CN103642761A - 一种呼吸道合胞病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及呼吸道合胞病毒样颗粒，建立了一种新的制备呼吸道合胞病毒样颗粒的方法，并用于动物免疫。本发明按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F、G基因进行密码子优化，分别克隆到穿梭载体中，获得重组腺病毒质粒，转染，获得重组腺病毒FGAd-Msyn，FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn；将重组腺病毒感染Vero细胞，获得病毒样颗粒；采用蔗糖密度梯度离心的方法进行病毒样颗粒纯化；并用于动物免疫。本发明采用腺病毒载体制备病毒样颗粒，建立了一种新的病毒样颗粒制备方法，并通过密码子优化，提高蛋白表达量，提高病毒样颗粒的产量，获得较好的免疫效果，并且相对安全。

Description

一种呼吸道合胞病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,RSV）病毒样颗粒（Virus like particles，VLPs）及其制备方法和应用。

背景技术

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,RSV）广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒性病原，发病高峰期为出生后的6周至6个月，尤其是2～6个月婴幼儿，发病率高，出生一年内约有70%婴儿被感染。RSV也是我国婴幼儿急性下呼吸道感染的主要病毒病原，引起婴幼儿流行性喘憋性肺炎或毛细支气管炎，分布广泛，流行发病率为0.24%～21.9%，住院病死率为0.5%～4%。老人和免疫缺陷人群也易遭受RSV引起的严重感染。世界卫生组织等估计全球每年发病人数为6400万、死亡人数为16-100万。近期研究认为，RSV感染引起的社会经济负担可能比季节性流感更加严重，但由于RSV的诊断、预防及治疗均缺乏有效、可靠的方法，面对RSV感染，人们因缺乏治本之策，常将其统称为“普通感冒”或“病毒性感染。为此，世界卫生组织及美国医学研究院有关21世纪疫苗报告中均将开发RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。

RSV属于副黏病毒科，肺炎病毒属，基因组为单股负链，编码11种蛋白，包括3种跨膜包膜糖蛋白（F、G和SH），4种核壳体蛋白（N、P、L和M2-1），2种非结构蛋白（NS1和NS2），1种基质蛋白（M）和1种RNA调节因子（M2-2）。其中G、F为RSV主要中和抗原。

尽管RSV作为呼吸道病原体的重要性已在50多年前就被广泛认识，已尝试过多种形式的RSV疫苗，例如：以传统方法获得的减毒RSV活疫苗、福尔马林灭活疫苗（Formalin-inactivated RSV vaccine，FI-RSV）、核酸疫苗、病毒载体疫苗和亚单位疫苗等。由于作为RSV疫苗主要接种对象的2-6个月低龄婴幼儿存在免疫系统发育不成熟及母传抗体干扰等问题，上述疫苗在安全性或免疫原性等方面均有不足，至今尚未有能够用于预防人RSV感染的疫苗问世。

病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是一种不含病毒核酸，在形态结构上与病毒类似的颗粒状物质，与蛋白疫苗相比，VLPs疫苗不仅有很好的安全性，而且由于VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，能迅速、有效地诱导机体产生强大的体液免疫应答。在新型疫苗的研究中，取得了巨大成功。如美国默克公司（Merck）的人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）HPV6/11/16/18VLPs四价疫苗Gardasil和葛兰素史克公司（GSK）的HPV16和HPV18双价疫苗Cervarix已经用于临床，这两种VLPs疫苗均可预防宫颈癌。用于临床的VLPs疫苗还有乙肝病毒（hepatitis B virus）疫苗和流感病毒（influenza virus）疫苗。由我国自主研发的戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）疫苗也已经上市。另外，至少有12种VLPs疫苗相继进入临床试验，如LigoCyte公司的诺瓦克病毒（Norwalk virus）疫苗和MedImmune公司的细小病毒（parvovirus）疫苗等。这些进展显示VLPs疫苗是一种具有很好发展前景的新型疫苗。

RSV VLPs疫苗的研究已见文献报道，以往多采用杆状病毒载体系统或真核质粒制备RSV VLPs，但均存在明显的缺点，如利用杆状病毒载体系统制备RSV VLPs时，VLPs在出芽过程中携带了大量昆虫细胞的膜蛋白，该VLPs应用于人时，可能会引起过敏反应；真核质粒制备RSV VLPs时，存在表达量低的问题。因而，迫切需要建立一种新的RSV VLPs制备方法。

发明内容

本发明解决的第一个技术问题是提供一种呼吸道合胞病毒样颗粒。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒样颗粒，该病毒样颗粒包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述蛋白由密码子优化的M基因进行编码。

进一步地，所述密码子优化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

进一步地，所述呼吸道合胞病毒颗粒还可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其组合，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码。

进一步地，所述密码子优化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示，密码子优化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

本发明对RSV A亚型Long株F、M、G蛋白基因序列进行密码子优化，目的是增加蛋白的表达量。

本发明解决的第二个技术问题是一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，利用重组腺病毒制备呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，该方法同样适于其他病毒的病毒样颗粒制备，采用的技术方案为，将所述的含有M蛋白的重组腺病毒FGAd-Msyn单独感染Vero细胞，或将FGAd-Msyn与含有呼吸道合胞病毒F蛋白的重组腺病毒FGAd-Fsyn和/或含有呼吸道合胞病毒G蛋白的重组腺病毒FGAd-Gsyn，按适当比例混合感染Vero细胞，获得病毒样颗粒，其中，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码，其步骤包括：

（1）针对哺乳动物细胞对密码子的偏好性，对M、F和G基因进行密码子优化，分别命名Msyn、Fsyn、Gsyn，将Msyn、Fsyn、Gsyn分别克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，得到重组穿梭质粒pShuttle-CMV-Msyn、pShuttle-CMV-Fsyn、pShuttle-CMV-Gsyn；

（2）将重组穿梭质粒转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA⁺E.coli BJ5183/p的感受态细胞，筛选鉴定，获得分别有Msyn、Fsyn、Gsyn基因的重组腺病毒质粒pAdeasy-Msyn，pAdeasy-Fsyn，pAdeasy-Gsyn；

（3）分别将pAdeasy-Msyn，pAdeasy-Fsyn，pAdeasy-Gsyn转染293细胞进行表达，获得重组腺病毒FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn；

（4）将FGAd-Msyn单独接种Vero细胞，或将FGAd-Msyn与FGAd-Fsyn和/或FGAd-Gsyn混合感染Vero细胞，获得含病毒样颗粒的上清液；

（5）蔗糖密度梯度离心进行纯化，获得纯化后的病毒样颗粒。

进一步地，步骤（5）中蔗糖密度梯度离心的步骤为：

（1）将上清液离心；

（2）弃掉上清，将沉淀重悬，分别加入60%、50%、30%蔗糖垫层，离心；

（3）收集目的条带位置的蛋白带，再分别加入60%、50%、40%、30%、20%蔗糖垫层，离心；

（4）收集密度接近的样品，加入预冷的NTE混匀，离心；

（5）弃掉上清，用预冷的NTE重悬沉淀，分装。

包含所述呼吸道合胞病毒样颗粒的疫苗。

进一步地，所述疫苗为注射剂、口服剂、滴鼻剂、喷雾剂或透皮剂形式。

所述呼吸道合胞病毒样颗粒在制备用于预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

所述呼吸道合胞病毒样颗粒用于制备呼吸道合胞病毒抗体。

所述呼吸道合胞病毒样颗粒用于制备呼吸道合胞病毒诊断试剂。

本发明采用的是腺病毒载体系统，即复制缺陷型腺病毒载体系统。该复制缺陷型腺病毒载体系统为E1和/或E3区缺失的腺病毒，容许携带6.5～8kb的外源基因，外源基因表达盒（包括外源启动子、目的基因以及终止子）一般被插入到E1区所对应的部分。该腺病毒载体被广泛用于基因治疗和疫苗研究，我们在实践中发现该载体能用于大量表达外源蛋白，于是采用该载体建立一种新的病毒样颗粒的制备方法。

密码子优化（codon optimization）遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare orlow-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是，灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）。基因利用的密码子可能不是蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子可以基因合成，基因的这种重新设计叫密码子优化。其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达。消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使得蛋白生产更有效和经济。

本发明的有益效果是：密码子优化可以大大提高蛋白表达量，提高病毒样颗粒的产量；通过复制缺陷型腺病毒系统来生产病毒样颗粒可减少例如使用杆状病毒等系统制备出的病毒样颗粒对人体的致敏性。本实验应用的Vero细胞是WHO批准的可用于疫苗研制的细胞之一，相对安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为pMA-T-Msyn酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，1是DL15000DNAmarker，2是目的基因Msyn，大小是774bp；

图2为pMA-T-Fsyn酶切后的琼脂糖凝胶电泳图,1是DL15000DNAmarker，2是目的基因Fsyn，大小是1728bp;

图3为重组穿梭质粒酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，1是目的基因Msyn，大小是774bp，2是DL15000DNA marker。

图4为重组穿梭质粒酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，1是目的基因Fsyn，大小是1728bp，2是DL15000DNA marker;

图5为重组腺病毒质粒pAdEasy-Msyn经PacΙ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，1是目的基因Msyn，条带大小是4.5Kb和33Kb的片段，2是DL15000DNA marker；

图6为重组腺病毒质粒pAdEasy-Fsyn经PacΙ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，1是DL15000DNA marker，2是目的基因Fsyn，条带大小是4.5Kb和33Kb的片段；

图7为重组腺病毒FGAd-Msyn转染293细胞，引起293细胞发生病变，A为病变的293细胞，B为正常的293细胞；

图8为重组腺病毒FGAd-Msyn感染293细胞约72h后的Western blot鉴定结果，1为上清中M蛋白；2细胞中M蛋白；

图9为重组腺病毒FGAd-Fsyn感染293细胞约72h后，收获细胞的Western blot鉴定结果；

图10为重组腺病毒FGAd-Msyn与重组腺病毒FGAd-Fsyn共同感染293细胞后培养基上清经蔗糖密度梯度离心后的Western blot鉴定结果；

图11为经蔗糖密度梯度离心后的VLPs形成的条带；

图12为由RSV Msyn形成VLPs的电镜观察结果（1%磷钨酸pH6.8负染，JEM-1400，10000×）；

图13为由RSV Msyn与RSV Fsyn共同形成VLPs的电镜观察结果（1%磷钨酸pH6.8负染，JEM-1400，15000×）；

图14为动物免疫后数据分析图。

具体实施方式

本发明所用的呼吸道合胞病毒和重组腺病毒由北京交通大学生物工程与生命科学研究院基因工程实验室保存。

实施例1：重组穿梭质粒的构建

1.构建：针对哺乳动物细胞对密码子的偏好性，对野生型RSV M、F、G进行密码子的优化，分别命名Msyn、Fsyn、Gsyn，以提高其在哺乳动物细胞中的表达量；全基因合成密码子优化的M、F、G基因，pMA-T-Msyn、pMA-T-Fsyn和pMA-T-Gsyn；分别利用限制性内切酶HindⅢ与EcoRⅤ双酶切pMA-T-Msyn、pMA-T-Fsyn和pMA-T-Gsyn，回收目的片段。

琼脂糖凝胶电泳后，在近774bp处（见图1）和1728bp处（见图2）各有一特异性条带，分别与Msyn基因和Fsyn基因长度一致。

采用限制性内切酶HindⅢ与EcoRⅤ双酶切穿梭载体pShuttle-CMV，回收载体片段，分别与目的片段Msyn、Fsyn、Gsyn片段12℃～16℃连接过夜，连接产物分别命名为pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn、pShuttle-Gsyn。用限制性内切酶HindⅢ与EcoRⅤ进行双酶切鉴定，凝胶电泳分别在774bp、7500bp处（见图3）以及1728bp、7500bp处（见图4）出现特异性条带，表明重组穿梭质粒构建成功。

2.连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞：

a取感受态菌E.coli DH5α一管，加10μl连接产物，混匀，冰浴30min；

b42℃，热休克90s；

c冰浴2min；

d加800μl不含抗生素的液体LB，37℃，振摇培养，200rpm，1h；

e取约100μl～200μl菌液涂板，37℃孵箱培养12～15h。

3.提取：

（1）超净工作台中挑取单个菌落接种Kana⁺LB液体培养基，37℃，250rpm振摇12～16h。

（2）使用OMEGA试剂盒进行小量提取质粒

a取约1.2ml菌液于1.5ml Ep管中，10000rpm离心1min，弃上清，吸水纸吸干；

b加入250μl溶液Ⅰ，在旋涡震荡器上剧烈震荡混匀，重悬菌体；

c加入250μl溶液Ⅱ，快速轻柔颠倒混匀4～5次，室温放置2min，至溶液变澄清；

d再加350μl溶液Ⅲ，剧烈颠倒混匀4～5次，至溶液出现白色絮状沉淀；

e13000g，离心10min，将上清液小心转移至结合柱内，10000g，离心1min；

f弃去收集管中的液体将结合住重新装入收集管，加入Buffer HB500μl，离心10000g，1min；

g弃去收集管中的液体将结合住重新装入收集管，加入Wash Buffer700μl，离心10000g，1min，重复一次；

h空离结合柱，13000g，2min；

i将结合住重新装入新的EP管中，向结合住中间部分缓慢加入30-50μl Elution buffer，室温静置1～2min；离心13000g，1min。

4.鉴定：由于片段两端分别有HindⅢ与EcoRⅤ酶切位点，取质粒用HindⅢ与EcoRⅤ双酶切鉴定重组质粒，37℃，2h。

实施例2：构建含有Msyn、Fsyn或Gsyn基因的重组腺病毒质粒

1.在RecA⁺E.coli BJ5183细胞内的同源重组：

PmeⅠ酶切线性化pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn、pShuttle-Gsyn，37℃，过夜酶切。取约500ng PmeⅠ酶切线性化后的pShuttle-Msyn DNA分子、pShuttle-Fsyn DNA分子、pShuttle-Gsyn DNA分子，加H₂O补至400μl，加入40μl3mol/L乙酸钠（pH5.2），再加入2-2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃沉淀30min。4℃，12000rpm离心10min。用75%乙醇洗涤沉淀1次，晾干后溶解于10μl ddH₂O中，置于-20℃保存备用。取约5μl上个步骤获得的pShuttle-Msyn DNA分子、pShuttle-Fsyn DNA分子、pShuttle-GsynDNA，化学转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA⁺E.coli BJ5183/p感受态细胞，涂Kana⁺的LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落，接种Kana⁺的5ml LB培养液内，37℃培养过夜，获得的重组腺病毒质粒分别命名为pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy-Gsyn。以碱裂解法小量制备质粒，方法同上，PacⅠ鉴定重组腺病毒质粒。

由于穿梭质粒pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn的右臂（right arm）与腺病毒骨架载体pAdEasy-1的右臂（right arm）同时共有Ad5病毒基因组3534-5772bp的序列，可有效介导二者同源重组；而穿梭质粒的左臂（leftarm）与骨架载体的左臂（left arm）同时共有腺病毒Ad5的右侧末端34931-35935bp的序列，同源重组可在此区发生，或在其共有的质粒复制原点ori处发生。为确定同源重组发生的位置，我们可用一组限制性内切酶予以鉴定。若同源重组发生在两者的左臂与右臂同源序列之间，这种情况下所获得的重组腺病毒质粒有两个EcoRⅠ和两个BamHⅠ的酶切位点。则EcoRⅠ的酶切结果应为两条带，分别约为24Kb，13Kb；BamHⅠ的酶切结果也应为两条带，分别约为12Kb，25Kb；PacⅠ酶切会有两条3.0Kb和34Kb的片段。若同源重组发生在两者的ori与右臂同源序列之间，pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn左臂的EcoR I酶切位点将不会出现在腺病毒重组质粒上，所获得的重组腺病毒质粒有一个EcoRⅠ和两个BamHⅠ的酶切位点。EcoRⅠ的酶切结果应为一条带，约37Kb；而BamHⅠ的酶切结果仍为两条带，分别约12Kb及25Kb；PacⅠ酶切酶切会有两条约4.5Kb和33Kb的片段。电泳结果表明同源重组发生在两者的ori与右臂同源序列之间，见图5、图6。

2.用PEG8000大量制备和纯化pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy-Gsyn

（1）取鉴定正确的阳性菌液于LB平板上进行四区划线，37℃培养过夜。挑取单菌落分别接种到500ml含Kana的LB培养液内，于37℃，250～300rpm震摇过夜。

（2）收集500ml菌液至干净的离心管，4℃，8000rpm，离心15min。（肉眼观察上清液应澄清透明）

（3）弃上清，在洗水纸上扣干。先后加入10ml溶液Ⅰ（用吸管将细菌充分悬起，混匀）,20ml溶液Ⅱ（上下颠倒混匀20次，室温静置5min）和15ml溶液Ⅲ（上下颠倒混匀20次）。4℃，8000rpm，离心15min。

其中，溶液Ⅰ为：50mM葡萄糖／25mM Tris－Cl／10mM EDTA，pH8.0；溶液Ⅱ为：0.2N NaOH/1%SDS；溶液Ⅲ为：3M醋酸钾／2M醋酸；

（4）转移上清至干净的50ml离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀。4℃，4000rpm，离心15min。

（5）弃上清，用3ml TE(pH8.0)充分溶解所有沉淀（用吸管操作），加入等体积5M LiCl（此时总体积为6ml），混匀（此时溶液呈白色混浊状），4℃，4000rpm，离心15min。

（6）转移上清至干净的50ml离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀。4℃，4000rpm，离心15min。

（7）弃上清，用0.5ml TE充分溶解沉淀，分两步溶解，先加300μl充分溶解并转移DNA后，再用200μl溶解剩余沉淀并转移，溶解时，使用吸管，并将溶液转移至1.5ml Ep管，此时溶液为白色不透明液体，加入5μlRNaseA，37℃1h。加入等体积的1.6mol/L NaCl含13%PEG8000，可观察到大量絮状沉淀。4℃，13000rpm，离心10min。

（8）弃上清，加入0.5ml TE溶解EP管底部的白色沉淀，将沉淀轻轻弹起，55℃，放置1h或更长时间。期间倒置数次以促进DNA溶解（EP管盖受热后极易弹开，要小心操作或者用胶带将EP管盖固定，DNA充分溶解后，溶液为无色粘稠液体。）

（9）酚/氯仿/异戊醇和氯仿抽提DNA。首先加入500μl苯酚（取酚时，应注意避开水相），剧烈倒置混匀数次，13000rpm，离心8min。用200μl移液器转移含DNA的上层水相到新的EP管中，避免吸到酚层液体。加入等量氯仿，剧烈倒置混匀数次，13000rpm，离心8min，移液器转移含DNA的上层水相到新的EP管中，避免吸到氯仿层液体。

（10）直接加入无水乙醇500μl，倒置混匀数次，可见明显的絮状沉淀，13000rpm，离心10min，肉眼观察，在Ep管底部有白色或无色透明的DNA沉淀，有时沉淀也会出现在管壁上，小心弃取上清，37℃，干燥30min。

（11）用200～500μl TE，充分溶解DNA（无色、透明物质），55℃，30min，并用移液器反复吹吸数次直至完全溶解。

实施例3：将重组腺病毒质粒转染293细胞，细胞培养，获得重组腺病毒

1.用PacⅠ酶切重组腺病毒质粒pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn和pAdEasy-Gsyn：

用PacⅠ过夜酶切重组腺病毒质粒pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy-Gsyn，完全消化以去除ori和Kana抗性基因等质粒构件，并暴露其ITR，酶切后无水乙醇沉淀，干燥，20μl无菌H₂O溶解。

2.转染293细胞

293细胞由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所惠赠。

当293细胞生长丰度约50%～70%时，取用PacⅠ酶分别消化重组的腺病毒质粒pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn和pAdEasy-Gsyn各10μl与240μlopti－MEM（GIBCO）充分混匀（溶液A），室温温育5min；同时将10μlLipofectamine2000与240μl opti－MEM（GIBCO）充分混匀（溶液B），室温温育5min。温育后将溶液A与溶液B混匀，室温继续作用30min。在上述等候的时间里，移去293细胞的原培养液，用2ml opti－MEM液洗细胞二次。30min后将500μl Lipofectamine-DNA的复合物加至洗涤过的细胞中，再补加1.5ml opti－MEM，置37℃，5%CO₂培养箱中，孵育5h。5h后更换完全培养液，次日更换维持液。转染后7d左右，293细胞出现肿胀，圆缩、细胞间隙增大、细胞折光性增强等典型的致细胞病变效应（CPE），显微镜下观察，见图7。于第10天收集细胞与上清液一起置-80℃、37℃反复冻融3次后，此为Passage0代毒种。取Passage0代的毒种，接种于293细胞，37℃、5%CO₂培养至细胞病变。约48h—72h左右，细胞已经完全病变、脱落，按上述方法处理293细胞，获得P1代病毒。重复上述操作，直至获得P3代病毒。获得的含有Msyn、Fsyn或Gsyn基因的复制缺陷型重组腺病毒分别命名为FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn。

实施例4：重组腺病毒的表达及表达产物鉴定

取生长丰度达到90%以上的293细胞，分别接种P3FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn，待出现80%CPE后，将细胞放置于冰上10-30min（目的让培养基冷却），刮下病变的细胞收集于预冷的离心管中，4℃，5000rpm，离心10min，保留上清并冻干，重复用PBS清洗一次。将细胞沉淀用100μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（碧云天）重悬，置冰上裂解1h，然后4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，立即加入适量5×SDS Loadingbuffer，进行WB鉴定。

（1）采用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后取出带有凝胶的玻璃板，用割胶刀顺其下缘小心撬开玻璃板，按样品的多少切下合适大小的凝胶，浸泡在1×电转液中5min左右，以平衡离子强度。用1×膜转移缓冲液浸泡预先剪好的合适大小的3M滤纸6片和硝酸纤维素膜一片，将3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸依次叠加在一起，修剪成同样大小，用玻璃棒轻轻擀压滤纸以赶出气泡。

（2）置于电转仪内，硝酸纤维素膜位于正极，合上阳极板，接好电线。

（3）转膜条件：电流为膜面积（cm²）×0.8，电转移时间为1小时10分钟至2小时。

（4）电转移结束后，取下硝酸纤维素膜，装入杂交袋中。

（5）用含5%脱脂奶的TBST封闭液封闭硝酸纤维素膜2h，用1︰3000稀释的羊抗人RSV多抗（Chemicon）与膜4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10min/次。用1︰5000稀释的HRP标记的兔抗山羊IgG（购于北京中杉金桥生物技术有限公司）与膜室温孵育1h，TBST洗涤3次，10min/次。

（6）用ECL增强化学发光系统曝光显迹：在暗室中，按膜面积（cm²）×0.125ml的用量，等体积混合化学发光试剂的A液与B液（购于Thermo）。将混合后的液体逐滴加到膜上，暗室中可见到膜上出现绿色荧光条带，甩干膜上多余液体，用保鲜膜将膜包好，蛋白面朝上。在暗室内对底片曝光5～10min。取出底片放置于显影液中显影2min，再放置于定影液中定影5min，大量水冲洗，晾干保存。

由图8、图9可见，在FGAd-Msyn和FGAd-Fsyn感染的细胞分别出现特异的Msyn和Fsyn蛋白条带。

实施例5：病毒样颗粒制备

在Vero细胞生长丰度为90%时，更换不含血清以及双抗的DMEM培养基，用重组腺病毒FGAd-Msyn感染Vero细胞，48～72小时收集培养基上清，5000rpm，4℃，离心10min，离心后弃掉细胞保留上清，获得病毒颗粒。在Vero细胞生长丰度为90%时，更换不含血清以及双抗的DMEM培养基，分别将重组腺病毒FGAd-Fsyn和重组腺病毒FGAd-Msyn按照适当比例混合感染Vero细胞，48～72小时收集培养基上清，5000rpm，4℃，离心10min，离心后弃掉细胞保留上清，获得病毒颗粒。在Vero细胞生长丰度为90%时，更换不含血清以及双抗的DMEM培养基，分别将重组腺病毒FGAd-Gsyn和重组腺病毒FGAd-Msyn按照适当比例混合感染Vero细胞，48～72小时收集培养基上清，5000rpm，4℃，离心10min，离心后弃掉细胞保留上清，获得病毒颗粒。在Vero细胞生长丰度为90%时，更换不含血清以及双抗的DMEM培养基，分别将重组腺病毒FGAd-Fsyn、重组腺病毒FGAd-Gsyn和重组腺病毒FGAd-Msyn按照适当比例混合感染Vero细胞，48～72小时收集培养基上清，5000rpm，4℃，离心10min，离心后弃掉细胞保留上清，获得病毒样颗粒。

实施例6：采用蔗糖密度滴度离心进行病毒样颗粒的纯化，并电镜观察

1.病毒样颗粒的纯化：

将实施例5中获得的含病毒样颗粒的上清转移至SW28转子中，22000rpm，12h，4℃离心；弃掉上清，用预冷的NTE（25mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl，0.1M MgSO₄，0.01M EDTA）约5ml将沉淀重悬，此时分别加入60%、50%、30%蔗糖垫层于SW40转子中，最上层加入重悬的沉淀，35000rpm，2.5h，4℃离心；离心收集目的条带位置的蛋白带于SW40转子中，此时再分别加入60%、50%、40%、30%。20%蔗糖垫层，最后加入蛋白条带，35000rpm，18h，4℃离心；离心完毕按每0.5ml体积收集样品称重计算密度，将密度接近的样品收集于SW55转子中，再加入预冷的NTE混匀，22000rpm，2.5h，4℃离心。离心后弃掉上清，用适量预冷的NTE重悬沉淀，分装，用于Western blot鉴定，鉴定结果见图10。其中，离心过程中收集的条带见图11。

2.透射电镜样品的制备：

取适量的待检测样品，将铜网放置于样品上1min后用滤纸吸干多余的样品，之后再将铜网放置于磷钨酸（pH6.8）上1min，吸干多余的液体，放入透射电镜中进行观察，见图12、图13，表明成功制备病毒样颗粒。

实施例7：动物免疫

本发明采用的实验动物为：雌性BALB/c小鼠，6～8周龄（购于北京维通利华实验动物技术有限公司），饲养于清华大学医学测试中心实验动物平台P2动物实验室。

1.采取随机编号，5只一组，其中RSV VLPs实验组，采用滴鼻免疫方式给予VLPs，30μg/25μl/只；阳性对照组为RSV，同样采用滴鼻免疫方式给予RSV病毒，5×10⁶pfu/25μl/只；阴性对照组，采用滴鼻免疫方式给予NTE，25μl/只。

2.于初次免疫后两周内眦静脉采血，为检测血清中特异性IgG效价。

3.ELISA方法检测RSV特异性抗体的效价，并进行数据分析，方法如下：

a.将纯化的RSV作为包被抗原，按1:4000稀释度包被，4℃过夜；

b.将包被液甩干，PBST洗96孔板，3min/次，洗三次；

c.用10%胎牛血清（PBS配制）进行封闭，37℃，1小时。

d.将基础血清、初免后血清用抗体稀释液（5%胎牛血清）按倍比稀释的方法进行稀释，加到96孔板中，37℃，1小时。

e.一小时后，用PBST洗96孔板，3min/次，洗三次。

f.将HRP标记的山羊抗小鼠IgG按1:5000的比例进行稀释，加到96孔板中，37℃，1小时

g.一小时后，用PBST洗96孔板，3min/次，洗六次。

h.加显色液，暗处37℃显色约15min。

i.加入2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪中读取OD450值。

数据分析结果见图14，动物实验表明，在初次免疫后第2周进行血清抗体滴度的检测，实验组即免疫VLPs组与阳性对照组即免疫RSV组没有显著差异，而这两组的结果与阴性对照组即免疫NTE组有显著性差异，说明实验组可产生与阳性对照组相同的免疫效果。同样的，在初次免疫后第6周进行血清抗体滴度的检测，实验组即免疫VLPs组与阳性对照组即免疫RSV组没有显著差异，而这两组的结果与阴性对照组即免疫NTE组有显著性差异，进一步说明实验组可产生与阳性对照组相同的免疫效果。

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述M蛋白由密码子优化的M基因进行编码。

2.根据权利要求1所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，还可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其组合，所述F蛋白和G蛋白分别由密码子优化的F基因和G基因进行编码。

3.根据权利要求1所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，所述密码子优化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求2所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒，其特征在于，所述密码子优化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，密码子优化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

5.一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，利用重组腺病毒制备呼吸道合胞病毒病毒样颗粒，该方法同样适于其他病毒的病毒样颗粒制备，其步骤包括：

（1）按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F和G基因进行密码子优化，分别命名Msyn、Fsyn、Gsyn；

（2）将Msyn、Fsyn、Gsyn分别克隆到穿梭载体中，得到重组穿梭质粒，将重组穿梭质粒转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA⁺E.coliBJ5183/p的感受态细胞，筛选鉴定，获得重组腺病毒质粒pAdeasy-Msyn，pAdeasy-Fsyn，pAdeasy-Gsyn；

（3）将pAdeasy-Msyn，pAdeasy-Fsyn，pAdeasy-Gsyn分别转染293细胞，获得重组腺病毒FGAd-Msyn，FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn；

（4）将FGAd-Msyn单独感染Vero细胞，或者将FGAd-Msyn与FGAd-Fsyn和/或FGAd-Gsyn感染Vero细胞，获得含有病毒样颗粒的上清液；

（5）蔗糖密度梯度离心进行纯化，获得纯化后的病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（5）中蔗糖密度梯度离心的步骤为：

（1）将上清液离心；

（2）弃掉上清，将沉淀重悬，分别加入60%、50%、30%蔗糖垫层，离心；

（3）收集目的条带位置的蛋白带，再分别加入60%、50%、40%、30%、20%蔗糖垫层，离心；

（4）收集密度接近的样品，加入预冷的NTE混匀，离心；

（5）弃掉上清，用预冷的NTE重悬沉淀，分装。

7.包含权利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒样颗粒的疫苗，所述疫苗优选为注射剂、口服剂、滴鼻剂、喷雾剂或透皮剂形式。

8.权利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒样颗粒在制备用于预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

9.权利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒样颗粒用于制备呼吸道合胞病毒抗体。

10.权利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒样颗粒用于制备呼吸道合胞病毒的诊断试剂。

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