を接触させる工程であり、
第１の捕捉体が、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
第１の検出体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの他方を備えるものである、［７］に記載の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。

［９］
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスを同時に検出する方法であり、
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体及び抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する第１の検出と、前記試料中のＥ型肝炎ウイルスに、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第２の抗体及びＥ型肝炎ウイルスに対する第３の抗体を結合させてＥ型肝炎ウイルスを検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程を含み、
前記抗原ポリペプチドが［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のポリペプチドであり、
第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体である、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法。

［１０］
前記検出工程が、前記試料と、第１の捕捉体と、第１の検出体と、第２の捕捉体と、第２の検出体と、を接触させる工程であり、
第１の捕捉体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
第１の検出体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの他方を備えるものであり、
第２の捕捉体が、第２の抗体及び第３の抗体のうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
第２の検出体が、第２の抗体及び第３の抗体のうちの他方を備えるものである、［９］に記載の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法。

本発明によれば、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出、特に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出を十分に高感度で行うことが可能なポリペプチド、それを用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法、並びに、これらの検出方法に用いるキットを提供することが可能となる。

配列番号５～８に記載の、１型～４型の遺伝子型（Ｇｅｎ１～Ｇｅｎ４）のアミノ酸配列を示す図である。

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。

＜ポリペプチド＞
本発明のポリペプチドは、下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、その配列番号に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、その配列番号に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドである。なお、本発明において、アミノ酸配列において「番目」と数を示すときには、Ｎ末端側からのアミノ酸残基の数を示すものとする。

本発明のポリペプチドは、下記の本発明の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法や、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法に用いるための抗原ポリペプチドとして好適に用いることができる。

本発明のポリペプチドは、典型的には、（ａ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわち、
（１ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（４ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド（以下、場合により「ポリペプチド（ａ）」という）である。

配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸を置換する置換アミノ酸としては、特に制限されないが、分子側鎖が比較的小さいためにポリペプチドの免疫原性や抗原性に及ぼす影響がより小さくなる傾向にある観点から、配列番号１～４においてそれぞれ独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、又はスレオニンであることが好ましく、グリシン、アラニン、又はバリンであることがより好ましい。

ポリペプチド（ａ）のアミノ酸配列の長さとしては、配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の長さである１４７残基あればよいが、通常、１４７～２６７残基であり、１４７～２２９残基であることが好ましく、１４７～２０９残基であることがより好ましく、１４７～１６６残基であることがさらに好ましい。このときのポリペプチド（ａ）としては、配列番号５～８のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの、それぞれ配列番号１～４に記載のアミノ酸配列を含む配列であることが好ましい。

このようなポリペプチド（ａ）としては、例えば、
（１ａ’）配列番号５に記載のアミノ酸配列のうちの配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む１４７～２２９残基（より好ましくは１４７～１６６残基）を含み、かつ、配列番号５に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２ａ’）配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちの配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む１４７～２２９残基（より好ましくは１４７～１６６残基）を含み、かつ、配列番号６に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３ａ’）配列番号７に記載のアミノ酸配列のうちの配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む１４７～２２９残基（より好ましくは１４７～１６６残基）を含み、かつ、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（４ａ’）配列番号８に記載のアミノ酸配列のうちの配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む１４７～２２９残基（より好ましくは１４７～１６６残基）を含み、かつ、配列番号８に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドが挙げられる。

ここで、アミノ酸配列において、特定のアミノ酸に「対応する」アミノ酸とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒやＣｌｕｓｔａｌＷ等）を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））アミノ酸配列を整列させた際に、前記特定のアミノ酸（対照のアミノ酸（アミノ酸残基）、例えば、配列番号５～８のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸や、配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸）と同位置になるアミノ酸を示す。

配列番号５に記載のアミノ酸配列は、遺伝子１型のＨＥＶのＯＲＦ２（ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ１１０９２）がコードするアミノ酸配列の第４３２～６６０番目であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、同遺伝子１型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４５６～６０２番目であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸は、同遺伝子１型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目のアスパラギン酸、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸である。

配列番号６に記載のアミノ酸配列は、遺伝子２型のＨＥＶのＯＲＦ２（ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｍ７４５０６）がコードするアミノ酸配列の第４３２～６６０番目であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、同遺伝子２型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４５６～６０２番目であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸は、同遺伝子２型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目のアスパラギン酸、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸である。

配列番号７に記載のアミノ酸配列は、遺伝子３型のＨＥＶのＯＲＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＢ４８１２２９）がコードするアミノ酸配列の第４３２～６６０番目であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列は、同遺伝子３型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４５６～６０２番目であり、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸は、同遺伝子３型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目のアスパラギン酸、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸である。

配列番号８に記載のアミノ酸配列は、遺伝子４型のＨＥＶのＯＲＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＢ４８１２２７）がコードするアミノ酸配列の第４３２～６６０番目であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、同遺伝子４型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４５６～６０２番目であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸は、同遺伝子４型のＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目のアスパラギン酸、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列の第６５番目のアスパラギン酸である。

配列番号１～４に記載のアミノ酸配列は、典型的には、ＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするカプシドタンパク質の突起を形成するＰドメインのうち、前記ＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の４５９～６０６番目のアミノ酸からなるＥ２ｓドメインと重複する領域である。

図１に、Ｇｅｎ１～Ｇｅｎ４として、配列番号５～８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ示す。また、図１中、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列に対応する領域を点線で囲んで示す。さらに、配列番号５～８に記載のアミノ酸配列の第２１～１８６番目のアミノ酸配列間の同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を下記の表１に示す。図１及び表１に示すように、１型～４型の遺伝子型間におけるアミノ酸同一性は高く、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列の第４１番目（ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目）のアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ４１（本明細書中、場合により「Ｄ４９６」ともいう））で共通である。

また、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、前記ポリペプチド（ａ）のアミノ酸配列情報又はそれをコードするヌクレオチド配列情報が得られた場合、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を用いてその配列を改変し、ポリペプチド（ａ）の改変体を調製することもできる。

したがって、本発明のポリペプチドの態様には、（ｂ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、その配列番号に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわち、
（１ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（４ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド（以下、場合により「ポリペプチド（ｂ）」という）も含まれる。

ここで、アミノ酸配列において、「置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸（アミノ酸残基）が、置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、これらのうちの２種以上の組み合わせがなされたアミノ酸配列であることを示す。また、「複数個」とは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個の整数であることを示す。１若しくは複数個とは、好ましくはアミノ酸（アミノ酸残基）が１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、特に好ましくは２個以下である。

また、本発明のポリペプチドの態様には、（ｃ）配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、その配列番号に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわち、
（１ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（４ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド（以下、場合により「ポリペプチド（ｃ）」という）も含まれる。

なお、アミノ酸配列の相同性という場合には、被対象のアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列とをアミノ酸配列解析ソフトウェア等を用いて整列させた際に、被対象のアミノ酸配列上の被対象アミノ酸と同列になる対象アミノ酸が、前記被対象アミノ酸と同じアミノ酸であっても、前記被対象アミノ酸と同じ性質を持つアミノ酸であってもよい。アミノ酸配列の同一性という場合には、被対象のアミノ酸配列上の被対象アミノ酸と同列になる対象アミノ酸は、前記被対象アミノ酸と同じアミノ酸である。同じ性質を持つアミノ酸のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られており、例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）；中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。

このようなアミノ酸配列の相同性及び同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，１９９０年、ｐ．４０３－４１０）を用いて決定することができる。また、前記ポリペプチド（ａ）のアミノ酸配列との相同性は、８０％以上であればよいが、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。より好ましくは、同一性で、８０％以上であればよいが、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。

前記ポリペプチド（ｂ）及び前記ポリペプチド（ｃ）としては、下記の本発明の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法や、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法に用いるための抗原ポリペプチドとして用いるためには、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＥＶ抗体）に結合可能であることが必要である。本発明において、ポリペプチドと抗ＨＥＶ抗体との結合性は、例えば、下記の実施例に記載のように、次の方法で評価することができる。例えば、先ず、野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）のＨＥＶのＥ２ｓドメインの一部（ＷＴＥ２ｓ：例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド）と、対象のポリペプチドとに、それぞれ標識物質（例えば、ＰＯＤ）を結合させて（又は二次標識体（例えば、ＰＯＤ標識ストレプトアビジン）に結合可能な修飾（例えば、ビオチン結合）をして）、各抗原ポリペプチド（検出体）を準備する。また、抗ヒトＩｇＭ抗体を固相化したプレート（例えば、９６ウェルプレート、抗ヒトＩｇＭ抗体の終濃度：０．５μｇ／ウェル）を作製し、これにＥ型肝炎患者血漿からなる検体を添加して抗ＨＥＶ抗体を捕捉させる。次いで、前記プレートに各抗原ポリペプチドを添加して複合体（抗ヒトＩｇＭ抗体－抗ＨＥＶ抗体－抗原ポリペプチド）を形成させ、必要により前記二次標識体を結合させ、前記標識物質に応じたシグナル（例えば、ＰＯＤ基質の添加による波長４５０ｎｍにおける吸光度）を検出する。このときに対象のポリペプチドを抗原ポリペプチドとして検出されたシグナル量が、ＷＴＥ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときに比べて高ければ、又は、ＷＴＥ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときのシグナル量の６０％以上、７０％以上、又は７５％以上であれば、当該ポリペプチドは抗ＨＥＶ抗体に結合すると評価することができる。また、例えば、対象のポリペプチドを抗原ポリペプチドとして検出されたシグナル量が、ＷＴＥ２ｓを抗原ポリペプチドとして、Ｅ型肝炎患者血漿を含まないヒト血漿からなる検体群（例えば、ｎ＝１００）を用いて検出されるシグナル量により求めたカットオフ値を基準として、前記カットオフ値を超える場合にも、当該ポリペプチドは、抗ＨＥＶ抗体に結合すると評価することができる。

本発明においては、前記ポリペプチドの中でも、下記の本発明の検出方法に用いる際に、抗ＨＥＶ抗体が存在する試料をより多く検出することができる（例えば、陽性検体をより多く検出することができる）観点、及び検出感度がより高くなる（例えば、抗ＨＥＶ抗体量が少なくとも検出することができる）観点から、前記（３ａ）～（３ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド（以下、場合により「ポリペプチド（３）」という）が好ましい。ＨＥＶには、後述するように１型～４型の遺伝子型が存在することがわかっているが、従来のＨＥＶ感染検出用キットでは、遺伝子１型や遺伝子４型に由来する抗原ポリペプチドを用いている。これに対して、これまでに日本で検出されているＨＥＶは遺伝子１型、遺伝子３型、及び遺伝子４型であり、北海道では４型も散発的に検出されるものの、このうち、主流は遺伝子３型である。そのため、従来のキットでは、かなりの検体において偽陰性を生じたと考えられる。これに対して、遺伝子３型のＨＥＶに由来する前記ポリペプチド（３）を抗原ポリペプチドとすることにより、このような検出漏れの頻度を減少させることが可能となるものと本発明者らは推察する。

また、本発明のポリペプチドとしては、２種以上を組み合わせてもよく、２量体以上の多量体を形成していてもよい。

［ポリペプチドの製造方法］
本発明のポリペプチドは、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜用いて得ることができる。例えば、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド及び前記ヌクレオチドを含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種が導入された宿主細胞を培養し、前記宿主細胞に発現したポリペプチドを採取する工程を含む製造方法により、得ることができる。

より具体的には、例えば、先ず、ＨＥＶから慣行法によって配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＲＮＡを得て、ｃＤＮＡを合成する。前記ｃＤＮＡとしては、例えば、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列のアミノ酸配列を基に人工的に化学合成した合成ＤＮＡであってもよい。次いで、例えば、かかるｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸に、前記置換アミノ酸による変異が導入されるように設計したプライマーを用いて部位特異的変異導入をすることにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片又はこれを含むベクターを調製する。前記ＤＮＡ断片としては、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を基に人工的に化学合成した合成ＤＮＡであってもよい。こうして調製したＤＮＡ断片又はこれを含む発現ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させ、培養物から組み換えポリペプチドとして得ることができる。

ＨＥＶから配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドを得る方法としては、例えば、ＨＥＶから抽出したＲＮＡを基に合成したｃＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクター等のベクターと連結してｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１～４のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づいて作成したプライマーを用いて、目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、必要に応じてこれを適当なベクターと連結する方法を挙げることができる。

前記発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能で、かつ、そのヌクレオチド配列がコードするポリペプチドを宿主細胞内で発現可能な状態で含むベクターである。かかる発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２等）を基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主細胞に導入された場合、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるファージＤＮＡ（例えば、λファージ等）を基本に構築してもよい。

前記発現ベクターの構築の手順及び方法は、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。例えば、前記目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入するには、前記ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、適当なプラスミドの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して当該プラスミドに連結する方法等が採用される。前記発現ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して前記ポリペプチドを発現させるために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の他に、その発現を制御するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、ターミネーター等をコードする配列）、前記発現を制御するヌクレオチド配列以外の発現を誘導するヌクレオチド配列（例えば、ラクトースオペロン等）、及び細胞を選択するための遺伝子マーカー配列（例えば、薬剤耐性遺伝子をコードする配列）等を含んでいることが好ましい。

前記宿主細胞としては、特に制限されないが、微生物であることが好ましく、例えば、糸状菌、酵母、大腸菌、放線菌、乳酸菌などが挙げられる。前記宿主細胞としては、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。これら宿主細胞に前記ＤＮＡ断片又は発現ベクターを導入する方法としては、公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられる。

前記ポリペプチドは、前記宿主細胞に前記ＤＮＡ断片又は発現ベクターが導入された形質転換体を適当な培地で培養することにより、その培養物（例えば、培養微生物細胞）から採取することができる。前記形質転換体の培養条件としては、例えば、宿主細胞の培養条件を適用することができ、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。

前記培養物から前記ポリペプチドを採取する方法としては、適宜公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができる。例えば、前記ポリペプチドを宿主細胞（例えば、大腸菌）内で発現させ、形質転換体の培養終了後、培養細胞を破砕し、遠心分離や濾過等によって得られる不溶性画分を粗精製物として得る方法を用いることができる。さらに、この不溶性画分を、必要に応じて洗浄し、例えば、尿素、塩酸グアニジン等の変性剤によって可溶化させた後、塩析法、透析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることによって精製してもよい。或いは、精製用タグ（例えば、ＨＩＳタグ、ｔｒｐＥタグ等）を付加した前記ポリペプチドを宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させ、その粗抽出液をタグ付きタンパク質の精製用カラム（例えば、Ｎｉカラム、アフィニティーカラム等）に通した後にタグ付きのタンパク質を溶出させることで精製してもよい。これらの精製方法は、１種を用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明のポリペプチドは、例えば、ＨＩＳタグを付加して発現させることにより、Ｎｉカラムを用いて容易に精製することが可能である。また、ｔｒｐＥタグを付加して発現させることにより、発現効率を向上させたり、抗ｔｒｐＥ抗体のアフィニティーカラムを用いて精製することが可能である。本発明のポリペプチドの精製方法の一態様として、より具体的には、先ず、ＨＩＳタグを付加して発現させて得られた前記粗精製物を、必要に応じて適宜洗浄した後、可溶化させる。前記可溶化に用いる溶液としては、例えば、４～８Ｍ尿素含有溶液が好ましい。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）等で透析し、透析後の遠心上清をＮｉカラムに捕捉させた後、必要に応じて洗浄し、イミダゾール等で溶出することにより、溶出物として前記抗原ポリペプチドの精製物を得ることができる。前記溶出物には、必要に応じて前記透析を再度行なってもよい。

＜Ｅ型肝炎ウイルス感染の検出方法＞
本発明は、試料のＥ型肝炎ウイルス感染の有無を検出する方法として、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法（本明細書中、場合により「本発明の抗ＨＥＶ抗体検出方法」という）、Ｅ型肝炎ウイルスの検出方法（本明細書中、場合により「本発明のＨＥＶ検出方法」という）、並びに、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法（本明細書中、場合により「本発明の同時検出方法」という）を提供する。本明細書中、場合により、これらの方法を「本発明の検出方法」と総称する。

本発明において、「検出」には、試料中の抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶの存在の有無及び量をシグナルの有無及び量として取り出す検出に加えて、検出した抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを前記シグナル量に応じて定量又は半定量することを含む。

本発明の抗ＨＥＶ抗体の検出方法は、試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法であり、試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する検出工程（第１の検出）を含み、前記抗原ポリペプチドが上記本発明のポリペプチドである方法である。

本発明のＨＥＶ検出方法は、試料中のＥ型肝炎ウイルスを検出する方法であり、試料中のＥ型肝炎ウイルスに、Ｅ型肝炎ウイルスに対する抗体を結合させてＥ型肝炎ウイルスを検出する検出工程（第２の検出）を含む方法である。

本発明の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法は、本発明の抗ＨＥＶ抗体の検出方法とＨＥＶ検出方法とを同時に行う方法であって、
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスを同時に検出する方法であり、
試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体及び抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する第１の検出と、
前記試料中のＥ型肝炎ウイルスに、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第２の抗体及びＥ型肝炎ウイルスに対する第３の抗体を結合させてＥ型肝炎ウイルスを検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程を含み、
前記抗原ポリペプチドが上記本発明のポリペプチドであり、
第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体である方法である。

［Ｅ型肝炎ウイルス］
本発明の抗ＨＥＶ抗体検出方法においては、試料中のＥ型肝炎ウイルスに対する抗体、すなわち抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルスの存在を間接的に検出する。より具体的には、当該試料、好ましくは同試料が由来する被験者のＥ型肝炎ウイルスへの感染の有無を検出する。また、本発明のＨＥＶ検出方法においては、試料中のＥ型肝炎ウイルスを検出することにより、Ｅ型肝炎ウイルスの存在を直接的に検出する。これにより、当該試料が由来する被験者のＥ型肝炎ウイルスへの感染の有無を検出する。

「Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ；本明細書中、場合により「ＨＥＶ」という）」は、エンベロープに覆われていない小型球状粒子（直径：２７～３４ｎｍ）であり、現在、４つの遺伝子型（遺伝子１型～遺伝子４型）が知られている。そのゲノムは約７２００塩基の１本鎖ＲＮＡであり、３つのＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３）を有する。ＯＲＦ１はヘリカーゼやＲＮＡポリメラーゼ等の非構造タンパクを、ＯＲＦ２はカプシドタンパク質を、ＯＲＦ３は１１３又は１１４アミノ酸残基からなるリン酸化タンパク質を、それぞれコードしている。このうち、ＯＲＦ２は、典型的には、６６０残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、当該ポリペプチドの１２９～６０６番目のアミノ酸がカプシドタンパク質を構成し、そのＮ末端側から、ウイルス殻を形成するＳドメイン（典型的には、１２９～３１９番目のアミノ酸）；２、３、又は５量体を形成するＭドメイン（Ｍ：典型的には、３２０～４５５番目のアミノ酸）；突起を形成するＰドメイン（Ｐ：典型的には、４５６～６０６番目のアミノ酸）を備える。また、前記Ｐドメインのうち、典型的には、前記ＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の４５９～６０６番目のアミノ酸配列からなるＥ２ｓドメインは２量体を形成し、ウイルスの宿主認識に重要な役割を果たすことが報告されている（Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ Ｐａｔｈｏｇ．５，ｅ１０００５３７，２００９年）。

本発明のＨＥＶ検出方法及び同時検出方法の検出対象となるＨＥＶとしては、下記のＨＥＶに対する抗体（第２の抗体及び第３の抗体）が結合できる限り、完全なウイルス粒子でなくともよく、少なくとも前記Ｅ２ｓドメインの一部又は全部を含む構成タンパク質であってよい。

［抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体］
本発明において、「抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体（本明細書中、場合により「抗ＨＥＶ抗体」という）」は、本発明の抗ＨＥＶ抗体検出方法及び同時検出方法においてその検出対象を示し、より具体的には、試料が由来する被験者の体内において産生された抗体である。本発明に係る抗ＨＥＶ抗体は、前記ＨＥＶに特異的に結合可能な抗体であり、通常、ＨＥＶの前記Ｅ２ｓドメインの一部又は全部を認識してＨＥＶに結合する。かかる抗ＨＥＶ抗体としては、下記の抗原ポリペプチドが認識できる限り、完全な抗体でなくてもよく、抗体断片であってもよい。

本発明に係る抗ＨＥＶ抗体のアイソタイプとしては、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのうちのいずれであってもよく、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。また、前記アイソタイプとしては、それぞれ、いずれのサブクラスであってもよい。例えば、ヒトにＨＥＶが感染した場合においては、先にＩｇＭが、次いでＩｇＡが血清中に出現して数ヶ月（最大５ヶ月程度）持続するため、これらを対象とすることで感染初期段階での検出が可能である。また、ＩｇＧはこれらよりもやや遅れて出現し、より長期間持続するため、過去のＨＥＶ感染の検出も可能である。これらの中でも、下記のサンドイッチ法（例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ）を用いた際により早期に検出できる観点からはＩｇＭが好ましく、例えば、感染時期の特定等のより詳細な解析が可能となる観点からは、ＩｇＭとＩｇＧとの組み合わせが好ましいが、これらに限定されるものではない。

［被検者］
本発明において、「被検者」とは、本発明の検出方法の試料が由来する者を示し、また、下記の本発明のＥ型肝炎ウイルスの検査方法を行う対象を示す。前記被験者としては、ヒト又はヒト以外の哺乳類（ブタ、イノシシ、ウシ、シカ等）が挙げられ、好ましくはヒトである。本発明に係る被検者としては特に制限されず、ＨＥＶに感染しておらずＥ型肝炎を発症していない健常者であっても、ＨＥＶに感染しているがＥ型肝炎を発症していない者であってもよい。また、発症時期の特定等を目的とした、既にＨＥＶに感染していることが既知の患者や過去にＥ型肝炎を発症した患者であってもよい。

［試料］
本発明において、「試料」とは、本発明の検出方法の対象であり、前記試料としては、前記抗ＨＥＶ抗体及び又はＨＥＶが存在し得る試料である限り特に制限はない。一般的には、前記被検者等、対象から採取された血清、血漿、及び全血等の血液検体；尿、糞便、痰、唾液、汗、髄液、消化液、精液、リンパ液、腹水等の血液以外の体液検体；口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜等の粘膜検体；並びに各種生検検体等が挙げられる。これらの中でも、本発明に係る試料としては血液検体が好ましく、血清又は血漿がより好ましい。

これらの試料は、必要に応じて希釈液で希釈又は懸濁したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液等の緩衝液が挙げられる。また、本発明に係る試料としては、必要に応じて適宜前処理が施されたものであってもよい。前記前処理としては、粉砕、凍結、加熱、濃縮、分画、脱塩等の処理；ｐＨ調整剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤等の添加処理；精製処理等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。

［抗原ポリペプチド］
本発明の検出方法においては、上記本発明のポリペプチドを抗原ポリペプチドとして、試料中の抗ＨＥＶ抗体を検出する。本発明のポリペプチドは、これを抗原ポリペプチドとして用いても、試料中の抗ＨＥＶ抗体に対して、上記Ｄ４９６が前記置換アミノ酸で置換されていない野生型のＨＥＶ由来のポリペプチドと同等の反応性を示すため、抗ＨＥＶ抗体を十分な感度で検出することができる。さらに、本発明のポリペプチドには結合せず、かつ、試料中のＨＥＶには結合可能な抗体（第２の抗体、第３の抗体）を容易に準備することが可能となるため、本発明の同時検出方法を十分な感度で実施することができる。このような抗原ポリペプチドの態様としては、その好ましい態様も含めて、上記本発明のポリペプチドにおいて述べたとおりである。

［Ｅ型肝炎ウイルスに対する抗体］
また、本発明のＨＥＶ検出方法及び同時検出方法において、「Ｅ型肝炎ウイルスに対する抗体」とは、検出対象であるＨＥＶに対する抗体を示し、ＨＥＶに結合可能であれば特に制限されない。例えば、前記Ｅ２ｓドメインの一部又は全部を含む構成タンパクを基に従来公知の方法で作製した抗体が挙げられ、本発明のＨＥＶ検出方法を単独で行う場合においては、前記試料から調製された前記抗ＨＥＶ抗体であってもよい。

前記「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。さらに、前記「抗体」には、完全な抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ））及びこれらの重合体も含まれる。また、前記「抗体」には、免疫グロブリンの全てのクラス（アイソタイプ）及びサブクラスが含まれ、２種以上を適宜組み合わせてもよいが、ＩｇＧであることが好ましい。さらに、かかる抗体の由来としては、特に制限されず、ヒト由来の抗体、非ヒト動物由来の抗体（例えば、ウサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体であってよい。

前記ＨＥＶに対する抗体は、従来公知の方法で適宜調製することができ、ポリクローナル抗体であれば、例えば、抗原（ＨＥＶ、前記Ｅ２ｓドメインの一部又は全部又はそれを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、適宜精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ハイブリドーマ法や組み換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、例えば、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられ、組み換えＤＮＡ法としては、例えば上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、前記抗ポリペプチド抗体を組み換え抗体として産生させる手法が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ；Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ；Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。また、前記ＨＥＶに対する抗体としては、市販のものを適宜用いてもよい。

本発明の同時検出方法において、前記ＨＥＶに対する抗体は、下記の抗ＨＥＶ抗体に対する抗体（第１の抗体）はもとより、本発明に係る抗原ポリペプチドに結合しない抗体であることが必要であり、本発明に係る抗原ポリペプチドに結合しない点で本発明に係る抗ＨＥＶ抗体と異なる。本発明において、前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体は、例えば、下記の実施例に記載のように、次の方法で評価することができる。例えば、先ず、野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）のＨＥＶのＥ２ｓドメインの一部（ＷＴＥ２ｓ：例えば、配列番号５又は配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列からなるポリペプチド）と、前記抗原ポリペプチド（変異Ｅ２ｓ：例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、同アミノ酸配列内のＤ４９６に対応するアスパラギン酸が前記置換アミノ酸（例えばＧ）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド）とをそれぞれ抗原ポリペプチドとして、それぞれ固相化したプレート（例えば、９６ウェルプレート、ポリペプチドの終濃度：０．０５μｇ／ウェル）を作製する。次いで、前記プレートに、対象の抗体（例えば、０．０２μｇ／ウェル）を添加した後、対象の抗体のアイソタイプに応じた抗体（例えば、対象の抗体のアイソタイプがマウスＩｇＧであれば抗マウスＩｇＧ抗体）に標識物質を結合させた検出体（例えば、ＰＯＤ標識抗ＩｇＧ抗体）を添加して複合体（抗原ポリペプチド－抗体－検出体）を形成させ、前記標識物質に応じたシグナル（例えば、ＰＯＤ基質の添加による波長４５０ｎｍにおける吸光度）を検出する。このときに検出されたシグナル量が、ＷＴＥ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときに比べて、変異Ｅ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときの方が低ければ、より好ましくは、ＷＴＥ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときの２／５以下、１／５以下、１／２５以下、又は１／１００以下であれば、当該抗体は、前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体と評価することができる。また、例えば、前記変異Ｅ２ｓを抗原ポリペプチドとしたときに検出されたシグナル量が、ＨＥＶ以外の他のウイルス由来の抗原であってＷＴＥ２ｓのアミノ酸配列との相同性が低い（例えば４０％未満）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原ポリペプチドとして検出されるシグナル量により求めたカットオフ値を基準として、前記カットオフ値未満である場合にも、当該抗体は、前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体と評価することができる。

このような抗原ポリペプチドに結合しない抗体は、上記のＨＥＶに対する抗体の中から、例えば、上記の評価方法で前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体として評価される抗体を選択することで得ることができる。

本発明のＨＥＶ検出方法及び同時検出方法において、ＨＥＶに対する抗体として、第２の抗体及び第３の抗体としては、互いに同じであってもよいが、各抗体とＨＥＶとの結合において互いに競合しない抗体（より好ましくは、エピトープが重複しない抗体）の組み合わせであることが好ましい。このような組み合わせは、当業者であれば上記のＨＥＶに対する抗体の中から適宜選択することができる。

［抗ＨＥＶ抗体に対する抗体］
また、本発明の抗ＨＥＶ抗体検出方法及び同時検出方法において、「抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する抗体」とは、検出対象である抗ＨＥＶ抗体に対する抗体（第１の抗体）を示し、抗ＨＥＶ抗体に結合可能であれば特に制限されない。

前記「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。さらに、前記「抗体」には、完全な抗体の他、前記抗体断片及びこれらの重合体も含まれる。また、前記「抗体」には、免疫グロブリンの全てのクラス（アイソタイプ）及びサブクラスが含まれ、２種以上を適宜組み合わせてもよい。抗ＨＥＶ抗体に対する抗体（第１の抗体）としては、例えば、検出対象である抗ＨＥＶ抗体のアイソタイプに応じて、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＤ抗体から選択することができる。本発明の同時検出方法においては、抗ＨＥＶ抗体のアイソタイプがＩｇＭ抗体であって、抗ＨＥＶ抗体に対する抗体（第１の抗体）が抗ＩｇＭ抗体であることが好ましい。さらに、かかる抗体の由来としては、特に制限されず、ヒト由来の抗体、非ヒト動物由来の抗体（例えば、ウサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体であってよい。このような抗ＨＥＶ抗体に対する抗体（第１の抗体）は、従来公知の方法で適宜調製することができ、また、市販のものを適宜用いてもよい。

［検出工程］
本発明の抗ＨＥＶ抗体の検出方法では、前記試料中の抗ＨＥＶ抗体に前記抗原ポリペプチドを結合させて抗ＨＥＶ抗体を検出し（第１の検出）、本発明のＨＥＶ検出方法では、前記試料中のＨＥＶに前記ＨＥＶに対する抗体を結合させてＨＥＶを検出し（第２の検出）、本発明の同時検出方法では、第１の検出と第２の検出とを同時に行う。

本発明の検出方法において、第１の検出及び第２の検出の各方法としては、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶをそれぞれ検出することができる方法である限り特に制限されず、従来公知の方法やそれに準じた方法、又はそれらの組み合わせを適宜採用することができる。例えば、サンドイッチ法、競合法、及び免疫比濁法等の免疫学的手法や、これらの原理に準じた検出方法が挙げられ、特に制限されない。かかる検出方法では、例えば、一般的に、ＥＬＩＳＡ、デジタルＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）、ＥＣＬＩＡ（電気化学免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）等の、マイクロプレートや粒子等を担体とする方法；イムノクロマト；表面プラズモン共鳴分析法；蛍光共鳴エネルギー移動による検出方法等を採用することができる。

本発明の検出方法においては、特に第１の検出と第２の検出とを同時にかつ容易に行うことが可能である観点からは、サンドイッチ法が好ましい。以下、本発明に係る検出工程について、サンドイッチ法を例に挙げてより具体的な態様を説明する。

前記サンドイッチ法を用いる場合、本発明に係る第１の検出の態様としては、
前記検出工程（第１の検出）が、前記試料と、第１の捕捉体と、第１の検出体と、を接触させる工程であり、
第１の捕捉体が、前記抗ＨＥＶ抗体に対する第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
第１の検出体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの他方を備えるものである態様が挙げられる。非特異反応をより低限させる観点からは、第１の捕捉体が、前記抗ＨＥＶ抗体に対する第１の抗体と非水溶性担体とを備えるものであり、第１の検出体が、前記抗原ポリペプチドを備えるものであることがより好ましい。

また、前記サンドイッチ法を用いる場合、本発明に係る第２の検出の態様としては、
前記検出工程（第２の検出）が、前記試料と、第２の捕捉体と、第２の検出体と、を接触させる工程であり、
第２の捕捉体が、前記ＨＥＶに対する第２の抗体及び第３の抗体のうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
第２の検出体が、前記ＨＥＶに対する第２の抗体及び第３の抗体のうちの他方を備えるものである態様が挙げられる。

前記サンドイッチ法を用いる場合、本発明の同時検出方法の態様としては、第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体であること以外、第１の検出と第２の検出とはそれぞれ独立して任意の組み合わせであってよい。

前記サンドイッチ法において、前記抗ＨＥＶ抗体に対する第１の抗体及び前記抗原ポリペプチド（第１の検出）、或いは、前記ＨＥＶに対する第２の抗体及び第３の抗体（第２の検出）は、それぞれ、前記捕捉体及び前記検出体のうちのいずれに備えられていてもよいが、一方が捕捉体に含まれ、もう一方が検出体に含まれる。これにより試料中の抗ＨＥＶ抗体（第１の検出）及びＨＥＶ（第２の検出）を前記捕捉体で捕捉し、かつ、前記検出体により標識することができるため、前記検出体を介した標識物質に由来するシグナルを検出することで、当該抗ＨＥＶ抗体（第１の検出）及びＨＥＶ（第２の検出）をそれぞれ高精度かつ容易に検出することができる。

検出したシグナルは、必要に応じてその量を半定量又は定量することによって、それぞれ、抗ＨＥＶ抗体量（第１の検出）及びＨＥＶ量（第２の検出）とすることができる。また、本発明の同時検出方法の場合には、第１の検出と第２の検出とで同じ標識物質を用いることにより、検出したシグナルは、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの合計量とすることができる。

前記「シグナル」には、前記標識物質に応じて、呈色（発色）、消光、反射光、発光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた検出方法・装置によって確認できるものも含まれる。本発明において、抗ＨＥＶ抗体量、ＨＥＶ量、又はこれらの合計量としては、標準試料を用いた検量線等によりその量を検量してもよいが、より簡便かつ迅速な観点からは、前記シグナル量をそのまま本発明の抗ＨＥＶ抗体量、ＨＥＶ量、又はこれらの合計量として扱ってもよい。

このようなサンドイッチ法としては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法（捕捉体と試料中の抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶとの反応、捕捉体に結合した抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶと検出体との反応を逐次的に行う方法）、リバースサンドイッチ法（予め検出体と試料中の抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶとを反応させ、生成した複合体を捕捉体と反応させる方法）、及び１ステップ法（試料中の抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶ、捕捉体、検出体の反応を同時に１ステップで行う方法）を挙げることができるが、これらのいずれも採用可能である。

例えば、第１の検出のフォワードサンドイッチ法の態様では、先ず、前記試料と第１の捕捉体とを接触させ、第１の捕捉体の第１の抗体（又は抗原ポリペプチド）と抗ＨＥＶ抗体との結合を介して抗ＨＥＶ抗体を当該捕捉体に捕捉させる（１次反応：捕捉ステップ）。次いで、第１の捕捉体に捕捉された抗ＨＥＶ抗体に第１の検出体を接触させて、当該検出体の抗原ポリペプチド（又は第１の抗体）と抗ＨＥＶ抗体との結合を介して標識する（２次反応：標識ステップ）。この反応により、第１の捕捉体－抗ＨＥＶ抗体－第１の検出体を含む複合体が形成される。

また、例えば、第２の検出のフォワードサンドイッチ法の態様では、先ず、前記試料と第２の捕捉体とを接触させ、第２の捕捉体の第２の抗体（又は第３の抗体）とＨＥＶとの結合を介してＨＥＶを当該捕捉体に捕捉させる（１次反応：捕捉ステップ）。次いで、第２の捕捉体に捕捉されたＨＥＶに第２の検出体を接触させて、当該検出体の第３の抗体（又は第２の抗体）とＨＥＶとの結合を介して標識する（２次反応：標識ステップ）。この反応により、第２の捕捉体－ＨＥＶ－第２の検出体を含む複合体が形成される。

本発明においては、前記抗原ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを用い、かつ、第２の抗体及び第３の抗体として前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体を用いることにより、第１の検出と第２の検出における前記複合体の形成が互いに阻害されない。そのため、本発明の同時検出方法では、第１の検出と第２の検出とを同一の反応系内で並行して同時に行うことが可能である。

前記フォワードサンドイッチ法の態様では、結合しなかった試料及び検出体を必要に応じて洗浄して除去（洗浄ステップ）した後、前記標識物質に応じた所定の方法で、当該標識物質に由来するシグナルを検出する（検出ステップ）。

〔非水溶性担体〕
前記非水溶性担体は、主に前記抗体（第１の抗体、第２の抗体、又は第３の抗体）又は前記抗原ポリペプチドを担持し、固相化する担体として機能するものであり、非水溶性の物質である。本発明において、「非水溶性の物質」とは、常温常圧下において水に不溶（水に対する溶解度が０．００１ｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．０００１ｇ／ｍＬ以下、以下同様）である物質を示す。

このような非水溶性担体の材質としては、一般的に免疫学的測定及びそれに準じた測定に用いられているものを用いることができ、特に制限はされず、例えば、高分子ポリマー（ポリスチレン、（メタ）アクリル酸エステル、ポリメチルメタクリレート、ポリイミド、ナイロン等）、ゼラチン、ガラス、ラテックス、シリカ、金属（金、白金等）、及び金属化合物（酸化鉄、酸化コバルト、ニッケルフェライト等）からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。また、前記非水溶性担体の材質としては、これらの複合材や、これら物質と他の物質との複合材であってもよく、例えば、前記高分子ポリマー、ゼラチン、及びラテックスからなる群から少なくとも１種の有機高分子と、酸化鉄（スピネルフェライト等）、酸化コバルト、及びニッケルフェライトからなる群から少なくとも１種の金属化合物と、からなる有機無機複合材（例えば、磁性粒子等）であってもよい。さらに、前記非水溶性担体としては、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基等の活性基で表面修飾されたものであってもよい。

また、本発明において、前記非水溶性担体の形状としても特に制限はされず、例えば、プレート、繊維、膜、粒子等のいずれであってもよい。このような非水溶性担体としては、従来公知のものを適宜用いることができ、市販のものを適宜用いることもできる。

〔標識物質〕
前記標識物質としては、公知の免疫学的測定方法やそれに準じた方法において標識物質として用いられているものを特に制限なく用いることができる。このような標識物質としては、例えば、酵素；アクリジニウム誘導体等の発光物質；ユーロピウム等の蛍光物質；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光タンパク質；^１２５Ｉ等の放射性物質；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光色素；ラテックス粒子、金粒子等の粒子；ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。

例えば、前記標識物質として酵素を用いた場合には、発色基質、蛍光基質、化学発光基質等を基質として添加することにより、当該基質に応じて種々のシグナルの検出を行うことができる。前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

前記標識物質は、前記各検出体において前記抗体（第１の抗体、第２の抗体、又は第３の抗体）又は前記抗原ポリペプチドに結合させ、直接的に抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶを検出してもよい。例えば、第１の検出体が前記抗原ポリペプチドを備える場合、かかる第１の検出体としては、前記抗原ポリペプチドと、前記標識物質とを備えていてもよい。

また、本発明の検出方法では、前記検出体において前記抗体又は前記抗原ポリペプチドに前記標識物質を結合させず、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドに二次標識体を結合させて、間接的に抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶを検出してもよい。ここで、「二次標識体」とは、抗ＨＥＶ抗体に直接結合する第１の抗体若しくは前記抗原ポリペプチド、又は、ＨＥＶに直接結合する第２の抗体若しくは第３の抗体（検出体）に結合可能であって、前記標識物質を備える標識体である。このような二次標識体としては、例えば、前記標識物質を結合させた前記検出体に結合可能な抗体（二次抗体等）や、前記標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡ等が挙げられる。また、例えば、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドにビオチン（又はアビジン）を結合させ、これに対応して、前記二次標識体を前記標識物質を結合させたアビジン（又はビオチン）としてもよい。

〔捕捉体〕
第１の捕捉体及び第２の捕捉体は、それぞれ、前記非水溶性担体と、前記抗体（第１の抗体、第２の抗体、又は第３の抗体）又は前記抗原ポリペプチドと、を備える複合体であって、前記非水溶性担体と前記抗体又は前記抗原ポリペプチドとが直接的又は間接的に結合してなる。

第１の捕捉体及び第２の捕捉体においては、それぞれ独立に、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドの含有量は特に制限されず、これらと抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶとの結合のしやすさ等に応じて適宜調整することができるが、例えば、前記非水溶性担体がプレートである場合、その表面積１ｃｍ^２あたりの質量（２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、０．０１～１．５μｇであることが好ましい。

第１の捕捉体及び第２の捕捉体は、それぞれ独立に、前記非水溶性担体に前記抗体又は前記抗原ポリペプチドを結合させることによって製造することができる。かかる製造方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、前記非水溶性担体に前記抗体又は前記抗原ポリペプチド（以下、場合により「被担持体」という）を直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。

直接結合させる場合には、例えば、前記非水溶性担体及び／又は前記被担持体として、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基、ピリジルジスルフィド基等の活性基を有するものを用い、又は必要に応じて前記活性基を付与して、これらを結合させることにより、前記被担持体を前記非水溶性担体に直接固定することができる。また、前記非水溶性担体がプレートである場合には、プレート上に前記被担持体を塗布し、必要に応じてカゼインナトリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングした後、これを乾燥させることにより、前記被担持体を前記非水溶性担体に直接固定することができる。

間接的に結合させる場合には、例えば、ポリヒスチジン、ポリエチレングリコール、システイン及び／又はリジンを含むオリゴペプチド、前記被担持体に結合するリンカー等を介して結合させることにより、前記被担持体を前記非水溶性担体に間接的に固定することができる。前記リンカーとしては、特に制限されず、例えば、被担持体に結合可能な二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、光分解可能な光切断型リンカー、前記活性基を有するリンカー分子（例えば、ヒドラジン塩、ヒドラジド）等が挙げられる。また、前記被担持体に何らかの修飾を行い、その修飾部分を捕捉する物質を前記非水溶性担体に固定化して、前記非水溶性担体上に前記被担持体を固定してもよい。例えば、前記修飾部分の代表例としてはビオチンが、その修飾部分を捕捉する物質の代表例としてはストレプトアビジンが、それぞれ挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これらの反応に供する非水溶性担体及び前記被担持体の比率は、上記の捕捉体における比率の好ましい範囲を達成するように適宜選択することができる。また、必要に応じて、前記被担持体や非水溶性担体への非特異的な吸着を防ぐことを目的として、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で前記非水溶性担体のブロッキングを行なってもよい。さらに、このような捕捉体としては、前記被担持体が前記抗体である場合には、市販のものを適宜用いてもよい。

また、本発明の同時検出方法においては、第１の捕捉体と第２の捕捉体とは同じであってもよい。すなわち、第１の検出と第２の検出とに共通する捕捉体として、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちのいずれか一方（Ａ）と、第２の抗体及び第３の抗体のうちのいずれか一方（Ｂ）とを備える捕捉体を用いることができる。この場合、ＡとＢとの比率は特に制限されず、これらと抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶとの結合のしやすさ等に応じて適宜調整することができるが、例えば、前記非水溶性担体がプレートである場合、ＡとＢとの質量比で、１：１０～１：０．１の範囲が挙げられる。

〔検出体〕
第１の検出体及び第２の検出体は、それぞれ、前記抗体（第１の抗体、第２の抗体、又は第３の抗体）又は前記抗原ポリペプチドを備えるものである。前記各検出体としては、それぞれ、前記標識物質と、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドと、を備える複合体であってもよく、この場合、前記標識物質と前記抗体又は前記抗原ポリペプチドとが直接的又は間接的に結合してなる。前記検出体としては、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドのみからなるものであってもよく、この場合、前記抗体又は前記抗原ポリペプチド、又は必要に応じて修飾（例えば、ビオチン、アビジンによる修飾）した前記抗体又は前記抗原ポリペプチドに、結合可能な前記二次標識体を結合させ、間接的に抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶを検出してもよい。前記標識物質をさらに備える場合、前記標識物質、前記抗体又は前記抗原ポリペプチドの含有量としては特に制限されず、前記標識物質の種類等に応じて適宜調整することができる。

第１の検出体及び第２の検出体が前記標識物質をさらに備える場合、これら検出体は、それぞれ独立に、前記標識物質と前記抗体又は前記抗原ポリペプチドとを結合させることによって製造することができる。かかる製造方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、前記標識物質と前記抗体又は前記抗原ポリペプチドとは直接結合させてよく、間接的に結合させてもよい。これらの結合方法としては、それぞれ、前記捕捉体において記載した結合方法と同様の方法が挙げられる。

（捕捉ステップ）
前記捕捉ステップにおいて、前記抗ＨＥＶ抗体と第１の捕捉体（第１の検出）、又は、前記ＨＥＶと第２の捕捉体（第２の検出）を接触させる方法としては、それぞれ特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記非水溶性担体がプレートである場合にはこれ（被担持体固相化プレート）に前記試料を注入する方法や、前記非水溶性担体が粒子である場合には前記試料中に前記捕捉体（被担持体固相化粒子）を添加する方法が挙げられる。

前記捕捉ステップにおける前記試料と前記捕捉体との反応において、前記試料の量としては、特に制限されず、試料の種類、濃度等に応じて適宜調整することができる。また、前記捕捉ステップの条件としても特に制限されず、適宜調整することができ、例えば、室温～４５℃、好ましくは２５～３７℃、ｐＨ６．０～９．０程度、好ましくはｐＨ７．０～８．０で、３０～９０分程度、好ましくは６０分程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。

（標識ステップ）
前記標識ステップにおいて、前記抗ＨＥＶ抗体と第１の検出体（第１の検出）、又は、前記ＨＥＶと第２の検出体（第２の検出）の反応では、前記抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶと各検出体とを含む反応液中の、当該検出体の含有量（終濃度）（検出体が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）としては、特に制限されず、試料の種類、濃度等に応じて適宜調整されるものであるため特に制限されないが、過剰に用いると高いバックグラウンドシグナルを生じる可能性がある観点から、例えば、０．０１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、０．１～５μｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．２～１μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。

また、前記標識ステップの他の条件としても特に制限されず、適宜調整することができ、例えば、室温～３７℃、好ましくは２５～３７℃、ｐＨ５．０～７．０、好ましくは５．５～６．５で、３０～９０分程度、好ましくは６０分程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。

（洗浄ステップ）
前記サンドイッチ法には、前記捕捉ステップ及び／又は前記標識ステップの後に、前記捕捉体に直接的又は間接的に結合した抗ＨＥＶ抗体、ＨＥＶ、及び検出体と、それ以外の前記捕捉体に結合していない（すなわち、捕捉されていない）夾雑物とを分離し、前記夾雑物を除去する洗浄ステップをさらに含むことが好ましい。前記夾雑物を除去する方法としては、特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記捕捉体が前記被担持体固相化プレートである場合にはプレート上から液相（上清）を除去する方法や、前記被担持体固相化粒子である場合には前記粒子を遠心や集磁によって回収して液相（上清）を除去する方法が挙げられる。また、前記洗浄ステップにおいては、必要に応じて、洗浄液の注入及び除去を繰り返してもよい。前記洗浄液としては、例えば、中性（好ましくは、ｐＨ６．０～９．０）の公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、ＢＳＡ等の安定化タンパク質や界面活性剤等が添加されたものであってもよい。

本発明に係る検出工程として前記サンドイッチ法を用いる場合、前記試料としては、上記のように希釈液で希釈して用いてもよいが、前記捕捉体が前記被担持体固相化粒子等である場合には、その粒子懸濁媒（粒子液）に懸濁して用いてもよく、さらに、前記試料と前記捕捉体及び／又は前記検出体との反応系には、他の反応用バッファーを適宜添加してもよい。これらの粒子懸濁媒、反応用バッファーとしては、特に制限されないが、例えば、それぞれ独立に、公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、それぞれ独立に、ＢＳＡ等の安定化タンパク質や血清等が添加されたものであってもよい。

（検出ステップ）
前記検出ステップにおいては、前記検出体を介した標識物質に応じてシグナルを検出する。例えば、前記検出体が前記標識物質を備える場合には当該標識物質に応じて、前記二次標識体を前記検出体に結合させて検出する場合には当該二次標識体を添加し、必要に応じて洗浄により結合しなかった二次標識体を除去した後、その標識物質に応じて、シグナルを検出する。例えば、前記標識物質が酵素である場合には、当該酵素に対応する発色基質や発光基質を添加して反応させることによって生じるシグナル（例えば、発色や発光）を検出する。

これにより、試料中の抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶの有無をシグナルの有無により検出し、第１の検出では、抗ＨＥＶ抗体が存在する場合に試料中の抗ＨＥＶ抗体量をシグナル量として得ることができ、第２の検出では、ＨＥＶが存在する場合に試料中のＨＥＶ量をシグナル量として得ることができ、さらに、必要に応じて標準試料におけるシグナル量との比較をすることによって、試料中の抗ＨＥＶ抗体量及びＨＥＶ量をそれぞれ検量することができる。

本発明の同時検出方法においては、第１の検出と第２の検出とで異なる標識物質を用いて試料中の抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶの有無をそれぞれ検出してもよいが、第１の検出と第２の検出とで同じ標識物質を用いることにより、試料中の抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶの有無をシグナルの有無により検出し、さらに、抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶが存在する場合に試料中の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの合計量をシグナル量として得てもよい。これにより、ＨＥＶ感染の時期に拘わらず、抗ＨＥＶ抗体又はＨＥＶのいずれかは検出することができるため、ＨＥＶ感染の有無を簡便に一度で検出することが可能となる。

＜Ｅ型肝炎ウイルスの検査方法＞
本発明のＥ型肝炎ウイルス感染の検出方法によれば、上記の検出工程によって検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶの有無を指標とすることにより、前記試料におけるＥ型肝炎ウイルスへの感染の有無、好ましくは、同試料が由来する被検者におけるＥ型肝炎ウイルスへの感染の有無を検出することができる。また、上記の検出工程によって検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを指標とすることにより、前記試料、好ましくは同試料が由来する被検者におけるＥ型肝炎ウイルスへの感染の程度（感染時期やＥ型肝炎の程度）についての情報を得ることもできる。したがって、本発明は、前記本発明のＥ型肝炎ウイルス感染の検出方法で被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを検出する工程を含む、Ｅ型肝炎ウイルスの検査方法（以下、場合により単に「検査方法」という）も提供する。

本発明の検査方法の態様としては具体的に、例えば、次の態様：
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を前記抗原ポリペプチドで検出する検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体を指標として、被験者がＨＥＶに感染しているか否かを判定する判定工程と、を含む方法；
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を前記抗原ポリペプチドで検出する検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体を指標として、Ｅ型肝炎である又はＥ型肝炎を発症する可能性が高いと予測される被検者を選別する選別工程と、を含む方法（スクリ－ニング方法）；
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を前記抗原ポリペプチドで検出する検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体を指標として、被検者におけるＥ型肝炎の罹患の有無を鑑別する鑑別工程と、を含む方法；
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を第１の抗体及び抗原ポリペプチドで検出する第１の検出と、前記試料中のＥ型肝炎ウイルスを第２の抗体及び第３の抗体で検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを指標として、被験者がＨＥＶに感染しているか否かを判定する判定工程と、を含む方法；
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を第１の抗体及び抗原ポリペプチドで検出する第１の検出と、前記試料中のＥ型肝炎ウイルスを第２の抗体及び第３の抗体で検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを指標として、Ｅ型肝炎である又はＥ型肝炎を発症する可能性が高いと予測される被検者を選別する選別工程と、を含む方法（スクリ－ニング方法）；
被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体を第１の抗体及び抗原ポリペプチドで検出する第１の検出と、前記試料中のＥ型肝炎ウイルスを第２の抗体及び第３の抗体で検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを指標として、被検者におけるＥ型肝炎の罹患の有無を鑑別する鑑別工程と、を含む方法；
が挙げられる。

前記各検査方法において、前記判定工程、選別工程、及び鑑別工程では、前記検出工程で抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶが少しでも前記試料に検出されれば、その試料が由来する被検者を、それぞれ、Ｅ型肝炎ウイルスに感染している、Ｅ型肝炎である若しくはＥ型肝炎を発症する可能性が高い、及びＥ型肝炎に罹患している（すなわち、陽性である）としてもよいが、検出された抗ＨＥＶ抗体量及び／又はＨＥＶ量に応じて判定、選別、又は鑑別することが好ましい。例えば、前記検出工程で検出された抗ＨＥＶ抗体量及びＨＥＶ量を、それぞれ、又は合計量で、予め定められたカットオフ値と比較して、前記抗ＨＥＶ抗体量及び／又はＨＥＶ量が前記カットオフ値よりも高い被検者を、Ｅ型肝炎ウイルスに感染している、Ｅ型肝炎である若しくはＥ型肝炎を発症する可能性が高い、又はＥ型肝炎に罹患しているとしてもよい。

前記「カットオフ値」とは、前記抗ＨＥＶ抗体量及び／又はＨＥＶ量によって判定するための基準となる予め定められた値であり、陽性群と陰性群とを判定するための境界値のことを示す。このようなカットオフ値は、本発明の検査方法の目的、抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶの検出方法、被検者や試料の性質、希釈条件等によって適宜設定されるものであるため、特に限定されるものではない。例えば、カットオフ値を比較的低値に設定することで、検出感度を高く、すなわち、陽性の疑いのある被験者をある程度広く拾集でき、他方、前記カットオフ値を比較的高値に設定することで、前記各検査方法をより高精度で行うことが可能となる。

このような本発明の検査方法によれば、他の肝炎と区別して、Ｅ型肝炎に特異的な治療方針の決定等のための情報を提供することが可能となる。また、Ｅ型肝炎に罹患（再活性化を含む）する可能性が高い被検者を特定することにより、早期治療介入等が可能となる。さらに、本発明の検査方法の態様としては、被検者由来の試料中の抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを検出する検出工程と、検出された抗ＨＥＶ抗体及び／又はＨＥＶを指標として、被検者のＨＥＶ感染時期を予測する予測工程と、を含む方法も挙げられ、例えば、第１の抗体として抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体を適宜選択することにより、抗ＨＥＶ抗体のアイソタイプから、被検者のＨＥＶ感染時期を予測することも可能となる。また、第１の検出と第２の検出とにおいて異なる標識物質を用いることにより、試料中の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの有無をそれぞれ異なるシグナル（例えば、異なる発色）により検出し、例えば、ＨＥＶ検出のシグナルが多く検出された場合には、被検者のＨＥＶ感染時期が初期であると予測することも可能となる。

なお、本発明の検査方法は、医師等によるＥ型肝炎の診断を補助する方法、又は医師等によるＥ型肝炎の診断のための情報を提供する方法でもある。

＜Ｅ型肝炎ウイルス感染検出用抗原ポリペプチド及びキット＞
本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス感染検出用キットとして、試料中の抗ＨＥＶ抗体を検出する方法に用いるためのキットであり、抗ＨＥＶ抗体に対する抗原ポリペプチドを含み、前記抗原ポリペプチドが本発明のポリペプチドであるキット（抗ＨＥＶ抗体検出用キット）、並びに、試料中の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶを同時に検出する方法に用いるためのキットであり、抗ＨＥＶ抗体に対する第１の抗体と、抗原ポリペプチドと、ＨＥＶに対する第２の抗体と、ＨＥＶに対する第３の抗体と、を含み、前記抗原ポリペプチドが本発明のポリペプチドであり、第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体であるキット（同時検出用キット）を提供する。抗ＨＥＶ抗体検出用キットとしては、第１の抗体をさらに含んでいることが好ましい。

本発明のＥ型肝炎ウイルス感染検出用キットに含まれる抗原ポリペプチド及び抗体（第１の抗体、第２の抗体、又は第３の抗体）としては、それぞれ、前記抗原ポリペプチド（２種以上のポリペプチドの組み合わせを含む）のみからなるもの及び前記抗体のみからなるものであっても、これを含む組成物であってもよい。前記組成物としては、他の成分をさらに含有していてもよく、当該他の成分としては、特に制限されないが、例えば、滅菌水、生理食塩水、界面活性剤、保存剤等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。

本発明のＥ型肝炎ウイルス感染検出用キットとしては、前記非水溶性担体と第１の抗体とを備える上述の第１の捕捉体を含むことが好ましい。この場合、前記抗原ポリペプチドとしては、前記標識物質で標識された上述の第１の検出体であるか、前記二次標識体が結合可能な抗原ポリペプチドを備える上述の第１の検出体であることが好ましい。また、本発明のＥ型肝炎ウイルス感染検出用キットとしては、前記標識物質と第１の抗体とを備える上述の第１の検出体、又は、前記二次標識体が結合可能な第１の抗体を備える上述の第１の検出体を含んでいてもよく、この場合、前記抗原ポリペプチドとしては、前記非水溶性担体に担持された上述の第１の捕捉体であることが好ましい。さらに、本発明の同時検出用キットとしては、前記非水溶性担体と第２の抗体及び第３の抗体のいずれか一方とを備える上述の第２の捕捉体を含むことが好ましい。この場合、第２の抗体及び第３の抗体のうちの他方としては、前記標識物質で標識された上述の第２の検出体、又は、前記二次標識体が結合可能な第２の抗体又は第３の抗体を備える上述の第２の検出体であってもよい。第１の捕捉体、第２の捕捉体、第１の検出体、及び第２の検出体としては、それぞれ、それらの好ましい態様も含めて、上述のとおりである。また、この場合、各捕捉体及び検出体としては、それぞれ独立に、固体（粉末やゼラチン）状であっても緩衝液に溶解又は分散された液体状（前記捕捉体の場合には例えば粒子分散液）であってもよい。液体状である場合、各溶液における各捕捉体及び検出体の濃度は、特に限定されないが、それぞれ独立に、例えば、０．０１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、０．１～５．０μｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．２～１．０μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。

本発明のＥ型肝炎ウイルス感染検出用キットとしては、他に、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、イムノクロマト等の通常の免疫学的測定方法及びそれに準じた方法で備えるべき構成をさらに備えていてもよい。例えば、上記のサンドイッチ法を本発明の検出方法の原理とする場合には、前記被担持体を固相化するための磁性ビーズやプレート；前記標識物質；前記二次標識体；前記標準試料（各濃度）；対照試薬；前記粒子懸濁媒；前記反応用バッファー；及び前記洗浄液からなる群から選択される少なくとも１種をさらに含んでいてもよい。また、前記標識物質が酵素である場合には、当該標識物質の検出・定量に必要な基質や反応停止液等をさらに含んでいてもよい。

さらに、本発明のＥ型肝炎ウイルス感染検出用キットは、必要に応じて、前記希釈液や、試料の前処理を行うための前処理液；希釈用カートリッジ；前処理の反応停止液又は中和液等を備えていてもよい。また、前記サンドイッチ法としてイムノクロマトを採用する場合には、前記捕捉体及び／又は前記検出体を担持したゾーンを含むデバイスをさらに含んでいてもよい。前記デバイスとしては、展開液パッドや吸収パッド等、イムノクロマトに適したその他の構成要素を備えることができる。さらに、本発明のキットには、当該キットの使用説明書をさらに含んでいてもよい。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（調製例１） 遺伝子３型のＨＥＶのＥ２ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）遺伝子のクローニング
（１－１）ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のクローニング
遺伝子３型のＨＥＶ（ＨＥＶＧ３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＢ４８１２２９）について、ＲＴ－ＰＣＲによってＨＥＶ遺伝子（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）のクローニングを行なった。すなわち、先ず、ＨＥＶＧ３サンプル１００μＬ（ＨＥＶＧ３：１０^４個程度）からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてＲＮＡ（ＨＥＶ－ＲＮＡ）を抽出して精製した。精製したＨＥＶ－ＲＮＡ １１μＬ、リバース・プライマーＧ３ＡＳ１（２μＭ、配列番号：９）１μＬ、及びｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）１μＬを０．５ｍＬチューブに分注した後、６５℃で５分間加熱し、氷上で急冷した。次いで、各チューブに、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）１μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ １μＬ、５×ＳＳＩＶ緩衝液（インビトロジェン社製）４μＬ、及び逆転写酵素ＳＳＩＶ（インビトロジェン社製）１μＬを加え、反応液２０μＬを調製した。前記反応液を５０℃で１０分間反応させた後、８０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させ、ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ合成反応液を得た。

ＰＣＲには、検出ＤＮＡの増幅感度及び特異性を上げることを目的として、ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を用いた。すなわち、先ず、２種類のプライマーで１回目のＰＣＲを行い（１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ）、次いで、そのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側に存在する２種類のプライマーを用いて、２回目のＰＣＲを行なった（２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲ）。１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲには、プライマーＧ３Ｓ１（配列番号：１０）及び前記リバース・プライマーＧ３ＡＳ１を用い、２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲには、プライマーＧ３Ｓ２（配列番号：１１）及びプライマーＧ３ＡＳ２（配列番号：１２）を用いた。

１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲの反応液は、前記ｃＤＮＡ合成反応液５μＬ、１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ用のプライマー２種（各５０ｐｍｏｌｅ）各２μＬ、ＫＡＰＡＴａｑ Ｅｘｔｒａ ＨＳ ＲＭ＋ｄｙｅ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１０μＬ、及び滅菌水３μＬで全量２０μＬとした。１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間加熱し、変性：９５℃で３０秒間、アニーリング：５５℃で３０秒間、伸長：７２℃で２分間の条件で３０サイクル行なった。

２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲの反応液は、１ｓｔ ＰＣＲ反応終了液２μＬ、２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲ用のプライマー２種（各５０ｐｍｏｌｅ）各２μＬ、ＫＡＰＡＴａｑ Ｅｘｔｒａ ＨＳ ＲＭ＋ｄｙｅ ９μＬ、及び滅菌水７μＬで全量２０μＬとし、１ｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ反応と同じ条件で行なった。

２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲ反応終了液１０μＬをアガロースゲル電気泳動し、約５ｋｂｐの長さで特異的に増幅されたＤＮＡ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローニングして、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のヌクレオチド配列を含むベクター「ｐＧＥＭ－ＨＥＶＧ３」を得た。

（１－２）遺伝子３型のＥ２ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）遺伝子の発現ベクターへのクローニング
上記（１－１）で得られたｐＧＥＭ－ＨＥＶＧ３を鋳型として、プライマーＧ３Ｅ２ｓ－４５２－Ｓ（配列番号：１３）及びプライマーＧ３Ｅ２ｓ－６１７－ＡＳ（配列番号：１４）を用いてＰＣＲを行い、Ｇ３Ｅ２ｓをコードするＤＮＡ断片（約５１０ｂｐ）を増幅した。プライマーは、増幅したＤＮＡ断片の５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列が、３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列が、それぞれ付加されるように設計した。この２種類の制限酵素を利用して、増幅したＤＮＡ断片を、ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ発現ベクター（大腸菌ｔｒｐＥタンパク質発現ベクター、特許３２１７６００号に記載のベクター）のＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列（Ｇ３ＤＴ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）をコードする配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号：１５）を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ」を得た。

（調製例２） Ｇ３Ｅ２ｓへの変異導入ポリペプチドの発現ベクターの調製
（２－１）Ｇ３Ｅ２ｓへの点変異（Ｄ４９６Ｇ）の導入
遺伝子３型のＨＥＶのＥ２Ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）の野生型アミノ酸配列（Ｇ３ＤＴ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）において、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアミノ酸（遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９６番目、以下、場合により「Ｄ４９６」ともいう）は通常アスパラギン酸（Ｄ）であるが、これをグリシン（Ｇ）に置換する点変異を導入した。すなわち、先ず、上記調製例１で得られたｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ（５０ｎｇ／ｍＬ）１μＬ、プライマーＧ３Ｄ４９６Ｇ－Ｓ（配列番号：１６）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１．５μＬ、プライマーＧ３Ｄ４９６－ＡＳ（配列番号：１７）（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１．５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ、滅菌蒸留水３５μＬ、及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、東洋紡株式会社製）１μＬからなる反応液４５μＬを、９４℃で２分間加熱し、９８℃：１０秒間、６８℃：４分間、９８℃：１０秒、及び６８℃：４分の条件を３０サイクル繰り返してＰＣＲ反応を行い、４℃で保存した。

次いで、ＰＣＲ反応後の反応液４５μＬにＤｐｎＩ ２μＬを加えて攪拌し、３７℃で１時間反応させて鋳型プラスミド（ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ）を消化させた。次いで、ＤｐｎＩ処理液２μＬ、滅菌蒸留水７μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）５μＬ、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ １μＬからなる反応液１５μＬを１６℃で１時間反応させて、ＰＣＲ増幅産物を自己連結させた。次いで、反応後の反応液の一部を大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で３７℃において一晩培養した。得られた４個のコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（液体）で３７℃において培養し、アルカリ法（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）にてプラスミドを調製した。

調製したプラスミドについてシークエンシングを行い、得られたプラスミドにクローニングされた配列及び変異箇所を確認したところ、得られたプラスミドは、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列において、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換されたアミノ酸配列（Ｇ３Ｄ４９６Ｇ、配列番号：１８）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドであることが確認され、これを発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ」とした。

（２－２）Ｇ３Ｅ２ｓへの他の点変異（Ｔ４９７Ｓ）の導入
遺伝子３型のＨＥＶのＥ２ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）の野生型アミノ酸配列（Ｇ３ＤＴ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）において、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４２番目のアミノ酸（遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列の第４９７番目、以下、場合により「Ｔ４９７」ともいう）は通常スレオニン（Ｔ）であるが、これを、遺伝子１型のＨＥＶのＥ２ｓの野生型アミノ酸配列において対応するアミノ酸であるセリン（Ｓ）に置換する点変異を導入した。すなわち、プライマーとして、プライマーＧ３Ｔ４９７Ｓ－Ｓ（配列番号：１９）及びプライマーＧ３Ｔ４９７Ｓ－ＡＳ（配列番号：２０）を用いたこと以外は上記（２－１）と同様の方法で、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列において、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６６番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４２番目のスレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）に置換されたアミノ酸配列（Ｇ３Ｔ４９７Ｓ、配列番号：２１）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｔ４９７Ｓ」を得た。

（２－３）Ｇ３Ｄ４９６Ｇへの追加点変異（Ｔ４９７Ｓ）の導入
プライマーとして、プライマーＧ３Ｔ４９７Ｓ－Ｓ（配列番号：１９）及びプライマーＧ３Ｄ４９６Ｇ／Ｔ４９７Ｓ－ＡＳ（配列番号：２２）を用いたこと以外は上記（２－１）と同様の方法で、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列において、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６６番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４２番目のスレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）に、それぞれ置換されたアミノ酸配列（Ｇ３Ｄ４９６Ｇ／Ｔ４９７Ｓ、配列番号：２３）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ／Ｔ４９７Ｓ」を得た。

（２－４）Ｇ３Ｅ２ｓへの点変異（Ｄ４９６Ａ）の導入
遺伝子３型のＨＥＶのＥ２Ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）の野生型アミノ酸配列（Ｇ３ＤＴ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）において、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換する点変異を導入した。すなわち、プライマーとして、プライマーＧ３Ｄ４９６Ａ－Ｓ（配列番号：２４）及びプライマーＧ３Ｄ４９６－ＡＳ（配列番号：１７）を用いたこと以外は上記（２－１）と同様の方法で、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列において、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸配列（Ｇ３Ｄ４９６Ａ、配列番号：２５）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ａ」を得た。

（２－５）Ｇ３Ｅ２ｓへの点変異（Ｄ４９６Ｖ）の導入
遺伝子３型のＨＥＶのＥ２Ｓ（Ｇ３Ｅ２ｓ）の野生型アミノ酸配列（Ｇ３ＤＴ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）において、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）をバリン（Ｖ）に置換する点変異を導入した。すなわち、プライマーとして、プライマーＧ３Ｄ４９６Ｖ－Ｓ（配列番号：２６）及びプライマーＧ３Ｄ４９６－ＡＳ（配列番号：１７）を用いたこと以外は上記（２－１）と同様の方法で、遺伝子３型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号７に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列において、配列番号７に記載のアミノ酸配列の第６５番目、つまり配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がバリン（Ｖ）に置換されたアミノ酸配列（Ｇ３Ｄ４９６Ｖ、配列番号：２７）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｖ」を得た。

（調製例３） 遺伝子１型のＨＥＶのＥ２ｓ（Ｇ１Ｅ２ｓ）遺伝子のクローニング
（３－１）遺伝子１型のＨＥＶ遺伝子の発現ベクターへのクローニング
遺伝子１型のＨＥＶ（ＨＥＶＧ１）については、そのＯＲＦ２のヌクレオチド配列及びそれにコードされるアミノ酸配列をＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）より取得した（ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ１１０９２）。取得したアミノ酸配列（ＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列）の３９４～６１７番目の全長２２４残基のアミノ酸（Ｇ１Ｅ２ｓ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）をコードする配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号：２８）を、ユーロフィン・ジェノミクス社に依頼して合成し、かかるヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＥＸ－Ａ－ＨＥＶＧ１」を得た。

（３－２）遺伝子１型のＥ２ｓ（Ｇ１Ｅ２ｓ）遺伝子の発現ベクターへのクローニング
上記（３－１）で得られたｐＥＸ－Ａ－ＨＥＶＧ１を鋳型として、プライマーＧ１Ｅ２ｓ－ｈｉｓ４５２－Ｓ（配列番号：２９）及びプライマーＧ１Ｅ２ｓ－６１７－ＡＳ（配列番号：３０）を用いてＰＣＲを行い、Ｇ１Ｅ２ｓをコードするＤＮＡ断片（約５３０ｂｐ）を増幅した。プライマーは、増幅したＤＮＡ断片の５’末端側に、その５’末端側から順に、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、ＨＩＳタグが、３’末端側に、その５’末端側から順に、終始コドン、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列が、それぞれ付加されるように設計した。この２種類の制限酵素を利用して、増幅したＤＮＡ断片を、ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ発現ベクターのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、遺伝子１型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち、配列番号５に記載のアミノ酸配列の２１～１８６番目の全長１６６残基のアミノ酸配列（Ｇ１Ｅ２ｓ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター「ｐＡＴ－ｔｒｐ－ｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓ」を得た。

（調製例４） ポリペプチド（Ｅ２ｓ）の発現及び精製
上記調製例１～３で作製した７種類の各発現ベクターを用いて、７種類のポリペプチドとｔｒｐＥとの融合ペプチド：ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｔ４９７Ｓ、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ／Ｔ４９７Ｓ、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ａ、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｖ、及びｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓの発現及び精製をそれぞれ行なった。すなわち、先ず、調製例１～３で作製した７種類の各発現ベクターを有する大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地４０ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液４０ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４ＬのＭ９－ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ_４Ｃｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．５％ カザミノ酸、０．２％ グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３のときに終濃度４０ｍｇ／Ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離し、約１２ｇの菌体を集めた。

次いで、得られた菌体に溶菌バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）６０ｍＬを加えて懸濁し、リゾチーム（生化学工業社製）１２ｍｇを加えて３７℃で１時間反応させた。反応後、超音波破砕１５０秒によって大腸菌膜を破砕し、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離を行なって上清を除去し、各目的のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドとｔｒｐＥとの融合ペプチドを含む不溶性画分を得た。

次いで、前記不溶性画分に界面活性剤を含む洗浄バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ－４０）を５５ｍＬ加えて懸濁し、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離を行なって上清を除去し、洗浄された不溶性画分を得た。さらに、前記不溶性画分に洗浄バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を５５ｍＬ加えて再懸濁し、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離を行なって上清を除去し、再洗浄された不溶性画分を得た。次いで、前記再洗浄された不溶性画分に可溶化バッファー（４Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を５５ｍＬ加えて、前記融合ペプチドを可溶化させた可溶化物を得た。

次いで、前記可溶化物を透析バック（ＭＷＣＯ：１０ｋＤ、スペクトラム社製）に入れ、ＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））に対して３Ｌ容ビーカー中で攪拌しながら４℃で終夜透析を行なったところ、透析バッグ中に白色の沈殿が認められた。透析後の試料を、１５０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で遠心分離を行なって沈殿を除去し、上清を０．２２μｍの濾過膜で濾過し、粗精製物を得た。

ＨＩＳタグの付いているｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓの粗精製物については、さらに、Ｎｉカラム（Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ、ＧＥヘルスケア社製）にアプライして捕捉させた後、５００ｍＭイミダゾールで溶出し、得られた溶出物をＰＢＳに対して透析し、精製物とした。

（調製例５） Ｅ２ｓを認識するモノクローナル抗体の作製
（５－１）Ｇ１Ｅ２ｓを認識するモノクローナル抗体の作製
ｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓを抗原ポリペプチドとして認識するモノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行なった。すなわち、調製例４で精製したｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓ ２５～１００μｇを抗原として、アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ社製）と共にＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。２週間後、同様の追加免疫を行い、さらに約２週間後、前記抗原をＰＢＳに溶解した溶液を最終免疫として尾静脈内に投与した。

最終免疫後３日目にマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ハサミ及び金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄後、この細胞と前記脾臓細胞とを１：５の細胞数比となるように混合した。２００×ｇで５分間遠心した後、上清を除去し、沈殿の細胞隗を緩やかに混合しながら、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（Ｍｅｒｋ社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地１ｍＬをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ－１６４０培地１０ｍＬを加えて細胞融合させた。

得られた融合細胞を、２００×ｇで５分間遠心してＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清及びヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、前記抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、前記抗原に反応するハイブリドーマを得た。限界希釈法により単一クローン化を行い、目的のハイブリドーマ７株（Ａ１０６、Ａ１０７、Ａ１１１、Ａ１２４、Ａ１２７、Ａ１３０及びＡ１３７）を樹立した。

樹立した各ハイブリドーマ株を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社製）を用い、３７℃にて５％炭酸ガス中において２～３週間培養した。培養後の培養液を、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、前記培養液中に産生された各モノクローナル抗体（Ａ１０６、Ａ１０７、Ａ１１１、Ａ１２４、Ａ１２７、Ａ１３０及びＡ１３７）を精製した。

（５－２）モノクローナル抗体のＥ２ｓ及び変異Ｅ２ｓに対する結合性評価１
上記（５－１）で得られた各モノクローナル抗体について、調製例４で得られたポリペプチド：ｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓ（Ｇ１ＤＳ抗原）、ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ（Ｇ３ＤＴ抗原）、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ（Ｇ３ＧＴ変異抗原）、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｔ４９７Ｓ（Ｇ３ＤＳ変異抗原）、及びｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ／Ｔ４９７Ｓ（Ｇ３ＧＳ変異抗原）をそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときのこれらに対する結合性を評価した。

先ず、調製例４で得られた各ポリペプチドの粗精製物又は精製物を抗原ポリペプチドとして、終濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））で希釈し、９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の１ウェルにつき１００μＬずつ分注した。次いで、これを４℃で一晩静置した後、ＰＢＳ ０．３５ｍＬを用いてそれぞれのウェルを２回洗浄した。その後、ブロッキング液（０．５％カゼイン－Ｎａを含むＰＢＳ）０．３５ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、さらに室温で３時間静置した。ブロッキング液を除去した後、マイクロプレートを真空乾燥させてＥＬＩＳＡプレートを準備し、使用まで４℃で保管した。

次いで、前記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、反応液バッファー１（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））に上記（５－１）で得られた各モノクローナル抗体０．２μｇ／ｍＬを含有させた抗体反応液を１００μＬずつ添加し、室温で６０分間保温した後、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で５回洗浄した。次いで、各ウェルに、前記反応液バッファー１にＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン・イムノリサーチ社製）を含有させた標識体液１００μＬずつを添加して室温で６０分間保温した後、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。次いで、各ウェルに、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、ＯＤ４５０－ＯＤ６３０を測定結果として、各モノクローナル抗体のＥ２ｓ及び変異Ｅ２ｓに対する結合性の評価指標とした。

下記の表２に、調製例４で得られたポリペプチドをそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときの測定結果及び評価結果を示す。表２において、「－」は結合性無し（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００未満）、「＋」は十分な結合性がある（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００以上２．０００未満）、「＋＋」は強い結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：２．０００以上）、を示す。

表２に示したように、モノクローナル抗体Ａ１０６、Ａ１０７、及びＡ１３７は、Ｇ１ＤＳ抗原、Ｇ３ＤＴ抗原、及びＧ３ＤＳ変異抗原、すなわち、配列番号１、３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）である抗原ペプチドであれば、遺伝子型に拘わらず結合性を示した。そのため、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸がこれらモノクローナル抗体のエピトープであると同定された。また、モノクローナル抗体Ａ１１１及びＡ１２４は、遺伝子１型よりも遺伝子３型に対して比較的強い結合性を示した。これらの結果より、下記の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出系に用いるモノクローナル抗体としては、Ｇ３ＧＴ変異抗原及びＧ３ＧＳ変異抗原に対する結合性が無く、野生型のＧ１ＤＳ抗原及びＧ３ＤＴ抗原に対する結合性を有するＡ１０６、Ａ１０７、及びＡ１３７が好適な抗体であると認められた。

（５－３）モノクローナル抗体のＥ２ｓ及び変異Ｅ２ｓに対する結合性評価２
上記（５－１）で得られた各モノクローナル抗体について、調製例４で得られたポリペプチド：ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ａ（Ｇ３ＡＴ変異抗原）及びｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｖ（Ｇ３ＶＴ変異抗原）についても、これらをそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときのこれらに対する結合性を評価した。また、参照として、ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ（Ｇ３ＤＴ抗原）及びｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ（Ｇ３ＧＴ変異抗原）をそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときの各モノクローナル抗体の結合性も合わせて評価した。

先ず、調製例４で得られた各ポリペプチドの粗精製物を抗原ポリペプチドとして、上記（５－２）と同様にしてＥＬＩＳＡプレートを準備し、使用まで４℃で保管した。次いで、反応停止用の２Ｎ硫酸溶液を５０μＬとしたこと以外は上記（５－２）と同様にして、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、ＯＤ４５０－ＯＤ６３０を測定結果として、各モノクローナル抗体のＥ２ｓ及び変異Ｅ２ｓに対する結合性の評価指標とした。

下記の表３に、各ポリペプチドをそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときの測定結果及び評価結果を示す。表３において、「－」は結合性無し（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：０．５００未満）、「＋」は十分な結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：０．５００以上２．０００未満）、「＋＋」は強い結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：２．０００以上）、を示す。なお、表２と表３との間で値が異なるのは、実施日時の違いにより抗原固相化条件等の諸反応条件が異なったためである。表２及び表３内のそれぞれにおいては、測定条件は同一で比較している。

表３に示したように、Ｇ３ＡＴ変異抗原及びＧ３ＶＴ変異抗原を抗原ポリペプチドとした場合にも、各モノクローナル抗体は、Ｇ３ＧＴ変異抗原を抗原ポリペプチドとした場合と同様のパターンの結合性を示した。特に、モノクローナル抗体Ａ１０６、Ａ１０７、及びＡ１３７は、Ｇ３ＤＴ抗原には結合性を示したが、Ｇ３ＧＴ変異抗原、Ｇ３ＡＴ変異抗原、及びＧ３ＶＴ変異抗原、すなわち、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がそれ以外のアミノ酸に置換された抗原ペプチドには結合性を示さなかった。したがって、これらの結果からも、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸がこれらモノクローナル抗体のエピトープであると同定され、下記の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出系に用いるモノクローナル抗体としては、Ａ１０６、Ａ１０７、及びＡ１３７が特に好適な抗体であると認められた。

（５－４）取得モノクローナル抗体のアイソタイプ
上記（５－１）で樹立した各ハイブリドーマ株を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社製）を用い、３７℃にて５％炭酸ガス中において２～３週間培養した。培養後の培養液を、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、前記培養液中に産生された各モノクローナル抗体（Ａ１０６、Ａ１０７、Ａ１１１、Ａ１２４、Ａ１２７、Ａ１３０及びＡ１３７）を精製した。次いで、精製した各モノクローナル抗体について、抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ社製）により、サブクラスを同定した。結果を下記の表４に示す。表４に示すように、アイソタイプは全てＩｇＧであり、サブクラスＩｇＧ２ａであるＡ１２７以外は、全てサブクラスＩｇＧ１であることが確認された。

（調製例６） ビオチン化抗原及びビオチン化モノクローナル抗体の作製
Ｇ１ＤＳ抗原、Ｇ３ＤＴ抗原、及びＧ３ＧＴ変異抗原、並びに、各モノクローナル抗体をビオチン化するために、ビオチン試薬（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ、サーモ社製）を用いて、それぞれの抗原・抗体をビオチンで修飾した。すなわち、先ず、使用直前にビオチン試薬１ｍｇを超純水１８０μＬに溶かし、１０ｍＭビオチン溶液を調製した。次いで、１ｍＬのＰＢＳに溶解している、調製例４で得られたポリペプチド：ｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓ（Ｇ１ＤＳ抗原）、ｔｒｐＥ－Ｇ３ＤＴ（Ｇ３ＤＴ抗原）、ｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ（Ｇ３ＧＴ変異抗原）、並びに、調製例５の（５－１）で得られた各モノクローナル抗体をそれぞれ１ｍｇと、前記１０ｍＭビオチン溶液６６．７μＬと、を混合し、室温で３０分間保温した。次いで、ＰＤ－１０を用いて、未反応のビオチン試薬をＰＢＳで脱塩し、ビオチン修飾された各Ｅ２ｓ抗原（ビオチン化抗原）及び各モノクローナル抗体（ビオチン化モノクローナル抗体）を精製した。

（試験例１） 変異抗原の抗ＨＥＶ抗体に対する結合性評価
変異抗原が抗ＨＥＶ抗体に対する結合性を維持していることを確認した。すなわち、市販又は従来公知の方法で生成された抗ヒトＩｇＭ抗体を、終濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））で希釈し、９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の１ウェルにつき１００μＬずつ分注した。次いで、これを４℃で一晩静置した後、ＰＢＳ ０．３５ｍＬを用いてそれぞれのウェルを２回洗浄した。その後、ブロッキング液（０．５％カゼイン－Ｎａを含むＰＢＳ）０．３５ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、さらに室温で３時間静置した。ブロッキング液を除去した後、マイクロプレートを真空乾燥させて抗ＩｇＭ抗体固相化プレートを準備し、使用まで４℃で保管した。

これを用いて、Ａａｌｔｏ Ｂｉｏ Ｒｅｇｅｎｔｓ社から購入したＥ型肝炎患者血漿を含むヒト血漿からなる検体群（３４検体）について、検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価を測定した。すなわち、前記抗ＩｇＭ抗体固相化プレートに、反応液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））９０μＬと、前記反応液で５０倍希釈した各検体１０μＬとを添加し、３７℃で４５分間反応させた。反応後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）０．３５ｍＬを用いて、それぞれのウェルを５回洗浄した。その後、調製例６で調製したビオチン化抗原：Ｇ３ＤＴ抗原（０．２μｇ／ｍＬ）及びＧ３ＧＴ変異抗原（実施例）（０．３μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつそれぞれ、前記抗ＩｇＭ抗体固相化プレートの各ウェルに添加し、３７℃で４５分間反応させた。次いで、前記洗浄液で洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識したストレプトアビジン（５００ｕｎｉｔ／ｍＬ）（ＳＡ－ＰＯＤ、ロシュ社製）を３０００倍希釈して調製した標識体液１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、前記洗浄液で洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、３７℃、暗所で１５分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を５０μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、ＯＤ４５０－ＯＤ６３０を測定結果（検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価）とし、各検体の陰性及び陽性の判定をした。

下記の表５に、Ｇ３ＤＴ抗原及びＧ３ＧＴ変異抗原をそれぞれ抗原ポリペプチドとしたときの各検体における測定結果及び判定結果を示す。カットオフ値は、別途、Ｇ３ＤＴ抗原を抗原ポリペプチドとしたときのＴＲＩＮＡ社から購入したＥ型肝炎患者血漿を含まないヒト血漿からなる検体群（陰性検体：ｎ＝１００）の平均値＋１０ＳＤを適用し、０．１００であった。表５において、「－」は陰性（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：カットオフ値未満）、「＋」は陽性（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：カットオフ値以上）を示す。

表５に示したように、変異抗原、すなわち、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換された抗原ペプチドであるＧ３ＧＴ変異抗原は、各検体に対して、変異を導入していないＧ３ＤＴ抗原と同じ結合性を示し、抗ＨＥＶ抗体に対する結合性が維持されているか、それ以上であることが確認された。

（試験例２） ＨＥＶ検出系のための各モノクローナル抗体の組合せ検討
（１）Ｇ１Ｅ２ｓ抗原に対する結合性の検討
上記調製例５の（５－１）で得られたモノクローナル抗体のうち、調製例５でＧ１ＤＳ抗原又はＧ３ＤＴ抗原には結合性を示したが、Ｇ３ＧＴ変異抗原、Ｇ３ＧＳ変異抗原、Ｇ３ＡＴ変異抗原、及びＧ３ＶＴ変異抗原には結合性を示さなかった抗体４種（Ａ１０６、Ａ１０７、Ａ１２７、及びＡ１３７）を、終濃度が５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））で希釈し、９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の１ウェルにつき１００μＬずつ分注した。次いで、これを４℃で一晩静置した後、ＰＢＳ ０．３５ｍＬを用いてそれぞれのウェルを２回洗浄した。その後、ブロッキング液（０．５％カゼイン－Ｎａを含むＰＢＳ）０．３５ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、さらに室温で３時間静置した。ブロッキング液を除去した後、マイクロプレートを真空乾燥させて各モノクローナル抗体固相化プレートを準備し、使用まで４℃で保管した。

前記モノクローナル抗体固相化プレートに、反応液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、及び０．００７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））９０μＬと、調製例４で得られたｔｒｐＥ－ｈｉｓ－Ｇ１Ｅ２ｓ：Ｇ１Ｅ２ｓ抗原（０．１μｇ／ｍＬ）１０μＬとを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）０．３５ｍＬを用いて、それぞれのウェルを５回洗浄した。その後、調製例６で調製した各ビオチン化モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）の５０００倍希釈物を１００μずつそれぞれ、前記モノクローナル抗体固相化プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識したストレプトアビジン（５００ｕｎｉｔ／ｍＬ）（ＳＡ－ＰＯＤ、ロシュ社製）を５０００倍希釈して調製した標識体液１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、ＯＤ４５０－ＯＤ６３０を測定結果として、Ｇ１Ｅ２ｓ抗原への結合性評価の指標とした。

下記の表６に、各モノクローナル抗体の組み合わせにおける測定結果及び評価結果を示す。表６において、「－」は結合性無し（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００未満）、「＋」は十分な結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００以上２．０００未満）、「＋＋」は強い結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：２．０００以上）、を示す。

表６に示したように、上記４種のモノクローナル抗体においてはいずれも、各モノクローナル抗体を捕捉体の補足用抗体としたときにＧ１Ｅ２ｓ抗原への結合性を示した。

（２）変異抗原（Ｇ３ＧＴ変異抗原）に対する結合性の検討
Ｇ１Ｅ２ｓ抗原に代えて、調製例４で得られたｔｒｐＥ－Ｇ３Ｄ４９６Ｇ：Ｇ３ＧＴ変異抗原（０．１μｇ／ｍＬ）を用いたこと以外は上記（１）と同様にして、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を変異抗原（Ｇ３ＧＴ変異抗原）への結合性評価の指標とした。

下記の表７に、各モノクローナル抗体の組み合わせにおける測定結果及び評価結果を示す。表７において、「－」は結合性無し（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００未満）、「＋」は十分な結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００以上２．０００未満）、「＋＋」は強い結合性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：２．０００以上）、を示す。

表７に示したように、上記４種のモノクローナル抗体の組み合わせにおいてはいずれも、変異抗原（Ｇ３ＧＴ変異抗原）に対する結合性は認められなかった。各組み合わせの中でも、検出用抗体がモノクローナル抗体Ａ１０７である場合には、補足用抗体がモノクローナル抗体Ａ１３７のときに最も低値を示した。

（３）ＨＥＶ抗原陽性検体への結合性の検討
Ｇ１Ｅ２ｓ抗原に代えて、ＴＲＩＡＮＡ社から購入したＨＥＶ抗原陽性検体（２０倍希釈）を用いたこと以外は上記（１）と同様にして、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）をＨＥＶ抗原陽性検体への反応性検討の指標とした。

下記の表８に、各モノクローナル抗体の組み合わせにおけるＨＥＶ抗原陽性検体への反応性の結果を示す。表８において、「－」は反応性無し（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：０．３００未満）、「＋」は十分な反応性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：０．３００以上１．０００未満）、「＋＋」は強い反応性有り（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０：１．０００以上）、を示す。

表８に示したように、モノクローナル抗体Ａ１０７を検出用抗体とした場合に、モノクローナル抗体Ａ１２７との組み合わせ、又は、モノクローナル抗体Ａ１３７との組み合わせにおいて、ＨＥＶ抗原陽性検体への反応性が確認された。調製例５及び上記（１）～（３）の結果より、下記の抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出系に用いるモノクローナル抗体として、検出用抗体としてはモノクローナル抗体Ａ１０７が最も好適であるとし、これと組み合わせる捕捉用抗体としては、モノクローナル抗体Ａ１３７が好適であるとした。

（試験例３） ＨＥＶ陽性・陰性検体での結合性の確認
（１）抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出系（実施例）
（１－１）抗ＨＥＶ抗体測定（抗体検出系）
市販又は従来公知の方法で生成された抗ヒトＩｇＭ抗体と、上記調製例５の（５－１）で精製したモノクローナル抗体Ａ１３７との質量比が１：４となるように混合し、抗体の合計濃度で終濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））で希釈し、９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の１ウェルにつき１００μＬずつ分注した。次いで、これを４℃で一晩静置した後、ＰＢＳ ０．３５ｍＬを用いてそれぞれのウェルを２回洗浄した。その後、ブロッキング液（０．５％カゼイン－Ｎａを含むＰＢＳ）０．３５ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、さらに室温で３時間静置した。ブロッキング液を除去した後、マイクロプレートを真空乾燥させて抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートを準備し、使用まで４℃で保管した。

これを用いて、ＴＲＩＮＡ社から購入したＥ型肝炎患者血漿を含むヒト血漿からなる検体群（１３検体）について、検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価を測定した。すなわち、前記抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートに、反応液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））９０μＬと、各検体１０μＬとを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）０．３５ｍＬを用いて、それぞれのウェルを５回洗浄した。その後、調製例６で調製したビオチン化変異抗原：Ｇ３ＧＴ変異抗原（０．０５μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつそれぞれ、前記プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識したストレプトアビジン（５００ｕｎｉｔ／ｍＬ）（ＳＡ－ＰＯＤ、サーモ社製）を５０００倍希釈して調製した標識体液１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６５０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価として、各検体の陰性及び陽性を判定した。

（１－２）ＨＥＶ測定（抗原検出系）
上記（１－１）と同様にして抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートを準備し、使用まで４℃で保管した。これを用いて、（１－１）と同じ検体群（１４検体）について、検体中のＨＥＶ抗原価を測定した。すなわち、前記抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートに、反応液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））９０μＬと、各検体１０μＬとを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）０．３５ｍＬを用いて、それぞれのウェルを５回洗浄した。その後、調製例６で調製したビオチン化モノクローナル抗体Ａ１０７（０．１５μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつそれぞれ、前記プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識したストレプトアビジン（５００ｕｎｉｔ／ｍＬ）（ＳＡ－ＰＯＤ、サーモ社製）を５０００倍希釈して調製した標識体液１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６５０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を検体中のＨＥＶ抗原価として、各検体の陰性及び陽性を判定した。

（１－３）同時検出系
上記（１－１）と同様にして抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートを準備し、使用まで４℃で保管した。これを用いて、（１－１）と同じ検体群（１４検体）について、検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価及びＨＥＶ抗原価の合計値を測定した。すなわち、前記抗ＩｇＭ抗体及びモノクローナル抗体Ａ１３７固相化プレートに、反応液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））９０μＬと、各検体１０μＬとを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）０．３５ｍＬを用いて、それぞれのウェルを５回洗浄した。その後、調製例６で調製したビオチン化変異抗原：Ｇ３ＧＴ変異抗原（０．０５μｇ／ｍＬ）とビオチン化モノクローナル抗体Ａ１０７（０．１５μｇ／ｍＬ）との混合液１００μＬをそれぞれ、前記プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識したストレプトアビジン（５００ｕｎｉｔ／ｍＬ）（ＳＡ－ＰＯＤ、サーモ社製）を５０００倍希釈して調製した標識体液１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、室温で３０分間反応させた。次いで、前記洗浄液で５回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク社製）の混合溶液を１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに２Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６５０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価及びＨＥＶ抗原価の合計値）として、各検体の陰性及び陽性を判定した。

（２）抗体検出系（比較例）
Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ社製のキット「ＨＥＶ－ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ」を用いて、上記（１－１）と同じ検体群（１３検体）について、検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価を測定した。具体的には、キットの抗ＩｇＭ抗体固相化プレートの各ウェルに、検体希釈液１００μＬ、及び検体１０μＬを添加し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにＰＯＤ標識した抗原ポリペプチド（遺伝子１型のＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２（ＤＤＢＪ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ１１０９２）にコードされるアミノ酸の３９４～６０６番目からなるリコンビナントＨＥＶ抗原ポリペプチド）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにクロモゲンＡ ５０μＬとクロモゲンＢ ５０μＬとを添加し、３７℃、暗所で１５分間反応させた。反応後、各ウェルに反応停止液を５０μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）を対照として波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を検体中の抗ＨＥＶ抗体（ＩｇＭ抗体）価として、各検体の陰性及び陽性を判定した。

（３）抗原検出系（比較例）
Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ社製のキット「ＨＥＶ－Ａｇ ＥＬＩＳＡ」を用いて、上記（１－１）と同じ検体群（１３検体）について、検体中のＨＥＶ抗原価を測定した。具体的には、キットの抗ＨＥＶポリクローナル抗体固相化プレートの各ウェルに、検体希釈液２０μＬ、及び検体５０μＬを添加し、３７℃で６０分間反応させた。反応後、各ウェルにＰＯＤ標識した抗ＨＥＶモノクローナル抗体１００μＬを追加添加し、３７℃で３０分間反応させた。次いで、洗浄液で５回洗浄後、各ウェルにクロモゲンＡ ５０μＬとクロモゲンＢ ５０μＬとを添加し、３７℃、暗所で１５分間反応させた。反応後、各ウェルに反応停止液を５０μＬずつ添加し、波長６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６５０）及び波長４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、測定結果（ＯＤ４５０－ＯＤ６３０）を検体中のＨＥＶ抗原価として、各検体の陰性及び陽性を判定した。

下記の表９に、上記（１）～（３）の各検出系における測定結果及び判定結果をそれぞれ示す。（２）の抗体検出系のカットオフ値は、次式：陰性コントロールの平均値（０．０４３）＋カットオフ係数（０．２６）により算出し、０．３０３であった。（３）の抗原検出系のカットオフ値は、次式：陰性コントロールの平均値（０．１６７）＋カットオフ係数（０．１６）により算出し、０．３２７であった。（１）の抗体検出系、抗原検出系、及び同時検出系のカットオフ値は、別途、ＴＲＩＮＡ社から購入したＥ型肝炎患者血漿を含まないヒト血漿からなる検体群（陰性検体：ｎ＝１００）の平均値＋１０ＳＤを適用し、それぞれ、０．２００、０．１００、及び０．２００であった。表９において、「－」は陰性（カットオフ値未満）、「＋」は陽性（カットオフ値以上、かつ、カットオフ値×５未満）、「＋＋」は強い陽性（カットオフ値×５以上）を示す。

表９に示したように、本発明のポリペプチド（Ｇ３ＧＴ変異抗原）を抗原ポリペプチドとした抗ＨＥＶ抗体検出系（１－１）においては、従来の抗ＨＥＶ抗体検出系（２）のキット（Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ社のＨＥＶ－ＩｇＭ ＥＬＩＳＡキット）を用いた結果と同等の反応性を示した。また、ＨＥＶ検出系（１－２）においても、従来のＨＥＶ検出系（３）のキット（Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ社のＨＥＶ－Ａｇ ＥＬＩＳＡキット）を用いた結果と同等の反応性を示した。さらに、本発明のポリペプチド（Ｇ３ＧＴ変異抗原）を抗原ポリペプチドとした、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの同時検出系（１－３）においては、（１－１）の抗体検出系及び（１－２）の抗原検出系を総合した結果に一致して、かつ、互いに阻害することなく、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶの両方を同時に高感度で検出できることが確認された。なお、検体番号２、７、１１は、ＨＥＶ抗原及び抗ＨＥＶ抗体陰性検体であった。以上の結果より、本発明のポリペプチド（変異抗原）を抗原ポリペプチドとして用いた同時検出方法によれば、従来のように２種の検出系（抗体検出系及び抗原検出系）をそれぞれ別に行わなくとも、簡便かつ高感度に、抗ＨＥＶ抗体及びＨＥＶを同時に検出することが可能となることが確認された。

本発明によれば、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出、特に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出を十分に高感度で行うことが可能なポリペプチド、それを用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法、並びに、これらの検出方法に用いるキットを提供することが可能となる。

Claims (10)

1. 下記（１ａ）～（１ｃ）、（２ａ）～（２ｃ）、（３ａ）～（３ｃ）、及び（４ａ）～（４ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするポリペプチド。
   （１ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （１ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （１ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （２ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （２ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （２ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （３ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （３ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （３ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （４ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （４ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （４ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第４１番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
2. （１ａ）～（１ｃ）、（２ａ）～（２ｃ）、（３ａ）～（３ｃ）、及び（４ａ）～（４ｃ）のポリペプチドにおいて、前記置換アミノ酸が、それぞれ独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、又はスレオニンであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法に用いるための抗原ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
4. 試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法に用いるためのキットであり、
   抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する抗原ポリペプチドを含み、
   前記抗原ポリペプチドが請求項１に記載のポリペプチドである、
   ことを特徴とするキット。
5. 試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスを同時に検出する方法に用いるためのキットであり、
   抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体と、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する抗原ポリペプチドと、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第２の抗体と、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第３の抗体と、を含み、
   前記抗原ポリペプチドが請求項１に記載のポリペプチドであり、
   第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体である、
   ことを特徴とするキット。
6. 前記抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体のアイソタイプがＩｇＭであることを特徴とする、請求項４又は５に記載のキット。
7. 試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法であり、
   試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する検出工程を含み、
   前記抗原ポリペプチドが請求項１又は２に記載のポリペプチドである、
   ことを特徴とする、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。
8. 前記検出工程が、前記試料と、第１の捕捉体と、第１の検出体と、を接触させる工程であり、
   第１の捕捉体が、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
   第１の検出体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの他方を備えるものである、
   ことを特徴とする、請求項７に記載の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。
9. 試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスを同時に検出する方法であり、
   試料中の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体に対する第１の抗体及び抗原ポリペプチドを結合させて抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する第１の検出と、前記試料中のＥ型肝炎ウイルスに、Ｅ型肝炎ウイルスに対する第２の抗体及びＥ型肝炎ウイルスに対する第３の抗体を結合させてＥ型肝炎ウイルスを検出する第２の検出と、を同時に行う検出工程を含み、
   前記抗原ポリペプチドが請求項１又は２に記載のポリペプチドであり、
   第２の抗体及び第３の抗体が前記抗原ポリペプチドに結合しない抗体である、
   ことを特徴とする、抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法。
10. 前記検出工程が、前記試料と、第１の捕捉体と、第１の検出体と、第２の捕捉体と、第２の検出体と、を接触させる工程であり、
    第１の捕捉体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
    第１の検出体が、第１の抗体及び前記抗原ポリペプチドのうちの他方を備えるものであり、
    第２の捕捉体が、第２の抗体及び第３の抗体のうちの一方と、非水溶性担体と、を備えるものであり、
    第２の検出体が、第２の抗体及び第３の抗体のうちの他方を備えるものである、
    ことを特徴とする、請求項９に記載の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体及びＥ型肝炎ウイルスの同時検出方法。