CN103911389A - 一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的g和f蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法，是根据分子生物学原理，对呼吸道合胞病毒表面抗原G蛋白和F蛋白基因的密码子进行优化，之后选择合适的表达载体和宿主表达菌使其得以在原核细胞中高量表达；将其重组G和F蛋白作为抗原包被Elisa板子，评价其在检测呼吸道合胞病毒感染病人中的有效性。本发明是对呼吸道合胞病毒表面抗原G和F密码子进行了优化使其得以上清表达，大大提高了G蛋白和F蛋白的活性，时间周期短，产量高，成本低，检测方法简单快速。

Description

一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法。 

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是世界范围内引起下呼吸道感染的重要病原体之一,它可以在各个年龄组引起呼吸道感染,尤其见于婴幼儿、老年人和免疫缺陷患者等急性的呼吸道感染。RSV的感染率很高,超过65%的儿童在1岁前感染过RSV，2岁时，感染率达100%，在发达国家致死率一般约在2%，而在一些发展中国家高达7%-8%。我国不但有RSV散发性感染，还发生过数次大规模爆发流行，如1997年津冀地区发生一次RSV所致的喘憋性肺炎暴发流行，造成447,216人感染，10,522人住院，86人死亡。因此，RSV病毒检测方法的建立对于有效诊断和治疗呼吸道感染至关重要。 

与单一ＲSV 感染相比，混合感染组患儿热程更长，更多存在肝肿大及ESＲ 异常。单一ＲSV 感染患儿更多见喘息、气促、流鼻涕等症状，病情相对较重，且与年龄呈负相关。目前，RSV检测试剂盒多以RSV病毒G蛋白和F蛋白的混合物作为抗原进行包被，主要是针对混合感染而言，因此，开发针对单一的RSV感染的试剂盒很迫切。 

RSV病毒G蛋白和F蛋白核苷酸序列含有大量的原核生物稀有密码子导致其在原核表达系统中仅少量表达或者不表达，因此目前市售RSV检测试剂盒多为哺乳动物细胞表达的G蛋白和F蛋白作为包被抗原。鉴于真核表达系统与原核表达系统相比具有时间周期长、产量低、成本高等缺点，我们对RSV病毒G蛋白和F蛋白基因的密码子、表达载体的启动子、分泌表达宿主菌进行了优化和选择，从而满足RSV病毒G蛋白和F蛋白的原核系统高量表达并用于实际生产。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法。 

本发明是利用优化过的G和F蛋白基因上清表达上述两种蛋白，之后将其作为抗原包被Elisa板子，最终实现对呼吸道合胞病毒感染者的准确检测。。 

本发明所述制备方法包括下列步骤： 

1、G和F蛋白的密码子优化：由于原始的G和F蛋白不适合原核系统进行表达，因此根据原核细胞密码子使用原则对G和F蛋白进行优化，使其具备可在原核系统中大量表达的特性；

2、载体构建：以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-对优化后的G蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco 和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为900 个碱基对，同理，以FL上游引物- catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，FL下游引物- tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -对优化后的F蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco 和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1.5 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为1700 个碱基对，将得到的G和F基因克隆至商品化质粒pET28c(+)中，分别构建pET28c-GL和pET28c-FL重组质粒；

3、重组质粒的转化和验证：将pET28c-GL和pET28c-FL转化至Top10感受态细胞，之后通过菌落PCR和基因测序确定序列是否正确；

4、将验证无误后的pET28c-GL和pET28c-FL转化至Rosetta细胞，进行蛋白表达；

具体操作为：从Top 10 cell提取质粒，转化进Rosetta 细胞中，涂平板，37℃下培养；挑取卡那平板上生长的单菌落，加入到20 毫升LB培养液中，37℃下，220转/分摇床上过夜培养；取1%的过夜培养的菌液接种到200 毫升 LB培养液中，37℃下,220转/分摇床上培养2小时；待菌液浑浊度OD600=0.5时，将摇床温度降到16℃，加入终浓度0.5毫摩尔/升的IPTG过夜诱导；将诱导后的培养液离心收集菌体，之后转移至50 毫升离心管，每管加入25毫升裂解液重悬细胞，进行超声破碎，超声破碎5 秒停8 秒，如此超声破碎2～3个循环，超声破碎机功率20%，至菌液澄清透亮即可； 在4℃下，10000 转/分，离心10 分钟，收集的上清即可作为抗原进行包被。

本发明的有益效果：是对呼吸道合胞病毒表面抗原G和F密码子进行了优化使其得以上清表达，大大提高了G蛋白和F蛋白的活性，时间周期短，产量高，成本低，检测方法简单快速。 

附图说明

图1 对照组GD蛋白，实验组G蛋白和F蛋白PCR扩增结果。图中M为商品化marker，1-3分别为对照蛋白，G蛋白，F蛋白。 

图2对照组GD蛋白，实验组G蛋白和F蛋白酶切验证结果。图中M为商品化marker，1-5分别为原始质粒，酶切后质粒，对照蛋白，G蛋白，F蛋白。 

图3对照组GD蛋白，实验组G蛋白和F蛋白菌落PCR验证结果。图中M为商品化marker，1-3分别为对照蛋白，G蛋白，F蛋白。 

图4 对照组GD蛋白，实验组G蛋白和F蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图中M为Marker，1-9分别为GD(R)IPTG诱导后菌体，GD(R)超声破碎后上清，GD(R) 超声破碎后沉淀，GL(R) IPTG诱导后菌体，GL(R)超声破碎后沉淀，GL(R)超声破碎后上清，FL(R) IPTG诱导后菌体，FL(R) IPTG诱导后上清，GL(R) IPTG诱导后沉淀。 

图5 对照组GD蛋白，实验组G蛋白和F蛋白在呼吸道合胞病毒感染病人实际检测中的应用。 

具体实施方式

实施例1： 

一种可用于检测人呼吸道合胞病毒抗体的重组G和F蛋白的原核制备方法

1、G和F蛋白的密码子优化：由于原始的G和F蛋白不适合原核系统进行表达，因此根据原核细胞密码子使用原则对G和F蛋白进行优化，使其具备可在原核系统中大量表达的特性; 

2、载体构建：以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-对优化后的G蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco 和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为900 个碱基对，同理，以FL上游引物- catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，FL下游引物- tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -对优化后的F蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco 和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1.5 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为1700 个碱基对，将得到的G和F基因克隆至商品化质粒pET28c(+)中，分别构建pET28c-GL和pET28c-FL重组质粒；

3、重组质粒的转化和验证：将pET28c-GL和pET28c-FL转化至Top10感受态细胞，之后通过菌落PCR和基因测序确定序列是否正确；

4、将验证无误后的pET28c-GL和pET28c-FL转化至Rosetta细胞，进行蛋白表达。具体操作为：从Top 10 cell提取质粒，转化进Rosetta 细胞中，涂平板，37℃下培养；挑取卡那平板上生长的单菌落，加入到20 毫升LB培养液中，37℃下，220 转/分摇床过夜培养；取1%过夜培养的菌液接种到200 毫升 LB培养液中，37℃下，220 转/分培养2小时；待菌液浑浊度OD600=0.5时，将摇床温度降到16℃，加入终浓度0.5毫摩尔/升的IPTG过夜诱导；将诱导后的培养液离心收集菌体，之后转移至50 毫升离心管，每管加入25毫升裂解液重悬细胞，进行超声破碎，超声破碎5 秒停8 秒，如此超声破碎2～3个循环，破碎机功率20%，至菌液澄清透亮即可；4℃下，10000 转/分，离心10 分钟，收集的上清即可作为抗原进行包被。

实施例2 

重组G和F蛋白在检测呼吸道合胞病人中的实际应用

1、  按实施例1中的试验方法优化G和F蛋白密码子，构建可于原核表达系统中进行蛋白表达的G和F蛋白。

2、  将得到的G和F蛋白上清100 ng/孔，4 ℃过夜；次日取出孔板，用PBS-T缓冲液洗3次，每次3 分钟，加入封闭液，封闭2 小时；倒去封闭液，用PBS-T缓冲液洗3次，每次3 分钟；将获取的样本血清取10 微升加入点样孔，同时做阴性、阳性和空白对照，37 ℃孵育1 小时；倒去液体，用PBS-T缓冲液洗涤3次，每次3 分钟，加入HRP标记的二抗，孵育45 分钟，洗涤3次，每次3 分钟；加入2 M 硫酸50 毫升 终止反应后加显色剂100 μL/孔，显色20 分钟，用酶标仪测定结果。 

3、  实验结果如图1所示，成功扩增到G和F蛋白的基因，片段大小与预期值相符合；图2和3表明所构建的pET28c-GL和pET28c-FL重组质粒经酶切和菌落PCR验证完全正确；图4说明在原核系统中表达的蛋白大小和位置与我们预期的完全相符。上述结果说明成功构建了G和F蛋白的质粒，并且可在原核系统中高量表达。 

图5中，用的到的G和F蛋白上清进行Elisa包被，并用于检测呼吸道合胞病毒感染者血清，实验结果表达明G和F蛋白均可检测到感染者体内的呼吸道合胞病毒抗体，呈阳性结果；而做的去离子水组，PBS组和细胞培养液组等阴性对照组均成阴性，说明生产的G和F蛋白上清可方便快捷得对呼吸道合胞病毒感染者进行检测。 

  

Claims (1)

1.一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法，其特征是：

A、G和F蛋白的密码子优化：由于原始的G和F蛋白不适合原核系统进行表达，因此根据原核细胞密码子使用原则对G和F蛋白进行优化，使其具备可在原核系统中大量表达的特性；

B、载体构建：以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-对优化后的G蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco                                                和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为900 个碱基对，同理，以FL上游引物- catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，FL下游引物- tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -对优化后的F蛋白基因进行扩增，其中黑线框中为上下游引物带入的酶切位点，分别为Nco 和Xho ，PCR条件为：94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 60 秒;56℃，60 秒;72℃，1.5 分钟；最后72℃延伸7分钟，得到PCR产物约为1700 个碱基对，将得到的G和F基因克隆至商品化质粒pET28c(+)中，分别构建pET28c-GL和pET28c-FL重组质粒；

C、重组质粒的转化和验证：将pET28c-GL和pET28c-FL转化至Top10感受态细胞，之后通过菌落PCR和基因测序确定序列是否正确；

D、将验证无误后的pET28c-GL和pET28c-FL转化至Rosetta细胞，进行蛋白表达；

具体操作为：从Top 10 cell提取质粒，转化进Rosetta 细胞中，涂平板，37℃下培养；挑取卡那平板上生长的单菌落，加入到20 毫升LB培养液中，37℃下，220转/分摇床上过夜培养；取1%的过夜培养的菌液接种到200 毫升 LB培养液中，37℃下,220转/分摇床上培养2小时；待菌液浑浊度OD600=0.5时，将摇床温度降到16℃，加入终浓度0.5毫摩尔/升的IPTG过夜诱导；将诱导后的培养液离心收集菌体，之后转移至50 毫升离心管，每管加入25毫升裂解液重悬细胞，进行超声破碎，超声破碎5 秒停8 秒，如此超声破碎2～3个循环，超声破碎机功率20%，至菌液澄清透亮即可；在4℃下，10000 转/分，离心10 分钟，收集的上清即可作为抗原进行包被。