CN103555766B

CN103555766B - 兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用

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Publication number: CN103555766B
Application number: CN201310515769.2A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 郑文文; 金宏丽; 张渭蛟
Original assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2013-10-28
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2033-10-28
Also published as: CN103555766A

Abstract

本发明提供了一种兔出血症病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对兔出血症病毒VP60基因进行优化，将优化后的VP60基因与昆虫细胞高效表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产兔出血症病毒样颗粒。将所述兔出血症病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到兔出血症疫苗。本发明可大幅度提高兔出血症病毒样颗粒的表达量，具有安全性高、免疫原性好、易发酵、成本低等优点。

Description

兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种兔出血症病毒样颗粒、其制备方法及应用。

背景技术

兔病毒性出血症俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性和致死性传染病。因曾是兔的一种毁灭性传染病，给养兔业带来巨大的经济损失而备受养兔业的关注。l984年中国首次报道了该病。1989年，世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病（王永坤等,兔瘟的诊断与防治,1992）。

在2000年国际病毒分类委员会(ICTV)的第七次报告中，将兔出血症病毒列入了杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形，无囊膜，直径32-36nm，20面体对称(张丽红等,广东畜牧兽医科技,31:9-11,2006)。其衣壳由32个高4-6nm的圆柱状壳粒构成，由主要结构蛋白VP60多重拷贝所组成，核心直径为17-23nm。负染电镜表面具有嵌杯样病毒典型的杯状形态结构，电镜下还可见少数没有核心的病毒空衣壳。病毒在氯化铯中的浮密度为1.29-1.34g/cm³，沉降系数为85-162S(李海等,贵州畜牧兽医,28:10-11,2004)。

RHDV基因组为单股正链RNA，全长7437bp，分子量为(2.4x10⁶-2.6x10⁶)KD，5’末端无帽状结构，3’末端有一个短的polyA尾。RHDV基因组含2个开放阅读框。5’末端的长开放阅读框架（ORF1）编码一个2344氨基酸的多聚蛋白前体，它被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白和多个非结构蛋白，其中衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。3’末端的短开放阅读框架（ORF2），位于7025-7378bp之间，编码病毒另一个小的结构成分，称为VP10，碱性蛋白且含量较低，可能在病毒粒子中与病毒RNA结合。除基因组RNA外，在感染的组织和病毒颗粒中还含有2.4kb的亚基因组RNA，也编码衣壳蛋白，并且该片段在5’端也与VPg蛋白共价结合（严维巍等,中国养兔杂志,1:26-29,2001）。

VP60的N-端组成衣壳蛋白的内部区，C-端组成衣壳蛋白的外部。N-端的第 31-250之间的氨基酸是主要的抗感染免疫决定区。对VP60蛋白的研究发现，体外表达该衣壳蛋白时，在没有其他任何成分存在的条件下，可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(Rob N,Virus-like particle as immunogens,Trends in Microbiology,11:438–444,2003)。近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗的抗原载体逐渐受到科学家们的重视。病毒样颗粒是模拟病毒的颗粒形态特点，将外源基因片段产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒，它的外部形态与病毒颗粒相同，甚至还有某些病毒受体的天然配体；同时，还可将其他病原的特异性抗原等呈递在颗粒表面，因而在病原体的疫苗研究中发挥着重要的作用。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该方法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。并且，由于VLPs不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S,Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers,Arch Virol,144:2429-2439,1999)。

大量实验表明，RHDV不能在鸡胚上增殖，也难于在各种原代或传代细胞中稳定增殖。目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。近来，新型疫苗的研究主要集中在基因工程苗的研制上，已在大肠杆菌、酿酒酵母、痘苗病毒以及植物等多种表达系统中表达了VP60蛋白（刘怀然等,动物医学进展,24:7-9,2003）。Boga等在大肠杆菌中表达了RHDV西班牙AST/89株的主要衣壳蛋白VP60，发现当VP60以β-半乳糖苷酶融合蛋白表达时，仅与天然VP60具有部分相同抗原并不诱导产生保护性免疫；而在以T7RNA聚合酶为基础的表达系统中则可表达与天然VP60抗原性极为相似的蛋白质并可诱导产生有效的保护性免疫，能抵抗住提纯RHDV的致死性攻击；Boga等在酿酒酵母中表达VP60并能形成病毒样颗粒；Famos等将Spanish isolate AST/89的VP60在酵母中进行高效表达，蛋白表达量高达1.5g/L，且约70%表达蛋白进行了糖基化修饰；严维巍等将RHDV VP60基因插入pPICZ B经毕赤酵母表达的重组蛋白具有血凝特性且可被抗RHDV的高免血清所抑制（严维巍等,中国兽医学报,23:447-449,2003）。Fernandez-Femandez等采用洋李痘马铃薯Y病毒构建的载体成功表达了VP60，该表达产物接种兔能抵御致死剂量RHDV的攻击（Fernandez-Fernandez M R,Protection of rabbits against rabbit hemotthagic disease virus by immnization with the VP60protein expressed in plan ts with a potyvirusbased vector,Virology,280:283-291,2001）；Castanon等采用马铃薯表达含VP60的抽提物对兔进行免疫，产生特异的抗体反应并可提供对RHDV强毒攻击的保护（Castanon S,The effect of the promoter on expression of VP60gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants,Plant Science,162:87-95,2002）。

目前，RHDV基因工程疫苗研究中仍然存在一些问题：大肠杆菌表达的VP60具有不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物体安全问题；采用转基因植物生产VP60的表达水平目前还不理想；因而研制RHD安全、高效的新型疫苗势在必行。

兔瘟以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，感染兔常在48-72小时内死亡。根据病变特点可作出初步诊断，结合实验室检测方法进行确诊，主要采用血凝实验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电镜技术及分子生物学方法。

昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）自1983年建立以来，已有近千种外源基因在该系统中进行表达。其优点为：（1）BEVS表达效率高，表达产物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似；（2）杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；（3）应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平；（4）借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能；（5）杆状病毒对脊椎动物无病原性，昆虫细胞没有与人畜共患的疾病，被认为遗传学上是安全的表达载体（景志忠等,中国兽医科技,31:43-45,2001）。

目前，杆状病毒表达系统的有关技术已相对成熟，利用该系统表达外源基因，不仅经济、高效，而且可提供一条新的技术途径。利用生物反应器生产兔出血症病毒样颗粒，保证其具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性，为兔出血症疫苗的商业生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统，提供一种高效制备兔出血症病毒样颗粒的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种兔出血症病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据昆虫细胞偏爱密码子对兔出血症病毒VP60基因进行优化，得到优化的兔出血症病毒VP60基因；（2）重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的VP60基因插入到昆虫细胞高效表达载体中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；（3）重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；（4）兔出血症病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到兔出血症病毒样颗粒。

本发明还提供采用上述方法制备的兔出血症病毒样颗粒。

本发明还提供所述兔出血症病毒样颗粒在制备兔出血症疫苗中的应用。

本发明还提供一种兔出血症疫苗，由上述方法制备的兔出血症病毒样颗粒辅以防腐剂（例如叠氮钠）和佐剂（氢氧化锌与硫酸乙酰肝素复合物）制备而成。

优选地，本发明的高效制备兔出血症病毒样颗粒的方法，包括克隆获得高滴度兔出血症病毒株的VP60基因序列，将其按昆虫细胞的密码子频率进行密码子优化。将优化后的序列克隆到具有多个启动子与表达盒（例如双启动子与双表达盒）的转移表达载体中。将转移表达载体与杆状病毒DNA进行同源重组或转座，转染Sf9昆虫细胞拯救获得重组杆状病毒。用IF和WB方法鉴定重组病毒，滴定重组病毒。将重组杆状病毒按照一定的MOI感染BTI-Tn-5B1-4昆虫细胞，摇瓶或发酵培养，4-6天后冻融收获，即得。

其中，所述的兔出血症病毒衣壳蛋白基因VP60的原始序列及经密码子优化后的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，由它们编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

步骤（2）中所述昆虫细胞高效表达载体（即转移表达载体）选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII(pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体中的至少一种。优选pFastBacDual杆状病毒运载载体。

本发明中所构建的转移表达载体为带有兔出血症病毒VP60基因密码子优化后序列的载体pFastBacDua-VP60-VP60-Y。VP60优化基因分别位于polyhedrin promoter(P_H)和P₁₀两个高效启动子下游，形成两个高效表达盒。

所述杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、SpltNPV中的至少一种。优选苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒亲本株AcMNPV。

所述重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV（AcMNPV-VP60-VP60-Y）。

所述的昆虫细胞来源于鳞翅目昆虫，例如，草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾（Spodoptera litura）ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN。优化组合为，用Sf9细胞进行重组杆状病毒的拯救和滴定，用H5昆虫细胞进行病毒样颗粒的表达。

本发明采用基因重组技术，对兔出血症病毒的VP60基因序列进行密码子优化，将该基因的原始序列（SEQ ID NO:1）及优化序列（SEQ ID NO:2）克隆到杆状病毒转移表达载体中，在PH、P10启动子或其它病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外（in vivo/in vitro）重组，使VP60的原始序列及优化后序列整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒感染昆虫细胞，表达生产兔出血症病毒样颗粒。

本发明的一个最优选的技术方案为：对兔出血症病毒（RHDV）的衣壳蛋白基因序列进行密码子优化，将该衣壳蛋白的原始序列及优化后的序列，即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列克隆到杆状病毒运载载体pFastBacDual上，再通过体内重组将兔出血症病毒VP60基因的原始序列VP60及密码子优化后的序列VP60-Y多启动子控制下的表达盒转移到苜蓿银纹夜蛾杆状病毒亲本株AcMNPV的基因组上，插入非功能区，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带单拷贝和多拷贝兔出血症病毒VP60基因的重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒rAcMNPV-VP60、rAcMNPV-VP60-VP60-Y；将其感染昆虫细胞系，大量繁殖rAcMNPV-VP60、 rAcMNPV-VP60-VP60-Y；当重组杆状病毒在昆虫细胞内复制时，VP60基因在多启动子（P_H、P₁₀）控制下高效表达，自组装成兔出血症病毒样颗粒；在感染4-6天后收集细胞培养液，便得到安全、高滴度的兔出血症病毒样颗粒，该抗原可用于制备预防兔病毒性出血症的注射用疫苗。

本发明采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产兔出血症病毒样颗粒，生产成本和安全性显著优于传统的制备兔出血症病毒抗原的方法。本发明方法可大幅度提高兔出血症病毒样颗粒表达量，具有安全性高、免疫原性好、易发酵、成本低等优点。

附图说明

图1为PCR扩增VP60基因琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M为DNA分子量标准，1、2泳道分别表示阴性组织对照和阳性兔肝脏。

图2为重组转移载体BamH I/EcoR I双酶切鉴定琼脂糖电泳结果；其中，M:DNA分子量标准DL15000；1:pFastBac1;2:pFastBac1-VP60;3:双酶切pFastBac1-VP60产物。

图3为重组表达载体转染昆虫Sf9细胞病变结果（200×显微镜下观察）；其中，左图为正常细胞；右图为病变细胞。

图4为PCR法鉴定重组病毒的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M:DNA分子量标准DL2000；1:对照细胞;2:重组杆状病毒;3:阳性质粒对照。

图5为免疫荧光染色鉴定VP60蛋白表达结果；其中，左图为AcMNPV-VP60病毒感染的Sf9细胞；右图为空白对照Sf9细胞。

图6为病毒样颗粒血凝条件的优化示意图；其中，A：PBS,0.02M,pH7.0;B：PBS,0.1M,pH7.0。

图7为电镜负染观察病毒样颗粒的结果。

图8为高效表达转移载体构建模式图。

图9为重组质粒pFastBacDua-VP60-VP60-Y的酶切鉴定结果；其中，M:DNA分子量标准DL5000；1.用Sph I/Xho I双酶切合成质粒pUC57-VP60；2.用BamHI/Not I双酶切；3.用Sph I/Xho I双酶切。

图10为重组病毒的PCR鉴定结果；其中，M:DNA分子量标准DL2000；1.PH启动子下游的VP60基因；2.P10启动子下游的VP60基因。

图11为免疫荧光染色鉴定VP60表达结果；其中，A为AcMNPV-VP60-VP60-Y病毒感染的Sf9细胞；B为空白对照Sf9细胞。

图12为Western Blot鉴定VP60蛋白的表达结果；其中，A图为SDS-PAGE检测结果：1为空白对照，2为AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9细胞；B图为WesternBlot检测结果：1为空白对照，2为AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9细胞。

图13为病毒样颗粒的血凝效果对比检测结果；其中，A为Sf9表达产物；B为H5细胞表达产物。

图14为电镜负染观察病毒样颗粒的结果；其中，A为病毒样颗粒透射电镜照片；B为病毒样颗粒免疫电镜照片。

图15为RHDV病毒样颗粒不同佐剂的免疫效果。

图16为添加不同佐剂的RHDV病毒样颗粒疫苗保护率。

图17为免疫兔组织切片图；其中，A.肾；B.肺；C.肝；D.脾；E.盲肠；F.气管；G-H.心脏；(A-F.HE×400;G-H.HE×200)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的试验材料：

大肠杆菌株E.coli DH5α购自Promega公司；克隆载体pEASY-T3购自全式金公司；克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET-28a⁺、受体菌E.coliTOP10和BL21(DE3)购自长春西诺生物科技有限公司，运载载体pFastBacDual购自Invitrogen公司；Sf9和H5昆虫细胞、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒亲本株AcMNPV购自长春西诺生物科技有限公司。

酶与试剂：限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司；T4DNALigase及缓冲液为Promega公司产品；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs购自Sigma公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TransGen Biotech公司产品；DEPC、M-MLV-Rtase（逆转录酶）购自Promega公司。

生化试剂：bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵（Ammonium Persulfate）、卡那霉素（Kanamycin）、细胞培养基TC-100购自Sigma公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物（Yeast Extract）、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；溴化乙锭（EB）、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；琼脂粉为日本进口分装；Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物由上海生工生物技术有限责任公司合成。

培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；昆虫细胞培养基为Grace培养基。

兔出血症病毒VP60基因表达产物的动物实验在隔离实验室中进行。

实施例1 单拷贝兔出血症病毒VP60基因在重组杆状病毒中的表达与检测

1.实验方法

1.1.有关溶液和培养基的配制

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1%SDS(现用现配)。

溶液III：100mL体系，5mol/L醋酸钾80mL，冰乙酸12mL，ddH2O8mL。

TAE(50×)：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/L EDTA(pH8.0)，无菌水定容至1000mL。

TER溶液：胰RNAse(RNAse A)溶解于10mM Tris-HCl、15mMNaCl中，配成10mg/mL的储存液-20℃冻存，用1×TE buffer稀释成20μg/mL的工作液4℃保存。

PPt缓冲液：异丙醇22mL；5mol/mL KAc1mL；ddH2O2mL。

1×TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，121℃高温高压蒸汽灭菌20min后储存于4℃。

溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配成浓度为10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储存于室温即可。

6mol/L NaI：将0.75g Na₂SO₃溶于40mL ddH₂O中，加入45gNaI并搅拌至完全溶解，4℃储存。

玻璃奶(Glassmilk)：将10g(100mg/mL，Sigma S-5631)的Silica溶于100mL PBS中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2～3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI中，终浓度为100mg/mL，4℃下避光保存。

New Wash洗液：Tris-HCl(pH7.4)20mmol/L；EDTA1mmol/L；NaCl100mmol/L；与等体积的无水乙醇配制而成。

蛋白表达诱导物IPTG为1mol/L，超纯水配制后用0.2mm滤器过滤除菌。

蛋白上样缓冲液(2×)：100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4%SDS、0.2%溴酚蓝、10%甘油。

30%丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，1gN，N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL 水，过滤。

考马斯亮蓝染液：0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇:水(1:1,v/v)和10mL冰乙酸中。

脱色液：90mL甲醇:水(1:1,v/v)和10mL冰乙酸。

裂解缓冲液(pH8.0)：50mmol/L Tris-Base、0.1M NaCl。

包涵体洗涤液Ⅰ(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、1%TritonX-100。

包涵体洗涤液Ⅱ(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、2M尿素。

包涵体蛋白溶解液(pH8.0)：20mmol/L Tris-Base、0.2M NaCl、8M尿素。

脲NTA-0缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea。脲NTA-500缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea，0.5M Imidazole。

Bradford试剂为Bio-Rad公司Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。

ELISA所需试剂：包被液(pH9.6)1.59g Na₂CO₃、2.93g NaHCO₃、ddH₂O定容至1L，保存于4℃；临用前配制封闭液，BSA溶于PBS中至终浓度为1%；洗涤液为含0.05%Tween-20的PBS；底物缓冲液为1.84g Na₂PO₄·12H₂O、0.51g柠檬酸、ddH₂O定容至100mL；OPD显色液是4mg OPD溶于10mL底物缓冲液，加15μL30%H₂O₂，临用前配制；终止液为2mol/L H₂SO₄。

Western Blot试剂：半干转电转膜缓冲液是14.41g甘氨酸、12.11g Tris-Base、50mL甲醇、ddH₂O定容至1L、4℃保存；1×PBS加Tween-20至终浓度为0.1%配成洗涤液；BSA溶于PBS中至终浓度为3%为封闭液；纯化的多克隆抗体用封闭液按1:1000稀释；HRP标记的羊抗兔IgG抗体用封闭液按1:1000稀释；临用前配制DAB显色液，4mg DAB溶于10mL100mmol/L pH7.5的Tris-Cl中，加15μL30%H₂O₂。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值7.0（固体培养基含1.5%琼脂）。液体培养基中加入1.5%琼脂粉，121℃高温高压蒸汽灭菌15min，在温度低于45℃且还未凝固时，加入相应抗生素溶液，混匀后倒入平板，为LB固体培养基，4℃保存备用。

1.2.兔出血热病毒VP60基因原始序列的获得

1.2.1.兔瘟种毒的分离鉴定

从某养兔场患有兔出血症的病死兔采集的样本，研磨后1:3添加双抗，注射健康兔1mL，发病后获得的肝脏。

1.2.2.TRIzol法提取基因组RNA

(1)将兔肝放入盛有Trizol(50-100mg组织/1mL)的玻璃匀浆器中匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10%；

(2)将匀浆液在室温下放置5min以使核蛋白质复合体完全裂解；

(3)加入氯仿(0.2mL/1ml Trizol)，盖紧管盖并漩涡剧烈震荡15sec；室温放置2-15min；

(4)4℃，12000g离心15min。离心后，混合液被分为三相：处于下层的浅红色酚-氯仿有机相、中间相和上层无色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白质则存留于间相和有机相中，水相体积约为用于匀浆的Trizol体积的60%;

(5)将水相移入新管，加异丙醇(0.5mL/1mLTrizol)；室温放置5-10min；

(6)4-25℃，12000g离心8min，RNA沉淀在管壁或管底形成胶状的或白色的小球；

(7)弃上清，用1mL75%乙醇清洗RNA沉淀；然后4-25℃，7500g离心5min；

(8)弃上清，干燥；沉淀重溶于20μL DEPC处理的双蒸水(ddH₂O)或去离子甲酰胺中，-70℃保存备用。若沉淀难溶，可用吸管吹打数次并55-60℃温育10-15min。

1.2.3.目的基因的获得

根据GenBank公布的序列GU339228，设计特异反转录引物RHDV-RT：5'-GGATTAAAACCTAACCTACC-3'。

VP60基因原始序列的扩增引物为：VP60上游：5'-AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3'（BamHI）；VP60下游：5'-GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3'(EcoR I)。

1.2.4.RT-PCR反应

1.2.4.1.cDNA第一链的合成

取2μLRNA(≤1μg)＋2μL RHDV-RT＋13.75μL DEPC处理水；70℃，5min，迅速置冰上5min；加入5μL5×M-MLV缓冲液＋1.25μL10mM dNTPs＋1μLM-MLV-RT(200U)，使终体积为25μL；混匀后室温放置10min；42℃反应1h；70℃2min灭活RTase，-20℃保存备用。

1.2.4.2.PCR扩增目的基因

反应体系及反应程序见表1：

表1 反应体系及反应程序

PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物用1.0%的TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶中含有0.5μg/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为1×TAE，80-100V，大约10-20min于紫外凝胶成像系统观察片段大小（图1）。

1.2.5.玻璃奶纯化回收DNA片段

配制专门回收用胶（制胶器洗干净），PCR产物或酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的DNA条带；加入3倍体积(v/w)的6mol/L NaI，50℃下使凝胶充分溶解；冰上放置2min后加入8μL玻璃奶吸附DNA，混匀后室温放置5min，中途摇晃两下，使充分吸附；稍离心（10000r/min，达到刻度即可，否则不易悬浮），去上清；加800μL New Wash溶液（于冰上操作），轻微震荡使沉淀重悬，再稍离心去上清，如此洗涤3次，最后一次洗涤完毕后，离心10000r/min，3min去上清；洗后在吸水纸上吸去多余水分后稍离心，放入培养箱干燥（半干即可）；干燥后用后用适量0.1×TE（10-50μL）将沉淀溶解，震荡弹起。12000r/min离心2min后取上清，即得到DNA溶液。将DNA保存于-20℃备用。凝胶电泳检测回收效果。

1.2.6.DNA片段与克隆载体连接

克隆载体pMD18-T连接体系：0.5μL pMD18-T vector，2.5μL目的片段，3μL连接溶液Ⅰ，16℃连接8h以上。

1.2.7.E.coli热激感受态细胞的小量制备：-70℃冻藏的E.coli TOP10或BL21甘油菌在LB平板上划线复苏；挑取单菌落，接种到4mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取1/100体积的新鲜的E.coli TOP10培养过夜的菌液接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，使OD值达到0.6左右；同时将CaCl₂(75mmol/L)与EP管置于冰上预冷5min以上；将1mL菌液收集到预冷好的无菌1.5mL EP管中，冰上预冷5min，4℃，4000r/min离心5min，弃上清；菌体重悬于800uL预冷的75mmol/L CaCl₂溶液中，冰浴30min，每隔5min摇一摇；4℃，4000r/min离心5min，弃上清；沉淀中加入200μL含10％甘油的预冷75mmol/L CaCl₂溶液，用枪头轻轻将菌体吹起，使混合均匀；冰上放3-4h后分装小管(100μL/管)，-70℃冻存备用。

1.2.7.连接产物的热转化：取-70℃冻存的感受态细胞，用双手搓至大部分融化后迅速置冰上；感受态细胞完全融化后加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速置于冰上1-2min；加入1mL已温浴至37℃的LB培养基，37℃温育培养1h；5000r/min离心3min，去部分上清后（留150-200μL）涂布于含适当抗生素的LB平板上；37℃倒置培养过夜。

1.2.9.重组质粒的鉴定

1.2.9.1.细胞破碎法快速鉴定：分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；取300-500μL菌液于Eppendorf管中，12,000g离心10sec，弃上清，加入30μL缓冲液(6%蔗糖，0.1%溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1:1)，充分振荡将菌体弹起；12,000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。

1.2.9.2.碱法少量快速抽提质粒DNA

取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000g离心5min收集菌体，弃上清；用150μL溶液Ⅰ悬浮沉淀，冰上放置5min；加300μL溶液Ⅱ和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；加450μL溶液Ⅲ，剧烈混匀后冰浴5-10min；4℃12,000g离心10min，取上清，加500μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；12,000g离心10min，弃上清，沉淀溶于250μL TER(含20μg/mL RNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μL PPt缓冲液，混匀后置4℃20min；12,000g离心10min，弃上清，70%乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用40μL0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

1.2.9.3.重组质粒的酶切鉴定

鉴定体系见表2：

表2 鉴定体系

10×缓冲液D 1.5μL	重组质粒 2.0μL
		EcoR I、BamH I 各0.5μL	ddH₂O 10.5μL

37℃酶切1-2h后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.2.9.4.重组质粒的测序鉴定以及分析

将鉴定为阳性克隆(命名为pT-VP60)的菌种重新加入含有Amp的LB培养液，220r/min摇培过夜后后，吸取1mL新鲜菌液至无菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后，到北京三博生物技术有限公司测序部进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。测序结果用DNAStar、DNAMAN软件对序列进行分析。

1.3.兔出血症病毒VP60基因原始序列在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

1.3.1.重组杆状病毒转移载体pFastBac1-VP60的构建

1.3.1.1目的片段及载体的获得

测序鉴定过的重组质粒pT-VP60用BamHⅠ和EcoR I酶切。酶切体系见表3：

表3 酶切体系

加入物	BamH I/EcoR I	缓冲液D	BSA(100x)	补水
					体积（共50μL）	各1μL	5μL	0.5μL	42.5μL

真核表达载体质粒pFastBac1用同样酶切处理，反应结束后于65℃灭活10分钟。

1.3.1.2酶切产物的回收

将pT-VP60经BamH I/EcoR I双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收约1.7kb大小的片段。在紫外灯下切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，放入灭菌的1.5mL离心管中，加入3倍(v/w)体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μL玻璃奶（Glass milk），混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起并离心。最后将沉淀晾干后加入20μL0.1×TE缓冲液溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进行下一步实验。

1.3.1.3目的片段与载体连接

酶切回收的RHDV-VP60目的片段与经BamH I/EcoR I酶切后的转移载体pFastBac1连接。用T4DNA连接酶进行DNA连接（16℃过夜）。

连接体系（10μL）：RHDV-VP606μL、pFastBac12μL、T4DNA连接酶1μL、缓冲液1μL。

1.3.1.4.重组质粒的转化与鉴定

参照1.2中的方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经BamH I/EcoR I双酶切、菌液PCR鉴定和基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac1-VP60（图2）。

1.3.2.重组Bacmid构建和筛选

将重组供体质粒pFastBac1-VP60转化到感受态E.coli DH10Bac：将1μL重组转移质粒加入到感受态E.coli DH10Bac中，冰浴30min，42℃热激45s，迅速转移至冰水混合物中冰浴2-3min，加入1mL LB培养基，37℃、200rpm孵育4h，做10^-1、10^-2、10^-3连续稀释，从10^-2、10^-3稀释液中各取100μl涂板（含抗生素、X-gal），37℃培养36-48h。

1.3.3.重组杆状病毒AcMNPV-VP60的拯救

提取重组Bacmid，转染昆虫细胞：⑴1μg重组Bacmid DNA加入100μL双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中；⑵将6μL脂质体加入到100μL双无（无血清、无双抗）Grace培养液中混匀；⑶将⑴和⑵溶液混合，室温放置15-45min；⑷将Sf9昆虫细胞（覆盖70-80%面积）用双无培养液系三次，脂质体和DNA混合物再加入800μL双无Grace培养液，混合，加入细胞中，27℃，静置5h；⑸去除脂质体、DNA复合物液体，加入2mL完全（含有双抗、血清）Grace培养液继续培养3-4d，收取上清，保存做种毒。重组病毒命名为rAcMNPV-VP60（图3）。

1.3.4.rAcMNPV-VP60在昆虫细胞Sf9中的扩增

将重组夜蛾杆状病毒rAcMNPV-VP60感染正常生长的Sf9细胞，培养4天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rAcMNPV-VP60。

1.3.5重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl（0.5mol/L）的NaOH后混匀，再加入20μl（8mol/L）的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为：VP60上游：5'-AACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3'；VP60下游：5'-TCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3'。

取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒（图4）。

1.3.6.VP60在H5昆虫细胞中的表达

所用的昆虫细胞为H5，按照常规方法进行培养。简述如下：使用Grace昆虫细胞培养基，1L培养基中加入22.2g粉剂，边加边搅拌至950mL双蒸水中，加入0.35g NaHCO₃，用1M NaOH调pH至6.2，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，使用前加入10%灭活血清及双抗。1.0×10⁶cell/cm²倍增传代，病毒按照MOI1、5、10进行接毒，4-5天后收集细胞培养物，-20℃冻存以进行血凝法检测。

1.4.表达产物的检测

1.4.1.免疫荧光检测目的蛋白

Sf9细胞在感染重组杆状病毒48-72h后进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察结果，重组杆状病毒感染的细胞中可观察到绿色荧光，表明VP60蛋白在细胞中表达。(图5)

1.4.2.病毒样颗粒的纯化及血凝条件的优化

病毒样颗粒的纯化。收集的细胞上清1.5×10⁵g超高速离心2小时。用含0.1MNaCl的Tris-HCl(PH7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95%，得率可达40%以上。同时证明，在昆虫细胞中表达的目的蛋白是可以自组装成病毒样颗粒的，而且还建立了兔出血症病毒样颗粒的纯化方法。

取人的“O”型红细胞于阿氏液中保存，用PBS（1M-0.02M，PH6.8-7.4）洗涤红细胞三次，最后将红细胞用生理盐水配成1%悬液。在U形板的每孔加入灭菌的PBS50μL；用微量移液器取适当倍数稀释的含病毒样颗粒溶液稀释液50μL加入第1孔内，混匀后，吸取50μL后加入到第二孔中，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取50μL液体弃掉；第12孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释。每孔加入50μL1%人的“O”型红细胞悬液，混匀后，4℃下反应45分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。发现病毒样颗粒在盐离子浓度为0.02M，pH为7.0时，病毒样颗粒的血凝效价最好，血凝最稳定。细胞培养液中的病毒样颗粒稀释到2048倍（图6）。

1.4.3.透射电镜观察

收集的病毒样颗粒样品用PBS稀释10倍，放上铜网，滤纸片吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸片吸干后铜网置于磷钨酸染色液滴上，电镜观察，可观察到典型的兔出血症病毒样颗粒，表明兔出血症病毒蛋白VP60能自主在昆虫细胞内组装病毒样颗粒（图7）。

实施例2 双拷贝VP60优化基因在杆状病毒-昆虫细胞中的高效表达和应用

2实验方法

有关溶液和培养基的配制：同实施例一。

2.2.VP60序列的优化

根据昆虫细胞密码子偏好性对实施例一测得的兔出血热病毒衣壳蛋白基因原始序列VP60进行优化，不改变氨基酸序列，优化后的序列VP60-Y如SEQ ID NO:2所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列甚至解除翻译装置，优化的序列CAI值由0.72提高为0.79，调整了GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期，GC含量由54.9%调整为53.34%，那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构被破坏，原始序列中有BamH I、Xho I酶切位点，优化后的序列无此两个酶切位点。直接合成优化后的序列VP60-Y并克隆到载体pUC57上，两端分别带有Bam H I/Not I或Sph I/Xho I酶切位点。

2.3.1.含双拷贝兔出血症病毒VP60基因重组转移质粒的制备（图8）

2.3.1.1目的片段及载体的获得

测序鉴定过的重组质粒pUC57-VP60和载体质粒pFastBacDua用BamH I，Not I双酶切。酶切体系见表4：

表4 酶切体系

总体积	重组质粒	Bam H I和Not I	缓冲液H	BSA(100x)	补水
						50μL	5μL	各1μL	5μL	0.5μL	37.5μL

37℃反应2小时，结束后于65℃灭活10分钟。

2.3.1.2酶切产物的回收

将pUC57-VP60经BamH I/Not I双酶切的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收约1.7kb大小的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5mL离心管中，加入3倍(v/w)体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μL玻璃奶（Glass milk），混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入20μL0.1×TE缓冲液溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进行下一步实验。pFastBacDua载体酶切回收方法同上。

2.3.1.3目的片段与双表达载体pFastBacDual连接

酶切回收的RHDV-VP60目的片段与经Bam HI/Not I酶切后的转移载体pFastBacDua连接。用T4DNA连接酶进行DNA连接（16℃过夜）。连接体系见表5：

表5 连接体系

总体积	VP60	pFastBacDua	T4DNA连接酶	缓冲液
					10μL	6μL	2μL	1μL	1μL

2.3.1.4.重组质粒的转化与鉴定

参照1.2中的方法将连接产物转化到感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经BamH I/Not I双酶切、菌液PCR鉴定和基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为pFastBacDua-VP60。

2.3.1.5.重组转移载体pFastBacDua-VP60-VP60-Y的构建与鉴定

将pUC57-VP60和pFastBacDua-VP60载体经Sph I/Xho I双酶切后，连接，方法如上述，命名为pFastBacDua-VP60-VP60-Y载体（图9）。

2.3.2.重组杆状病毒Bacmid构建和鉴定

将重组供体质粒pFastBacDua-VP60-VP60-Y转化到感受态E.coli DH10Bac：将1μl重组转移质粒加入到感受态E.coli DH10Bac中，冰浴30min，42℃热激45s，迅速转移至冰水混合物中冰浴2-3min，加入1ml LB培养基，37℃、200rpm孵育4h，进行10^-1、10^-2、10^-3连续稀释，从10^-2、10^-3稀释液中各取100μl涂板（含抗生素、X-gal），37℃培养36-48h。

2.3.3.重组杆状病毒AcMNPV-VP60-VP60-Y的构建和拯救

提取重组Bacmid，转染昆虫细胞：⑴1μg重组Bacmid DNA加入100μl双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中；⑵将6μl脂质体加入到100μl双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中混匀；⑶将⑴和⑵溶液混合，室温放置15-45min；⑷将昆虫细胞（覆盖70-80%面积）用双无培养液系三次，脂质体和DNA混合物再加入800μl双无TC-100培养液，混合，加入Sf9细胞中，27℃，静置5h；⑸去除脂质体、DNA复合物液体，加入2ml完全（含有双抗、血清）TC-100培养液继续培养3-4d，收取上清，保存做种毒。重组病毒命名为AcMNPV-VP60-VP60-Y。

2.3.4重组病毒的基因水平鉴定

利用PCR方法分析外源基因。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl（0.5mol/L）的NaOH后混匀，再加入20μl（8mol/L）的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。为鉴定双拷贝的VP60基因均整合正确，寡核苷酸引物为：

PHVP60S-5’-GGATTATTCATACCGTCCCACCA-3’

PHVP60X-5’-AACCTCTACAAATGTGGTATGGCTG-3’；

P10VP60S-5’-CTTCCGGTATTGTCTCCTTCC-3’

P10VP60X-5’-CGGACCTTTAATTCAACCCAA-3’。

取上述病毒基因组DNA1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，目的条带均为1980bp结果证明双表达VP60基因整合正确（图10）。

2.4.重组病毒的蛋白水平鉴定

2.4.1.IF及Western Blot检测

IF鉴定蛋白表达。将重组杆状病毒AcMNPV-VP60-VP60-Y感染昆虫sf9细胞，72h后以80%预冷丙酮固定2h左右。PBST洗涤3次，加入150μl300倍稀释的针对VP60的单克隆抗体（购自PL Laboratories，PL0500130R）37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入150μl含有0.02%的伊文斯蓝的荧光二抗（1:100倍稀释，Sigma），37℃孵育1h，PBST洗涤3次，荧光显微镜观察并记录结果(图11)。

Western Blot鉴定蛋白表达。重组病毒感染昆虫细胞72小时后，弃去上清，加入RAPIA溶液进行裂解，SDS-PAGE电泳，然后进行考马斯亮蓝染色或Western Blot染色。结果表明在重组病毒感染的昆虫细胞和上清液中可检测到60kD大小的特异性条带（图12）。

2.4.2.昆虫细胞的优选

使用昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4或Sf9，按照常规方法进行细胞培养。简述如下：采用TC-100昆虫细胞培养基，1L培养基中加入22.2g粉剂，边加边搅拌至950mL双蒸水中，加入0.35g NaHCO3，用1M NaOH调整pH至6.2，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，使用前加入10%灭活血清及双抗。使用T75细胞培养瓶、1.0×10⁶cell/mL倍增传代，病毒按照MOI=1、5、10进行接毒，恒温恒湿27℃培养5-6天后收集细胞培养物，-20℃冻存以血凝法进行表达量检测，每个滴度做三瓶重复。最终确定最佳细胞为BTI-Tn-5B1-4，接毒MOI=5、最佳收获时间为5天。

病毒样颗粒的检测。取人的“O”型红细胞于阿氏液中保存，用PBS（0.02M，pH7.2）洗涤红细胞三次，最后将红细胞用生理盐水配成1%悬液。在U形板的每孔加入灭菌的PBS50μL；用微量移液器取适当倍数稀释的含病毒样颗粒溶液稀释液50μL加入第1孔内，混匀后，吸取50μL后加入到第二孔中，如此连续稀释至第22孔，第22孔吸取50ul液体弃掉；第23孔和第24孔为PBS对照，阴性细胞培养物按相同方法稀释。每孔加入50μL1%人的“O”型红细胞悬液，混匀后，4℃下反应45分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。细胞培养液中的兔出血症病毒样颗粒稀释到52000倍时仍为阳性（图13）。

2.4.3.电镜及胶体金免疫电镜观察

病毒样颗粒收集与纯化后的样品用PBS稀释10倍，放上铜网，滤纸片吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸片吸干，将铜网置于醋酸铀液滴上，滤纸片吸干液体后放入新的醋酸铀液滴上，重复3次后电镜观察，如图14A，可观察到兔出血症病毒样颗粒，大小与预期相符。样品用水稀释40倍后放铜网，滤纸片吸干液体后用ddH₂O滴洗后再用滤纸片吸干，将铜网置于稀释的一抗液滴上约3min，滴洗吸干后置于稀释的胶体金二抗液滴上，滴洗吸干后铜网置于醋酸铀液滴上，洗染3次后电镜观察，可观察到吸附胶体金的兔出血症病毒样颗粒，数量不少，表明兔出血症病毒蛋白VP60能自主在昆虫细胞内组装病毒样颗粒。

2.5动物免疫实验

2.5.1配苗：取血凝效价为2⁹的RHDV病毒衣壳粒子与氢氧化锌和硫酸乙酰肝素复合物（ZineHS）或弗氏佐剂（FCA）以1：1(v/v)比例充分混匀，添加0.05%叠氮钠，无菌分装，即成佐剂苗，置室温备用。

2.5.2效力试验：将75只3月龄大的兔子（血清阴性）分为3组各25只兔，第一组为病毒样颗粒加弗氏佐剂组，第二组为病毒样颗粒加氢氧化锌与硫酸乙酰肝素复合物佐剂（ZineHS）组，第三组为对照组。注射疫苗1ml/只，每隔1个月后耳缘静脉取血，进行抗体效价检测。在7天、28天、140天、175天进行攻毒实验（每次5只）。

2.5.3HI抗体检测：分别于接种前和接种后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月每组随机取5只兔耳静脉采血1mL，分离血清，按微量法进行HI试验,检测HI抗体效价。试验组全部产生RHDV的抗体，2个月时血凝抑制效价2⁹以上（图16）。ZineHS佐剂组抗体效价更高，维持时间可达12个月（图15）。

2.5.4攻毒试验：分别于免疫后7天、28天、140天、175天每组随机取5只试验兔攻毒,攻毒剂量为1：10肝毒悬液1ml/只。175天攻毒时ZineHS佐剂组100%存活，第一组和第三组全部发病死亡（图16）。表明ZineHS佐剂能够诱导更长更久的保护。对保护的兔进行解剖，结果显示该疫苗对兔无任何毒副作用（图17）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.兔出血症病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对兔出血症病毒VP60基因进行优化，得到优化的兔出血症病毒VP60基因；

(2)重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化的VP60基因插入到昆虫细胞高效表达载体中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；

(3)重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

(4)兔出血症病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到兔出血症病毒样颗粒；

其中，步骤(1)中优化的兔出血症病毒VP60基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；

步骤(2)中所述的昆虫细胞高效表达载体为pFastBacDual。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将优化的VP60基因分别构建到pFastBacDual中P_H和P₁₀两个启动子的下游，形成两个高效表达盒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中使用的昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se 301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中使用的昆虫细胞分别为Sf9细胞、BTI-Tn-5B1-4细胞。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法制备的兔出血症病毒样颗粒。

6.权利要求5所述的兔出血症病毒样颗粒在制备兔出血症疫苗中的应用，其特征在于，将权利要求5所述的兔出血症病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。