CN101880318A - 戊型肝炎病毒4型orf2片段的病毒蛋白颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种戊型肝炎病毒的蛋白颗粒，具体的讲，涉及戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，肝炎病毒蛋白颗粒的重组表达载体、宿主细胞、抗体，肝炎病毒蛋白颗粒、抗体和核苷酸序列的应用，表达方法以及其制备方法和应用。本发明的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列中至少477位连续的核苷酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种戊型肝炎病毒的蛋白颗粒，具体的讲，是涉及戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，以及其制备方法和应用。
背景技术
戊型肝炎的病原体为戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)，属单股正链RNA病毒，无包膜，目前发现只存在一种血清型。戊型肝炎主要经粪口途径传播，另外有证据表明，在戊肝流行区，除肠道传播途径外，HEV尚可通过非粪口途径及母婴传播。Xia等取体内存在HEV的人静脉血10ml注入恒河猴体内，发现猴体内有HEV存在，表明经血液也是HEV传播的一个危险途径。除了引发急性戊型肝炎之外，超过50％以上的急性肝功能衰竭也是由HEV引起的，而自然人群戊型肝炎抗体的保护率却不超过25％，故人群对戊型肝炎普遍易感，戊型肝炎疫苗的研制刻不容缓。目前虽然已有许多细胞系能支持HEV复制，但均不能产生足够高滴度的HEV病毒颗粒，另外，HEV在现有的传代细胞中经历数次传代后均出现不适应，尚未发现能在体外持续支持HEV复制的传代细胞系，因而无法大量生产用于检测抗HEV抗体的病毒抗原及制备减毒活疫苗。
目前戊型肝炎疫苗研究的热点是基于HEV基因的重组壳蛋白；除此之外，DNA疫苗和转基因番茄疫苗等也在研发之中。其中最佳的候选戊肝疫苗是用杆状病毒表达的HEV基因重组壳蛋白(分子量为55kD)疫苗。
目前已发现的HEV主要有4个基因型，24个亚型。不同基因型基因组结构上差异见图1。HEV虽然有多种基因型，但多数病毒的血清型相同，灵长类动物攻击试验也证实HEV的1、2、3基因型之间可以发生交叉保护反应。
HEV基因组具有3个开放读码框(open reading frame，ORF)。其中ORF1编码产物为病毒功能蛋白；ORF2编码一含660氨基酸的糖基化蛋白，分子量约为72kD，为病毒衣壳蛋白，其中至少含有7个线性抗原表位，特别是其C末端，有多个重要免疫抗原表位；ORF3与ORF1、ORF2部分重叠，其编码的蛋白至少含有4个线性抗原表位，但该蛋白的具体功能目前仍不太清楚。
ORF2是疫苗研究的焦点，而戊型肝炎病毒衣壳上的中和表位又是核心问题。越来越多的研究表明HEV ORF2编码的结构蛋白C端的2/3部分含有多个具有免疫优势的B细胞表位，包括能诱导免疫保护力的抗原表位，因而广泛应用于HEV感染的免疫诊断及疫苗研究。Kaur等用含10个氨基酸的合成肽与戊型肝炎患者血清反应，检测HEV的B细胞表位。结果显示ORF2有3个线性表位，分别位于25～28，341～354及517～530氨基酸。长期以来，针对HEV抗原表位的研究一直集中在HEV中和抗原表位柤碆细胞表位领域。Aggarwal等应用淋巴细胞增殖试验和重叠肽库分析的方法来定位HEV ORF2和ORF3编码蛋白的CD4 T细胞表位，结果显示ORF2编码蛋白的T细胞表位位于289～372氨基酸。该研究结果对机体感染HEV产生细胞免疫的机制及戊型肝炎疫苗的研究有重要意义。
目前国内外学者大多采用HEV重组蛋白进行免疫预防，使易感者体内出现保护性的特异免疫应答产物，即产生针对HEV的特异性抗体和/或效应T细胞，阻断病毒感染肝细胞，从而发挥免疫保护作用。现已有许多ORF2基因或其片段在不同细胞中成功地进行了表达，如原核细胞、昆虫细胞、酵母细胞、动物和植物细胞等，且其表达产物均具有良好的免疫原性。
1.原核表达系统
Purdy等用大肠杆菌表达HEV ORF2 C端436个氨基酸，制成trpE-C2重组融合蛋白，用其免疫猕猴研究该蛋白的免疫保护性。结果显示该重组HEV ORF2蛋白可对受到同源毒株攻击的动物提供保护。
2.昆虫杆状病毒表达系统
Li等对应用杆状病毒表达系统表达HEV病毒样颗粒(VLPs)进行了多年的研究表明：以往应用多种表达系统无法产生均一、大量的VLPs，而杆状病毒表达系统的则具有以下优势：(1)产量高；(2)应用Hi-5细胞表达可分泌至上清中，制备毫克级的VLPs；(3)VLPs抗原性类似天然HEV。其实验室应用杆状病毒表达系统表达的HEV VLPs进行ELISA检测，结果灵敏度与特异性均较好。食蟹猴口服免疫HEV VLPs，可诱发产生血清IgM、IgG、IgA抗体反应，应用天然HEV攻毒后显示，口服免疫对感染具有保护性。
在美国，一种用杆状病毒表达的55kD的重组壳蛋白疫苗首先通过I期临床试验，在尼泊尔进行II和III期临床试验，II期临床试验结果表明：针对高危人群，重组HEV疫苗可有效预防戊型肝炎的发生。
3.酵母表达系统
苏彩霞等利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)系统成功表达HEV 4型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段，得到分子量为56kD的重组蛋白，为进一步研究基于ORF2抗原大片段的基因工程疫苗打下了坚实的基础。
4.其他相关疫苗研究
Guo等应用HEV重组ORF2壳蛋白与铝佐剂联合免疫鸡，可诱发保护性免疫反应。Zhou等将HEV-E2片段插入烟草质体基因组，进而在小鼠体内表达出pE2抗原，研究表明烟草质体有望成为经济有效的来源应用于HEV疫苗的生产。Li等进行的研究表明，在大型动物(如羊)中，Sig3(HEV ORF2编码蛋白末端的50个氨基酸)可作为DNA疫苗的靶分子。Lin等进行的研究显示应用P34表位-Th表位初免BALB/C小鼠，可提高其载体蛋白-E2的免疫原性。另外，有研究表明应用转基因植物表达的重组抗原亦显示出免疫原性。
发明内容
本发明要解决的首要技术问题是提出一种戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒。
本发明要解决的第二技术问题是提出编码该戊型肝炎病毒蛋白颗粒的核苷酸序列。
本发明要解决的第三技术问题是提出本发明的戊型肝炎病毒蛋白颗粒的抗体。
本发明要解决的第四技术问题是提出本发明的戊型肝炎病毒蛋白颗粒的重组表达载体、宿主细胞和表达方法。
本发明要解决的第五技术问题是提出本发明的肝炎病毒蛋白颗粒、抗体和核苷酸序列的应用。
本发明要解决的第六技术问题是提出预防戊型肝炎的疫苗。
本发明要解决的第七技术问题是提出治疗或预防戊型肝炎的药物组合物。
为完成本发明之目的，本发明采用的技术方案为：
本发明涉及一种戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，具有SEQ NO：1或SEQNO：3所示序列中至少477位连续的核苷酸序列。
本发明的第一优选方案为：本发明的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1～21位为蛋白的N端，497～516位为蛋白的C端。
本发明的第二优选方案为：本发明的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13～21位为蛋白的N端，508～516位为蛋白的C端。
本发明的第三优选方案为：本发明的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端，508位为蛋白的C端。
本发明的病毒蛋白颗粒在电镜70,000倍下为直径30～40nm的颗粒。
本发明还涉及一种戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒的核苷酸序列，具有SEQNO：2或SEQ NO：4所示的核苷酸序列。
本发明又涉及一种抗体，具有本发明所述的病毒蛋白颗粒有特异性的结合亲和力。
本发明又涉及一种重组表达载体，含有本发明的核苷酸序列。
本发明又涉及一种宿主细胞，含有本发明所述的重组表达载体。
本发明又涉及一种产生免疫原性戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒的方法，包括：在适合表达所述病毒蛋白颗粒的条件下，培养本发明所述的宿主细胞。其优选方案包括以下四个步骤：
(1)PCR扩增得到目的基因，将目的基因片段克隆入pEASY-T3质粒中，并鉴定；
(2)将步骤(1)中的重组质粒克隆至昆虫杆状病毒表达系统的载体pFastBac1中，得到pFastBac1重组质粒，并鉴定；
(3)将步骤(2)中pFastBac1重组质粒感染大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，鉴定阳性克隆，分离重组杆粒DNA；
(4)将步骤(3)得到的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，得到重组杆菌病毒。
本发明还涉及一种用于预防人戊型肝炎的疫苗，含有本发明的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒中的至少一种和药学上可接受的载体和/或佐剂。
本发明还涉及一种用于预防或治疗人戊型肝炎的药物组合物，含有治疗有效量的抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及一种用于诊断人戊型肝炎的诊断试剂盒，包括本发明的病毒蛋白颗粒、核苷酸序列、抗体，以及适用于所述抗原抗体结合反应的检测试剂。
本发明还涉及戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒和抗体在制备诊断、预防或治疗人戊型肝炎的药物中的应用。
下面对本发明的发明内容做进一步的描述。
本发明涉及一种戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，具有SEQ NO：1或SEQNO：3所示序列中至少477位连续的核苷酸序列。
本发明的病毒蛋白颗粒的序列选自：
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
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以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的8位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
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以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的11位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的12位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的14位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的15位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3示序列的16位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的16位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的17位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的18位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的19位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、506位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的20位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、497位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、498位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、499位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、500位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、501位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、502位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、503位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、504位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、505位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、507位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、508位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、509位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、510位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、511位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、512位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、513位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、514位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、515位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；以SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的21位为蛋白的N端、516位为蛋白的C端的病毒蛋白颗粒；
其中，SEQ NO：1所示的氨基酸序列为：
SAPAGASPLTAVAPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSTIATGTNLVLYAALLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSSARHKLRRGPDGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYP
SEQ NO：2所示的核苷酸序列为：
GCCACCATGTCTGCCCCAGCTGGGGCTTCGCCGTTAACGGCTGTGGCTCCGGCCCCTGACACCGCCCCAGTTCCCGATGTTGATTCTCGTGGCGCCATACTACGTCGCCAGTATAATTTATCAACATCCCCACTCACGTCCACTATCGCTACTGGTACTAATCTTGTTCTGTATGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTGCTCCCGCTTCAGGATGGAACTAATACTCATATTATGGCCACTGAGGCTTCAAATTATGCCCAGTATCGCGTTGCCCGTGCCACCATCCGGTACCGCCCGTTAGTGCCGAATGCTGTTGGCGGGTACGCTATTTCTATCTCTTTCTGGCCCCAGACAACAACCACTCCGACATCTGTTGATATGAACTCTATCACCTCCACTGATGTTCGAATTCTTGTCCAACCCGGTATCGCCTCTGAACTTGTGATCCCTAGTGAGCGCCTGCATTATCGTAATCAAGGCTGGCGTTCGGTTGAGACCTCTGGTGTCGCGGAGGAAGAGGCGACCTCTGGTCTTGTTATGCTTTGCATTCACGGTTCGCCTGTGAACTCCTATACCAATACGCCTTATACTGGTGCACTTGGCTTGCTTGATTTCGCGCTCGAGCTCGAGTTTCGTAATCTAACACCTGGCAATACGAACACTCGTGTCTCCCGTTATTCTAGCAGTGCACGCCACAAGCTACGCCGCGGGCCTGATGGCACTGCTGAATTAACTACTACTGCTGCCACCCGCTTTATGAAAGACCTTCACTTTACAGGGACTAATGGTGTTGGTGAGGTTGGTCGTGGCATAGCGTTAACCCTGTTTAACCTTGCTGATACGCTTCTCGGTGGGCTACCGACAGAATTGATTTCGTCGGCTGGTGGACAATTGTTTTACTCTCGCCCCGTCGTCTCAGCCAATGGCGAGCCGACAGTGAAACTTTACACTTCAGTCGAGAATGCCCAGCAGGATAAGGGTATAGCTATCCCCCACGATATTGATCTTGGTGAGTCCCGAGTTGTCATCCAGGACTATGATAACCAACACGAGCAGGACCGCCCCACTCCTTCTCCGGCCCCCTCTCGCCCCTTCTCTGTCCTTCGTGCTAATGACGTGCTCTGGCTATCTCTTACAGCCGCTGAGTATGACCAGACTACCTATGGCTCTTCTACCAATCCTATGTATGTTTCTGACACTGTGACATTTGTTAATGTAGCTACTGGTGCCCAGGGAGTTTCCCGCTCTCTTGACTGGTCCAAAGTCACTCTTGATGGACGCCCACTCACTACTATCCAGCAGTATTCTAAAACATTCTATGTTTTACCTCTCCGTGGTAAACTTTCCTTCTGGGAGGCTGGTACTACCAAGGCTGGCTACCCTTATAATTATAATACTACTGCTAGTGACCAGATTTTAATAGAGAATGCGGCTGGTCACCGTGTCTGCATTTCAACTTATACTACTAATCTTGGCTCCGGCCCTGTTTCTATTTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCTCACTCTGCGCTGGCCGCTCTGGAGGATACCGTCGACTATCCATAG
其中，GCCACC序列为Kozak序列，GCCACC序列后的ATG为表达需要的起始子和最后三位TAG终止子，可以提高表达效率。
SEQ NO：3所示的氨基酸序列为：
PAPAGASPLTAVAPAPDTAPVPDADSRGAILRRQYNLSTSPLTSTIATGTNFVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVTPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSSARHKLRRGPDGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGELTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSVSAVGVLAPHSALAALEDTADYP
SEQ NO：4所示的核苷酸序列为：
CCTGCCCCAGCTGGGGCTTCGCCGTTGACTGCTGTGGCTCCGGCTCCTGACACTGCACCTGTCCCCGATGCTGATTCCCGTGGCGCTATTCTACGCCGCCAGTACAATTTGTCCACATCCCCGCTCACGTCCACTATTGCAACTGGCACCAATTTTGTGCTATATGCTGCCCCACTTAGTCCCCTGCTACCGCTTCAGGATGGCACCAATACCCACATCATGGCTACTGAAGCATCTAATTATGCCCAGTATCGTGTTGTTCGTGCTACCATCCGATATCGCCCCTTGGTGCCGAATGCCGTTGGCGGGTATGCCATATCTATCTCCTTTTGGCCTCAGACAACGACCACCCCAACGTCTGTTGATATGAATTCAATTACCTCCACTGATGTCCGCATTCTTGTCCAGCCTGGTATAGCTTCTGAGTTGGTAACTCCCAGTGAGCGCCTGCATTATCGAAATGAAGGATGGCGTTCGGTTGAGACCTCTGGTGTCGCTGAGGAAGAAGCGACCTCTGGCCTTGTTATGCTTTGCATTCATGGGTCACCTGTGAATTCCTATACTAATACACCTTATACCGGTGCCCTCGGCTTACTTGACTTTGCACTCGAGCTCGAGTTTCGCAATTTGACACCTGGTAACACCAATACGCGCGTTTCTCGTTATTCGAGTAGCGCGCGTCACAAACTGCGCCGAGGGCCTGATGGTACTGCTGAGTTGACTACTACTGCCGCCACACGTTTTATGAAAGACCTCCATTTTACGGGGACTAATGGTGTTGGTGAGGTCGGTCGTGGTATAGCGTTAACTTTGTTTAATCTTGCTGATACGCTTCTCGGTGGGCTTCCGACAGAATTGATTTCGTCGGCAGGGGGTCAGTTATTCTACTCCCGCCCCGTTGTCTCAGCCAATGGCGAGCTGACAGTGAAACTTTACACTTCAGTCGAGAACGCTCAGCAGGACAAGGGTGTAGCTATTCCACATGATATTGACCTTGGTGAGTCCCGTGTGGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAAGATCGTCCCACTCCCTCCCCTGCTCCCTCTCGTCCATTTTCTGTTCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTTTCACTTACTGCTGCTGAGTATGATCAAACGACTTATGGCTCCTCTACCAACCCTATGTATGTTTCTGACACTGTTACATTTGTTAACGTAGCGACTGGTGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGATTGGTCTAAGGTCACTCTCGATGGCCGTCCACTCACCACCATCCAGCAGTATTCTAAGACTTTCTATGTCTTGCCCCTTCGTGGTAAGCTTTCCTTTTGGGAGGCCGGCACCACTAAAGCCGGCTACCCTTATAATTATAACACTACTGCTAGTGACCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCGGGCCACCGAGTTTGCATCTCTACCTACACTACTAACCTGGGCTCCGGGCCTGTGTCTGTATCTGCTGTTGGTGTCCTCGCCCCTCACTCTGCGCTGGCTGCTTTGGAGGATACCGCTGACTACCCT
除非另有定义，本发明中所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域中的熟练技术人员所理解的通常含义，这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
本发明所述的疫苗中可用的免疫佐剂包括但不限定于：氢氧化铝、磷酸铝、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂等。
本发明中所述的“治疗有效量”是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量，本领域技术人员知晓，说的“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用抗体的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，临床医生应当能够凭经验得出所用的“治疗有效量”。优选的，本发明中所治疗有效量为每千克体重0.001～20mg，特别优选0.01～10mg，更优选0.1～10mg。
本发明所述的预防和/或治疗戊型肝炎病毒感染的药物组合，其包含预防和/或治疗有效量的病毒颗粒的抗体中的至少一种，以及任选的药学上课接受的载体和/或赋形剂。根据施用对象的具体情况，本领域的技术人员知晓如何选择适当的剂量和给要方法，优选的，本发明中所述的治疗有效量为每千克体重0.001～20mg，特别优选0.01～10mg，更优选0.1～10mg。
附图说明
图1为HEV基因组结构示意图，其中A为基因1型-3型，B为基因4型；
图2为质粒pEASY-T3结构图；
图3为载体pFastBac1结构图；
图4为载体pFastBac1的多克隆位点；
图5为杆粒在DH10Bac？感受态细胞中的转座模式；
图6为阳性对照质粒pFastBacl-Gus结构图
图7为PCR扩增结果：其中箭头所指的是1500bp；其中，分子量标准自上而下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图8为BamH I和Hind III双酶切鉴定pFastBac1重组质粒；其中分子量标准自上而下分别为10,000bp、8000bp、6000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp。
图9为PCR分析重组杆粒结果；分子量标准自上而下分别为10,000bp、8000bp、6000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp；
图10为未感染的Sf9细胞；
图11为感染杆状病毒72小时的Sf9细胞(400×)；
图12为Western Blot检测重组蛋白的初步表达；
图13感染时相的优化；
图14为感染量的优化；
图15感染时相的优化-ELISA测定结果；
图16噬斑法滴定杆状病毒；
图17为噬斑法滴定结果：该孔为106稀释度，空斑数为20，则杆状病毒滴度为2×107pfu/ml；
图18为免疫荧光-阴性对照；
图19为免疫荧光-感染72小时细胞；
图20病毒样颗粒的透射电镜照片；
图21病毒样颗粒的透射电镜照片。
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅对本发明的内容进行进一步的解释和说明，并不对本发明的内容进行限制。
材料
1.质粒及载体
模板质粒pCB-E2-4为本室马红霞博士惠赠。
克隆载体pEASY-T3购自北京全式金生物技术有限公司。
杆状病毒供体质粒载体pFastBac1为美国Invitrogen公司产品。
2.菌株和细胞株
大肠杆菌菌株DHi0Bac为美国Invitrogen公司产品，大肠杆菌DH5α为本室保存。Sf9昆虫细胞由中国医学科学院许雪梅教授惠赠。
3.其他试剂耗材
琼脂糖(Agarose) Promega
酵母粉，胰蛋白胨 OXIOD
琼脂粉 北京欣经科
LA Taq聚合酶 TaKaRa
1kbDNA电泳Marker NEB
100bpDNA电泳Marker 天根生物
胶回收试剂盒 全式金
限制性核酸内切酶 NEB
T4DNA连接酶 NEB
质粒小量提取试剂盒 天根生物
Cellfectin转染试剂 Invitrogen
SF 900II SFM无血清培养基(1×) Invitrogen
SF 900II SFM无血清培养基(1.3×) Invitrogen
细胞培养板、细胞培养瓶 BD
质粒大量提取试剂盒 QIAGEN
预染蛋白Marker Fermantas
硝酸纤维素膜 Amersham Biosciences
碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体 中杉金桥
其它生化试剂 北京化工
4.主要仪器
5.常用溶液配制
5.1引物合成：由上海生工生物公司合成，PAGE级，纯度＞98％。
5.2测序：由奥科生物技术有限公司完成。
5.3细菌培养所用试剂：
LB液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 10g，加水至1L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌20min；
LB固体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加水至1L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌20min。
5.4抗生素配制：
卡那霉素(10mg/ml)：用ddH2O配成浓度为10mg/ml的贮存液，0.2μm滤器过滤除菌，-20℃避光冻存备用；
氨苄青霉素(50mg/ml)：用ddH2O配成浓度为50mg/ml的贮存液，0.2μm滤器过滤除菌，-20℃避光冻存备用；
四环素(10mg/ml)：用无水乙醇配成浓度为10mg/ml的贮存液，0.2μm滤器过滤除菌，-20℃避光冻存备用；
庆大霉素(7mg/ml)：用ddH2O配成浓度为50mg/ml的贮存液，0.2μm滤器过滤除菌，-20℃避光冻存备用。
5.5IPTG(200mg/ml)：用ddH2O配成浓度为200mg/ml的贮存液，0.2μm滤器过滤除菌，-20℃冻存备用
5.6琼脂糖电泳缓冲液：50×TAE：Tris242克、冰乙酸57.1ml、0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ml，加水定容至1L，调pH值至8.4。
5.7CaCl2法制备新鲜的感受态细胞：0.1mol/L CaCl2，在适量水中溶解5.4g CaCl2·H2O，加甘油终浓度为10-20％，并定容至200ml，高压除菌后保存于4℃备用。
5.8SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂：
30％丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N′-亚甲丙烯酰胺1g，溶于60ml水中，定容至100ml，滤纸过滤后使用；
5xTris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000ml；
1.5mmol/L Tris-Cl(pH8.8)：在800ml水中溶解186.71gTris，调pH8.8，定容至1000ml；
0.5mmo/L Tris-Cl(pH6.8)：在800ml水中溶解121.14gTris，调pH6.8，定容至1000ml；
10％SDS：900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，分装备用；
10％过硫酸铵：称取过硫酸铵2g，适量水溶解后，定容于至20ml，分装成1ml/管，-20℃保存备用；
TEMED：4℃避光保存；
脱色液：45％甲醇，45％水，10％冰乙酸；
考马斯亮蓝染液：脱色液中加考马斯亮蓝R-250或G-250至0.25％，滤纸过滤后使用；
2xSDS凝胶加样缓冲液：Tris-HCl(0.5M，PH6.8，2.5ml)，SDS(0.4g)，甘油(2ml)，β-巯基乙醇或DTT(0.2ml)，溴酚蓝(1％)。
5.9Western Blot试剂：
封闭液：3％脱脂奶PBS溶解；
磷酸缓冲盐溶液(PBS)：在800ml水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4，盐酸调PH值至7.4，加水定容至1000ml；
电转移缓冲液：在800ml水中溶解2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS、200ml甲醇，加水定容至1000ml；
PBST：PBS中加Tween-20至0.2％；
碱性磷酸酶缓冲液：100mmol/LNaCl，5mmol/LMgCl，100mmol/L Tris-HCl(pH9.5)；
NBT：在10ml 70％的二甲基甲酰胺中溶解0.5g NBT；
BCIP：在10ml 100％的二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP；
显色底物溶液：10ml碱性磷酸酶缓冲液中加入66μlNBT及33μlBCIP。
5.10细胞裂解液
62.5mM Tris-HCl，pH6.8，2％SDS。
二、实验方法
1.大肠杆菌E.coli化学感受态细胞的制备
(1)从平板中挑取单菌落(直径1～2mm)，转至含5ml无抗LB培养基的试管中，于37℃振摇(220rpm)培养过夜。
(2)培养过夜的菌液1∶100转接至含100ml无抗LB培养基的250ml三角烧瓶中，于37℃振摇(220rpm)培养，每隔20～30min测量A600值监测培养物的生长情况。
(3)当A600值达0.375左右时，在无菌条件下，将细菌转移到两个无菌、一次性、用冰预冷的50ml聚丙烯管(Falcon270)中，冰上放置30min，使培养物冷却至0℃。
(4)4℃，4000g，离心10min。
(5)倾去上清，以20ml用冰预冷的制备液(0.1mol/L CaCl2，10％甘油)重悬菌体，冰浴30min。
(6)4℃，4000g，离心10min。
(7)倾去上清，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的制备液(0.1mol/L CaCl2，10％甘油)重悬菌体。
(8)将制备的感受态细胞分装于预冷的1.5ml离心管中，100μl/管，冻存于-70℃备用。
2.PCR产物回收
使用天根生化凝胶回收试剂盒进行胶回收。
(1)PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带所在的胶块，并将其放入一干净的1.5ml离心管中，称取重量。
(2)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积视为100μl，则加入300μl溶胶液)，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(3)溶解的胶液全量移入吸附柱，13,000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(4)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管中，13,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
(6)将吸附柱放入一干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中央加入30μl洗脱液，室温静置1min；13,000rpm离心1min，收集洗脱液，-20℃储存备用。
3.转化
(1)从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰盒中解冻。
(2)取5μl连接产物加入刚刚解冻的感受态细胞中，于冰盒中静置30min。
(3)30min过后，将感受态细胞放入42℃水浴中准确计时30秒，而后重新放入冰盒中静置2min。
(4)每管加入室温LB培养基600μl，于37℃，80～120rpm振摇45min。同时将细菌培养板置于37℃平衡。
(5)将EP管置于台式离心机中，2000rpm离心5min，倾去大部分培养基，重悬菌体，加于培养板上，或于离心前直接取50～200μl菌液加于平板上，用细菌涂布棒将液体均匀涂开
(6)将细菌培养板倒置于37℃孵箱中培养12～16小时。
4.质粒的小量提取
挑取细菌培养板上的单克隆菌落，37℃振摇过夜，使用天根生化质粒提取试剂盒进行质粒小量提取。
(1)取1.5ml过夜培养的菌液，加于1.5ml离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，低压真空泵吸除上清。
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(使用前加入RNaseA，使其终浓度为100μg/ml)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
(3)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转8～10次使菌体充分裂解，此时菌液变得清亮粘稠。
(4)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转8～10次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心10min，此时在离心管底部及侧壁形成沉淀。
(5)小心的将上清倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要倒入沉淀。室温放置1min，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前按要求加入无水乙醇)，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，弃掉收集管中的废液。
(8)将吸附柱CB3重新放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(9)将吸附柱CB3置于一个干净的1.5ml离心管中，于37℃孵箱中静置10min，使吸附膜充分晾干。
(10)向吸附膜的中央部位滴加50μl溶解缓冲液(Elution Buffer)，室温放置1min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
(11)取2μl质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、定量。
实施例1戊型肝炎病毒蛋白颗粒在昆虫杆状病毒表达系统中的表达
1.昆虫细胞的培养
(1)Sf9细胞的冻存
| 细胞系 | 冻存培养基 | 密度(cell/ml) | 复苏后贴壁时间(min) |
| Sf9 | 60％Grace’s Insect Medium 30％FBS 10％DMSO | 1×107 | 3045 |
a.用细胞计数器计数细胞。
b.将无菌细胞冻存管置于冰上，做好标记。
c.400-600g室温离心10min，弃上清。
d.用上表的冻存培养基按上述密度重悬细胞。
e.将1ml细胞悬液转移至无菌细胞冻存管。
f.-20℃放置1小时，-80℃放置24-48小时。
g.冻存于液氮。
(2)Sf9细胞的复苏及贴壁培养
a.将细胞冻存管置于37℃温水中，轻轻摇动使其尽快融化。
b.用70％乙醇擦拭冻存管外部，置于冰上。
c.向25cm2细胞培养瓶中加入4ml Sf-900II SFM培养基。
d.将1ml细胞悬液加入培养瓶中，27℃贴壁30-45min。
e.贴壁后去除培养基，加入5ml新鲜培养基。
f.24小时后，给细胞换液，并检测细胞活力。传代无需胰酶消化，直接吹打即可，一般每周传代2-3次。
2.重组pFastBac1载体的构建
(1)目的基因的获得：
以质粒pCB-E2-4为模板，设计引物进行PCR扩增得到目的基因栁煨透窝撞《？型ORF2编码的第13-508位氨基酸的基因。为了提高表达水平与效率，引物设计时引入Kozak序列。引物序列如下：
126U 5′-GGATCCGCCACCATGGCTGTGGCTCCGGCC-3′
126D 5′-AAGCTTCTACAGCGCAGAGTGAGGTGCGAG-3′
上游引物引入BamHI酶切位点(下划线标示)，Kozak序列(方框标示)，下游引物引入HindIII酶切位点(下划线标示)。
PCR反应体系如下：
| TaKaRa LA Taq(5U/μl) | 0.25μl |
| 10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus) | 2.5μl |
| 126U(20μM) | 0.5μl |
| 126D(20μM) | 0.5μl |
| dNTP混合物(各2.5mmol/L) | 4μl |
| 模板质粒pCB-E2-4 | 1ng |
| 火菌双蒸水 | 加至25μl |
PCR扩增条件：
| 反应条件 | 循环数 |
| 94℃，1min | 1 |
| 98℃，10s；68℃，1min 30s | 30 |
| 72℃，10min | 1 |
[0233](2)将目的基因克隆至T载体中：
琼脂糖凝胶回收上述目的基因片段，约1.5kb，并将回收的目的片段克隆入pEASY-T3载体中，pEASY-T3载体结构图见附图2：
a.克隆反应体系的建立：在微型离心管中依次加入以下溶液：
| 回收的PCR产物 | 1μl |
| pEASY-T3 | 1μl |
用移液器轻柔混匀反应体系，置室温反应10min，反应结束后，将离心管置于冰上。
b.将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞。
c.挑取单菌落，提取质粒，进行酶切鉴定。
d.将酶切结果正确的克隆送测序鉴定，在NCBI上利用BLAST对测序结果进行分析，确定该序列与欲扩增模板序列完全一致，进行下列实验。
(3)将目的基因克隆至昆虫杆状病毒表达系统的特异性载体pFastBac1(见附图3)上，载体pFastBac1的多克隆位点见附图4。
a.将上述鉴定正确的质粒及pFastBac1载体应用BamH I、Hind III双酶切后，琼脂糖凝胶回收。
双酶切反应体系如下：
| 10×BamH I buffer | 5μl |
| 10×BSA | 5μl |
| 待酶切的质粒或载体 | 2？g |
| BamH I | 0.7μl |
| Hind III | 0.7μl |
| 双蒸水 | 加至50μl |
b.将上述酶切回收的目的片段与pFastBac1载体按摩尔比为5∶1放入连接体系中，加入0.5μl T4 DNA连接酶，1μl 10×T4连接酶缓冲液，用无菌双蒸水将反应体系补充至10μl，16℃连接16小时。
c.将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞。
d.挑取单菌落，提取质粒，BamH I、Hind III双酶切鉴定阳性克隆。
3.重组杆粒的扩增
将构建好的重组pFastBac1载体转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，完成杆粒转座，杆粒转座模式如图5所示：
a.于冰上融化DH10Bac？感受态细胞。
b.轻轻混匀并将100μlDH10Bac感受态细胞转移至预冷的圆底离心管中。
c.加入1ng质粒DNA并轻轻混匀。
d.冰浴30分钟。
e.42℃热激45秒，迅速转入冰中2分钟。
f.加入900μl室温放置的S.O.C.培养基，225rpm 37℃振摇4小时。
g.用S.O.C.培养基倍比稀释的细胞(10-1，10-2，10-3)。每个稀释度取100μl涂于LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml X-gal，40μg/mlIPTG)
h.平板于37℃孵育48小时以上。
(2)应用蓝/白斑筛选初步鉴定包含重组杆粒的阳性克隆。
a.挑取10个白色克隆(为避免假阳性，尽量挑选大的、独立的白色克隆)，重新划线于新鲜配制的LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml X-gal，40μg/mlIPTG)，37℃孵育过夜。
b.挑选白色克隆，转接于含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素的LB液体培养基。
c.提取重组杆粒DNA。
(3)PCR分析确定包含重组杆粒的阳性克隆。
a.引物序列：
M13Forward(-40) 5′d[GTTTTCCCAGTCACGAC]3′
M13Reverse 5′d[CAGGAAACAGCTATGAC]3′
b.PCR反应体系如下：
c.PCR扩增条件
反应条件 循环数
93℃，3min 1
94℃，45s；55℃，45s；72℃，5min 30
72℃，7min 1
d.取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
(4)大量提取重组杆粒DNA。
应用QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取。
a.从选择性细菌培养板上挑取单克隆接种到含相应抗性的5ml LB培养基中，37℃振摇(~225rpm)12小时。
b.将菌液1∶500接种到含相应抗性的500ml LB培养基中，37℃振摇(~225rpm)12～16小时。
c.4℃6000×g离心15min收集细菌。
d.用50ml P1(使用前加入RNaseA，使其终浓度为100μg/ml)将细菌沉淀悬起。
e.加入50ml P2，温和地翻转8～10次，室温静置5min。
f.加入50ml预冷的P3，温和地翻转8～10次，冰上静置30min。
g.4℃13,000×g离心30min。
h.向吸附柱中加入35ml QBT，依重力作用排空，平衡吸附柱。
i.将步骤g中得到的上清经四层滤纸过滤后，加入到吸附柱中，依重力作用排空，使质粒挂柱。
j.将总体积200ml的漂洗液QC加入到吸附柱中，依重力作用排空，清洗掉非特异性吸附。
k.向吸附柱中加入35ml QF，洗脱挂柱质粒，依重力作用排空，收集洗脱液。
l.向洗脱液中加入24.5ml室温异丙醇，沉淀DNA，4℃13,000g离心30min，小心地弃掉上清。
m.用7ml 70％乙醇清洗沉淀，4℃13,000×g离心10min，小心地弃掉上清。室温干燥10～20min，500μl TE缓冲液溶解DNA沉淀，并将其转移到1.5ml离心管中。
4.重组杆状病毒的获得
(1)应用重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞。
a.在六孔细胞培养板上，每孔接种2ml共1×106个Sf9细胞。
b.细胞于27℃贴壁1小时。
c.每个转染样本，按下列步骤准备杆粒DNA：Cellfectin Reagent复合物：
①稀释1μg纯化的杆粒DNA于100μl Grace’s Medium中。
②颠倒5-10次使Cellfectin Reagent充分混匀，稀释6μl Cellfectin Reagent于100μl Grace’s Medium中。
③将上述稀释的杆粒DNA与稀释的Cellfectin Reagent混合(总体积约210μl)轻轻混合，室温孵育30min。
d.DNA：脂质体复合物孵育过程中，用2ml Grace’s Medium清洗细胞。
e.每管DNA：脂质体复合物中加入0.8ml Grace’s Medium，轻轻混合并加入细胞孔中。
f.27℃培养5小时。
g.除去DNA：脂质体复合物并加入2ml完全培养基(含抗生素的Sf-900 II SFM)。
h.27℃培养72小时，收获第一代病毒株。
注：转染过程中应设置阳性对照质粒pFastBacl-Gus(图6)，其基因编码β-葡萄糖醛酸酶(Gus)，在多角体蛋白或p10启动子控制下表达。转染后，表达β-葡萄糖醛酸酶(Gus)。可应用以下方法进行检测：5μl 20mg/ml X-glucuronide(X-葡萄糖醛酸底物，溶于DMSO)与50μl转染后的培养基混合，孵育2h，蓝色为表达。
(2)收获重组杆状病毒P1，扩增P1获得重组杆状病毒P2-P3。
a.依以上步骤转染细胞后，从每个孔中收集含病毒的培养基(约2ml)并转移至15ml离心管中，500g离心5min。
b.取上清至新的15ml离心管中，即得P1病毒株，4℃避光保存。
c.在六孔细胞培养板上，每孔接种2ml共2×106个Sf9细胞，27℃贴壁1小时。
d.取适量(需优化)P1病毒株感染细胞，27℃孵育48-72小时。
e.依上述a、b步骤操作，如此反复，即可获得的高滴度的P2、P3病毒株。
(3)噬斑法测定杆状病毒滴度，并对病毒进行纯化。
a.将30ml SF-900II SFM(1.3×)与10ml 4％的琼脂糖凝胶轻柔混合，置于40℃水浴备用。
b.在六孔细胞培养板中，每孔接种2ml共1×106个细胞，室温贴壁1小时。
c.用SF-900II SFM稀释杆状病毒：10-1-10-8。
d.去除孔内培养基，用1ml倍比稀释的病毒室温感染细胞1小时。
e.从最高稀释度至最低稀释度除去含病毒的培养基，每孔加入2.5-3ml覆盖琼脂，室温静置10-20min使其凝固。
f.27℃培养7-10天直至可见空斑产生。
若进行噬斑纯化，依以下步骤进行试验：
a.用移液器将空斑吸出，放入含500？l培养基的1.5ml管中，涡旋震荡混匀。
b.在六孔细胞培养板中，每孔接种2ml共1×106个细胞，室温贴壁1小时，每孔加入100μl胶液。
c.27℃培养72小时。
d.收集每孔含病毒培养基(约2ml)，移入15ml离心筒，500g离心5min.
e.上清转移至新管中，即为纯化的杆状病毒。
若应用噬斑法测定病毒滴度，依以下步骤进行试验：
a.每孔加入0.5ml 1mg/ml的中性红溶液，室温放置1-2小时。
b.吸出多余的中性红染料，计数空斑。
5.重组蛋白的表达及分析
(1)SDS-PAGE电泳
a.依下列配方配制分离胶(10％)，混匀后灌胶
| dd H2O | 1.6ml |
| 30％聚丙烯酰胺溶液 | 1.32ml |
| 1.5M Tris-Cl(pH8.8) | 1.0ml |
| 10％SDS | 40μl |
| 10％过硫酸胺 | 40μl |
| TEMED | 4μl |
b.待分离胶凝固后，依下列配方配制浓缩胶，混匀后灌胶
| dd H2O | 2.7ml |
| 30％聚丙烯酰胺溶液 | 0.67ml |
| 1M Tris-Cl(pH6.8) | 0.5ml |
| 10％SDS | 40μl |
| 10％过硫酸胺 | 40μl |
| TEMED | 4μl |
c.待浓缩胶凝固后，将胶板固定于电泳槽中，加入电泳缓冲液。
d.将细胞裂解液处理后的样品上样于配制好的PAGE胶的上样孔中。
e.恒压90V，待指示条带到达分离胶时，将电压调至120V。
f.电泳结束，进行转膜或染色。
(2)目的蛋白的鉴定(Western Blot)
a.将待测样品进行SDS-PAGE电泳。
b.将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜上，17V恒压电转17min。
c.将膜用PBS作漂洗，按每平方厘米0.1ml加入PBS溶解的3％脱脂奶粉，室温缓摇1小时。
d.用PBST(Tween-20终浓度为0.2％)洗一次，每次洗涤5min。
e.用含一抗的PBS(含1％脱脂奶粉)浸泡膜，封闭1.5小时。
f.用PBST漂洗滤膜3次，5min/次。
g.用含二抗的PBS(含1％脱脂奶粉)浸泡膜，封闭30-45min。
h.用PBST洗四次，5min/次；然后用PBS洗一次。
i.取66μl NBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33μl BCIP溶液，这一生色底物混合液应在30min内使用。
j.用生色底物混合液浸泡膜，于室温平缓摇动进行温育。
k.细心观察反应过程，一旦蛋白带的颜色浓度达到要求(约20min)，终止反应，膜用PBS漂洗，然后把滤膜晾干。
l.拍摄滤膜照片作永久实验记录。
(3)细胞免疫荧光测定
a.如前所述，重组杆状病毒感染Sf9细胞(24孔板)72小时以上。
b.弃去孔中培养基，每孔用300？l PBS洗一次。
c.每孔用300？l无水乙醇室温固定细胞30min。
d.吸去孔中无水乙醇，每孔用300？l PBS洗一次，每孔用200？l 0.5％Triton X-100穿膜30分钟。
e.吸去Triton X-100，每孔用300？l PBS洗一次。
f.每孔加入200？l一抗(感染HEV的兔血清，用PBS1：50稀释)，37℃孵育30min。
g.每孔用300？l PBS洗两次。
h.每孔加入200？l二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG)，37℃孵育30min。
i.PBS洗两次，蒸馏水洗一次。
j.倒置荧光显微镜下进行观察。
6.HEV VLP的透射电镜观察
1)将所得到细胞裂解液通过蛋白纯化，得到纯化后的病毒样颗粒样品，取约50μl点样于洁净的封口膜上，铜网扣于样品上约5分钟，用滤纸吸干多余样品。
(2)用去离子水清洗铜网，多余水分用滤纸吸干。
(3)用1％的醋酸铀负染3分钟，共染3次，每次都吸干多余染液。
(4)空气中干燥30分钟以上，在Hitach 7500电子显微镜70,000倍下进行观察拍照。
实验结果
一.重组pFastBac1载体的构建
以质粒pCB-E2-4为模板，设计引物进行PCR扩增得到目的基因栁煨透窝撞《？型ORF2编码的第13-508位氨基酸的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小约为1500bp的条带(图7)，与预期大小一致。限制性内切酶BamH I和Hind III对提取的重组质粒进行酶切鉴定，结果如图8所示：双酶切后得到两个片段，其长度分别为约4800bp和1500bp，与pFastBac1载体和目的基因理论值一致。将重组质粒进行测序，显示其序列及读码框均正确。
二.PCR分析确定包含重组杆粒的阳性克隆
使用M13Forward(-40)Primer和M13Reverse Primer作为引物对杆粒进行PCR扩增，如果是空载杆粒，PCR产物大小为300bp；如果是转座成功的重组杆粒，PCR产物大小为约3800bp(即2300+1500bp插入片段)。图9为杆粒转座、蓝白斑抗生素初步筛选后PCR分析重组杆粒的电泳图，图中1-8号阳性重组杆粒PCR鉴定结果为3800bp(如前所述2300+1500bp插入片段)，9、11、12号pF-Gus阳性对照重组杆粒PCR鉴定结果为4200bp(2300+Gus基因约1900bp)，10号为未发生转座的空载杆粒，PCR产物大小为300bp；图9中分子量标准自上而下分别为10,000bp、8000bp、6000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp。
昆虫细胞感染后所发生的病变如图11所示：
转染或感染后72小时，病毒芽生释放至培养基中，细胞直径增大，可增加25～50％，细胞核增大，与未感染的细胞相比感染细胞停止生长，细胞内出现空泡及不规则的折光性颗粒，而后可见颗粒状物分泌出胞外，随着感染时间的延长，细胞逐渐溶解死亡并脱落。图10为未感染的Sf9细胞。
重组蛋白的初步表达
重组杆粒转染Sf9细胞后72小时，裂解细胞，Western Blot法(非还原SDS-PAGE)检测重组蛋白的初步表达，一抗戊肝患者的阳性血清。如图12所示，可见约170Kd，95Kd，56kD三条带，根据条带可见多聚体的形成，推测可能形成病毒样颗粒(VLPs)，需电镜观察进一步确证。
五.感染条件的优化
图13为Western Blot法检测细胞感染时相的优化，可见杆状病毒感染Sf9细胞后72h-96h有重组蛋白的表达，确定收获杆状病毒时间为病毒感染细胞后72h。图15对感染后不同时相的Sf9细胞裂解液进行ELISA检测，也印证了杆状病毒感染细胞后72小时收获细胞病毒产率和蛋白表达量最大，此时收获较为适宜。图14为Western Blot法检测杆状病毒感染量的优化，转染杆粒为1μg和1.5μg，再感染病毒量为80μl可见蛋白表达量较高，基于经济成本的考虑，采用转染杆粒为1μg，再感染病毒量为80μl作为最佳感染量。详见本论文第二部分MOI(感染复数)的优化。
六.噬斑法滴定杆状病毒
杆状病毒滴度计算公式如下：
滴度(pfu/ml)＝空斑数紫∈投茸1/(ml接种量/孔)
在噬斑法测定杆状病毒滴度的过程中，我们对病毒稀释度、琼脂浓度、琼脂培养基覆盖物的使用量、最后滴定时中性红溶液的使用量进行了优化(附图16)，最终确定针对第二代P2重组杆状病毒株，最终观察选择106和107稀释度、琼脂浓度为1％、琼脂-培养基覆盖物使用量为2.5ml、最后滴定时采用0.5ml 1mg/ml的中性红溶液/孔(6孔细胞培养板)较为适宜，得出以上较理想的噬斑结果。如图17所示：该孔为106稀释度，空斑数为20，则杆状病毒滴度为2？07pfu/ml。
免疫荧光检测结果
如图18所示：图中为未感染的阴性对照细胞，无荧光产生，图19为感染杆状病毒72小时后的Sf9细胞，图中可见较强绿色荧光分布于胞内，证明昆虫杆状病毒表达系统表达的HEVORF2抗原片段具有抗原特异性，主要定位于胞内，故大量表达时收获Sf9昆虫细胞进行以下的分析纯化工作。
八.HEV VLP的透射电镜观察
表达的蛋白经纯化后，应用醋酸铀负染，电镜70,000倍下观察，如图19和20所示，可见直径诶30～40nm的病毒样颗粒(VLPs)，较天然病毒颗粒略大。该结果表明在本实验摸索的条件下，HEV ORF2编码第13-508位氨基酸可于昆虫杆状病毒表达系统中表达并形成病毒样颗粒。
实施例2
过实施例1的实验流程表达SEQ NO：1所示序列的1～21位为蛋白的N端、497～516位为蛋白的C端的氨基酸序列，可得到与实施例1相似的病毒蛋白颗粒。
Claims (16)
1.一种戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，其特征在于，所述病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列中至少477位连续的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，其特征在于，所述的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的1～21位为蛋白的N端，497～516位为蛋白的C端。
3.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，其特征在于，所述的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13～21位为蛋白的N端，508～516位为蛋白的C端。
4.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，其特征在于，所述的病毒蛋白颗粒的序列具有SEQ NO：1或SEQ NO：3所示序列的13位为蛋白的N端，508位为蛋白的C端。
5.一种编码权利要求1所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有SEQ NO：2或SEQ NO：4所示的核苷酸序列。
7.一种抗体，其特征在于，所述的抗体对具有权利要求1～4所述的病毒蛋白颗粒有特异性的结合亲和力。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有权利要求5所述的核苷酸序列。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求8所述的重组表达载体。
10.一种产生免疫原性戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒的方法，其特征在于，所述的方法包括：在适合表达所述病毒蛋白颗粒的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞。
11.权利要求10所述的产生免疫原性戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PCR扩增得到目的基因，将目的基因片段克隆入pEASY-T3质粒中，并鉴定；
(2)将步骤(1)中的重组质粒克隆至昆虫杆状病毒表达系统的载体pFastBac1中，得到pFastBac1重组质粒，并鉴定；
(3)将步骤(2)中pFastBac1重组质粒感染大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，鉴定阳性克隆，分离重组杆粒DNA；
(4)将步骤(3)得到的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，得到重组杆菌病毒。
12.一种用于预防人戊型肝炎的疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1～4所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒中的至少一种和药学上可接受的载体和/或佐剂。
13.一种用于预防或治疗人戊型肝炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有治疗有效量的如权利要求7所述的抗体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
14.一种用于诊断人戊型肝炎的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1、5或7所述的病毒蛋白颗粒、核苷酸序列、抗体，以及适用于所述抗原抗体结合反应的检测试剂。
15.权利要求1～4所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒或权利要求7所述抗体在制备诊断、预防或治疗人戊型肝炎的药物中的应用。
16.根据权利要求1所述的戊型肝炎病毒4型ORF2片段的病毒蛋白颗粒，其特征在于，所述的病毒蛋白颗粒在电镜70,000倍下为直径30～40nm的颗粒。
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| CN109195624A (zh) * | 2016-05-25 | 2019-01-11 | 英特维特国际股份有限公司 | Hev疫苗 |
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